KR20220148186A - 안정성-증진된 프로테아제 변이체 ⅵ - Google Patents

Abstract

본 발명은 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 주어진 아미노산 서열과 적어도 70 %의 서열 동일성을 공유하고, 서열식별번호: 1에 따른 넘버링과 관련하여 (a) 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E를 갖고; (b) 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개에서 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 프로테아제의 생산 및 용도에 관한 것이다. 이러한 유형의 프로테아제는 우수한 세정 성능과 함께 매우 우수한 안정성을 나타낸다.

Description

안정성-증진된 프로테아제 변이체 Ⅵ

본 발명은 효소 기술 분야에 속한다. 본 발명은, 특히 세척제 및 세정제에서의 용도와 관련하여 보다 우수한 저장 안정성을 제공하도록 아미노산 서열이 변경된 바실루스 푸밀루스(Bacillus pumilus)로부터의 프로테아제에 관한 것이고, 또한 상기 프로테아제를 코딩하는 핵산 및 그의 생산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이들 프로테아제의 용도 및 이들이 사용되는 방법, 뿐만 아니라 이들을 함유하는 작용제, 특히 세척제 및 세정제에 관한 것이다.

프로테아제는 기술적으로 가장 중요한 효소 중 일부이다. 이들은 세척제 및 세정제를 위한 가장 오래 전에 확립된 효소이고, 사실상 모든 현대의 효과적인 세척제 및 세정제에 함유된다. 이들은 세정될 물품 상의 단백질-함유 얼룩의 분해를 유발한다. 이들 중, 다시, 서브틸리신 유형의 프로테아제(서브틸라아제, 서브틸로펩티다아제, EC 3.4.21.62)가 특히 중요하고, 촉매 활성 아미노산으로 인해 세린 프로테아제이다. 이들은 비-특이적 엔도펩티다아제로서 작용하고, 펩티드 또는 단백질 내부에 있는 임의의 산 아미드 결합을 가수분해한다. 그의 최적 pH는 통상적으로 뚜렷하게 알칼리성 범위이다. 예를 들어, 논문[“Subtilases: Subtilisin-like Proteases" by R. Siezen, pages 75-95 in "Subtilisin enzymes," published by R. Bott and C. Betzel, New York, 1996]은 이 패밀리의 개관을 제공한다. 서브틸라아제는 자연적으로 미생물로부터 형성된다. 특히, 바실루스 종에 의해 형성되고 분비되는 서브틸리신은 서브틸라아제의 가장 중요한 군이다.

세척제 및 세정제에 바람직하게 사용되는 서브틸리신 프로테아제의 예는 서브틸리신 BPN' 및 칼스버그(Carlsberg), 프로테아테 PB92, 서브틸리신 147 및 309, 바실루스 렌투스(Bacillus lentus)로부터의, 특히 바실루스 렌투스 DSM 5483으로부터의 프로테아제, 서브틸리신 DY 및 서브틸라아제로서 분류될 수 있지만 보다 좁은 의미에서는 더 이상 서브틸리신으로서 분류될 수 없는 효소 써미타아제, 프로테이나아제 K 및 프로테아제 TW3 및 TW7 및 출발 프로테아제와 관련하여 변경된 아미노산 서열을 갖는 상기 프로테아제의 변이체이다. 프로테아제는 선행 기술로부터 공지된 방법에 의해 선택적으로 또는 무작위로 변경되고, 이에 의해 예를 들어 세척제 및 세정제에서의 사용을 위해 최적화된다. 이러한 방법은 점, 결실 또는 삽입 돌연변이유발 또는 다른 단백질 또는 단백질 부분과의 융합을 포함한다. 따라서, 적절하게 최적화된 변이체는 선행 기술로부터 공지된 대다수의 프로테아제에 대해 공지되어 있다.

유럽 특허 출원 EP 2016175 A1은, 예를 들어, 세척제 및 세정제를 위해 의도된 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제를 개시한다. 일반적으로, 단지 선택된 프로테아제만이 임의의 경우에 액체, 계면활성제-함유 제제에 사용하기에 적합하다. 많은 프로테아제는 이러한 제제에서 충분한 촉매 성능을 나타내지 않는다. 따라서, 세정제에서의 프로테아제의 사용을 위해, 세척 사이클에 있는 동안 조건 하에서 높은 촉매 활성 및 높은 저장 안정성이 특히 바람직하다.

결과적으로, 선행 기술로부터의 프로테아제 및 계면활성제-함유 액체 제형은 함유된 프로테아제가 표준 세척 조건 하에서(예를 들어, 20 ℃ 내지 40 ℃ 온도 범위에서) 만족스러운 단백질 분해 활성을 갖지 않거나 또는 저장-안정성이 아니고, 따라서 제형이 프로테아제-감수성 얼룩에 대해 최적의 세정 성능을 나타내지 않는다는 점에서 불리하다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 따른 넘버링을 기초로 하여, 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 및 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개에서 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터, 특히 6W, 89A, 131H, 166M, 189T, 211N 및 224A로부터 경우에 따라 선택되는 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 갖는 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제 또는 (서열 동일성을 기초로 하여) 충분히 유사한 프로테아제가 야생형 형태 및/또는 참조 돌연변이체와 비교하여 저장 안정성의 관점에서 개선되고, 따라서 세척제 또는 세정제에 사용하기에 특히 적합하다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 주어진 아미노산 서열과 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖고, 각각의 경우에 서열식별번호: 1에 따른 넘버링을 기초로 하여:

(a) 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 뿐만 아니라

(b) 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개에서 특히 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터 선택되는, 보다 바람직하게는 6W, 89A, 131H, 166M, 189T, 211N 또는 224A로부터 선택되는 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환

을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 (ⅰ) 서열식별번호: 1에서의 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서, 프로테아제가 그 위치에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E를 포함하고, (ⅱ) 서열식별번호: 1에서의 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개에서 특히 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터, 보다 바람직하게는 6W, 89A, 131H, 166M, 189T, 211N 및 224A로부터 선택되는 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 갖는, 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 주어진 아미노산 서열과 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는 출발 프로테아제에서의 아미노산의 치환을 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 프로테아제를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법에 의해 수득될 수 있는 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 주어진 아미노산 서열과 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖는다.

따라서, 본 특허 출원의 의미 내의 프로테아제는 프로테아제 그 자체 및 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 프로테아제 둘 다를 포함한다. 따라서, 프로테아제에 관한 모든 언급은 프로테아제 그 자체 및 상응하는 방법에 의해 생산된 프로테아제 둘 다에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 이러한 프로테아제를 코딩하는 핵산, 본 발명에 따른 프로테아제 또는 핵산을 함유하는 비-인간 숙주 세포 및 본 발명에 따른 프로테아제를 포함하는 작용제, 특히 세척제 및 세정제, 세척 및 세정 방법 및 단백질-함유 얼룩을 제거하기 위한 세척제 또는 세정제에서의 본 발명에 따른 프로테아제의 용도에 관한 것이다.

본원에 사용된 "적어도 1개"는 1개 이상, 즉 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 그 초과를 의미한다.

본 발명은 본원에 기재된 위치에서의 아미노산 치환이 세척제 및 세정제에서 이러한 변경된 프로테아제의 개선된 저장 안정성을 유발한다는 본 발명자들의 놀라운 발견을 기초로 한다.

본 발명에 따른 프로테아제의 바람직한 실시양태에서, 프로테아제는 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터, 특히 6W, 89A, 131H, 166M, 189T, 211N 및 224A로부터 선택되는 치환을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 프로테아제는 이러한 위치 중 적어도 2개에서 상응하는 치환을 갖는다. 이러한 2개의 치환은 바람직하게는 위치 (ⅰ) 189 및 224, (ⅱ) 166 및 189 또는 (ⅲ) 166 및 211 및 경우에 따라 적어도 1개의 다른 위치에서의 것일 수 있다. 이들은 바람직하게는 189T, 224A, 166M 및 211N이다.

다양한 실시양태에서, 프로테아제는

(1) 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 및

(2) 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 및 224에 상응하는 위치 중 적어도 2개에서 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터 선택되는, 바람직하게는 6W, 89A, 131H, 166M, 189T, 211N 및 224A로부터 선택되는 아미노산 치환

을 갖는다.

다양한 실시양태에서, 프로테아제는

(1) 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 및

(2) (a) 위치 166 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 189T;

(b) 위치 166, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M, 189T 및 224A;

(c) 위치 89, 131, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 131H, 189T 및 224A;

(d) 위치 89, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 189T 및 224A;

(e) 위치 6, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 6W, 189T 및 224A;

(f) 위치 166 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 211N;

(g) 위치 6 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 6W 및 189T;

(h) 위치 131 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 189T;

(i) 위치 89 및 131에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 131H;

(j) 위치 89 및 166에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 166M;

(k) 위치 89 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 189T;

(k) 위치 89 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 211N;

(l) 위치 89 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 224A;

(m) 위치 131 및 166에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 166M;

(n) 위치 131 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 211N;

(o) 위치 131 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 224A; 또는

(p) 위치 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 189T 및 224

를 갖는다.

본 발명의 다양한 실시양태에서, 프로테아제는 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 9T, 130D, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 및

(a) 위치 166 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 189T;

(b) 위치 166, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M, 189T 및 224A;

(c) 위치 89, 131, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 131H, 189T 및 224A;

(d) 위치 89, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 189T 및 224A;

(e) 위치 6, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 6W, 189T 및 224A; 또는

(f) 위치 166 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 211N;

을 갖는다.

본 발명의 다양한 실시양태에서, 프로테아제는 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 9T, 130V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 뿐만 아니라 위치 89, 131, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 131H, 189T 및 224A를 갖는다.

다양한 실시양태에서, 프로테아제는 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 및 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 1개 이상에서 적어도 1개, 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개, 예를 들어 1, 2, 3 또는 4개의 추가의 아미노산 치환(들)을 가지며, 상기 아미노산 치환(들)은 바람직하게는: 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터, 보다 바람직하게는: 6W, 89A, 131H, 166M, 189T, 211N 및 224A로부터 선택된다.

