KR20120057562A - 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물의 검출 및 관련된 제조 방법 및 암의 검출 및 모니터링을 위한 용도 - Google Patents
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Abstract
본원은 단일 분석 시스템으로 생물학적 샘플 중의 6종의 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP)의 존재를 동시에 검출함으로써 암을 검출하거나 암 진행을 모니터링하기 위한 방법, 시스템 및 키트를 개시한다.
Description
본 출원은 일반적으로 피브리노겐 및 피브린 분해 생성물(FDP)에 대한 항체 집단의 제조 방법 및 생산, 항체 집단 그 자체, 및 관련된 사용 방법, 혈청 중의 FDP의 양을 면역화학적으로 측정함으로써 암을 검출하고 암 치료의 진행을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
최근 암에 대한 이해가 진보했음에도 불구하고, 암의 스크리닝 및 확인을 위한 현재의 기술은 개선의 여지가 있다. 당업계에 공지된 암 스크리닝 방법은 항체를 이용함으로써 암 관련 항원을 검출하고자 시도한다. 항원은 체내에서 면역 반응을 유발할 수 있는 단백질, 핵산 또는 다당류와 같은 거대분자이다. 포유동물 및 다른 동물의 면역계는 암 관련 항원과 같은 외부 물질을 탐지할 수 있는 능력 및 그러한 암 관련 항원을 특이적으로 표적화하여 그와 반응하는 항체를 생산함으로써 이러한 항원에 반응할 수 있는 능력을 갖는다. 따라서, 이들 암 관련 항원 또는 포유동물의 순환 혈액 중의 이들 항원을 표적화하는 순환 항체의 검출과 그 개체에서의 암의 존재 사이에는 강한 상관성이 있다. 따라서, 그러한 항원 또는 항체의 존재를 검출하는 테스트가 암의 스크리닝 및 진단에 유용하다.
전망있는 암 관련 항원 표적의 하나는 피브린 분해 생성물 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP) 둘 다로 이루어진 풀(pool)이다. 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물 둘 다의 생성은 건강한 개체에서는 제한되지만, FDP는, 플라스민 및 트롬빈과 같은 단백질 분해 효소가 암 세포에 의해 방출될 때 암 환자에게서 과다 생성된다. 또한, FDP는 신생혈관형성 및 전이와 같은 다른 암 관련 프로세스의 부산물로서 생성된다. FDP는 종양으로부터 주변 체액으로 누출되기 때문에, 방광암 환자의 뇨, 폐암 환자의 혈장 및 기타 암 환자의 혈장 또는 혈청에서 FDP 수치의 증가를 측정할 수 있다. 암 진단에 있어서의 FDP 측정의 유용성은 수년 동안 의심을 받아왔지만, 요구되는 감도로 FDP를 정량적으로 측정할 수 있는 개량된 분석법은 개발되지 않았다. 현재의 FDP 분석법은 일반적으로 FDP 그룹의 대표로서 D 이량체와 같은 하나의 특정 FDP 성분을 측정하는 것에 제한된다.
암은 조직 인자(TF) 및 유로키나제형 플라스미노겐 활성화제(uPA)에 의해 조절되는 경로를 통해 피브리노겐 분해 생성물 및 피브린 분해 생성물 둘 다를 생성함으로써 피브린 분해 생성물 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP) 수치를 둘 다 상승시킨다(도 1). 플라스민에 의해 피브리노겐이 절단되면 단편 D 및 E가 주요 최종 생성물로서 생성된다. 트롬빈은 응고 캐스케이드로부터의 신호에 반응하여 피브리노겐을 피브린으로 전환시킨다. 플라스민에 의해 피브린이 절단되면 주요 최종 생성물로서 D 이량체가 생성된다. 암에 의한 플라스민의 절단을 통해 생성된 FDP의 조성은 2종의 기질, 즉 피브린과 피브리노겐의 상대적 양에 의해 영향을 받는다.
본원은, 3종의 필수 단편 유형(단편 D, 단편 E 및 D 이량체)을 포함하고, 경우에 따라, 추가의 3종의 단편 유형(단편 Y 및 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP)의 2종의 구별 가능한 형태)을 포함하는 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP)의 특정한 혼합물을 총 6종의 FDP 성분에 대하여 동시에 검출하는 것을 포함하는 암 검출 방법을 개시한다. 이 방법은 특이적인 다클론 항체 풀을 이용하여 생물학적 샘플 중의 상기 3종의 필수 FDP 항원을 동시에 검출하는 것을 포함하며, 여기서 상기 다클론 항체는 상기 3종의 FDP 단편에 대해 특이적인 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 피험체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계; 상기 생물학적 샘플을 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP)과 관련된 적어도 3종의 항원에 결합하여 항체-FDP 복합체를 형성하는 항체 제제와 반응시키는 단계로서, 상기 3종의 FDP 관련 항원은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체인 단계; 상기 항체-FDP 복합체를 검출하는 단계; 및 피험체의 암을 진단하는 단계를 포함하는, 피험체에서 암을 검출하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체 제제는 추가로 경우에 따라 단편 Y 및 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP) 중 하나 이상에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체 제제는 다클론 항체 제제이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 효소 결합 면역흡착 분석을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 진단 단계는 하나 이상의 추가의 진단 테스트를 더 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, (a) 피험체로부터 제1 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 상기 제1 샘플은 제1 샘플링 시점에 수집하는 것인 단계; (b) 피험체로부터 제2 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 상기 제2 샘플은 상기 제1 샘플링 시점 후 제2 샘플링에 수집하는 것인 단계; (c) 상기 생물학적 샘플을, FDP와 관련된 적어도 3종의 항원에 결합하는 항체 제제와 반응시켜 항체-FDP 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 3종의 FDP 관련 항원은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체인 단계; (d) 상기 항체-FDP 복합체를 검출하는 단계; (e) 제1 생물학적 샘플 중 FDP 수치에 대한 제2 생물학적 샘플 중 FDP 수치의 비를 결정하는 단계; (f) 암이 진행되었는지를 판정하는 단계; 및 경우에 따라, 상기 제1 시점 및 제2 시점 후의 시점에 채취한 추가의 생물학적 샘플로 단계 (a)∼(e)를 반복하는 단계를 포함하는, 환자의 암을 모니터링하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 항체 제제는 추가로 경우에 따라 단편 Y 및 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP) 중 하나 이상에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체 제제는 다클론 항체 제제이다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 효소 결합 면역흡착 분석을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 비가 1.15 이상일 경우 암은 진행된 것이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 비가 1.15 미만일 경우 암은 퇴행하였거나 안정한 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 피험체에서 암을 검출하기 위한 키트를 제공하며, 이 키트는 적어도 3종의 FDP 관련 항원에 결합하는 항체 제제로서, 상기 3종의 FDP 관련 항원이 단편 D, 단편 E 및 D 이량체인 항체 제제; 검출 시스템; 및 FDP를 측정하고 FDP의 존재를 암과 서로 관련시키는 것에 관한 설명서를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 검출 시스템은 적어도 3종의 FDP 관련 항원에 특이적인 검출 항체를 포함하며, 여기서 상기 3종의 FDP 관련 항원은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 항체 제제는 경우에 따라 추가로 단편 Y 및 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP) 중 하나 이상에 결합한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 항체 및 검출 시스템은 효소 결합 면역흡착 분석을 포함한다.
도 1은 암에 의한 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP) 생성의 개략도를 도시한다.
도 2는 FDP 면역원 로트(03, 13, 15, 17, 19 21, 24 및 25로 명명된 8개 로트)의 비환원(도 2A) 및 환원(도 2B) SDS-PAGE 겔을 도시한다. UD는 비분해 피브리노겐을 나타내고; D는 단편 D를 나타내며; E는 단편 E를 나타낸다.
도 3은 대장 암종(CRC) 환자(n=5)로부터 얻은 인간 혈청 샘플(도 3A, 약 5초 동안 필름에 노출됨, 도 3B, 약 30초 동안 필름에 노출됨) 및 정상 대조군 혈청(n=5)에 대한 항FDP 항체 결합의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 도 3C는 레인당 로딩된 단백질 총량을 보여주는 컴패니언 겔의 쿠마시 블루 염색을 도시한다. FDP 아형의 위치가 겔에 표시되어 있다.
도 4는 항FDP 다클론 항체 풀(+) 및 토끼 IgG(-) 결합 비드를 사용하여 인간 혈청(정상인 및 CRC 환자)으로부터의 항원에 면역 침전(IP)을 실시한 결과를 도시한다. 3종의 샘플, 즉 FDP 캘리브레이터 대조군(FDP), 정상 인간 혈청(N4) 및 CRC 혈청(C15)을 테스트하였다.
