KR20120024822A

KR20120024822A - 일주기 유전자 활성자 및 ｓｉｒｔ１ 유전자 활성자들의 상승작용적 조합물을 포함하는 피부 복구 조성물

Info

Publication number: KR20120024822A
Application number: KR1020117030682A
Authority: KR
Inventors: 다니엘 에이치. 매스; 나딘 에이. 페르노데; 토마스 맘몬; 도날드 에프. 콜린스; 렌니 슬럿스키; 케리 골드그라벤; 제임스 티모시 매카시; 에드워드 펠레
Original assignee: 이엘씨 매니지먼트 엘엘씨
Priority date: 2009-06-23
Filing date: 2010-06-09
Publication date: 2012-03-14
Also published as: CA2761967A1; BRPI1015932B1; RU2494756C1; AU2010271088B2; HK1178798A1; EP2445511B1; BRPI1015932A2; EP2445511A2; CN102802656A; US8703161B2; CN102802656B; CA2761967C; AU2010271088A1; JP2015129138A; JP5715623B2; US20100028317A1; EP2445511A4; KR101393960B1; RU2012102050A; ES2605623T3

Abstract

피부 세포에서 손상된 DNA의 복구를 향상시키기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 피부 세포에서 일주기 유전자 발현을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제 및 피부 세포에서 유사분열을 지연시키는 적어도 하나의 비-일주기 작용제를 함유하는 국소 조성물이 개시된다. 바람직하게는 그러한 조성물은 하나 이상의 각질세포 clock 및 per1 유전자 활성자를 SIRT1 또는 하나 이상의 sirt1 활성자와 함께 함유한다. 더 바람직하게는, sirt1 활성자는 특정한 펩티드성 sirt1 활성자와 레스베라트롤의 상승작용적 조합물이다. 바람직하게는 그러한 조성물은 사용이 용이하며, 유효하고, 화장용으로 허용되며, 화학적으로 안정하고 열역학적으로 안정하며 광에 안정하고, 국소용으로 안전하며, 부작용이 거의 없거나 전혀 없고, 개인 관리 시장에서 상업적으로 실현가능하다.

Description

일주기 유전자 활성자 및 ＳＩＲＴ１ 유전자 활성자들의 상승작용적 조합물을 포함하는 피부 복구 조성물{SKIN REPAIR COMPOSITIONS COMPRISING CIRCADIAN GENE ACTIVATORS AND A SYNERGISTIC COMBINATION OF SIRT1 GENE ACTIVATORS}

본 출원은 2007년 8월 13일에 출원된 계류 중인 미국 특허 출원 제11/837,658호의 부분 계속 출원이며, 2009년 2월 9일에 출원된 계류 중인 미국 특허 출원 제12/367,705호의 부분 계속 출원이고, 상기 미국 특허 출원 둘 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

기술분야

본 발명은 피부 처리 분야에 있다. 더 구체적으로는 본 발명은 피부 세포에서 손상된 DNA의 복구를 향상시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

피부는 다양한 환경 및 생활방식 인자로부터의 매일의 공격하에 있음이 지금에 와서야 잘 인식되고 있다. 이들 인자의 짧은 목록은 UVA 방사선, UVB 방사선, 오염, 담배 연기, 빈약한 식사, 불충분한 휴식 및 심리적 스트레스를 포함한다. 이러한 공격은 피부 세포 DNA 및 단백질에의 손상으로 나타난다. 피부 세포 손상의 덜 심각한 결과 중에는 피부에서의 주름 및 주름살이 있는 반면, 흑색종은 더 심각한 것이다.

DNA 손상

일부 환경 및 생활방식 인자는 피부 세포 DNA 및/또는 단백질과 직접적으로 상호작용하여 손상을 야기하며, 일부 인자는 손상을 간접적으로 야기하며, 일부 요인은 둘 모두를 야기할 수 있다. 직접적인 DNA 손상의 일례로는 피부 세포 DNA가 스펙트럼의 UVB 부분으로부터 광자를 흡수할 때가 있다. 광자의 흡수는 DNA 서열에서의 돌연변이를 야기할 수 있다. 예를 들어, 모든 흑색종 발생 중 약 8%는 직접적인 DNA의 돌연변이로 인한 것이다.

피부 세포 DNA 및 단백질에의 간접적인 손상의 일례는 자외선 광자가 피부에 들어가고 발색단에 의해 흡수될 때 관찰된다. 여기된 상태에서 발색단은 반응성 산소 화학종을 형성시키는 반응에 들어간다. 예를 들어, 인간 피부에 있어서, UVB 노출은 과산화수소의 생성과 결부되어 있는 반면, UVA는 일중항 산소의 생성과 결부되어 있다. 피부가 반응성 화학종의 중화에 의한 항상성 유지를 할 수 없다면, 반응성 화학종은 산화를 통하여 피부 세포 DNA 및 단백질을 손상시킨다. DNA 및 단백질에 대한 이러한 손상은 산화적 스트레스로 불리며, 피부 노화의 주요 원인이다. 또한, 모든 흑색종 발생 중 약 92%는 간접적인 산화적 DNA 손상으로 인한 것이다.

DNA 손상: 방지 및 견제 베르세스 ( Verses ) 복구

DNA 함유 피부 세포는 각질세포 줄기 세포 및 멜라닌 세포를 포함한다. 단일 일광 화상은 영향을 받은 세포에서 수십만개의 DNA 돌연변이 유발성 염기 변형, 예컨대 T-T (티아민-티아민) 이량체; 8-옥소-7,8-디히드로-2'-데옥시구아노신 (8-옥소-DG); 06MeG (06-메틸 구아닌); 시클로부탄 피리미딘 이량체 (CPD); 및 6-4 광생성물 (photoproduct) (6-4PP)을 생성하는 것으로 추정된다. 이들 돌연변이는 피부 세포 내에서 다양한 응답을 트리거링하며, 이는 세포의 추가의 DNA 손상 또는 아폽토시스 (apoptosis)를 방지할 수 있다. 예를 들어, 멜라닌 세포에서의 멜라닌 생성은 보호 조치로서 UV 방사선에 의해 상향조절되는 것으로 공지되어 있다. UV로부터의 위협을 다루기 위하여, 멜라닌은 하부 표피에서 멜라닌 세포에 의해 생성되며, 밖으로 이주하는 각질세포의 도움으로 상부 및 하부 표피 전체에 걸쳐 분포된다. 첫 번째 경우에서 멜라닌은 멜라닌 세포 및 각질세포 줄기 세포가 위치하는 하부 표피로 침투하는 UV의 양을 한정하는 UV 필터로서 작용함으로써 추가의 UV-유발된 DNA 손상을 방지하는 것으로 보인다. 그러나, 두 번째 방어선으로서, 멜라닌은 각질세포의 아폽토시스의 유발에 의한 UV 방사선으로 인한 DNA 손상을 포함한다. 아폽토시스의 촉진에 의해, 딸세포에게 넘어가는 기회가 더 적은 손상된 DNA가 포함된다 (예를 들어, 문헌[Yamaguchi et al., Melanin mediated apoptosis of epidermal cells damaged by ultraviolet radiation: factors influencing the incidence of skin cancer; Arch Dermatol Res. 2008 Apr; 300 Suppl 1 : S43-S50] 참조).

DNA 손상을 방지하고 DNA 손상을 견제하는 것 이외에, 건강한 각질세포 및 멜라닌 세포는 DNA 상해 복구를 위한 자연적인 내부 기작을 갖는다. 이들 기작은 방지 및 견제 기작과는 상이한데, 상기 방지 및 견제 기작은 (때로 중복되기는 하지만) 상이한 반응 캐스캐이드를 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 DNA 손상의 복구과 첫 번째로 관련된다.

