KR20120139836A - 2＇,2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물, 이의 제조방법, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 간염 바이러스 억제제로서의 용도 - Google Patents

2＇,2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물, 이의 제조방법, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 간염 바이러스 억제제로서의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약제학에 속하며, 하기 화학식 I의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물 부류, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 화합물은 항-HBV 및 항-HCV 활성 모두를 가지며, B형 및 C형 간염 치료에 유용하다. 약물동력학 시험은 상기 화합물이 우수한 생체활성을 갖는 것으로 나타났다.

Description

2＇,2-디티아졸 비뉴클레오시드 화합물, 이의 제조방법, 이를 포함하는 약학 조성물 및 이의 간염 바이러스 억제제로서의 용도{2',2-DITHIAZOL NON-NUCLEOSIDE COMPOUNDS, PREPARATION METHODS, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND USES AS HEPATITIS VIRUS INHIBITORS THEREOF}
본 발명은 약제학에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 B형 및 C형 간염 치료에 사용될 수 있는 항-HBV(B형 간염 바이러스) 및 항-HCV(C형 간염 바이러스) 활성을 갖는 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물 부류, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
바이러스성 간염은 현재까지 치료법상 국제적으로 어려운 문제로 인식된다. 또한, 어떤 부류의 간염은 심각한 감염성을 갖는 가장 일반적이고 유해한 것이다. 일반적으로, 간염을 일으키는 바이러스는 주로 5가지 타입, 즉, A, B, C, D 및 E 타입으로 분류된다. 이 중에서, A형 및 E형 간염 바이러스는 장에 감염하며, 수원(water source) 또는 식품에서 이의 오염은 유행성 감염을 일으킬 수 있다. 하지만, A형 및 E형 간염은 만성 간염으로 발달하거나 간경화를 유도하지 않으며, 이로부터 회복되는 환자들은 평생 면역력을 얻는다. B, C 및 D형 간염 바이러스는 혈액을 통해 전염되며, 일부 환자들은 부부 또는 엄마와 아기 사이의 감염과 같이 환자의 타액, 정액, 젖 등과 밀접한 접촉에 의해 감염된다. 간염 바이러스 중에서, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 D형 간염 바이러스(HDV)의 급성 감염의 80% 이상은 만성으로 진행되며, 이 중에서 약 20%는 만성 감염에 걸린 경우 아마도 간경화로 발달되며, 그리고 이 중에서 약 1% 내지 5%는 간암으로 발달된다.
중국은 바이러스성 간염의 높은 질병률을 가지며, 중국에 1억 2천만 명의 B형 간염 바이러스 보균자가 있으며, 바이러스성 간염에 의해 직접적으로 야기되는 경제적 손실은 해마다 약 300억 내지 500억 RMB이다. 한편, C형 간염 바이러스는 전세계적으로 유행하는 경향을 가지며, 유럽, 아메리카 및 일본에서 말기 간 질환에 대한 주 원인이다. WHO의 통계에 따르면, HCV의 전세계 감염률은 약 3%이며, 이에 따라 약 1억 7천만 명의 사람들이 HCV에 감염되어 있으며, 그리고 해마다 약 3만 5천 명의 새로운 케이스의 C형 간염이 발달된다. 중국에서 전국적인 혈청역학 조사 결과, 일반 집단에서 항-HCV 항체를 가진 자의 비율은 3.2%이었다.
HBV 및 HCV는 모두 간염 바이러스에 속하며, 유사한 감염 경로를 갖지만, 각각 다른 바이러스속에 속한다. HBV는 헤파드나바이러스과에 속하며, 부분 이중-스트랜드 환형 DNA로 구성되는 반면에, HCV는 플라비바이러스과에 속하며, 양성-센스 단일-스트랜드 RNA 바이러스이다. 현재, 임상적 항-HBV 약물은 주로 라미부딘(lamivudine), 팜시클로버(famciclovir), 로부카비어(lobucavir), 아데포비어 데피복실(adefovir dipivoxiil), FTC(2',3'-dideoxy-5-fluoro-3'-thiacytidine), FMAU(1-(2-fluoro-5- methyl-beta,L-arabinofuranosyl)uracil), FDDC(5-fluoro-2',3'-dideoxycytidine), BMS 200475(9-[4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-methylenecyclopentyl]guanine), 엔티카버(enticavir) 등과 같이 주로 뉴클레오시드 약물이다. HBV 및 HCV는 다른 바이러스속에 속하기 때문에, 현존하는 항-HBV 약물은 C형 간염을 치료하는데 사용될 수 없다. 현재까지, HCV에 대해 영향을 주지 않는 소분자 약물이 임상적으로 사용될 수 있다. 현재, HCV에 대해 가장 효과적인 치료 요법은 인터페론과 리바비린과 같은 인터페론과 광범위 항바이러스제의 복합 투여이다. 하지만, 이러한 복합 투여는 심한 부작용과 함께 단지 40% 미만의 지속성 치유 효과를 갖는다.
따라서, 국내외 약학 과학자들은 바이러스성 간염 치료를 위한 약물을 연구 및 개발하는데 항상 중점을 두고 있다.
본 출원에 앞선 국제출원인 제 PCT/CN2007/001861호(국제출원 공개 제 WO 2007/147336호)에는 헤테로시클릭 비뉴클레오시드 화합물 부류 및 이의 항-HBV 생물활성이 개시되어 있으며, 그리고 상기 화합물들이 B형 간염 바이러스 치료에 유용하다는 것이 개시되어 있다. 그러나, 후속적인 연구 결과, 상기 화합물들의 일부는 저조한 약물동력학적 파라미터, 특히 생체이용률을 나타내는 것으로 나타났다. 예를 들어, 수컷 랫트(10mg/kg)에서 화합물 W28F의 경구 생체이용률은 단지 2.80%이다. 따라서, 상기 화합물들에 대해 이들의 강한 항바이러스 활성을 유지하면서 이들의 생체이용률을 향상시키도록 상기 화합물들을 더욱 개질시키는 것이 시급히 요구된다.
본 출원인은 본래 구조에 기초한 상기 화합물들 중에서 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물의 티아졸 고리의 5-위치 측쇄에 히드록실기, 할로겐 원자 또는 이중 결합을 편입시켰다. 획득된 화합물은 본래 화합물과 동일한 항-HBV 생체활성을 가질 뿐만 아니라, 효과적으로 향상된 생체이용률을 나타낸다. 광범위한 연구 결과, 이러한 새로운 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물은 항-HBV 생체활성 뿐만 아니라 항-HCV 생체활성을 갖는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 새로운 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 활성 성분으로서 본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 포함하는 HBV 및/또는 HCV 억제제의 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 B형 바이러스 간염 및/또는 C형 바이러스 간염 치료용 약물 제조시 본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 사용하는 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 B형 바이러스 간염 또는 C형 바이러스 간염의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 화학식 I의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물이 제공되며,
Figure pct00001
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이며, 바람직하게, R1은 H, 메틸 또는 에틸이며, R2는 H이며,
R3는 적어도 하나의 히드록실기로 치환된 C1-C6 알킬, 적어도 하나의 C1-C6 알콕실기로 치환된 C1-C6 알킬, 적어도 하나의 할로겐 원자로 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 적어도 하나의 히드록실기 또는 적어도 하나의 할로겐 원자로 치환된 C2-C6 알케닐이며, 바람직하게, R3는 한 개 또는 두 개의 히드록실기로 치환된 C1-C5 알킬, 한 개 또는 두 개의 C1-C4 알콕실기로 치환된 C1-C5 알킬, 하나의 불소, 염소 또는 브롬 원자로 치환된 C1-C5 알킬, 메틸프로페닐, 메틸올프로페닐 또는 플루오메틸프로페닐이며, 그리고 가장 바람직하게, R3는 한 개 또는 두 개의 히드록실기로 치환된 C4 알킬, 한 개 또는 두 개의 C1-C4 알콕실기로 치환된 C4 알킬, C4 플루오로알킬, 2-메틸프로페닐, 2-메틸올프로페닐 또는 2-플루오메틸프로페닐이며,