도 5는 항FDP 다클론 항체 풀(도 5A) 또는 토끼 IgG(대조군) 결합 비드(도 5B)를 사용하여 5명의 CRC 환자 및 5명의 정상 피험자의 혈청으로부터 면역 침전시킨 FDP 항원을 도시한다.
도 2는 FDP 면역원 로트(03, 13, 15, 17, 19 21, 24 및 25로 명명된 8개 로트)의 비환원(도 2A) 및 환원(도 2B) SDS-PAGE 겔을 도시한다. UD는 비분해 피브리노겐을 나타내고; D는 단편 D를 나타내며; E는 단편 E를 나타낸다.
도 3은 대장 암종(CRC) 환자(n=5)로부터 얻은 인간 혈청 샘플(도 3A, 약 5초 동안 필름에 노출됨, 도 3B, 약 30초 동안 필름에 노출됨) 및 정상 대조군 혈청(n=5)에 대한 항FDP 항체 결합의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 도 3C는 레인당 로딩된 단백질 총량을 보여주는 컴패니언 겔의 쿠마시 블루 염색을 도시한다. FDP 아형의 위치가 겔에 표시되어 있다.
도 4는 항FDP 다클론 항체 풀(+) 및 토끼 IgG(-) 결합 비드를 사용하여 인간 혈청(정상인 및 CRC 환자)으로부터의 항원에 면역 침전(IP)을 실시한 결과를 도시한다. 3종의 샘플, 즉 FDP 캘리브레이터 대조군(FDP), 정상 인간 혈청(N4) 및 CRC 혈청(C15)을 테스트하였다.
도 5는 항FDP 다클론 항체 풀(도 5A) 또는 토끼 IgG(대조군) 결합 비드(도 5B)를 사용하여 5명의 CRC 환자 및 5명의 정상 피험자의 혈청으로부터 면역 침전시킨 FDP 항원을 도시한다.
피브린 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP)의 검출은 다수의 암에 있어서 중요한 임상적 진단 도구가 될 수 있다. FDP 수치는 암 발생, 단계, 진행 및 예후와 서로 관련이 있다. 현재의 FDP 분석은 일반적으로 D 이량체와 같은 하나의 특정 FDP 성분을 이 그룹의 대표로서 측정하는 것에 한정되어 있다. 이와는 달리, 본 발명자들은, FDP의 존재 또는 그 수치의 변화를 각각 암의 존재 또는 진행과 서로 관련시키기 위해, 복수의 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물을 동시에 측정해야 한다고 판단하였다. 본 명세서에 있어서, "암의 진행"이란 어구는 환자에 있어서의 암의 진행, 퇴행 또는 재발을 포함한다. 본 명세서에 개시된 분석은 암의 진행을 검출 및 모니터링하는 데 특히 유용한 적어도 3종의 FDP 항원을 특이적으로 인식하는 항체 제제를 사용한다. 이들 3종의 필수 FDP는 단편 D, 단편 E 및 D 이량체(단편 X로도 알려짐)이다. 암의 검출 및 모니터링에 유용한 3종의 추가의 FDP는 시퀀싱에 의해 정의된 2종의 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP) 및 단편 Y이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 이들 3종의 필수 FDP 항원을 동일한 분석으로 거의 동시에 검출한다. 다른 실시형태에서는, 4종, 5종 또는 6종의 FDP 항원을 동일한 분석으로 동시에 검출한다.
일 실시형태에서, 개시된 분석은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체를 측정한다. 또 다른 실시형태에서, 개시된 분석은 단편 D, 단편 E, D 이량체, 및 IPDP 중 하나 또는 둘 다를 측정한다. 또 다른 실시형태에서, 개시된 분석은 단편 D, 단편 E, D 이량체 및 단편 Y를 측정한다. 또 다른 실시형태에서, 개시된 분석은 단편 D, 단편 E, D 이량체, 단편 Y, 및 IPDP 중 하나 또는 둘 다를 측정한다.
면역분석은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에 개시된 친화성 정제 항FDP 항체는 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 도트 또는 슬롯 블롯, 세파로스 비드 트랩핑 피분석물 시스템, 또는 측면 흐름(lateral-flow) 또는 유통(flow-through) 시스템과 같은 다양한 고속 테스트 방식을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 분석 방법에 이용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법의 특별한 특징 중 하나는 포착 및/또는 검출 항체가 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP 항원에 특이적으로 결합할 수 있다는 것이다. 본원에서 항체 제제는, 항체 제제가 다중 항체 특이성을 포함하는 것을 반영하기 위해 항체 풀로서 언급된다. 일 실시형태에서, 항체 제제는 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP 항원 종을 포함하는 면역원 제제에 대해 생성된 다클론 항체 제제이다. 다클론 항체는 토끼, 염소, 말, 당나귀, 양, 닭 또는 상어를 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 종에서 생성될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP 항원 각각에 대해 생성된 항체 제제는 독립적으로 제조된 후 함께 합해져서 항FDP 항체 풀을 형성할 수 있다.
또한, 다른 실시형태에서, 상기 항체 제제는 단일클론, 일특이적 다클론, 키메라 또는 인간화 항체 또는 항체 단편의 풀을 포함할 수 있으며, 이때 각각의 항체는, 항체 풀이 동일한 분석에서 거의 동시에 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP 항원과 반응할 수 있는 한, 6종의 FDP 항원 중 1종 이상과 반응한다. 이러한 항체의 제제는 당업계에 잘 알려져 있으며 본 명세서에서 상세히 설명하지 않는다.
본 발명은 또한 FDP에 결합하여 피험체에 있어서 암의 존재 또는 진행을 검출 또는 모니터링하기 위한 시스템 및 키트를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 시스템은 생물학적 샘플 중의 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP에 결합하고 검출하여 상기 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP의 존재를 피험체에 있어서의 암의 존재 또는 진행과 서로 관련시키기 위한 항체 풀 및 검출 시약을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 키트는 생물학적 샘플 중의 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP에 결합하고 검출하여 상기 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP를 피험체에 있어서의 암의 존재 또는 진행과 서로 관련시키기 위한 항체 풀 및 검출 시약을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 키트는 (1) 생물학적 샘플로부터의 FDP를 포착하기 위한 3종, 4종, 5종 또는 6종의 FDP에 결합하는 1종 이상의 항체 풀; (2) 검출 항체; (3) (a) 항체 풀 또는 (b) 검출 항체 중 하나 이상을 고정화하기 위한 고체 지지체; (4) 검출 시약; (5) 세척 용액; 및 (6) 키트 구성요소 및 생물학적 샘플을 사용하여 분석을 수행하는 것에 관한 설명서 중 하나 이상을 패키지 또는 용기 내에 포함할 수 있다. 상기 구성요소 (1)∼(6) 중 2개 이상이 동일한 용기 내에 포함되는 실시형태도 이용될 수 있다.
키트가 제공될 경우, 상이한 시약을 별개의 용기에 포장하고, 사용 직전에 혼합하거나 고체 지지체에 부착시킬 수 있다. 성분들을 이와 같이 개별적으로 포장하는 것에 의해 활성 성분의 기능의 손실없이 장기간 저장하는 것이 가능하다.
특정 키트에 포함되는 조성물은, 상이한 성분들의 수명이 보존되고 그 성분이 용기의 재료에 의해 흡착되거나 변경되지 않도록, 임의의 유형의 용기 내에 제공될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 키트에 또한 사용 설명서를 제공할 수 있다. 사용 설명서는 종이 또는 다른 기재에 인쇄된 것이고/이거나 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오 테이프, 오디오 테이프, 플래시 메모리 소자 등의 전자 판독이 가능한 매체로서 제공될 수 있다. 상세한 설명서는 키트와 물리적으로 결합되지 않아도 되며, 대신에, 사용자에게 키트의 제조업자 또는 판매자가 지정한 인터넷 웹 사이트를 알려 주거나 사용자에게 전자 메일로서 제공될 수 있다.
또한, 청구된 방법, 시스템 및 키트는 혈청, 전혈, 혈장, 객담, 뇨, 복수, 종양 조직, 뇌척수액, 질 또는 직장 분비물 및 눈물을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는 다양한 공급원으로부터 얻은 생물학적 샘플 중의 암 관련 FDP를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 분석 방법을 암 스크린법으로서 이용할 경우, 각각의 실험실은, 지역 단체 연구에 기초한 정상 범위 및 비정상 범위를 확립해야 한다. 실시예 11은 정상인 샘플과 암 환자 샘플의 전형적인 분포를 제공한다. 암을 가진 것으로 의심되는 환자의 생물학적 샘플 중의 FDP 수치를, 정상 범위를 특정 수치만큼 초과하는 샘플을 확인하는 것에 암의 존재와 서로 관련시킨다.
