KR20120051733A - 베타 세포 마커 항체 - Google Patents

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KR20120051733A
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antibodies
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케르스틴 얀-호프만
산나 조프만 옌센
후구에스 마틸레
크리스티아노 미그리오리니
하이얀 왕
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에프. 호프만-라 로슈 아게
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Abstract

본 발명은 베타 세포 마커 단백질에 대한 항체, 특히 단백질 TMEM27에 대한 항체에 관한 것이다.

Description

베타 세포 마커 항체{BETA CELL MARKER ANTIBODY}
본 발명은 베타 세포 마커 단백질에 대한 항체, 특히 단백질 TMEM27에 대한 항체에 관한 것이다.
작용성 베타 세포 덩어리의 손실은 1형 및 2형 당뇨병 모두의 병인에 기저를 이룬다. 따라서 생체 내 베타 세포 덩어리의 비 침습적 화상진찰(noninvasive imaging)은 당뇨병으로의 진행 및 치료학적 중재에 대한 반응을 정량분석하는데 귀중한 진단 및 연구 도구를 제공한다. 또한, 생체 내에서 비 침습적 및 표적화된 베타 세포 siRNA 전달은 연구 및 치료 모두에 매우 귀중할 것이다.
막 통과 단백질 Tmem27(콜렉트린(Collectrin))은 췌장 β-세포에서 발현되며 여기에서 췌장 β-세포 덩어리 및 인슐린 분비를 조절한다. Tmem27은 단백질 분해에 의한 절단 및 발산에 의해 혈장 막에서 불활성화된다.
따라서, 베타-세포 덩어리를 정량분석하기 위한 진단 및/또는 연구 도구가 필요하며 베타-세포로 표적화된 약물을 전달하기 위한 도구가 필요하다.
본 발명의 목적은 Tmem27 폴리펩타이드의 에피토프에 대한 항체를 제공하는 것이다.
바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 인간 Tmem27 폴리펩타이드에 대한 것이다.
추가의 실시태양에서, 상기 항체는 단클론 항체, 바람직하게는 인간화된 항체이다.
추가의 실시태양에서, 상기 항체는 적합한 동물을 상기 Tmem27 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 Tmem27 폴리펩타이드를 발현하는 전(whole) 세포로 면역시킴으로써 생산되었다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VH 도메인의 CDR3 및 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VL 도메인의 CDR3을 포함한다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VH 도메인의 CDR1 내지 CDR3 및 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VL 도메인의 CDR1 내지 CDR3을 포함한다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 키메릭 항체이다.
추가의 바람직한 실시태양에서, 상기 항체는 2009년 5월 27일자로 독일 생물 자원 센터(DSMZ)에 기탁되고 기탁 번호 DSM ACC2995를 받은 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9에 의해 생산된다.
두 번째 목적에서, 본 발명은 TMEM27 절단 및 이의 신호전달 경로의 변형을 수반하는 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명 항체의 용도에 관한 것이다. 상기 질병은 바람직하게는 당뇨병이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 항체를 활성 화합물의 세포 내 전달을 위한 도구로서 사용한다. 상기 활성 화합물은 바람직하게는 상기 항체에 공유 결합된다. 상기 "활성 화합물"은 임의의 적합한 분자, 예를 들어 DNA, RNA, siRNA, 단백질, 펩타이드, 또는 약학적으로 활성인 작용제, 예를 들어 독소, 항생제, 병원체 억제제, 항원, 항체, 항체 단편, 면역조절제, 효소, 또는 치료제일 수 있다. 본 발명의 항체는 췌장 베타-세포를 특이적으로 표적화함으로써 활성 화합물의 표적화된 세포 내 전달을 허용하므로 상기 활성 화합물의 세포 내 전달에 적합하다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 항체를 동물, 바람직하게는 인간의 췌장에서의 베타 세포 섬 및 베타-세포 덩어리의 생체 내 화상진찰에 사용할 수 있다. 생체 내 화상진찰에 적합한 방법은 예를 들어 면역-PET(양전자 단층 촬영)이다. 면역-PET는 양전자-방출 방사성 핵종으로 표지된 단클론 항체의 우연한 검출에 근거한다. 하기의 양전자 방사체를 면역-PET에 사용할 수 있다: 갈륨-68 (68Ga; t1 /2, 1.13 시간), 불소-18 (18F; t1 /2, 1.83 시간), 구리-64 (64Cu; t1 /2, 12.7 시간), 이트륨-86 (86Y; t1 /2, 14.7 시간), 브롬-76 (76Br; t1 /2, 16.2 시간), 지르코늄-89 (89Zr; t1/2, 78.4 시간), 및 요오드-124 (124I; t1 /2, 100.3 시간) [The Oncologist, Vol. 12, No. 12, 1379-1389, December 2007)].
환자에 있어서 PET 접합체의 분포를 PET 카메라를 사용하여 소멸 광자 쌍의 검출에 의해 모니터할 수 있다. PET 카메라는 상기 환자의 몸 주위에 놓인 검출기들의 고리로 이루어진다. 2 개의 광자가 매우 짧은 시간 간격(전형적으로는 5 내지 15 나노초) 내에 상기 몸의 양쪽 맞은편 상의 검출기들에 의해 일치되는 경우, 상기 두 검출기 사이의 라인을 따라 있는 어딘가에서 소멸 사건이 발생한 것으로 추정된다. 모든 라인의 교차를 계산함으로써, 방사선 출처(방사성 표지된 mAb)의 위치를 결정할 수 있다.