상기 언급된 프로테아제의 서열의 나머지는 프로테아제의 전체 서열 동일성이 적어도 70 %, 바람직하게는 적어도 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 또는 97 %이도록 서열식별번호: 1과 충분한 서열 동일성을 갖는다. 다양한 실시양태에서, 돌연변이될 수 있는 프로테아제의 나머지 서열, 즉 본원에 언급된 위치를 제외한 서열은 서열식별번호: 1의 상응하는 서열과 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 100 % 동일하다. 이는 프로테아제의 서열이 언급된 치환을 제외하고는 서열식별번호: 1의 서열에 상응할 수 있다는 것을 의미한다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 프로테아제는 서열식별번호: 1과 70 % 초과 및 100 % 미만의 서열 동일성을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로테아제는 서열식별번호: 1과 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 % 또는 97 % 초과 및 100 % 미만의 서열 동일성을 갖는다. 프로테아제의 서열은 본원에 언급된 치환을 제외하고는 서열식별번호: 1의 서열에 상응할 수 있다.

본 발명에 따른 프로테아제는 증진된 저장 안정성을 갖는다. 이들은, 특히 3일 이상, 4일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 12일 이상, 14일 이상, 21일 이상 또는 28일 이상 동안 저장되는 경우에, 야생형 효소와 비교하여, 특히 또한 프로테아제의 출발 변이체(서열식별번호: 2)와 관련하여 세척제 또는 세정제에서 증가된 안정성을 갖는다. 이러한 성능-증진된 프로테아제는 다양한 온도 범위, 특히 20 ℃ 내지 40 ℃ 온도 범위에서 단백질분해 민감성 얼룩에 대한 개선된 세척 결과를 가능하게 한다.

증가된 저장 안정성과 독립적으로 또는 그에 추가로, 본 발명에 따른 프로테아제는 또한 세척제 또는 세정제에서 증가된 촉매 활성을 가질 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 발명에 따른 프로테아제는 야생형 및/또는 프로테아제의 이미 성능-증진된 참조 돌연변이 변이체(서열식별번호: 1 및/또는 서열식별번호: 2)를 기초로 하여 적어도 101 %, 바람직하게는 적어도 102 %인 단백질분해 활성을 가질 수 있다. 이러한 성능-증진된 프로테아제는 다양한 온도 범위, 특히 20 ℃ 내지 40 ℃ 온도 범위에서 단백질분해에 민감한 얼룩에 대한 개선된 세척 결과를 가능하게 한다.

본 발명에 따른 프로테아제는 효소 활성을 나타내며, 즉 이들은 특히 세척제 또는 세정제에서 펩티드 및 단백질을 가수분해할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 프로테아제는 단백질/펩티드 기질에서 아미드/펩티드 결합의 가수분해를 촉매하여 단백질 또는 펩티드를 절단할 수 있는 효소이다. 또한, 본 발명에 따른 프로테아제는 바람직하게는 성숙 프로테아제, 즉 신호 펩티드(들) 및/또는 프로펩티드(들)가 없는 촉매 활성 분자이다. 달리 언급되지 않는 한, 주어진 서열은 또한 각각 성숙(프로세싱된) 효소를 지칭한다.

본 발명의 다양한 실시양태에서, 프로테아제는 유리 효소이다. 이는 프로테아제가 작용제의 모든 성분과 직접 작용할 수 있고, 작용제가 액체 작용제인 경우에 프로테아제가 작용제의 용매(예를 들어, 물)와 직접 접촉한다는 것을 의미한다. 다른 실시양태에서, 작용제는 다른 분자와 상호작용 복합체를 형성하거나 또는 "코팅"을 함유하는 프로테아제를 함유할 수 있다. 이 경우에, 개별 프로테아제 분자 또는 다수의 프로테아제 분자는 주변 구조에 의해 작용제의 다른 구성성분으로부터 분리될 수 있다. 이러한 분리 구조는 소포, 예컨대 미셀 또는 리포솜으로부터 발생할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 주변 구조는 또한 바이러스 입자, 박테리아 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 다양한 실시양태에서, 작용제는 본 발명에 따른 프로테아제를 발현하는 바실루스 푸밀루스 또는 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 세포 또는 이러한 세포의 세포 배양 상등액을 포함할 수 있다.

본 발명의 다양한 실시양태에서, 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 주어진 아미노산 서열과 적어도 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 90.5 %, 91 %, 91.5 %, 92 %, 92.5 %, 93 %, 93.5 %, 94 %, 94.5 %, 95 %, 95.5 %, 96 %, 96.5 % 또는 97 % 동일하고(여기서 "적어도"는 각각의 주어진 값을 지칭한다), 각각의 경우에 서열식별번호: 1에 따른 넘버링을 기초로 하여 상기 주어진 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 문맥에서, 프로테아제가 주어진 치환을 갖는 특징은 그것이 관련 위치에서 (주어진 것 중) 1개의 치환(들)을 함유함을, 즉 적어도 주어진 위치가 예를 들어 프로테아제의 단편화에 의해 달리 돌연변이 또는 결실되지 않음을 의미한다. 다양한 실시양태에서, 본원에 기재된 프로테아제는, 명백하게 언급된 치환을 제외하고, 서열식별번호: 1의 서열을 가지며, 즉 치환된 위치 이외에, 이들은 서열식별번호: 1에 따른 서열과 100 % 동일하다.

핵산 또는 아미노산 서열의 동일성은 서열 비교에 의해 측정된다. 이러한 서열 비교는 선행 기술에서 통상적으로 사용되고 확립된 블라스트(BLAST) 알고리즘을 기초로 하고(예를 들어, 문헌[Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410] 및 문헌[Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp. 3389-3402] 참조), 원칙적으로 핵산 또는 아미노산 서열 내의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 유사한 서열이 서로 할당되는 것에 의해 실시한다. 관련 위치의 표로 나타낸 연관성은 정렬로 지칭된다. 선행 기술에서 이용 가능한 또 다른 알고리즘은 파스타(FASTA) 알고리즘이다. 서열 비교(정렬), 특히 다중 서열 비교는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 생성된다. 예를 들어, 클러스탈(Clustal) 시리즈(예를 들어, 문헌[Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497-3500] 참조), T-커피(T-Coffee)(예를 들어, 문헌[Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217] 참조) 또는 이들 프로그램 또는 알고리즘을 기초로 하는 프로그램이 종종 사용된다. 컴퓨터 프로그램 벡터 NTI® 스위트(Vector NTI® Suite) 10.3(미국 캘리포니아주 칼스배드 패러데이 애비뉴 1600 소재의 인비트로젠 코포레이션(Invitrogen Corporation))을 미리 결정된 디폴트 파라미터와 함께 사용하는 서열 비교(정렬) 및 클러스탈W를 기초로 하는 서열 비교를 위한 그의 얼라인X(AlignX) 모듈이 또한 가능하다. 달리 언급되지 않는 한, 본원에 주어진 서열 동일성은 블라스트 알고리즘에 의해 측정된다.

이러한 비교는 또한 비교되는 서열의 유사성에 관한 결론을 도출할 수 있게 한다. 이는 통상적으로 퍼센트 동일성, 즉 상기 서열에서 또는 상응하는 위치의 정렬에서 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 비율로 주어진다. 상동성의 보다 넓은 개념은 아미노산 서열의 경우에 보존된 아미노산 교환, 즉 유사한 화학적 활성을 갖는 아미노산을 고려하는데, 이는 이들이 통상적으로 단백질 내에서 유사한 화학적 활성을 수행하기 때문이다. 따라서, 비교되는 서열 사이의 유사성은 또한 퍼센트 상동성 또는 퍼센트 유사성으로 표현될 수 있다. 동일성 및/또는 상동성 정보는 전체 폴리펩티드 또는 유전자에 관하여 또는 단지 개별 영역에 관하여 제공될 수 있다. 따라서, 상이한 핵산 또는 아미노산 서열의 상동 또는 동일한 영역은 서열 내의 매치에 의해 정의된다. 이러한 영역은 종종 동일한 기능을 갖는다. 이들은 소형일 수 있고 단지 소수의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다. 종종, 이러한 작은 영역은 단백질의 전체 활성에 대해 필수적인 기능을 수행한다. 따라서, 서열 매치를 단지 개별적인, 경우에 따라 작은 영역에 관련시키는 것이 편리할 수 있다. 그러나, 달리 언급되지 않는 한, 본 출원에서의 동일성 또는 상동성 정보는 표시된 특정 핵산 또는 아미노산 서열의 전체 길이에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 문맥에서, 아미노산 위치가 서열식별번호: 1에서의 숫자로 표시되는 위치에 상응한다는 표시는 상응하는 위치가 상기 정의된 바와 같은 정렬에서 서열식별번호: 1에서의 숫자로 표시되는 위치와 연관된다는 것을 의미한다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 프로테아제는 (저장 후, 예를 들어 4주에 걸친) 그의 세정 성능이 서열식별번호: 2에 주어진 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 프로테아제의 그것과 비교하여 유의하게 감소되지 않는 것, 즉 참조 세척 성능의 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 100 %, 보다 바람직하게는 적어도 110 % 또는 그 초과를 갖는 것을 특징으로 한다. 세정 성능은 세척액 리터 당 4.5 내지 7.0 그램의 투여량으로 세척제를 함유하는 세척 시스템에서 측정될 수 있고, 비교될 프로테아제인 프로테아제는 (활성 단백질을 기초로 하여) 동일한 농도로 사용되고, 면 상의 얼룩에 대한 세정 성능은 세척된 텍스타일의 세정 정도를 측정함으로써 측정된다. 예를 들어, 세척 공정은 40 ℃의 온도에서 60분 동안 수행될 수 있고, 물은 15.5°dH 및 16.5°dH(독일 경도(German hardness)) 사이의 물 경도를 가질 수 있다. 이 세척 시스템을 위해 의도된 세척제 중 프로테아제의 농도는 활성, 정제된 단백질을 기준으로 0.001 내지 0.1 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 0.06 중량%이다.