암 진단이 확정된 환자를 모니터링하는 분석 방법을 이용할 경우, 베이스라인(baseline) 판독이 그 FDP 수치의 평가에 앞서 행해져야 한다. 초기 혈청 분리물의 FDP 값이 베이스라인 판독값으로서 이용된다. 후속 혈청 분리물의 값은 하기 비(R)를 구함으로써 평가한다.
R = b/a
(여기서, a는 초기 FDP 값이고, b는 현재의 FDP 값임)
베이스라인 FDP에 대한 현재의 FDP 값의 비가 1.15보다 클 경우, 그 환자는 병이 진행되었을 가능성이 있으나, FDP 항원 테스트의 결과가 이들 암 환자의 병 진행을 모니터링하기 위한 진료 기준인 다른 임상적 양상과 함께 이용되어야 한다.
실시예
실시예에서 인용된 상업적으로 입수 가능한 시약들은 달리 나타내지 않는다면 제조업자의 설명서에 따라 사용하였다.
실시예 1
FDP 면역원의 제조
FDP 면역원은 피브린과 피브리노겐을 둘 다 포함하는 정제된 인간 피브리노겐 제품을 구입하여 제조하였으며, 이것을 본 절차에서 피브린/피브리노겐이라 칭한다. 그 후, Haverkate 및 Timan 법(Thromb. Res. 10:803-812, 1977)에 의해, 피브린/피브리노겐을 플라스민과 반응시켜, 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP)을 형성하였다. 피브린/피브리노겐의 플라스민 분해는 특정 시간 동안 반응을 진행시킨 후 프로테아제 억제제 칵테일을 이용하여 반응을 중지시킴으로써 제어하였다.
구체적으로, 하기 절차를 이용하였다: 50 ml의 원추형 튜브를 이용하여, MOPS 완충액(0.1 M 염화나트륨 및 20 mM 염화칼슘을 함유하는 5 mM 3-(N-모르폴리노)프로판-설폰산(pH 7.4)) 20 ml를, 용액이 37℃ 온도에 도달할 때까지(약 20∼25분) 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이트하고, 정제된 인간 피브린/피브리노겐을 가온된 MOPS 완충액에 첨가하여 용해될 때까지 37℃에서 진탕시켰다. PBS(pH 7.4) 1 ml를 플라스민에 첨가하여 재구성하고, 그 후 5 유닛의 플라스민을 MOPS 용액 중의 피브린/피브리노겐에 첨가하였다. 그 후, 이 혼합물을 37℃ 인큐베이터에서 3시간 동안 진탕시켰다. 진탕기로부터 분해된 FDP를 꺼내어 프로테아제 억제제 칵테일 200 ㎕를 첨가하고, 이 용액을 철저히 혼합하였다. 그 후, 농축된 FDP 저장 용액의 총 단백질 농도를 측정하고, FDP 분해 생성물 신호를 변성 및 환원 조건 하의 4∼20% 구배 SDS-PAGE에서 확인하였다(도 2 참조). 얻어진 FDP 용액을 -40℃에서 보존하였다.
또한, FDP 면역원을 항체의 면역친화성 정제에서와 같이 사용하였고, FDP 검출 시스템에서의 FDP 캘리브레이터 및 대조군으로서 사용하였다.
실시예 2
토끼 항FDP 항체의 제조
실시예 1에 따라 제조된 FDP 면역원으로 토끼를 면역화하였다. 1차 면역화를 위해, 각 토끼에게 1.0∼1.5 ml 인산염 완충 식염수 및 동량의 완전 프로인트 어쥬번트(Complete Freund's Adjuvant) 중 1 mg의 면역원으로 이루어진 에멀션을 주사하였다. 주사한 지 3주 후, 각 토끼에 대해 채혈을 실시하고, FDP에 대한 항체에 대해 혈청을 분석하였다. 채혈한 지 1주 후, 1.0∼1.5 ml 인산염 완충 식염수 및 동량의 불완전 프로인트 어쥬번트(Incomplete Freund's Adjuvant) 중 1 mg의 면역원으로 이루어진 에멀션을 각 토끼에게 주사하여 추가 면역화를 실시하였다. 토끼들은 생존하고 있을 때까지 추가 면역화 및 채혈의 스케쥴로 유지하였다.
면역화 후 다양한 시간 간격에 얻은 토끼 혈청을, 96웰 플레이트 시스템을 이용하는 표준 적정 분석을 수행함으로써 FDP에 대한 항체의 농도를 분석하였다. 전형적인 혈청 적정 분석에서는, 면역원 10 ㎍을 96웰 미량적정 플레이트의 웰에 고정화하고, FBS로 차단하고, 그 후, 1:1 희석률의 일련의 다양한 토끼 혈청과 반응시키고, 세척하고, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합 염소 항토끼 항체(Sigma)로 검출하고, 세척하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 용액과 함께 인큐베이트하고, 중지 용액을 첨가하고, OD 450 nm에서 판독하였다. 희석률에 대한 OD 450 nm 값을 그래프로 작성함으로써 역가를 결정한 후, 곡선의 변곡점을 결정하였다.
토끼 항FDP는 실시예 6에서와 같이 면역친화성 정제하였다.
실시예 3
닭 항FDP 항체의 제조
실시예 1에 따라 제조한 FDP 면역원으로 닭을 면역화하였다. 1차 면역화(0일)를 위해, 각 닭에게 1.0∼1.5 ml의 인산염 완충 식염수 및 동량의 완전 프로인트 어쥬번트 중 1 mg의 면역원으로 이루어진 에멀션을 주사하였다. 35일, 56일, 77일 및 98일째 각 닭에게 추가 면역화를 실시하였다. 26일, 40일, 60일, 81일 및 100일째 닭으로부터 채혈을 실시하였다(혈청 수집). 45일째 혈청 반응 테스트를 시작하였다. 1차 IgY의 채취는 53일째 이루어졌다. 1차 친화성 정제는 56일째 시작하였다.
면역화 후 다양한 시간 간격에 얻은 닭 혈청을, 96웰 플레이트 시스템을 이용하는 표준 적정 분석을 수행함으로써 FDP에 대한 항체의 농도를 분석하였다. 닭 항FDP IgY 항체의 부분집합을 분석 전에 HRP에 접합시켰다. 전형적인 혈청 적정 분석에서는, 면역원 10 ㎍을 96웰 미량적정 플레이트의 웰에 고정화하고, FBS로 차단하고, 그 후, 1:1 희석률의 일련의 다양한 토끼 혈청과 반응시키고, 세척하고, TMB 용액과 함께 인큐베이트하고, 중지 용액을 첨가하고, OD 450 nm에서 판독하였다. 희석률에 대한 OD 450 nm 값을 그래프로 작성함으로써 역가를 결정한 후, 곡선의 변곡점을 결정하였다.
닭 항FDP는 실시예 6에서와 같이 면역친화성 정제하였다.
실시예 4
염소 항
FDP
항체의 제조
실시예 1에 따라 제조된 FDP 면역원으로 염소를 면역화하였다. 1차 면역화를 위해, 각 염소에게 1.0∼1.5 ml의 인산염 완충 식염수 및 동량의 완전 프로인트 어쥬번트 중 1 mg의 면역원으로 이루어진 에멀션을 주사하였다. 주사한 지 3주 후, 각 염소로부터 채혈을 실시하여 혈청을 FDP에 대한 항체에 대해 분석하였다. 채혈한 지 1주 후, 1∼1.5 ml의 인산염 완충 식염수 및 동량의 불완전 프로인트 어쥬번트 중 1 mg의 면역원으로 이루어진 에멀션을 주사함으로써 각 염소에 대해 추가 면역화를 실시하였다. 염소가 더 이상 생존하지 못할 때까지 추가 면역화 및 채혈 계획으로 유지하였다.
면역화 후 다양한 시간 간격에 얻은 염소 혈청을, 96웰 플레이트 시스템을 이용하는 표준 적정 분석을 수행함으로써 FDP에 대한 항체의 농도를 분석하였다. 전형적인 혈청 적정 분석에서는, 면역원 10 ㎍을 96웰 미량적정 플레이트의 웰에 고정화하고, FBS로 차단하고, 그 후, 1:1 희석률의 일련의 다양한 염소 혈청과 반응시키고, 세척하고, HRP 접합 토끼 항염소 항체(Sigma)로 검출하고, 세척하고, TMB 용액과 함께 인큐베이트하고, 중지 용액을 첨가하고, OD 450 nm에서 판독하였다. 희석률에 대한 OD 450 nm 값을 그래프로 작성함으로써 역가를 결정한 후, 곡선의 변곡점을 결정하였다.
