KR20120123075A - Ａβ42 생산을 감소시키기 위한 신규한 조성물 및 알쯔하이머 질환(ＡＤ)의 치료에서의 이들의 용도 - Google Patents

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우데이 삭세나
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Abstract

Aβ42의 생산을 감소시키고, 그리고 알쯔하이머 질환 및 다른 신경퇴화 장애들의 치료를 위한 신규한 소분자 화합물들, 이들을 제조하는 방법 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물들이 기술된다.

Description

Ａβ42 생산을 감소시키기 위한 신규한 조성물 및 알쯔하이머 질환(ＡＤ)의 치료에서의 이들의 용도 {NOVEL COMPOSITIONS FOR REDUCING Aβ42 PRODUCTION AND THEIR USE IN TREATING ALZHEIMER'S DISEASE (AD)}
알쯔하이머 질환(Alzheimer's Disease ;AD)은 이 질환의 발병을 야기하는 특히 신경독성(neurotoxic)인 Aβ42 펩티드를 갖는 아밀로이드 베타 펩티드(amyloid beta peptides ; Aβ 펩티드)라 불리우는 작은 소수성 펩티드의 과도한 생성으로 특징지워진다. 여기에서 본 발명자들은 Aβ42의 생산을 감소시키고, 그리고 AD, 치매(dementia) 및 허혈성 뇌졸증(ischemic stroke), 파킨슨씨병(Parkinson's disease) 등과 같은 다른 신경퇴화 장애(neurodegenerative disorders)들을 치료하는 데 사용될 수 있는 일련의 소분자 화합물들, 소분자들의 제조방법 및 이들을 포함하는 약제학적 조성물들을 기술한다.
알쯔하이머 질환(AD)은 특정한 신경 세포(neuronal cells)들의 과도한 손상과 연관되는 퇴행성 중추신경계 장애(degenerative central nervous system disorder)이며, 임상적으로는 점진적으로 깊은 정신적 황폐화(profound mental deterioration) 및 극단적으로 사망을 야기하는 기억(memory), 인지능력(congnition), 추리능력(reasoning), 판단능력(judgment) 및 감정적 안정성(emotional stability)의 점진적인 상실로 특징지워진다. 이 질환은 현재 미합중국에서만 4백만명(four million individuals) 정도의 사람들이 앓고 있다. 현재까지, 이 질환을 정지시키거나 또는 역전시키는 치료법은 존재하지 않으며, 이는 현재 연간 100,000명의 사망을 야기하고 있다.
알쯔하이머 질환을 앓고 있는 개체의 두뇌는 신경퇴화(neuronal degeneration) 및 아밀로이드 반점(amyloid plaques) 및 신경섬유의 다발성 병변(neurofibrillary tangles) 등과 같이 다양하게 언급되는 특정의 병변(lesions)들을 나타낸다. 현재, 알쯔하이머 질환의 유일한 확진(definitive diagnosis)은 사후 뇌(post-mortem brains) 내의 이들 반점들의 존재이다. 아밀로이드 연쇄(amyloid cascade) 또는 아밀로이드 가설(amyloid hypothesis)이라고도 불리우는 알쯔하이머 질환에 대한 지배적인 과학적 가설에 따르면, 특정의 아밀로이드 생성 펩티드(amyloidogenic peptide), 베타-아밀로이드 펩티드(beta-amyloid peptides)의 점진적인 중추신경계 침착(progressive cerebral deposition)이 알쯔하이머 질환의 발병에서 유해한 역할을 하고, 그리고 치매의 인지적 증상 및 개시(onset)에 수년 또는 심지어는 수십년 선행할 수 있는 것으로 여겨지고 있다(문헌 Hardy J, Selkoe DJ, Science. 2002 297(5580): 353-6 참조). 따라서, 이들 펩티드들의 생산의 방지가 알쯔하이머 질환의 치료에 대한 약학산업의 주요한 촛점이 되고 있다.
상기 Aβ 펩티드들은 신경 및 다른 세포들 내에서 발견되는 부모 막-수송 단백질(parent trans-membrane protein)인 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein ; APP)의 과도한 진행(excessive processing)의 결과로서 생성된다(문헌 Selkoe, DJ. Trends Cell Biol. 1998, 8(11):447-53 참조). 아밀로이드 반점들은 베타-세크레타아제(beta-secretase)인 아스파틸 프로테아제(aspartyl protease)에 의해 촉매되는 순차적 단백질분해 및 후속하는 프레세닐린-의존적 감마-세크레타아제 개열(presenilin-dependent gamma-secretase cleavage)에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)로부터 유도되는 40 및 42개의 아미노산 펩티드들(각각 Aβ40 및 Aβ42라고 불리움)로 주로 구성된다. Aβ42가 Aβ40에 비해 더 소수성이고 그리고 덜 가용성이며, 아밀로이드 반점들 내에서 우월한 종이다. Aβ42가 응집(aggregation) 및 침착(deposition)되는 경향이 있으며, 따라서 시냅스 손실(synaptic loss)과 마찬가지로 세포독성을 더 야기하는 경향이 있다. 따라서 약물 개발에 대한 모든 주의가 임의의 다른 베타 아밀로이드 펩티드 종들 보다 오히려 Aβ42 생성을 억제하는 데 집중되고 있다(문헌 Selkoe DJ, Schenk D. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003; 43:545-84 참조).
Aβ42의 과도한 생성을 촉발할 수 있는 많은 이유들 및 위험 인자들이 존재한다. 특히 노화(ageing), 두부 손상/트라우마(head injury/trauma), 아포 이4/4 캐리어(Apo E4/4 carriers) 등과 같은 유전학, 심혈관 질환 및 제2형 당뇨병들 모두 개체가 Aβ42의 보다 높은 생산 쪽으로 향하도록 하며 그에 따라 알쯔하이머 질환을 개시하는 경향을 가질 수 있다. 강화된 Aβ42 생산 및 개시에 긴밀하게 얽매일 수 있는 2개의 분자상 사건들인 질병의 진행과 발병들이 신경(neurons)들에 의한 반응성 산소종(reactive oxygen species ; ROS)의 생성 및 감소된 에너지 생산들이다(문헌 Moreira PI et al., CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 2008; 7:3-10 참조). ROS의 생성 및 그에 따른 세포상 손상/반응(cellular damage/response)이 감수성의 신경들 내에서 보여지는 너무 많은 뚜렷한 알쯔하이머 질환 병리학에 기여한다고 여겨진다. 신경들에 의한 에너지 생산에서의 결함이 이 질병 과정에서의 가장 초기에 관측되었다. 신경들에서의 에너지 결핍은 세포 내에서의 에너지의 분자상 형태인 아데노신 3인산(ATP)의 합성에서의 감소로 정의된다.
이들 사건들, 즉 Aβ42 생성을 감소시키는 방법으로서 그리고 그 질병에 대한 치료법으로서의 신경의 산화성 스트레스(neuronal oxidative stress) 및 에너지 결핍 둘 다를 표적으로 하는 약물 또는 소분자 화합물들은 알려지지 않았다. 본 발명에 있어서 본 발명자들은 이들 사건들 둘 다를 동시적으로 목표로 하는 일련의 화합물들을 기술하고 그리고 이러한 화합물이 Aβ42 생성을 감소시킬 수 있고 그리고 또한 질병의 동물 모델에서의 인지능력을 개선시킬 수 있다는 것을 나타내고 있다.
이제 신규하고도 세포 내에서의 Aβ의 생산을 저해/감소시킬 수 있는 피리딘 카르복실산 유도체(pyridine carboxylic derivatives)들이 발견되었다.
본 발명은 하기 화학식 (I)의 신규한 화합물
Figure pct00001
또는 그의 약제학적으로 수용가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체(stereoisomer)에 관한 것으로서,
여기에서 X는 O, NR", S 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌으로부터 선택될 수 있고;
L은 하나의 결합이거나 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌, 바람직하게는 치환되거나 또는 미치환된 탄소수 1 내지 4의 알킬렌이 될 수 있고, 그리고 바람직하게는 치환체들은 Ra로부터 선택될 수 있고;
X 및 L은 그들에 부착된 위치들과 함께 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴(heterocyclyl)로 형성될 수 있고;
Y는 하나의 결합, -C(O)-, -S(O)2-, NR" 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌이 될 수 있고,
R1은 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬이 될 수 있고;
R2는 H, (CH2)nOR', 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 알케닐, 치환되거나 또는 미치환된 알카노일, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 아랄킬, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬로부터 선택될 수 있고;
R3는 H, OH, 할로겐, NR", C(O)2R", C(O)NR", 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 알코일(alkoyl) 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬이 될 수 있고;
Ra는 H, OR', C(O)2R', C(O)R', NR', N(NR")NR', SR', S02R', SO2NR', NSO2R', C(O)NR', (CH2)nOR', (CH2)nSR', 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴이 될 수 있고;
n은 0 내지 5의 정수가 될 수 있고;
R' 및 R"들은 독립적으로 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물 또는 화합물들의 조합 또는 약제학적으로 수용가능한 염의 형태, 입체이성질체 또는 화학식 (I)의 전구약물의 약제학적으로 유효한 양 및 약제학적으로 수용가능한 담체(carrier)를 포함하는 약제학적 조성물(pharmaceutical composition)을 제공한다.
본 발명은 또한 알쯔하이머 질환(AD), 치매 및 허혈성 뇌졸증, 파킨슨씨병 등과 같은 다른 신경퇴화 장애들을 치료 또는 중증도(severity)를 완화(lessening)시키는데 유용한 화합물들을 제공한다.
본 발명은 또한 알쯔하이머 질환(AD), 치매 및 허혈성 뇌졸증, 파킨슨씨병 등과 같은 다른 신경퇴화 장애들을 치료 또는 중증도를 완화시키는 방법들을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 화합물 또는 그의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
상기 화학식 (I)의 화합물들의 약제학적으로 수용가능한 염들이 또한 고려된다. 유사하게, 상기 화학식 (I)의 화합물들의 수화물(hydrates)들을 포함하는 약제학적으로 수용가능한 용매화물(solvates)들이 고려된다.
상기 화학식 (I)이 거울상이성질체(enantiomers)들 및 부분입체이성질체(diastereomers)들을 포함하여 구조적으로 모든 입체이성질체들을 포함하며, 여기에 기술된 종의 화학적 구조로부터 고려될 수 있다는 것은 이해되어야 할 것이다.
상기 화학식 (I)의 화합물들의 전구약물들 또한 고려된다.
하나의 구체예에 따르면, X가 O인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, X가 N인 화합식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, L이 하나의 결합인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, L이 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, Y가 -C(O)-인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R1이 치환되거나 또는 미치환된 알킬인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R2가 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, CH2CH=CH2인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R3가 H인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, X 및 L가 그들에 부착된 위치들과 함께 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴을 형성할 수 있는 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, Ra가 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, C(O)2R', -C3H6SCH3, 치환되거나 또는 미치환된 페닐, 치환되거나 또는 미치환된 벤질 및 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, n이 3인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R' 및 R"가 독립적으로 H, CH3 및 4-알릴-6-메톡시페닐(4-allyl-6-methoxyphenyl)인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
도 1은 생쥐에서의 신규한 대상체 인지 시험에서 인지 기능을 개선시키는 화합물 9의 효과를 나타내는 그래프이다. 신규하고 그리고 익숙한 대상체를 탐색하는 데 소요된 시간에 대한 비히클(vehicle)(2㎖/㎏, 경구(p.o.))+비히클(1㎖/㎏, 복강내(i.p.)), 비히클(2㎖/㎏, 경구)+스코폴라민(Scopolamine)(1㎖/㎏, 복강내), 도네페질(Donepezil)(1㎖/㎏, 복강내)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내), 화합물-9(10㎎/㎏, 경구)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내), 화합물-9(30㎎/㎏, 경구)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내) 및 화합물-9(90㎎/㎏, 경구)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내)의 효과 평균(±표준오차(S.E.M)).
도 2는 생쥐에서의 신규한 대상체 인지 시험에서 인지 기능을 개선시키는 화합물 9의 효과를 나타내는 그래프이다. 신규하고 그리고 익숙한 대상체를 탐색하는 데 소요된 시간에 대한 비히클(2㎖/㎏, 경구)+비히클(1㎖/㎏, 복강내), 비히클(2㎖/㎏, 경구)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내), 도네페질(1㎖/㎏, 복강내)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내), 화합물-9(0.3㎎/㎏, 경구)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내), 화합물-9(1㎎/㎏, 경구)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내) 및 화합물-9(3㎎/㎏, 경구)+스코폴라민(1㎖/㎏, 복강내)의 효과 평균(±표준오차).
본 발명은 하기 화학식 (I)의 신규한 화합물
Figure pct00002
또는 그의 약제학적으로 수용가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체에 관한 것으로서,
여기에서 X는 O, NR", S 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌으로부터 선택될 수 있고;
L은 하나의 결합이거나 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌, 바람직하게는 치환되거나 또는 미치환된 탄소수 1 내지 4의 알킬렌이 될 수 있고 그리고 바람직하게는 치환체들은 Ra로부터 선택될 수 있고;
X 및 L은 그들에 부착된 위치들과 함께 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴을 형성할 수 있고;
Y는 하나의 결합, -C(O)-, -S(O)2-, NR" 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌이 될 수 있고,
R1은 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬이 될 수 있고;
R2는 H, (CH2)nOR', 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 알케닐, 치환되거나 또는 미치환된 알카노일, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 아랄킬, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬로부터 선택될 수 있고;
R3는 H, OH, 할로겐, NR", C(O)2R", C(O)NR", 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 알코일 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬이 될 수 있고;
Ra는 H, OR', C(O)2R', C(O)R', NR', N(NR")NR', SR', S(0)2R', S(O)2NR', NS(O)2R', C(O)NR', (CH2)nOR', (CH2)nSR', 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴이 될 수 있고;
n은 0 내지 5의 정수가 될 수 있고;
R' 및 R"들은 독립적으로 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 화학식 (I)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물 또는 화합물들의 조합 또는 약제학적으로 수용가능한 염의 형태, 입체이성질체의 약제학적으로 유효한 양 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 알쯔하이머 질환(AD), 치매 및 허혈성 뇌졸증, 파킨슨씨병 등과 같은 다른 신경퇴화 장애들을 치료 또는 중증도를 완화시키는데 유용한 화합물들을 제공한다.