이러한 세척 시스템을 위한 액체 기준 세척제는 하기와 같이 구성될 수 있다(모든 수치는 중량% 단위임): 알킬 벤젠 술폰산 4.4 %, 추가의 음이온성 계면활성제 5.6 %, 지방산의 C₁₂-C₁₈ Na 염(비누) 2.4 %, 비-이온성 계면활성제 4.4 %, 포스포네이트 0.2 %, 시트르산 1.4 %, NaOH 0.95 %, 소포제 0.01 %, 글리세롤 2 %, 보존제 0.08 %, 에탄올 1 % 및 나머지는 탈염수이다. 바람직하게는, 액체 세척제의 투여량은 세척액 리터 당 4.5 내지 6.0 그램, 예를 들어 세척액 리터 당 4.7, 4.9 또는 5.9 그램이다. pH 7 내지 pH 10.5, 바람직하게는 pH 7.5 내지 pH 8.5의 pH 범위에서의 세척이 바람직하다.

본 발명의 문맥에서, 세정 성능은 예를 들어 상기 언급된 바와 같은 액체 세척제를 사용하여 20 ℃ 또는 40 ℃에서 측정되며, 세척 공정은 바람직하게는 600 rpm에서 60분 동안 수행된다.

세정 성능의 척도로서의 백색도, 즉 얼룩의 미백(lightening)은 광학 측정 방법, 바람직하게는 광도측정법에 의해 측정된다. 이러한 목적을 위해 적합한 장치는 예를 들어 미놀타(Minolta) CM508d 분광계이다. 통상적으로, 측정을 위해 사용되는 장치는 백색 표준, 바람직하게는 공급된 백색 표준으로 미리 보정된다.

관련 프로테아제의 활성-등가적 사용은 활성 물질 대 총 단백질의 비(비활성(specific activity)의 값)가 분기되더라도, 각각의 효소적 특성, 예를 들어 특정 얼룩에 대한 세정 성능이 비교되는 것을 보장한다. 일반적으로, 낮은 비활성은 더 많은 양의 단백질을 첨가함으로써 보상될 수 있다.

다른 면에서, 프로테아제 활성을 측정하는 방법은 효소 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 이에 의해 일상적으로 사용된다. 예를 들어, 이러한 방법은 문헌[Tenside, vol. 7 (1970), pp. 125-132]에 개시되어 있다. 대안적으로, 프로테아제 활성은 기질 suc-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-p-니트로아닐리드(AAPF)로부터의 발색단 파라-니트로아닐린(pNA)의 방출로써 측정될 수 있다. 프로테아제는 기질을 절단하여 pNA를 방출한다. pNA의 방출은 410 nm에서 흡광도의 증가를 야기하며, 그의 시간적 진행은 효소 활성의 척도이다(문헌[Del Mar et al., 1979] 참조). 측정은 25 ℃의 온도, 8.6의 pH 및 410 nm의 파장에서 수행된다. 측정 시간은 5분이고 측정 간격은 20초 내지 60초이다. 프로테아제 활성은 통상적으로 프로테아제 단위(PE)로 나타내어진다. 적합한 프로테아제 활성은 예를 들어 세척액 mL 당 2.25, 5 또는 10 PE에 이른다. 그러나, 프로테아제 활성은 0이 아니다.

본 발명에 따른 프로테아제의 단백질분해 활성을 확립하기 위한 대안적 시험은 광학 측정 방법, 바람직하게는 광도측정 방법이다. 적절한 시험은 기질 단백질 카제인의 프로테아제-의존성 절단을 포함한다. 이는 프로테아제에 의해 다수의 보다 작은 부분 생성물로 절단된다. 이러한 부분 생성물의 전체는 절단되지 않은 카제인과 비교하여 290 nm에서 증가된 흡광을 가지며, 이러한 증가된 흡광은 광도계를 사용하여 측정되고, 따라서 프로테아제의 효소적 활성에 관한 결론을 도출하는 것이 가능하다.

단백질 농도는 공지된 방법, 예를 들어 BCA 방법(비신코닌산; 2,2'-비키놀릴-4,4'-디카르복실산) 또는 뷰렛(Biuret) 방법(문헌[A. G. Gornall, C.S. Bardawill and M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), p. 751-766])을 사용하여 측정될 수 있다. 활성 단백질 농도는 이와 관련하여 적합한 비가역적 억제제를 사용하여 활성 중심을 적정하고 잔류 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다(문헌[M. Bender et al., J. Am. Chem. Soc. 88, 24 (1966), pp. 5890-5913] 참조).

상기 논의된 아미노산 변경에 추가로, 본 발명에 따른 프로테아제는 다른 아미노산 변경, 특히 아미노산 치환, 삽입 또는 결실을 가질 수 있다. 이러한 프로테아제는, 예를 들어, 표적화 유전자 변경에 의해, 즉 돌연변이유발 방법에 의해 개발되고, 특정 적용을 위해 또는 특정 특성과 관련하여(예를 들어, 그의 촉매 활성, 안정성 등과 관련하여) 최적화된다. 또한, 본 발명에 따른 핵산은 재조합 접근법에 도입될 수 있고, 따라서 완전히 새로운 유형의 프로테아제 또는 다른 폴리펩티드를 생성하는데 사용될 수 있다.

목적은, 예를 들어 본 발명에 따른 효소의 세정 성능을 개선시키기 위해 공지된 분자 내로 표적화 돌연변이, 예컨대 치환, 삽입 또는 결실을 도입하는 것이다. 이러한 목적을 위해, 특히 분자의 표면 전하 및/또는 등전점 및 그에 따른 그의 기질과의 상호작용이 변경될 수 있다. 예를 들어, 효소의 순 전하는 특히 세척제 및 세정제에 사용하기 위해 기질 결합에 영향을 미치도록 변경될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 1개 이상의 상응하는 돌연변이는 프로테아제의 안정성 또는 촉매 활성을 증가시키고, 따라서 그의 세정 성능을 개선시킬 수 있다. 개별 돌연변이, 예를 들어 개별 치환의 유리한 특성은 서로 보완될 수 있다. 따라서, 특정 특성과 관련하여, 예를 들어 저장 동안의 그의 안정성과 관련하여 이미 최적화된 프로테아제가 또한 본 발명의 범위 내에서 개발될 수 있다.

정확히 1개의 아미노산 위치와 관련된 치환(아미노산 교환)의 설명을 위해 하기 관습이 본원에 사용된다: 먼저, 자연 발생 아미노산은 국제적으로 사용되는 1-문자 코드의 형태로 표시되고, 연관된 서열 위치 및 최종적으로 삽입된 아미노산이 뒤따른다. 동일한 폴리펩티드 쇄 내의 여러 또는 대안적 교환은 슬래시에 의해 분리된다. 따라서, "130D/V"는 위치 130이 D 또는 V로 돌연변이되었음을 의미한다. 삽입에 대해, 추가의 아미노산은 서열 위치 다음에 지정된다. 결실의 경우에, 누락된 아미노산은 기호, 예를 들어 별표 또는 대시로 대체되거나 또는 Δ가 상응하는 위치 앞에 표시된다. 예를 들어, P9T는 위치 9에서의 프롤린의 트레오닌에 의한 치환을 기재하고, P9TH는 위치 9에서의 아미노산 트레오닌 다음의 히스티딘의 삽입을 기재하고, P9* 또는 ΔP9는 위치 9에서의 프롤린의 결실을 기재한다. 이러한 명명법은 효소 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.

따라서, 본 발명은 또한 출발 분자로서 상기 기재된 바와 같은 프로테아제로부터 단일 또는 다중 보존적 아미노산 치환에 의해 수득 가능하며, 서열식별번호: 1에 따른 넘버링에서의 프로테아제가 상기-기재된 아미노산 치환을 갖는 것을 특징으로 하는 프로테아제에 관한 것이다. 용어 "보존적 아미노산 치환"은 1개의 아미노산 잔기의 또 다른 아미노산 잔기로의 교환(치환)을 의미하며, 이러한 교환은 교환된 아미노산의 위치에서 극성 또는 전하에 변화를 일으키지 않는, 예를 들어 비극성 아미노산 잔기의 또 다른 비극성 아미노산 잔기로의 교환을 의미한다. 본 발명의 범위 내의 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T를 포함한다.

대안적으로 또는 추가로, 프로테아제는 본 발명에 따른 프로테아제로부터 출발 분자로서 단편화 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 수득 가능하고, 적어도 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 인접 아미노산 길이에 걸쳐 출발 분자와 매칭하는 아미노산 서열을 포함하며, 상기-기재된 아미노산 치환, 즉 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 및 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개에서 추가의 아미노산 치환이 여전히 존재하는 것을 특징으로 한다.

예를 들어, 단백질분해 활성이 공정에서 상실 또는 감소되지 않으면서 효소의 루프 내 또는 말단에서 개별 아미노산을 결실시키는 것이 가능하다. 또한, 이러한 단편화 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발은 또한 예를 들어 관련 효소의 알레르기항원성을 감소시키고, 따라서 그의 전체 적용가능성을 개선시킬 수 있다. 유리하게는, 효소는 심지어 돌연변이유발 후에도 그의 단백질분해 활성을 보유하며, 즉 그의 단백질분해 활성은 적어도 출발 효소의 그것에 상응하고, 즉 바람직한 실시양태에서 단백질분해 활성은 출발 효소의 활성의 적어도 80 %, 바람직하게는 적어도 90 %이다. 다른 치환이 또한 유리한 효과를 나타낼 수 있다. 단일 및 다수의 인접 아미노산 둘 다는 다른 아미노산으로 교환될 수 있다.

추가의 아미노산 위치는 이 경우에 본 발명에 따른 프로테아제의 아미노산 서열과 서열식별번호: 1에 주어진 바와 같은 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열의 정렬에 의해 정의된다. 또한, 위치의 할당은 성숙 단백질에 따라 달라진다. 이러한 할당은 또한 특히 본 발명에 따른 프로테아제의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1에 따른 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제보다 더 많은 수의 아미노산 잔기를 포함하는 경우에 사용된다. 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 아미노산 서열에서의 상기-언급된 위치로부터 진행하여, 본 발명에 따른 프로테아제에서의 변경 위치는 정렬에서 정확하게 이들 위치에 할당된 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 프로테아제의 상동 위치로 전달될 때 특히 중요하고 프로테아제에 유리한 기능적 특성을 부여하는 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 서열 변경, 특히 치환을 위한 유리한 위치는 정렬에서, 즉 서열식별번호: 1에 따른 넘버링에서 본원에 기재된 위치에 상응하는 위치이다. 언급된 위치에서, 하기 아미노산 잔기가 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 야생형 분자에 존재한다: P9, N130, T133, N144, Y217, N252 및 Q271뿐만 아니라 Y6, S89, G131, G166, S189, S211 및 S224.

