JP2009511055A

JP2009511055A - 標的核酸シグナル検出

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Publication number: JP2009511055A
Application number: JP2008535685A
Authority: JP
Inventors: ソージ，ジョゼフ・エイ; カーステンズ，カーステン‐ピーター; モネル，クレイグ・ロバート; ベリャーエフ，アレクサンダー
Original assignee: Stratagene California
Current assignee: Stratagene California
Priority date: 2005-10-11
Filing date: 2006-10-11
Publication date: 2009-03-19
Also published as: WO2007044864A2; EP1948823A4; US20070122827A1; EP1948823A2; WO2007044864A3

Abstract

本明細書で提供されるのは、標的核酸を検出するための方法、組成物およびキットである。標的核酸は、例えば、生体試料の検出のためのアッセイでの切断反応によって生成することができる。１つの態様では、記載されている方法は、５’末端および３’末端を有する標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、核酸合成用の鋳型として該プローブを用いて共有結合した環状標的核酸を形成するステップと、共有結合した環状標的核酸を検出するステップとを含む。

Description

ポリヌクレオチド検出のための技術は、基礎研究、診断法および科学捜査に広い用途を見出してきた。ポリヌクレオチド検出は、多くの方法により遂行することができる。ほとんどの方法は、標的核酸の量を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用に頼っている。核酸を検出し得る感度は、非核酸生体試料を検出するためのアッセイ法の発展をもたらした。例えば、いくつかの所謂「近接プローブ（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ−ｐｒｏｂｅ）」アッセイが当分野で知られている。近接プローブと分析物が互いに近接して結合すると、該プローブが検知可能なシグナルを生成する。このようなアッセイ法は、米国特許出願公開第２００２／００６４７７９号（Ｂａｅｚｅｔａｌ．）、米国特許第６，５１１，８０９号（Ｅ．Ｉ．ｄｕＰｏｎｔｄｅＮｅｍｏｕｒｓａｎｄＣｏｍｐａｎｙに譲渡）、米国特許出願公開第２００５／０００３３６１号（Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，Ｓ．）、ＰＣＴ国際公開公報第２００５／０１９４７０号（ＡｃｌａｒａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）および米国特許出願公開第２００５／００２６１８０号（ＢｏａｒｄｏｆＴｒｕｓｔｅｅｓｏｆＬｅｌａｎｄＳｔａｎｆｏｒｄＪｕｎｉｏｒＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙに譲渡）に述べられている。

本明細書に記載されているのは、核酸検出のための方法、試薬およびキットである。

１つの態様では、本発明は、標的核酸検出法または標的核酸を提供する。標的核酸は、例えば、生体試料の検出のためのアッセイ中に切断反応によって生成することができる。該方法は、
５’末端および３’末端を有する標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、
核酸合成用の鋳型として該プローブを用いて、共有結合した環状標的核酸を形成するステップと、
該共有結合した環状標的核酸を検出するステップとを含む。

プローブは、５’末端および３’末端を有し、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含む。該プローブは３’末端がブロックされており、５’末端が連結可能ではない。

別の態様では、本発明は、標的核酸を検出するための組成物を提供する。該組成物は、プローブ、ポリメラーゼおよび任意でプライマーを含む。プローブは５’末端および３’末端を有し、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含む。プローブは３’末端がブロックされており、５’末端が連結可能ではない。

更に別の態様では、標的核酸を検出するためのキットが提供される。
キットは、プローブ、ポリメラーゼ、プライマーおよびキット用包装材料を含む。

＜定義＞
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的なポリヌクレオチド鎖（部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖を含む）の対形成を意味する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度（即ち、ポリヌクレオチド鎖間の会合強度）は、ポリヌクレオチド間の相補性の程度、塩濃度などの条件により影響される関連条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）、他成分の存在（例えばポリエチレングリコールまたはホルムアミドの有無）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のＧ：Ｃ含量を含め、当分野で周知の多数の要因により影響を受ける。

本明細書で使用する「核酸ポリメラーゼ」または「ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指し、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などを包含する。一般に、該酵素は、標的配列にアニーリングしたプライマーの３’末端で合成を開始し、鋳型に沿って５’方向に進行し、５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する場合には、合成が終結するまで介在するアニーリングプローブを加水分解して標識および非標識プローブフラグメントの両方を放出する。公知のＤＮＡポリメラーゼには、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼおよびピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。