본 발명은 또한 알쯔하이머 질환(AD), 치매 및 허혈성 뇌졸증, 파킨슨씨병 등과 같은 다른 신경퇴화 장애들을 치료 또는 중증도를 완화시키는 방법들을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 본 발명의 화합물 또는 그의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
상기 화학식 (I)의 화합물들의 약제학적으로 수용가능한 염들이 또한 고려된다. 유사하게, 상기 화학식 (I)의 화합물들의 수화물들을 포함하는 약제학적으로 수용가능한 용매화물들이 고려된다.
상기 화학식 (I)이 거울상이성질체들 및 부분입체이성질체들을 포함하여 구조적으로 모든 입체이성질체들을 포함하며, 여기에 기술된 종의 화학적 구조로부터 고려될 수 있다는 것은 이해되어야 할 것이다.
상기 화학식 (I)의 화합물들의 전구약물들 또한 고려된다.
하나의 구체예에 따르면, X가 O인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, X가 N인 화합식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, L이 하나의 결합인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, L이 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, Y가 -C(O)-인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R1이 치환되거나 또는 미치환된 알킬인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R2가 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, CH2CH=CH2인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R3가 H인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, X 및 L가 그들에 부착된 위치들과 함께 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴을 형성할 수 있는 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, Ra가 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, C(O)2R', -C3H6SCH3, 치환되거나 또는 미치환된 페닐, 치환되거나 또는 미치환된 벤질 및 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, n이 3인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, R' 및 R"가 독립적으로 H, CH3 및 4-알릴-6-메톡시페닐인 화학식 (I)의 화합물이 제공된다.
하나의 구체예에 따르면, 화학식 (II)의 조합, 화학식 (II)의 약제학적 조성물이 제공되며,
Figure pct00003
이는 피리딘카르복실산, X-L-Y 및 메톡시벤젠 유도체 같은 3개의 구성요소 (a), (b), (c) 모두를 포함하며, 여기에서 X 및 Y는 H 또는 상기 화학식 (I)에 대하여 정의된 기들을 나타내며, 알쯔하이머 질환을 치료하는 데 사용된다.
하나 또 그 이상의 구체예에 따르면, 화학식 (III)의 조합, 화학식 (III)의 약제학적 조성물이 제공되며,
Figure pct00004
이는 화학식 (III)의 두 구성요소들을 포함하며, 여기에서 상기 두 구성요소들 (a) 및 (d)들은 피리딘카르복실산, 메톡시벤젠 유도체등과 같은 것들이며; 여기에서 X 및 Y는 H 또는 상기 화학식 (I)에 대하여 정의된 기들을 나타내며, 알쯔하이머 질환, 치매 및 허혈성 뇌졸증, 파킨슨씨병 등과 같은 다른 신경퇴화 질병들을 치료하는 데 사용된다.
하나 또는 그 이상의 구체예에 따르면, 화학식 (IV)의 조합, 화학식 (IV)의 약제학적 조성물이 제공되며,
Figure pct00005
이는 피리딘카르복실산 유도체, 메톡시벤젠 유도체 같은 두 구성요소들을 포함하며, 여기에서 X 및 Y는 H 또는 상기 화학식 (IV)의 두 구성요소들을 포함하는 상기 화학식 (I)에 대하여 정의된 기들을 나타내며, 알쯔하이머 질환, 치매 및 다른 신경퇴화 질병들을 치료하는 데 사용된다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 화합물들은
Figure pct00006
Figure pct00007
들로 나타내어진다.
용어 "알킬(alkyl)"은 오로지 탄소 및 수소 원자들로 이루어지고, 불포화를 포함하지 아니하고, 1 내지 8개의 탄소원자들을 갖는 직쇄 또는 분지된(branched) 탄화수소쇄 라디칼(hydrocarbon chain radical)을 의미하며, 이는 상기 분자의 나머지(rest)에 단일결합으로 부착되며, 예를 들면, 메틸(methyl), 에틸(ethyl), 노말-프로필(n-propyl), 1-메틸에틸(이소프로필)(1-methylethyl(isopropyl)), 노말-부틸(n-butyl), 노말-펜틸(n-pentyl) 및 1,1-디메틸에틸(3차-부틸)(1,1-dimethylethyl(t-butyl)들이다.
용어 "알케닐(alkenyl)"은 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 지방족 탄화수소기를 의미하며 또한 이는 2 내지 10개의 탄소원자들을 갖는 직쇄 또는 분지된 쇄이며, 예를 들면, 에테닐(ethenyl), 1-프로페닐(1-propenyl), 2-프로페닐(알릴)(2-propenyl(allyl)), 이소-프로페닐(iso-propenyl), 2-메틸-1-프로페닐(2-methyl-l-propenyl), 1-부테닐(1-butenyl) 및 2-부테닐(2-butenyl)들이다.
용어 "알카노일기(alkanoyl group)"는 선형 또는 분지된 지방족 아실기(acyl group)(바람직하게는 탄소수 2 내지 6의 알카노일기) 또는 2 내지 10개의 탄소원자들을 포함하는 방향족 아실기를 나타내는 데 사용된다. 예들에는 아세틸기(acetyl group), 프로피오닐기(propionyl group), 피발로일기(pivaloyl group), 부티릴기(butyryl group), 이소부티릴기(isobutyryl group), 발레릴기(valeryl group) 및 벤조일기(benzoyl group)들이 포함되며, 아세틸기가 선호된다.
용어 "사이클로알킬(cycloalkyl)"은 사이클로프로필(cyclopropyl), 사이클로부틸(cyclobutyl), 사이클로펜틸(cyclopentyl) 및 사이클로헥실(cyclohexyl) 등과 같은 3 내지 12개의 탄소원자들의 비-방향족의 1 또는 다원환계(mono or multicyclic ring system)를 의미한다. 다원의 사이클로알킬기들의 예들에는 퍼하이드로나프틸(perhydronapththyl), 아다만틸(adamantyl) 및 노르보르닐기들(norbornyl groups), 가교화된 사이클릭기들(bridged cyclic groups) 및 예를 들어 스피로(4,4)논-2-일(spiro(4,4)non-2-yl) 등과 같은 스피로바이사이클릭기들(spirobicyclic groups)이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
용어 "아릴(aryl)"은 페닐(phenyl), 나프틸(naphthyl), 테트라하이드로나프틸(tetrahydronapthyl), 인다닐(indanyl) 및 비페닐(biphenyl) 등과 같은 6 내지 14개의 탄소원자들을 갖는 방향족 라디칼(aromatic radical)을 의미한다.
용어 "아릴알킬(arylalkyl)"은 앞서 정의된 바와 같은 알킬기에 직접적으로 결합된 앞서 정의된 바와 같은 아릴기, 예를 들면, -CH2C6H5 and -C2H5C6H5들을 의미한다.
"치환된(substituted)"은 동일한 위치 상에 또는 서로 다른 위치들 상에 동일한 기들 또는 서로 다른 기들을 갖는 1 내지 3개의 치환체(substituents)들을 의미한다.
"알키닐(alkynyl)"은 2 내지 6개의 탄소원자들을 갖고 그리고 적어도 하나의 알키닐 포화를 갖는 알키닐기들을 의미하며, 이러한 기의 예들에는 아세틸레닐(acetylenyl), 프로파길(propargyl)들이 포함된다.
용어들 "헤테로사이클릴(heterocyclyl)" 및 "헤테로고리환(heterocyclic ring)"은 탄소원자들 및 질소, 인, 산소 및 황들로부터 선택되는 1 내지 5개의 헤테로원자들로 이루어지는 안정한 3- 내지 15-원환 라디칼(3- to 15-membered ring radical)을 의미한다. 본 발명의 목적들을 위하여는, 상기 헤테로고리환 라디칼은 1원(monocyclic), 2원(bicyclic) 또는 3원환계(tricyclic ring system)가 될 수 있으며, 이는 융합된(fused), 가교화된(bridged) 또는 스피로환계(spiro ring systems)들이 포함될 수 있으며, 상기 헤테로고리환 라디칼 내의 질소, 인, 탄소, 산소 또는 황원자들은 선택적으로 여러 산화 상태들로 산화될 수 있다. 게다가, 상기 질소원자는 선택적으로 4량체화(quaternized)될 수 있고; 그리고 상기 환 라디칼은 부분적으로 또는 전체적으로 포화(즉, 헤테로사이클(heterocyclic) 또는 헤테로아릴(heteroaryl))될 수 있다.
용어 "헤테로사이클릴알킬(heterocyclylalkyl)"은 알킬기에 직접적으로 결합된 헤테로고리환 라디칼을 의미한다. 상기 헤테로사이클릴알킬 라디칼은 알킬기 내의 임의의 탄소원자에서 주구조(main structure)에 부착되어 안정한 구조의 형성이라는 결과를 가져올 수 있다.
달리 특정되지 않는 한, 여기에서 사용된 바와 같은 용어 "치환된"은 하기의 치환체들, 즉 하이드록시(hydroxy), 할로겐(halogen), 카르복실(carboxyl), 시아노(cyano), 니트로(nitro), 옥소(oxo (=0)), 티오(thio (=S)), 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 할로알킬(haloalkyl), 치환되거나 또는 미치환된 알콕시, 치환되거나 또는 미치환된 알케닐, 치환되거나 또는 미치환된 알키닐, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 아릴알킬, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알케닐알킬, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알케닐, 치환되거나 또는 미치환된 아미노, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로아릴, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴알킬환(heterocyclylalkyl ring), 치환되거나 또는 미치환된 헤테로아릴알킬, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로고리환, 치환되거나 또는 미치환된 구아니딘(guanidine), COORx, -C(O)Rx, -C(S)Rx, -C(O)NRxRy, -C(O)ONRxRy, -NRxCONRyRz, -N(Rx)SORy, -N(Rx)S02Ry, -(=N-N(Rx)Ry), -NRxC(O)ORy, -NRxRy, -NRxC(O)Ry, -NRxC(S)Ry, -NRxC(S)NRyRz, -SONRxRy, -S02NRxRy, -ORx, -ORxC(O)NRyRz, -ORxC(O)ORy, -OC(O)Rx, -OC(O)NRxRy, -RxNRyC(O)Rz, -RxORy, -RxC(O)ORy, -RxC(O)NRyRz, -RxC(O)Ry, -RxOC(O)Ry, -SRx, -SORx, -S02Rx 및 -ON02들 중의 임의의 것 또는 임의의 조합으로의 치환을 의미하며, 여기에서, Rx, Ry 및 Rz들은 수소, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 할로알킬, 치환되거나 또는 미치환된 알콕시, 치환되거나 또는 미치환된 알케닐, 치환되거나 또는 미치환된 알키닐, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 아릴알킬, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알케닐, 치환되거나 또는 미치환된 아미노, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로아릴, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴알킬환, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로아릴알킬, 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로고리환들로부터 독립적으로 선택된다. 앞서 언급된 "치환된" 기들 중에서 치환체들은 더 치환되지 않을 수 있다. 예를 들면, "치환된 알킬" 상의 상기 치환체가 "치환된 아릴"인 경우, "치환된 아릴" 상의 상기 치환체는 "치환된 알케닐"이 될 수 없다.
상기 용어들 "할로겐" 또는 "할로(halo)"에는 불소(fluorine), 염소(chlorine), 브롬(bromine) 또는 요오드(iodine)가 포함된다.
용어 "할로알킬"은 할로겐원자로 치환된 알킬기를 포함하는 기(group)를 나타내는 데 사용되며, 여기에서 알킬기는 앞서 정의한 바와 같고, 그리고 할로겐은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 나타내는 데 사용되며, 이러한 기의 예들로는 트리플루오로메틸(trifluoromethyl), 디플로오로메틸(difluoromethyl)들이 있다.
용어 "알콕시기(alkoxy group)"는 1 내지 6개의 탄소원자들로 이루어지는 선형 또는 분지된 알콕시기를 나타내는 데 사용된다. 메톡시기(methoxy group), 에톡시기(ethoxy group), 프로폭시기(propoxy group), 이소프로폭시기(isopropoxy group), 노말-부톡시기(n-butoxy group), 이소부톡시기(isobutoxy group) 및 3차-부톡시기(tert-butoxy group)들을 포함하는 탄소수 1 내지 4개의 알콕시기들이 바람직하다.
용어 "알콕시카르보닐기(alkoxycarbonyl group)"는 선형 또는 분지된 탄소수 1 내지 5의 알콕시기 및 카르보닐기로 이루어지는 구조를 나타내는 데 사용된다. 메톡시카르보닐기(methoxycarbonyl group), 에톡시카르보닐기(ethoxycarbonyl group), 프로폭시카르보닐기(propoxycarbonyl group), 이소프로폭시카르보닐기(isopropoxycarbonyl group) 및 부톡시카르보닐기(butoxycarbonyl group)들을 포함하는 탄소수 2 내지 5의 알콕시카르보닐기들이 바람직하다. 이들 중, 메톡시카르보닐기가 바람직하다.
용어 "전구약물(prodrug)"은 생체 내에서 변환되어 화학식 (I), (II) 또는 (IIA)의 화합물 또는 상기 화합물의 약제학적으로 수용가능한 염, 수화물 또는 용매화물들을 수득하는 화합물을 의미한다. 상기 변환(transformation)은 혈액 내에서의 가수분해를 통하는 것과 같은 여러 메카니즘들에 의하여 일어날 수 있다. 전구약물들의 사용에 대한 논의는 문헌 T. Higuchi and W. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series, and in Bioreversible Carriers in Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987에 의해 제공된다.