X는 할로겐 원자, 바람직하게 F, 그리고 가장 바람직하게 4-위치에 있는 F이다.
하기 정의가 본 명세서에 주어진다. 알킬은 선형 또는 분지형 알킬을 포함하며, 알케닐은 선형 또는 분지형 알케닐을 포함하며, 그리고 할로겐은 F, Cl, Br 및 I를 포함한다.
본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물은 가장 바람직하게
Figure pct00002
로 구성되는 그룹으로부터 선택된 것이다.
본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물은 출발물질로서 국제출원 제 PCT/CN2007/001861호(국제출원공개 제 WO 2007/147336호)에 개시된 하기 스킴(스킴 I)에 따라 합성될 수 있는 중간물(4)로부터 제조될 수 있다:
Figure pct00003
스킴 I
상기 식에서, R1 및 R2는 상기 정의된 바와 같으며, 그리고 R4는 C1-C6 알킬이다.
구체적으로, 중간물 2-브로모-티아졸(1)은 활성 아연 분말과 반응하여 아연 제제가 생성되고, 그 다음 이는 다른 2-브로모-티아졸 중간물(3)과 반응하여 팔라듐 아세테이트의 존재하에서 네기시(Negishi) 결합 반응을 통해 중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)가 생성된다.
중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)로부터 출발하여, 측쇄가 히드록실, 알콕실 또는 할로겐 원자(불소 원자와 같은)로 치환된 다양한 중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4a-4i)가 일련의 그룹 변환(group transformation)을 통해 제조될 수 있으며, 이는 R4가 이소부틸기인 경우에 나타낸 바와 같으며(스킴 II), 본 발명에서 어떠한 특정 제한을 두지 않는다.
중간물 메틸 5-이소부틸-2',2-비스티아졸(4) 카르복실레이트는 용매로서 카본 테트라클로라이드에서 NBS(N-브로모숙시닐이민)와 반응하여 브롬화물을 생성하며, 이는 질산은으로 처리되어 중간물 히드록실-치환 화합물(4a)이 생성된다. 그 다음, 중간물(4a)은 DAST(디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드)로 처리되어 중간물 불소-치환 화합물(4b)이 생성된다.
상기 브롬화물은 염기로서 DBU(1,8-디아자비시클로[5,4,0]-운덱-7-엔)로 처리되어 중간물 올레핀(4c)이 생성되며, 이는 또한 m-CPBA로 처리된 후에 에폭시 화합물로 전환된다. 에폭시 화합물의 에폭시 고리는 Pd-C의 존재하에서 수소화에 의해 선택적으로 열려 중간물 히드록실-치환 화합물(4d)이 생성되며, 이는 DAST로 처리되어 중간물 불소-치환 화합물(4e)을 생성한다.
중간물 올레핀(4c)은 이소프로판올과 물의 혼합 용매에서 포타슘 오스메이트에 의해 촉매화되어 비스-히드록실화를 통해 중간물 비스히드록실 화합물(4f)을 생성한다.
또한, 중간물 올레핀(4c)은 용매로서 디옥산에서 셀레늄 디옥시드와 반응하여 알데히드 중간물을 생성할 수 있으며, 이는 소듐 보로히드라이드에 의해 환원되어 중간물 히드록실 화합물(4g)을 생성한다. 그 다음, 중간물(4g)은 DAST로 처리되어 중간물 불소-치환 화합물(4h)을 생성한다.
또한, 중간물 히드록실 치환 화합물(4g)은 NaH의 존재하에서 할로겐화 탄화수소 R5X(여기서 R5는 C1-C6 알킬임)에 의해 알킬화되어 중간물 알콕실-치환 화합물(4i)을 생성할 수 있다.
Figure pct00004
스킴 II
중간물(4)로부터 출발하여, 본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물은 하기 절차(스킴 III, IV 또는 V)를 통해 합성될 수 있다:
Figure pct00005
스킴 III
Figure pct00006
스킴 IV
Figure pct00007
스킴 V
상기 식에서, 스킴 III, IV 및 V에서 R1, R2, R3 및 X의 정의는 상기 정의한 바와 같다.
구체적으로, 중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)는 상승된 온도에서 에틸렌 글리콜의 용매에서 친핵제로서 할로겐화 벤질아민과 직접 반응하여 본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 생성할 수 있다.
변형적으로, 중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)는 가수분해를 통해 이에 상응하는 산으로 전환될 수 있으며, 그 다음 이는 옥살릴클로라이드와 반응하여 아실 클로라이드를 생성하며, 그리고 그 다음 아실 클로라이드는 할로겐화 벤질아민과 반응하여 본 발명의 2',2-비스티아졸 헤테로시클릭 화합물 부류를 생성한다.
변형적으로, 중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)는 가수분해를 통해 이에 상응하는 산으로 전환될 수 있으며, 이는 EDCI(1-에틸-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드)와 같은 축합제의 존재하에서 할로겐화 벤질아민과 반응하여 본 발명의 2',2-비스티아졸 헤테로시클릭 화합물 부류를 생성한다.
본 발명에 의해 제공되는 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 헤테로시클릭 화합물의 새로운 부류는 HBV 및 HCV 모두에 대해 활성을 나타내며, 이에 따라 B형 간염 및 C형 간염의 치료에 사용될 수 있다. 약물동력학 시험 결과, 이러한 화합물들은 우수한 생체이용률을 가지며, 이에 따라 B형 간염 및/또는 C형 간염 치료용 약물을 제조하는데 사용될 수 있는 것으로 나타났다.
본 발명은 본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물의 치료학적 유효량을 B형 간염 또는 C형 간염에 걸린 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 B형 간염 또는 C형 간염 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 활성 성분으로서 하나 이상의 본 발명의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물의 치료학적 유효량을 포함하는 B형 간염 및/또는 C형 간염에 대한 약학 조성물을 제공하며, 그리고 이는 분산제, 부형제, 붕괴제, 항산화제, 감미제, 코팅제 등과 같은 약학적으로 허용되는 보조제를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 약제학 분야에서 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있으며, 정제, 코팅 정제, 캡슐, 분말 등과 같은 다양한 통상적인 투여 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명은 HBV 및 HCV의 복제를 효과적으로 억제할 수 있어, 이에 따라 B형 간염 및/또는 C형 간염의 치료에 사용될 수 있는 새로운 부류의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 디자인 및 합성한다. 본 발명자에 의해 국제 출원 제 PCT/CN2007/001861호(국제 공개 제 WO 2007/147336호)에 앞서 개시된 유사 화합물들과 비교하여, 본 발명의 새로운 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물은 항-HBV 활성을 유지하면서 항-HCV 활성을 나타내며, 그리고 측쇄 상에 이중 결합, 히드록실, 알콕실, 할로겐 원자 등과 같은 극성 기의 편입에 기인한 기존 화합물들의 낮은 생체이용률의 결점을 극복하며, 이에 따라 우수한 개발 가능성을 갖는다.
본 발명은 특정 실시예와 관련하여 상세하게 설명된다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.
제조예
하기 실시예에서, NMR 스펙트럼은 Mercury-Vx 300M 스펙트로미터(Varian)에서 획득되었다. NMR 보정: δ H 7.26ppm(CDCl3). 질량 스펙트럼은 Agilent 1200 Quadrupole LC/MS instrument에서 획득되었다. 대부분의 시약들은 Shanghai Chemical Company에 의해 공급되었다. 박층 크로마토그래피용 실리카겔 플래이트(모델: HSGF 254)는 Huiyou silica development company(Yantai, Shandong)에 의해 제조되었다. 화합물들을 정제하기 위한 정상 컬럼 크로마토그래피에 사용된 실리카겔(모델: zcx-11, 200-300메쉬)은 Qingdao haiyang chemical plant의 지사에 의해 제조되었다.
제조예 1 중간물 메틸 2',2- 비스티아졸 -4- 카르복실레이트의 합성
(1) 메틸 5-이소부틸-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00008