단지 본 발명자가 논의하여 왔던 UV-유발된 손상뿐만이 아니라 다양한 원인으로부터의 DNA 상해를 복구하기 위한 세포 복구 기작이 존재한다. 그러나, DNA 상해의 복구는 시간이 걸린다. 예를 들어, UVB 노출에 의해 형성된 TT 이량체 및 6-4PP 손상의 복구는 외인적 영향에 의해 촉진되지 않는다면 각각 최대 48시간 및 8시간 걸릴 수 있다. UVA 또는 UVB 노출, 오존, 또는 연기 및 오염으로 인한 8-옥소-dG 및 06MeG 상해의 복구는 최대 2시간이 걸릴 수 있다. 이상적으로는, DNA 상해는 세포 분열이 일어나기 전에 복구된다. 그렇지 않다면, 바람직한 결과는 아폽토시스이다. 그러나, DNA 손상이 아폽토시스의 상향조절에 악영향을 주도록 일어난다면, 또는 돌연변이가 탐지되지 않고서 진행된다면, 손상된 DNA는 다음 세대로 넘어간다. 본 발명의 조성물 및 방법은 세포 분열이 일어나기 전에 DNA 손상의 복구를 최대화하는 것에 첫 번째로 관련된다.

세포의 방지 및 복구 기작은 일주기 ( circadian ) 시계에 의해 제어된다

보통의 조건하에서 DNA 발현 및 복구를 비롯한 세포 기능은 랜덤한 시점에 동일한 확률로 일어나지 않는다. 오히려, 각각의 세포는 약 24시간의 내인적 주기 (또는 시계) (즉, 일주기 리듬)를 가지며, 세포의 활동은 이러한 내인적 주기에 의해 조절된다. 일부의 외부 자극이 없으면, 각각의 세포는 그의 내인적 시계에 따라 자유롭게 작동한다. 그러나, 신체 전체에 걸친 세포의 내인적 시계는 동시성을 지닌다. 세포의 활동이 서로와 그리고 환경과 동시성을 지니게 하기 위하여, 신체는 환경으로부터의 큐 (cue)를 수용할 수 있다. 가장 주목할 만한 환경적 큐는 일광 부재의 존재이다. 따라서, 일주기성 주기는 태양일의 시기와 대략적으로 일치하는 명기 및 암기로 이루어진다.

일주기 리듬은 세포가 세포에 영향을 줄 수도 있는 환경의 변화를 예상하게 하며 상기 변화에 적시에 적응하게 한다는 것이 지금에 와서야 인식되고 있다. 세포 일주기 리듬의 유전자 기구가 적당하게 기능을 하고 있는 한, 세포는 세포 생육성 및/또는 항상성에 최적인 시점에 동시성을 지니는 방식으로 그의 많은 기능 각각을 실시한다. 예를 들어, 일광이 접근할 때 (그러나 심지어 피부가 UV로부터의 공격하에 있기 전에), 특정한 유전자가 활성화되어 예상된 UV 방사선 손상에 대해 세포를 보호하는 단백질을 생성한다. 그 후, 일광이 약화될 때, 이들 유전자는 턴오프된다 (turned off). 반면에, 일주기 유전자 그 자신은 환경 인자에 의해 공격받을 수 있다. 세포 일주기 리듬을 조절하는 하나 이상의 유전자에 대한 손상은 세포가 환경과 그리고 다른 세포와 동시성을 지니지 않게 할 수 있다.

핵심적인 일주기 기작

전사 인자는 DNA로부터의 RNA로의 유전 정보의 전달을 제어하기 위하여 특정 DNA 서열에 결합하는 단백질이다. 핵심적인 일주기 기작, 또는 "세포 시계"는 불일치 (out-of-phase), 음성 및 양성 피드백 루프에 참가하는 전사 인자들로 이루어지며, 상기 피드백 루프는 유전자 전사를 동요시킨다.

포유류의 주요 음성 피드백 루프에서, CLOCK 및 BMAL1 전사 인자의 헤테로이량체는 period (per) 및 cryptochrome (cry) 유전자의 전사를 활성화시킨다. 인간에 있어서, period 유전자는 실제 3가지 유전자 per1, per2 및 per3의 패밀리이며, cry 유전자 패밀리는 cry1 및 cry2로 이루어진다. PER 및 CRY 단백질은, 그의 번역 후에, 세포질 내로 이주하여 PER/CRY 복합체를 형성한다. 번역후 조절은 고의적인 지연을 생성하며, 그 후 PER/CRY 복합체는 세포 핵 내로 재배치된다. 핵에서의 PER 및 CRY의 농도는 일주기 중 주간의 마지막에 최고이며, 이 시점에서 CRY 단백질은 그 후 CLOCK/BMAL1 헤테로이량체의 전사 활성을 저해하는 작용을 한다. 따라서, CRY는 그 자신의 전사를 턴오프시키는 것으로 보인다.

반면에, 하나의 양성 피드백 루프에서, 핵으로의 재배치시에 PER2는 BMAL1의 전사를 상향조절하여 결국 period 및 cry 유전자의 전사에 이르게 되는 것으로 보인다. 또한, CLOCK/BMAL1 이량체는 rev - erb α 및 rora 유전자를 상향조절하는 것으로 보인다. rora는 BMAL1 전사를 활성화하는 반면, rev - erb α는 CLOCK 및 BMAL1을 억제한다. 소위 "정준 시계 유전자들" (clock , bmal1, per1, per2, per3, cry1 및 cry2)의 최고 활성은 불일치하여, 자가-지속 루프가 생성되며 이는 대략 24시간의 기간을 갖는다.

세포 주기

세포 주기는 세포에서 일어나는 이벤트의 시리즈를 나타내며 이는 세포의 분열 및 복제에 이르게 된다. 상기 주기는 일반적으로 완료에 약 24시간을 필요로 하는 4 또는 5개의 순차적인 시기로 기술된다. 세포 주기의 각 시기 내에서, 주어진 시기의 모든 필요한 과정이 다음 시기의 개시 이전에 완료됨을 보장하는 체크포인트가 있다. 인간 세포에서, "첫 번째" 시기는 세포의 DNA가 복제되고 합성되는 합성기 (Synthesis (S) phase)이다. S기는 전형적으로 6-8시간 지속될 수 있다. 3-4시간 지속되는 G2기에서, 단백질이 합성되며 세포의 크기는 배가된다. 유사분열 (M) 동안, 핵 엔벨로포는 분해되어 유전 물질의 각각의 카피는 세포의 반대 극으로 분리될 수 있다. 염색체의 각각의 세트 주위에서의 새로운 핵 엔벨로프의 형성 이후, 세포는 2개로 핀치된다 (세포질 분열). M기는 약 1시간 걸린다. 네 번째의 그리고 가장 긴 시기 (6 내지 12시간)는 RNA 및 단백질 합성을 특징으로 하는 G1이다. G1기로부터 세포는 다시 S기로 들어갈 수 있거나 이것은 G0기로 들어갈 수 있다. G0에서, 세포는 휴지기 상태에 있다. G0은 수일 또는 수년 동안 지속될 수 있다. 줄기 세포는 G0기로부터 되돌아와서 G1에 들어갈 수 있다. 분화된 세포는 일반적으로 G0으로부터 되돌아온다. 또한, 손상된 DNA를 갖는 세포는 아폽토시스라기보다는 오히려 G0에 들어갈 수 있다.