本明細書で使用する「エキソヌクレアーゼを欠く」ポリメラーゼとは、野生型酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の１０％、５％、１％、０．５％または０．１％未満を有するＤＮＡポリメラーゼを指す。「エキソヌクレアーゼを欠く」との語句は、検出不可能な活性を有するか、または野生型酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の約１％、０．５％もしくは０．１％未満を有することを意味する。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性はエキソヌクレアーゼアッセイにより測定することができる。このアッセイは、適切な緩衝液、例えば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、および５０μｇ／ｍｌウシ血清アルブミンの存在下でニックの入った基質を６０℃で３０分間切断するステップと、１０ｍＭＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルーを含む９５％ホルムアミドを添加することにより切断反応を終結させるステップと、ニックの入った生成物またはニックの入っていない生成物を検出するステップとを含む。

１つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドに「ハイブリダイズする」と本明細書に記載されている場合、その記載は、これらの２つのポリヌクレオチド間にある程度の相補性があるか、２つのポリヌクレオチドが高ストリンジェントの条件下でハイブリッドを形成することを意味する。

本明細書で使用する「Ｔ_ｍ」および「融解温度」は、相互に置き換え可能な用語であり、これらは、二本鎖ポリヌクレオチド分子の母集団の５０％が一本鎖に解離される温度である。ポリヌクレオチドのＴｍの計算式は、当分野では周知である。例えば、Ｔ_ｍは次式により算出することができる。Ｔ_ｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６５０／Ｌ（式中、Ｌはヌクレオチド数で表したプローブの長さである）。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴ_ｍは、１Ｍ塩でのハイブリダイゼーションアッセイから導出された式を用いて推定することもでき、一般にＰＣＲプライマーのＴ_ｍの計算に使用することができる。［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］（例えば、Ｎｅｗｔｏｎｅｔａｌ．ＰＣＲ，２^ｎｄＥｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ＮｅｗＹｏｒｋ：１９９７），ｐ．２４を参照のこと）。当分野には、さらに複雑な計算法もあり、その方法では、Ｔ_ｍの算出に構造および配列の特徴を考慮する。算出されるＴ_ｍは、単なる推定値にすぎない。最適温度は一般に実験により決定される。

「核酸合成」反応または「鎖伸長」反応とは、標的−プローブハイブリッドとヌクレオチドとの反応を意味し、この反応の結果、取り込まれたヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的になるようにプライマーの３’末端にヌクレオチドが付加される。プライマー伸長試薬は、典型的には（ｉ）ポリメラーゼ酵素；（ｉｉ）緩衝液；および（ｉｉｉ）１つまたは複数の伸長可能なヌクレオチドを含む。

本明細書で使用する「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、特定のポリヌクレオチド鋳型配列を増幅するためのインビトロ方法を指す。ＰＣＲ反応は一連の温度サイクルの繰り返しを含み、典型的には５０〜１００μｌの容量中で行なわれる。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４種のデオキシヌクレオチド：ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰのそれぞれ）、プライマー、緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼおよび鋳型ポリヌクレオチドを含む。１回のＰＣＲ反応は、５〜１００「サイクル」のポリヌクレオチド分子の変性および合成からなっていてもよい。

本明細書で使用する「ヌクレオチド類似体」は、ペントース糖および／または１つまたは複数のリン酸エステルが各々その類似体と置き換えられているヌクレオチドを指す。典型的なペントース糖類似体はヌクレオシド類似体に関連してこれまでに記載されてきたものである。典型的なリン酸エステル類似体は、存在する場合には関連するいずれの対イオンも含め、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなどを含むが、これらに限定されない。更に、ＤＮＡ／ＲＮＡリン酸エステルおよび／または糖リン酸エステル主鎖が異なるタイプの結合と置き換えられているポリヌクレオチド類似体に重合することができる核酸塩基モノマーも、「ヌクレオチド類似体」の定義内に含まれる。

本明細書で使用する「標的核酸」は、その存在を判定すべき標的核酸を指す。「標的核酸」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸またはそれらの混合物を含むことができる。本明細書で使用する「標的核酸」は、定義された５’末端および３’末端を有する。加えて、「標的核酸」は非天然核酸を更に含むことができる。通常、「標的核酸」は、プローブの２つの標的核酸結合部位にハイブリダイズするのに十分な長さがあり、したがって、一般には少なくとも１０塩基長、典型的には少なくとも２０塩基長、例えば少なくとも２５、３０または３５塩基長である。標的核酸は大きな核酸断片でもよいが、一般には２０キロベース以下の核酸に限定される。