활성 Zn 분말(84g)을 2L 3구경 병에 첨가하고, 새로운 THF(600ml)를 이에 첨가하였다. 그 혼합물을 약 60℃의 내부 온도로 가열하였을 때, 무수 THF(60ml)에 용해된 2-브로모티아졸(200g) 용액을 약 3-4시간에 걸쳐 적가하였다. 환류하에 반응이 계속되었다. 그 결과 형성된 아연 제제를 무수 톨루엔 용액(1.2L)에 용해된 메틸 2-브로모-5-이소부틸티아졸-4-카르복실레이트(233g), 팔라듐 아세테이트(9.4g) 및 트리페닐포스핀(22g)으로 이루어진 용액에 옮기고, 80-85℃로 가열하고, 이 온도로 1-1.5시간 동안 유지하였다. 실온으로 냉각한 후, 5% HCl 수용액(2L)을 반응 혼합물에 첨가하여 유기상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합 유기상을 5% HCl 수성 용액으로 세정하고, 농축하여 브라운-블랙 오일을 얻었으며, 이를 메탄올에 재결정화하여 메틸 5-이소부틸-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 황색 고형물로서 얻었다(162g). 몰 수율: 69%.
1HNMR(CDCl3)：δ 1.00(s, 3H), 1.02(s, 3H), 2.03(m, 1H), 3.17-3.19(d, J = 7.2Hz, 2H), 3.96(s, 3H), 7.46-7.47(d, J = 3.3Hz, 1H), 7.87-7.88(d, J = 3.3Hz, 1H).
ESI-MS (m/z): 305.1 (M+Na)+(C12H14N2NaO2S2에 대해 산출됨: 305.04).
(2) 메틸 5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00009

메틸 5-이소부틸-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(2.2g)를 카본 테트라클로라이드(60ml)와 디클로로메탄(20ml)의 혼합물에 용해하였다. NBS(N-브로모-숙신이미드, 1.8g) 및 AIBN(2,2-아조비스이소부티로니트릴, 0.2g) 첨가 후, 그 결과 형성된 혼합물을 3시간 동안 가열하여 환류시켰다. 반응 완료는 TLC에 의해 확인되었다. 농축으로부터 형성된 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기상을 물로 세정하고, 건조 및 농축하였다. 그 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸 5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(2.8g)를 정량적인 수율로 황색 고형물로서 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.03 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.23 (d, J = 6.6Hz, 3H), 2.24 (m, 1H), 3.98 (s, 3H), 6.11 (d, J = 7.2Hz, 1H), 7.51 (d, J = 3.3Hz, 1H), 7.90 (d, J = 3.3Hz, 1H).
(3) 메틸 5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00010

메틸 5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(235mg)를 메탄올(7ml)에 용해하고, 물(3ml) 및 AgNO3(435mg)를 이에 첨가하였다. 반응은 48시간 동안 실온에서 수행되었다. TLC 검출 결과, 대부분의 원료 물질들은 실질적으로 고갈되었다. 반응 혼합물을 여과하였다. 여과물의 농축으로 형성된 잔류물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 완전히 추출하였다. 혼합 유기상을 농축하고, 그 결과 형성된 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸 5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(81mg)를 거의 백색 고형물로서 얻었다.
몰 수율: 42%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.00 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.20 (d, J = 6.6Hz, 3H), 2.21 (m, 1H), 3.96 (s, 3H), 5.32 (t, J = 5.4Hz, 1H), 7.50 (d, J = 3.3Hz, 1H), 7.90 (d, J = 3.3Hz, 1H).
(4) 메틸 5-[1-(2-메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00011

메틸 5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(1.2mg)를 톨루엔(50ml)에 용해하고, DBU(1,8-디아자비시클로[5,4,0]운덱-7-엔, 1.5g)를 이에 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 가열하여 환류시켰다. 반응 완료는 TLC에 의해 확인되었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 각각, 물, 5% HCl 수성 용액 및 포화 염수로 세정하였다. 건조 및 농축하여 얻어진 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 메틸 5-[1-(2-메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(0.73g)를 황색 고형물로서 얻었다.
몰 수율: 79%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.06 (s, 6H), 3.98 (s, 3H), 7.31 (t, J = 1.2Hz, 1H), 7.47 (d, J =3.0Hz, 1H), 7.89 (d, J = 3.3Hz, 1H).
(5) 메틸 5-[2-(3,3-디메틸 옥시라닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00012

메틸 5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(426mg)를 클로로포름(25ml)에 용해하고, m-CPBA(메타클로로퍼벤조산, 600mg)를 이에 첨가하였다. 반응을 실온에서 3시간 동안 수행하였다. 반응 완료는 TLC에 의해 확인되었다. 반응 혼합물을 각각, 포화 소듐 비카보네이트 수용액 및 포화 소듐 비설피트 수용액으로 세정하였다. 유기상을 분리, 건조 및 농축하였다. 그 결과 형성된 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 백색 결정 분말로서 메틸 5-[2-(3,3-디메틸옥시라닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(300mg)를 얻었다. 몰 수율: 67%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.23 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 4.42 (s, 1H), 7.48 (d, J= 3.0Hz, 1H), 7.89 (d, J = 3.3Hz, 1H).
(6) 메틸 5-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00013