염소 항FDP는 실시예 6에서와 같이 면역친화성 정제하였다.
실시예 5
FDP 결합 세파로스 CL 4B의 제조
퍼요오데이트 산화 세파로스 CL 4B(20 ml)를 세파로스 겔 부피의 10배(즉, 20 ml 세파로스 겔의 10배로서 200 ml)의 인산염 완충 염수(PBS)(pH 7.5)로 세척하였다. 세척하고 배수시킨 세파로스 CL 4B를 2.0 mg/ml의 풀링한 FDP 항원 용액 20 ml(겔 부피의 1배)(MOPS 중 FDP, 실시예 1 참조)와 혼합하였다. 탈이온수(DI) 중 0.1 M 나트륨 시아노보로하이드라이드 3 1/2 ml(겔 부피의 1/6)를 이 현탁액에 첨가하고, 현탁액을 실온에서 16∼20시간 동안 진탕시켰다. 그 후, PBS(pH 7.5) 중 0.1 M 글리신 및 0.1 M 나트륨 시아노보로하이드라이드 40 ml(겔 부피의 2배)를 현탁액에 첨가하고, 이 현탁액을 실온에서 2시간 동안 더 연속적으로 진탕시켰다. FDP 결합 세파로스 CL-4B 겔로부터 15분 동안 기체를 제거한 후, 중력 유동에 의해 크로마토그래피 컬럼에 충전하였다. 겔을 하기 용액을 사용하여 순차적으로 세척하였다: 탈이온수(겔 부피의 10배), PBS(pH 7.5)(겔 부피의 10배), 0.5 M NaCl 함유 PBS(겔 부피의 10배), 0.1 M 아세트산나트륨/0.15 M NaCl(pH 3)(겔 부피의 10배, PBS(pH 7.5)(겔 부피의 10배). 사용하지 않을 경우, 겔을 0.1% 나트륨 아지드 함유 PBS 중에서 4℃로 1주까지 보존하였다.
실시예 6
FDP
에 대한
다클론
항체의 면역친화성 정제
다클론 항혈청을 0.2 ㎛ 시린지 필터에 통과시킨 후, 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조한 FDP 결합 세파로스 CL 4B 겔 컬럼에 로딩하였다. 첨가된 여과된 다클론 항혈청의 부피는 겔 부피와 거의 동일하다(겔 부피의 1배). 다클론 항혈청을 첨가한 후, FDP 결합 세파로스 CL 4B 겔 컬럼을 PBS(겔 부피의 5배)로 다시 세척하고, 계속해서 0.5 M NaCl 함유 PBS(겔 부피의 5배)로 세척하였다. 컬럼 상의 FDP에 결합하는 면역친화성 정제된 항FDP 항체를 0.1 M 아세트산나트륨/0.15 M NaCl(pH 3)로 용출시켰다. 모니터링을 위해 용출물을 분획 튜브에 수집하고, 나중에, 검출 가능한 단백질 농도(OD 280 nm 0.2 초과)를 갖는 분획을 장기간 보존을 위해 PETG 보틀로 옮겼다. 얻어진 항체 용액의 pH는 1 M Tris 완충액(pH 8.5)을 첨가하여 중화시켰다.
실시예 7
FDP에 대한 토끼 다클론 항체의 특징 분석
일 실시형태에서, 포착 항체는 친화성 정제된, FDP에 대한 다클론 토끼 항체이다. 토끼를 면역화하고, 실시예 3에서와 같이 단리하였다.
친화성 정제된 항체의 SDS-PAGE는 매우 높은 순도를 보여주었다. 비환원 항FDP 제제 중의 주요 단백질 밴드는 분자량이 약 152 kDa이었으며, 이것은 토끼 IgG의 분자량과 일치한다. 환원시키자, 152 kDa의 단백질 밴드가 사라졌으며, 동시에 약 59 kDa 및 30 kDa의 2개의 단백질 밴드가 나타났고, 이것은 각각 IgG 분자의 중쇄 및 경쇄의 분자량과 유사하다. 따라서, 항FDP 항체는 IgM(분자량 약 900 kDa)도 IgA(약 320 kDa의 이량체)도 아니고 주로 IgG였다. 친화성 정제 FDP 항체 풀의 순도는, SDS-PAGE 분석에 기초할 때, 정성적으로 약 90%로 추정되었다.
FDP 항원에 대한 항FDP 항체의 결합은 전형적인 랭뮈어 흡착 등온선에 부합하였다. 이 데이터로부터, 이중 역수 플롯을 이용할 때, 항체의 결합 상수는 1.25×10-9 M로 계산되었다. 항체 제제가 다클론 기원이었기 때문에, 이 연구에서 얻은 결합 상수는 복합 결합 상수, 즉 상이한 클론에 의해 생성된 항체가 기여하는 결합 상수의 평균이었다.
포착 항체 및 검출 항체는 임의의 ELISA에 기초한 테스트의 특이성을 담보한다. FDP 항체 풀이 인간 혈청 샘플 중의 FDP를 포착하는지를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯(도 3) 및 면역 침전(IP) 실험(도 4 및 5와 표 2) 둘 다에서 FDP 항체 풀을 인간 혈청 샘플과 교차 반응시켰다. 또한, FDP 항체 풀에 의해 면역침전된 단백질을 시퀀싱하고 질량 분광분석법을 이용하여 확인하였다.
인간 혈청 중의 FDP 항원의 수 및 추정 분자량을 측정하기 위해, 대장암(CRC) 환자와 및 정상 대조군 피험체 둘 다로부터 얻은 인간 혈청 샘플의 웨스턴 블롯 분석을 이용하였다. 도 3A 및 3B는 각각 5초 및 30초 동안 필름에 노출시킨 동일한 겔의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 3C는 상응하는 쿠마시 염색 겔을 도시한다. 도 3에서, CRC 혈청 샘플 중 6개의 주요 FDP 항원이 검출되었고, 추정 분자량은 340 kDa, 260∼320 kDa, 220 kDa, 150 kDa, 80 kDa 및 50 kDa이었다. 이들 밴드는 각각 비분해 피브리노겐, 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP), 단편 D 이량체/단편 X, 단편 Y, 단편 D 및 단편 E에 해당한다. 대조적으로, 정상 대조군 혈청에서는 약 220 kDa에서 단 1개의 주요 밴드가 검출되었다. 테스트된 모든 혈청 샘플에 있어서, 정상 대조군의 혈청 샘플보다 CRC 환자의 혈청 샘플에서 반응 강도가 훨씬 더 컸다.
표 1에서 입증된 바와 같이, 이들 FDP 성분 6종 모두의 평균 신호 밀도는 5명의 정상 대조군 피험자의 혈청 샘플보다 5명의 CRC 환자의 혈청 샘플에서 유의적으로 더 높았다(p 값 ≤ 0.00000005). 웨스턴 블롯(도 3A)에서의 교차 반응성 수준의 밀도측정에 기초한 분석은 Scion Image 밀도측정 소프트웨어(Scion Corporation)를 이용하였다. 표 1은 항FDP 풀이 그 각각의 FDP 수치에 기초하여 암 혈청 샘플과 정상 혈청 샘플을 구별할 수 있음을 확인해 준다.
인간 혈청 샘플로부터 포착된 FDP 항원의 수와 크기를 확인하기 위해, 세파로스 비드에 결합된 토끼 항FDP IgG 또는 대조군 토끼 IgG를 사용하여 면역 침전 연구를 수행하였다(도 4 및 5). 면역 침전은 또한 FDP 항원을 쿠마시 염색 SDS-PAGE로부터 시퀀싱할 수 있도록 농축시켰다.