本明細書で使用する「共有結合した環状標的核酸」は、標的核酸とプローブとの間で形成された環状のハイブリダイゼーション複合体から、プローブを鋳型として用いる核酸合成によって形成される環状の核酸を指す。核酸合成生成物と元の標的核酸とを連結すると、「共有結合した標的核酸」が形成される。

本明細書で使用する「プローブ」は、別のポリヌクレオチド、例えば標的核酸に相補的である配列を有する、または含む一種のオリゴヌクレオチドを指す。本発明のプローブは、通常５０〜３００塩基長、典型的には１００〜２００塩基長である。

本発明のプローブは、２つの「標的核酸結合部位」を含む。本明細書で使用する「標的核酸結合部位」および「ＴＮＡ結合部位」は、標的核酸の一部に相補的であるプローブ内の領域を指す。例えば、プローブの「第一の標的核酸結合部位」は、標的核酸の「第一プローブ相互作用部位」に相補的であり、該部位にハイブリダイズする。「標的核酸結合部位」は、通常１０〜４０塩基長、典型的には１５〜２５塩基長である。

標的核酸結合部位は、プローブの「５’末端」または「３’末端」に位置することができる。本明細書で使用するように、最も近位のヌクレオチドがプローブの５’端から５塩基内に位置するような標的核酸結合部位は、プローブの「５’末端に」あると記載される。同様に、最も近位のヌクレオチドがプローブの３’端から５塩基内に位置するような標的核酸結合部位は、プローブの「３’末端に」あると記載される。

標的核酸結合部位の一方に最も近いプライマー結合領域のヌクレオチドが、該標的核酸結合部位から少なくとも一定数の塩基の位置にある場合、本明細書で使用するように、プライマー結合領域は、「標的核酸結合部位の一方から少なくとも一定数の塩基の位置にある」と記載される。例えば、第一のプライマー結合領域に最も近いヌクレオチドが第一のプライマー結合領域から少なくとも１０塩基の位置にあるような、または第二のプライマー結合領域に最も近いヌクレオチドであるようなプライマー結合領域は、第二の標的核酸結合部位から少なくとも１０塩基の位置にあると記載される。

本明細書で使用する「環状ハイブリダイゼーション複合体」は、標的核酸とプローブとの間で形成されるハイブリッド複合体を指す。プローブは、それぞれ標的核酸内の異なる領域に相補的である２つの標的核酸結合部位を含み、該領域にプローブはハイブリダイズし、その結果、環状で部分的に二本鎖である構造、即ち「環状ハイブリダイゼーション複合体」が形成される。

本明細書で使用する「プライマー結合部位」は、オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズすることができるプローブ内の相補配列を指す。

一般に、プローブの３’端は、伸長生成物の生成を阻止するために「ブロック」されている。「ブロック」は、３’端もしくはその近傍に非相補的塩基を使用することにより、またはビオチンなどの化学部分もしくはリン酸基を最終ヌクレオチドの３’−ヒドロキシルに付加することにより成し遂げることができる。ブロックは、３’−ＯＨの除去により、もしくはジデオキシヌクレオチドなどの３’−ＯＨを欠くヌクレオチドの使用により、または当業者に公知の他の方法によって成し遂げることもできる。

プローブの５’端は、一般にそれが「連結可能ではない（ｎｏｔｌｉｇａｔａｂｌｅ）」ように、または「連結不可能な（ｎｏｎ−ｌｉｇａｔａｂｌｅ）」ように修飾される。プローブを「連結可能」でないように修飾するために、５’ホスホリル部分を除去または置換することができる。または、追加の部分を５’ホスホリル部分に結合させて、例えばリガーゼ酵素による別の核酸とのライゲーションを妨げることもできる。

＜標的核酸＞
本発明は、核酸の検出および／または定量を意図する。本明細書に記載の方法は、極めて広範囲の核酸を検出することができる。多くの状況で、核酸は直接検出することができる。しかしながら、他の例では、検出ステップに先立ち、核酸を処理することができる場合もある。標的核酸は、かなり多くの手段を用いて生成することができる。例えば、標的核酸は、制限酵素または他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼを用いた切断反応により生成することができる。別法として、より長い核酸鎖を特異的または非特異的に切断して生成することもでき、酵素的または化学的に生成することもできる。本発明の標的核酸は、加齢組織、アポトーシス細胞、または核酸断片を生成し得る任意の他の自然的、生物学的もしくは化学的反応の結果により生成された断片も意図する。