메틸 5-[2-(3,3-디메틸옥시라닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(200mg)를 메탄올(150ml)에 용해하고, 촉매 Pd-D(10%, 10mg)를 이에 첨가하였다. 수소를 혼합물에 버블링하고, 반응기 내의 공기를 완전히 대체하였다. 그 다음, 반응을 실온에서 5시간 동안 수행하였다. 반응 완료는 TLC에 의해 확인하였다. 미반응 수소 가스가 질소 가스로 대체된 후, 반응 혼합물을 여과하고, 그 여과물을 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 대부분 정량적인 수율로 거의 백색 고형물로서 메틸 5-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(200mg)를 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.34 (s, 6H), 3.51 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 7.47(d, J = 3.0Hz, 1H), 7.89(d, J = 3.0Hz, 1H).
(7) 메틸 5-(1,2-디히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00014

5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(500mg)를 이소프로필 알코올(20ml)과 물(15ml)의 혼합 용매에 용해하였다. 포타슘 오스메이트(25mg) 및 N-메틸 모폴린-N-옥시드(NMO, 50%)(550mg)를 이에 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 수행하였다. 다음날에, 반응 완료를 TLC에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 포화 소듐 비설피트 수용액으로 담금질하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합 유기상을 포화 염수로 세정하고, 건조, 여과 및 농축하여 연한 갈색 오일로서 메틸 5-(1,2-디히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(494mg)를 얻었다. 몰 수율: 87%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.21 (s, 3H), 1.53 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 4.32 (s, 1H), 7.49 (d, J= 3.0Hz, 1H), 7.89 (d, J = 3.3Hz, 1H).
(8) 메틸 5-[1-(2-포밀프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00015

메틸 5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(50mg)를 디옥산(5ml)에 용해하고, 셀레늄 옥시드(30mg)를 이에 첨가하였다. 그 혼합물을 3시간 동안 가열하여 환류하였다. TLC 검출 결과, 원료 물질들은 실질적으로 고갈된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 농축하고, 디클로로메탄에 용해된 잔류물의 용액을 정제를 위해 실리카겔 컬럼(석유 에테르/에틸 아세테이트=5/1(v/v))에 이동시켜 황색 고형물로서 메틸 5-[1-(2-포밀프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(31mg)를 얻었다. 몰 수율: 60%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.10 (s, 3H), 3.97 (s, 3H), 7.57 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.96 (d, J= 3.0Hz, 1H), 8.49 (d, J = 1.5Hz, 1H), 9.69(s, 1H).
(9) 메틸 5-(3-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00016

메틸 5-[1-(2-포밀프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(122g)를 메탄올(80ml)과 DMF(10ml)의 혼합 용매에 첨가하고, 촉매 Pd-C(10%, 10mg)를 이에 첨가하였다. 반응기 내의 공기는 수소 가스로 완전히 대체되고, 반응은 밤새 수행되었다. 다음날, 반응 완료를 TLC에 의해 확인하였다. 미반응 수소를 질소 가스로 대체하고, 그 반응 혼합물을 여과하였다. 여과물을 농축하고, 잔류물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 물로 3회 세정하고, 그 다음 염수로 세정하였다. 유기상을 건조, 여과 및 농축하여 대부분 정량 수율로 거의 무색 오일로서 메틸 5-(2-포밀프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(123mg)를 얻었다.
상기에서 제조된 산물(123mg)을 메탄올(25ml)에 용해하고, 아이스 배스 하에서 소듐 보로하이드라이드(300mg)를 이에 첨가하였다. 반응을 동일한 온도에서 15분간 수행한 후, 아이스 배스를 제거하였다. 그 다음, 반응을 실온에서 3시간 동안 수행하였다. 반응 완료를 TLC에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 완전히 추출하였다. 혼합 유기상을 포화 염수로 세정하고, 건조, 여과 및 농축하여 거의 무색 오일로서 메틸 5-(3-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(32mg)를 얻었다. 조 생성물을 직접 후속 반응에 정제 없이 사용하였다.
(10) 메틸 5-[1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00017

메틸 5-[1-(2-포밀프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(300mg)를 메탄올(300ml)에 용해하였다. 소듐 보로하이드라이드(200mg)를 아이스 배스 하에서 이에 첨가하였다. 반응을 동일한 온도에서 15분간 수행한 후, 아이스 배스를 제거하였다. 반응을 실온에서 1.5시간 동안 수행하였다. 반응 완료를 TLC에 의해 확인하였다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 완전히 추출하였다. 혼합 유기상을 포화 염수로 세정하고, 건조, 여과 및 농축하여 황색 오일로서 메틸 5-[1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(198mg)를 얻었다. 몰 수율: 66%. 조 생성물은 정제 없이 후속 반응에 직접 사용되었다.
(11) 메틸 5-(2-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00018

메틸 5-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(63mg)를 디클로로메탄(5ml)에 용해하였다. 디에틸아미노설퍼 트리플루오라이드(DAST, 0.1ml)를 아이스 배스 하에서 상기 용액에 적가하였다. 그 반응을 동일한 온도에서 1시간 동안 수행하였다. 반응 완료는 TLC에 의해 확인되었다. 반응물을 포화 소듐 비카보네이트 수용액으로 담금질하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합 유기상을 건조, 여과 및 농축하고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고형물로서 메틸 5-(2-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(20mg)를 얻었다. 몰 수율: 33%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.39 (s, 3H), 1.46 (s, 3H), 3.69-3.77 (d, J = 23.1Hz,1H), 3.97 (s, 3H), 7.47 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.90 (d, J = 3.0Hz, 1H).
(12) 메틸 5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00019

메틸 5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 원료 물질로서 사용하여 메틸 5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 제조예 1(11)에 기재된 방법으로 제조하였다. 몰 수율: 42%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.07 (d, J = 6.9Hz, 6H), 2.24 (m, 1H), 3.99 (s, 3H), 6.21-6.39 (2d, J = 5.4, 17.1Hz, 1H), 7.51 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.92 (d, J = 3.3Hz, 1H).
ESI-MS (m/z): 323.1 (M+Na)+ (C12H13FN2NaO2S2에 대해 산출됨: 323.03).
(13) 메틸 5-(1-(3-플루오로-2-메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00020

메틸 5-(1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 원료 물질로서 사용하여 메틸 5-(1-플루오로-2-메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 제조예 1(11)에 기재된 방법으로 제조하였다. 몰 수율: 83%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.07 (s, 3H), 2.24 (m, 1H), 3.97 (s, 3H), 4.89-5.05 (d, J =46.8Hz, 1H), 7.51 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.61 (s, 1H), 7.92 (d, J = 3.3Hz, 1H).
ESI-MS (m/z): 321.0 (M+Na)+ (C12H11FN2NaO2S2에 대해 산출됨: 321.01).
(14) 메틸 5-(1-메톡시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00021

메틸 5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(55mg) 및 요오드메탄을 DMF(10ml)에 용해하였다. NaH(60%, 50mg)를 아이스 배스 하에서 상기 용액에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온으로 상승시키고, 6시간 동안 반응시켰다. 반응 완료는 TLC에 의해 확인되었다. 반응 혼합물을 포화 암모늄 클로라이드 수용액으로 담금질하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합 유기상을 각각, 물 및 포화 염수로 세정하였다. 유기상을 무수 마그네슘 설페이트로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 그 결과 형성된 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 무색 오일로서 메틸 5-(1-메톡시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(52mg)를 얻었다. 몰 수율: 86%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.95 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.6Hz, 3H), 2.05 (m, 1H), 3.40 (s, 3H), 3.98 (s, 3H), 5.07 (d, J = 6.0Hz, 1H), 7.49 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.91 (d, J = 3.0Hz, 1H).
(15) 이소프로필 5'-메틸-5-이소부틸-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트