세포 주기 체크포인트는 손상된 DNA 가 넘어가는 것을 저해한다

세포 분열 동안, 체크포인트를 사용하여 세포 주기를 세포가 진행하는 것을 조절한다. 체크포인트는 손상된 DNA의 임의의 복구를 포함하는 모든 필요한 과정이 완료될 때까지는 세포가 다음 시기로 진행하지 못하게 한다. 이러한 방식으로, 체크포인트는 손상된 또는 불완전한 DNA가 딸세포로 넘어가지 못하게 되는 것을 보장한다. 몇몇 체크포인트가 존재한다. G1/S 체크포인트 (제한 체크포인트)는 세포 주기를 방해하여 "결정"이 휴지기에 들어갈 것인지의 여부에 대하여 내려질 수 있게 한다. G2/M 체크포인트에서, 세포 주기는 손상된 DNA가 탐지될 경우 중단되는데, 이는 드물지 않다. 복제후 체크포인트는 합성기에서 복제된 손상된 DNA에 관계된다. 손상된 DNA의 복제는 복제후 복구 과정이 완료될 때까지 세포 주기 진행을 방지하는 세포 응답을 트리거링한다. 인간 세포에서, 복제후 체크포인트는 유사분열기의 개시를 지연시킴으로써 복구를 위한 시간을 마련한다. chk1 유전자는 복제후 체크포인트에 대한 제어를 발휘하는 반면, p53 유전자는 G1/S 및 G2/M 체크포인트 둘 모두에서의 제어 기작의 트리거링에 있어서 중요한 역할을 한다.

일주기 시계는 세포 증식을 또한 조절한다

최근에, 세포 증식 조절에 있어서의 일주기 시계의 중요성이 인지되었다. 예를 들어,

"일주기 타이밍의 파괴는...세포 분열의 정상적인 조절에 있어서 장기적인 결과를 갖는다." (문헌[Reddy et al., 2005 Circadian clocks: neural and peripheral pacemakers that impact upon the cell division cycle. Mutation Research 574 76-91]).

"시계 구성요소가 세포 주기 조절 기구와 상호작용하는 기작에 대한 상세한 식견이 최근의 마우스 연구로부터 나왔다. 예를 들어,...간 조직의 제거 (부분적인 간 절제)와 유사분열의 후속적인 첫 번째 물결 사이의 지연은 수술이 수행된 날의 시점에 의존한다." (문헌[Vallone et al., 2007 Start the clock! Circadian rhythms and development. Developmental Dynamics 236 142-155]).

"시아노박테리아로부터 고등 척추 동물까지 밤 기간 동안 일어나는 세포 주기의 유사분열 및 S기를 "게이팅하는 (gating)" 일주기 시계의 많은 예가 있다." (발론 (Vallone) 등). [아마도, DNA 합성 및 유사분열이 태양으로부터의 해로운 UV 또는 기타 이온화 방사선으로부터 DNA를 보호하기 위하여 밤에 일어난다.]

따라서, 일주기 시계는 DNA 및 단백질 합성, 유사분열 및 세포질 분열, RNA 합성 및 복구의 세포 주기에 대하여 모든 것에 우선하는 영향을 발휘한다. 따라서, 환경 인자가 세포의 일주기 기작을 간섭할 경우, 세포 기능은 위태로워진다. 본 발명자는 처리가 세포 일주기 시계를 승차시키거나 다시 동시성을 지니게 할 수 있다면 또는 처리가 일주기 유전자 발현의 "정상적인" 수준을 회복시킬 수 있다면, 세포 기능은 개선될 수 있거나, 세포 손상은 촉진된 방식으로 복구될 수 있거나, 아폽토시스는 더욱 적시인 방식으로 일어날 수 있다고 주장한다.

환경은 일주기 리듬이 동시성을 지니는 것에서 벗어나게 할 수 있다

세포의 일주기 리듬을 조절하는 하나 이상의 유전자를 간섭하는 작용제 (agent)는 세포가 환경과 그리고 다른 세포와 동시성을 지니는 것에서 벗어나게 할 수 있다. 예를 들어, UV 노출 후 수시간 후에, 아마도 20시간만큼 많은 시간 후에, 인간 각질세포에서의 clock, bmal1 및 per1 유전자 발현 수준은 유의하게 하락한다 (도 1 참조). "유의하게 하락하다"는 상기에 기술된 바와 같이 이들 유전자가 그의 정상적인 일주기성 주기에서 경험하는 최소 발현보다 적음을 의미한다. 더욱이, UV 노출 후, 대략 사인 곡선형으로 기술될 수 있는 일반적인 유전자 발현 패턴이 손실된다.

도 1에서, 수평선은 clock 유전자 발현의 일반적인 평균 수준을 표시하며, UV 노출 후 약 44시간에서 출발하여 상기 선 주위에서 전형적인 일주기성 변동을 나타낸다. 이와는 대조적으로, UVB 노출 직후, 유전자 발현 수준은 정상보다 충분히 낮게 하강하며, 약 20시간 동안 정상 수준으로 되돌아가지 않았다. 상기 20시간 동안, 유전자 발현의 정상 패턴이 모든 3가지 유전자에 있어서 손실되었다. 그리고, 심지어 유전자 발현 수준이 정상 수준 근처로 되돌아갔을 때에도, 발현의 정상적인 사인 곡선형 패턴이 되돌아가는 데 있어서 약 20시간 내지 약 44시간의 기간이 필요하였다. 따라서 UV 노출은 실제로 2가지 효과를 가졌다. 하나의 효과는 일주기 유전자 발현 수준의 극적인 감소이며, 다른 하나는 패턴, 말하자면 그의 발현의 타이밍이다. UV 노출 후 0 내지 약 44시간에서, DNA 및 단백질 합성 타이밍, 유사분열 및 세포질 분열, RNA 합성 및 복구와 세포 예정사 (아폽토시스)가 모두 위태롭게 된다.

물론, UV 노출은 주간 동안, 특히 임계적인 오전 10시 내지 오후 2시의 윈도우 동안 일어난다. 이미 나타낸 바와 같이, 핵 중 PER 및 CRY 단백질의 농도는 일주기중 주간의 마지막에 최고이며, 그 시점에서 CRY 단백질은 CLOCK/BMAL1 헤테로이량체의 전사를 저해하는 작용을 한다. clock 및 bmal1 발현을 턴오프시키는 임계 농도에 도달하는 것에서의 임의의 지연은 일주기성 주기를 길어지게 한다. 따라서, UV 노출은 일주기성 주기를 길어지게 하는 경향이 있다. 이는 세포 주기가 환경과 동시성을 지니는 것에서 벗어나게 한다. DNA 복제 및 유사분열은 밤에 일어날 수 없으며, 이는 세포 복제에 최적이다. 또한, 일주기 유전자가 세포 주기에 대하여 발휘하는 게이팅 영향은 위협을 받을 수 있어서, DNA 손상은 탐지될 수 없거나 복구될 수 없으며, 딸세포에 넘어가게 될 수 있다.

시르투인(Sirtuin)은 유사분열의 개시를 지연시키는 것으로 보고된다

시르투인 1 (SIRT1 또는 사일런트 정보 조절자 2 오르토로그 1 (Silent information regulator two ortholog 1)로도 공지됨)은 스트레스에 응답하여 대사 및 세포 생존성을 조절하는 효소이다. 이것은 세포 장수와 결부되어 있다. SIRT1 효소를 암호화하는 sirt1 유전자는 일주기 유전자가 아니다. 츄아 (Chua) 등은 SIRT1이 세포 주기를 저지함으로써 복제성 노화를 촉진한다고 제안하였다 (문헌[Chua et al., (2005) Mammalian SIRT1 limits replicative life span in response to chronic genotoxic stress. Cell Metabolism 2, 67-76]).