변경될 아미노산의 정확한 할당, 즉 특히 그의 기능적 상응성의 추가의 확인은 비교 실험에 의해 제공될 수 있으며, 그에 따라 정렬에 기초하여 서로에게 할당된 2개의 위치가 비교되는 프로테아제 둘 다에서 동일한 방식으로 변경되고, 효소적 활성이 둘 다의 경우에 동일한 방식으로 변경되는지 여부에 대한 관찰이 이루어진다. 예를 들어, 서열식별번호: 1에 따른 바실루스 푸밀루스로부터의 프로테아제의 특정 위치에서의 아미노산 교환이 효소적 파라미터의 변경, 예를 들어 K_M 값의 증가를 동반하고, 효소적 파라미터의 상응하는 변경, 예를 들어 마찬가지로 K_M 값의 증가가, 아미노산 교환이 동일한 도입된 아미노산에 의해 달성되는 본 발명에 따른 프로테아제 변이체에서 관찰되는 경우, 이는 따라서 정확한 할당의 확인인 것으로 간주될 수 있다.

모든 이러한 측면은 또한 본 발명에 따른 프로테아제를 생산하기 위한 방법에 적용 가능하다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 하기 방법 단계 중 1개 이상을 추가로 포함한다:

a) 프로테아제는 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 및; 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개 또는 적어도 2개에서 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 프로테아제 내로 단일 또는 다중 보존적 아미노산 치환을 도입하는 단계;

b) 프로테아제는 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 및; 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개 또는 적어도 2개에서 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 포함하는 것인, 프로테아제가 적어도 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 인접 아미노산 길이에 걸쳐 출발 분자와 매칭되는 아미노산 서열을 포함하도록 단편화 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 아미노산 서열을 변경시키는 단계.

모든 실시양태는 또한 본 발명에 따른 방법에 적용된다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 프로테아제 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 주어진 아미노산 서열과 여전히 적어도 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 90.5 %, 91 %, 91.5 %, 92 %, 92.5 %, 93 %, 93.5 %, 94 %, 94.5 %, 95 %, 95.5 %, 96 %, 96.5 % 또는 97 % 동일하다. 대안적으로, 프로테아제 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 프로테아제는 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 2에 주어진 아미노산 서열과 여전히 적어도 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 90.5 %, 91 %, 91.5 %, 92 %, 92.5 %, 93 %, 93.5 %, 94 %, 94.5 %, 95 %, 95.5 %, 96 %, 96.5 %, 97 %, 97.5 %, 98 %, 98.5 % 또는 99 % 동일하다. 프로테아제 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생산되는 프로테아제는 각각의 경우에 서열식별번호: 1에 따른 넘버링을 기초로 하여 위치 9, 130, 133, 144, 252 및 271에 상응하는 위치에서 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E로부터의 아미노산 치환; 및 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개에서 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개의 추가의 아미노산 치환(들)을 갖는다. 그의 예는 하기 아미노산 치환 변이체이다: (ⅰ) G166M 및 S189T; (ⅱ) G166M, S189T 및 S224A (ⅲ) S89A, G131H 및 S189T; (ⅳ) S89A 및 S189T; (ⅴ) Y6W, S189T 및 S224A; 또는 (ⅵ) G166M 및 S211N 중 1개와 조합된 P9T, N130D, T133A, N144K, Y217M, N252T 및 Q271E 또는 S89A, G131H 및 S189T와 조합된 P9T, N130V, T133A, N144K, Y217M, N252T 및 Q271E이고, 넘버링은 각각의 경우에 서열식별번호: 1 및 실시예에 기재된 변이체에 따른 넘버링을 기초로 한다.

본 발명은 또한 특히 1개 이상의 돌연변이, 예를 들어 치환에 의해 또는 중합체에 대한 커플링에 의해 추가로 안정화되는 상기 기재된 프로테아제에 관한 것이다. 저장 동안 및/또는 사용 동안, 예를 들어 세척 공정에서 안정성의 증가는 보다 긴 효소적 활성을 유도하고 따라서 세정 성능을 개선시킨다. 원칙적으로, 선행 기술에 기재되고/거나 적절한 모든 안정화 옵션이 고려된다. 효소 자체의 돌연변이에 의해 달성되는 안정화가 바람직한데, 이는 이러한 안정화가 효소의 회수 후의 임의의 추가의 작업 단계를 필요로 하지 않기 때문이다. 이러한 목적을 위해 적합한 서열 변경의 예는 상기에 언급되어 있다. 추가의 적합한 서열 변경은 선행 기술로부터 공지되어 있다.

안정화를 위한 추가의 가능성은, 예를 들어:

- 예를 들어 칼슘 결합에 관여하는 아미노산(들) 중 1개 이상을 1개 이상의 음으로 하전된 아미노산과 교환함으로써 및/또는 2개의 아미노산 아르기닌 및 글리신의 서열 중 적어도 1개에 서열 변경을 도입함으로써 금속 이온, 특히 칼슘 결합 부위의 결합을 변경시키는 것;

- 단백질의 표면 상의 또는 표면에서의 아미노산 서열의 변경을 유발하는 돌연변이에 의해 변성제, 예컨대 계면활성제의 영향에 대해 보호하는 것;

- N-말단 근처의 아미노산을 비-공유 상호작용을 통해 분자의 나머지와 접촉할 가능성이 있는 아미노산으로 교환하여 구형 구조의 유지에 기여하는 것이다.

바람직한 실시양태는 여러 안정화 돌연변이가 추가적으로 또는 상승작용적으로 작용하기 때문에 효소가 여러 방식으로 안정화되는 것이다.

본 발명은 또한 적어도 1개의 화학적 변형을 갖는 것을 특징으로 하는, 상기 기재된 바와 같은 프로테아제에 관한 것이다. 이러한 변경을 갖는 프로테아제는 유도체로서 지칭되며, 즉 프로테아제는 유도체화된다.

따라서, 본 출원의 문맥에서, 유도체는 순수한 아미노산 쇄가 화학적으로 변형된 단백질을 의미하는 것으로 이해된다. 이러한 유도체화는, 예를 들어, 단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 생체내에서 달성될 수 있다. 이와 관련하여, 저-분자량 화합물, 예컨대 지질 또는 올리고당의 커플링이 특히 주목할 만하다. 그러나, 유도체화는 또한 시험관내에서, 예를 들어 아미노산의 측쇄의 화학적 전환에 의해 또는 단백질에 대한 또 다른 화합물의 공유 결합에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 등전점을 변경시키기 위해 아민을 효소의 카르복실 기에 커플링시키는 것이 가능하다. 또 다른 이러한 화합물은 또한, 예를 들어 이관능성 화학적 화합물을 통해 본 발명에 따른 단백질에 결합되는 또 다른 단백질일 수 있다. 유도체화는 또한 거대분자 캐리어에 대한 공유 결합 또는 적합한 거대분자 케이지 구조 내의 비-공유 봉입체를 의미하는 것으로 이해된다. 유도체화는, 예를 들어 기질 특이성 또는 기질에 대한 결합 강도에 영향을 미치거나 또는 커플링된 물질이 억제제인 경우에 효소적 활성의 일시적 차단을 유발할 수 있다. 이는, 예를 들어 저장 기간 동안 편리할 수 있다. 이러한 변형은 안정성 또는 효소적 활성에 추가로 영향을 미칠 수 있다. 이들은 또한 단백질의 알레르기항원성 및/또는 면역원성을 감소시켜, 예를 들어 그의 피부 적합성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어 거대분자 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜과의 커플링은 안정성 및/또는 피부 적합성의 관점에서 단백질을 개선시킬 수 있다.

본 발명에 따른 단백질의 유도체는 또한 가장 넓은 의미에서 이러한 단백질의 제제를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 회수, 가공 또는 제제에 따라, 단백질은 예를 들어 생산 미생물의 배양물로부터의 다양한 다른 물질과 조합될 수 있다. 단백질은 또한 예를 들어 그의 저장 안정성을 증가시키기 위해 다른 물질에 의도적으로 첨가될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질의 모든 제제는 또한 본 발명에 따른다. 이는 또한 특정 제제에서 이러한 효소적 활성을 실제로 나타내는지 여부와 무관하다. 이는 저장 동안 활성을 갖지 않거나 단지 낮은 활성을 갖고 단지 사용시에만 그의 효소적 기능을 나타내는 것이 바람직할 수 있기 때문이다. 이는 예를 들어 적절한 수반 물질을 통해 제어될 수 있다. 특히, 이와 관련하여 프로테아제와 특이적 억제제의 공동 제제가 가능하다.

본 발명의 문맥에서, 상기 기재된 모든 프로테아제 또는 프로테아제 변이체 및/또는 유도체 중 저장 안정성이 적어도 서열식별번호: 2에 따른 프로테아제 또는 실시예에서 시험된 변이체에 상응하고/거나 세정 성능이 적어도 서열식별번호: 2에 따른 프로테아제 또는 실시예에서 시험된 변이체에 상응하는 것들이 특히 바람직하며, 세정 성능은 상기 기재된 세척 시스템에서 측정된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 프로테아제를 코딩하는 핵산, 뿐만 아니라 이러한 핵산을 함유하는 벡터, 특히 클로닝 벡터 또는 발현 벡터에 관한 것이다.