2-브로모-5-메틸티아졸 및 이소프로필 2-브로모-5-이소부틸티아졸-4-카르복실레이트를 원료 물질로 사용하여 제조예 1(1)에 기재된 방법으로 황색 고형물로서 이소프로필 5'-메틸-5-이소부틸-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 얻었다. 몰 수율: 66%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.99 (d, J = 6.6Hz, 6H), 1.41 (d, J = 6.3Hz, 6H), 1.98 (m, 1H), 2.53 (s, 3H)，3.10 (d, J = 7.2Hz, 2H), 5.28 (m, 1H), 7.51 (s, 1H).
(16) 이소프로필 5'-메틸-5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00023

이소프로필 5'-메틸-5-이소부틸-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 원료 물질로 사용하여 제조예 1(2)에 기재된 방법으로 거의 정량 수율로 황색 오일로서 이소프로필 5'-메틸-5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비티아졸-4-카르복실레이트를 얻었다. 그 산물을 후속 반응에 직접 사용하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.92 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.20 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.44 (m, 6H), 2.24 (m, 1H), 2.54 (s, 3H)，5.28 (m, 1H), 6.04 (d, J = 6.6Hz, 3H)，7.54 (s, 1H).
(17) 이소프로필 5'-메틸-5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00024

이소프로필 5'-메틸-5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 원료 물질로 사용하여 제조예 1(3)에 기재된 방법으로 황색 고형물로서 이소프로필 5'-메틸-5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비티아졸-4-카르복실레이트를 얻었다. 몰 수율: 13%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.97 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.05 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.44 (d, J =6.3Hz, 6H), 2.10 (m, 1H), 2.54 (s, 3H)，3.28 (d, J = 5.7Hz, 1H), 5.26 (m, 1H), 7.53 (s, 1H).
(18) 이소프로필 5'-메틸-5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00025

제조예 1(11)에 기재된 방법으로 정량 수율로 황색 고형물로서 이소프로필 5'-메틸-5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.04 (d, J = 6.6Hz, 6H), 1.25 (m, 6H), 2.20 (m, 1H), 2.55 (s, 3H)，5.28 (m, 1H), 6.15-6.33 (2d, J = 5.4, 17.1Hz, 1H), 7.55 (s, 1H).
(19) 이소프로필 5'-메틸-5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트
Figure pct00026

이소프로필 5'-메틸-5-(1-브로모-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트를 제조예 1(4)에 기재된 방법으로 황색 고형물로서 이소프로필 5'-메틸-5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비티오아졸-4-카르복실레이트를 얻었다. 몰 수율: 40%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ1.55 (s, 6H), 2.03 (s, 6H), 2.54 (s, 3H)，5.27 (m, 1H), 7.20 (s, 1H)，7.54 (s, 1H).
제조예 2 2',2- 디티아졸론 비뉴클레오시드 화합물의 합성
(1) N-(p-플루오로벤질)-5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(391-1)
Figure pct00027

메틸 5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(300mg)를 에틸렌 글리콜(3ml)에 용해하고, p-플루오로벤질아민(125mg)을 이에 첨가하였다. 반응을 질소 분위기 하에서 150℃에서 밤새 수행하였다. 반응의 완료는 TLC에 의해 확인되었다. 반응 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합 유기상을 물, 5% HCl 수용액 및 포화 염수로 각각 세정한 후, 이를 건조하고 농축하였다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 오일로서 N-(p-플루오로벤질)-5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(17mg)를 얻었다. 몰 수율: 50%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.93 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.18 (d, J = 6.6Hz, 3H), 2.20 (m, 1H), 4.63 (d, J = 6.0Hz, 2H), 4.89 (t, J = 7.8Hz, 1H), 5.65 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.05(m, 2H), 7.34(m, 2H), 7.46(d, J = 3.0Hz, 1H), 7.89(d, J = 3.0Hz, 1H), 7.94(m, 1H).
(2) N-(p-플루오로벤질)-5-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(391-2)
Figure pct00028

제조예 2(1)에 기재된 방법에 따라 N-(p-플루오로벤질)-5-(2-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 황색 오일로서 제조하였다. 몰 수율: 55%
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.28 (s, 6H), 3.52 (s, 2H), 3.97 (s, 1H), 4.61 (d, J = 6.0Hz, 2H), 7.04 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.45 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.88(d, J = 3.0Hz, 1H), 7.89(s, 1H).
(3) N-(p-플루오로벤질)-5-(3-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(391-3)
Figure pct00029

제조예 2(1)에 기재된 방법에 따라 N-(p-플루오로벤질)-5-(3-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 황색 오일로서 제조하였다. 몰 수율: 16%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.10 (d, J = 6.9Hz, 3H), 2.04 (br s, 1H), 3.24 (dd, J = 5.4, 14.4Hz, 2H), 3.34 (m, 1H), 3.54 (m, 1H), 3.71 (dd, J = 6.0, 14.1Hz, 2H), 3.67 (m, 2H), 7.05 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.46 (d, J = 3.3Hz, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.88(d, J = 3.3Hz, 1H).
(4) N-(p-플루오로벤질)-5-(1,2-디히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(407)
Figure pct00030

제조예 2(1)에 기재된 방법에 따라 황색 오일로서 N-(p-플루오로벤질)-5-(1,2-디히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 제조하였다. 몰 수율: 26%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.32 (s, 6H), 4.61 (d, J = 6.0Hz, 1H), 5.69 (s, 1H), 7.07 (m, 2H), 7.37 (m, 2H), 7.45 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.89 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.90 (s, 1H).
(5) N-(p-플루오로벤질)-5-[1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(389)
Figure pct00031

메틸 5-[1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(120mg)를 메탄올(20ml)과 물(10ml)의 혼합 용매에 용해하고, 리튬 히드록시드 모노하이드레이트(50mg)를 이에 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 수행하였다. 반응이 완료되면, 그 혼합물을 감압하에 농축하여 대부분의 메탄올을 제거하였다. 그 결과 형성된 수상을 5% HCl 수용액으로 산성으로 조절하여 불투명하게 하였다. 그 수상을 디클로로메탄으로 완전히 추출하고, 획득된 유기상을 무수 마그네슘 설페이트로 건조하고, 여과 및 농축하여 거의 정량적인 수율로 황색 고형물로서 5-[1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복시산(110mg)을 획득하였다. 그 산물을 직접 후속 반응에 사용하였다.
상기로부터 획득된 5-[1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복시산(62mg)을 DMF(N,N-디메틸포름아미드)(20ml)에 용해하고, p-플루오로벤질아민(140mg), EDCI(30mg) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 30mg)을 이에 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 수행하였다. 반응이 완료되면, 반응 혼합물을 물로 희석하고, 에틸 아세테이트로 완전히 추출하였다. 그 결과 형성된 유기상을 각각, 물, 5% HCl 수용액 및 포화 염수로 세정하고, 무수 마그네슘 설페이트로 건조하고, 여과 및 농축하였다. 조 생성물을 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르/아세톤=4/1으로 용출됨)로 정제하여 황색 고형물로 N-(p-플루오로벤질)-5-[1-(3-히드록시-2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 얻었다. 몰 수율: 32%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.05 (s, 3H), 4.28 (s, 2H), 4.62 (d, J = 6.0Hz, 2H), 7.04 (m, 2H), 7.38 (m, 2H), 7.48 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.83 (m, 1H), 7.89 (d, J = 3.6Hz, 1H)，7.93 (s, 1H).
ESI-MS (m/z): 412.0 (M+Na)+ (C18H16FN3NaO2S2에 대해 산출됨: 412.06).
(6) N-(p-플루오로벤질)-5'-메틸-5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(Me-391-1)
Figure pct00032