미국 특허 제2009-0082278호 (그 전문이 본원에 참고로 포함됨)에는 이 유전자 및 그를 상향조절할 수 있는 국소 피부 조성물이 추가로 기술되어 있다. 단락 8-13에는

"본 출원인은 노화 과정 및 세포 보호에서 상당한 역할을 하는, 피부 세포의 기작에서의 새로운 단백질의 연루를 최근에 발견하였다."

"본 출원인은 SIRT 단백질, 더 정확하게는 SIRT1 단백질이 피부 세포에서 발현되었으며, 그의 발현은 피부 세포가 직면하는 상이한 스트레스에 관련되었음을 입증하였다. 본 출원인은 특히 상이한 작용제를 이용하여 이 단백질 발현의 유도가 세포 보호를 허용하고 세포가 스트레스 및 내인적 노화에 대항하는 것을 더 우수하게 돕는다는 것을 입증하였다."

"SIRT 단백질은 시르투인 패밀리의 일부이며, 히스톤 탈아세틸화에서 상당한 역할을 하는 NAD+ 의존성 핵 단백질이다. SIR 단백질을 암호화하는 SIR 유전자 (Silent Information Regulators)가 1979년에 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)에서 처음으로 기술되었다 (문헌[Rine J and A L, Genetics 1979]). 이후에, 씨. 엘레간스 (C. elegans)에서의 SIR2P 단백질의 과발현이 이 유기체의 수명을 증가시킴이 입증되었다 (문헌[Tissenbaum and A l., Nature 2001]). 이 연구는 이들 단백질이 장수에 관련된다는 가설을 세우는 것을 허용하였다."

"SIRT1 단백질은 가장 우수하게 특성화된 인간 시르투인이며, 다수의 전사 조절자와 상호작용한다. 인간 SIRT1 단백질은 p53 조절에 연루된 것으로 기술되었으며 (문헌[Cheng H L and A l. Proc Natl Acad Sci USA. 2003]), 더욱 최근에는 세포 노화의 조정자로서 기술되었다 (문헌[Langley E and A l., EMBO J. 2002]). 다른 인간 SIRT 단백질이 발견되었다 (SIRT2, SIRT3, SIRT4-7). 인간 SIRT2 단백질은 매우 적게 연구되었지만, 몇몇 연구는 p53 단백질의 조절에서의 그의 연루 (문헌[Vaziri H and A l., Cell. 2001])뿐만 아니라 유사분열 활성의 제어에서의 그의 역할 (문헌[Dryden S C and A l. Mol Cell Bio. 2003])도 입증하였다. 현재까지, 데아세틸라제 시르투인은 세포사 및 세포 생활 주기의 조절에서 중요한 역할을 하는 효소 패밀리인 것으로 간주된다 (문헌[Porcu M. and Chiarugi A, Trends Pharmacol Sci., 2005])."

"본 발명 [즉, 미국 특허 제2009-0082278호]은 피부 세포에서 SIRT 단백질의 합성을 활성화할 가능성이 있는 적어도 하나의 화합물을 화장용으로 허용되는 또는 제약상 허용되는 매질 중에 함유하는 화장 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 우선적으로, 본 발명에 따르면, 상기 화합물은 SIRT 단백질의 특정한 종류인 SIRT1 단백질을 활성화할 것이다."

"현재까지, 피부 세포에서 SIRT 패밀리의 단백질의 합성의 유도자로서의 역할을 하는 화합물의 사용은 결코 기술되지 않았다."라고 씌어져 있다.

본 명세서는 현재까지 sirt1 활성자를 일주기 유전자 활성자와 제휴하여 사용하는 것이 심지어 미국 특허 제2009-0082278호에도 결코 기술되지 않았음을 주장한다. 본 출원인의 지식이 미치는 한, 인간 표피 각질세포에서의 CLOCK 및 PER1 단백질의 수준 강하에 대처하는, 하나 이상의 비-일주기성, 유사분열 지연제를 함유하는 국소 조성물은 공지되어 있지 않다.

DNA 복구용 국소 조성물

세포 복구 과정을 촉진하기 위하여 피부에 적용하기 위한 국소 제품이 공지되어 있다. 예를 들어, 그러한 제품은 자연적인 세포 DNA 복구의 유효성을 향상시키기 위한 DNA 복구 효소, 각질세포 수화를 유지하기 위한 습윤제 (humectant) 성분, 피부 장벽 기능을 향상시키기 위한 보습 성분 등을 포함할 수 있다. 이들 성분은 각질세포가 그 자신을 복구하는 능력을 향상시킬 수 있는 반면, 항상 개선의 여지가 있다. 종래 기술과는 대조적으로, 본 발명은 손상된 DNA가 딸세포에 넘어가는 것을 저해하는 수단과 조합된, 피부 세포에서 미손상 일주기 단백질의 수준을 회복하는 수단 및 일주기 유전자 발현의 정상적인 패턴을 회복하는 수단을 제공한다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 적용될 경우 촉진된 방식으로 피부 세포에서의 일주기 단백질의 정상 수준을 회복시키고 일주기 유전자 발현의 정상 패턴을 회복시키는 국소 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 clock 및 per1 유전자 발현을 상향조절함으로써 그리고 피부 세포의 유사분열을 지연시킴으로써 광 손상된 및/또는 산화적으로 손상된 피부를 복구하는 국소 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 손상된 피부 세포 DNA의 증식 기회를 감소시키는 국소 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 환경적 공격자, 특히 UV 노출에 의해 손상된 피부 세포 DNA의 증식 기회를 감소시키는 국소 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 적어도 하나의 각질세포 clock 또는 per1 유전자 활성자, 적어도 비-일주기성, 유사분열 지연제, 및 임의로 적어도 하나의 DNA 복구 효소를 포함하는 피부 처리용 조성물을 제공하는 것이다.

개요

전술한 것 모두는 피부 세포에서 일주기 유전자 발현을 상향조절하는 적어도 하나의 작용제 및 피부 세포에서 유사분열을 지연시키는 적어도 하나의 비-일주기성 작용제를 함유하는 국소 조성물에 의해 충족된다. clock 유전자 및 per1 유전자를 상향조절하면서 (또는 활성화하면서) SIRT1의 수준도 증가시키는 작용제를 함유하는 조성물은 세포 생육성, 세포 장수를 상승작용적으로 촉진하며, 환경적 공격자로 인한 세포 손상을 저해하며, DNA 손상의 복구를 향상시키며, 손상된 피부 세포 DNA의 증식 기회를 상승작용적으로 감소시킨다는 것이 발견되었다. 임의로, 본 조성물은 하나 이상의 DNA 복구 효소를 함유한다.

본 발명의 바람직한 실시양태는 상기에 기술된 효과를 나타내는 국소 피부 조성물이다. 바람직하게는, 그러한 조성물은 하나 이상의 각질세포 clock 및 per1 유전자 활성자를 SIRT1 또는 하나 이상의 sirt1 활성자와 함께 함유한다. 바람직하게는 그러한 조성물은 사용이 용이하며, 유효하고, 화장용으로 허용되며, 화학적으로 안정하고 열역학적으로 안정하며 광에 안정하고, 국소용으로 안전하며, 부작용이 거의 없거나 전혀 없고, 개인 관리 시장에서 상업적으로 실현가능하다.

도면의 설명
도 1에는 UV 노출 후 72시간 동안 인간 각질세포에서의 clock, bmal1 및 per1 유전자 발현 수준이 도시되어 있다.
도 2에는 인간 각질세포 생존성에 대한 sirt1 활성자, 오르시르틴 (Orsirtine)^TM 및 레스베라트롤의 영향이 도시되어 있다.
도 3에는 sirt1 활성자, 오르시르틴^TM 및 레스베라트롤과 조합된 일주기 유전자 활성자의 영향이 도시되어 있다.