이들은 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 이들은 단일 가닥으로서, 이러한 단일 가닥에 상보적인 단일 가닥으로서 또는 이중 가닥으로서 존재할 수 있다. 특히 DNA 분자의 경우에, 2개의 상보적 가닥의 서열은 모든 3개의 가능한 리딩 프레임에서 고려되어야 한다. 또한, 특정 아미노산 서열이 복수의 상이한 핵산에 의해 코딩될 수 있도록 상이한 코돈, 즉 염기 트리플렛이 동일한 아미노산을 코딩할 수 있음이 주목되어야 한다. 유전자 코드의 이러한 축퇴(degeneracy)로 인해, 상기 기재된 프로테아제 중 임의의 것을 코딩할 수 있는 모든 핵산 서열이 본 발명의 대상에 포함된다. 유전자 코드의 축퇴에도 불구하고, 정의된 아미노산이 개별 코돈에 할당될 수 있기 때문에 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이러한 핵산 서열을 명백하게 결정할 수 있다. 따라서, 아미노산 서열로부터 나아가는 기술분야의 통상의 기술자는 상기 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 쉽게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 핵산의 경우에, 1개 이상의 코돈은 동의 코돈에 의해 대체될 수 있다. 이러한 측면은 특히 본 발명에 따른 효소의 이종 발현에 관한 것이다. 예를 들어, 모든 유기체, 예를 들어 생산 균주의 숙주 세포는 특정한 코돈 용법을 갖는다. 코돈 용법은 관련 유기체에 의한 유전자 코드의 아미노산으로의 번역을 의미하는 것으로 이해된다. 유기체 내의 핵산 상의 코돈이 비교적 적은 수의 로딩된 tRNA 분자에 직면하는 경우 단백질 생합성에서 병목현상이 발생할 수 있다. 동일한 아미노산을 코딩하지만, 이는 동일한 아미노산을 코딩하는 동의 코돈보다 코돈이 유기체에서 덜 효율적으로 번역되게 한다. 동의 코돈에 대한 tRNA 분자의 보다 많은 수의 존재로 인해, 이는 유기체에서 보다 효율적으로 번역될 수 있다.

현재 일반적으로 공지된 방법, 예컨대 화학적 합성 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)(PCR)을 분자-생물학적 및/또는 단백질-화학적 표준 방법과 함께 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자는 공지된 DNA 및/또는 아미노산 서열에 기초하여 상응하는 핵산 및 심지어 완전한 유전자를 생산하는 것이 가능하다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition, Cold Spring Laboratory Press]으로부터 공지되어 있다.

본 발명의 의미 내에서, 벡터는 특징적인 핵산 영역으로서 본 발명에 따른 핵산을 함유하는 요소인, 핵산으로 이루어진 요소를 의미하는 것으로 이해된다. 이들은 이들을 여러 세대 또는 세포 분열에 걸쳐 종 또는 세포주에서 안정한 유전적 요소로서 확립할 수 있다. 벡터는 특수한 플라스미드, 즉 특히 박테리아에서 사용되는 경우 원형 유전적 요소이다. 본 발명의 문맥에서, 본 발명에 따른 핵산은 벡터 내로 클로닝된다. 벡터는, 예를 들어 박테리아 플라스미드, 바이러스 또는 박테리오파지로부터 유래하는 것들 또는 주로 매우 다양한 기원의 요소를 갖는 합성 벡터 또는 플라스미드를 포함한다. 각각의 경우에 존재하는 추가의 유전적 요소와 함께, 벡터는 수 세대에 걸쳐 상응하는 숙주 세포에서 안정한 단위로서 그 자체를 확립할 수 있다. 이들은 염색체외 방식으로 별개의 단위로서 존재하거나 염색체 또는 염색체 DNA 내로 통합될 수 있다.

발현 벡터는 그들을 함유하는 숙주 세포, 바람직하게는 미생물, 특히 바람직하게는 박테리아 내에서 그들을 복제할 수 있게 하고 그에 함유된 핵산을 발현할 수 있게 하는 핵산 서열을 포함한다. 발현은 특히 전사를 조절하는 프로모터(들)에 의해 영향을 받는다. 원칙적으로, 발현은 발현될 핵산 앞에 원래 위치하는 천연 프로모터에 의할 뿐만 아니라 발현 벡터 상에 제공된 숙주 세포의 프로모터에 의해 또는 또 다른 유기체 또는 또 다른 숙주 세포의 변형된 또는 완전히 상이한 프로모터에 의해 또한 일어날 수 있다. 본 경우에, 적어도 1개의 프로모터가 본 발명에 따른 핵산의 발현을 위해 제공되고 그의 발현을 위해 사용된다. 또한, 발현 벡터는, 예를 들어 배양 조건을 변화시킴으로써 또는 이들을 함유하는 숙주 세포의 특정 세포 밀도가 도달되었을 때 또는 특정 물질, 특히 유전자 발현의 활성자의 첨가에 의해 조절 가능할 수 있다. 이러한 물질의 예는 박테리아 락토오스 오페론(lac 오페론)의 활성자로서 사용되는 갈락토스 유도체 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)이다. 발현 백터와 대조적으로, 함유된 핵산은 클로닝 벡터에서 발현되지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유하거나 또는 본 발명에 따른 프로테아제, 특히 숙주 세포 주변의 배지 내로 프로테아제를 분비하는 것을 함유하는 비-인간 숙주 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터는 미생물 내로 형질전환되고, 이는 이어서 본 발명에 따른 숙주 세포를 나타낸다. 대안적으로, 개별 성분, 즉 본 발명에 따른 핵산의 핵산 부분 또는 단편은 생성된 숙주 세포가 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유하도록 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 절차는 숙주 세포가 이미 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 벡터의 1개 이상의 구성성분을 함유하고, 이어서 추가의 구성성분이 그에 따라 보충되는 경우에 특히 적합하다. 세포를 형질전환시키는 방법은 선행 기술에 확립되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 원칙적으로, 모든 세포, 즉 원핵 또는 진핵 세포가 숙주 세포로서 적합하다. 유전적으로 유리한 방식으로, 예를 들어 핵산 또는 벡터를 사용한 형질전환 및 그의 안정한 확립의 측면에서 관리될 수 있는 숙주 세포, 예를 들어 단세포 진균 또는 박테리아가 바람직하다. 또한, 바람직한 숙주 세포는 우수한 미생물학적 및 생명공학적 관리성을 특징으로 한다. 이는, 예를 들어 용이한 배양, 높은 성장 속도, 발효 배지에 대한 낮은 요건 및 외래 단백질에 대한 우수한 생산 및 분비 속도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바람직한 숙주 세포는 (유전자 도입으로(transgenically)) 발현된 단백질을 숙주 세포 주변의 배지 내로 분비한다. 또한, 프로테아제는 그의 생산 후에 그를 생산하는 세포에 의해, 예를 들어 당 분자의 부착, 포르밀화, 아미노화 등에 의해 변형될 수 있다. 이러한 번역-후 변형은 프로테아제에 기능적으로 영향을 미칠 수 있다.

다른 바람직한 실시양태는, 예를 들어 벡터 상에서 이용 가능하게 되지만 또한 처음부터 이들 세포에 존재할 수 있는 유전자 조절 요소로 인해 활성이 조절될 수 있는 숙주 세포이다. 이러한 숙주 세포는, 예를 들어 활성자로서 사용되는 화학적 화합물의 제어된 첨가에 의해, 배양 조건의 변화에 의해 또는 특정 세포 밀도가 도달되는 경우에 발현하도록 유도될 수 있다. 이는 본 발명에 따른 단백질의 경제적 생산을 가능하게 한다. 이러한 화합물의 예는 상기 기재된 바와 같은 IPTG이다.

원핵 또는 박테리아 세포가 바람직한 숙주 세포이다. 박테리아는 짧은 세대 시간 및 배양 조건에 대한 낮은 요구를 특징으로 한다. 그 결과, 비용-효율적인 배양 방법 또는 생산 방법이 확립될 수 있다. 또한, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 발효 기술에서 박테리아의 경우에 풍부한 경험을 갖는다. 특정 생산을 위해, 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아는 개별 경우, 예컨대 영양소 공급원, 생성물 형성 속도, 시간 요건 등에서 실험적으로 결정되는 매우 다양한 이유로 적합할 수 있다.

그람-음성 박테리아, 예컨데 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 경우에, 다수의 단백질이 주변세포질 공간 내로, 즉 세포를 둘러싸는 2개의 막 사이의 구획 내로 분비된다. 이는 특정 적용에 유리할 수 있다. 또한, 그람-음성 박테리아는 발현된 단백질을 주변세포질 공간 내로 뿐만 아니라 박테리아 주변 배지 내로 방출하도록 또한 설계될 수 있다. 대조적으로, 그람-양성 박테리아, 예컨대 바실루스 또는 악티노미세테스(actinomycetes) 또는 악티노미세탈레스(Actinomycetales)의 다른 대표물은 외막을 갖지 않고, 따라서 분비된 단백질은 박테리아 주변 배지, 통상적으로 영양 배지 내로 즉시 방출되며, 이로부터 발현된 단백질이 정제될 수 있다. 이들은 배지로부터 직접 단리되거나 또는 추가로 가공될 수 있다. 또한, 그람-양성 박테리아는 기술적으로 유의한 효소에 대해 대부분의 기원 유기체와 관련되거나 또는 동일하고, 통상적으로 심지어 필적하는 효소를 형성하며, 이는 이들이 유사한 코돈 용법을 갖고 단백질 합성기가 그에 따라 자연적으로 정렬된다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 배양 조건에 대한 그의 요건의 관점에서 변경될 수 있거나, 상이한 또는 추가의 선별 마커를 가질 수 있거나 또는 다른 또는 추가의 단백질을 발현할 수 있다. 특히, 이는 또한 몇몇 단백질 또는 효소를 유전자 도입으로 발현하는 이러한 숙주 세포를 포함할 수 있다.