용어 상황(state), 질병(disease), 장애(disorder) 또는 상태(condition)의 "치료하는(treating)" 또는 "치료(treatment)"에는:
(1) 상황, 질병, 장애 또는 상태로 피해를 입거나 또는 그러한 경향이 있을 수 있으나 그러나 아직 상기 상황, 질병, 장애 또는 상태의 임상적 또는 준임상적(subclinical)인 증후군들을 아직 경험하거나 또는 나타내지 못하는 대상체에서 전개되는 상황, 질병, 장애 또는 상태의 임상적 증후군(clinical symptoms)들의 외관을 방지하거나 또는 지연시키는 것;
(2) 상기 상황, 질병, 장애 또는 상태를 억제, 즉 상기 상황, 질병, 장애 또는 상태 또는 이들의 임상적 또는 준임상적 증후군 중의 적어도 하나를 정지시키거나 또는 감소시키는 것; 또는
(3) 상기 상황, 질병, 장애 또는 상태를 완화, 즉 상기 상황, 질병, 장애 또는 상태 또는 이들의 임상적 또는 준임상적 증후군 중의 적어도 하나의 퇴행(regression)을 야기하는 것; 또는
(4) 상황, 질병, 장애 또는 상태 또는 이들의 임상적 또는 준임상적 증후군 중의 적어도 하나의 중증도를 완화시키는 것
들이 포함된다.
본 발명에서 기술되는 상기 화합물들은 염들을 형성할 수 있다. 본원의 일부를 구성하는 약제학적으로 수용가능한 염들의 비제한적인 예들에는 무기염기들로부터 유래되는 염들, 유기염기들의 염들, 키랄염기(chiral bases)들의 염들, 천연 아미노산들의 염들 및 비-천연 아미노산들의 염들이 포함된다. 본 특허출원의 특정의 화합물들은 입체이성질 형태들(예를 들면, 부분입체이성질체 및 거울상이성질체)로 존재할 수 있다. 상기 화학식 (I)로 기술되는 전체 화합물들에 대하여는, 본 특허출원은 이들 입체이성질체 형태들 및 이들의 혼합물에까지 확장된다. 선행기술이 특정의 입체이성질체들의 합성 또는 분리를 교시하는 정도까지 본 특허출원의 서로 다른 입체이성질체 형태들이 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의하여 서로 분리될 수 있거나, 또는 주어진 이성질체들이 입체특이적(stereospecific) 또는 비대칭적(asymmetric) 합성에 의해 수득될 수 있다. 여기에서 기술된 화합물들의 호변이성 형태(tautomeric forms)들 및 혼합물들이 또한 고려된다.
약제학적으로 수용가능한 용매화물들에는 수화물 및 결정화(알코올 등과 같은)의 다른 용매화물들이 포함된다. 본 발명의 상기 화합물들은 당해 기술분야에서 공지된 방법들에 의하여 저분자량의 용매들과 함께 용매화물들을 형성할 수 있다.
약제학적 조성물들
본 특허출원에서 제공되는 상기 약제학적 조성물들은 여기에서 기술된 적어도 하나의 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 수용가능한 부형제(excipient ; 약제학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제(diluent) 등과 같은)들을 포함한다. 바람직하게는, 고려되는 약제학적 조성물들은 알쯔하이머 질환, 치매 또는 다른 신경퇴화 질병들을 치료하기에 충분한 양의 여기에서 기술되는 화합물(들)을 포함한다.
고려되는 상기 대상체들에는 예를 들면 살아 있는 세포 및 인간을 포함하여 포유동물이 포함된다. 본 발명의 상기 화합물(들)은 약제학적으로 수용가능한 부형제(담체 또는 희석제 등과 같은)와 결합될 수 있거나 또는 담체로 희석되거나 또는 캡슐(capsule), 정제(tablet), 분말(powder), 시럽(syrup), 패치(atch)의 형태가 될 수 있는 담체 내에 내포될 수 있다.
적절한 담체들의 예들에는 물(water), 염용액(salt solutions), 알코올(alcohols), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycols), 폴리하이드록시에톡실화 캐스터오일(polyhydroxyethoxylated castor oil), 땅콩유(peanut oil), 올리브유(olive oil), 젤라틴(gelatin), 락토오스(lactose), 백토(terra alba), 슈크로스(sucrose), 덱스트린(dextrin), 탄산마그네슘(magnesium carbonate), 설탕(sugar), 사이클로덱스트린(cyclodextrin), 아밀로스(amylose), 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 활석(talc), 젤라틴(gelatin), 아가(agar), 펙틴(pectin), 아카시아(acacia), 셀룰로오스의 스테아린산 또는 저급 알킬에테르(stearic acid or lower alkyl ethers of cellulose), 규산(silicic acid), 지방산(fatty acids), 지방산아민(fatty acid amines), 지방산모노글리세리드 및 디글리세리드(fatty acid monoglycerides and diglycerides), 펜타에리쓰리톨지방산에스테르(pentaerythritol fatty acid esters), 폴리옥시에틸렌(polyoxyethylene), 하이드록시메틸셀룰로오스(hydroxymethylcellulose) 및 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
상기 담체 또는 희석제는 예를 들면 단독으로 또는 왁스(wax)와 혼합된 글리세릴모노스테아레이트(glyceryl monostearate) 또는 글리세릴디스테아레이트(glyceryl distearate) 등과 같은 지효성 방출 물질(sustained release material)을 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 또한 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 수용가능한 보조제(auxiliary agents), 적심제(wetting agents), 에멀젼화제(emulsifying agents), 현탁제(suspending agents), 보존제(preserving agents), 삼투압에 영향을 주는 염(salts for influencing osmotic pressure), 완충제(buffers), 감미제(sweetening agents), 방향제(flavoring agents), 착색제(colorants) 또는 앞서의 것들의 임의의 조합들을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 약제학적 조성물은 당해 기술분야에서 공지된 방법들을 사용하는 것에 의하여 상기 대상체에 투여된 후 활성성분(active ingredient)의 속성 방출, 지효 방출 또는 지연 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.
여기에서 기술되는 상기 약제학적 조성물들은 예를 들면 문헌 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed., 2003 (Lippincott Williams & Wilkins)에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 예를 들면, 활성 화합물(active compound)은 담체와 혼합되거나 또는 담체로 희석될 수 있다. 상기 담체가 희석제로서 기능하는 경우, 이는 상기 활성 화합물에 대한 비히클, 부형제 또는 매질로서 작용하는 고체, 반-고체 또는 액체 물질이 될 수 있다. 상기 활성 화합물은, 예를 들면, 사세(sachet) 내에서 입상의 고체 컨테이너(granular solid container) 상에 흡수될 수 있다. 상기 약제학적 조성물은, 예를 들면, 캡슐(capsules), 정제(tablets), 에어로졸(aerosols), 용액(solutions), 현탁액(suspensions) 또는 주사가능한 형태(injectible forms)가 될 수 있다.
투여의 경로는 상기 활성 화합물을 적절하거나 또는 원하는 작용의 위치(site)에 효과적으로 전달할 수 있는 임의의 경로가 될 수 있다. 적절한 투여의 경로들에는 입(oral), 코(nasal), 폐(pulmonary), 구강(buccal), 피하(subdermal), 피내(intradermal), 경피(transdermal), 장관외(parenteral ; 비경구), 직장(rectal), 데포(depot), 피하(subcutaneous), 정맥내(intravenous), 요도내(intraurethral), 근육내(intramuscular), 비강내(intranasal), 눈(ophthalmic ; 안용액(ophthalmic solution)으로와 같은) 또는 국부(topical ; 국부 연고(topical ointment)로와 같은)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 경구 경로(oral route)가 바람직하다.
고체 경구 제형들에는 정제(tablets), 캡슐(capsules ; 연질 또는 경질 젤라틴), 당의정(dragees ; 분말 또는 펠릿(pellet) 형태의 활성 성분을 포함), 트로키(troches) 및 로젠지(lozenges)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 활석(talc) 및/또는 탄수화물 담체 또는 결합제 등을 갖는 정제, 당의정 또는 캡슐들이 특히 경구 적용에 적절하다. 정제, 당의정 또는 캡슐용의 바람직한 담체들에는 락토오스(lactose), 옥수수녹말(cornstarch) 및/또는 감자녹말(potato starch)들이 포함된다. 감미화된 비히클(sweetened vehicle)이 사용될 수 있는 경우 시럽(syrup) 또는 엘릭서(elixir)가 사용될 수 있다.
통상의 정제화 기술(tabletting techniques)들에 의해 제조될 수 있는 전형적인 장제는 (1) 코어: 활성 화합물(유리 화합물 또는 그의 염으로서), 250㎎ 콜로이드성 이산화규소(colloidal silicon dioxide ; 에어로실®(Aerosil®), 1.5마운드(1.5mounds) 미결정셀룰로오스(microcrystalline cellulose ; 아비셀®(Avicel®), 70㎎ 변성 셀룰로오스검(modified cellulose gum ; 악-디-솔®(Ac-Di-Sol®) 및 7.5㎎ 마그네슘스테아레이트(magnesium stearate); (2) 코팅: 하이드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 대략 9㎎ 미와세트 9-40티(Mywacett 9-40 T) 및 0.9㎎ 아실화 모노글리세리드(acylated monoglyceride)를 포함할 수 있다.
액체 제형들에는 시럽, 에멀젼, 연질 젤라틴 및 수성 또는 비-수성의 액체 현탁액 또는 용액 등과 같은 멸균의 주사가능한 액체들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
비경구 적용을 위하여는, 주사가능한 용액 또는 현탁액, 특히 폴리하이드록실화 캐스터오일(polyhydroxylated castor oil) 내에 용해된 활성 화합물을 갖는 수성 용액들이 특히 적절하다.
치료의 방법들
본 발명은 아밀로이드-베타-42 펩티드와 연관된 장애의 치료 또는 중증도를 완화시키는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 대상체에 그의 화학식 (I)의 화합물을 투여하는 것을 포함한다. 이러한 장애들에는 알쯔하이머 질환, 치매 및 허혈성 뇌졸증, 파킨슨씨병 등과 같은 다른 신경퇴화 장애들이 포함된다.
제조법들
여기에서 기술된 상기 화합물들은 당해 기술분야에서 공지된 기술들로 제조될 수 있다. 게다가, 여기에서 기술된 상기 화합물들은 도식 1 내지 2에서 기술된 반응순서를 따르는 것에 의해 제조될 수 있다. 더욱이, 하기의 도식들에서, 특정의 염기, 산, 반응물, 시약, 용매, 커플링제(coupling agents) 등이 언급되는 경우, 당해 기술분야에서 공지된 다른 염기, 산, 시약, 용매,커플링제 등이 또한 사용될 수 있으며, 따라서 본 발명 내에 포함되는 것으로 이해된다. 당해 기술분야에서 공지된 것으로서 사용될 수 있는 반응 조건들, 예를 들면, 반응의 온도 및/또는 지속시간에서의 변화들 또한 본 발명의 관점 내에 속하는 것이다. 달리 특정되지 않는 한, 이들 도식들 내에서의 상기 화합물들의 입체이성질체들 모두는 또한 본 발명의 관점 내에 포함되는 것이다.
Figure pct00008
Lg가 이탈기(leaving group)인 경우의 화학식 (i)의 화합물은 당해 기술분야에서 공지된 방법들에 의하여 화학식 (ii)와 반응될 수 있다. 예를 들면, Lg가 OH인 경우, 화학식 (i)은 N-메틸몰포린(N-methyl morpholine ; NMM), 디메틸포름아미드(dimethylformamide), 디이소프로필에틸아민(diiospropyl ethylamine), 디클로로메탄(dichloromethane), 에틸아세테이트(ethyl acetate) 등과 같은 용매들 내의 DCC, N,N,N',N'-테트라메틸-오-(벤조트리아졸-1-일)우로니움테트라플루오로보레이트(N,N,N',N'-tetramethyl-o-(benzotriazol-1-yl)uronium tetrafluoroborate ; TBTU), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)carbodiimide ; EDCI), 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole ; HOBt) 등과 같은 커플링제들의 존재 중에서 화학식 (ii)와 반응되어 화학식 (I)의 화합물을 수득할 수 있다.
Figure pct00009
유사하게 상기한 방법에 따라, 화학식 (iii)을 화학식 (iv)와 커플링시키는 것에 의하여 화학식 (I)의 화합물이 제조될 수 있다.
시험관 내 및 생체 내 실험들을 위한 방법:
인간 신경세포 모델:
본 발명자들은 Aβ42 생성을 위한 모델로서의 약물 시험에 대하여 인간 신경아세포종(human Neuroblastoma) SH-SY5Y 세포들을 사용하였다. 상기 세포들을 공급자들의 지시에 따라 95%의 공기, 5%의 CO2의 가습 분위기(humidified atmosphere) 중에서 37℃에서 둘베코 변성 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 또는 10% 우태혈청(fetal bovine serum), 100단위/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신 보충 둘베코 변성 이글 배지/함의 F-12 배지(Ham's F-12 medium) 내에서 배양시켰다. 세포들을 전형적으로 상기 화합물들과 함께 밤새도록 배양시키고, 그리고 계속해서 하기에서 기술된 바와 같이 Aβ42 정량화를 위하여 배지들을 수확하였다. MTT 분석을 사용하여 세포 독성을 감시하였으며, 보고된 모든 데이터들을 임의의 세포 손실(cell loss)에 대하여 보정하였다.
Aβ42의 정량화를 위한 샌드위치 효소-결합 면역흡수분석( Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay ; sELISA ):
Aβ42의 표준 정제 제제들과 마찬가지로 포획 항체(capture antibody), 검출 항체(detection antibody) 및 2차 항체(secondary antibody)들을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 수득하였다. 화합물들의 존재 또는 부재 중에서 세포들을 24시간 동안 배양시켰으며, 조정된 배지를 sELISA에 적용시켰다.
위스타 랫트(wistar rats)들에서의 신규한 대상체 인지 시험에서 스코폴라민 유발 기억력 결핍( scopolamine induced memory deficit )에 대한 화합물 9의 시험:
인지 즉, 신규한 대상체 인지 시험에서 스코폴라민 유발 기억력 결핍에서의 개선을 시험하는 데 종종 사용된 랫트 인지 모델에서 약물들의 효과를 시험하였다(문헌, Ennaceur A, Delacour J. A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data. Behav Brain Res. 1988;31:47-59 참조). 비히클 또는 시험 화합물(0, 1, 3, 10, 30 또는 100㎎/㎏ 체중의 도네제필 또는 화합물)을 습관화(habituation)의 개시 7일 이전부터 그리고 신규한 대상체 인지 시험 실험 기간 전체에 걸쳐 수컷 랫트들에 투여하였다.
