JP2009511055A - 標的核酸シグナル検出 - Google Patents
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Abstract
本明細書で提供されるのは、標的核酸を検出するための方法、組成物およびキットである。標的核酸は、例えば、生体試料の検出のためのアッセイでの切断反応によって生成することができる。1つの態様では、記載されている方法は、5’末端および3’末端を有する標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、核酸合成用の鋳型として該プローブを用いて共有結合した環状標的核酸を形成するステップと、共有結合した環状標的核酸を検出するステップとを含む。
Description
ポリヌクレオチド検出のための技術は、基礎研究、診断法および科学捜査に広い用途を見出してきた。ポリヌクレオチド検出は、多くの方法により遂行することができる。ほとんどの方法は、標的核酸の量を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用に頼っている。核酸を検出し得る感度は、非核酸生体試料を検出するためのアッセイ法の発展をもたらした。例えば、いくつかの所謂「近接プローブ(proximity−probe)」アッセイが当分野で知られている。近接プローブと分析物が互いに近接して結合すると、該プローブが検知可能なシグナルを生成する。このようなアッセイ法は、米国特許出願公開第2002/0064779号(Baez et al.)、米国特許第6,511,809号(E.I.du Pont de Nemours and Companyに譲渡)、米国特許出願公開第2005/0003361号(Fredriksson,S.)、PCT国際公開公報第2005/019470号(Aclara Biosciences社)および米国特許出願公開第2005/0026180号(Board of Trustees of Leland Stanford Junior Universityに譲渡)に述べられている。
本明細書に記載されているのは、核酸検出のための方法、試薬およびキットである。
1つの態様では、本発明は、標的核酸検出法または標的核酸を提供する。標的核酸は、例えば、生体試料の検出のためのアッセイ中に切断反応によって生成することができる。該方法は、
5’末端および3’末端を有する標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、
核酸合成用の鋳型として該プローブを用いて、共有結合した環状標的核酸を形成するステップと、
該共有結合した環状標的核酸を検出するステップとを含む。
5’末端および3’末端を有する標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、
核酸合成用の鋳型として該プローブを用いて、共有結合した環状標的核酸を形成するステップと、
該共有結合した環状標的核酸を検出するステップとを含む。
プローブは、5’末端および3’末端を有し、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含む。該プローブは3’末端がブロックされており、5’末端が連結可能ではない。
別の態様では、本発明は、標的核酸を検出するための組成物を提供する。該組成物は、プローブ、ポリメラーゼおよび任意でプライマーを含む。プローブは5’末端および3’末端を有し、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含む。プローブは3’末端がブロックされており、5’末端が連結可能ではない。
更に別の態様では、標的核酸を検出するためのキットが提供される。
キットは、プローブ、ポリメラーゼ、プライマーおよびキット用包装材料を含む。
キットは、プローブ、ポリメラーゼ、プライマーおよびキット用包装材料を含む。
<定義>
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的なポリヌクレオチド鎖(部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖を含む)の対形成を意味する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度(即ち、ポリヌクレオチド鎖間の会合強度)は、ポリヌクレオチド間の相補性の程度、塩濃度などの条件により影響される関連条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度(Tm)、他成分の存在(例えばポリエチレングリコールまたはホルムアミドの有無)、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のG:C含量を含め、当分野で周知の多数の要因により影響を受ける。
本明細書で使用する用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的なポリヌクレオチド鎖(部分的に相補的なポリヌクレオチド鎖を含む)の対形成を意味する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション強度(即ち、ポリヌクレオチド鎖間の会合強度)は、ポリヌクレオチド間の相補性の程度、塩濃度などの条件により影響される関連条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドの融解温度(Tm)、他成分の存在(例えばポリエチレングリコールまたはホルムアミドの有無)、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、およびポリヌクレオチド鎖のG:C含量を含め、当分野で周知の多数の要因により影響を受ける。