本発明によれば、標的核酸は、例えばサンプル中でその存在を判定する必要がある核酸である。標的核酸は、１０塩基長を超える任意の長さ、例えば２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００塩基長以上であり得る。標的核酸は典型的には一本鎖である。しかし、二本鎖核酸の存在も、最初にサンプルを変性させ、次いで判定用の標的核酸として２本の鎖の片方を用いることによって、容易に検出することができる。または、その存在を判定すべき二本鎖核酸が一本鎖領域を含んでいる場合、この領域は、標的核酸結合部位とのプローブのハイブリダイゼーション部位として使用することができる。

標的核酸は、天然核酸、非天然核酸またはそれらの組み合わせから構成され得る。標的核酸であるための要件は、標的核酸の３’末端がポリメラーゼ依存伸長反応を可能にするものでなければならないこと（即ち、ブロックされていてはならない）、および５’末端が連結可能でなければならないことのみである。したがって、標的核酸の全配列を知る必要はないが、標的核酸の５’末端および３’末端の配列は知っていなければならない。標的核酸の５’末端および３’末端は、プローブの標的核酸結合部位に相補的なプローブ相互作用部位を含む。

特定の実施形態では、その存在を判定すべき核酸が、例えば一方の末端がブロックもしくは破損されているか、または核酸が環状であるため、本明細書に記載の方法を用いる検出には望ましくない。当業者は、そのような核酸を酵素的または化学的に処理することにより、該核酸を標的核酸に変え得ることを理解できる。例えば、環状核酸は、特定の条件で特異的または非特異的ヌクレアーゼを使用して線状にすることができる。また、伸長を妨げるブロックされた末端を、エキソヌクレアーゼを用いて限定的に処理することによって同様に除去することができる。更に、例えば、制限酵素を用いてより小さな断片を生成することによって長い核酸（即ち１０ｋｂを超える）の検出を行うことができることも当業者には明白である。

＜プローブ＞
本発明によれば、プローブは５’末端および３’末端を有する。プローブは、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を更に含む。プローブはその３’末端がブロックされている。更に、プローブはその５’末端が連結可能ではない。プローブは２つの標的核酸結合部位を含み、それぞれの部位は標的核酸の異なる領域に結合することができる。プローブは、標的核酸と環状ハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。

本発明のプローブは、標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成することができ（例えば、本発明のプローブが２つの標的核酸結合部位を含んでいなければならない）、標的核酸の末端から効率的な伸長反応が可能である限り、いかなる長さであってもよい。１つの実施形態では、プローブは５０〜３５０塩基長であり、別の実施形態では、プローブは１００〜２００塩基長である。

プローブは、天然もしくは非天然核酸またはそれらの組み合わせを含むことができる。プローブは、２−アミノエチルグリシン、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロックされた核酸（ＬＮＡ、ｌｏｃｋｅｄｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ）などの核酸類似体モノマー単位および核酸モノマー単位を含む核酸類似体またはキメラを含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの一部または全部が、ＬＮＡまたはＬＮＡ／核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）キメラであってもよい。１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのロックされた核酸を含む。ロックされた核酸は、例えば国際公開公報第９９／１４２２６号（参照により組み込まれる）に記載されている、立体配座的に制限された一群のヌクレオチド類似体を表す。ＬＮＡは、天然のヌクレオチドに比べ、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方により強くハイブリダイズする。ロックされたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．Ａ．，ｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９８），５４：３６０７−３６３０）およびＯｂｉｋａ，Ｓ．ｅｔａｌ．，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．（１９９８），３９：５４０１−５４０４）（ともに参照により組み込まれる）に記載されている。ロックされたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入すると、相補配列への親和性が向上し、融解温度が数度上昇する（Ｂｒａａｓｃｈ，Ｄ．Ａ．ａｎｄＤ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ（２００１），８：１−７）。本発明は、例えば国際公開公報第９９／１４２２６号およびＬａｔｏｒｒａＤ，ｅｔａｌ．，２００３．Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２２：７９−８５（ともに参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたものなど、当分野で公知のいかなるＬＮＡを用いても実施することができる。ＬＮＡ類似体を用いることにより、より特異的な結合が得られ、よりストリンジェントな洗浄条件を使用することができ、バックグラウンドノイズの量の顕著な低下という有利な効果が得られる。