상기 시험은 다음과 같이 수행될 것이다: 1일차에서 상기 랫트들이 그들 개개의 무대(arenas)들에 20분간 순응되고(비히클 또는 시험 화합물들의 투여 1시간 후), 계속해서 그들 개개의 홈케이지(home cages)에로 되돌아갈 것이다. 2일차에서 시험 1시간 전에 상기 랫트들에 비히클 또는 시험 화합물들이 투여될 것이다. 친밀화 단계(familiarization phase) 30분 전에 돈페질(donpezil)이 1회 투여될 것이다. 스코폴라민(1㎎/㎏, 복강내)이 시험 20분전에 주사될 것이다. 스코폴라민 투여 20분 후, 랫트들은 친밀화 단계에 적용될 것이다. 상기 동물들을 무대 내로 위치시키기 이전 10 내지 15초간 상기 동물들을 손바닥 상에 위치시키는 핸들링(handling)이 수행될 것이다. 친밀화 단계 동안, 랫트들은 황색 보호테이프(masking tape)로 덮인 2개의 유사한 대상체들(친밀한 대상체(familiar objects)들, 플라스틱병들, 12㎝ 높이 * 5㎝ 직경)을 포함하는 상기 무대들을 3분간 탐험하도록 허용될 것이다. 동일한 대상체들 각각을 조사하는 데 소요된 시간이 조사자(investigator ; 상기 치료에 대해 알지 못하는)에 의하여 수동 스톱워치(hand held stopwatches)를 사용하여 기록될 것이다. 모든 시도들은 녹화될 것이다. 상기 대상체들의 조사는 움직이는 비모(vibrissae)로 상기 대상체의 1㎝ 반경 내에서의 코로의 냄새맡기(smelling), 킁킁거리기(sniffing), 핥기(licking), 코가 상기 대상체 쪽으로 지향된 채로 앞발(fore paw)로 상기 대상체를 터치하기(touching)로 정의된다. 상기 시도가 수행된 후, 동물들은 그들의 홈케이지로 되돌려질 것이다. 시도의 3분의 간격 이후, 상기 랫트들은 3분의 기간 동안 시도를 선택하도록 적용될 것이다. 여기에서 상기 랫트들은 상기 친숙한 대상체의 복사본(copy)과 신규한 대상체(호박색 유리병(amber color glass bottle, 11.5㎝ 높이 * 4.5㎝ 직경)를 포함하는 무대를 탐험하도록 허용될 것이다. 상기 신규한 대상체 및 친숙한 대상체들을 조사하는 데 소요된 시간은 동일한 조사자(친밀화 단계를 기록하고 그리고 상기 치료에 대해 알지 못하는 조사자)에 의하여 수동 스톱워치들을 사용하여 기록될 것이다. 각 동물의 탐험은 상기 무대 상에 고정된 카메라를 사용하여 DVD 리코더(DVD recorder)에 녹화될 것이다. 상기 친밀화 단계 동안 15초 이상 그리고 상기 선택 시도 동안 10초 이상의 탐험을 보이는 동물들이 데이터 분석에 고려될 것이다. 이는 상기 동물들이 대상체 훈련을 받아들였다는 것을 보증한다. 선택적 탐험(친밀화 단계에서 하나의 대상체에 다른 대상체에 비해 20초 이상의 탐험으로 정의되는)을 보이는 동물들은 데이터 분석에 고려되지 않을 것이다. 신규한 대상체 인지 임무 실험은 4일의 기간에 걸쳐 수행될 것이며, 즉 첫 번째의 6개체의 동물들이 첫 2일 동안 실험될 것이고 그리고 다음 6개체의 동물들이 다음 2일 동안 실험될 것이다(7일의 투여 스케쥴(dosing schedule)은 모든 동물들이 7 투여량(7 doses)의 비히클 또는 시험 약물을 습관화의 일 이전에 수용하도록 개시될 것이다. 전체적으로 각 동물은 9 투여량의 비히클 또는 시험 약물을 수용하게 될 것이다).
통계학적 분석: 각 치료군에 대하여, 신규한 대상체 및 친숙한 대상체들에 대하여 소요된 시간을 스튜던트 대응 t-검정(Student's paired 't'test)으로 대조할 것이다. 크루스칼-월리스 시험(Kruskal-Wallis test)의 사용에 의하여 약물 치료된 군들에 대한 변별지수(discriminative index)를 비히클 군의 변별지수와 비교할 것이다. 상기 변별지수는 선택 시험에서 상기 신규한 대상체를 탐험하는 데 소요된 시간을 상기 신규한 대상체와 친숙한 대상체를 탐험하는 데 소용된 시간의 합으로 나눈 비율이다. 변별지수에 기초한 이상값(outliers ; 그루브스 이상값 시험(Grubbs outlier test) (또는) 평균으로부터 2 표준편차 더 크거나 더 작은)들은 통계학적 분석에서 고려되지 않을 것이다.
랫트 모델에서의 뇌 Aβ42( abeta -42) 수준들에 대한 화합물 9의 효과의 시험:
약물 치료(drug treatment)
동물들을 체중에 기초하여 서로 다른 치료군들로 임의추출하였다. 시험군들은 2주간 경구로 투여된 반면 대조 동물들은 비히클만 투여되었다.
뇌조직 제조
연구의 마지막에서, 마지막 투여량 투여 2시간 후 동물들을 희생시키고 그리고 뇌조직들을 절개해내고 그리고 즉각적으로 드라이아이스 상에서 동결시켰다. 동결된 뇌를 50mM NaCl, pH10 및 프로테아제 억제제(protesae inhibitors)를 포함하는 3용적(중량/용적)의 빙냉(ice-cold)의 0.2% 디에틸아민(diethylamine) 내에서 균질화시키고 그리고 계속해서 원심분리기를 사용하여 1500rpm에서 4℃에서 30분간 원심분리시켰다. 그 결과의 상청액(supernatant)을 가용성 분획(soluble fraction)으로 보유하고 그리고 10%의 0.5M 트리스-염산(Tris-HCl), pH 6.8의 첨가에 의해 중화시켰다.
Aβ-42 수준들의 결정
혈장, 뇌척수액(CSF) 및 뇌조직 추출물들 내의 Aβ-42 수준들을 시그마(Sigma)로부터의 항-Aβ-42 항체(항-아밀로이드 펩티드 β, 개열사이트(Cleavage Site 42, A1976)를 사용하는 ELISA에 의해 결정하였다.
ELISA 프로토콜
뇌조직 추출물 내의 Aβ-42 수준을 ELISA로 결정하였다. 모노클로날 항 β-아밀로이드 클론 BAM-10 모노클로날 항체(Monoclonal anti β-Amyloid Clone BAM-10 monoclonal antibody ; 시그마, A3981)를 코팅 완충제로 1:1000으로 희석시켜 1.5㎍/㎕의 작업농도(working concentration)를 수득하였다. 4℃에서 16 내지 18시간 동안 100㎕의 이것을 96웰 면역플레이트(96 well immunoplate ; NUNC) 내의 웰 마다 코팅시켰다. 상기 플레이트를 230㎕의 세척완충제(wash buffer)로 3회 세척시켰다. 계속해서 상기 웰들을 1시간 동안 150㎕의 블로킹완충제(blocking buffer)로 블로킹시켰다. 상기 플레이트를 230㎕의 세척완충제로 3회 세척하였다. 샘플, 표준(2500-1.1ng/㎖) 및 블랭크(blank)를 적절한 웰들에 첨가하고 그리고 완만한 교반을 수반하며 2시간 동안 배양시켰다. 계속해서 상기 플레이트를 230㎕의 세척완충제로 3회 세척하였다. 2차 항체(항-아밀로이드 펩티드, 개열사이트 42, 시그마 A1976)를 1% 우혈청알부민(BSA)으로 1:1000으로 희석시켜 1.25㎍/㎕의 작업농도를 수득하였다. 100㎕의 이것을 웰 마다 첨가하고 그리고 완만한 교반을 수반하며 2시간 동안 배양시켰다. 상기 플레이트를 230㎕의 세척완충제로 3회 세척하였다. 100㎕의 검출 항체, 항-토끼 면역글로블린 전분자 HRP 콘쥬게이트(Anti-rabbit IgG whole molecule HRP conjugate ; 시그마 1% 우혈청알부민으로 1:1000으로 희석시킴)를 상기 웰들에 첨가하고 그리고 완만한 교반을 수반하며 2시간 동안 배양시켰다. 상기 플레이트를 230㎕의 세척완충제로 3회 그리고 후속하여 100㎕의 스트렙아비딘(Strepavidin HRP(1% 우혈청알부민으로 1:200으로 희석시킨)로 세척하였다. 상기 플레이트를 230㎕의 세척완충제로 3회 세척하고 그리고 100㎕의 TMB/H2O2 기질(substrate)을 첨가하고 그리고 20분 동안 배양시켰다. 50㎕의 2N H2SO4를 첨가하는 것에 의해 상기 반응을 정지시키고 그리고 흡광도(absorbance)를 마이크로플레이트 리더(microplate reader ; 바이오텍(BioTek))에서 450/570㎚에서 측정하였다.
위스타 랫트들에서의 모리스 수중 미로 임무( Morris water maze task )에서의 기억력 결핍에 대한 화합물 9의 효과:
상기 모리스 수중 미로는 인지 측정을 위한 시험에서 통상적으로 사용된다(문헌 D'Hooge R, De Deyn PP. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Brain Res Brain Res Rev. 2001;36:60-90 참조). 이 연구를 위하여 수컷 위스타 랫트들이 사용되었다. 상기 수중 미로는 물(24±2℃)로 채워진 1.8m 직경; 0.6m 높이의 원형 탱크로 이루어진다. 16㎝ 직경 플랫폼(platform)이 4개의 가상의 4분의(four imaginary quadrants)들 중의 하나의 중앙에 물의 표면 1.0㎝ 아래에 위치될 것이며, 이는 상기 랫트들 모두에 대하여 항상 남겨진다. 화합물 9를 습득 시도(acquisition trial) 5일 전부터 투여하여 상기 습득 시도 동안에 걸쳐 지속시켰다. 상기 습득 시도들 동안에 화합물 9를 시도 60분 전에 투여하였다. 도네페질을 습득 시도 50분에서 투여하였다. 스코폴라민을 습득 시도 30분에서 투여하였다. 랫트들을 살며시 다리부터 먼저 물에 담갔다. 랫트가 60초간 수영하여 상기 플랫폼을 찾도록 허용하였다. 이 시간 동안에 상기 플랫폼을 발견한 경우, 그 시도를 중단하고 그리고 랫트를 플랫폼 상에서 30초 동안 머무는 것을 허용한 후 상기 미로에서 제외시켰다. 60초의 시도 동안 상기 플랫폼을 발견하지 못한 경우, 계속해서 상기 랫트를 손으로 상기 플랫폼 상으로 옮겨서 시각적인 신호(visual cue)와 접하도록 한 후, 상기 플랫폼 상에서 30초 동안 머무는 것을 허용한 후 상기 미로에서 제외시켰다. 상기 랫트들을 상기 플랫폼으로부터 꺼내고(꺼내기 전에 상기 랫트가 조사자의 손을 전방으로부터 보는 것을 확실하게함) 그리고 수건으로 부드럽게 건조시켰다. 각 랫트를 하우에 4회의 시도들을 받도록 하였다. 상기 미로는 8개의 출발점들을 갖는다. 1일차와 3일차에서는 상기 동물들을 제1 출발점, 제3 출발점, 제5 출발점 및 제7 출발점들에서 출발하였다. 2일차와 4일차에서는 상기 동물들을 제2 출발점, 제4 출발점, 제6 출발점 및 제7 출발점들에서 출발하였다. 상기 임무의 기억력(retention)을 5일차에서 평가하였으며 여기에서 각 동물은 단일의 120초 검증 시험(probe trial)을 받았으며, 그 동안 플랫폼이 풀(pool)에서 제거되었다. 랫트들은 기억력 시도에 앞서 치료되지 않았다. 랫트들은 그들의 홈케이지에로 되돌려지기 전에 5분간 가열램프(heating lamp) 아래에 놓여졌다. 습득 시도들에서 상기 플랫폼에 도달하는 데에 있어서의 지연(latency ; ms), 수영 속도(㎝/s) 및 경로 길이(path length ; ㎝)가 측정되었다. 검증 시험에서 목표 사분의(습득 훈련(acquisition training) 동안 플랫폼이 위치되는 사분의) 내에서 보낸 시간 백분율 및 수영 속도(㎝/s)가 산출되었다. 상기 동물들을 추적하고 그리고 데이터를 비디오 모트 2 소프트웨어(Video Mot 2 software)를 사용하여 생성시켰다.
10일의 기간에 걸쳐 실험이 수행되었으며, 즉 처음 6개체의 동물들이 처음 5일 동안에 실험되었으며, 다음 6개체의 동물들이 다음 5일 동안에 실험되었다(모든 동물들이 9 투여량의 비히클 또는 시험 약물을 받도록 전처리(pretreatment) 및 시험 스케쥴이 개시되었다). 수득된 데이터를 그래프 패드 프리즘 소프트웨어 패키지(Graph pad prism software package)를 사용하는 것에 의하여 반복 측정 투웨이 아노바(Repeated measures Two way ANOVA)와 후속하여 본페로니 포스트 테스트(Bonferroni post tests)에 의하여 분석하였다.
알쯔하이머 질환 Tg2576 생쥐의 형질전환 모델( transgenic model )에서의 화합물 9의 효과
본 연구는 6월령(6 month old)의 Tg (HuApp695.K670-M671L) 2576 형질전환 생쥐 및 연령을 맞춘(age matched) C57Bl6 / SJL 비-형질전환 대조 생쥐를 사용하였다(문헌 Hsiao K, Chapman P, Nilsen S,Eckman C, Harigaya Y, et al. Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science. 1996;274:99-102 참조). 생쥐들은 잭슨 실험실(Jackson Labs)로부터 수득하였으며 군락(colony)을 구축하였다. Tg2576 형질전환 생쥐는 인간 APP를 이중 스웨덴 돌연변이(double Swedish mutation)으로 과-발현시켰다. Tg2576 및 대조 생쥐들을 4주간의 기간 동안 1) 비히클 단독 n = 10), 2) 화합물 9(50㎎/㎏ 경구적으로 투여; n = 10)들 중의 하나로 치료하였다. 가용성의 뇌 aβ-42 및 aβ-40들을 이전에 기술된 전형적인 ELISA 프로토콜을 사용하여 측정하였다.