本明細書で使用する「核酸ポリメラーゼ」または「ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指し、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素などを包含する。一般に、該酵素は、標的配列にアニーリングしたプライマーの3’末端で合成を開始し、鋳型に沿って5’方向に進行し、5’→3’ヌクレアーゼ活性を有する場合には、合成が終結するまで介在するアニーリングプローブを加水分解して標識および非標識プローブフラグメントの両方を放出する。公知のDNAポリメラーゼには、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼI、T7DNAポリメラーゼ、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)(Tth)DNAポリメラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィルス(Bacillus stearothermophilus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)(Taq)DNAポリメラーゼおよびピロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNAポリメラーゼが含まれる。
本明細書で使用する「エキソヌクレアーゼを欠く」ポリメラーゼとは、野生型酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の10%、5%、1%、0.5%または0.1%未満を有するDNAポリメラーゼを指す。「エキソヌクレアーゼを欠く」との語句は、検出不可能な活性を有するか、または野生型酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の約1%、0.5%もしくは0.1%未満を有することを意味する。5’→3’エキソヌクレアーゼ活性はエキソヌクレアーゼアッセイにより測定することができる。このアッセイは、適切な緩衝液、例えば10mM Tris−HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2、および50μg/mlウシ血清アルブミンの存在下でニックの入った基質を60℃で30分間切断するステップと、10mM EDTAおよび1mg/mlブロモフェノールブルーを含む95%ホルムアミドを添加することにより切断反応を終結させるステップと、ニックの入った生成物またはニックの入っていない生成物を検出するステップとを含む。
1つのポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドに「ハイブリダイズする」と本明細書に記載されている場合、その記載は、これらの2つのポリヌクレオチド間にある程度の相補性があるか、2つのポリヌクレオチドが高ストリンジェントの条件下でハイブリッドを形成することを意味する。
本明細書で使用する「Tm」および「融解温度」は、相互に置き換え可能な用語であり、これらは、二本鎖ポリヌクレオチド分子の母集団の50%が一本鎖に解離される温度である。ポリヌクレオチドのTmの計算式は、当分野では周知である。例えば、Tmは次式により算出することができる。Tm=69.3+0.41×(G+C)%−650/L(式中、Lはヌクレオチド数で表したプローブの長さである)。ハイブリッドポリヌクレオチドのTmは、1M塩でのハイブリダイゼーションアッセイから導出された式を用いて推定することもでき、一般にPCRプライマーのTmの計算に使用することができる。[(A+Tの数)×2℃+(G+Cの数)×4℃](例えば、Newton et al.PCR,2nd Ed.,Springer−Verlag(New York:1997),p.24を参照のこと)。当分野には、さらに複雑な計算法もあり、その方法では、Tmの算出に構造および配列の特徴を考慮する。算出されるTmは、単なる推定値にすぎない。最適温度は一般に実験により決定される。
「核酸合成」反応または「鎖伸長」反応とは、標的−プローブハイブリッドとヌクレオチドとの反応を意味し、この反応の結果、取り込まれたヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドの対応するヌクレオチドに相補的になるようにプライマーの3’末端にヌクレオチドが付加される。プライマー伸長試薬は、典型的には(i)ポリメラーゼ酵素;(ii)緩衝液;および(iii)1つまたは複数の伸長可能なヌクレオチドを含む。
本明細書で使用する「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、特定のポリヌクレオチド鋳型配列を増幅するためのインビトロ方法を指す。PCR反応は一連の温度サイクルの繰り返しを含み、典型的には50〜100μlの容量中で行なわれる。反応混合物は、dNTP(4種のデオキシヌクレオチド:dATP、dCTP、dGTPおよびdTTPのそれぞれ)、プライマー、緩衝液、DNAポリメラーゼおよび鋳型ポリヌクレオチドを含む。1回のPCR反応は、5〜100「サイクル」のポリヌクレオチド分子の変性および合成からなっていてもよい。
本明細書で使用する「ヌクレオチド類似体」は、ペントース糖および/または1つまたは複数のリン酸エステルが各々その類似体と置き換えられているヌクレオチドを指す。典型的なペントース糖類似体はヌクレオシド類似体に関連してこれまでに記載されてきたものである。典型的なリン酸エステル類似体は、存在する場合には関連するいずれの対イオンも含め、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなどを含むが、これらに限定されない。更に、DNA/RNAリン酸エステルおよび/または糖リン酸エステル主鎖が異なるタイプの結合と置き換えられているポリヌクレオチド類似体に重合することができる核酸塩基モノマーも、「ヌクレオチド類似体」の定義内に含まれる。
本明細書で使用する「標的核酸」は、その存在を判定すべき標的核酸を指す。「標的核酸」は、デオキシリボ核酸、リボ核酸またはそれらの混合物を含むことができる。本明細書で使用する「標的核酸」は、定義された5’末端および3’末端を有する。加えて、「標的核酸」は非天然核酸を更に含むことができる。通常、「標的核酸」は、プローブの2つの標的核酸結合部位にハイブリダイズするのに十分な長さがあり、したがって、一般には少なくとも10塩基長、典型的には少なくとも20塩基長、例えば少なくとも25、30または35塩基長である。標的核酸は大きな核酸断片でもよいが、一般には20キロベース以下の核酸に限定される。