도 1은 베타-세포 TMEM27 단백질 수준이 당뇨병 진행과 상관 있음을 나타낸다. 7- 또는 9-주령의 야윈 또는 ZDF 래트로부터 췌장의 파라핀-섹션을 인슐린(적색), 글루카곤(청색) 및 TMEM27(녹색)에 대한 항체로 염색하였다. 인슐린 내성이지만 정상 혈당의 7 주된 ZDF 래트의 췌장 섹션에서 TMEM27의 증가된 발현이 존재하며, 이는 베타-세포 덩어리의 확대와 상관 있다.
도 2는 TMEM27 단백질 수준이 2형 당뇨병 환자에게서 감소함을 나타낸다. 정상 혈당 공여자 및 2형 당뇨병 환자로부터의 췌장의 파라핀 섹션에 대한 면역조직화학 염색은 TMEM27(녹색)(글루카곤(적색)과 함께 국소화되지 않는다)이 2형 당뇨병 섬을 크게 감소시킴을 보인다.
도 3은 독시사이클린-의존적인 방식으로 인간 TMEM27의 유도성 발현을 허용하는 INS-1 안정성 세포 주의 웨스턴 블럿을 나타낸다. hTMEM27 단백질은 독시사이클린에 의해 용량 의존적으로 유도될 수 있다.
도 4a 내지 4k는 TMEM27-8/9-알렉사(Alexa)488-IgG 및 TMEM27-8/9-알렉사555-Fab를 살아있는 INS-hTMEM27 세포와 배양한 결과를 나타낸다.
도 5는 FDA-승인된 인간 조직 미세배열의 면역조직화학 염색을 나타낸다. 인간 조직 미세배열의 파라핀 섹션들이 알렉사488-접합된 항-TMEM27(클론 8/9)로 염색되었다.
도 6a 및 6b는 인간 및 원숭이 췌장의 면역조직화학 염색을 나타낸다. 인간 및 원숭이 췌장의 파라핀 섹션들이 알렉사488 접합된 TMEM27(클론 8/9)로 염색되었다.
도 7은 TMEM27 단백질 수준이 2형 당뇨병 원숭이에서 감소됨을 나타낸다. 정상 혈당 또는 2형 당뇨병 원숭이로부터의 췌장의 파라핀 섹션에 대한 면역조직화학 염색은 TMEM27(녹색)(인슐린(적색)과 함께 국소화된다)이 2형 당뇨병 섬을 크게 감소시킴을 보인다.
도 8a 내지 8i는 TMEM27을 인식하는 항체에 특이적인 IgG 매개된 siRNA 세포 흡수를 나타낸다.
도 9a 및 9b는 표면 면역 염색 및 세포 내 축적된 siRNA 마커 Cy5로부터 정량화된 형광을 나타낸다.
"항체"란 용어는 비 제한적으로 전 항체 및 항체 단편을 포함하여 항체 구조물의 다양한 형태를 포함한다. 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간화된 항체, 키메릭 항체, 또는 본 발명에 따른 특징적인 성질들이 유지되는 한 추가의 유전 공학 항체이다.
"항체 단편"은 완전 길이 항체의 일부, 바람직하게는 이의 가변 도메인, 또는 적어도 이의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예로는 다이아바디, 단 쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이성 항체가 있다. scFv 항체는 예를 들어 문헌[Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96]에 개시되어 있다. 또한, 항체 단편은 VH 도메인의 특성을 갖는, 즉 VL 도메인과 함께 조립될 수 있는, 또는 ANG-2에 결합하는 VL 도메인의 특성을 갖는, 즉 VH 도메인과 함께 조립되어 작용성 항원 결합 부위에 결합하고 이에 의해 상기 성질을 제공할 수 있는 단일 쇄 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "단클론 항체" 또는 "단클론 항체 조성물"이란 용어는 단일 아미노산 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다.
"키메릭 항체"란 용어는 대개는 재조합 DNA 기법에 의해 제조되는, 하나의 출처 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉 결합 영역 및 상이한 출처 또는 종으로부터 유래된 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 지칭한다. 쥐 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메릭 항체가 바람직하다. 본 발명에 의해 포함되는 "키메릭 항체"의 다른 바람직한 형태는 상기 불변 영역이 원래 항체의 영역으로부터 변형되거나 변화되어, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질들을 생성시키는 것들이다. 상기와 같은 키메릭 항체를 또한 "부류 전환(class-switched) 항체"라 칭한다. 키메릭 항체는 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 DNA 절편 및 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 DNA 절편을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메릭 항체의 생산 방법은 통상적인 재조합 DNA를 수반하며 유전자 형질감염 기법이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 문헌[Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; 미국 특허 제 5,202,238 호 및 5,204,244 호를 참조하시오.
"인간화된 항체"란 용어는 프레임워크 또는 "상보성 결정 영역"(CDR)이 모 면역글로불린의 경우에 비해 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린의 CDR을 포함하도록 변형된 항체를 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 쥐 CDR을 인간 항체의 프레임워크 영역에 그래프트화시켜 "인간화된 항체"를 제조한다. 예를 들어 문헌[Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327]; 및 [Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270]을 참조하시오. 특히 바람직한 CDR은 키메릭 항체에 대해 상기 나타낸 항원들을 인식하는 서열을 나타내는 것들에 상응한다. 본 발명에 의해 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 상기 불변 영역이 원래 항체의 것으로부터 추가로 변형되거나 변화되어, 특히 Clq 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관하여 본 발명에 따른 성질들을 생성시키는 것들이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 항체"란 용어는 인간 생식 세포 계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함함을 의미한다. 인간 항체는 현재의 발달 상태로 널리 공지되어 있다(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한, 면역화 시 내생적인 면역글로불린 생산의 부재 하에서 인간 항체의 선택 또는 완전한 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들어 마우스)에서 생산될 수 있다. 상기와 같은 생식 세포 계열 돌연변이 마우스에서 상기 인간 생식 계열 면역글로불린 유전자 배열의 운반은 항원 시험감염 시 인간 항체를 생성시킬 것이다(Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40). 인간 항체를 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생산할 수 있다(Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). 콜(Cole) 등 및 베르너(Boerner) 등의 기법을 또한 인간 단클론 항체의 제조에 이용할 수 있다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); and Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메릭 및 인간화된 항체에 대해 이미 언급한 바와 같이, 본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 항체"란 용어는 또한, 특히 Clq 결합 및/또는 FcR 결합에 관하여, 예를 들어 "부류 전환", 즉 Fc 부분의 변화 또는 돌연변이(예를 들어 IgG1에서 IgG4 및/또는 IgG1/IgG4로의 돌연변이)에 의해, 본 발명에 따른 성질들을 생성하도록 상기 불변 영역을 변형시킨 상기와 같은 항체를 포함한다.