실시예들
실시예 1: 3- 페닐 -2-[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산-4- 알릴2 -메톡시-페닐에스테르(3- phenyl -2-[( pyridine -3- carbonyl )- amino ]- propionic acid -4-allyl2-methoxy-phenyl ester )의 제조
Figure pct00010
단계 1: 3-페닐-2-[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산 메틸에스테르(3-phenyl-2-[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-propionic acid methylester)의 제조
Figure pct00011
DCM(20㎖) 내의 니코틴산(1.64g, 1.11mmol)의 용액에 EDCI.HCl(4.2g, 2.22mmol), N-메틸몰포린(N-methyl morpholine ; 3.6㎖, 3.33mmol) 및 페닐알라닌메틸에스테르(phenylalaninemethylester ; 2.0g, 1.11mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에서 실온(25℃)에서 밤새도록 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석시키고, 물로 세척하고(100㎖, 2회) 그리고 황산나트륨(sodium sulphate) 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득되는 조생성물(crude product)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 더욱 정제하여 오프 화이트(off-white ; 약간 회색을 띤 흰색) 고체로서 생성물을 수득하였다.
단계 2: 3-페닐-2-[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산(3-phenyl-2-[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-propionic acid)의 제조
Figure pct00012
메탄올(10㎖), THF(30㎖) 내의 3-페닐-2-[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산 메틸에스테르(1.2g, 4.2mmol)의 용액에 물(10㎖)에 용해시킨 LiOH(O.885g, 21.1mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 2시간에 걸쳐 실온(25℃)에서 교반시켰다. 반응혼합물로부터 THF를 증발시키고, 1.5N HCl로 산성화시키고 계속해서 에틸아세테이트(ethylacetate ; 200㎖)로 추출하고 그리고 농축시켜 황색 고체로서 생성물을 수득하였다(l.Og, 96%).
단계 3: 3-페닐-2-[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산-4-알릴 2-메톡시-페닐에스테르(3-phenyl-2-[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-propionic acid-4-ally1 2-methoxy-phenylester)의 제조
Figure pct00013
DCM(3㎖) 내의 3-페닐-2-[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산(O.350g, 1.2mmol)의 용액에 EDC.HCl(0.450g, 2.4mmol), N-메틸몰포린(0.4㎖, 3.6mmol), 유게놀(Eugenol ; O.23㎖, O.0015mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에서 실온(25℃)에서 밤새도록 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(100㎖)로 희석시키고, 물로 세척하고(50㎖, 3회) 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득되는 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 오프 화이트 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(0.170g, 34%).
양성자 핵자기공명 분광분석( 1 H NMR)(300MHz, CDCl 3 ) d(ppm): 3.18-3.43(m, 4H), 3.74(s, 3H), 4.92-5.13(bs, 1H), 6.76-6.78(m, 1H), 6.97-7.00(m, 2H), 7.19-7.53(m, 6H), 8.15(d, J = 7.8Hz, 1H), 8.71(d, J = 4.5Hz, 1H), 8.95(s, 1H), 9.24(m, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화)(LCMS(ESI)) m/z: 416.9([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도(HPLC purity): 97.72%
화합물의 속성(Nature of the compound): 오프 화이트 고체
실시예 2: 4-메틸-설파닐-2-[(피리딘-3카르보닐)-아미노]부티르산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(4-methyl-sulfanyl-2-[(pyridine-3carbonyl)-amino] butyric acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00014
단계 1: 4-메틸-설파닐-2-[(피리딘-3카르보닐)-아미노]부티르산메틸에스테르(4-methyl-sulfanyl-2-[(pyridine-3carbonyl)-amino] butyric acid methylester)의 제조
Figure pct00015
질소 하에서 DCM(20㎖) 내의 니코틴산(nicotinic acid ; 1.8g, 14.7mmol)의 용액에 EDCI.HCl(4.7g, 24.6mmol), N-메틸몰포린(6.7㎖, 61.5mmol) 및 메티오닌에스테르(methionine ester ; 2.0g, 12.3mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에서 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(200㎖)으로 희석시키고, 물로 세척하고(100㎖, 2회) 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득되는 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 황색 고체로서 생성물을 수득하였다(1.45g, 44%).
단계 2: 4-메틸-설파닐-2-[(피리딘-3 카르보닐)-아미노]부티르산(4-methyl-sulfanyl-2-[(pyridine-3 carbonyl)-amino] butyric acid)의 제조
Figure pct00016
메탄올(5㎖), THF(6㎖) 내의 에스테르(0.5g, 1.54mmol)의 용액에 물(3㎖)에 용해시킨 LiOH(0.32g, 7.73mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 증발시키고, 물(10㎖)로 희석시키고, 1.5N HCl로 산성화시키고, 에틸아세테이트(100㎖)로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 그리고 농축시켜 황색 고체를 수득하였다(0.23g, 58%).
단계 3: 4-메틸-설파닐-2-[(피리딘-3 카르보닐)-아미노]부티르산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(4-methyl-sulfanyl-2-[(pyridine-3 carbonyl)-amino] butyric acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00017
DCM(3㎖) 내의 화합물 4-메틸-설파닐-2-[(피리딘-3카르보닐)-아미노]부티르산(0.25g, 0.98mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(0.21g, 1.96mmol), EDCI.HCl(0.56g, 0.29mmol) 및 유게놀(0.15㎖, 0.98mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에서 실온(25℃)에서 밤새도록 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 물로 세척하고(50㎖, 3회) 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득되는 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 백색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(0.15g, 38%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300MHz, CDCl 3 ) d(ppm): 2.17(s, 3H), 2.46-2.52(m, 2H), 2.80-2.84(m,2H), 3.38(d, J = 6.4Hz, 2H), 5.08-5.28(m, 3H), 5.89-6.02(m, 1H), 6.76-6.78(m, 2H), 7.00-7.05(m, 1H), 7.71-7.59(m, 1H), 8.60-8.82(m, 3H), 9.69(bs, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 400.9([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 91.41%
화합물의 속성: 백색 고체
실시예 3: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-부티르산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-butyric acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00018
단계 1: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-부티르산메틸에스테르(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-butyric acid methyl ester)의 제조
Figure pct00019
DCM(30㎖) 내의 L-발린메틸에스테르(L-valine methylester ; 3.0g, 2.29mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(11.5㎖, 11.45mmol), EDCI.HCl(8.7g, 45.8mmol) 및 니코틴산(3.3g, 27.4mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(200㎖)으로 희석시키고, 물로 세척하고(100㎖, 3회) 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득되는 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 점착성의 고체(sticky solid)로서 요구된 생성물을 수득하였다(2.0g, 38%).
단계 2: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-부티르산(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-butyric acid)의 제조
Figure pct00020
메탄올(15㎖), THF(9㎖) 내의 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-부티르산메틸에스테르(1.5g, 6.3mmol)의 용액에 물(3㎖)에 용해시킨 LiOH(1.3g, 31.7mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응혼합물로부터 용매를 증발시키고, 물(15㎖)에 용해시키고, 1.5N HCl로 산성화시키고, 에틸아세테이트(150㎖)로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 그리고 농축시켜 황색 고체로서 생성물을 수득하였다(1.38g, 99%).
단계 3: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-부티르산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl] -amino-butyric acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00021
DCM(3㎖) 내의 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-부티르산(0.3g, 1.35mmol)의 제제의 용액에 N-메틸몰포린(0.44㎖, 4.0mmol), EDCI.HCl (0.51g, 2.7mmol) 및 유게놀(0.24㎖, 1.62mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 하에서 실온(25℃)에서 밤새도록 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득되는 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 백색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(0.20g, 42%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , DMSO - d 6 ) d( ppm ): 0.79-0.87(m, 6H), 2.20-2.30(m, 1H), 3.36(m, 2H), 3.72(s, 3H), 4.59-4.61(bs, 1H), 5.04-5.14(m, 2H), 5.96-5.98(m, 1H), 6.75-6.78(m, 1H), 6.95-7.00(m, 2H), 7.51-7.56(m, 1H), 8.23-8.25(m, 1H), 8.72-8.74(m, 1H), 8.97-9.05(m, 2H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 369.0([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 92.86%
화합물의 속성: 백색 고체
실시예 4: 3(1H-인돌-3-일)-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노프로피온산-5-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3(1H-indol-3-yl)-2-[pyridine-3-carbonyl]-aminopropionic acid-5-allyl-2-methoxy phenylester)의 제조
Figure pct00022
단계 1: 3(1H-인돌-3-일)-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-프로피온산메틸에스테르(3(1H-indo1-3-yl)-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-propionic acid methylester)의 제조
Figure pct00023
DCM(20㎖) 내의 메틸에스테르(2.0g, 9.2mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(5㎖, 46.0mmol), EDCI.HCl(3.5g, 18.4mmol) 및 니코틴산(2.0g, 9.2mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(150㎖)로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 더욱 정제하여 오프 화이트 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(2.4g, 81%).
단계 2: 3(lH-인돌-3-일)-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-프로피온산(3(lH-indol-3-yl)-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-propionic acid)의 제조
Figure pct00024
메탄올(5㎖), THF(9㎖) 내의 3(1H-인돌-3-일)-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-프로피온산메틸에스테르(O.5g, 1.6mmol)의 용액에 물(3㎖)에 용해시킨 LiOH(0.39g, 7.70mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 박리해내고(stripped off ; 제거하고), 반응덩어리(reaction mass)를 1.5N HCl로 산성화시키고, 에틸아세테이트(100㎖)로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고 그리고 농축시켜 무색 고체로서 생성물을 수득하였다(0.48g, 99%).
단계 3: 3(lH-인돌-3-일)-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-프로피온산-5-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3(lH-indol-3-yl)-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-propionic acid-5-allyl-2-methoxy phenylester)의 제조
Figure pct00025
DCM 내의 3(lH-인돌-3-일)-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-프로피온산(0.23g, 0.74mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(0.15g, 1.44mmol), EDCI.HCl(0.42g, 2.2mmol) 및 유게놀(0.12g, 0.74mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(50㎖)으로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 더욱 정제시켜 황색 저융점 고체(yellow low melting solid)로서 생성물을 수득하였다(0.15g, 44%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , DMSO - d 6 ) d( ppm ): 3.37(d, J = 6.6 Hz, 2H), 3.40-3.49(m, 1H), 3.74(s, 3H), 5.05-5.14(m, 3H), 5.90-6.01(m, 1H), 6.75-6.78(m, 1H), 6.94-7.07(m, 4H), 7.32-7.36(m, 2H), 7.56-7.64(m, 2H), 8.22-8.32(m, 1H), 8.74(d, J = 4.5Hz, 1H), 9.01(s, 1H), 9.29(d, J = 7.8Hz, 1H), 10.91(s, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 455.8([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 99.58%
화합물의 속성: 황색 저융점 고체
실시예 5: 3-(4-하이드록시페닐)2-[(피리딘-3-카르보닐)아미노]프로피온산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3-(4-hydroxy phenyl )2-[(pyridine-3-carbonyl)amino]propionic acid -4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00026
단계 1: 3-(4-하이드록시페닐)2-[(피리딘-3-카르보닐)아미노]프로피온산메틸에스테르(3-(4-hydroxy phenyl)2-[(pyridine-3-carbonyl)amino]propionic acid methyl ester)의 제조
Figure pct00027
질소 하에서 DCM(20㎖) 내의 나이아신(1.26g, 10.24mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(2.25㎖, 25.0mmol), EDCI.HCl(5.87g, 30.73mmol) 및 아민(2.0g, 10.24mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석시키고, 물(100㎖, 3회)로 희석시키고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 백색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(1.7g, 56.6%).
단계 2: 3[4-(t-부틸-디메틸-실릴옥시)페닐]2-[(피리딘-3-카르보닐)아미노]프로피온산메틸에스테르(3[4-(t-butyl-dimethyl-silyloxy)phenyl]2-[(pyridine-3-carbonyl)amino]propionic acid methyl ester)의 제조
Figure pct00028
DMF(l㎖) 내의 3-(4-하이드록시페닐)2-[(피리딘-3-카르보닐)아미노]프로피온산메틸에스테르(0.53g, 1.76mmol)의 용액에 N,N'-디이소프로필에틸아민(N,N'-Di isopropyl ethyl amine ; 0.47㎖, 2.00mmol)을 첨가하고 계속해서 반응혼합물을 (0℃)까지 냉각시키고, (0℃)에서 반응덩어리에 t-부틸-디메틸-실릴클로라이드(t-butyl dimethyl-silylchloride ; 0.26g, 1.76mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 5시간 동안 교반시켰다. 반응혼합물을 얼음으로 퀀칭(quenched)시키고, 에틸아세테이트(100㎖)로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 감압 하에서 용매를 증발시켜 엷은 갈색 액체(pale brown liquid)로서 생성물을 수득하였다(0.6g, 82%).
단계 3: 3[4-(t-부틸-디메틸-실릴옥시)페닐]2-[(피리딘-3-카르보닐)아미노]프로피온산(3[4-(t-butyl-dimethyl-silyloxy)phenyl]2-[(pyridine-3-carbonyl) amino] propionic acid)의 제조
Figure pct00029
메탄올(l㎖), THF(3㎖) 내의 메틸에스테르(0.91g)의 용액에 물(l㎖)에 용해시킨 LiOH(0.45g, 10.97mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응혼합물로부터 용매를 박리해내고, 반응덩어리를 1.5N HCl(pH = 2 내지 4)을 사용하여 산성화시켰다. 에틸아세테이트(200㎖)로 유리산(free acid)을 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 그리고 농축시켰다. 수득된 황색 고체를 직접 다음 단계로 가져갔다.
주의: 이 산 작업(acid workup) 동안 t-부틸디메틸실릴클로라이드 분리(t-butyl dimethyl silylchloride cleavage)가 관측되었다.