プローブは、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含む。標的核酸結合部位は、標的核酸内の配列に相補的であるプローブ内の配列である。第一および第二標的核酸結合配列は、標的核酸内の２つの異なる領域に相補的である。標的核酸結合部位は、一般に１０〜４０塩基長である。１つの実施形態では、標的核酸結合部位は１５〜２５塩基長である。標的核酸結合配列は、３’または５’端（即ち３’または５’末端）に位置することができる。または、プローブおよび標的核酸が環状ハイブリダイゼーション複合体を形成することができる限り、標的核酸結合部位はプローブ内のどこに位置していてもよい。１つの実施形態では、第一の標的核酸結合部位は、プローブの５’末端または３’末端のいずれかにある。別の実施形態では、第二の標的核酸結合部位は、プローブの５’末端または３’末端の他方に位置する。更に別の実施形態では、標的核酸の３’末端の部位にハイブリダイズする第一の標的核酸結合部位は、プローブの５’末端またはその近傍に位置し、標的核酸の５’末端の部位にハイブリダイズする第二の標的核酸結合部位は、プローブの３’末端またはその近傍に位置する。

プローブは、標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。ハイブリダイゼーション複合体は、２つの標的核酸結合部位でプローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションすることによって形成される。２つの標的核酸結合部位はそれぞれ、標的核酸内の異なる部分に対して相補的である。ハイブリダイゼーション複合体の一例を図１に示す。

本明細書に記載されているように、プローブの５’末端は連結可能ではない。１つの実施形態では、プローブの５’末端は脱リン酸化している。別の実施形態では、プローブの５’末端には、ホスホリル基上にまたはホスホリル部分を置換して化学部分が結合しており、ライゲーションを妨げている。更に別の実施形態では、５’末端のヌクレオチドは、リガーゼ酵素を用いたライゲーションを不可能にする非天然核酸である。

本発明によるプローブは、その３’末端からの伸長反応を可能としない。１つの実施形態では、プローブの３’末端ヌクレオチドはブロックされている。例えば、３’末端ヌクレオチドは、ジデオキシ核酸、またはポリメラーゼ酵素を用いた伸長を不可能にする他のいかなる核酸（天然またはそうでないもの）でもあり得る。別の実施形態では、プローブの３’末端には、例えば３’ −ＯＨ部分上で化学部分が結合しており、該末端からの伸長を妨げている。更に別の実施形態では、プローブの３’末端はプライマーとハイブリダイズせず、その結果、該プローブの３’末端は、ポリメラーゼによる伸長反応のためのプライマーとしての機能を果たすことができない。

１つの実施形態では、プローブは第一のプライマー結合領域を更に含む。別の実施形態では、プローブは第二のプライマー結合領域を更に含む。一般に、プライマー結合領域は、プローブの標的核酸結合部位と重複しない。更に、第一のプライマー結合領域および第二のプライマー結合領域を包含する実施形態では、通常、２つのプライマー結合領域は互いに重複しない。１つの実施形態では、第一のプライマー結合領域は、プローブの第一標的核酸結合配列と第二標的核酸結合配列の間に位置する。別の実施形態では、第二のプライマー結合領域は、プローブの第一標的核酸結合配列と第二標的核酸結合配列の間に位置する。プライマー結合領域は、標的核酸結合部位の一方から少なくとも１５塩基、例えば標的核酸結合部位の一方から少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５塩基以上の位置にあることができる。更に別の実施形態では、プローブは２つのプライマー結合領域を含み、プライマー結合領域はそれぞれ、第一標的核酸結合領域と第二標的核酸結合領域の間に位置し、標的核酸結合部位の一方から少なくとも２０塩基離れている。別の実施形態では、プライマー結合領域はそれぞれ、標的核酸結合部位の一方から少なくとも３０塩基離れている。

＜標的核酸の検出＞
本明細書に記載されているように、標的核酸の検出法は、
標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、
核酸合成のための鋳型としてプローブを用いて、共有結合した環状の標的核酸を形成するステップと、
共有結合した環状の標的核酸を検出するステップと
を含む。

前述のように、プローブは、標的核酸に相補的であり該標的核酸にハイブリダイズする、２つの標的核酸結合部位を含む。標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーション複合体の理想的なＴ_ｍは、４０℃〜７５℃、典型的には４５℃〜７０℃、例えば５０℃〜６５℃である。