제조업자의 설명서에 따라 Affi-Gel® Hz 면역친화성 키트(BIO-RAD)를 사용하여, 토끼 항FDP IgG 또는 대조군 토끼 IgG 항체를 IgG 중쇄 상의 Fc 부분의 보존된 탄화수소 잔기를 통해 세파로스 비드에 공유 결합시켰다. 인간 혈청 샘플을 무작위로 선택하여 PBS(pH 7.4)에 1 대 10으로 희석하였다. 희석된 혈청 샘플을 항FDP 결합 비드 또는 대조군 토끼 IgG 결합 비드와 함께 인큐베이트하였다. 또한, 두 타입의 비드를, IP 반응을 위한 양성 대조군으로서 이용하기 위해, 제조된 FDP의 0.25 mg/ml 용액과 함께 인큐베이트하였다. 희석된 혈청과 대조군 토끼 IgG 결합 비드 사이의 IP 반응은 비특이적 토끼 IgG와 혈청 항원 사이의 잘못된 양성 반응을 인지하기 위한 대조군으로서의 역할을 한다. IP 반응물을 엔드 오버 엔드 로테이터(end-over-end rotator)에서 4℃로 밤새 인큐베이트하였다. IP 비드를 PBS로 5회 세척하고, 비환원 Laemmli 샘플 완충액 중에서 95℃로 8분 동안 항원을 추출하였다. 그 후, 항FDP 및 대조군 토끼 IgG 비드로부터 추출된 항원을 4∼20% SDS-PAGE에서 러닝하였다. 도 4는 2개의 대표 혈청 샘플에 대한 완전한 실험 조건 세트를 보여주며, N4는 정상 피험자 4로부터의 것이고, C15는 대장암 환자 15로부터의 것이다. 도 5A 및 5B는, IP 분석을 통해 5명의 추가의 정상 피험자와 5명의 추가의 대장암 환자를 보여줌으로써, 이들 IP 반응이 재현성이 있음을 보여준다.
도 4에 제시된 IP 실험의 결과는, 4개의 주요 FDP 특이적 항원과 1개의 비특이적 항원이 항FDP 비드(+)에 의해 대장암 환자의 혈청으로부터 포착되었음을 보여준다. 이 샘플(C15(+), 오른쪽으로부터 2번째 레인에서 마지막 레인까지)로부터, 4개의 주요 FDP 특이적 항원의 추정 분자량(MW)은 감소하는 순서로 각각 340 kDa, 300 kDa, 220 kDa 및 50 kDa이다. 이 레인의 1개의 비특이적 항원은 약 25 kDa이다. 혈청 샘플에 대한 대조군 레인 N4(-) 및 C15(-)(오른쪽으로부터 3번째 및 5번째 레인)는 또한 25 kDa 단백질과의 반응을 나타내는데, 이것은, N4(+) 및 C15(+)(오른쪽으로부터 2번째 및 4번째 레인)에서 나타난 바와 같이, 항FDP 비드(+)에 노출된 N4 및 C15 샘플 중의 25 kDa 단백질에 상응한다. 이들 레인 N4(-), N4(+), C15(-), C15(+) 모두에서의 25 kDa 단백질의 존재는, 혈청 샘플의 IP 반응으로부터 추출된 25 kDa 단백질이 임의의 IgG 결합 비드와 비특이적으로 상호작용한다는 것을 확인해 준다. IP 분석을 위한 양성 대조군 반응을 FDP(-) 및 FDP(+)로 표시한다(왼쪽으로부터 6번째 및 7번째 레인). 비드 대조군 레인(FDP(-))은 혈청 베이스가 아닌 FDP 캘리브레이터 용액과 음성 대조군 비드 사이의 상호작용이 없음을 나타낸다. FDP(+) 반응은 1개의 부밴드와 3개의 주밴드를 포함한다. 1개의 부밴드의 추정 MW는 340 kDa이며, 이것은 비분해 피브리노겐의 MW와 상응한다. FDP 대조군 면역원 용액 중의 3개의 주요 FDP 특이적 항원의 추정 분자량은 220 kDa(피브리노겐 단편 X 또는 D 이량체의 MW와 일치함), 80 kDa(피브리노겐 단편 D 단량체의 MW와 일치함) 및 50 kDa(피브리노겐 단편 E 단량체와 일치함)이다. 항FDP 비드는 대장암 환자의 인간 혈청으로부터 4개의 주요 FDP 항원을 포착한 반면, 동일한 비드가 정상 혈청 중에서는 약 53 kDa에 1개의 부밴드(흐린 밴드)를 형성시켰다. 인간 혈청 샘플(및 FDP)과 항FDP 비드와의 IP 반응과 대조군 비드와의 IP 반응을 비교한 것은 항FDP 항체 풀의 특이성을 확인해 준다.
도 5는 FDP 항원의 패턴이 복수의 환자 혈청 사이에서 재현성이 있음을 보여준다. 이 실험을 위해, 추가의 5명의 CRC 환자와 5명의 정상 피험자의 혈청(임상 시험 샘플로부터 무작위로 선택)을, 대조군 토끼 IgG와 항FDP 비드를 둘 다 사용하여, 면역침전 반응으로 개별적으로 테스트하였다. 또한, FDP 면역원(캘리브레이터 용액)을 두 타입의 비드를 사용하여 테스트하였다. 도 5A의 SDS-PAGE는 FDP(양성 대조군), CRC 환자 혈청 샘플 및 정상 혈청 샘플로부터 추출된 FDP 특이적 항원을 포함한다. 도 5B에 도시된 SDS-PAGE는, 항원이 도 5A에서와 동일한 순서로 동일한 샘플로부터의 대조군 토끼 IgG 비드에 부착함을 보여준다.
도 5에 도시된 실험은, 인간 혈청 중에 4개의 주요 FDP 특이적 항원이 존재하고 25 kDa에 비특이적 항원이 1개 존재함을 확인해 준다. 도 5A에서, 제어된 조건 하에서의 피브린 및 피브리노겐의 시험관내 플라스민 분해로부터 유래된 FDP 대조군 레인은 1개의 주밴드와 1개의 부밴드를 포함한다. 이들 비환원 샘플의 개략적인 분자량에 기초할 때, FDP 대조군 샘플로부터 FDP 항체 풀에 의해 포착된 주밴드는 분자량 기준으로 감소하는 순서로 피브리노겐 단편 D 이량체, 단편 D 단량체 및 단편 E 단량체에 해당한다. 340 kDa에서의 부밴드는, 역시 그 개략적인 분자량에 기초할 때, 아마도 비분해 피브리노겐이다. 인간 혈청으로부터의 FDP 특이적 항원은 약 340 kDa, 300 kDa(280∼320 kDa), 210 kDa 및 50 kDa에 있다. 이들 밴드는 각각 비분해 피브리노겐, 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP), 단편 D 이량체/단편 X 및 단편 E에 해당한다. 이 IP 실험(및 다른 IP 실험 모두)에 있어서의 IP 반응은, 동일한 농도의 각각의 혈청 샘플을 IP 반응에 첨가함으로써 표준화하였다. 도 5B에서, 주항원은 약 25 kDa에 있다. 앞서 설명한 바와 같이, 이것은 25 kDa에서의 혈청 단백질이 모든 토끼 IgG 결합 비드와 비특이적으로 반응한다는 것을 나타낸다. 25 kDa 단백질은 또한 명백히 도 5A에 도시된 토끼 항FDP IgG 결합 비드 반응과 비특이적으로 상호작용한다.
도 5에 도시된 실험에서, CRC 환자 혈청으로부터의 FDP 특이적 항원은, 표 2에 제시된 밀도측정 판독에 기초할 때, 정상 피험자 혈청의 것보다 6.6∼9.8배 더 풍부하였다. 그러나, 비특이적 항원(약 25 kDa)은 비암에 대한 암의 비가 0.9 또는 약 1이었다. 표 2에서 입증된 바와 같이, FDP 특이적 항원 모두의 평균 신호 밀도는 5명의 정상 대조군 피험자의 혈청 샘플보다 5명의 대장암 환자의 혈청 샘플에서 유의적으로(p 값 ≤ 0.000035) 더 높았다. 암 환자의 혈청으로부터의 비특이적 항원 밴드는 정상 대조군의 것과는 유의성 없이(p = 0.53) 차이를 보였다. 표 2는 항FDP 항체 풀이 그 각각의 FDP 수치에 기초하여 암 혈청 샘플과 정상 혈청 샘플을 서로 구별할 수 있음을 확인해 준다.
실시예 8
항FDP 포착 항체의 특징 분석
포착 항체 풀을 제조하여, 실시예 2 및 7에 기재된 바와 같은 일 실시형태로 특징 분석하였다.
실시예 9
검출을 위한 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 FDP 항체
분석에서의 검출을 위해 검출 항체를 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)를 사용하여 효소 표지하였다. 더 구체적으로, 이 실시예에서, 검출 항체는 실시예 2의 방법에 따라 제조된 다클론 토끼 항인간 FDP 항체였다. 이 항체는 특이성이 매우 높은 효소 활성을 갖는 호스래디쉬 퍼옥시다제와 접합된 토끼 항혈청의 정제된 면역글로불린 분획이다.