단계 4: 3-(4-하이드록시페닐)2-[(피리딘-3-카르보닐)아미노]프로피온산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3-(4-hydroxy phenyl)2-[(pyridine-3-carbonyl)amino]propionic acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00030
DCM(40㎖) 내의 3[4-(t-부틸-디메틸-실릴옥시)페닐]2-[(피리딘-3-카르보닐)아미노]프로피온산(0.498g, 17.4mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(0.528g, 5.2mmol), EDCI.HCl(0.66g, 3.4mmol) 및 유게놀(0.22g, 13.9mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고, 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 상에서 더욱 정제시켜 엷은 황색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(0.75g, 31.5%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , DMSO - d 6 ) d( ppm ): 3.11-3.47(m, 4H), 4.52(s, 3H), 5.06-5.14(m, 3H), 5.94-6.03(m, 1H), 6.74-6.81(m, 3H), 6.92-6.98(m, 2H), 7.18-7.21(m, 2H), 7.51-7.55(m, 1H), 8.15-8.19(m, 1H), 8.68(d, J = 3.9Hz, 1H), 8.90(bs, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 433.1([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 99.5%
화합물의 속성: 엷은 황색 고체
실시예 6: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-pentanoic acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
KU -020의 합성
Figure pct00031
단계 1: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐-아미노]-펜타논산메틸에스테르(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl-amino]-pentanoic acid methyl ester)의 제조
Figure pct00032
DCM(20㎖) 내의 니코틴산(2.0g, 16.5mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(6.9㎖, 49.5mmol), EDCI.HCl(6.3g, 33.0mmol) 및 이소류신메틸에스테르(isoleucine methyl ester ; 3.0g, 16.5mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 2.5시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석시키고, 물(100㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 황색 고체로서 생성물을 수득하였다(2.9g, 72%).
단계 2: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐-아미노]-펜타논산(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl-amino]-pentanoic acid)의 제조
Figure pct00033
메탄올(lO㎖), THF(9㎖) 내의 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐-아미노]-펜타논산메틸에스테르(1.5g, 5.9mmol)의 용액에 물(3㎖)에 용해시킨 LiOH(1.25g, 29.9mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 반응덩어리로부터 메탄올과 THF를 박리해내고, 상기 반응덩어리를 1.5N HCl(pH = 2 내지 3)을 사용하여 산성화시켰다. 상기 반응덩어리를 에틸아세테이트(100㎖)로 3회(thrice) 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 그리고 농축시켜 엷은 황색 고체로서 생성물을 수득하였다(0.7g, 50%).
단계 3: 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(3-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-pentanoic acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00034
DCM(4㎖) 내의 3-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐-아미노]-펜타논산(0.47g, 1.59mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(9.49g, 4.9mmol), EDCI.HCl(0.62g, 3.28mmol) 및 유게놀(0.26g, 1.59mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 4시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 백색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(0.12g, 19.3%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , DMSO - d 6 ) d( ppm ): 0.91-0.98(m, 3H), 1.06-1.14(m, 3H), 1.20-1.41(m, 1H), 1.50-1.70(m, 1H), 2.09-2.30(m, 1H), 3.36(d, J = 6.9Hz, 3H), 3.72(s, 3H), 4.63-4.87(m, 1H), 5.04-5.13(m, 2H), 5.96-5.98(m, 1H), 6.76-6.79(m, 1H), 6.95-7.00(m, 2H), 7.50-7.55(m, 1H), 8.21-8.25(m, 1H), 8.72-8.74(m, 1H), 8.89-9.04 (m, 3H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 382.9([M+H]+).
화합물의 속성: 백색 고체
실시예 7: 2-[피리딘-3-카르보닐-아미노]-펜탄디온산-1-(4-알릴-2-메톡시페닐)에스테르(2-[pyridine-3-carbonyl-amino]-pentane dioic acid-1-(4-allyl-2-methoxy phenyl)ester)의 제조
Figure pct00035
단계 1: 2-벤조일아미노-펜탄디온산디메틸에스테르(2-benzoyl amino-pentane dioic acid dimethyl ester)의 제조
Figure pct00036
DCM(20㎖) 내의 나이아신(l.4g, 11.42mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(3.76㎖, 34.2mmol), EDCI.HCl(4.36g, 34.2mmol) 및 L-글루탐산디메틸에스테르(L-glutamic acid dimethyl ester ; 2.0g, l1.42mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 엷은 황색 오일로서 요구된 생성물을 수득하였다(3.1g, 73%).
단계 2: 2-[피리딘-3-카르보닐-아미노]-펜탄디온산(2-[pyridine-3-carbonyl-amino]-pentanedioic acid)의 제조
Figure pct00037
메탄올(2㎖), THF(9㎖) 내의 2-벤조일아미노-펜탄디온산디메틸에스테르(0.25g, 0.89mmol)의 용액에 물(3㎖)에 용해시킨 LiOH(0.037g, 8.9mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. THF, 메탄올을 박리시켰다. 1.5N HCl을 이용하여 pH를 1로 하고, 반응덩어리를 에틸아세테이트(100㎖)로 3회 추출하였다. 황산나트륨 상에서 건조시키고 그리고 농축시켰다. 분석 결과 1가산(mono acid) 및 2가산(di acid)들이 발견되었으며 이를 다음 단계로 가져갔다(1.6g).
단계 3: 2-[피리딘-3-카르보닐-아미노]-펜탄디온산-1-(4-알릴-2-메톡시페닐)에스테르(2-[pyridine-3-carbonyl-amino]-pentane dioic acid-1-(4-allyl-2-methoxy phenyl)ester)의 제조
Figure pct00038
DCM(10㎖) 내의 2가산(100㎎, 0.42mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(0.085g, O.84mmol), EDCI.HCl(0.097g, 0.50mmol) 및 유게놀(0.055g, 0.33mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응혼합물을 물(5㎖)로 퀀칭시키고, DCM(100㎖)으로 희석시키고, 물세척을 수행하고(50㎖, 3회), 황산나트륨 상에서 건조시키고 그리고 농축시켰다. 조반응덩어리(crude reaction mass)를 조제용 HPLC(preparative HPLC(고성능 액체크로마토그래피))로 정제시켜 엷은 황색고체를 수득하였다(0.16g, 0.29%).
실시예 8: 니코틴산 4-알릴-2-메톡시페녹시카르보닐메틸에스테르(염산염)(nicotinic acid 4-allyl-2-methoxyphenoxycarbonylmethyl ester (Hydrochloride salt))의 제조:
Figure pct00039
단계 1: 브로모-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(bromo-acetic acid 4-allyl-2-methoxy-phenyl ester)의 제조
Figure pct00040
0℃에서 디클로로메탄(5㎖) 내의 유게놀(500㎎, 3.03mmol)의 용액에 K2C03(1.0g, 7.57mmol)을 그리고 후속하여 브로모아세틸브로마이드(bromo acetyl bromide ; 931㎎, 4.54mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 1시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(200㎖)로 희석시키고, 물(200㎖, 2회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 점성의 오일로서 브로모-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르를 수득하였다(550㎎, 63%).
단계 2: 니코틴산 4-알릴-2-메톡시-페녹시카르보닐메틸에스테르(Nicotinic acid 4-allyl-2-methoxy-phenoxycarbonylmethyl ester)의 제조
Figure pct00041
0℃에서 DMF(4.0㎖) 내의 니코틴산(172㎎, 1.40mmol)의 용액에 K2C03(605㎎, 4.38mmol)를 첨가하였다. 동일한 온도에서 이 혼합물에 DMF(1.0㎖) 내의 화합물 1-a(500㎎, 1.75mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응혼합물을 25℃에서 60분 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(400㎖)로 희석시키고, 물(200㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 점성의 오일로서 생성물을 수득하였다(500㎎).
0℃에서 디에틸에테르(5.0㎖) 내의 상기 생성물(500㎎, 1.52mmol)의 용액에 디옥산(dioxane ; 0.36㎖, 0.95mmol) 내의 4M HCl의 용액을 첨가하였다. 반응혼합물을 실온(25℃)에서 90분 동안 교반시켜 무색의 침전물을 수득하였다. 용매를 경사(decant ; 한 용기에서 다른 용기로 옮겨 붓는 것)시키고 감압 하에서 건조시켜 무색의 고체로서 생성물을 수득하였다(450㎎, 85%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , DMSO - d 6 ) d( ppm ): 3.37 (d, J = 6.9Hz, 1H), 3.77(s, 3H), 5.04-5.14(m, 2H), 5.28(s, 1H), 5.90-6.02(m, 1H), 6.77-6.81(m, 1H), 6.98(d, J = 1.5Hz, 1H), 7.05-7.07(m, 1H), 7.71-7.75(m, 1H), 8.47-8.51(m, 1H), 8.92-8.94(m, 1H), 9.21(d, J = 1.2Hz, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 328.2([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 99.41%
화합물의 속성: 엷은 황색 고체
융점 범위: 109.3 내지 111.2℃
실시예 9: 2-(피리딘-3-카르보닐옥시)-숙신산 4-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르 1-메틸에스테르(2-(Pyridine-3-carbonyloxy)-succinic acid 4-(4-allyl-2-methoxy-phenyl)ester 1-methyl ester)의 제조
Figure pct00042
단계 1. ((S)-2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산(((S)-2,2-Dimethyl-5-oxo-[1,3]dioxolan-4-yl)-acetic acid)의 제조
Figure pct00043
실온(25℃)에서 2,2-디메톡시프로판(5.0㎖) 내의 L(-)-말레산(L-(-)-Malic acid ; 5.0g, 37.3mmol)의 현탁액에 PPTS(0.13g, 0.5mmol)를 첨가하였다. 반응혼합물을 동일한 온도에서 48시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 물(100㎖)과 디클로로메탄(250㎖) 사이에서 분획(partitioned)하고, 수성층(aqueous layer)을 디클로로메탄(lOO ㎖, 2회)으로 2회 추출하였다. 결합된 유기층들을 건조시키고(Na2S04) 그리고 감압하에서 농축시켜 무색 고체를 수득하였다(2.1g, 32%).
단계 2: (2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르((2,2-Dimethyl-5-oxo-[1,3]dioxolan-4-yl)-acetic acid 4-allyl-2-methoxy-phenyl ester)의 제조
Figure pct00044
결빙온도(ice temperature ; 0℃)에서 디클로로메탄 내의 ((S)-2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산(2.1g, 12.0mmol)의 용액에 N-에틸디이소프로필아민(N-ethyldiisopropyl amine ; 10.3㎖), EDCI.HCl(6.9g, 36.0mmol), HOBt(1.8g, 12.0mmol), DMAP(0.14g, 1.2mmol)를 첨가하고 그리고 동일한 온도에서 반응혼합물을 15분 동안 교반시켰다. 계속해서 동일한 온도에서 상기 반응혼합물에 유게놀(2.18g, 13.2mmol)을 첨가하고 그리고 그 혼합물을 실온(25℃)에서 12시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 디클로로메탄(200㎖)으로 희석시키고, 물(lOO㎖, 4회)로 세척하고, 건조시키고(Na2S04) 그리고 농축시켰다. 수득된 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 무색 고체를 수득하였다(2.3g, 60%).
단계 3: 2-하이드록시-숙신산 4-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르(2-Hydroxy-succinic acid 4-(4-allyl-2-methoxy-phenyl) ester)의 제조
Figure pct00045
실온(25℃)에서 THF(10.0㎖) 내의 (2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(1.0g, 3.12mmol)의 용액에 1N 염산(10㎖)을 첨가하고 그리고 동일한 온도에서 그 혼합물을 6시간 동안 교반시켰다. 용매를 절반의 용적으로 증발시키고, 염화나트륨으로 포화시키고 그리고 그 생성물을 에틸아세테이트(100㎖, 2회)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 그리고 농축시켜 오프 화이트 고체를 수득하였다(0.81g, 93%).
단계 4: 2-하이드록시-숙신산 4-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르 1-메틸에스테르(2-Hydroxy-succinic acid 4-(4-allyl-2-methoxy-phenyl)ester 1-methyl ester)의 제조
Figure pct00046
0℃에서 건조 DMF(2.0㎖) 내의 2-하이드록시-숙신산4-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르(0.1g, 0.35mmol)의 용액에 건조 K2C03를 그리고 후속하여 요오드화메틸(methyl iodide ; 0.024㎖)을 첨가하고 그리고 그 반응혼합물을 실온(25℃)에서 60분 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(50.0㎖)로 희석시키고 그리고 여과하였다. 여과액(filtrate)을 물(200㎖, 4회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 휘발분(volatiles)들의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 오렌지색의 점성 액체(orange color viscuss liquid)를 수득하였다(0.05g, 47%).
단계 5: 2-(피리딘-3-카르보닐옥시)-숙신산 4-(4-알릴-2-메톡시페닐)에스테르 1-메틸에스테르(2-(Pyridine-3-carbonyloxy)-succinic acid 4-(4-allyl-2-methoxyphenyl)ester 1-methyl ester)의 제조
Figure pct00047
0℃에서 디클로로메탄(10.0㎖) 내의 나이아신(90㎎, 0.7mmol)의 현탁액에 N-에틸디이소프로필아민(N-ethyldiisopropyl amine ; 0.58㎖, 3.0mmol), EDCI.HCl(380㎎, 2.0mmol), HOBt(50㎎, 0.3mmol)을 첨가하고 그리고 15분 동안 교반시켰다. 계속해서 동일한 온도에서 2-하이드록시-숙신산 4-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르(200㎎, 0.6mmol)를 첨가하고 그리고 실온(25℃)에서 그 반응혼합물을 5시간 동안 교반시켰다. 그 반응혼합물을 DCM(150㎖)으로 희석시키고, 물(50㎖, 4회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 휘발분들의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 엷은 황색의 점성의 오일을 수득하였다(140㎎, 51%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , CDCl 3 ) d( ppm ): 3.32(d, J = 6.3Hz, 2H), 3.37(d, J = 6.6Hz, 2H), 3.73(s, 3H), 3.84(s, 3H), 5.07(s, 1H), 5.10-5.13(m, 1H), 5.85-5.98(m, 2H), 6.74-6.76(m, 2H), 6.92-6.95(m, 1H), 7.40-7.45(m, 1H), 8.35-8.39(m, 1H), 8.82(d, J = 3.6Hz, 1H), 9.31(s, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 400.0([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도( HPLC purity ): 99.23%
화합물의 속성: 엷은 황색의 점성의 오일, 냉장고 내에서의 저장 시 저융점의 고체(48℃)가 됨.