ポリヌクレオチドのＴ_ｍを算出するための式は、当分野において周知である。例えば、Ｔ_ｍは次式により算出することができる。Ｔ_ｍ＝６９．３＋０．４１×（Ｇ＋Ｃ）％−６５０／Ｌ（式中、Ｌはヌクレオチドにおけるオリゴヌクレオチドの長さである）。ハイブリッドポリヌクレオチドのＴ_ｍは、１Ｍ塩でのハイブリダイゼーションアッセイから導出された式を用いて推定することもでき、一般にＰＣＲプライマーのＴ_ｍの計算に使用することができる。［（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃］（例えば、Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎｅｔａｌ．ＰＣＲ，２^ｎｄＥｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ＮｅｗＹｏｒｋ：１９９７），ｐ．２４を参照のこと）。当分野には、さらに複雑な計算法もあり、その方法では、Ｔ_ｍ算出に構造および配列の特徴を考慮する。算出されるＴ_ｍは、単なる推定値にすぎない。最適温度は一般に実験的に決定される。配列の安定性および融解温度は、例えば、ｍｆｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，４８−５２）またはＯｌｉｇｏ５．０（Ｒｙｃｈｌｉｋ＆Ｒｈｏａｄｓ（１９８９）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７，８５４３−５１）などのプログラムを使用して決定することもできる。天然および非天然核酸のＴ_ｍの算出法も、当分野では公知である。例えば、ＬＮＡ−ＤＮＡハイブリッドの融解温度は、例えば参照により組込まれるＭｃＴｉｇｕｅｅｔａｌ．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，５３８８−５４０５およびＴｏｌｓｔｒｕｐｅｔａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＲｅｓ．３１，３７５８−６２に記載されているような、当分野で公知の方法を用いて計算することができる。

＜伸長＞
環状ハイブリダイゼーション複合体が形成されると、標的核酸は鋳型依存重合反応におけるプライマーとして使用される。伸長ステップは、当業者に公知の重合を可能にする条件（所与のポリメラーゼに適切なヌクレオチド、緩衝液、マグネシウムおよび温度）下でポリメラーゼを与えることにより行なわれる。本発明は、当分野で公知のいかなるポリメラーゼの使用も意図する。１つの実施形態では、ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼを欠くＤＮＡポリメラーゼである。更に別の実施形態では、ポリメラーゼは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。伸長反応は、鎖置換が起こらない条件下で一般に行なわれる。１つの実施形態では、鎖を置換しないＤＮＡポリメラーゼが使用される。別の実施形態では、鎖置換が可能なＤＮＡポリメラーゼを、鎖置換が生じない条件下で使用する。例えば、伸長を６５℃以下の温度で行う場合、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性酵素は鎖を置換しない。前述のように、プローブ自体は伸長反応のプライマーとして機能することができず、更に、その５’末端は連結可能ではない。プローブは、標的核酸をプライマーとして使用して合成するための鋳型として機能するにすぎない（例えば図２を参照のこと）。

伸長された後（例えば、図２を参照）、標的核酸の５’末端に伸長生成物が連結されることにより、共有結合した環状標的核酸が形成される。

本明細書に記載の方法によれば、プローブは、標的核酸の濃度より高濃度で提供される。プローブ濃度は、標的核酸の濃度の少なくとも１．１倍、例えば少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、１００倍またはそれ以上であり得る。

＜共有結合した環状標的核酸の検出＞
次に、共有結合した環状標的核酸を検出する。共有結合した環状標的核酸は、当分野で公知のいずれかの方法を使用して検出することができる。１つの実施形態では、共有結合した環状標的核酸はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して検出される。前述のように、プローブは１つまたは複数のプライマー結合領域を含むことができる。これらの配列に相補的なＰＣＲプライマーを使用することができる。