상세한 설명

본 출원인의 지식이 미치는 한, 세포 주기 저지를 촉진하기 위한 sirt1 활성자를 포함하는 국소 조성물을, 정상적인 일주기성 주기를 복구하기 위한 일주기 유전자 활성자의 국소 적용과 제휴하여 사용하는 것은 여태껏 기술되지 않았다.

정의

본원에 언급된 모든 백분율은 달리 나타내지 않으면 중량을 기준으로 한 백분율이다. 유전자와 관련하여, "활성화시키다" 및 "상향조절하다"라는 용어 또는 어원학상 관련된 용어는 유전자에 의해 암호화되는 하나 이상의 단백질의 발현을 야기하는 성분을 의미한다.

"시계 유전자"라는 용어는 당해 문헌에서 때로 소위 "정준" 일주기 유전자들 중 임의의 것을 나타내기 위하여 사용되며, 이는 clock, bmal1, period 및 cryptochrome 유전자를 포함한다. 본 명세서에서, "clock" (이탤릭체)은 항상 CLOCK 단백질을 암호화하는 유전자를 나타낸다. 총칭적으로, 유전자 clock, bmal1, period 및 cryptochrome는 본원에서 "일주기 유전자"로 칭해진다.

"DNA 복구 효소"라는 용어는 DNA 염기 돌연변이 유발 손상을 복구할 수 있는 효소를 의미한다. 흔히 그러한 효소는 그가 복구하는 DNA 손상의 유형에 의해 분류된다. 예를 들어, 염기 절제 복구 (base excision repair, BER) 효소, 뉴클레오티드 절제 복구 (nucleotide excision repair, NER) 효소; 미스매치 복구 (mismatch repair, MMR) 효소; DNA 헬리카제; DNA 폴리머라제 등. 예를 들어, 8-옥소-7,8-디히드로-2'-데옥시구아노신과 같은 돌연변이는 OGG1 (8-옥소구아닌 글리코실라제)에 의해 복구될 수 있다. T-T 이량체는 뉴클레오티드 절제 복구 효소, 포토라이아제에 의해 복구될 수 있다. 6-4 광생성물은 NER에 의해 복구될 수 있다. 06-메틸 구아닌은 06-알킬 구아닌 트랜스퍼라제 (AGT)에 의해 복구될 수 있다.

피부 또는 피부 세포와 관련하여 "복구"는 각질세포 생육성, 강도 및 장수가 일반적으로 개선됨을 의미한다. 복구의 예는 UV광, 연기 또는 기타 환경적 공격자로 인한 세포 수화 손실의 역전 및 손상된 각질세포 DNA의 복구를 포함한다.

"국소용으로 안전한"은 화장품의 안전성을 규정하는 모든 지역 및 지방의 규제에 따름을 의미한다. "화장용으로 허용되는"은 조성물의 외관, 느낌 및 냄새가 당업계의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 소비자의 용인의 한계 이내임을 의미한다. "화학적으로 안정한", "열역학적으로 안정한" 및 광에 안정한"은 제조로부터 6개월 이상의 기간 (더 바람직하게는 3년)까지 조성물이 여전히 화장용으로 허용가능하게 남아있음을 의미한다. "개인 관리 시장에서 상업적으로 실현가능한"은 조성물의 분배 및 제조 비용이 개인 관리 산업에서 이미 경험된 것보다 많지 않아야 함을 의미한다.

CLOCK 및 PERIOD1 의 상향조절

본 발명의 조성물은 clock 및/또는 per1 각질세포 유전자를 상향조절하는 적어도 하나의 작용제를 함유한다. 이들 작용제의 제안된 농도는 최종 조성물의 총 중량에 대하여 총 약 0.000001 내지 약 40%, 바람직하게는 약 0.000005 내지 35%, 더 바람직하게는 약 0.00001 내지 25%의 범위이다. 일반적으로, 이들 범위는 유효량으로 이해될 수 있다. "유효량"은 환경 공격하의 인간 피부에 적용되는 국소 조성물 중 이들 작용제의 농도가 각질세포 생존률을 5% 이상만큼 개선시키기에 충분함을 의미한다. 적합한 clock 또는 per1 활성자는 식물 추출물, 폴리펩티드, 펩티드, 아미노산 등에 존재할 수 있다.

특히 바람직한 clock 및/또는 per1 유전자 활성자는 하기 화학식 I의 펩티드를 포함한다.

<화학식 I>

여기서,

이며,

X₁은 트레오닌 또는 세린을 나타내거나, 0이고,

X₂는 이소류신 또는 류신 또는 프롤린 또는 발린 또는 알라닌 또는 글리신을 나타내거나 0이며,

AA는 임의의 아미노산 또는 그의 유도체를 나타내고, n 및 p는 (0과 4를 포함하여) 0과 4 사이의 정수이며,

R₁은 자유이거나, 또는 아세틸기, 벤조일기, 토실기 또는 벤질옥시카르보닐기로부터 선택될 수 있는 보호기에 의해 치환된, N-말단 아미노산의 1차 아민 관능기를 나타내고;

R₂는 C₁ 내지 C₂₀ 알킬쇄 또는 NH₂, NHY 또는 NYY기 (이때 Y는 C₁ 내지 C₄ 알킬쇄를 나타냄)로부터 선택될 수 있는 보호기에 의해 치환된 C-말단 아미노산의 카르복실 관능기의 히드록실기를 나타내며,

화학식 I의 서열은 약 3 내지 약 13개의 아미노산 잔기를 포함한다.

화학식 I의 서열은 아미노산 X₁ 및 X₂가 다른 화학적으로 등가인 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있으며, 여기서, 아미노산은 알라닌 (A), 아르기닌 (R), 아스파라긴 (N), 아스파르트산 (D), 시스테인 (C), 글루탐산 (E), 글루타민 (Q), 글리신 (G), 히스티딘 (H), 이소류신 (I), 류신 (L), 리신 (K), 메티오닌 (M), 페닐알라닌 (F), 프롤린 (P), 세린 (S), 트레오닌 (T), 트립토판 (W), 티로신 (Y) 및 발린 (V)이다.

화학식 I의 더 바람직한 버전은 하기와 같이 펩티드이다.

더 바람직한 것은 S-T-P-NH₂ 펩티드, 서열 4 또는 그의 혼합물이다. 가장 바람직한 것은 아이에스피-빈사이언스 (ISP-Vinscience)에 의해 상표명 크로놀룩스 (Chronolux)^？로 제조된 펩티드이며, 이는 INCI명이 트리펩티드 (Tripeptide)-32이다.

관련 출원인 미국 특허 출원 제12/367,705호의 도 1, 도 2 및 도 3과, 상기 도면을 설명하는 텍스트는 특히 적어도 하나의 DNA 복구 효소와 조합될 때 UV 유도된 스트레스에 대하여 각질세포 생존성을 향상시키는 크로놀룩스^？의 능력을 입증한다.

clock 및 per1 유전자 활성자를 동시에 적용하면 유익한 결과가 생성됨이 즉각적으로 명백한 것은 아니다. 무엇보다도, 정상적인 일주기 리듬에서, CLOCK 및 Period1 단백질의 세포중 농도는 일치하지 않는다. 그럼에도 불구하고, 유익한 결과가 달성된다. 환경적 공격하의 피부 세포는 CLOCK 및 PERIOD1 단백질 수준 면에서 그렇게 감소되어서, 이득은 가능한한 빠르게 상기 둘 모두의 단백질을 상향조절함으로써 달성된다고 제안될 수 있다.