"에피토프"란 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩타이드 결정인자를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측 쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 기을 포함하며, 몇몇 실시태양에서 특이적인 3차원 구조 특징 및/또는 특이적인 전하 특징을 가질 수도 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "가변 도메인"(경 쇄의 가변 도메인(VL), 중 쇄의 가변 도메인(VH))은 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관련되는 경 쇄 및 중 쇄 도메인 쌍의 각각을 나타낸다. 상기 가변 경 쇄 및 중 쇄 도메인은 동일한 일반 구조를 가지며 각각의 도메인은, 서열들이 광범위하게 보존되고 3 개의 "초 가변 영역"(또는 상보성 결정 영역, CDR)에 의해 연결되는 4 개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 상기 프레임워크 영역은 β-시트 형태를 채용하며 상기 CDR은 상기 β-시트 구조를 연결하는 고리를 형성할 수도 있다. 각 쇄 중에서 CDR은 상기 프레임워크 영역에 의해 이의 3차원 구조를 유지하며 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 상기 항체의 중 쇄 및 경 쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하며 따라서 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.
"항체의 항원 결합 부분"이란 용어는 본 발명에 사용되는 경우 항원 결합을 맡고 있는 항체의 아미노산 잔기를 지칭한다. 항체의 항원 결합 부분은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 영역은 본 발명에서 정의한 바와 같은 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역들이다. 따라서, 항체의 상기 경 쇄 및 중 쇄 가변 도메인은 N-말단에서부터 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 특히, 상기 중 쇄의 CDR3은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이며 항체의 성질을 한정한다. CDR 및 FR 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 표준 정의 및/또는 "초 가변 고리"로부터의 잔기들에 따라 결정된다.
"Tmem7 폴리펩타이드"란 용어는 본 발명에서 임의의 동물, 예를 들어 인간을 포함한 포유동물 종으로부터의 고유 Tmem27 폴리펩타이드, 및 Tmem27 변체를 지칭하는데 사용된다. 상기 Tmem27 폴리펩타이드를 인간 조직 유형을 포함한 다양한 출처로부터 단리하거나, 또는 재조합 및/또는 합성 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 Tmem27 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 서열번호: 7에 제공한다.
추가의 목적에서, 본 발명은 본 발명의 항체 및 상기 항체에 공유 결합된 활성 화합물을 포함하는 접합체를 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 상기 활성 화합물은 독소 또는 siRNA 분자, 바람직하게는 siRNA 분자이다.
본 발명의 항체를 siRNA 분자의 단부 기에 공유 결합시킴으로써 A-X-Y 형태로 siRNA-항체 접합체를 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 소정의 siRNA 분자를 선택하고; 상기 siRNA 분자를 본 발명의 항체에 공유 결합시킴을 포함하며, 여기에서 A는 본 발명의 항체이고, X는 연결기-매개된 공유 결합이고, Y는 siRNA 분자이다.
siRNA-항체 접합체의 제조 방법은 siRNA의 작용기를 활성화시키고 상기 활성화된 작용기를 상기 항체에 공유 결합시킴을 포함할 수 있다. 상기 활성화되는 작용기는 비 제한적으로 아민 기, 티올 기, 포스페이트 기, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 siRNA의 작용기를 활성화하는 물질은 1-에틸-3,3-다이에틸아미노프로필 카보다이이미드, 이미다졸, N-하이드록실숙신이미드, 다이클로로헥실-카보다이이미드, N-말레이미도프로피온산, N-말레이미도프로필-옥실숙신이미드 에스터, N-숙신이미딜피리딜다이티오프로피오네이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 siRNA 항체 접합체의 추가적인 제조 방법들을 문헌[the Handbook of Cell Penetrating Peptides, Chapter 18, Second Edition, April 2006, Editor: Ulo Langel]에서 찾을 수 있다.
추가의 목적에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
보다 양호한 투여를 위해서, 상기 조성물은 상술한 활성 성분 이외에 한 종류 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기와 같은 담체의 예로는 염수 용액, 멸균수, 링거액, 완충된 염수 용액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 (수성) 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물이 있다. 필요에 따라, 전형적인 첨가제, 예를 들어 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제 등을 첨가할 수 있다. 더욱이, 상기 조성물은 추가의 첨가제들, 예를 들어 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가함으로써 수용액, 현탁액, 유화액 등의 형태로 주사하기 위해 약학적으로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 다양한 투여 경로들, 예를 들어 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 동맥 내 투여, 수질 내 투여, 척수강 내 투여, 심장 내 투여, 경피 투여, 피하 투여, 복강 내 투여, 설하 투여 및 국소 투여를 통해 신체와 접촉하게 할 수 있다.
상기와 같은 임상 투여를 위해서, 본 발명의 약학 조성물을 통상적인 기법을 사용하여 적합한 제품으로 제조할 수 있다.