검출 항체 면역원은 피브린과 피브리노겐 분해 생성물을 둘 다 포함하였다. 이 항체는 네이티브(native) 인간 피브리노겐뿐만 아니라 FDP 단편 아형: D, E, X/D 이량체, 및 Y와도 반응한다. 혼재된 미량의 항체는 인간 혈장 단백질을 이용한 고상 흡수에 의해 제거하였다. 항체의 특이성은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 검출 항체는, 포착 항체에 의해 검출되는 바와 같이, 암 환자의 인간 혈청 중의 동일한 6개 FDP 단편과의 교차 반응성을 확인해 주었다.
실시예 10
FDP에 대한 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA)
FDP ELISA는 효소 표지 샌드위치 면역분석이다. 포착 항체(다클론, 토끼 항FDP)는 실시예 2, 7 및 8에 기재된 바와 같이 토끼 혈청으로부터 얻었다.
예시적인 실시형태에서, FDP 면역분석은 96웰 미량적정 플레이트 포맷으로 제거 가능한 스트립을 사용하는 것을 포함한다. 미량적정 플레이트의 웰을 친화성 정제 토끼 항FDP 항체로 코팅하였다. 인간 혈청 샘플을 희석하여(1:200), 웰에 첨가하였다. 미량적정 플레이트의 웰에 고정화된 항FDP 항체에 의해 혈청 샘플로부터 FDP를 포착하였다. 세척 단계 후, HRP에 접합된 항FDP 항체(검출 항체)를 웰에 첨가하였다. 항FDP-HRP 복합체는 포착된 FDP에 결합하여 고정화된 항FDP 항체와 면역학적 샌드위치를 형성한다. 2차 세척 단계 후, 효소 기질 TMB를 웰에 첨가하였다. 반응을 0.1 N HCl로 중지시킨 후, 마이크로플레이트 판독기로 450 nm에서 종점을 판독하였다. 형성된 색의 강도는 혈청 중의 FDP의 양에 비례한다. 그 양을 정제된 FDP 캘리브레이터를 이용하여 표준 곡선으로부터 내삽법에 의해 정량하였다.
실시예 11
건강한 정상 개체로부터의 혈청과 양성 질환을 가진 환자로부터의 혈청 중의 FDP 분포
건강한 정상 코호트 내의 FDP 값의 개략적인 분포를 측정하기 위해, 채취한 날 스스로 병이 없다고 생각한 여성 209명과 남성 212명의 샘플을 이용하였다. 피험자를 연령과 성별로 2개의 연령 그룹(40∼64세 및 65세 이상)으로 나누었다. 분석값은 이중으로(in duplicate) 측정하였다. 누적 분포를 확립하였다. 5번째 백분위수마다의 순서 통계량을 측정하였다.
양성 질환을 가진 피험자로부터의 다양한 샘플을 모아, 암이 확정된 환자에게 동시에 존재할 수 있는 양성 질환에서의 혈청 FDP 값의 분포를 측정하였다. 미국 전역의 지리적으로 다양한 지역으로부터 적절한 사전 동의를 얻고 IRB 승인 프로토콜에 따라 검체를 수집하였다. 하기 표 3에 샘플의 수 및 양성 질환 그룹의 구성을 기재하였다. 74개의 정상 샘플을 포함하여 이 코호트에서 총 400명의 환자를 테스트하였다.
표 4는 조사된 양성 그룹 각각의 특성과 정상 개체의 특성을 보여준다. 정상 코호트를 제외하고 모든 그룹 내에 유의적인 산포가 존재한다. 평균값은 높은 값의 FDP를 갖는 샘플에 의해 비대칭을 보이는 경향이 있다. 그러나, 이들 그룹 각각의 중간값은 충분히 겉보기에는 건강한 개체에 대한 참고치 내에 있다. 이 시험에서의 다른 모든 연구에서와 마찬가지로, FDP 값은 이중으로 측정하였고, 모든 피험자는 IRP 승인 프로토콜에 따라 동의하였다.
분석은, 이들 양성 질환 코호트의 중간값이 건강한 정상 피험자의 중간값과 같은 크기임을 보여준다. 췌장의 상태를 제외하고 모든 양성 상태가 건강한 정상 코호트와 유사한 분포와 95% 신뢰 한계를 갖는다.
실시예 12
악성 질환을 가진 피험자의 혈청 중의 FDP 분포
이 연구는 원발성 악성종양을 갖는 것으로 진단되어 치료 중인 439명의 환자를 대상으로 수행되었다. 피험자를 5개 그룹, 즉 폐암/간암, 유방암/난소암/자궁경부암, 담낭암/담도암/췌장암, 위암 및 대장암으로 분류하였다. FDP 분석은 샘플에 대해 이중으로 수행하였다. 사후 타만 검정(post hoc Tamhane test)을 이용하여 일원 ANOVA를 수행하였다. 결과는 그룹 간에 유의적인 차이가 없음을 나타낸다. 각 암 그룹에 대한 상세 사항은 표 5에 기재하였다.
실시예 13
각각의 질환 코호트 내에서의 FDP 값 퍼센트의 분포
각각의 정상 코호트, 양성 질환 코호트 및 악성 질환 코호트에서, 각각의 질환 코호트 내에서의 상이한 FDP 농도 수치에 대해 FDP 값을 분석하였다. 통계자료에 대한 정확도 95%의 신뢰 구간을 확립하기 위해 이 분석에서 StatXact® 소프트웨어를 이용하였다. 분포표는 하기 표 6에 제시하였다.
실시예 14
대장암으로 진단된 환자의 연속적(종단적) 모니터링
연구의 이 부분을 위한 샘플을 2개의 후향적 샘플 은행으로부터 입수하였다. 48개의 연속 세트를 미국 플로리다주의 베로 비치에 위치하는 게펜 암 센터(Geffen Cancer Center)로부터 입수하였고, 64개의 연속 세트를 미국 텍사스주 휴스턴에 위치하는 MD 앤더슨 암 센터(MD Anderson Cancer Center)의 혈청 은행으로부터 입수하였다.
총 445개의 평가 가능한 관찰 중에, 평가 가능한 환자의 연속 세트는 112개였다. 연속 모니터링 연구의 샘플은, 수집 시점에 은행 내의 대장암 진단을 받은 모든 환자를 포함시키기 위해 맹검으로 편견없이 수집한 후향적 은행 샘플이었다. 환자당 평균 관찰 횟수는 4.0이었다.
요약하면, 총 445쌍의 관찰이 가능하도록 112명의 대장암 환자로부터 연속 샘플을 채취하여, FDP를 판독하고 병 진행을 판정하였다. 순차적 채취는 평균 9개월 이상의 종단적 기간을 커버하였다. 연속 모니터링 세트에서의 FDP 값의 진행은 현재의 판독값과 이전의 판독값 사이의 변화율(Y)로서 평가되었으며, FDP 분석에서 병 진행을 특정하기 위한 최소 변화율은 15%인 것으로 결정되었다. 병상 진행(clinical disease progression)(D)은 모니터링 기간 동안 진료 표준이었던 병원내 절차 및 임상 검사실 기초 분석에 기초하여 주치의가 결정하였다. 이 분석의 주요 목적은, FDP 분석이, 민감도 및 특이도의 합이 1을 초과하는지를 보여줌으로써 정보력이 있음을 입증하는 것이다.
치료에 대한 반응은 임상 검사 결과 및 영상화 결과(즉, 뼈 스캔, CT 스캔, 자기 공명 영상법, 방사선 사진법, 초음파)에 기초한 임상의의 기록에서 제공되는 정보를 이용하여 평가하였다. 치료에 대한 반응은 다음과 같이 정의된다:
완전 반응 또는 질환 증거 없음(CR 또는 NED): 임상 검사 및 영상 검사 또는 의사가 지시한 다른 진단법에 의해 증명되는 바와 같이 모든 병상 및 영상 측정이 가능한 질환의 완전한 소멸.
부분 반응(PR): 최초 채취 시에 전이가 있었던 환자에 있어서, 뼈 스캔에서 관찰되는 바와 같이, 적어도 안정화를 입증하는 원발성 전이성 병변 또는 골 전이의 크기의 현저한 축소.
안정한 질환(PD): 임상 검사 및 영상 검사 또는 의사가 지시한 다른 진단법에 의해 증명되는 바와 같이 원발성 병변 크기에 현저한 변화가 없거나 원발성 병변 크기의 현저한 증가가 없거나 새로운 병변이 생기지 않음.