이소프로필 5'-메틸-5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2'2-비스티아졸-4-카르복실레이트 원료 물질로 사용하여, 제조예 2(5)에 기재된 방법에 따라 가수분해, 응축 및 컬럼 크로마토그래피(석유 에테르/아세톤=5/1)를 통해 무색 오일로서 N-(p-플루오로벤질)-5'-메틸-5-(1-히드록시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 얻었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.92 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.01 (d, J = 6.6Hz, 3H), 2.17 (m, 1H), 2.53 (s, 3H), 4.62 (d, J = 6.0Hz, 2H), 4.83 (t, J = 7.8Hz, 1H), 5.76 (d, J = 8.4Hz, 1H), 7.05 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.54 (s, 1H), 7.89 (d, J = 3.6Hz, 1H)，7.93 (m, 1H).
(7) N-(p-플루오로벤질)-5-[1-(2-메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(373)
Figure pct00033

메틸 5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복실레이트(276mg)를 메탄올(10ml)에 용해하고, 물(10ml) 및 리튬 히드록시드 모노하이드레이트(100mg)를 이에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 밤새 반응시켰다. 반응 완료는 다음날에 TLC로 확인하였다. 그 혼합물을 감압하에 농축하여 대부분의 메탄올을 제거하였다. 그 결과 형성된 수상을 5% HCl 수용액으로 산성이 되도록 조절하고, 디클로로메탄으로 완전히 추출하였다. 혼합 유기상을 물로 세정하고, 건조, 여과 및 농축하여 거의 정량적인 수율로 황색 고형물(275mg)로서 5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복시산을 얻었다. 그 산물을 후속 반응에 직접 사용하였다.
그 결과 형성된 5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-카르복시산(257mg)을 디클로로메탄(15ml)에 용해하고, 한 방울의 DMF 및 옥살릴 클로라이드(0.15ml)를 이에 첨가하였다. 반응을 실온에서 3시간 동안 수행하고, 농축 후 황색 고형물을 얻었다. 상기 얻어진 고형물을 에틸 아세테이트(15ml)에 용해하여 형성된 용액을 에틸 아세테이트(15ml)에 용해된 p-플루오로벤질아민(180mg) 용액과 물(10ml)에 용해된 소디움 비카보네이트(200mg) 용액의 혼합물에 아이스 배스하에서 적가하였다. 이 혼합물을 자연적으로 온도가 상승하게 하고, 밤새 반응시켰다. 반응 완료는 다음날에 TLC에 의해 확인하였다. 유기상을 분리하고, 수상을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 혼합 유기상을 5% HCl 수용액 및 포화 염수로 각각 세정하고, 건조, 여과 및 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 황색 고형물로서 N-(p-플루오로벤질)-5-1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(284mg)를 얻었다. 두 단계의 몰 수율은 77%이었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.06 (s, 6H), 4.62 (d, J = 6.0Hz, 2H), 7.04 (m, 2H), 7.37 (m, 2H), 7.45 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.85 (m, 1H), 7.89 (d, J = 3.0Hz, 1H).
(8) N-(p-플루오로벤질)-5-(2-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(393-2)
Figure pct00034

제조예 2(7)에 기재된 방법에 따라 황색 오일로서 두 단계 정량 수율로 N-(p-플루오로벤질)-5-(2-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.40 (s, 3H), 1.47 (s, 3H), 3.90 (d, J = 24.0Hz, 2H), 4.60 (d, J= 6.6Hz, 2H), 7.07 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.44 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.87 (m, 1H), 7.89 (d, J =3.0Hz, 1H).
ESI-MS (m/z): 416.1 (M+Na)+ (C18H17F2N3NaOS2에 대해 산출됨: 416.07).
(9) N-(p-플루오로벤질)-5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(393-1)
Figure pct00035

제조예 2(7)에 기재된 방법에 따라 정량적인 수율로 무색 오일로서 N-(p-플루오로벤질)-5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2'2-비스티아졸-4-포름아미드를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.06 (t, J = 6.6Hz, 6H), 2.26 (m, 1H), 4.63 (m, 2H), 6.47-6.65(2d, J = 5.4, 46.5Hz, 1H), 7.05 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.48 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.77 (m, 1H), 7.91 (d, J = 3.0Hz, 1H).
ESI-MS (m/z): 416.1 (M+Na)+ (C18H17F2N3NaOS2에 대해 산출됨: 416.07).
(10) N-(p-플루오로벤질)-5'-메틸-5-[1-(2-메틸프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(Me-373)
Figure pct00036

제조예 2(7)에 기재된 방법에 따라 황색 고형물로서 N-(p-플루오로벤질)-5'-메틸-5-[1-(2-메틸 프로페닐)]-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 제조하였다. 두 단계의 몰 수율: 93%.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.04 (s, 6H), 2.53 (s, 3H), 4.62 (d, J = 6.3Hz, 2H), 7.04 (m, 2H), 7.35 (m, 2H), 7.53 (s, 1H), 7.66 (s, 1H), 7.84 (m, 1H).
(11) N-(p-플루오로벤질)-5'-메틸-5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(Me-393-1)
Figure pct00037

제조예 2(7)에 기재된 방법에 따라 거의 무색 오일로서 N-(p-플루오로벤질)-5'-메틸-5-(1-플루오로-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 제조하였다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.05 (m, 6H), 2.25 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 4.61 (m, 2H), 6.46-6.64 (2d, J = 5.4, 46.8Hz, 1H), 7.05 (m, 2H), 7.33 (m, 2H), 7.55 (s, 1H), 7.76 (m, 1H).
(12) N-(p-플루오로벤질)-5-[1-(2-플루오로메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(391-F)
Figure pct00038

제조예 2(7)에 기재된 방법에 따라 거의 백색 고형물로서 N-(p-플루오로벤질)-5-[1-(2-플루오로메틸프로페닐)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 제조하였다. 두 단계의 몰 수율은 68%이었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.09 (s, 3H), 4.63 (d, J = 6.0Hz, 2H), 4.89 (s, 1H), 5.05 (s, 1H), 7.05 (m, 2H), 7.36 (m, 2H), 7.50 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.88 (m, 1H), 7.92 (d, J = 3.0Hz, 1H), 8.00 (s, 1H).
ESI-MS (m/z): 414.0 (M+Na)+ (C18H15F2N3NaOS2에 대해 산출됨: 414.05).
(13) N-(p-플루오로벤질)-5-(1-메톡시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드(405-1)
Figure pct00039