本明細書で使用する「共有結合した環状標的核酸」は、標的核酸とプローブとの間で形成された環状のハイブリダイゼーション複合体から、プローブを鋳型として用いる核酸合成によって形成される環状の核酸を指す。核酸合成生成物と元の標的核酸とを連結すると、「共有結合した標的核酸」が形成される。
本明細書で使用する「プローブ」は、別のポリヌクレオチド、例えば標的核酸に相補的である配列を有する、または含む一種のオリゴヌクレオチドを指す。本発明のプローブは、通常50〜300塩基長、典型的には100〜200塩基長である。
本発明のプローブは、2つの「標的核酸結合部位」を含む。本明細書で使用する「標的核酸結合部位」および「TNA結合部位」は、標的核酸の一部に相補的であるプローブ内の領域を指す。例えば、プローブの「第一の標的核酸結合部位」は、標的核酸の「第一プローブ相互作用部位」に相補的であり、該部位にハイブリダイズする。「標的核酸結合部位」は、通常10〜40塩基長、典型的には15〜25塩基長である。
標的核酸結合部位は、プローブの「5’末端」または「3’末端」に位置することができる。本明細書で使用するように、最も近位のヌクレオチドがプローブの5’端から5塩基内に位置するような標的核酸結合部位は、プローブの「5’末端に」あると記載される。同様に、最も近位のヌクレオチドがプローブの3’端から5塩基内に位置するような標的核酸結合部位は、プローブの「3’末端に」あると記載される。
標的核酸結合部位の一方に最も近いプライマー結合領域のヌクレオチドが、該標的核酸結合部位から少なくとも一定数の塩基の位置にある場合、本明細書で使用するように、プライマー結合領域は、「標的核酸結合部位の一方から少なくとも一定数の塩基の位置にある」と記載される。例えば、第一のプライマー結合領域に最も近いヌクレオチドが第一のプライマー結合領域から少なくとも10塩基の位置にあるような、または第二のプライマー結合領域に最も近いヌクレオチドであるようなプライマー結合領域は、第二の標的核酸結合部位から少なくとも10塩基の位置にあると記載される。
本明細書で使用する「環状ハイブリダイゼーション複合体」は、標的核酸とプローブとの間で形成されるハイブリッド複合体を指す。プローブは、それぞれ標的核酸内の異なる領域に相補的である2つの標的核酸結合部位を含み、該領域にプローブはハイブリダイズし、その結果、環状で部分的に二本鎖である構造、即ち「環状ハイブリダイゼーション複合体」が形成される。
本明細書で使用する「プライマー結合部位」は、オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズすることができるプローブ内の相補配列を指す。
一般に、プローブの3’端は、伸長生成物の生成を阻止するために「ブロック」されている。「ブロック」は、3’端もしくはその近傍に非相補的塩基を使用することにより、またはビオチンなどの化学部分もしくはリン酸基を最終ヌクレオチドの3’−ヒドロキシルに付加することにより成し遂げることができる。ブロックは、3’−OHの除去により、もしくはジデオキシヌクレオチドなどの3’−OHを欠くヌクレオチドの使用により、または当業者に公知の他の方法によって成し遂げることもできる。
プローブの5’端は、一般にそれが「連結可能ではない(not ligatable)」ように、または「連結不可能な(non−ligatable)」ように修飾される。プローブを「連結可能」でないように修飾するために、5’ホスホリル部分を除去または置換することができる。または、追加の部分を5’ホスホリル部分に結合させて、例えばリガーゼ酵素による別の核酸とのライゲーションを妨げることもできる。
<標的核酸>
本発明は、核酸の検出および/または定量を意図する。本明細書に記載の方法は、極めて広範囲の核酸を検出することができる。多くの状況で、核酸は直接検出することができる。しかしながら、他の例では、検出ステップに先立ち、核酸を処理することができる場合もある。標的核酸は、かなり多くの手段を用いて生成することができる。例えば、標的核酸は、制限酵素または他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼを用いた切断反応により生成することができる。別法として、より長い核酸鎖を特異的または非特異的に切断して生成することもでき、酵素的または化学的に生成することもできる。本発明の標的核酸は、加齢組織、アポトーシス細胞、または核酸断片を生成し得る任意の他の自然的、生物学的もしくは化学的反応の結果により生成された断片も意図する。
本発明は、核酸の検出および/または定量を意図する。本明細書に記載の方法は、極めて広範囲の核酸を検出することができる。多くの状況で、核酸は直接検出することができる。しかしながら、他の例では、検出ステップに先立ち、核酸を処理することができる場合もある。標的核酸は、かなり多くの手段を用いて生成することができる。例えば、標的核酸は、制限酵素または他のエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼを用いた切断反応により生成することができる。別法として、より長い核酸鎖を特異的または非特異的に切断して生成することもでき、酵素的または化学的に生成することもできる。本発明の標的核酸は、加齢組織、アポトーシス細胞、または核酸断片を生成し得る任意の他の自然的、生物学的もしくは化学的反応の結果により生成された断片も意図する。
本発明によれば、標的核酸は、例えばサンプル中でその存在を判定する必要がある核酸である。標的核酸は、10塩基長を超える任意の長さ、例えば20、25、30、40、50、60、100塩基長以上であり得る。標的核酸は典型的には一本鎖である。しかし、二本鎖核酸の存在も、最初にサンプルを変性させ、次いで判定用の標的核酸として2本の鎖の片方を用いることによって、容易に検出することができる。または、その存在を判定すべき二本鎖核酸が一本鎖領域を含んでいる場合、この領域は、標的核酸結合部位とのプローブのハイブリダイゼーション部位として使用することができる。