항체를 재조합 방법 및 조성물을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 항-TMEM27 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 항체(예를 들어 상기 항체의 경 쇄 및/또는 중 쇄)의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다(예를 들어 하기에 의해 형질전환된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터. 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 항-TMEM27 항체의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 제공된 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하고, 임의로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수함을 포함한다.
본 발명 항체의 재조합 생산을 위해서, 예를 들어 상술한 바와 같은 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 상기와 같은 핵산을 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어 상기 항체의 중 쇄 및 경 쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 단리하고 서열화할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 발명에 개시된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체를, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 작용이 필요하지 않은 경우 세균에서 생산할 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서, 예를 들어 미국 특허 제 5,648,237 호, 제 5,789,199 호, 및 제 5,840,523 호를 참조하시오. (또한 에스케리키아 콜라이에서 항체 단편의 발현을 개시하는 문헌[Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 참조하시오). 발현 후에, 상기 항체를 용해성 분획 중의 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있으며 추가로 정제할 수 있다.
단클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항체 유전자를 클로닝하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 예를 들어, 가변 중 쇄 및 경 쇄 도메인(VH 및 VL)에 대한 유전 정보를 면역글로불린-특이성 프라이머와 함께 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 사용하여 하이브리도마 세포로부터 증폭시킬 수 있다(Methods Mol Med. 2004;94:447-58). 이어서 상기 가변 중 쇄 및 경 쇄 도메인(VH 및 VL)을 암호화하는 핵산을 숙주 세포에서 적합한 발현 벡터에 클로닝할 수 있다.
실험 부분
독시사이클린 -의존적인 방식으로 인간 TMEM27 의 유도성 발현을 허용하는 INS-1 안정성 세포 주의 생성
INS-1E 세포를 10 mM Hepes(pH 7.3), 10%(v/v) 열-불활성화된 송아지 태아 혈청(Brunschwig AG, Switzerland), 50 μM β-머캅토에탄올, 1 mM 나트륨 피루베이트, 50 ㎍/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 11 mM 글루코스(Invitrogen, Switzerland)를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 인간 TMEM27 cDNA(5183554, Invitrogen)를 pTRE2 벡터(631008, Clontech)에 서브클로닝하였으며, 상기 벡터를 왕(Wang) 등에 의해 개시된 과정에 따라 INS-1 유도된 안정성 세포 주의 형질감염 및 생성에 사용하였다. 클론 INS-hTMEM27*F2는 최고의 유도성을 나타내며 최저의 배경이 선택된다. 도 3의 웨스턴 블럿팅에 의해 나타낸 바와 같이, hTMEM27 단백질을 독시사이클린에 의해 용량-의존적으로 유도할 수 있다.
도 3: 세포를 지시된 농도의 독시사이클린의 존재하에서 24 시간 동안 배양하였다. 양고추 냉이 퍼옥시다제-접합된 마우스 항-인간 TMEM27 단클론 항체(클론 3/3)로 면역블럿팅을 수행한 다음 화학발광 검출을 수행하였다.
전 세포 면역화를 사용하는 마우스 항- TMEM27 단클론 항체의 생성
스위스 알비노 마우스의 면역화를, 살아있는 세포의 반복된 주사에 의해 INS-h-TMEM27 클론 F2 INS-1 세포로 수행하였다. 상기 동물이 hTMEM27에 대해 특이적인 면역-반응을 나타내자마자, 문헌[G. Kohler and C. Milstein (1975) "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity". Nature 256:495-497]에 따라 비장 세포를 제거하고 Ag8 세포에 융합시켰다.
TMEM27-8/9-알렉사488-IgG 및 TMEM27-8/9-알렉사555-Fab 와 살아있는 INS-hTMEM27 세포와의 배양
INS-hTMEM27 클론 F2 WT 세포를 PDL-코팅된 유리-슬라이드 상에서 증식시키고 37 ℃에서 배양하였다.
상이한 농도의 mAb를 유도 배지(완전 배양 배지 + 500 ng/㎖ - 독시사이클린):0.6 ㎖/웰에 가하고 33 ℃에서 24 시간 동안 배양한다. 이어서 세포를 둘베코(Dulbeccos) PBS(+Ca2 +/+Mg2 +)로 1 회 세척하고 2% 폼알데하이드로 고정시킨다.
도 4a 내지 4k는 TMEM27-8/9-알렉사488-IgG 및 TMEM27-8/9-알렉사555-Fab를 살아있는 INS-hTMEM27 세포와 배양한 결과를 나타낸다.
TMEM27 을 인간 및 원숭이 췌장 섬의 베타-세포에 둔다
포르말린-고정된 파라핀-매몰된(FFPE) 섹션을 사용하여 슬라이드를 조립하였다. 샘플을 탈수시키고 자일롤(x2), 100% EtOH, 95% EtOH, 80% EtOH, 70% EtOH 및 1X PBS 중에 연속적으로 흠뻑 적셨다(각각 3 분). 상기 슬라이드를 1X 시트레이트 완충제에 흠뻑 적시고 이를 전자 레인지(850 와트)에서 3 분간 비등시킴으로써 항원 회복을 수행하였다. 상기 슬라이드를 물로 2 회 세정한 후에, 세포를 RT에서 10 분간 1X PBS 중의 0.2% 트리톤 100 ㎕로 투과성으로 만들었다. 1X PBS로 3 회 세척 후에, RT에서 30 초 내지 1 시간 동안 1X PBS 중의 2% BSA로 차단시켰다. 1X PBS로 3 회 더 세척하여 상기 Ab 배양(37 ℃에서 1 내지 2 시간 또는 4 ℃에서 O/N)을 진행시켰다. 3 회 더 세척하고 DAPI 염색(암실에서 RT에서 5 내지 10 분)시켰다. 최종적으로 3 회 세척하고 커버 슬립을 조립하였다.