본 발명은 원칙적으로 모든 미생물, 특히 모든 발효 가능한 미생물, 특히 바람직하게는 바실루스 속의 것들에 적용 가능하고, 이러한 미생물의 사용에 의해 본 발명에 따른 단백질을 생산하는 것을 가능하게 한다. 이어서, 이러한 미생물은 본 발명의 의미 내에서 숙주 세포를 나타낸다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 숙주 세포는 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아, 클레브시엘라(Klebsiella), 바실루스, 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아르트로박터(Arthrobacter), 스트렙토미세스(Streptomyces), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 군으로부터 선택되는 1종, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 클레브시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실루스 렌투스, 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실루스 서브틸리스, 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alcalophilus), 바실루스 글로비기이(Bacillus globigii), 바실루스 깁소니이(Bacillus gibsonii), 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii), 바실루스 할로두란스(Bacillus halodurans), 바실루스 푸밀루스, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylococcus carnosus), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 아르트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxidans), 스트렙토미세스 리비단스(Streptomyces lividans), 스트렙토미세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor) 및 스테노트로포모나스 말토필리아(Stenotrophomonas maltophilia)의 군으로부터 선택되는 1종인 것임을 특징으로 한다.

그러나, 숙주 세포는 또한 세포 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 진핵 세포일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 세포 핵을 갖는 것을 특징으로 하는 숙주 세포에 관한 것이다. 원핵 세포와 대조적으로, 진핵 세포는 형성된 단백질을 번역-후 변형시킬 수 있다. 그의 예는 진균, 예컨대 악티노미세테스 또는 효모, 예컨데 사카로미세스(Saccharomyces) 또는 클루이베로미세스(Kluyveromyces)이다. 이는, 예를 들어 단백질이 이러한 시스템을 가능하게 하는 그의 합성과 관련하여 특정 변형을 겪는 경우에 특히 유리할 수 있다. 특히 단백질 합성과 관련하여 진핵 시스템에 의해 수행되는 변형은, 예를 들어 저-분자량 화합물, 예컨대 막 앵커 또는 올리고당의 결합을 포함한다. 이러한 올리고당 변형은, 예를 들어 발현된 단백질의 알레르기항원성을 저하시키는데 바람직할 수 있다. 이러한 세포에 의해 자연적으로 형성되는 효소, 예컨대 셀룰라아제와의 공동-발현이 유리할 수 있다. 또한, 예를 들어 호열성 진균 발현 시스템이 온도-저항성 단백질 또는 변이체의 발현에 특히 적합할 수 있다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 통상적인 방식으로, 예를 들어 불연속적 또는 연속적 시스템에서 배양 및 발효된다. 첫 번째 경우에, 적합한 영양 배지는 숙주 세포로 접종되고, 실험적으로 결정될 기간 후에 배지로부터 생산물이 수확된다. 연속 발효는 유동 평형의 달성을 특징으로 하며, 여기서 세포는 부분적으로 비교적 장기간에 걸쳐 사멸하지만 또한 다시 성장하고, 형성된 단백질은 동시에 배지로부터 제거될 수 있다.

본 발명에 따른 숙주 세포는 바람직하게는 본 발명에 따른 프로테아제를 생산하는데 사용된다. 따라서, 본 발명은 또한

a) 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및

b) 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리하는 단계

를 포함하는, 프로테아제를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다.

본 발명의 대상은 바람직하게는 발효 공정을 포함한다. 발효 공정은 선행기술로부터 그 자체로 공지되어 있고, 통상적으로 제조된 생산물, 예를 들어 본 발명에 따른 프로테아제의 적합한 정제 방법이 뒤따르는 실제 대-규모 생산 단계를 나타낸다. 본 발명에 따른 프로테아제를 생산하기 위한 상응하는 방법을 기초로 하는 모든 발효 공정은 본 발명의 이러한 대상의 실시양태를 구성한다.

발효가 공급 전략을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 공정이 특히 고려될 것이다. 이 경우, 연속적 배양에 의해 소비되는 배지 구성성분이 첨가된다. 그 결과, 세포 밀도 및 세포 매스 또는 건조 매스 둘 다 및/또는 특히 관심 프로테아제의 활성에서 상당한 증가가 달성될 수 있다. 또한, 발효는 원치 않는 대사 생산물이 완충제 또는 적합한 반대 이온을 첨가함으로써 중화되거나 여과 제거되도록 하는 방식으로 또한 설계될 수 있다.

생산된 프로테아제는 발효 배지로부터 수확될 수 있다. 이러한 발효 공정은 숙주 세포로부터의 프로테아제의 단리, 즉 세포 매스(건조 물질)로부터의 생성물 제조에 바람직하지만, 프로테아제를 발효 배지 내로 분비하기 위해 숙주 세포에 적합한 숙주 세포 또는 1개 이상의 적합한 분비 마커 또는 메커니즘 및/또는 수송 시스템의 제공을 필요로 한다. 분비 없이, 프로테아제는 대안적으로 숙주 세포로부터 단리될 수 있고, 즉 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올을 사용한 침전에 의해 또는 크로마토그래피 정제에 의해 세포 매스로부터 정제될 수 있다.

상기-언급된 모든 측면은 본 발명에 따른 프로테아제를 생산하기 위한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 작용제에 관한 것이다. 작용제는 바람직하게는 세척체 또는 세정제이다.

본 발명의 이러한 대상은 상업적 규모로, 세탁기에서 또는 수동 세척 또는 세정을 위해 사용하기 위한, 농축제 및 희석되지 않은 작용제 둘 다의, 모든 고려 가능한 유형의 세척제 또는 세정제를 포괄한다. 이들은, 예를 들어 텍스타일, 카펫 또는 천연 섬유를 위한 세척제를 포함하며, 이에 대해 용어 세척제가 사용된다. 이들은, 예를 들어 식기세척기용 식기세척 세제 또는 수동 식기세척 세제 또는 경질 표면, 예컨대 금속, 유리, 자기, 세라믹, 타일, 석재, 페인팅된 표면, 플라스틱, 목재 또는 가죽용 세정제를 포함하며, 이에 대해 용어 세정제, 즉 수동 및 기계적 식기세척 세제에 추가로, 또한, 예를 들어 정련제, 유리 세정제, WC 화장실 향기제(scenter) 등이 사용된다. 본 발명에 따른 세척제 및 세정제는 또한 추가의 효과를 달성하기 위해 수동 또는 자동 텍스타일 세척 동안 실제 세척제에 첨가되는 보조 세척제를 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 세척제 및 세정제는 또한 텍스타일 전-처리제 및 후-처리제, 즉 실제 세척 사이클 전에 세탁물과 접촉되어, 예를 들어 없애기 힘든 오염을 느슨하게 하는 작용제 및 또한 실제 텍스타일 세척 후의 단계에서 세탁물에 추가의 바람직한 특성, 예컨대 쾌적한 느낌, 구김 방지 또는 낮은 정전하를 제공하는 작용제를 포함한다. 특히, 유연제가 마지막에-언급된 작용제에 포함된다.

분말화 고체, 추가-압축된 미립자 형태, 균질 용액 또는 현택액의 형태일 수 있는 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 본 발명에 따른 프로테아제에 추가로 이러한 작용제에서 통상적인 모든 공지된 성분을 함유할 수 있으며, 바람직하게는 적어도 1종의 다른 성분이 작용제에 존재한다. 본 발명에 따른 작용제는 특히 계면활성제, 보조제, 과산소 화합물 또는 표백 활성화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 수혼화성 유기 용매, 추가의 효소, 격리제, 전해질, pH 조절제 및/또는 추가의 보조제, 예컨대 광표백제, 회색화 억제제, 발포 조절제, 뿐만 아니라 염료 및 향료 및 그의 조합을 함유할 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 프로테아제와 작용제의 1종 이상의 추가의 성분의 조합이 유리한데, 이는 본 발명에 따른 바람직한 실시양태에서, 이러한 작용제가 생성된 상승작용에 의해 개선된 세정 성능을 갖기 때문이다. 특히, 본 발명에 따른 프로테아제를 계면활성제 및/또는 보조제 및/또는 과산소 화합물 및/또는 표백 활성화제와 조합하는 것은 이러한 상승작용을 유발할 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 작용제는 붕산을 함유하지 않을 수 있다.

본 발명에 따른 작용제의 유리한 성분은 국체 특허 출원 WO 2009/121725, 제5면의 끝에서 두 번째 단락에서 시작하여 제13면의 두번째 단락에서 끝나는 곳에 개시되어 있다. 이 개시내용이 명백히 참조되며, 그의 개시내용은 본 특허 출원에 참조로 포함된다.

본 발명에 따른 작용제는 유리하게는 프로테아제를 작용제 g 당 2 μg 내지 20 mg, 바람직하게는 5 μg 내지 17.5 mg, 보다 바람직하게는 20 μg 내지 15 mg, 가장 특히 바람직하게는 50 μg 내지 10 mg의 양으로 함유한다. 다양한 실시양태에서, 작용제 중 본원에 기재된 프로테아제(활성 효소)의 농도는 작용제 또는 조성물의 총 중량을 기준으로 >0 내지 1 중량%, 바람직하게는 0.0001 또는 0.001 내지 0.1 중량%이다. 또한, 작용제에 함유된 프로테아제 및/또는 작용제의 다른 성분은 실온에서 또는 물의 부재 하에 효소에 대해 불투과성이고 작용제의 사용 조건 하에서 효소에 대해 투과성이 되는 물질로 코팅될 수 있다. 따라서 본 발명의 이러한 실시양태는 프로테아제가 실온에서 또는 물의 부재 하에 프로테아제에 대해 불투과성인 물질로 코팅되는 것을 특징으로 한다. 또한, 세척제 또는 세정제 자체는 또한 용기, 바람직하게는 공기-투과성 용기에 포장될 수 있으며, 이로부터 세척 공정 동안 또는 사용 직전에 방출된다.

본 발명의 추가의 실시양태에서, 작용제는

(a) 고체 형태로, 특히 300 g/L 내지 1200 g/L, 특히 500 g/L 내지 900 g/L의 벌크 밀도를 갖는 유동성 분말로서 존재하거나 또는

(b) 페이스트 또는 액체 형태로 존재하고/거나,

(c) 겔 형태로 또는 투여 파우치 형태로 존재하고/거나,

(d) 단일-성분 시스템으로서 존재하거나 또는

(e) 복수의 성분으로 나누어지는 것

을 특징으로 한다.