시르투인1 상향조절

예기치 않게도 본 출원인은 clock 및 per1 각질세포 유전자 활성자의 적용에 의해 달성된 유익한 결과가 각질세포 sirt1 활성자와 조합될 때 변경되고 때로는 유의하게 개선됨을 밝혀냈다. SIRT1은 세포 주기의 저지를 유발하는 경향이 있다. 일주기 기작의 복잡성 및 세포 주기와의 그의 조절적 상호작용이 주어진다면, 이것은 세포 주기 저지를 유발하면서 그와 동시에 일주기 단백질의 정상적인 수준을 회복시키는 것이 유익하다는 종래 기술로부터 예상되지 못하였을 수 있다.

임의의 한 이론에 구애되고자 함이 없이, PER1은 일주기 감독을 통한 것 이외의, 세포 주기에서의 직접적인 효과를 가짐이 인식된다. 예를 들어, PER1은 일주기의 핵심 구성요소로서의 그의 역할은 별도로 하고서도, ATM 키나제 경로를 활성화할 수 있어서 세포 주기를 저지하는 것으로 보고되고 있다. ATM (돌연변이된 모세혈관 확장성 운동 실조증 (Ataxia telangiectasia)) 키나제는 DNA 이중 가닥 절단에 응답하여 모집되는 핵 단백질 키나제이다. ATM 키나제는 세포 주기 저지 및 유사분열로의 지연된 진입에 연루된 세포 주기 체크포인트 조절자인 CHK1 및 CHK2를 인산화시킨다. PER1이 일부 환경적 스트레스의 결과로서 덜 발현될 때, 세포 주기 저지는 일어나지 않을 수 있거나 지연될 수 있다. 따라서, 유사분열 또는 세포질 분열 전에 손상 DNA에 대하여 복구를 초래하기에는 시간이 불충분할 수 있다. 이와 동시에, PER1의 감소된 발현은 감소된 아폽토시스에 연결되었다. 따라서, 사멸되어야 하는 손상된 세포는 생존 및 분열할 수 있다. 따라서, 환경적 스트레스가 세포 주기를 저지하지 못하는 PER1 수준의 비정상적 감소 및 손상된 DNA의 전파에 이르게 되는 감소된 아폽토시스에 이르게 될 경우, per1 활성화가 그 문제를 바로잡을 것으로 기대될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 각질세포 생육성은 sirt1 유전자 활성자가 clock 및 per1 유전자 활성자와 조합되어 사용될 때 유의하게 향상됨이 본 발명자에 의해 관찰되었다. 임의의 한 이론에 구애되고자 함이 없이, 이러한 관찰은 per1 단독의 활성화는 손상된 DNA가 딸세포에 전파될 수 있기 전에 복구를 초래하기에 충분히 빠르게 PER1의 수준을 회복시키지는 못함을 내포할 수 있다.

"SIRT1 활성자"는 SIRT1 단백질, 특히 DNA 또는 RNA와 같은 전구체의 양성 제어에 연루된 분자의 내인적 생성을 지지할 가능성이 있는 임의의 화합물을 의미한다. 피부 세포에서 SIRT1 단백질의 합성을 활성화시킬 가능성이 있는 이들 화합물 중, 폴리페놀과 같은 상이한 분자가 기술되었다. 더욱 구체적으로는 트랜스-스틸벤의 유도체 (예컨대 레스베라트롤, 피세아타놀), 칼콘의 유도체 (예컨대 이소리퀴리티게닌, 부테인), 및 플라본의 유도체 (예컨대 피스테인, 루테올린, 쿠에르세틴)가 언급될 수 있다. 적어도 하나의 DNA 복구 효소와 조합된 레스베라트롤 또는 레스베라트롤 유도체의 효능이 관련 특허 출원인 미국 특허 출원 제11/837,658호에 예시되었다. 그러나, 특정 펩티드는 피부에서의 펩티드에 대한 그의 내인적의 구조적 유사성으로 인하여 바람직한 sirt1 활성자이다. 더욱 더 바람직한 것은 펩티드성 활성자(들)와 레스베라트롤의 상승작용적 조합물이다 (이것에 대한 추가의 것은 하기에 있음).

펩티드성 sirt 1 활성자

피부에서의 펩티드에 대한 그의 내인적인 구조적 유사성으로 인하여 펩티드가 바람직한 sirt1 활성자이다. 펩티드 성질의 화합물 중에서, 펩티드 결합에 의해 함께 연결된 2가지 이상의 아미노산의 모든 서열뿐만 아니라 단백질 단편, 펩티드 및 폴리펩티드 단편, 펩티드도 언급될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 펩티드 단편은 크기가 3 내지 50개의 아미노산, 더욱 특히는 3 내지 10개의 아미노산의 범위이다. 이들 펩티드 단편 모두는 생물학적 활성을 갖는다. 바람직한 펩티드는 하기이다.

여기서, (AA)는 임의의 특정 아미노산 또는 그의 유도체이며, n은 (0과 3을 포함하여) 0과 3 사이의 정수이다. 특히 바람직한 펩티드는 하기이다.

이 펩티드는 오르시르틴^TM GL (INCI명: 물 (및) 글리세린 (및) 오리자 사티바 (Oryza Sativa) (쌀) 추출물)로 입수가능하며, 이는 아이에스피 빈시언스 (ISP Vincience)로부터 입수가능하다. 본 발명의 조성물에서, 펩티드성 SIRT1 활성자는 최종 조성물의 총 중량에 대하여 대략 0.000001% 내지 20%의 양, 바람직하게는 약 0.0001 내지 5%의 양으로 존재한다.

레스베라트롤 및 그의 유도체

3,5,4'-트리히드록시스틸벤으로도 칭해지는 레스베라트롤은 적포도, 나무딸기, 블루베리 및 특정한 기타 식물 딸기류 또는 추출물에 존재하는 폴리히드록시-치환된 스틸벤 화합물이며, 이는 하기 일반식을 갖는다.

레스베라트롤은 효과적인 항산화제인 것으로 밝혀졌으며, 또한 강한 항증식 및 항염증 특정을 나타낸다. 레스베라트롤은 다양한 유기체, 예컨대 효모, 회충, 과실 파리, 단명 어류 및 마우스에서의 칼로리 제한 (caloric restriction, CR)을 모방하고, 그러한 유기체에서의 노화 과정을 늦추고, 그의 수명을 연장시킬 수 있는 것으로 최근에 보고되었다. 임의의 특정 이론에 구애되고자 함이 없이, 본 발명의 발명자는 레스베라트롤이 세포 증식을 감소시키고 아폽토시스 과정을 늦춤으로써 세포에서의 DNA 손상 복구를 위한 더 많은 시간을 허용할 수 있다고 생각한다. 레스베라트롤은 DNA 복구 효소와 조합될 때 세포의 천연 DNA 복구 잠재력을 증대시키거나 또는 다르게는 향상시키는 것에 대하여 상승 효과를 생성할 수 있다고 가정된다.

그러나, 레스베라트롤은 특정한 화장 제형에서 잠재적으로 불안정할 수 있다. 구체적으로, 레스베라트롤은 수성-기재의 제형에서 가수분해되기 쉬우며, 그러한 제형이 변색되게 할 수 있다. 수성-기재의 제형에서의 레스베라트롤의 불안정성에 대처하는 한 가지 방법으로는 화장 제형에서 더욱 안정한 레스베라트롤 유도체를 형성하도록 3, 5 및 4' 위치의 히드록시기를 다른 관능기로 치환함으로써 레스베라트롤을 개질시키는 것이 있다. 그러한 유도체가 레스베라트롤에 비하여 바람직하다. 무기 산, 유기 카르복실산, 모노사카라이드, 디사카라이드 또는 폴리사카라이드, 또는 기타 관능기의 레스베라트롤 유도체는 수성-기재의 제형에서 더욱 안정함이 발견되었다. 치환기는 레스베라크롤의 보호 및 안정화하여 레스베라트롤 유도체가 수성-기재의 화장 제형에서 사용하기에 더욱 적합해지도록 하는 기능을 한다. 또한 치환기는 피부에의 적용시, 바람직하게는 피부 표면 상의 효소 및 기타 성분에 의해 화합물로부터 용이하게 가수분해되어 레스베라트롤의 활성 형태가 피부 내로 방출되게 할 수 있다. 본 발명의 레스베라트롤 유도체는 하기 일반식을 갖는다.