진행성 질환(PD): 임상 검사 또는 영상 검사 결과가 이전의 검사에서 관찰되지 않았던 병변의 존재, 또는 원발성 또는 전이성 병변의 크기가 현저히 증가하였음을 확실히 보여줌.
446쌍의 관찰이 가능하도록 112명의 대장암 환자로부터 연속 샘플을 채취하여 FDP 분석값을 판독하고 병 진행을 판정하였다. 몇 명의 환자는 1차 검사 시에도 진행의 징후를 보였기 때문에, 이후 내원할 때마다 FDP 분석값과 진행 사이의 관계를 확인하도록 결정하였다. 따라서, 이 데이터로부터, 이후의 FDP 분석 판독값과 이전의 판독값의 비를 구함으로써 변수를 도출하였다. 이 척도는, 진행에 대한 정보를 제공하는 수단으로서 이전의 판독값으로부터의 증가를 확인하기 위한 것이었다. 진행의 증거를 확인하기 위한 의미있는 증가는 15% 이상이라고 판단하였다. 따라서, 상기 비가 1.15 이상일 경우, FDP 분석값은 양성인 것으로 간주하였고, 그렇지 않으면, 음성인 것으로 간주하였으며, 이러한 판정을 내원 시의 진행 여부 결과와 쌍으로 만들었다.
베이스라인 샘플링 이후의 샘플링으로부터 행한 335쌍의 관찰을 2원, 내원당(per-visit) 및 환자당(per-patient) 평가로 평가하였다. 초기 분석은, 1회 내원 시 각각의 샘플에 대해 무작위로 샘플링하고 그 내원에 대한 민감도 또는 특이도를 기록함으로써, 각각의 환자에 대한 부트스트랩(bootstrap)을 수행하였다. 진행이 되었고, 이전 내원 시로부터 FDP 분석값이 15% 이상 증가하였다면, 민감도는 1이고, 그렇지 않다면 민감도는 0이다. 해당 내원 시 진행이 관찰되지 않았다면, 해당 내원 시 민감도는 기록되지 않았으나, FDP 분석값이 해당 내원 시 15% 증가에 못미쳤다면 1로 기록되고, 그렇지 않다면 0으로 기록되었다. 내원당 분석에 있어서, 민감도를 위해서는 135회의 내원, 특이도를 위해서는 198회의 내원이 이용되었다.
특정 환자의 모든 내원에 대한 진행 횟수를, 진행이 관찰되었던 내원 횟수 중에서 FDP 분석값이 15% 이상 증가하는 내원 횟수를 선택함으로써, 환자의 민감도를 산출하는 데 이용하는 환자 개개인을 기초로 한 2차 분석을 수행하였다. 유사하게, FDP 분석값이 진행이 없었던 내원 횟수로 나누었을 때 15% 증가보다 낮은 값을 갖는 내원 횟수는 환자 개개인의 특이도의 산출을 가능하게 하였다. 환자가 매번 진행을 보였다면, 그 환자에 대해 특이성이 없는 것이고, 환자가 매번 진행을 보이지 않았다면, 그 환자에 대해 민감성이 없는 것이다. 그 결과, 112명의 환자의 샘플이 하나 이상의 민감도, 특이도 또는 둘 다를 보였다. 이로써, 70개의 환자 개개인의 민감도의 추정값과 86개의 환자 개개인의 특이도의 추정값을 얻었다.
또한, 환자당 및 내원당 기준으로 양성 예측값(positive predictive value) 및 음성 예측값(negative predictive value)을 산출하였다. FDP 분석값이 15% 이상 증가하였을 때 존재하는 진행 횟수를 나누어 PPV를 계산하고, FDP 분석값이 15% 이상 증가하지 않았을 때 부재하는 진행 횟수를 나누어 NPV를 계산한다.
평가에 이용될 수 있는 샘플이 적고 복잡한 구조를 가질 경우, 관련 집단 특성의 타당한 추정치를 제공하기 위해 부트스트랩이라 불리는 통계적 방법을 이용할 수 있다. 그러한 산출을 가능하게 하는 방법은 333개의 관찰로부터 반복하여 무작위 샘플을 복원 추출하고, 민감도와 특이도의 합을 산출한 후, 얻어진 샘플의 빈도 분포를 통해 통계 검정의 알파 수준에 해당하는 백분위수를 배제하는 합을 결정하는 것이다. 그러한 샘플은 임의의 환자 내 상관관계를 자동적으로 도입하여 상기 귀무 가설의 불편 검정을 생성한다. 부트스트랩 추출은 얻어진 분포가 시행 간에 확실히 일관성을 나타내도록 하기 위해 통상적으로 여러 차례 반복된다.
112명의 환자 개개인에 대해 1회 내원을 무작위로 복원 추출함으로써 2,000회 내원당 부트스트랩 샘플 추출을 행하였다. 각 샘플에 대해, 모든 환자에 대한 민감도 또는 특이도(1 또는 0의 값)를 합하여 존재하는 민감도 또는 특이도 측정값의 총수로 나눔으로써, 평균 민감도, 평균 특이도 및 합을 산출하였다. 샘플에 대한 평균 민감도 또는 특이도를 구한 후, 이 2개를 서로 더하여 합계를 얻었다. 이 실행에 의해 내원당 민감도, 특이도 및 이 2개의 합의 2,000개 부트스트랩 추정치를 구하였다. 변수에 의한 이들 2,000개 값의 빈도 디스플레이는 하한 단측 및 양측 95% 신뢰 한계의 부트스트랩 추정 등을 가능하게 한다.
샘플추출 방법은, 환자당 k(1∼7) 내원수 각각에 1∼k의 수를 할당함으로써 행하였다. 0과 1 사이의 균등 난수를 발생시켜 그 수에 k를 곱하고 그 수의 정수를 취하여 1을 더함으로써 112개의 관찰의 샘플을 얻었다. 이 과정은 각 환자에게 1∼k의 난수를 제공하였다. 얻어진 수를 갖는 환자 내원에 대해, 이전 분석으로부터 변화된 FDP 분석비를 포착하였다. 샘플추출을 복원 추출로 행하였기 때문에 이중 검사가 가능하였고, 이 과정은 112회 반복하였다. 112개의 각각의 샘플에 대해 민감도, 특이성 및 그 합을 산출하여 보유하였다.
333개의 내원당 평가로부터 산출된 내원당 민감도는 100×88/134=65.19였고, 특이도는 100×133/199=67.34였으며, 민감도와 특이도의 합은 132.53이었고, PPV는 100×88/153=57.52였으며, NPV는 100×134/181=74.03이었다.
대장암 환자의 병 진행에 대한 정보를 제공하는 FDP 면역분석의 유효성을 확인하기 위한 통계적 분석의 결과는 하기 표 7에 기재하였다.
검정을 알파 = 0.05로 행하든지, 알파 = 0.025로 행하든지 간에, 이 분석으로부터의 민감도와 특이도의 합은 명백히 통계적으로 유의적으로 100 이상이다. 중간 합은 약 133으로서, 중간 민감도가 약 65, 중간 특이도가 약 67로 추정된다. 그 합에 대한 하한 단측 5% 신뢰 한계는 약 120이고, 하한 단측 2.5% 신뢰 한계는 약 118이다. 5개 샘플에 대해 중간 PPV 및 NPV는 각각 약 59 및 73이다. 이들 값이 상기 표 7에 기재된 내원당 값으로부터 산출한 것과 일치한다는 점에 주목해야 한다. 2,000개 샘플에 대한 5회 반복 시행은 결과가 견실성이 있고 일관성이 있음을 입증한다.
환자당 분석에 있어서, 112회의 환자당 평가로부터 산출된 내원당 민감도는 100×45.68/69=66.21이었고, 특이도는 100×58.63/86=68.18이었으며, 민감도와 특이도의 합은 134.39였고, PPV는 100×51.83/97=53.44였고, NPV는 100×71.67/103=69.58이었다.
검정을 알파 = 0.05로 행하든지, 알파 = 0.025로 행하든지 간에, 이 분석으로부터의 민감도와 특이도의 합은 명백히 통계적으로 유의적으로 100 이상이다. 중간 합은 약 134로서, 중간 민감도가 약 65, 중간 특이도가 약 68로 추정된다. 그 합에 대한 하한 단측 5% 신뢰 한계는 약 124이고, 하한 단측 2.5% 신뢰 한계는 약 121이다. 5개 샘플에 대해 중간 PPV 및 NPV는 각각 약 53 및 69이다. 이들 값이 상기 표 8에 기재된 환자당 값으로부터 산출한 것과 일치한다는 점에 주목해야 한다. 2,000개 샘플에 대한 5회 반복 시행은 결과가 견실성이 있고 일관성이 있음을 입증한다.