본 발명의 이러한 실시양태는 본 발명에 따른 작용제의 모든 고체, 분말화, 액체, 겔 또는 페이스트 투여 형태를 포함하며, 이는 경우에 따라 또한 복수의 상으로 이루어질 수 있고, 압축 또는 비압축 형태로 존재할 수 있다. 작용제는 특히 300 g/L 내지 1200 g/L, 특히 500 g/L 내지 900 g/L 또는 600 g/L 내지 850 g/L의 벌크 밀도를 갖는 유동성 분말로서 존재할 수 있다. 작용제의 고체 투여 형태는 또한 압출물, 과립, 정제 또는 파우치를 포함한다. 대안적으로, 작용제는 또한 액체, 겔 또는 페이스트 형태, 예를 들어 비-수성 액체 세척제 또는 비-수성 페이스트의 형태 또는 수성 액체 세척제 또는 물-함유 페이스트의 형태일 수 있다. 액체 작용제가 일반적으로 바람직하다. 작용제는 또한 단일-성분 시스템으로서 존재할 수 있다. 이러한 작용제는 1개의 상으로 이루어진다. 대안적으로, 작용제는 또한 복수의 상으로 이루어질 수 있다. 따라서, 이러한 작용제는 복수의 성분으로 나누어진다.

본 발명에 따른 세척제 또는 세정제는 단지 1종의 프로테아제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 이들은 또한 다른 가수분해 효소 또는 다른 효소를 작용제의 유효성을 위해 편리한 농도로 함유할 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 1종 이상의 추가의 효소를 추가로 포함하는 작용제에 의해 나타내어진다. 바람직하게 사용될 수 있는 추가의 효소는 본 발명에 따른 작용제에서 촉매 활성을 나타낼 수 있는 모든 효소, 특히 리파아제, 아밀라아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제, 만난아제, 탄나아제, 크실라나아제, 크산타나아제, 크시토글루카나아제, β-글루코시다아제, 펙티나아제, 카라기나아제, 퍼히드롤라아제, 옥시다아제, 옥시도리덕타아제 또는 본 발명에 따른 프로테아제와 상이한 또 다른 프로테아제, 뿐만 아니라 그의 혼합물이다. 추가의 효소는 유리하게는 활성 단백질을 기준으로 각각의 경우에 1 × 10^-8 내지 5 중량%의 양으로 작용제에 함유된다. 더욱 바람직하게는, 각각의 추가의 효소는 활성 단백질을 기준으로 1 × 10^-7 내지 3 중량%, 0.00001 내지 1 중량%, 0.00005 내지 0.5 중량%, 0.0001 내지 0.1 중량%, 특히 바람직하게는 0.0001 내지 0.05 중량%의 양으로 본 발명에 따른 작용제에 함유된다. 특히 바람직하게는, 효소는 특정 얼룩 또는 지점에 대해 상승작용적 세정 성능을 나타내며, 즉 작용제 조성물에 함유된 효소는 그의 세정 성능에서 서로를 지지한다. 매우 특히 바람직하게는, 특히 상기 프로테아제 및 아밀라아제 및/또는 리파아제 및/또는 만난아제 및/또는 셀룰라아제 및/또는 펙티나아제 사이를 포함하는, 본 발명에 따라 함유된 프로테아제와 본 발명에 따른 작용제의 추가의 효소 사이에 이러한 상승작용이 존재한다. 상승작용적 효과는 상이한 효소 사이에서뿐만 아니라 1종 이상의 효소와 본 발명에 따른 작용제의 다른 성분 사이에서도 발생할 수 있다.

본원에 기재된 세정제에서, 사용되는 효소는 또한, 예를 들어 발효로부터의 동반 물질과 함께 제형화될 수 있다. 액체 제형에서, 효소는 바람직하게는 효소 액체 제형으로서 사용된다.

효소는 일반적으로 순수한 단백질의 형태로 제공되지 않고, 오히려 안정화된, 저장 가능한 및 수송 가능한 제제의 형태로 제공된다. 이러한 기성 제제는, 예를 들어 과립화, 압출 또는 동결건조를 통해 수득되는 고체 제제 또는 특히 액체 또는 겔 작용제의 경우에, 유리하게는 최대로 농축되고/거나, 낮은 물 함량을 갖고/거나, 안정화제 또는 다른 보조제가 보충된 효소의 용액을 포함한다.

대안적으로, 효소는 또한 고체 및 액체 투여 형태 둘 다에 대해, 예를 들어 바람직하게는 천연 중합체와 함께 또는 캡슐의 형태로의, 예를 들어 효소가 경화 겔에 봉입된 것 또는 효소-함유 코어가 물-, 공기- 및/또는 화학물질-불투과성 보호 층으로 코팅된 코어-쉘 유형의 것으로의 효소 용액의 분무-건조 또는 압출에 의해 캡슐화될 수 있다. 추가의 활성 성분, 예컨대 안정화제, 유화제, 안료, 표백제 또는 염료가 오버레이된(overlaid) 층에 추가로 적용될 수 있다. 이러한 캡슐은 본질적으로 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 진탕 또는 롤 과립화에 의해 또는 유동상 공정으로 적용된다. 이러한 과립은 유리하게는, 예를 들어 중합체 필름-형성제의 적용으로 인해 분진이 적고, 코팅으로 인해 저장 시 안정하다.

더욱이, 단일 과립이 복수의 효소 활성을 나타내도록 2종 이상의 효소를 함께 제형화하는 것이 가능하다.

효소는 또한 수용성 필름, 예컨대 단위 투여 형태의 세척제 및 세정제의 제형에 사용되는 것들에 혼입될 수 있다. 이러한 필름은 물과의 접촉 후에 효소의 방출을 가능하게 한다. 본원에 사용된 "수용성"은 바람직하게는 완전히 수용성인 필름 구조를 지칭한다. 바람직하게는, 이러한 필름은 (완전히 또는 부분적으로 가수분해된) 폴리비닐 알코올(PVA)로 이루어진다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 작용제가 적어도 1개의 방법 단계에서 사용되거나 또는 본 발명에 따른 프로테아제가 적어도 1개의 방법 단계에서 촉매 활성이 되어, 특히 프로테아제가 40 μg 내지 4 g, 바람직하게는 50 μg 내지 3 g, 특히 바람직하게는 100 μg 내지 2 g, 가장 바람직하게는 200 μg 내지 1 g의 양으로 또는 본원에 기재된 농도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 텍스타일 또는 경질 표면을 세정하기 위한 방법에 관한 것이다.

다양한 실시양태에서, 상기 기재된 방법은 프로테아제가 0 내지 100 ℃, 바람직하게는 0 내지 60 ℃, 보다 바람직하게는 20 내지 40 ℃, 가장 바람직하게는 25 ℃의 온도에서 사용되는 것을 특징으로 한다.

이들은 수동 및 기계적 방법 둘 다를 포함하며, 기계적 방법이 바람직하다. 텍스타일 세정을 위한 방법은 일반적으로, 복수의 방법 단계에서, 다양한 세정-활성 물질이 세정될 물질에 적용되고 노출 시간 후에 세척 제거되거나 또는 세정될 물질이 달리 세척제 또는 이러한 작용제의 용액 또는 희석물로 처리된다는 사실을 특징으로 한다. 텍스타일 이외의 모든 물질, 특히 경질 표면을 세정하기 위한 방법에 동일한 것을 적용한다. 모든 고려 가능한 세척 또는 세정 방법은 방법 단계 중 적어도 1개에서 본 발명에 따른 세척제 또는 세정제 또는 본 발명에 따른 프로테아제의 사용에 의해 증진될 수 있고, 따라서 본 발명의 실시양태를 나타낸다. 본 발명에 따른 프로테아제 및 이를 함유하는 작용제에 대해 기재된 모든 측면, 목적 및 실시양태는 또한 본 발명의 이러한 대상에 적용 가능하다. 따라서, 본 개시내용이 상기 기재된 본 발명에 따른 방법에 또한 적용된다는 것을 주목하면서, 적절한 시점에서의 본 개시내용이 이 시점에서 명백하게 참조된다.

본 발명에 따른 프로테아제는 자연적으로 이미 가수분해 활성을 갖고, 또한 달리 세정력을 갖지 않는 매질, 예를 들어 단순 완충제에서 이를 나타내기 때문에, 이러한 방법의 단일 및/또는 단독 단계는 바람직하게는 완충제 용액 중에서 또는 물 중에서 얼룩과 접촉되는 유일한 세정-활성 성분인 본 발명에 따른 프로테아제로 이루어질 수 있다. 이는 본 발명의 이러한 대상의 추가의 실시양태를 구성한다.

본 발명의 이러한 대상의 대안적 실시양태는 또한 본 발명에 따른 프로테아제가 적어도 1개의 방법 단계에서 활성이 되는, 텍스타일 원료를 처리하기 위한 또는 텍스타일 관리를 위한 방법에 의해 나타내어진다. 이들 중, 천연 구성성분을 갖는 텍스타일 원료, 섬유 또는 텍스타일을 위한, 매우 특히 울 또는 실크를 갖는 것들을 위한 방법이 바람직하다.

마지막으로, 본 발명은 또한, 예를 들어 텍스타일 또는 경질 표면으로부터의 단백질-함유 얼룩의 (개선된) 제거를 위한, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 세척제 또는 세정제에서의 본원에 기재된 프로테아제의 용도를 포괄한다. 이러한 용도의 바람직한 실시양태에서, 세척제 또는 세정제 중의 프로테아제는 세척 또는 세정 공정 전에 3일 이상, 4일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 12일 이상, 14일 이상, 21일 이상 또는 28일 이상 동안 저장된다.

본 발명에 따른 프로테아제 및 이를 함유하는 작용제에 대해 기재된 모든 측면, 목적 및 실시양태는 또한 본 발명의 이러한 대상에 적용 가능하다. 따라서, 본 개시내용이 상기-기재된 본 발명에 따른 용도에 또한 적용된다는 것을 주목하면서, 적절한 시점에서의 본 개시내용이 이 시점에서 명백하게 참조된다.