실시예 10: 1-(피리딘-3-카르보닐)-피롤리딘-2-카르복실산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(1-(pyridine-3-carbonyl)-pyrrolidine-2-carboxylic acid 4-allyl-2-methoxy-phenyl ester)의 제조
Figure pct00048
단계 1: 1-(피리딘-3-카르보닐)-피롤리딘-2-카르복실산메틸에스테르(1-(pyridine-3-carbonyl)-pyrrolidine-2-carboxylic acid methyl ester)의 제조
Figure pct00049
결빙온도(0℃)에서 DCM(10㎖) 내의 나이아신(0.4g, 3.50mmol)의 용액에 L-프롤린메틸에스테르(L-proline methyl ester ; 0.5g, 3.21mmol), N-메틸몰포린(1.1㎖, 10.5mmol), EDC.HCl(1.2g, 6.4mmol) 및 촉매량(catalytic amount)의 DMAP를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고 물(100㎖, 2회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 감압하에서 용매를 증발시켜 황색의 검 모양의 오일(yellow gummy oil)로서 생성물을 수득하였다(1.3g).
단계 2: 1-(피리딘-3-카르보닐)-피롤리딘-2-카르복실산(1-(pyridine-3-carbonyl)-pyrrolidine-2-carboxylic acid)의 제조
Figure pct00050
실온(25℃)에서 THF(13㎖) 내의 1-(피리딘-3-카르보닐)-피롤리딘-2-카르복실산메틸에스테르(1.3g, 5.4mmol)의 용액에 수(1.3㎖) 중의 수산화리튬(lithium hydroxide ; 0.34g, 8.1 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 반응혼합물로부터 THF를 증발시키고, 그 잔사(residue)를 메탄올에 용해시키고, pH = 4로 산성화시키고, 여과하고 그리고 증발시켜 증발에 의한 끈적끈적한 액체(sticky liquid)를 디에틸에테르로 적정(titurated)하여 오프 화이트 고체로서 요구된 화합물을 수득하였다(1.0g, 83%).
단계 4: 1-(피리딘-3-카르보닐)-피롤리딘-2-카르복실산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(1-(pyridine-3-carbonyl)-pyrrolidine-2-carboxylic acid 4-allyl-2-methoxy-phenyl ester)의 제조
Figure pct00051
실온(0℃)에서 DCM(20㎖) 내의 유게놀(0.7g, 4.2mmol)의 용액에 1-(피리딘-3-카르보닐)-피롤리딘-2-카르복실산(lg, 4.6mmol)을 그리고 후속하여 N-메틸몰포린(2.7㎖, 25.2mmol), EDCI.HCl(1.6g, 8.4mmol) 및 촉매량의 DMAP를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 12시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석시키고 물(100㎖, 2회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제하여 엷은 황색의 검 모양의 화합물로서 결과의 생성물을 수득하였다(260㎎, 16%).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 367.0([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도( HPLC purity ): 99.26%
화합물의 속성: 엷은 황색의 검 모양의 고체
실시예 11: [(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르([(pyridine-3-carbonyl)-amino]-acetic acid 4-allyl-2-methoxy-phenyl ester)의 제조
Figure pct00052
단계 1: 아미노-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(Amino-acetic acid 4-allyl-2-methoxy-phenyl ester)의 제조
Figure pct00053
결빙온도에서 DCM(20㎖) 내의 유게놀(0.3g, 1.82mmol)의 용액에 부틸옥시카르보닐-글리신(Boc-glycine ; 0.35g, 2.01mmol), N-메틸몰포린(0.65㎖, 6.00mmol), EDC.HCl(0.76g, 4.0mmol) 및 DMAP를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 12시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고 물(50㎖, 2회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 엷은 황색 오일로서 결과의 생성물을 수득하였다(300㎎, 46.9%).
단계 2: 아미노-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르트리플루오로아세테이트(Amino-acetic acid 4-ally1-2-methoxy-phenyl ester Trifluoroacetate)의 제조
Figure pct00054
(0℃)에서 DCM(10㎖) 내의 화합물 아미노-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(0.3g)의 용액에 트리플루오로아세트산(0.5㎖)을 적가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 용매를 완전히 박리해내고 반응을 다음 단계로 옮겼다(510㎎).
단계 3: [(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-아세트산 4-알릴-2-메톡시페닐에스테르([(pyridine-3-carbonyl)-amino]-acetic acid 4-allyl-2-methoxyphenyl ester)의 제조
Figure pct00055
결빙온도(0℃)에서 DCM(20㎖) 내의 아미노-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(510㎎, 1.7mmol)의 용액에 나이아신(0.23g, 1.9mmol), N-메틸몰포린(0.96㎖, 8.8mmol), EDC.HCl(0.67g, 3.5mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석시키고 물(lOO㎖, 2회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 오프 화이트 고체로서 생성물을 수득하였다(210㎎, 43%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , CDCl 3 ) d( ppm ): 3.40(d, J = 8.4Hz, 2H), 3.84(s, 3H), 4.55(d, J = 5.1Hz, 2H), 5.09-5.15(m, 2H), 5.92-6.01(m, 1H), 6.78-6.83(m, 2H), 6.96-7.02(m, 1H), 7.39-7.43(m, 1H), 8.15-8.19(m, 1H), 8.74-8.96(m, 1H), 9.07 (d, J = 2.1Hz, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 372.0([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 98.25%
화합물의 속성: 오프 화이트 고체
실시예 12: (S)-2-하이드록시-숙신산 비스-(4-알릴-2-메톡시페닐)에스테르((S)-2-hydroxy-succinic acid bis-(4-allyl-2-methoxyphenyl)ester)의 제조
단계 1: ((S)-2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산(((S)-2,2-Dimethyl-5-oxo-[1,3]dioxolan-4-yl)-acetic acid)의 제조:
Figure pct00056
실온(25℃)에서 2,2-디메톡시프로판(2,2-dimethoxy propane ; 200㎖) 내의 L-(-)말산(100.0g, 0.74mol)의 용액에 PPTS(2.60g, 15.11mmol)을 첨가하였다. 반응혼합물을 동일한 온도에서 48시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 물(1.0ℓ)과 디클로로메탄(2.5ℓ) 사이에서 분획하고, 그 수성층을 디클로로메탄(500㎖, 2회)으로 2회 추출하였다. 결합된 유기층들을 건조시키고(Na2SO4) 감압하에서 농축시켜 무색 고체를 수득하였다(75.0g, 58%).
단계 2: (2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르((2,2-Dimethyl-5-oxo-[1,3]dioxolan-4-yl)-acetic acid 4-allyl-2-methoxy-phenyl ester)의 제조:
Figure pct00057
결빙온도(0℃)에서 디클로로메탄(300㎖) 내의 ((S)-2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산(30.0g, 0.17mol)의 용액에 N-에틸디이소프로필아민(N-ethyldiisopropyl amine ; 147㎖, 0.86mol), EDCI.HCl(98.0g, 0.51mol), HOBt(13.1g, 0.08mol), DMAP(0.2g, 0.01mol)을 첨가하고 그리고 그 반응혼합물을 동일한 온도에서 15분 동안 교반시켰다. 계속해서 동일한 온도에서 그 반응혼합물에 유게놀(26.1㎖, 0.17mol)을 첨가하고 그리고 그 혼합물을 실온(25℃)에서 5시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 디클로로메탄(2.0ℓ)으로 희석시키고, 물(500㎖, 4회)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4) 그리고 농축시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 잔사를 석유에테르(petroleum ether)로 세척하여 오프 화이트 고체로서 생성물을 수득하였다(35.0g, 63%).
단계 3: 2-하이드록시-숙신산 4-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르(2-Hydroxy-succinic acid 4-(4-allyl-2-methoxy-phenyl) ester)의 제조:
Figure pct00058
실온(25℃)에서 THF(350㎖) 내의 (2,2-디메틸-5-옥소-[1,3]디옥솔란-4-일)-아세트산 4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(35.0g, 0.10mol)의 용액에 1N 염산(350㎖)을 첨가하고 그리고 그 혼합물을 동일한 온도에서 8시간 동안 교반시켰다. 용매를 절반의 용적까지 증발시키고, 염화나트륨으로 포화시키고 그리고 그 생성물을 에틸아세테이트(850㎖, 2회)로 추출하였다. 유기층을 황산나트륨 상에서 건조시키고 그리고 농축시켜 오프 화이트 고체를 수득하였다(30.0g, 98%).
단계 4: (S)-2-하이드록시-숙신산 비스-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르((S)-2-hydroxy-succinic acid bis-(4-allyl-2-methoxy-phenyl)ester)의 제조:
Figure pct00059
결빙온도(0℃)에서 디클로로메탄(450㎖) 내의 2-하이드록시-숙신산 4-(4-알릴-2-메톡시-페닐)에스테르(20.0g, 0.07mol)의 용액에 N-에틸디이소프로필아민(61.0㎖, 0.35mol), EDCI.HCl(40.8g, 0.21mol), HOBt(5.4g, 0.03mmol), DMAP(87㎎, 0.7mmol)를 첨가하고 그리고 그 반응혼합물을 동일한 온도에서 15분간 교반시켰다. 계속해서 동일한 온도에서 상기 반응혼합물에 유게놀(11.7g, 0.07mol)을 첨가하고 그리고 그 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다.
결빙온도(0℃)에서 상기 반응혼합물에 N-에틸디이소프로필아민(24.0㎖, 0.14mol)을 그리고 후속해서 염화니코티노일염산염(nicotinoyl chloride hydrochloride ; 25.4g, 0.14mol)을 첨가하고 그리고 그 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(2.0ℓ)로 희석시키고, 물(1.0ℓ, 4회)로 세척하고, 건조시키고(Na2SO4) 그리고 농축시켰다. 수득된 조생성물을 컬럼 크로마토그래피로 더 정제하여 황색의 점성 액체를 수득하였다(10.02g, 37%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , DMSO - d 6 ) d( ppm ): 3.34-3.38(m, 4H), 3.53-3.55(m, 2H), 3.65(s, 3H), 3.75(s, 3H), 5.04-5.08(m, 2H), 5.13(s, 1H), 5.14(s, 1H), 5.92-6.02(m, 3H), 6.77-6.80(m, 2H), 6.95-7.06(m, 4H), 7.63-7.67(m, 1H), 8.36-8.40(m, 1H), 8.88-8.90(m, 1H), 9.18(s, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 532.1([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 98.42%
화합물의 속성: 엷은 황색 점성 오일
실시예 13: 4[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-부티르산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(4[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-butyric acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00060
단계 1: 4[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-부티르산메틸에스테르(4[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-butyric acid methyl ester)의 제조
Figure pct00061
니코틴산(1.6g, 13.0mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(4.29㎖, 39.04mmol), EDCI.HCl(4.0g, 26.0mmol) 및 아민(2.0g, 13.00mmol)을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 혼합물을 실온(25℃)에서 3시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(200㎖)으로 희석시키고, 물(100㎖, 2회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 백색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(1.59g, 55%).
단계 2: 4[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-부티르산(4[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-butyric acid)의 제조
Figure pct00062
THF(14㎖) 내의 4[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-부티르산메틸에스테르(0.8g, 3.5mmol)의 용액에 물(6㎖)에 용해시킨 LiOH(0.75g, 17.9mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 밤새도록 교반시켰다. 50%의 출발물질은 있는 그대로 남겨 두었다. 계속해서 반응혼합물을 (45℃)로 가열시켰다. 반응은 진행되지 않았다. 그 반응혼합물을 클로로포름으로 처리(worked up)하여 출발물질을 회수하였다. 수성층을 물로 희석시키고, 1.5N HCl로 (pH = 2 내지 3)이 될 때까지 산성화시키고, 에틸아세테이트(150㎖)로 추출하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켜 황색 고체를 수득하였다(0.6g, 80%).
단계 3: 4[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-부티르산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(4[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-butyric acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00063
DMF(10㎖) 내의 4[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-부티르산(0.6g, 2.8mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(0.9㎖, 8.6mmol), EDCI.HCl(1.1g, 5.7mmol) 및 유게놀(0.4㎖, 4.8mmol)을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 혼합물을 실온(25℃)에서 밤새도록 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 에틸아세테이트(200㎖)로 희석시키고, 물(100㎖, 4회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 조제용 HPLC로 더욱 정제시켜 무색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다.
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 355.1([M+H]+).
화합물의 속성: 무색 고체
실시예 14: 4-알릴-2-메톡시페닐 2-(니코틴아미도)프로파노에이트(4-allyl-2-methoxyphenyl 2-(nicotinamido) propanoate)의 제조
Figure pct00064
단계 1: 2-3차-부톡시카르보닐아미노-프로피온산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(2-tert-butoxycorbonylamino-propionic aid-4-allyl-2-methoxyphenyl ester)의 제조
Figure pct00065
결빙온도(0℃)에서 DCM(30㎖) 내의 N-부틸옥시카르보닐-알라닌(N-Boc-alanine ; 3g, 14.7mmol)의 용액에 EDC.HCl(3.73g, 29.5mmol), N-메틸몰포린(2.86㎖, 44.2mmol) 및 유게놀(1.5㎖, 14.7mmol)을 첨가하였다. 질소 하에서 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(300㎖)으로 희석시키고, 물(lOO㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 오프 화이트 고체로서 결과의 생성물을 수득하였다(3g, 61%).
단계 2: 2[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산-4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(2[(pyridine-3-carbonyl)-amino]-propionic acid-4-allyl-2-methoxy-phenylester)의 제조
Figure pct00066
(0℃)에서 DCM(10㎖) 내의 2-3차-부톡시카르보닐아미노-프로피온산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(1.0g, 2.9mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산(1.0g, 8.9mmol)을 적가하였다. 질소 하에서 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시키고 그리고 진공 하에서 TFA를 박리해내고, 조생성물 덩어리(crude mass)의 pH를 탄산수소염 용액(bicarbonate solution)으로 6 내지 7로 조정하였다. 에틸아세테이트(100㎖)로 유리 아민(free amine)을 추출해내고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시키고 농축시켜 오프 화이트 고체를 수득하였다(0.45g, 64%).