標的核酸は、天然核酸、非天然核酸またはそれらの組み合わせから構成され得る。標的核酸であるための要件は、標的核酸の3’末端がポリメラーゼ依存伸長反応を可能にするものでなければならないこと(即ち、ブロックされていてはならない)、および5’末端が連結可能でなければならないことのみである。したがって、標的核酸の全配列を知る必要はないが、標的核酸の5’末端および3’末端の配列は知っていなければならない。標的核酸の5’末端および3’末端は、プローブの標的核酸結合部位に相補的なプローブ相互作用部位を含む。
特定の実施形態では、その存在を判定すべき核酸が、例えば一方の末端がブロックもしくは破損されているか、または核酸が環状であるため、本明細書に記載の方法を用いる検出には望ましくない。当業者は、そのような核酸を酵素的または化学的に処理することにより、該核酸を標的核酸に変え得ることを理解できる。例えば、環状核酸は、特定の条件で特異的または非特異的ヌクレアーゼを使用して線状にすることができる。また、伸長を妨げるブロックされた末端を、エキソヌクレアーゼを用いて限定的に処理することによって同様に除去することができる。更に、例えば、制限酵素を用いてより小さな断片を生成することによって長い核酸(即ち10kbを超える)の検出を行うことができることも当業者には明白である。
<プローブ>
本発明によれば、プローブは5’末端および3’末端を有する。プローブは、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を更に含む。プローブはその3’末端がブロックされている。更に、プローブはその5’末端が連結可能ではない。プローブは2つの標的核酸結合部位を含み、それぞれの部位は標的核酸の異なる領域に結合することができる。プローブは、標的核酸と環状ハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。
本発明によれば、プローブは5’末端および3’末端を有する。プローブは、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を更に含む。プローブはその3’末端がブロックされている。更に、プローブはその5’末端が連結可能ではない。プローブは2つの標的核酸結合部位を含み、それぞれの部位は標的核酸の異なる領域に結合することができる。プローブは、標的核酸と環状ハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。
本発明のプローブは、標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成することができ(例えば、本発明のプローブが2つの標的核酸結合部位を含んでいなければならない)、標的核酸の末端から効率的な伸長反応が可能である限り、いかなる長さであってもよい。1つの実施形態では、プローブは50〜350塩基長であり、別の実施形態では、プローブは100〜200塩基長である。
プローブは、天然もしくは非天然核酸またはそれらの組み合わせを含むことができる。プローブは、2−アミノエチルグリシン、ペプチド核酸(PNA)もしくはロックされた核酸(LNA、locked nucleic acid)などの核酸類似体モノマー単位および核酸モノマー単位を含む核酸類似体またはキメラを含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの一部または全部が、LNAまたはLNA/核酸(DNAまたはRNA)キメラであってもよい。1つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つのロックされた核酸を含む。ロックされた核酸は、例えば国際公開公報第99/14226号(参照により組み込まれる)に記載されている、立体配座的に制限された一群のヌクレオチド類似体を表す。LNAは、天然のヌクレオチドに比べ、DNAおよびRNAの両方により強くハイブリダイズする。ロックされたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、Koshkin,A.A.,et al.,Tetrahedron(1998),54:3607−3630)およびObika,S.et al.,Tetrahedron Lett.(1998),39:5401−5404)(ともに参照により組み込まれる)に記載されている。ロックされたヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに導入すると、相補配列への親和性が向上し、融解温度が数度上昇する(Braasch,D.A.and D.R.Corey,Chem.Biol(2001),8:1−7)。本発明は、例えば国際公開公報第99/14226号およびLatorra D,et al.,2003.Hum.Mutat.22:79−85(ともに参照により本明細書に組み込まれる)に記載されたものなど、当分野で公知のいかなるLNAを用いても実施することができる。LNA類似体を用いることにより、より特異的な結合が得られ、よりストリンジェントな洗浄条件を使用することができ、バックグラウンドノイズの量の顕著な低下という有利な効果が得られる。
プローブは、第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含む。標的核酸結合部位は、標的核酸内の配列に相補的であるプローブ内の配列である。第一および第二標的核酸結合配列は、標的核酸内の2つの異なる領域に相補的である。標的核酸結合部位は、一般に10〜40塩基長である。1つの実施形態では、標的核酸結合部位は15〜25塩基長である。標的核酸結合配列は、3’または5’端(即ち3’または5’末端)に位置することができる。または、プローブおよび標的核酸が環状ハイブリダイゼーション複合体を形成することができる限り、標的核酸結合部位はプローブ内のどこに位置していてもよい。1つの実施形態では、第一の標的核酸結合部位は、プローブの5’末端または3’末端のいずれかにある。別の実施形態では、第二の標的核酸結合部位は、プローブの5’末端または3’末端の他方に位置する。更に別の実施形態では、標的核酸の3’末端の部位にハイブリダイズする第一の標的核酸結合部位は、プローブの5’末端またはその近傍に位置し、標的核酸の5’末端の部位にハイブリダイズする第二の標的核酸結合部位は、プローブの3’末端またはその近傍に位置する。