도 5: FDA-승인된 인간 조직 미세배열의 면역조직화학 염색을 나타낸다. 인간 조직 미세배열의 파라핀 섹션들이 알렉사488-접합된 항-TMEM27(클론 8/9)로 염색되었다.
항-TEMEM27은 인간 및 원숭이 베타-세포를 특이적으로 염색한다.
도 6a, 6b 및 7은 인간 및 원숭이 췌장의 면역조직화학 염색을 나타낸다. 인간 및 원숭이 췌장의 파라핀 섹션들이 알렉사488 접합된 TMEM27(클론 8/9)로 염색되었다.
비히클로서 TMEM27 항체를 사용하는, 세포 siRNA 흡수의 정량분석
siRNA 제조
올리고리보뉴클레오타이드 합성
올리고리보뉴클레오타이드를 10 μmol 규모로 ABI 394 합성기(Applied Biosystems)를 사용하여 고체상으로 포스포아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNA 서열 정보에 대하여 표 1을 참조하시오. 합성을 조절된 기공 유리(CPG, 520 Å, 75 μmol/g의 로딩으로, Prime Synthesis, Aston, PA, USA로부터 수득됨)로 제조된 고체 지지체 상에서 수행하였다. 정규 RNA 포스포아미다이트, 2'-O-메틸포스포아미다이트 뿐만 아니라 보조 시약을 프롤리고(Proligo)(Hamburg, Germany)로부터 구입하였다. 구체적으로, 하기의 아미다이트들을 사용하였다: (5'-O-다이메톡시트리틸-N6-(벤조일)-2'-O-t-부틸다이메틸실릴-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트, 5'-O-다이메톡시트리틸-N4-(아세틸)-2'-O-t-부틸다이메틸실릴-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트, (5'-O-다이메톡시트리틸-N2-(아이소부티릴)-2'-0-t-부틸다이메틸실릴-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트, 및 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-t-부틸다이메틸실릴-유리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-다이아이소프로필아미노) 포스포아미다이트. 2'-O-메틸포스포아미다이트, N4-(t-부틸페녹시아세틸) 보호된 2'-O-메틸-시티딘을 제외하고 상기 정규 RNA 아미다이트와 동일한 보호 기을 가졌다. 모든 아미다이트를 무수 아세토나이트릴(100 mM)에 용해시키고 분자체(3 Å)를 가하였다. 상기 올리고머의 5'-단부에 설프하이드릴 연결기를 생성시키기 위해서, 글렌 리써치(Glen Research)(Sterling, Virginia, USA)로부터의 1-O-다이메톡시트리틸-헥실-다이설파이드, 1'-[(2-시아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)]-포스포아미다이트 연결기를 사용하였다. mAb 접합 전에 상기 다이설파이드 연결기를 TCEP를 사용하여 환원시켰다(하기 참조). Cy5 접합을 위해서, 상기 올리고리보뉴클레오타이드에 C-6 아미노 연결기를 이의 5'-단부에서 6-(4-모노메톡시트리틸아미노)헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포아미다이트(글렌 리써치)를 사용하여 갖게 하였다. 5-에틸 티오테트라졸(ETT, 아세토나이트릴 중 500 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 결합 시간은 6 분이었다. 포스포로티오에이트 결합을 도입시키기 위해서, 무수 아세토나이트릴 중의 3-에톡시-1,2,4-다이티아졸린-5-온(EDITH, Link Technologies, Lanarkshire, Scotland로부터 수득됨)의 100 mM 용액을 사용하였다. 상기 Cy5 형광 염료를, 상응하는 NHS 에스터(GE Healthcare, Munich, Germany로부터 수득됨) 및 상기 C6 아미노 연결기를 지니는 올리고리보뉴클레오타이드를 사용하여 상기 5'-단부에 부착시켰다.
지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호
상기 고상 합성의 종료 후에, 건조된 고체 지지체를 15 ㎖ 튜브로 옮기고 45 ℃에서 180 분간 메탄올(2 M, Aldrich) 중의 메틸아민으로 처리하였다. 원심분리 후에, 상등액을 새로운 15 ㎖ 튜브로 옮기고 상기 CPG를 1200 ㎕의 N-메틸피롤리딘-2-온(NMP, Fluka, Buchs, Switzerland)으로 세척하였다. 상기 세척물을 메탄올성 메틸아민 용액과 합하고 450 ㎕의 트라이에틸아민 트라이하이드로플루오라이드(TEA?3HF, Alfa Aesar, Karlsruhe, Germany)를 가하였다. 상기 혼합물을 150 분간 65 ℃로 만들었다. RT로 냉각시킨 후에 0.75 ㎖의 NMP 및 1.5 ㎖의 에톡시트라이메틸실란(Fluka, Buchs, Switzerland)을 가하였다. 10 분 후에, 상기 침전된 올리고리보뉴클레오타이드를 원심분리에 의해 수거하고, 상등액은 버리고 고체를 1 ㎖의 완충제 A(하기 참조)로 재조성하였다.
올리고리보뉴클레오타이드의 정제
조 올리고리보뉴클레오타이드를 AKTA 익스플로러(Explorer) 시스템(GE Healthcare) 상의 예비 22 x 250 ㎜ DNA 팩(Pac) 100 컬럼(Dionex, Idstein, Germany)을 사용하여 강한 음이온 교환(SAX) HPLC에 의해 정제하였다. 완충제 A는 10 mM NaClO4, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.4, 6M 유레아 및 20% 아세토나이트릴로 이루어졌다. 완충제 B는 완충제 A 중의 500 mM NaClO4를 가졌다. 4.5 ㎖/분의 유속을 사용하였다. 260 및 280 ㎚에서의 UV 자취를 기록하였다. 55 분 이내에 20% B에서부터 45% B로의 구배를 사용하였다. 적합한 분획들을 모으고 3M NaOAc, pH = 5.2 및 70% 에탄올로 침전시켰다.