단계 3:
Figure pct00067
질소 하에서 DCM(6㎖) 내의 니코틴산(0.280g, 0.42mmol)의 용액에 EDCI.HCl(0.876g, 0.85mmol), N-메틸몰포린(0.74㎖, 1.27mmol) 및 2[(피리딘-3-카르보닐)-아미노]-프로피온산-4-알릴-2-메톡시-페닐에스테르(0.543g, 0.42mmol)를 첨가하였다. 질소 하에서 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 백색 고체로서 결과의 생성물을 수득하였다(0.30g, 38.4%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , CDCl 3 ) d( ppm ): 1.79(d, J = 7.2Hz, 3H), 3.38-3.44(m, 2H), 3.83(s, 3H), 4.38(bs, 1H), 5.02-5.14(m, 3H), 5.89-6.02(m, 1H), 6.76-6.78(m, 2H), 6.85-7.02(m, 1H), 7.60(bs, 1H), 8.10(bs, 1H), 8.57(bs, 1H), 8.77(bs, 1H), 9.56(s, 1H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 341.0([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 92.07%
화합물의 속성: 백색 고체
실시예 15: 4-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(4-methyI-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-pentanoic acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00068
단계 1: 4-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산메틸에스테르(4-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-pentanoic acid methyl ester)
Figure pct00069
DCM(20㎖) 내의 나이아신(1.35g, 11.0mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(3.34g, 33.00mmol), EDCI.HCl(4.2g, 22.02mmol) 및 L-로이신메틸에스테르 염산염(L-leucinemethyl ester hydrochloride ; 2.0g, 11.0mmol)을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 혼합물을 실온(25℃)에서 2.5시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(200㎖)로 희석시키고, 물(lOO㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 백색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(2.0g, 72%).
단계 2: 4-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산(4-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-pentanoic acid)의 제조
Figure pct00070
메탄올(8㎖), THF(3㎖) 내의 4-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산메틸에스테르(0.80g, 3.3mmol)의 용액에 물(9㎖)에 용해시킨 LiOH(0.7g, 16.9mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온(25℃)에서 2.5시간 동안 교반시켰다. 반응덩어리로부터 메탄올과 THF를 박리해내고, 상기 반응덩어리를 1.5N HCl을 사용하여 산성화시켰다(pH = l). 상기 반응덩어리를 에틸아세테이트(100㎖)로 3회 추출하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시키고 그리고 농축하여 엷은 황색 고체로서 생성물을 수득하였다(0.45g, 60%).
단계 3: 4-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산-4-알릴-2-메톡시페닐에스테르(4-methyl-2-[pyridine-3-carbonyl]-amino-pentanoic acid-4-allyl-2-methoxy phenyl ester)의 제조
Figure pct00071
DCM(5㎖) 내의 4-메틸-2-[피리딘-3-카르보닐]-아미노-펜타논산(0.47g, 1.99mmol)의 용액에 N-메틸몰포린(0.6㎖, 5.99mmol), EDCI.HCl(0.76g, 3.99mmol) 및 유게놀(0.32㎖, 1.99mmol)을 첨가하였다. 질소 분위기 하에서 혼합물을 실온(25℃)에서 2.5시간 동안 교반시켰다. 그 결과의 혼합물을 DCM(100㎖)으로 희석시키고, 물(50㎖, 3회)로 세척하고 그리고 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매의 증발에 의하여 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 더욱 정제시켜 백색 고체로서 요구된 생성물을 수득하였다(0.09g, 12%).
양성자 핵자기공명 분광분석(300 MHz , DMSO - d 6 ) d( ppm ): 0.94-0.99(m, 6H), 1.79-1.93(m, 3H), 3.36(d, J = 9.3Hz, 2H), 3.73(s, 3H), 4.75(bs, 1H), 5.04-5.14(m, 2H), 5.92-5.98(m, 1H), 6.75-6.78(m, 1H), 6.95-7.00(m, 2H), 7.51-7.56(m, 1H), 8.23-8.27(m, 1H), 8.72-8.74(m, 1H), 8.05-9.12(m, 2H).
액체크로마토그래피-질량분석(전자분무이온화) m/z: 383.0([M+H]+).
고성능 액체크로마토그래피 순도: 98.59%
화합물의 속성: 백색 고체
인간 신경 SH - SY5Y 세포들 내에서의 화합물들에 의한 Aβ42 생산의 감소:
상기 화합물들의 농도들을 증가시키면서 세포들을 밤새도록 배양시켰다. 계속해서 세포 배지를 수확하고 그리고 샌드위치 ELISA(sandwich ELISA)를 사용하여 상기 배지 내의 Aβ42를 정량하였다. 결과들을 표 1(Aβ42 분비의 차단에서의 화합물들의 효과)에 나타내었다.
Figure pct00072
[표 1 - 계속]
Figure pct00073
[표 1 - 계속]
Figure pct00074
화합물 9는 랫트 신규한 대상체 인지 시험( NORT ; novel object recognition test )에서 인지 기능을 향상시킴:
화합물 9를 상기한 방법들에서 기술한 바와 같이 NORT 시험에서 시험하였다. 근본적으로 상기 화합물은 시험된 전 투여량들(0 내지 90㎎/㎏/일)에서 친숙한 대상체와 신규한 대상체 사이를 구별하는 그들의 능력에서 기술한 바와 같이 인지 기능이 향상되는 것을 나타내었으며, 향상들은 양성 대조(positive control) 돈페질과 유사하거나 보다 더 높았다(하기 나타낸 도 1 및 도 2).
Aβ42의 랫트 뇌 수준들에 대한 화합물 9의 효과
2주간 동안 랫트들을 치료한 후, 뇌 내에서의 가용성 Aβ42 수준들(표 2: 화합물 9로의 랫트의 치료 이후의 뇌 내에서의 Aβ42 수준)을 추산하고 그리고 하기 표에 나타내었다. 이 펩티드의 수준들에서 상기 화합물에 의한 용량 의존적 감소(dose dependent decrease)가 있었으며 저감시키는 치료(therapeutic lowering)를 암시하고 있다.
치료군 Aβ42 수준들(ng/㎎ 단백질)
평균±표준오차(SE)		 변화 백분율
대조 56.51±7.57
심바스타틴, 250㎎/㎏ 60.83±7.65 8
화합물 9, 10㎎/㎏ 44.14±7.88 -22
화합물 9, 25㎎/㎏ 31.03±3.98* -45
화합물 9, 50㎎/㎏ 21.85±1.75** -61
P<0.05, **P<O.OOl, 일방향 아노바(One way ANOVA)에 후속하여 대조(control)에 대한 던네트 실험(Dunnett's test)
주의: 심바스타틴군(Simvastatin group)은 12일차에서 종료됨.
모리스 수중 미로 시험에서의 인지에 대한 화합물 9의 효과:
모리스 수중 미로 연구(상기 방법들에서 제공된 바와 같은)로부터의 결과들을 표 3에 나타내었다. 개선된 인지의 측정은 상기 동물들에 의한 목표 4분의에 도달하는 데 걸린 시간이다. 비히클치료군(vehicle treated group)의 목표에로의 지연은 1일차, 2일차, 3일차 및 4일차에서 스코폴라민치료군(scopolamine treated group)과 비교하여 명백하게 덜하였다. 비히클치료군의 통과 경로 및 수영 속도는 4일 모두에서 스코폴라민치료군과 비교하여 명백하게 덜하였다. 유사하게, 스코폴라민치료군과 비교하여 도네페질로 치료된 군에서 2일차, 3일차 및 4일차에서 목표에로의 지연 및 통과 경로에서 유사한 명백한 감소가 관측되었다.
화합물 9(3㎎/㎏, 경구) 치료군에서는 스코폴라민치료군과 비교하여 1일차, 2일차, 3일차 및 4일차에서 목표에로의 지연에서 명백한 감소가 관측되었으며, 목표에로의 통과 경로에서는 명백한 감소가 3일차 및 4일차에서 관측되었다. 화합물 9(1㎎/㎏, 경구) 치료군에서는 스코폴라민치료군과 비교하여 3일차에서 목표에로의 통과 경로에서 명백한 감소가 관측되었으며, 상기 관측된 효과는 친인지 특성(procognitive property ; 수영 속도에서 변화가 없기 때문에)에 기여할 수 있다. 화합물 9(1㎎/㎏, 경구) 치료군에서는 스코폴라민치료군과 비교하여 4일차에서 목표에로의 통과 경로에서 명백한 감소가 관측되었다. 상기 화합물 9(3 및 10㎎/㎏, 경구) 치료군에서의 수영 속도는 상기 스코폴라민치료군과 비교하여 3일차에서 명백하게 덜하였다. 도네페질 및 스코폴라민치료군 사이에서 수영 속도에서의 명백한 차이는 관측되지 않았다. 화합물 9(10㎎/㎏, 경구) 치료군에서는 스코폴라민치료군과 비교하여 4일차에서 목표에로의 통과 경로에서 명백한 감소가 관측되었다.
검증시험 동안 비히클치료 동물들은 스코폴라민치료군과 비교하여 목표 4분의 내에서 명백하게 더 많은 시간을 소비하였다. 그러나 스코폴라민치료군과 비교하여 볼 때 상기 화합물 9와 도네페질 사이에서는 명백한 차이가 관측되지 않았다. 상기 비히클, 스코폴라민, 도네페질 및 화합물 9 치료군들 사이에서 수영 속도에서는 명백한 차이가 관측되지 않았다.
결론적으로, 특히 목표에로의 지연에서의 개선들로 주어진다면, 화합물 9가 친인지 특성(procognitive property)을 나타내고 그리고 인지 장애들을 치료하는 가능성이 있다.
표 3은 목표 지연, 습득 시도들에서의 수중 미로 내에서의 통과 경로 및 검증 시험에서의 목표 4분의 내에서 소요한 시간 백분율 및 수영 속도에 대한 화합물 9의 효과의 평균(±표준오차)를 나타내고 있다.
Figure pct00075
[표 3 - 계속]
Figure pct00076
[표 3 - 계속]
Figure pct00077
[표 3 - 계속]
Figure pct00078
COMPOUND 9 치료가 Tg2576 생쥐 모델에서의 Aβ42 펩티드 저감을 야기함
화합물 9(50㎎/㎏ 투여량, 매일 경구로 투여)로의 4주간 동안의 Tg 2576 생쥐의 치료가 가용성 Aβ-42 및 Aβ-40의 뇌 수준들을 각각 22% 및 23% 감소시켰다. 이러한 감소는 이 화합물이 알쯔하이머 질환과 연관된 2가지 발병성 펩티드(pathogenic peptides)를 저감시키는 능력을 입증하여 이 화합물의 치료효과를 암시한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 (I)의 신규한 화합물:
    Figure pct00079

    또는 그의 약제학적으로 수용가능한 염, 전구약물 또는 입체이성질체에 관한 것으로서,
    여기에서 X는 O, NR", S 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌으로부터 선택되고;
    L은 하나의 결합이거나 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌, 바람직하게는 치환되거나 또는 미치환된 탄소수 1 내지 4의 알킬렌이고 그리고 바람직하게는 치환체들은 Ra로부터 선택되고;
    X 및 L은 그들에 부착된 위치들과 함께 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴로 형성될 수 있고;
    Y는 하나의 결합, -C(O)-, -S(O)2-, NR" 또는 치환되거나 또는 미치환된 알킬렌이고,
    R1은 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬로부터 선택되고;
    R2는 H, (CH2)nOR', 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 알케닐, 치환되거나 또는 미치환된 알카노일, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 아랄킬, 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬로부터 선택되고;
    R3는 H, OH, 할로겐, NR", C(O)2R", C(O)NR", 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 알코일(alkoyl) 또는 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬로부터 선택되고;
    Ra는 H, OR', C(O)2R', C(O)R', NR', N(NR")NR', SR', S02R', SO2NR', NSO2R', C(O)NR', (CH2)nOR', (CH2)nSR', 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴로부터 선택되고;
    n은 0 내지 5의 정수이고;
    R' 및 R"들은 독립적으로 H, 치환되거나 또는 미치환된 알킬, 치환되거나 또는 미치환된 아릴, 치환되거나 또는 미치환된 사이클로알킬 또는 치환되거나 또는 미치환된 헤테로사이클릴로부터 선택될 수 있다.
  2. 화합물 (i)과 화합물 (ii)의 커플링(coupling)을 포함하는 상기 청구항 제1항에서 청구된 화학식 (I)의 화합물의 제조방법:
    Figure pct00080
  3. 화합물 (iii)과 화합물 (iv)를 반응시키는 것을 포함하는 상기 청구항 제 1 항에서 청구된 화학식 (I)의 화합물의 제조방법:
    Figure pct00081
  4. 치료학적으로 유효한 양의 화학식 (I)의 화합물 또는 화학식 (I)의 약제학적으로 수용가능한 염의 형태 또는 입체이성질체 또는 전구약물 및 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  5. 알쯔하이머 질환(AD), 치매 및 허혈성 뇌졸증 및 파킨슨씨병으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 다른 신경퇴화 질병들의 치료 또는 중증도를 완화시키기 위한 청구항 제 1 항에서 청구된 화합물의 용도.
  6. 환자에게 청구항 제 1 항 또는 제 4 항의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 알쯔하이머 질환(AD), 치매 및 허혈성 뇌졸증, 파킨슨씨병 등과 같은 다른 신경퇴화 질병들의 치료 또는 중증도를 완화시키는 방법.
  7. 화학식 (II)의 화합물:
    Figure pct00082

    또는 상기 화학식 (II)의 3가지의 성분들 (a), (b) (c)들을 모두 포함하는 이들의 조합.
  8. 화학식 (III)의 조합 또는 화학식 (III)의 성분들 (a) 및 (d) 둘 다를 포함하는 화학식 (III)의 약제학적 조성물:
    Figure pct00083
  9. 화학식 (IV)의 조합 또는 화학식 (IV)의 성분들 (e) 및 (c) 둘 다를 포함하는 화학식 (IV)의 약제학적 조성물:
    Figure pct00084
  10. 알쯔하이머 질환(AD), 치매 및 허혈성 뇌졸증 및 파킨슨씨병으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 다른 신경퇴화 질병들의 치료 또는 중증도를 완화시키기 위한 청구항 제 7 항 내지 제 9 항들에서 청구된 화합물들의 용도.
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