제조예 2(7)에 기재된 방법에 따라 황색 고형물로서 N-(p-플루오로벤질)-5-(1-메톡시-2-메틸프로필)-2',2-비스티아졸-4-포름아미드를 제조하였다. 두 단계의 몰 수율은 73%이었다.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 0.97 (d, J = 6.6Hz, 3H), 1.02 (d, J = 6.6Hz, 3H), 2.07(m, 1H), 3.42 (s, 3H), 4.62 (d, J = 6.3Hz, 2H), 5.36 (d, J = 6.0Hz, 1H), 7.05 (m, 2H), 7.34 (m, 2H), 7.47 (d, J = 3.0Hz, 1H), 7.79 (m, 1H), 7.90 (d, J = 3.3Hz, 1H).
항-간염 바이러스 실험예
항바이러스 실험예 1 항-B형 간염 바이러스( HBV ) 활성 어세이
1. 실험 목적:
시료 화합물의 세포독성(CC50) 및 HBV-DNA(IC50)의 복제 수준에 미치는 시료 화합물의 영향(IC50) 검출을 포함하는, 시료의 항-HBV 활성 어세이를 HBV의 전체 게놈으로 안정하게 형질전환된 HepG2.2.15 세포에서 수행하였다.
2. 실험 원리:
HBV의 전체 게놈으로 안정하게 형질전환된 인간 간암 암종 세포 HepG2.2.15 세포주는 배양 중에 배양 상층액에서 B형 간염 바이러스의 (DNA를 함유하는) 비로좀(virosomes)을 안정하게 분비할 수 있다. 시료 약물의 항바이러스 활성 및 세포독성은 항바이러스 약물이 부재한 대조군의 양을 기준으로하여 항바이러스 약물의 개입하에서 세포에 의해 배양 상층액으로 분비된 바이러스 DNA의 양을 검출함으로써 측정될 수 있다. 실시간 형광 정량 PCR 어세이를 채용하여 HBV-DNA 복제의 50%가 억제되는 시료 약물의 농도(IC50)를 측정하였으며, MTT 어세이를 채용하여 50% 세포독성이 일어나는 시료 약물의 농도(CC50)를 측정하였다.
3. 실험용 시료의 제조:
시료 약물은 사용전 실험에 소정 농도(400μM)를 갖는 용액으로 제조하였다. 6개의 희석 농도를 각 시편 약물에 대해 시험하였다. 임상 항-B형 간염 바이러스 약물 라미부딘(Lamivudine)을 각 실험에서 반응이 정상적인지 아닌지를 검출하도록 실험에 양성 대조군으로 사용하였다.
4. 실험 프로토콜:
a) 실험 방법 및 배양 상층액의 수집
HepG2.2.15 세포를 5 × 105cells/ml로 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 2일째 날에, 시료 약물을 첨가하였다. 상기와 동일한 농도를 갖는 배양 배지 및 시료 약물로 정기적으로 갈아준 후, 8일 째에, 배양 상층액을 수집하여 시험하였다. 96-웰 플레이트에 있는 세포들에, MTT(5mg/ml)를 첨가하였다. 4시간 후, MTT 세포용해 용액을 첨가하였다(100μl/well). 다음날, 마이크로플레이트 리더에서 OD570을 리딩하였다. HepG2.2.15 세포에서 시료 약물의 세포독성, 시료 약물이 세포 성장에 미치는 영향 및 세포의 50%가 사멸하는 시료 약물의 농도(CC50)를 OD값에 따라 산출하였다.
b) 형광 정량 PCR 어세이를 이용한 배양 상층액에서 HBV-DNA의 양의 검출
적당한 양의 배양 상층액을 등용성 바이러스 추출물에 첨가하고 균일하게 혼합하였다. 그 결과 얻어진 혼합물을 가열한 다음, 실온에서 10,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 얻어진 상층액의 적당한 양을 PCR 증폭을 수행하는데 사용하였으며, 한편으로는 HBV-DNA의 4개의 표준 시료를 표준 곡선을 생성하는데 사용하였다. HBV-DNA의 복제에 대한 다양한 농도에서의 각 시료 약물의 억제는 바이러스 DNA의 검출된 복제값에 따라 산출된 다음, 시료 약물의 절반 억제율을 산출하여 이의 IC50을 구하였다.
PCR 실험용 프라이머:
P1: 5'ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3'
P2: 5'ACAGTGGGGAAAGCCCTACGAA3'.
PCR 실험용 프로브:
5'TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTTG3'
4. 실험 결과:
Figure pct00040
주:
CC50은 세포들의 50%가 사멸하는 시료 약물의 농도이며, HepG2.2.15 세포의 성장에 미치는 약물의 영향을 나타낸다.
IC50은 HBV의 복제의 50%가 억제되는 시료 약물의 농도이다.
SI는 시료 약물의 생체활성 선택 지수이며, 2이상의 SI값은 약물이 유효하다는 것을 나타내고, SI값이 클수록 보다 효과적인 약물임을 나타낸다.
5. 결과 및 디스커션:
양성 대조군(라미부딘)의 결과는 본 시험법 및 실험 결과가 신뢰할 수 있는 것으로 나타났다. 세포 수준에서의 상기 시험 결과로부터, 얻어진 본 발명의 화합물은 HBV-DNA의 복제에 대해 이러한 부류의 화합물의 우수한 생체활성이 잘 유지되며, W28F(N-파라플루오로벤질-5-이소부틸-2',2-비티아졸-4-포름아미드)에 상당하는 항-HBV 복제 활성을 가지며, 0.2-33.3μM의 절반 유효 억제 상수(IC50)를 갖는 것을 알 수 있다.
항바이러스 실험예 2 C형 간염 바이러스( HCV )의 복제에 대한 활성 어세이
1. 실험 프로토콜:
항-HCV 활성 어세이는 인핸스드 그린 플로로센트 단백질(EGFP)과 함께 HCV(J399E)로 감염된 Huh7.5.1 세포(WUHAN INSTITUTE of VIROLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES에 의해 기증됨)를 사용하여 수행되었다. 녹색 형광 강도의 변화를 마이크로플레이트에서 기록하고, 이와 동시에 세포독성을 측정하여 HCV의 복제 활성에 미치는 화합물의 영향을 평가하였다.
시험하고자 하는 화합물들을 DMSO에 용해하여 시험전에 모액을 제조하였다. 사용시, 모액을 10% FBS(Hyclone사(Logan, Utah, USA)에서 구입한 소태아혈청)를 함유한 DMEM(GibcoBRL사(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)로부터 구입한 Dulbecco's Modified Eagle Media)으로 소정 농도로 희석하였다. 세포 배양을 위한 DMSO의 최종 농도는 0.25%(V/V, 부피 대 부피)이하이었으며, 이러한 DMSO 농도하에서 세포의 성장은 영향을 받지 않는다.
양성 대조군: 리바비린(Sigma/Aldrich). 이를 DMSO에 용해하여 모액을 제조하고, 사용전에 -20℃에 보관하였으며, 사용시 소정 농도로 희석하였다.
105cells/ml 농도의 Huh7.5.1 세포(10% FBS, DMEM)를 웰당 100μl로 96-웰 플레이트(Costar 3904)에 접종하였다. 24시간 후, 배양 상층액을 흡출하고, 0.1 MOI로 50μl의 바이러스 상층액을 첨가하였다. 8시간 후, 50μl의 시험 약물을 첨가하고, 100μl의 배양 배지를 보충하였다. 72시간 배양 후, 상층액을 흡출하고, 형광 마이크로플레이트 리더(Ex=488nm, Em=516nm)에서 리딩하였다. 그 다음, 각 웰에 20μl의 MTT(5mg/ml) 및 추가 50μl의 배지를 첨가하였다. 4시간 후, 100μl의 MTT 세포 용해 용액을 첨가하였다. 6시간 후, 570nm의 파장에서 리딩을 수행하였다.
2. 실험 결과:
Figure pct00041
주:
CC50은 세포들의 50%가 사멸하는 시료 약물의 농도이며, Huh7.5.1 세포의 성장에 미치는 약물의 영향을 나타낸다.
IC50은 HCV의 복제의 50%가 억제되는 시료 약물의 농도이다.
SI는 시료 약물의 생체활성 선택 지수이며, 2이상의 SI값은 약물이 유효하다는 것을 나타내고, SI값이 클수록 보다 효과적인 약물임을 나타낸다.
3. 결과 및 디스커션:
상기 결과는 상기 대표적인 화합물들의 일부의 시험관내 투여가 HCV-감염된 Huh7.5.1 세포에서 HCV의 복제를 현저히 억제하였으며, 상기 화합물들의 IC50은 1.5-21.3μM 범위이며, 이는 양성 대조군 리바비린보다 더 우수한 것으로 나타났다.
약물동력학 실험예 3 랫트에서 시험관내 약물동력학 시험
검사 프로토콜:
위내 투여: 200-250g 체중의 건강한 수컷 3마리 SD 랫트에 20mg/kg 및 10mg/kg의 투여량으로 시료 약물을 투여하였다. 랫트들은 투여전 12시간 동안 절식되었으며, 물을 자유로이 섭취하도록 하였다. 투여후, 0.25h, 0.5h, 1.0h, 2.0h, 3.0h, 4.0h, 5.0h, 7.0h, 9.0h 및 24h에 랫트의 교후부 정맥 총(retrobulbar venous plexus)으로부터 0.3ml의 부피로 정맥혈을 얻고, 헤파린처리된 튜브에 넣고, 3500rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하였으며, 이를 시험전까지 -20℃에 보관하였다.
정맥내 주사: 200-250g 체중의 건강한 수컷 3마리 SD 랫트에 10mg/kg 및 5.0mg/kg의 투여량으로 시료 약물을 투여하였다. 랫트들은 투여전 12시간 동안 절식되었으며, 물을 자유로이 섭취하도록 하였다. 투여후, 5분, 15분, 0.5h, 1.0h, 2.0h, 3.0h, 4.0h, 5.0h, 7.0h, 9.0h 및 24h에 랫트의 교후부 정맥 총(retrobulbar venous plexus)으로부터 0.3ml의 부피로 정맥혈을 얻고, 헤파린처리된 튜브에 넣고, 3500rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하였으며, 이를 시험전까지 -20℃에 보관하였다.
검사 결과:
투여량이 정상화된 후, W28F(10mg/kg)는 AUC0 -t에 따른 산출로 2.80%의 평균 경구 생체이용률을 가졌다. 동일한 조건하에서, 화합물 373(20mg/kg)은 6.9%의 평균 경구 생체이용률을 가졌으며, 화합물 391-2(20mg/kg)는 76.5%의 평균 경구 생체이용률을 가졌다. 화합물 373 및 화합물 391-2는 측쇄상에 치환되지 않은 화합물 W28F에 비해 우수하였다.