조 표지된 올리고머를 AKTA 익스플로러 시스템(GE Healthcare) 상의 엑스테라 프렙(XTerra Prep) MS C8 10 x 50 ㎜ 컬럼(Waters, Eschborn, Germany)을 사용하여 RP HPLC에 의해 정제하였다. 완충제 A는 100 mM 트라이에틸암모늄 아세테이트이고(Biosolve, Valkenswaard, The Netherlands) 완충제 B는 완충제 A 중의 50% 아세토나이트릴을 함유하였다. 5 ㎖/분의 유속을 사용하였다. 260, 280 및 643 ㎚에서의 UV 자취(Cy5의 경우에)를 기록하였다. 58 컬럼 부피(CV) 이내에 5% B에서부터 60% B로의 구배를 사용하였다. 적합한 분획들을 모으고 3M NaOAc, pH = 5.2 및 70% 에탄올로 침전시켰다.
최종적으로, 상기 정제된 올리고머를 세파덱스 G-25(GE Healthcare)를 함유하는 컬럼 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 탈염시켰다. 상기 용액의 농도를 UV 광도계(Beckman Coulter, Krefeld, Germany)에서 260 ㎚에서 흡광도 측정에 의해 측정하였다. 어닐링시까지 개별적인 가닥들을 -20 ℃에서 동결된 용액으로서 보관하였다.
siRNA를 생성시키기 위한 올리고리보뉴클레오타이드의 어닐링
상보성 가닥들을 동 몰의 RNA 용액을 배합하여 어닐링시켰다. 상기 혼합물을 동결건조시키고 적합한 부피의 어닐링 완충제(100 mM NaCl, 20 mM 인산 나트륨, pH 6.8)로 재조성하여 목적하는 농도를 성취하였다. 상기 용액을 95 ℃에서 수욕에 넣고 이를 3 시간 이내에 RT로 냉각시켰다.
siRNA 서열 정보
서열번호 센스 가닥 서열 (5'-3') 서열번호 안티센스 가닥 서열 (5'-3')
서열번호: 1 uuuGcAGAAAAGGuuGcAAdTsdT 서열번호: 4 UUGcAACCUUUUCUcAAAdTsdT
서열번호: 2 (C6SSC6)uuuGcAGAAAAGGuuGcAAdTsdT 서열번호: 5 UUGcAACCUUUUCUGcAAAdTsdT
서열번호: 3 (C6SSC6)uuuGcAGAAAAGGuuGcAAdTsdT 서열번호: 6 (Cy5)(NHC6)UUGcAACCUUUUCUGcAAAdTsdT
하부 경우 문자: 2'OMe 뉴클레오타이드; s: 포스포로티오에이트 결합; dT: 데옥시티미딘; (C6SSC6): C-6 다이설파이드 연결기; (NHC6): C-6 아미노 연결기; (Cy5): 시아닌 5 염료
항체 - siRNA 접합체 제조
상기 항체의 말레이미드 활성화: 단클론 항체 TMEM27-8/9를 10 배 몰 과잉의 SMCC(설포숙신이미딜 4-[N말레이미도메틸]사이클로헥산-1-카복실레이트)와 반응시킨 다음 탈염에 의해 과잉(반응하지 않은) 시약을 제거하였다.
siRNA 활성화: 단일 데옥시티미딘에 대해 C6SSC6-연결기를 갖는 Cy5 표지된 siRNA를 TCEP(트리스[2-카복시에틸]포스핀)로 환원시켜 상기 다이설파이드 결합을 선택적으로 환원시켰다.
이어서 상기 설프하이드릴-함유 siRNA를 가하여, 이미 단클론 항체에 부착된 말레이미드 기와 반응시켰다. 이어서 siRNA 상의 반응하지 않은 유리 설프하이드릴을 MEM(N-에틸말레이미드)를 사용하여 차단하고 최종 생성물을 100 kD-컷오프 농도 과정을 사용하여 크기 배제에 의해 정제시켰다.
최종 표지화-비를 나노드롭(nanodrop)으로 측정한다(280 ㎚에서 IgG 흡착, 652 ㎚에서 Cy5, 소광 계수 Cy5:250'000).
샘플 제조
제 1 일: 고유 INS-1E 세포 또는 INS-hTMEM27*F2 세포를 96-웰 플레이트에 50,000/웰로 시딩하였다.
제 3 일: 배지를 500 ng/㎖ 독시사이클린(Sigma-Aldrich)을 함유하는 배양 배지로, 또는 유도되지 않은 대조용 샘플의 경우 배양 배지로 대체하였다.
제 4 일: I-완충제를 제조하고 37 ℃로 가열하였다. (1 x HBSS, 20 mM Hepes, 0.1% BSA, 3차 증류수로 제조됨, pH 7.0). siRNA-Cy5에 접합되거나(67 nM 항체, TMEM 항체의 경우 항체당 평균 2.4 분자를 갖는 siRNA-Cy5로 표지됨, mGluR7 대조용 항체 접합체의 경우 분자 비 2.2) 또는 siRNA-Cy5(67 nM 항체 및 160 nM siRNA-Cy5)와 혼합된 항체의 용액을 제조하고 37 ℃에서 5 분간 평형화시켰다. 상기 세포 배양 배지를 서서히 흡기하고, 상기 항체 용액 60 ㎕/웰로 대체하고 37 ℃의 온도에서 1 시간 동안 배양하였다.