プローブは、標的核酸とハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。ハイブリダイゼーション複合体は、2つの標的核酸結合部位でプローブと標的核酸とがハイブリダイゼーションすることによって形成される。2つの標的核酸結合部位はそれぞれ、標的核酸内の異なる部分に対して相補的である。ハイブリダイゼーション複合体の一例を図1に示す。
本明細書に記載されているように、プローブの5’末端は連結可能ではない。1つの実施形態では、プローブの5’末端は脱リン酸化している。別の実施形態では、プローブの5’末端には、ホスホリル基上にまたはホスホリル部分を置換して化学部分が結合しており、ライゲーションを妨げている。更に別の実施形態では、5’末端のヌクレオチドは、リガーゼ酵素を用いたライゲーションを不可能にする非天然核酸である。
本発明によるプローブは、その3’末端からの伸長反応を可能としない。1つの実施形態では、プローブの3’末端ヌクレオチドはブロックされている。例えば、3’末端ヌクレオチドは、ジデオキシ核酸、またはポリメラーゼ酵素を用いた伸長を不可能にする他のいかなる核酸(天然またはそうでないもの)でもあり得る。別の実施形態では、プローブの3’末端には、例えば3’ −OH部分上で化学部分が結合しており、該末端からの伸長を妨げている。更に別の実施形態では、プローブの3’末端はプライマーとハイブリダイズせず、その結果、該プローブの3’末端は、ポリメラーゼによる伸長反応のためのプライマーとしての機能を果たすことができない。
1つの実施形態では、プローブは第一のプライマー結合領域を更に含む。別の実施形態では、プローブは第二のプライマー結合領域を更に含む。一般に、プライマー結合領域は、プローブの標的核酸結合部位と重複しない。更に、第一のプライマー結合領域および第二のプライマー結合領域を包含する実施形態では、通常、2つのプライマー結合領域は互いに重複しない。1つの実施形態では、第一のプライマー結合領域は、プローブの第一標的核酸結合配列と第二標的核酸結合配列の間に位置する。別の実施形態では、第二のプライマー結合領域は、プローブの第一標的核酸結合配列と第二標的核酸結合配列の間に位置する。プライマー結合領域は、標的核酸結合部位の一方から少なくとも15塩基、例えば標的核酸結合部位の一方から少なくとも20、25、30、35、40、45塩基以上の位置にあることができる。更に別の実施形態では、プローブは2つのプライマー結合領域を含み、プライマー結合領域はそれぞれ、第一標的核酸結合領域と第二標的核酸結合領域の間に位置し、標的核酸結合部位の一方から少なくとも20塩基離れている。別の実施形態では、プライマー結合領域はそれぞれ、標的核酸結合部位の一方から少なくとも30塩基離れている。
<標的核酸の検出>
本明細書に記載されているように、標的核酸の検出法は、
標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、
核酸合成のための鋳型としてプローブを用いて、共有結合した環状の標的核酸を形成するステップと、
共有結合した環状の標的核酸を検出するステップと
を含む。
本明細書に記載されているように、標的核酸の検出法は、
標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップと、
核酸合成のための鋳型としてプローブを用いて、共有結合した環状の標的核酸を形成するステップと、
共有結合した環状の標的核酸を検出するステップと
を含む。
前述のように、プローブは、標的核酸に相補的であり該標的核酸にハイブリダイズする、2つの標的核酸結合部位を含む。標的核酸とプローブとのハイブリダイゼーション複合体の理想的なTmは、40℃〜75℃、典型的には45℃〜70℃、例えば50℃〜65℃である。
ポリヌクレオチドのTmを算出するための式は、当分野において周知である。例えば、Tmは次式により算出することができる。Tm=69.3+0.41×(G+C)%−650/L(式中、Lはヌクレオチドにおけるオリゴヌクレオチドの長さである)。ハイブリッドポリヌクレオチドのTmは、1M塩でのハイブリダイゼーションアッセイから導出された式を用いて推定することもでき、一般にPCRプライマーのTmの計算に使用することができる。[(A+Tの数)×2℃+(G+Cの数)×4℃](例えば、C.R.Newton et al.PCR,2nd Ed.,Springer−Verlag(New York:1997),p.24を参照のこと)。当分野には、さらに複雑な計算法もあり、その方法では、Tm算出に構造および配列の特徴を考慮する。算出されるTmは、単なる推定値にすぎない。最適温度は一般に実験的に決定される。配列の安定性および融解温度は、例えば、mfold(Zuker(1989)Science,244,48−52)またはOligo 5.0(Rychlik & Rhoads(1989)Nucleic Acids Res.17,8543−51)などのプログラムを使用して決定することもできる。天然および非天然核酸のTmの算出法も、当分野では公知である。例えば、LNA−DNAハイブリッドの融解温度は、例えば参照により組込まれるMcTigue et al.(2004)Biochemistry,43,5388−5405およびTolstrup et al.,(2003)Nucl.Acid Res.31,3758−62に記載されているような、当分野で公知の方法を用いて計算することができる。
<伸長>