대장암 샘플을 모니터링하기 위한 FDP 면역분석의 유효성 분석으로부터 얻은 결론은 다음과 같다. 이들 데이터 및 분석은, 이전 내원으로부터의 변화가 15% 이상인 것으로 간주될 경우, FDP 분석이 대장암 진행에 대해 정보성 좋은 데이터를 제공한다는 것을 입증한다. FDP 면역분석 결과는 대장암 환자의 모니터링을 위한 진료 절차 표준과 함께 이용되어야 한다.
달리 나타내지 않는다면, 명세서 및 특허청구범위에서 사용된, 성분의 양, 분자량과 같은 특성, 반응 조건 등을 표현하는 모든 수치는, 모든 경우에 있어서, "약"이라는 용어로 수식된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 적절치 않음을 명시하지 않는다면, 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 개시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근삿값이다. 적어도, 특허청구범위에 대한 균등론의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는, 적어도, 기록된 유효 자릿수를 고려하고 통상의 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 개시하는 수치 범위 및 파라미터는 근삿값이지만, 특정 예에 개시된 수치 값은 가능한 한 정확히 기록된 것이다. 그러나 임의의 수치 값에는 그 개개의 테스트 측정에서 발생하는 표준 편차에 기인하는 약간의 오차가 수반되기 마련이다.
본 발명을 기술하는 문맥에서(특히 하기 특허청구범위의 문맥에서) 사용된 단수 형태의 지시사 및 유사한 지시사는 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되는 것이 아니라면 단수 형태와 복수 형태를 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 인용한 것은, 단지 그 범위에 속하는 개개의 값을 개별적으로 인용하기 위한 간편한 방법으로서 이용된 것이다. 본원에서 달리 나타내지 않는다면, 각각의 개별 값은 이 값이 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 기재된 모든 방법들은 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되는 것이 아니라면 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제시된 임의의 모든 예, 또는 예시적인 용어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것으로서 다르게 청구된 본 발명의 범위에 제한을 부과하려는 것은 아니다. 명세서 내의 어떠한 표현도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비청구된 요소를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 개시된 본 발명의 택일적인 요소 또는 실시형태의 그룹핑은 한정으로서 해석되어서는 안된다. 각 그룹의 구성원은 개별적으로 또는 본원에 개시된 그 그룹의 다른 구성원 또는 다른 요소와의 임의의 조합으로 인용되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의상 및/또는 특허성을 위해 그룹에 포함될 수도 있고 그룹으로부터 삭제될 수 있을 것으로 생각한다. 임의의 이같은 포함 또는 삭제가 발생할 경우, 본원 명세서는 변형된 그 그룹을 포함함으로써 첨부된 특허청구범위에서 사용된 모든 마커쉬 그룹의 기재 사항을 충족시킨다고 생각한다.
본 발명자들이 알고 있는 본 발명의 실시를 위한 최선의 방식을 비롯하여 본 발명의 특정 실시형태를 본원에 기술하였다. 물론, 당업자라면 전술한 설명으로부터 이러한 특정 실시형태에 대한 변경예를 알 수 있을 것이다. 본 발명자들은 당업자가 필요에 따라 그러한 변경예를 이용할 것으로 기대하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과 달리 실시될 수도 있다고 생각한다. 따라서, 본 발명은 적용법이 허용하는 한 본원에 첨부된 특허청구범위에서 인용된 주제의 모든 변형예 및 균등예를 포함한다. 또한, 가능한 모든 변경예에 있어서의 전술한 요소들의 임의의 조합은, 본원에서 달리 나타내거나 문맥상 명백히 모순되는 것이 아니라면, 본 발명에 포함된다.
본원에 개시된 특정 실시형태는 특허청구범위에서 "∼으로 구성되는" 또는 "∼으로 필수적으로 구성되는"이라는 표현을 사용하여 추가로 한정될 수 있다. "∼으로 구성되는"이라는 연결 어구는, 출원 시에 존재하였든지 보정에 의해 추가되었든지 간에 특허청구범위에서 사용될 경우, 특허청구범위에 명시되지 않은 임의의 구성요소, 단계 또는 성분을 배제한다. "∼으로 필수적으로 구성되는"이라는 연결 어구는, 특허청구범위를, 명시된 재료 또는 단계와 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 한정한다. 그렇게 청구된 본 발명의 실시형태는 본원에 본질적으로 또는 명백히 기재된 것이며 실시 가능한 것이다.
또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 다수의 특허 및 간행물이 인용되었다. 앞서 인용된 참고 문헌 및 간행물은 각각 그 전체가 참고 문헌으로서 본원에 개별적으로 포함된다.
마지막으로, 본원에 개시된 본 발명의 실시형태들은 본 발명의 원리를 예시하는 것으로서 이해되어야 한다. 이용될 수 있는 다른 변형예도 본 발명의 범위에 속한다. 그러므로, 비한정적인 예를 들면, 본 발명의 택일적인 구성이 본원의 교시에 따라 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 제시 및 기술된 바로 그것에만 한정되지 않는다.
Claims (15)
- 피험체로부터 생물학적 샘플을 얻는 단계;
상기 생물학적 샘플을 피브린 및 피브리노겐 분해 생성물(FDP)과 관련된 적어도 3종의 항원에 결합하는 항체 제제와 반응시켜 항체-FDP 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 3종의 FDP 관련 항원은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체인 단계;
상기 항체-FDP 복합체를 검출하는 단계; 및
상기 피험체에서 암을 진단하는 단계
를 포함하는, 피험체에서 암을 검출하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 항체 제제가 추가로 경우에 따라 단편 Y 및 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP) 중 하나 이상에 결합하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항체 제제가 다클론 항체 제제인 방법.
- 제1항에 있어서, 효소 결합 면역흡착 분석을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 진단 단계가 하나 이상의 추가의 진단 테스트를 더 포함하는 것인 방법.
- (a) 피험체로부터 제1 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 상기 제1 샘플을 제1 샘플링 시점에 수집하는 것인 단계;
(b) 상기 피험체로부터 제2 생물학적 샘플을 얻는 단계로서, 상기 제2 샘플을 제1 샘플링 시점 후 제2 샘플링 시점에 수집하는 것인 단계;
(c) 상기 생물학적 샘플을 FDP와 관련된 적어도 3종의 항원에 결합하는 항체 제제와 반응시켜 항체-FDP 복합체를 형성하는 단계로서, 상기 3종의 FDP 관련 항원은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체인 단계;
(d) 상기 항체-FDP 복합체를 검출하는 단계; 및
(e) 상기 제1 생물학적 샘플 중 FDP 수치에 대한 상기 제2 생물학적 샘플 중 FDP 수치의 비를 결정하는 단계;
(f) 암이 진행되었는지를 판정하는 단계
를 포함하고, 경우에 따라, 상기 제1 및 제2 시점 후의 시점에 채취한 추가의 생물학적 샘플로 단계 (a)∼(e)를 반복하는 단계
를 포함하는, 환자의 암을 모니터링하는 방법. - 제6항에 있어서, 상기 항체 제제가 경우에 따라 추가로 단편 Y 및 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP) 중 하나 이상에 결합하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 항체 제제가 다클론 항체 제제인 방법.
- 제6항에 있어서, 반응 및 검출 단계가 효소 결합 면역흡착 분석을 포함하는 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 비가 1.15 이상일 경우, 암이 진행된 것인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 비가 1.15 미만일 경우, 암이 퇴행하였거나 안정한 것인 방법.
- FDP와 관련된 적어도 3종의 항원에 결합하는 항체 제제로서, 상기 3종의 FDP 관련 항원은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체인 항체 제제;
검출 시스템; 및
상기 FDP를 측정하고 상기 FDP의 존재와 암을 서로 관련시키는 것에 관한 설명서
를 포함하는, 피험체에서 암을 검출하기 위한 키트. - 제12항에 있어서, 상기 검출 시스템이 FDP와 관련된 적어도 3종의 항원에 특이적인 검출 항체를 포함하며, 상기 3종의 FDP 관련 항원은 단편 D, 단편 E 및 D 이량체인 키트.
- 제13항에 있어서, 상기 항체 제제가 경우에 따라 추가로 단편 Y 및 초기 플라스민 분해 생성물(IPDP) 중 하나 이상에 결합하는 것인 키트.
- 제12항에 있어서, 상기 항체 및 상기 검출 시스템이 효소 결합 면역흡착 분석을 포함하는 것인 키트.
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