여기서, X, Y 및 Z는 수소 또는 보호기이되, 단, X, Y 및 Z 중 적어도 하나는 보호기이다. 본 발명의 화장 조성물 또는 국소 조성물에서 사용하기에 적합한 예시적인 레스베라트롤 유도체가 이하에 더욱 상세하게 기술되어 있다.

A. 무기 또는 유기 산의 레스베라트롤 에스테르

X, Y 및 Z 중 하나 이상이 무기 산 관능기, 예컨대 포스페이트, 니트레이트, 술포네이트 및 카르보네이트인 무기 산의 레스베라트롤 에스테르가 본 발명에서 사용될 수 있다. 하기는 본 발명의 실행에 특히 적합한 예시적인 무기 산 에스테르의 목록이다.

상기에 열거된 레스베라트롤 에스테르의 제약상 허용되는 염도 본 발명의 화장 조성물에서 사용될 수 있다. 그러한 염은 Na, K, Mg, Ca, Fe 및 NH₄로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 1가 또는 2가 양이온을 포함할 수 있다. 염은 상응하는 염기, 예컨대 수소화나트륨, 수소화칼륨 등을 레스베라트롤 에스테르 함유 용액 내에 첨가함으로써 형성시킬 수 있다.

레스베라트롤의 무기 산 에스테르는 페놀 또는 폴리페놀의 히드록실기를 포스페이트, 술포네이트 및 카르보네이트 관능기로 치환하는 공지된 화학 공정에 의해 쉽게 형성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4003966호에는 페놀을 선택적으로 인산화하여 그의 포스페이트 에스테르를 형성하는 1단계 공정이 기술되어 있으며, 상기 미국 특허의 내용은 사실상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 실행에 특히 바람직한 레스베라트롤 유도체는 하기 화학식을 갖는 레스베라트롤 트리포스페이트 에스테르로도 칭해지는 3,4',5-트리포스페이트 스틸벤이다.

레스베라트롤 트리포스페이트을 포함하는 레스베라트롤의 포스페이트 에스테르가 국제 특허 공개 제WO 2006/029484A1호에 개시되어 있으며, 상기 국제 특허 공개는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 레스베라트롤 트리포스페이트는 국제 특허 공개 제WO 2006/029484A1호의 실시예 2에 나타낸 방법에 의해 합성될 수 있다. 더 구체적으로는, 100 ml의 아세토니트릴 중 레스베라트롤 (3,4,5-트리히드록시스틸벤) (25 mmol, 5.7 g) 및 디메틸아미노피리딘 (7.5 mmol, 0.93 g)의 용액을 질소하에 최대 -10℃까지 냉각시킨다. 10분 후 사염화탄소 (375 mmol, 36.2 ml) 및 DIEA (159 mmol; 27.7 ml) 및 상기 혼합물을 교반하에 30분 동안 유지한다. 디벤질포스페이트 (113 mmol, 25.0 ml)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가로 12시간 동안 교반시킨다. 반응 코스를 TLC (실리카 F254, 용출제: 80/20 (v/v)의 에틸 아세테이트/n-헥산)로 모니터링한다. 1리터의 0.5 M KH₂PO₄를 첨가하고, 그 후 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출한다. 생성된 생성물인 트리(디벤질포스페이트) 레스베라트롤은 실리카 겔 상에서 여과시키고, 먼저 에틸 아세테이트/n-헥산 (80/20 (v/v))의 혼합물로 세척하여 임의의 잔류 미반응 레스베라트롤을 제거하고 그 후 메탄올로 세척함으로써 여과하여 황색 오일을 얻는다.

0℃의 200 mL의 무수 DCM 중 트리(디벤질포스페이트) 레스베라트롤 (12.5 mmol)에 브로모메틸실란 (79 mmol, 10.4 mL)을 첨가한다. 2시간 후, 300 mL의 H₂O를 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 교반시킨다. 수상을 에틸 아세테이트로 다시 세척하고, 그 후 동결건조시켜 오렌지색 오일을 수득한다.

400 mL의 에탄올에 용해시킨 상기에서 수득된 생성물에 CH₃ONa (37 mmol; 2.03 g)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 12시간 동안 교반시킨다. 에탄올을 로타베이퍼 (rotavapor)에서 증발시키고, 잔류물을 H₂O에 용해시킨다. 수상을 에틸 아세테이트로 세척하고, 동결건조시킨다. 생성된 백색 고형물의 질량 스펙트럼에 의하면 레스베라트롤 트리포스페이트 (PM = 468.1)이 존재함이 나타나며, 이때 레스베라트롤과 관련하여 총 수율은 90% 초과이다.

요망될 경우, 레스베라트롤 트리포스페이트는 유기 또는 무기 염기, 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨 등에 의해 중화될 수 있다. 특히 바람직한 것은 레스베라트롤 트리포스페이트를 수산화나트륨으로 중화시켜 트리나트륨 레스베라트롤 트리포스페이트를 형성하는 경우이다. 또한 레스베라트롤 트리포스페이트는 아지노모토 (Ajinomoto)로부터 중화된 형태로 구매될 수 있으며, 이는 CTFA명이 트리나트륨 레스베라트롤 트리포스페이트이다.

B. 레스베라트롤의 카르복실산 에스테르

본 발명에서 사용될 수 있는 레스베라트롤 유도체의 또 다른 군으로는 X, Y 및 Z 중 하나 이상이 -C(O)-R₁ 기인 레스베라트롤과 지방족 또는 방향족 카르복실산의 에스테르가 있으며, 여기서, R₁은 선형, 분지형, 포화 또는 불포화, 또는 환형 C₁-C₄₀ 알킬, 치환 C₁-C₄₀ 알킬, C₁-C₄₀ 알케닐, 치환 C₁-C₄₀ 알케닐, C₁-C₄₀ 알키닐, 치환 C₁-C₄₀ 알키닐, 아릴, C₁-C₄₀ 아릴 및 C₁-C₄₀ 치환 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 일 실시양태에서, R 기는 직쇄 또는 분지쇄 지방, 또는 C₆-₃₀, 포화 또는 불포화 알킬기이다. 치환체는 C₁ _-40 직쇄 또는 분지쇄, 포화 또는 불포화 알킬, 할로겐 (예컨대 플루오로), 수소, 알콕시, 히드록실 등으로부터 선택될 수 있다.

레스베라트롤의 에스테르의 형성에 사용될 수 있는 예시적인 카르복실산은 포화 모노카르복실산, 예컨대 아세트산, 프로피온산, 부티르산 (C4), 발레르산, 헥산산, 카프릴산 (C8), 라우르산, 스테아르산 (C18), 이소스테아르산 (분지형 C18), 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산 (C14), 아라키드산 (C20), 아라키돈산, 에루식산, 베헨산 (C22), 라우르산 (C12), 카프릭산 (C10), 카프로익산 (C6), 및 팔미트산 (C16); 불포화 모노카르복실산, 예컨대 아크릴산, 메타크릴산, 소르브산, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 도코사헥사엔산, 및 에이코사펜타엔산; 아미노산, 예컨대 아르기닌, 글루타민 및 티로신; 케토산, 예컨대 피루브산 및 아세토아세트산; 방향족 카르복실산, 예컨대 아스코르브산, 벤조산, 살리실산, 및 페룰산; 디- 및 트리-카르복실산, 예컨대 옥살산, 말론산, 말산, 숙신산, 및 글루타르산을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. "C", 이어서 숫자의 표기는 알킬쇄 내의 탄소 원자의 개수를 나타낸다.