環状ハイブリダイゼーション複合体が形成されると、標的核酸は鋳型依存重合反応におけるプライマーとして使用される。伸長ステップは、当業者に公知の重合を可能にする条件(所与のポリメラーゼに適切なヌクレオチド、緩衝液、マグネシウムおよび温度)下でポリメラーゼを与えることにより行なわれる。本発明は、当分野で公知のいかなるポリメラーゼの使用も意図する。1つの実施形態では、ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである。別の実施形態では、ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼを欠くDNAポリメラーゼである。更に別の実施形態では、ポリメラーゼは熱安定性DNAポリメラーゼである。伸長反応は、鎖置換が起こらない条件下で一般に行なわれる。1つの実施形態では、鎖を置換しないDNAポリメラーゼが使用される。別の実施形態では、鎖置換が可能なDNAポリメラーゼを、鎖置換が生じない条件下で使用する。例えば、伸長を65℃以下の温度で行う場合、Pfu DNAポリメラーゼなどの熱安定性酵素は鎖を置換しない。前述のように、プローブ自体は伸長反応のプライマーとして機能することができず、更に、その5’末端は連結可能ではない。プローブは、標的核酸をプライマーとして使用して合成するための鋳型として機能するにすぎない(例えば図2を参照のこと)。
環状ハイブリダイゼーション複合体が形成されると、標的核酸は鋳型依存重合反応におけるプライマーとして使用される。伸長ステップは、当業者に公知の重合を可能にする条件(所与のポリメラーゼに適切なヌクレオチド、緩衝液、マグネシウムおよび温度)下でポリメラーゼを与えることにより行なわれる。本発明は、当分野で公知のいかなるポリメラーゼの使用も意図する。1つの実施形態では、ポリメラーゼはDNAポリメラーゼである。別の実施形態では、ポリメラーゼはエキソヌクレアーゼを欠くDNAポリメラーゼである。更に別の実施形態では、ポリメラーゼは熱安定性DNAポリメラーゼである。伸長反応は、鎖置換が起こらない条件下で一般に行なわれる。1つの実施形態では、鎖を置換しないDNAポリメラーゼが使用される。別の実施形態では、鎖置換が可能なDNAポリメラーゼを、鎖置換が生じない条件下で使用する。例えば、伸長を65℃以下の温度で行う場合、Pfu DNAポリメラーゼなどの熱安定性酵素は鎖を置換しない。前述のように、プローブ自体は伸長反応のプライマーとして機能することができず、更に、その5’末端は連結可能ではない。プローブは、標的核酸をプライマーとして使用して合成するための鋳型として機能するにすぎない(例えば図2を参照のこと)。
伸長された後(例えば、図2を参照)、標的核酸の5’末端に伸長生成物が連結されることにより、共有結合した環状標的核酸が形成される。
本明細書に記載の方法によれば、プローブは、標的核酸の濃度より高濃度で提供される。プローブ濃度は、標的核酸の濃度の少なくとも1.1倍、例えば少なくとも2、3、4、5、10、20、30、50、100倍またはそれ以上であり得る。
<共有結合した環状標的核酸の検出>
次に、共有結合した環状標的核酸を検出する。共有結合した環状標的核酸は、当分野で公知のいずれかの方法を使用して検出することができる。1つの実施形態では、共有結合した環状標的核酸はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して検出される。前述のように、プローブは1つまたは複数のプライマー結合領域を含むことができる。これらの配列に相補的なPCRプライマーを使用することができる。
次に、共有結合した環状標的核酸を検出する。共有結合した環状標的核酸は、当分野で公知のいずれかの方法を使用して検出することができる。1つの実施形態では、共有結合した環状標的核酸はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して検出される。前述のように、プローブは1つまたは複数のプライマー結合領域を含むことができる。これらの配列に相補的なPCRプライマーを使用することができる。
共有結合した環状標的核酸の量は、PCRを使用して定量することもできる。例えば蛍光、リアルタイム測定法を用いるPCRによる定量法は、参照により組み込まれる米国特許第5,723,591号、米国特許第5,846,717号、米国特許第5,994,056号、米国特許第6,001,567号、米国特許第6,348,314号および米国特許第6,635,427号に記載されている。定量的PCR(qPCR)は、おそらく最も高感度で最も融通性のある遺伝子発現プロファイリング法であり、核酸レベルを比較するために用いることができる。1つの実施形態では、共有結合した環状標的核酸は、TaqMan(登録商標)アッセイ(Applied Biosystems,Foster City,CA;例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,723,591号を参照のこと)を使用して、検出・定量される。アッセイは1回のPCR反応中に行なわれる。TaqManアッセイは、AMPLITAQ(登録商標)DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems,Foster City,CA)などのDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。所与の対立遺伝子または突然変異に特異的な蛍光プローブがPCR反応に含まれている。該蛍光プローブは、5’−リポーター色素(例えば蛍光色素)および3’−消光色素を有するオリゴヌクレオチドからなる。PCR中に、蛍光プローブがその標的に結合すると、ポリメラーゼの5’→3’核酸分解活性によって蛍光プローブがリポーター色素と消光色素の間で切断される。消光色素からリポーター色素が分離すると、蛍光が増加することになる。そのシグナルが、PCRのサイクル毎に蓄積し、これを蛍光計でモニターすることができる。共有結合した環状標的核酸は、当業者に公知のいずれの方法を使用しても、検出・定量することができる。