세포 표면 면역염색을 위해서, 알렉사647 염소-항-마우스 2차 항체의 1:400 용액을 빙냉 PBS로 제조하였다. 상기 웰을 90 ㎕/웰 빙냉 PBS로 3 회 세척하였다. 상기 플레이트를 빙욕으로 옮기고 60 ㎕/웰의 빙냉 항체 용액을 상기 웰에 가하고 상기 플레이트를 60 분간 배양하였다. 상기 웰을 실온에서 90 ㎕/웰의 PBS로 3 회 세척하였다. 이어서 100 ㎕/웰의 4% 폼알데하이드를 가하고, 상기 웰을 실온에서 15 분간 배양하였다. 상기 용액을 2 ㎍/㎖의 셀마스크블루(CellMaskBlue)를 함유하는 60 ㎕ PBS/웰로 대체하고 RT에서 20'간 배양하였다. 상기 세포를 실온에서 90 ㎕/웰의 PBS로 1 회 세척하였다. PBS 중의 3 μM 훽스트(hoechst) 및 4% 폼알데하이드의 용액을 가하고, 상기 웰을 실온에서 15 분간 배양하였다. 상기 웰을 실온에서 PBS로 1 회 세척하고, 150 ㎕ PBS/웰 중에 두었다.
면역염색의 세포 이하 수준의 정량분석
항체 및 siRNA-Cy5의 세포 이하(subcellular) 국소화를 에보테크 테크놀로지스(Evotec Technologies, Hamburg, Germany)를 사용하여 정량 분석하였다. 상기 기계에는 도립 공초점 형광 현미경이 장착되어 있으며 상기 기계는 투명한 기부 미세적정 플레이트에서 제조된 샘플로부터의 상들의 자동화된 포착이 수행되도록 설치된다. 판독기에서, 상 분석용 소프트웨어 "아카펠라(Accapella)"가 통합되어 있으며, 여기에서 소정 유형의 대상의 위치를 식별하는 상 분석 방법(스크립트)을 준비할 수 있다.
본 실시예에서 상기 정량 분석에 사용된 스크립트는 각각 상기 세포 표면 영역 상에 및 세포 내 세포질 영역에 국소화된 면역 염색의 강도를 확인하기 위해 개발되었다. 상기 분석은 DNA-특이성 형광단 및 동종의 세포 색소 셀마스크블루로 염색한 샘플, 알렉사488 및 siRNA 표지 Cy5로 표지한 2차 항체에서 나란히 획득한 3 개의 상에 근거한다. 각각의 상으로부터 대상을 식별한다. 상기 DNA 염색 및 셀마스크 블루 염색에 특이적인 첫 번째 상으로부터, 핵의 수, 위치, 크기 및 모양을 상기 더 밝은 훽스트 염색 및 상기 셀마스크블루 염색으로부터의 세포질의 윤곽으로부터 측정하였다. 상기 알렉사488 2차 항체에 대해 선택성인 두 번째 상으로부터, 세포 표면 면역염색된 면적을 측정하고 강도를 정량분석하였다. 상기 세 번째로부터, 상기 세포의 세포질 영역 중의 Cy5 염색의 강도를 확인하고 형광 강도를 정량분석하였다.
도 8은 상기 프로토콜에 개시된 바와 같이 세척하고 2차 염색 및 고정을 위해 얼음으로 옮기기 전에, 37 ℃에서 siRNA-Cy5와 접합된 67 nM 1차 항체 또는 67 nM 1차 항체 및 160 nM siRNA-Cy5의 혼합물과 배양한 INS-hTMEM27*F2 세포의 상들을 나타낸다. 각 열은 상기 웰 중에서 동일한 시야로 나란히 획득한 상들을 함유한다. 패널 A 내지 F는 독시사이클린으로 유도된 세포이다. 패널 G 내지 I는 유도되지 않은 세포를 제외하고 패널 A 내지 C의 샘플로서 제조된 샘플의 상들이다. 패널 J 내지 L은 상기 TMEM27 항체 siRNA-Cy5 접합체를 mGluR7 수용체를 인식하는 항체에 접합된 siRNA-Cy5로 대체함을 제외하고 패널 A 내지 C의 샘플로서 제조된 샘플의 상들이다.
패널 A, D, G 및 J는 셀마스크블루 및 훽스트 염색에 대해 선택성인 필터 지정으로 획득한 상들을 나타낸다: 레이저 405 ㎚, 롱패스(Longpath) 650 필터에 의해 반사되고 쇼트패스(Shortpath) 568 필터 및 밴드패스(Bandpath) 455/70 필터를 통해 여과된 방출. 패널 B, E, H 및 K는 알렉사488 2차 항체에 의한 세포 표면 염색에 대해 선택성인 필터 지정으로 획득한 상들을 나타낸다: 레이저 488 ㎚, LP650 및 LP568에 의해 반사되고 BP535/60을 통해 여과된 방출. 패널 C, F 및 I는 siRNA 표지 Cy5에 대해 선택성인 필터 지정으로 획득한 상들을 나타낸다: 레이저 635 ㎚, LP650을 통과하고 BP690/50을 통해 여과된 방출. 상의 강도 환산(scaling)은 동일한 카메라에 의해 획득된 상들의 경우와 유사하다.
상기 상들은 TMEM27 항체가 세포막 매몰된 인간 TMEM27의 인식을 통해 siRNA의 세포 흡수를 매개할 수 있음을 입증한다.
도 9는 Cy5의 정량화된 세포 표면 2차 항체 면역염색 및 세포질 영역 강도를 나타낸다. 상기 샘플들은 독시사이클린 유도된 인간 TMEM27 발현(검은색 막대) 및 유도되지 않은(흰색 막대) 세포로 제조되었으며 이들 샘플을 siRNA와 항체의 상이한 조합들과 1 시간 동안 배양하였다. x축에서 왼쪽에서부터 오른쪽으로: siRNA-Cy5와 접합된 67 nM TMEM27 8/9 1차 항체(항체당 평균 2.4 분자), 67 nM TMEM27 8/9 1차 항체와 160 nM siRNA-Cy5의 혼합물, siRNA-Cy5와 접합된 67 nM mGluR7 1차 항체(항체당 평균 2.2 분자) 및 마지막으로, 상기 프로토콜에 개시된 바와 같이 세척하고 2차 염색 및 고정을 위해 얼음으로 옮기기 전에, 37 ℃에서 1 시간 동안 siRNA 또는 항체 없이 완충제와 배양한 샘플.