실시예

돌연변이의 개괄:

본 발명은 바실루스 푸밀루스로부터의 서브틸리신-유형 알칼리성 프로테아제에 관한 것이다. 이러한 프로테아제(서열식별번호: 1에 따른 야생형 바실루스 푸밀루스 DSM18097 프로테아제)로부터, 변이체를 무작위 돌연변이유발에 의해 생산하고, 이어서 이를 특히 개선된 세척 성능 및/또는 효소 안정성에 대해 스크리닝하였다. 이러한 방식으로, 무작위 돌연변이유발에 의해 상기-언급된 야생형 프로테아제(서열식별번호: 1)로부터 성능- 및 안정성-증진된 돌연변이체(C0C[서열식별번호: 2])를 여러 라운드로 생성하였다. 무작위 돌연변이유발의 추가의 라운드를 이 돌연변이체에 대해 설정하였다. 돌연변이체 C1-C7을 이러한 돌연변이 라운드에서 생성하였다. 따라서, 본원에 언급된 모든 돌연변이체는 또한 돌연변이체 C0C의 돌연변이를 보유한다.

사용한 세척제 매트릭스

하기 표는 세척 시험을 위해 사용한 세척제 매트릭스(상업적으로 입수 가능, 효소, 광표백제, 향료 및 염료 없음)를 명시한다.

프로테아제 활성 분석

프로테아제의 활성을 기질 숙시닐 알라닌-알라닌-프롤린-페닐알라닌-파라-니트로아닐리드(AAPFpNA; 바켐(Bachem) L-1400)로부터의 발색단 파라-니트로아닐린의 방출로써 측정한다. pNA의 방출은 410 nm에서의 흡광도의 증가를 야기하며, 그의 시간적 진행은 효소 활성의 척도이다.

25 ℃의 온도, 8.6의 pH 및 410 nm의 파장에서 측정을 수행하였다. 측정 시간은 20 내지 60초의 측정 간격으로 5분이었다.

측정 접근법:

AAPF 용액(70 mg/mL) 10 μL

트리스/HCl(0.1 M, 0.1 % 브리즈(Brij) 35를 갖는 pH 8.6) 1000 μL

희석된 프로테아제 용액 10 μL

25 ℃(410 nm)에서 5분에 걸쳐 생성된 반응속도론

저장 안정성 시험 및 결과

프로테아제를 동일한 수준의 활성으로 세척제(상기 참조) 매트릭스 내로 교반하고 30 ℃에서 저장하였다. 프로테아제에 대한 통상적인 활성 분석(suc-AAPF-pNA의 가수분해)에 의해, 프로테아제의 출발 활성 및 잔류 활성을 30 ℃에서 4주의 저장 후에 측정하였다. 가혹한 조건을 생성하기 위해, 프로테아제를 안정화제 없이 세척제 매트릭스에 저장하였다.

프로테아제를 바실루스 서브틸리스로부터의 진탕 플라스크 상등액에서 생성하였다. 이들을 동일한 수준의 활성으로 희석하였다. 붕산이 없는 50 % 세척제 매트릭스를 50 %의 적절하게 희석된 바실루스 서브틸리스 프로테아제 상등액에 첨가하고 잘 혼합하였다. 밀봉된 유리를 30 ℃에서 인큐베이션하였다. 샘플링 시점에, 소정의 양의 매트릭스/프로테아제 혼합물을 제거하고 샘플 완충제(0.1 M 트리스/HCl, pH 8.6) 중에서 실온에서 20분 동안 교반함으로써 용해시켰다. 이어서, AAPF 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.

청구되는 돌연변이체가 유리한 것으로 밝혀졌다. 활성을 30 ℃에서 4주의 저장 후에-야생형 효소와 비교하여 이미 유의하게 개선된 안정성을 갖는-출발 변이체(서열식별번호: 2에 따른 돌연변이체 1)의 잔류 활성의 %로 제시한다.

붕산의 첨가 없이, 모든 돌연변이체는 서열식별번호: 2에 따른 출발 돌연변이체에 비해 개선된 안정성을 나타냄을 알 수 있다. 모든 돌연변이체는 서열식별번호: 1에 따른 야생형에 필적하는 세척 성능을 나타내고, 즉 이들은 측정 변동 내에 있는 세척 성능의 측면에서 최대 10 % 더 불량하다(결과는 제시되지 않음).

SEQUENCE LISTING <110> Henkel AG & Co. KGaA <120> Stabilit?sverbesserte Proteasevarianten VI <130> 2020P00049WO <150> DE102020105720.2 <151> 2020-03-03 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 275 <212> PRT <213> Bacillus pumilus <400> 1 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Pro Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asn Gly Ser Thr Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Asn 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Asn Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Gln Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275 <210> 2 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Protease variant C0C <400> 2 Ala Gln Thr Val Pro Tyr Gly Ile Thr Gln Ile Lys Ala Pro Ala Val 1 5 10 15 His Ala Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asn Val Lys Val Ala Val Leu Asp 20 25 30 Thr Gly Ile His Ala Ala His Pro Asp Leu Asn Val Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Ser Phe Val Pro Ser Glu Pro Asn Ala Thr Gln Asp Phe Gln Ser His 50 55 60 Gly Thr His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asp Asn Thr Ile Gly 65 70 75 80 Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 85 90 95 Asp Arg Asn Gly Asp Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Ser Gly Ile Glu 100 105 110 Trp Ala Val Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly 115 120 125 Pro Asp Gly Ser Ala Ala Leu Lys Asn Ala Val Asp Thr Ala Asn Lys 130 135 140 Arg Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Ser Gly Ser Thr Gly 145 150 155 160 Ser Thr Ser Thr Val Gly Tyr Pro Ala Lys Tyr Asp Ser Thr Ile Ala 165 170 175 Val Ala Asn Val Asn Ser Ser Asn Val Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala 180 185 190 Gly Pro Glu Leu Asp Val Ser Ala Pro Gly Thr Ser Ile Leu Ser Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Thr Gly Thr Ser Met Ala Ser 210 215 220 Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys Asn Pro Asn 225 230 235 240 Leu Ser Asn Ser Gln Val Arg Gln Arg Leu Glu Thr Thr Ala Thr Pro 245 250 255 Leu Gly Asn Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Ala Glu Ala 260 265 270 Ala Ser Asn 275

Claims (12)

1. 그의 전체 길이에 걸쳐 서열식별번호: 1에 주어진 아미노산 서열과 적어도 70 %의 서열 동일성을 갖고, 각각의 경우에 서열식별번호: 1에 따른 넘버링을 기초로 하여
   (a) 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 바람직하게는 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 뿐만 아니라
   (b) 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 및 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개에서 바람직하게는 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터 선택되는 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환
   을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 프로테아제.
2. 제1항에 있어서,
   (1) 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 및
   (2) 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 및 224에 상응하는 위치 중 적어도 2개에서 6W/F, 89A/G, 131H/Y/F, 166M/L/I, 189T/L/I, 211N/Q 및 224A/G로부터 선택되는, 바람직하게는 6W, 89A, 131H, 166M, 189T, 211N 및 224A로부터 선택되는 아미노산 치환
   을 갖는, 프로테아제.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   (1) 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 및
   (2) (a) 위치 166 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 189T;
   (b) 위치 166, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M, 189T 및 224A;
   (c) 위치 89, 131, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 131H, 189T 및 224A;
   (d) 위치 89, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 189T 및 224A;
   (e) 위치 6, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 6W, 189T 및 224A;
   (f) 위치 166 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 211N;
   (G) 위치 6 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 6W 및 189T;
   (H) 위치 131 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 189T;
   (i) 위치 89 및 131에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 131H;
   (j) 위치 89 및 166에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 166M;
   (k) 위치 89 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 189T;
   (k) 위치 89 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 211N;
   (l) 위치 89 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 224A;
   (m) 위치 131 및 166에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 166M;
   (n) 위치 131 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 211N;
   (o) 위치 131 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 131H 및 224A; 또는
   (p) 위치 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 189T 및 224
   를 갖는, 프로테아제.
4. 제3항에 있어서, 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 9T, 130D, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 및
   (a) 위치 166 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 189T;
   (b) 위치 166, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M, 189T 및 224A;
   (c) 위치 89, 131 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 131H 및 189T;
   (d) 위치 89 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A 및 189T;
   (e) 위치 6, 189 및 224에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 6W, 189T 및 224A; 또는
   (f) 위치 166 및 211에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 166M 및 211N
   을 갖는, 프로테아제.
5. 제3항에 있어서, 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 9T, 130V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E 뿐만 아니라 위치 89, 131 및 189에 상응하는 위치에서 아미노산 치환 89A, 131H 및 189T를 갖는, 프로테아제.
6. (a) 출발 분자로서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제로부터 단일 또는 다중 보존적 아미노산 치환에 의해 수득될 수 있으며, 프로테아제는 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 바람직하게는 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 및 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 2개에서 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 갖는 것; 또는
   (b) 출발 분자로서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제로부터 단편화 또는 결실, 삽입 또는 치환 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있고 적어도 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273 또는 274개의 인접 아미노산 길이에 걸쳐 출발 분자와 매칭하는 아미노산 서열을 포함하며, 프로테아제는 위치 9, 130, 133, 144, 217, 252 및 271에 상응하는 위치에서 아미노산 치환, 바람직하게는 아미노산 치환 9T, 130D/V, 133A, 144K, 217M, 252T 및 271E; 및 위치 6, 89, 131, 166, 189, 211 또는 224에 상응하는 위치 중 적어도 1개에서 적어도 1개의 추가의 아미노산 치환을 갖는 것
   을 특징으로 하는, 프로테아제.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제를 코딩하는 핵산.
8. 제7항에 따른 핵산 또는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제를 함유하는 비-인간 숙주 세포.
9. a) 제8항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
   b) 배양 배지로부터 또는 숙주 세포로부터 프로테아제를 단리하는 단계
   를 포함하는, 프로테아제를 생산하기 위한 방법.
10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 적어도 1종의 프로테아제를 함유하는 것을 특징으로 하는 작용제, 특히 세척제 또는 세정제.
11. 제11항에 따른 작용제가 적어도 1개의 방법 단계에서 사용되는 것을 특징으로 하는, 텍스타일 또는 경질 표면을 세정하기 위한 방법.
12. 펩티드- 또는 단백질-함유 얼룩을 제거하기 위한 세척제 또는 세정제에서의 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 프로테아제의 용도.