このような当業者に公知の方法として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,538,848号に記載の方法;ポリメラーゼ連鎖反応;分枝ハイブリダイゼーション法(例えば、参照により組み込まれるChiron社の米国特許第5,849,481号、米国特許第5,710,264号、米国特許第5,124,246号および米国特許第5,624,802号);ローリングサークル複製(例えば、参照により組み込まれる米国特許第6,210,884号および米国特許第6,183,960号);NASBA(例えば参照により組み込まれる米国特許第5,409,818号);分子ビーコン技術(例えば、参照により組み込まれる米国特許第6,277,607号;米国特許第6,150,097号;および米国特許第6,037,130号);近接プローブ法(参照によりその全体が本明細書に組込まれる米国特許第6,174,670Bl号);サンライズプライマーシステム(例えば、参照により組み込まれる米国特許第5,866,336号);スコルピオンプローブシステム(例えば参照により組み込まれるThelwell et al.,(2000)Nucleic Acids Research 28,3752−3761; Whitcombe et al.,(1999).Nature Biotechnology 17,804−807);Luminex/xMAP(ミクロスフェア)システム;およびDzyNA−PCRシステム(例えば、参照により組み込まれる米国特許第6,140,055号)などが挙げられる。
<他のハイブリッド複合体>
まれではあるが、プローブ濃度が過剰な場合には、1つの標的核酸および2つのプローブを含む、線状ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合もある。その場合には、標的核酸は、第一プローブの第一の標的核酸結合部位および第二プローブの第二核酸結合部位にハイブリダイズしている(例えば、図3を参照)。例えば、伸長反応を追加プライマーの存在下で行えば、二本鎖複合体が形成され、このような線状ハイブリダイゼーション複合体を検出することができる。
まれではあるが、プローブ濃度が過剰な場合には、1つの標的核酸および2つのプローブを含む、線状ハイブリダイゼーション複合体が形成される場合もある。その場合には、標的核酸は、第一プローブの第一の標的核酸結合部位および第二プローブの第二核酸結合部位にハイブリダイズしている(例えば、図3を参照)。例えば、伸長反応を追加プライマーの存在下で行えば、二本鎖複合体が形成され、このような線状ハイブリダイゼーション複合体を検出することができる。
<複数標的核酸の同時検出>
本明細書に記載の方法は、1回の反応で複数の標的核酸の検出を可能にする。1つの実施形態では、同じプローブにハイブリダイズすることができる(例えば、標的核酸のすべてが共通の第一および第二プローブ相互作用部位を有する)が、第一プローブ相互作用部位と第二プローブ相互作用部位の間に様々な長さが介在する複数の標的核酸を検出することができる(例えば、図4を参照)。例えば、標的は、第一プローブ相互作用部位と第二プローブ相互作用部位の間に介在する長さが、50、100、150、200、250、300、400、500塩基以上異なっていてもよい。または、標的は配列が異なってもよい。標的はそれぞれ、配列解析、判別制限酵素消化パターン(differential restriction digest pattern)またはポリメラーゼ連鎖反応によって同定することができるユニークな配列を有していてもよい。標的はまた、様々な抗原または化学部分に対する親和性を有する様々なアプタマー配列を含むこともできる。
本明細書に記載の方法は、1回の反応で複数の標的核酸の検出を可能にする。1つの実施形態では、同じプローブにハイブリダイズすることができる(例えば、標的核酸のすべてが共通の第一および第二プローブ相互作用部位を有する)が、第一プローブ相互作用部位と第二プローブ相互作用部位の間に様々な長さが介在する複数の標的核酸を検出することができる(例えば、図4を参照)。例えば、標的は、第一プローブ相互作用部位と第二プローブ相互作用部位の間に介在する長さが、50、100、150、200、250、300、400、500塩基以上異なっていてもよい。または、標的は配列が異なってもよい。標的はそれぞれ、配列解析、判別制限酵素消化パターン(differential restriction digest pattern)またはポリメラーゼ連鎖反応によって同定することができるユニークな配列を有していてもよい。標的はまた、様々な抗原または化学部分に対する親和性を有する様々なアプタマー配列を含むこともできる。
別の実施形態では、複数の標的核酸は、プローブ相互作用部位が異なり得る。例えば、プローブはそれぞれ、特異的な標的核酸(例えば、それぞれの標的にユニークなプローブ)と相互作用する。または、プローブは、標的核酸のサブセットと相互作用することができる。プローブの第一および第二の標的核酸結合部位は、2、3、4、5、10または20個以上の標的のサブセットにハイブリダイズすることができる。
別段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験では本明細書に記載された方法および材料に類似または同等のものを使用することができるが、適切な方法および材料は下記の通りである。本明細書で言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はすべて、参照により全体が組み入れられる。矛盾を来す場合には、定義を含め本明細が規定する。更に、材料、方法および実施例は例示に過ぎず、これらに限定する意図はない。
約5μl容量のサンプルを、以下の成分と混合し、最終容量を50μlとする。
1μM プローブDNA
PCRプライマー、各100nM
4U Pfuポリメラーゼ
2U Taq−リガーゼ
1mM NADP
2mM dNTPs(それぞれ)
トリス緩衝液
2.0mM MgSO4
1μM プローブDNA
PCRプライマー、各100nM
4U Pfuポリメラーゼ
2U Taq−リガーゼ
1mM NADP
2mM dNTPs(それぞれ)
トリス緩衝液
2.0mM MgSO4
熱サイクルは以下に記載の条件を使用して実施する。第一サイクルは、標的核酸にプローブをアニーリングさせ、伸長させ、連結させて共有結合した環状標的核酸を形成するために実施する。