도 9a: 세포 표면 막 영역 중의 2차 항체 면역염색의 평균 화소 강도. 패널 9b: Cy5의 세포질 영역에서의 평균 화소 강도.
현재 본 발명의 바람직한 실시태양들을 나타내고 개시하지만, 본 발명이 이들로 제한되는 것이 아니라 달리 다양하게 실현되고 하기 청구의 범위 내에서 실행될 수 있음은 물론이다.
DSMZ(독일 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하) DSMACC2995 20090527
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Beta cell marker antibody <130> 26057 WO <140> PCT/EP2010/061078 <141> 2010-07-30 <150> EP09167160.2 <151> 2009-08-04 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> s: phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Deoxythymidine <400> 1 uuugcagaaa agguugcaat st 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> s = phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Deoxythymidine <400> 2 uuugcagaaa agguugcaat st 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14)..(15) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> s = phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Deoxythymidine <400> 3 uuugcagaaa agguugcaat st 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> Deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> s = phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> Deoxythymidine <400> 4 uugcaaccuu uucucaaats t 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> s = phosphorothoate linkage <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Deoxythymidine <400> 5 uugcaaccuu uucugcaaat st 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> 2' O-Methyl nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Deoxythymidine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> s = phosphorothioate linkage <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> Deoxythymidine <400> 6 uugcaaccuu uucugcaaat st 22 <210> 7 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Leu Trp Leu Leu Phe Phe Leu Val Thr Ala Ile His Ala Glu Leu 1 5 10 15 Cys Gln Pro Gly Ala Glu Asn Ala Phe Lys Val Arg Leu Ser Ile Arg 20 25 30 Thr Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Ala Trp Asp Thr Asn Glu Glu Tyr 35 40 45 Leu Phe Lys Ala Met Val Ala Phe Ser Met Arg Lys Val Pro Asn Arg 50 55 60 Glu Ala Thr Glu Ile Ser His Val Leu Leu Cys Asn Val Thr Gln Arg 65 70 75 80 Val Ser Phe Trp Phe Val Val Thr Asp Pro Ser Lys Asn His Thr Leu 85 90 95 Pro Ala Val Glu Val Gln Ser Ala Ile Arg Met Asn Lys Asn Arg Ile 100 105 110 Asn Asn Ala Phe Phe Leu Asn Asp Gln Thr Leu Glu Phe Leu Lys Ile 115 120 125 Pro Ser Thr Leu Ala Pro Pro Met Asp Pro Ser Val Pro Ile Trp Ile 130 135 140 Ile Ile Phe Gly Val Ile Phe Cys Ile Ile Ile Val Ala Ile Ala Leu 145 150 155 160 Leu Ile Leu Ser Gly Ile Trp Gln Arg Arg Arg Lys Asn Lys Glu Pro 165 170 175 Ser Glu Val Asp Asp Ala Glu Asp Lys Cys Glu Asn Met Ile Thr Ile 180 185 190 Glu Asn Gly Ile Pro Ser Asp Pro Leu Asp Met Lys Gly Gly His Ile 195 200 205 Asn Asp Ala Phe Met Thr Glu Asp Glu Arg Leu Thr Pro Leu 210 215 220

Claims (21)

  1. Tmem27 폴리펩타이드의 에피토프에 대한 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    인간 Tmem27 폴리펩타이드에 대한 항체.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    단클론 항체인 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적합한 동물을 Tmem27 폴리펩타이드, 바람직하게는 인간 Tmem27 폴리펩타이드를 발현하는 전(whole) 세포로 면역시킴으로써 생산된 항체.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VH 도메인의 CDR3 및 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VL 도메인의 CDR3을 포함하는 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VH 도메인의 CDR1 내지 CDR3 및 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VL 도메인의 CDR1 내지 CDR3을 포함하는 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하는 항체.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2009년 5월 27일자로 독일 생물 자원 센터(DSMZ)에 기탁되고 기탁 번호 DSM ACC2995를 받은 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9에 의해 생산되는 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 항체.
  10. TMEM27 절단 및 이의 신호전달 경로의 변형을 수반하는 질병, 바람직하게는 당뇨병의 치료용 약제의 제조를 위한 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    당뇨병의 치료에 사용하기 위한 항체.
  12. 동물 췌장의 베타 세포 섬 및 베타 세포 덩어리의 생체 내 화상진찰을 위한 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 항체의 용도.
  13. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 상기 항체에 공유 결합된 활성 화합물을 포함하는 접합체.
  14. 제 13 항에 있어서,
    활성 화합물이 독소 또는 siRNA 분자, 바람직하게는 siRNA 분자인 접합체.
  15. 2009년 5월 27일자로 독일 생물 자원 센터(DSMZ)에 기탁되고 기탁 번호 DSM ACC2995를 받은 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9.
  16. 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VH 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
  17. 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9(DSM ACC2995)로부터 수득되는 항체의 VL 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
  18. 2009년 5월 27일자로 독일 생물 자원 센터(DSMZ)에 기탁되고 기탁 번호 DSM ACC2995를 받은 하이브리도마 세포 주 TMEM27-8/9에 의해 생산된 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 분자.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 기술된 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  20. 제 19 항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  21. 특히 상기 실시예와 관련된, 상기한 바와 같은 발명.
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