Claims (10)

  1. 화학식 I의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물:
    Figure pct00042

    상기 식에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬이며,
    R3는 적어도 하나의 히드록실기로 치환된 C1-C6 알킬, 적어도 하나의 C1-C6 알콕실기로 치환된 C1-C6 알킬, 적어도 하나의 할로겐 원자로 치환된 C1-C6 알킬, C2-C6 알케닐, 또는 적어도 하나의 히드록실기 또는 적어도 하나의 할로겐 원자로 치환된 C2-C6 알케닐이며, 그리고
    X는 할로겐 원자임.
  2. 제1항에 있어서,
    R1은 H, 메틸 또는 에틸이며, 그리고 R2는 H인, 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    R3는 한 개 또는 두 개의 히드록실기로 치환된 C1-C5 알킬, 한 개 또는 두 개의 C1-C4 알콕실기로 치환된 C1-C5 알킬, 하나의 불소, 염소 또는 브롬 원자로 치환된 C1-C5 알킬, 메틸프로페닐, 메틸올프로페닐 또는 플루오메틸프로페닐인, 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3는 한 개 또는 두 개의 히드록실기로 치환된 C4 알킬, 한 개 또는 두 개의 C1-C4 알콕실기로 치환된 C4 알킬, C4 플루오로알킬, 2-메틸프로페닐, 2-메틸올프로페닐 또는 2-플루오메틸프로페닐인, 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    X는 F이며, 바람직하게는 4-위치에 있는 F인, 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    Figure pct00043

    로 구성되는 그룹으로부터 선택된 것인, 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물.
  7. 하기 스킴 III, 스킴 IV 또는 스킴 V에 따른, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물의 제조방법:
    Figure pct00044

    스킴 III
    중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)는 상승된 온도에서 용매로서 에틸렌 글리콜에서 친핵제로서 할로겐화 벤질아민과 반응하여 상기 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 생성하거나, 또는
    Figure pct00045

    스킴 IV
    중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)는 가수분해를 통해 이에 상응하는 산으로 전환되며, 이는 옥살릴클로라이드와 반응하여 아실 클로라이드를 생성하며, 그리고 그 다음 상기 아실 클로라이드는 할로겐화 벤질아민과 반응하여 상기 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 생성하거나, 또는
    Figure pct00046

    스킴 V
    중간물 메틸 2',2-비스티아졸카르복실레이트(4)는 가수분해를 통해 이에 상응하는 산으로 전환되며, 이는 축합제로서 EDCI(1-에틸-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드 하이드로클로라이드)의 존재하에서 할로겐화 벤질아민과 반응하여 상기 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물을 생성하며,
    상기 스킴에서, R1, R2, R3 및 X의 정의는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 바와 동일함.
  8. 활성 성분으로서 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물의 치료학적 유효량 및 선택적으로 약학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, B형 간염 바이러스 및/또는 C형 간염 바이러스에 대한 약학 조성물.
  9. B형 간염 바이러스 및/또는 C형 간염 바이러스의 치료에 사용되는 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물의 용도.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 2',2-비스티아졸 비뉴클레오시드 화합물의 치료학적 유효량을 B형 간염 또는 C형 간염에 걸린 대상자에게 투여하는 것을 포함하는 B형 간염 또는 C형 간염 치료 방법.
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