95℃で1分間;55℃で30秒間;65℃で2分間を1サイクル。
95℃で1分間;55℃で30秒間;65℃で2分間を1サイクル。
伸長は、鎖を置換しない条件(例えば65℃)で行う。その後、以下のサイクルを実施して、共有結合した環状標的核酸を検出する。
95℃で30秒間;55℃で30間秒;72℃で30秒間を30サイクル。
95℃で30秒間;55℃で30間秒;72℃で30秒間を30サイクル。
第二サイクルの後、反応生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析する。
Claims (33)
- a.5’末端および3’末端を有する標的核酸をプローブに対して環状のハイブリダイゼーション複合体を形成するようにハイブリダイズさせるステップであって、前記プローブが5’末端および3’末端を有し、前記プローブが第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含み、前記プローブの3’末端がブロックされており、5’末端が連結可能ではないステップと、
b.核酸合成のための鋳型として前記プローブを用いて、閉じた標的核酸を形成するステップと、
c.前記共有結合した環状の標的核酸を検出するステップと
を含む標的核酸を検出するための方法。 - 前記プローブが50〜300塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブが100〜200塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸結合部位が前記プローブの前記5’末端または3’末端の一方にある、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の標的核酸結合部位が前記プローブの前記5’末端または3’末端の他方にある、請求項4に記載の方法。
- 前記核酸合成にDNAポリメラーゼを使用する、請求項1に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼがエキソヌクレアーゼを欠く、請求項1に記載の方法。
- DNAポリメラーゼが鎖を置換しないポリメラーゼである、請求項6に記載の方法。
- 前記DNAポリメラーゼが、T7−DNAポリメラーゼ、Pfu−DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼから成る群より選ばれる、請求項6に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸結合部位が10〜40塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸結合部位が15〜25塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の標的核酸結合部位が10〜40塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記第二の標的核酸結合部位が15〜25塩基長である、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブの前記5’末端が脱リン酸化されている、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブの前記3’末端ヌクレオチドがジデオキシ核酸である、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブが少なくとも1つのプライマー結合領域を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記プローブが第一のプライマー結合領域および第二のプライマー結合領域を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマー結合領域が、前記標的核酸結合部位の一方から少なくとも15塩基の位置にある、請求項17に記載の方法。
- 前記第一のプライマー結合領域が、前記第一の標的核酸結合部位から少なくとも15塩基の位置にあり、前記第二のプライマー結合部位が、前記第二の標的核酸結合部位から少なくとも15塩基の位置にある、請求項18に記載の方法。
- 前記共有結合した標的核酸をポリメラーゼ連鎖反応により検出する、請求項1に記載の方法。
- a.5’末端および3’末端を有するプローブであって、前記プローブが第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含み、前記プローブの3’末端がブロックされており、5’末端が連結可能ではないプローブと、
b.ポリメラーゼと
を含む組成物。 - 5’末端および3’末端を有する標的核酸を更に含む、請求項21に記載の組成物。
- 前記ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、請求項21に記載の組成物。
- 前記DNAポリメラーゼが鎖を置換しないポリメラーゼである、請求項23に記載の組成物。
- 前記DNAポリメラーゼがエキソヌクレアーゼを欠く、請求項23に記載の組成物。
- プライマーを更に含む、請求項21に記載の組成物。
- リガーゼを更に含む、請求項21に記載の組成物。
- a.5’末端および3’末端を有するプローブであって、前記プローブが第一の標的核酸結合部位および第二の標的核酸結合部位を含み、前記プローブの3’末端がブロックされており、5’末端が連結可能ではないプローブと、
b.ポリメラーゼと、
c.それらのための包装材料と
を含むキット。 - プライマーを更に含む、請求項28に記載のキット。
- 前記ポリメラーゼがDNAポリメラーゼである、請求項28に記載のキット。
- 前記DNAポリメラーゼが鎖を置換しないポリメラーゼである、請求項30に記載のキット。
- 前記DNAポリメラーゼがエキソヌクレアーゼを欠く、請求項30に記載のキット。
- リガーゼを更に含む、請求項28に記載のキット。
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