共有結合した環状標的核酸の量は、ＰＣＲを使用して定量することもできる。例えば蛍光、リアルタイム測定法を用いるＰＣＲによる定量法は、参照により組み込まれる米国特許第５，７２３，５９１号、米国特許第５，８４６，７１７号、米国特許第５，９９４，０５６号、米国特許第６，００１，５６７号、米国特許第６，３４８，３１４号および米国特許第６，６３５，４２７号に記載されている。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、おそらく最も高感度で最も融通性のある遺伝子発現プロファイリング法であり、核酸レベルを比較するために用いることができる。１つの実施形態では、共有結合した環状標的核酸は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ；例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，７２３，５９１号を参照のこと）を使用して、検出・定量される。アッセイは１回のＰＣＲ反応中に行なわれる。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＡＭＰＬＩＴＡＱ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）などのＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。所与の対立遺伝子または突然変異に特異的な蛍光プローブがＰＣＲ反応に含まれている。該蛍光プローブは、５’−リポーター色素（例えば蛍光色素）および３’−消光色素を有するオリゴヌクレオチドからなる。ＰＣＲ中に、蛍光プローブがその標的に結合すると、ポリメラーゼの５’→３’核酸分解活性によって蛍光プローブがリポーター色素と消光色素の間で切断される。消光色素からリポーター色素が分離すると、蛍光が増加することになる。そのシグナルが、ＰＣＲのサイクル毎に蓄積し、これを蛍光計でモニターすることができる。共有結合した環状標的核酸は、当業者に公知のいずれの方法を使用しても、検出・定量することができる。このような当業者に公知の方法として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５３８，８４８号に記載の方法；ポリメラーゼ連鎖反応；分枝ハイブリダイゼーション法（例えば、参照により組み込まれるＣｈｉｒｏｎ社の米国特許第５，８４９，４８１号、米国特許第５，７１０，２６４号、米国特許第５，１２４，２４６号および米国特許第５，６２４，８０２号）；ローリングサークル複製（例えば、参照により組み込まれる米国特許第６，２１０，８８４号および米国特許第６，１８３，９６０号）；ＮＡＳＢＡ（例えば参照により組み込まれる米国特許第５，４０９，８１８号）；分子ビーコン技術（例えば、参照により組み込まれる米国特許第６，２７７，６０７号；米国特許第６，１５０，０９７号；および米国特許第６，０３７，１３０号）；近接プローブ法（参照によりその全体が本明細書に組込まれる米国特許第６，１７４，６７０Ｂｌ号）；サンライズプライマーシステム（例えば、参照により組み込まれる米国特許第５，８６６，３３６号）；スコルピオンプローブシステム（例えば参照により組み込まれるＴｈｅｌｗｅｌｌｅｔａｌ．，（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２８，３７５２−３７６１；Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅｅｔａｌ．，（１９９９）．ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７，８０４−８０７）；Ｌｕｍｉｎｅｘ／ｘＭＡＰ（ミクロスフェア）システム；およびＤｚｙＮＡ−ＰＣＲシステム（例えば、参照により組み込まれる米国特許第６，１４０，０５５号）などが挙げられる。

＜他のハイブリッド複合体＞
まれではあるが、プローブ濃度が過剰な場合には、１つの標的核酸および２つのプローブを含む、線状ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合もある。その場合には、標的核酸は、第一プローブの第一の標的核酸結合部位および第二プローブの第二核酸結合部位にハイブリダイズしている（例えば、図３を参照）。例えば、伸長反応を追加プライマーの存在下で行えば、二本鎖複合体が形成され、このような線状ハイブリダイゼーション複合体を検出することができる。

＜複数標的核酸の同時検出＞
本明細書に記載の方法は、１回の反応で複数の標的核酸の検出を可能にする。１つの実施形態では、同じプローブにハイブリダイズすることができる（例えば、標的核酸のすべてが共通の第一および第二プローブ相互作用部位を有する）が、第一プローブ相互作用部位と第二プローブ相互作用部位の間に様々な長さが介在する複数の標的核酸を検出することができる（例えば、図４を参照）。例えば、標的は、第一プローブ相互作用部位と第二プローブ相互作用部位の間に介在する長さが、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００塩基以上異なっていてもよい。または、標的は配列が異なってもよい。標的はそれぞれ、配列解析、判別制限酵素消化パターン（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｄｉｇｅｓｔｐａｔｔｅｒｎ）またはポリメラーゼ連鎖反応によって同定することができるユニークな配列を有していてもよい。標的はまた、様々な抗原または化学部分に対する親和性を有する様々なアプタマー配列を含むこともできる。

別の実施形態では、複数の標的核酸は、プローブ相互作用部位が異なり得る。例えば、プローブはそれぞれ、特異的な標的核酸（例えば、それぞれの標的にユニークなプローブ）と相互作用する。または、プローブは、標的核酸のサブセットと相互作用することができる。プローブの第一および第二の標的核酸結合部位は、２、３、４、５、１０または２０個以上の標的のサブセットにハイブリダイズすることができる。

別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では本明細書に記載された方法および材料に類似または同等のものを使用することができるが、適切な方法および材料は下記の通りである。本明細書で言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、参照により全体が組み入れられる。矛盾を来す場合には、定義を含め本明細が規定する。更に、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、これらに限定する意図はない。

約５μｌ容量のサンプルを、以下の成分と混合し、最終容量を５０μｌとする。
１μＭプローブＤＮＡ
ＰＣＲプライマー、各１００ｎＭ
４ＵＰｆｕポリメラーゼ
２ＵＴａｑ−リガーゼ
１ｍＭＮＡＤＰ
２ｍＭｄＮＴＰｓ（それぞれ）
トリス緩衝液
２．０ｍＭＭｇＳＯ_４

熱サイクルは以下に記載の条件を使用して実施する。第一サイクルは、標的核酸にプローブをアニーリングさせ、伸長させ、連結させて共有結合した環状標的核酸を形成するために実施する。
９５℃で１分間；５５℃で３０秒間；６５℃で２分間を１サイクル。

伸長は、鎖を置換しない条件（例えば６５℃）で行う。その後、以下のサイクルを実施して、共有結合した環状標的核酸を検出する。
９５℃で３０秒間；５５℃で３０間秒；７２℃で３０秒間を３０サイクル。

第二サイクルの後、反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析する。

標的核酸およびプローブの一実施形態を示す。検出方法の伸長、ライゲーションのステップの例を示す。１つの標的核酸と２つのプローブの間で形成された線状ハイブリダイゼーション複合体の例を示す。複数の標的核酸を同時に検出する例を示す。

Claims

ａ．５’末端および３’末端を有する標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブが５’末端および３’末端を有し、前記プローブが第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含み、前記プローブの３’末端がブロックされており、５’末端が連結可能ではないステップと、
ｂ．核酸合成のための鋳型として前記プローブを用いて、閉じた標的核酸を形成するステップと、
ｃ．前記共有結合した環状の標的核酸を検出するステップと
を含む標的核酸を検出するための方法。
前記プローブが５０〜３００塩基長である、請求項１に記載の方法。
前記プローブが１００〜２００塩基長である、請求項１に記載の方法。
前記第一の標的核酸結合部位が前記プローブの前記５’末端または３’末端の一方にある、請求項１に記載の方法。
前記第二の標的核酸結合部位が前記プローブの前記５’末端または３’末端の他方にある、請求項４に記載の方法。
前記核酸合成にＤＮＡポリメラーゼを使用する、請求項１に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼを欠く、請求項１に記載の方法。
ＤＮＡポリメラーゼが鎖を置換しないポリメラーゼである、請求項６に記載の方法。
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ−ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼから成る群より選ばれる、請求項６に記載の方法。
前記第一の標的核酸結合部位が１０〜４０塩基長である、請求項１に記載の方法。
前記第一の標的核酸結合部位が１５〜２５塩基長である、請求項１に記載の方法。
前記第二の標的核酸結合部位が１０〜４０塩基長である、請求項１に記載の方法。
前記第二の標的核酸結合部位が１５〜２５塩基長である、請求項１に記載の方法。
前記プローブの前記５’末端が脱リン酸化されている、請求項１に記載の方法。
前記プローブの前記３’末端ヌクレオチドがジデオキシ核酸である、請求項１に記載の方法。
前記プローブが少なくとも１つのプライマー結合領域を更に含む、請求項１に記載の方法。
前記プローブが第一のプライマー結合領域および第二のプライマー結合領域を更に含む、請求項１に記載の方法。
前記プライマー結合領域が、前記標的核酸結合部位の一方から少なくとも１５塩基の位置にある、請求項１７に記載の方法。
前記第一のプライマー結合領域が、前記第一の標的核酸結合部位から少なくとも１５塩基の位置にあり、前記第二のプライマー結合部位が、前記第二の標的核酸結合部位から少なくとも１５塩基の位置にある、請求項１８に記載の方法。
前記共有結合した標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応により検出する、請求項１に記載の方法。
ａ．５’末端および３’末端を有するプローブであって、前記プローブが第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含み、前記プローブの３’末端がブロックされており、５’末端が連結可能ではないプローブと、
ｂ．ポリメラーゼと
を含む組成物。
５’末端および３’末端を有する標的核酸を更に含む、請求項２１に記載の組成物。
前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項２１に記載の組成物。
前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖を置換しないポリメラーゼである、請求項２３に記載の組成物。
前記ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼを欠く、請求項２３に記載の組成物。
プライマーを更に含む、請求項２１に記載の組成物。
リガーゼを更に含む、請求項２１に記載の組成物。
ａ．５’末端および３’末端を有するプローブであって、前記プローブが第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含み、前記プローブの３’末端がブロックされており、５’末端が連結可能ではないプローブと、
ｂ．ポリメラーゼと、
ｃ．それらのための包装材料と
を含むキット。
プライマーを更に含む、請求項２８に記載のキット。
前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項２８に記載のキット。
前記ＤＮＡポリメラーゼが鎖を置換しないポリメラーゼである、請求項３０に記載のキット。
前記ＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼを欠く、請求項３０に記載のキット。
リガーゼを更に含む、請求項２８に記載のキット。