하기는 본 발명의 실행에 특히 적합한 레스베라트롤의 예시적인 카르복실산 에스테르의 목록이다.

레스베라트롤의 카르복실산 에스테르의 한 가지 특히 바람직한 군으로는 레스베라트롤의 포화 또는 불포화 지방산 에스테르, 예컨대 레스베라트롤 부티레이트, 레스베라트롤 발레레이트, 레스베라트롤 헥사노에이트, 레스베라트롤 소르베이트, 레스베라트롤 라우레이트, 레스베라트롤 스테아레이트, 레스베라트롤 팔미테이트, 레스베라트롤 올레에이트, 레스베라트롤 리놀레에이트, 레스베라트롤 리놀레네이트, 레스베라트롤 에이코사펜타에노에이트, 및 레스베라트롤 도코사헥사노에이트가 있다. 레스베라트롤의 그러한 지방산 에스테르는 미국 특허 제6,572,882호에 기술된 바와 같이 알칼리 수성 매질에서 소튼-바우만 (Schotten-Baumann) 반응에 따라 레스베라트롤을 산 유도체로 에스테르화함으로써 쉽게 형성될 수 있으며, 상기 미국 특허의 내용은 사실상 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

레스베라트롤의 카르복실산 에스테르의 또 다른 특히 바람직한 군으로는 레스베라트롤의 방향족 카르복실산 에스테르, 예컨대 레스베라트롤 페룰레이트가 있으며, 이는 수성 매질에서 레스베라트롤을 페룰산과 반응시킴으로써 형성될 수 있다.

C. 레스베라트롤 에테르 유도체

본 발명에서 사용될 수 있는 레스베라트롤 유도체의 또 다른 군으로는 X, Y 및 Z 중 하나 이상이 -R₂인 레스베라트롤 에테르가 있으며, 여기서, R₂는 선형, 분지형 또는 환형 C₁-C₄₀ 알킬, 치환 C₁-C₄₀ 알킬, C₁-C₄₀ 알케닐, 치환 C₁-C₄₀ 알케닐, C₁-C₄₀ 알키닐, 치환 C₁-C₄₀ 알키닐, C₁-C₄₀ 아릴, 치환 C₁-C₄₀ 아릴, 및 모노사카라이드, 디사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하기는 본 발명의 실행에 특히 적합한 예시적인 레스베라트롤 에테르의 목록이다.

본 발명의 구체적인 일 실시양태에서, 메톡시-치환된 레스베라트롤 유도체가 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 인디언 키노 트리 (Indian Kino Tree) (프테로카르푸스 마르수피움 (Pterocarpus marsupium))로부터 추출될 수 있고 상표명 프테로스틸벤 (PTEROSTILBENE)으로 미국 미주리주 세인트 루이스의 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich)로부터 구매가능한 3,5- 디메톡시-4'-히드록시스틸벤을 함유할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체적인 실시양태에서, 레스베라트롤 유도체는 하나 이상의 사카라이드-함유 보호기, 예컨대 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프룩토스, 수크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스 등을 포함한다. 예를 들어, 폴리고눔 쿠스피다툼 (polygonum cuspidatum) 조직 또는 비티스 비니페라 (vitis vinifera) 세포의 시험관내 배양물과 같은 식물 물질 또는 식물로부터의 추출에 의해 수득될 수 있는 레스베라트롤 글루코시드가 본 발명의 화장 조성물에서 사용된다.

D. 레스베라트롤의 질소-함유 유도체

본 발명의 조성물에서 사용되는 레스베라트롤 유도체는 하나 이상의 질소-함유 관능기를 또한 포함할 수 있으며, 즉, 상기 식에서 A, B 및 C 중 하나 이상은 아미드, 아민, 이민, 아미딘 및 카르복사미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하기는 본 발명의 실행에 특히 적합한 예시적인 레스베라트롤 에테르의 목록이다.

바람직하게는, 본 발명의 레스베라트롤 유도체는, 존재할 경우 단독으로 또는 DNA 복구 효소 및/또는 하나 이상의 추가의 피부 관리 활성자와 조합되어 피부 진피 내로의 그의 더욱 효과적인 전달을 위하여 리포좀 내에 캡슐화된다. 레스베라트롤 유도체는 전체 조성물의 총 중량을 기준으로 본 발명의 화장 조성물에 약 0.001% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 0.005% 내지 약 90%, 더 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 20%의 범위의 양으로 존재할 수 있다.

DNA 복구 효소

본 발명의 조성물은 적어도 하나의 DNA 복구 효소를 임의로 함유한다. 이는 적어도 하나의 DNA 복구 효소가 필요하고 sirt1 활성자의 사용을 고려하지 않는 미국 특허 출원 제11,837,658호와는 다르다. 임의의 DNA 복구 효소의 제안된 농도는 최종 조성물의 총 중량에 대하여 약 0.00001 내지 약 35%, 바람직하게는 약 0.00005 내지 약 30%, 더 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 25%이다.

미국 특허 제5,077,211호; 미국 특허 제5,190,762호; 미국 특허 제5,272,079호; 및 미국 특허 제5,296,231호에 개시된 DNA 복구 효소가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합하며, 상기 미국 특허 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 그러한 DNA 복구 효소의 일례가 에이지아이/더마틱스 (AGI/Dermatics)로부터 상표명 록시좀즈 (Roxisomes)^？로 구매될 수 있으며, 이것의 INCI명은 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis Thaliana) 추출물이다. 이것은 단독으로 존재하거나 레시틴 및 물과의 혼합물로 존재할 수 있다. 이 DNA 복구 효소는 8-옥소-디구아닌 염기 돌연변이 손상의 복구에 효과적인 것으로 공지되어 있다.

사용될 수 있는 DNA 복구 효소의 또 다른 유형으로는 06-메틸 구아닌 염기 돌연변이 손상의 복구에 효과적인 것으로 공지된 것이 있다. 이것은 에이지아이/더마틱스에 의해 상표명 아다좀즈 (Adasomes)^？로 판매되며, 이것의 INCI명은 락토바실루스 (Lactobacillus) 발효물이고, 이는 단독으로 또는 레시틴 및 물과의 혼합물로 본 발명의 조성물에 첨가될 수 있다.

사용될 수 있는 DNA 복구 효소의 또 다른 유형으로는 T-T 이량체 복구에 효과적인 것으로 공지된 것이 있다. 이 효소는 생물학적 또는 식물학적 물질들의 혼합물로 존재한다. 그러한 성분의 예가 에이지아이/더마틱스에 의해 상표명 울트라좀즈 (Ultrasomes)^？ 또는 포토좀즈 (Photosomes)^？로 판매된다. 울트라좀즈^？는 마이크로코쿠스 (Micrococcus) 용해물 (다양한 종의 미구균의 제어된 용해의 최종 산물), 레시틴 및 물의 혼합물을 포함한다. 포토좀즈 (Photosomes)^？는 플랑크톤 추출물 (이는 하기 유기체 중 하나 이상을 포함하는 해양 바이오매스 (biomass)의 추출물임: 해수 플랑크톤 (thalassoplankton), 녹색 마이크로조류, 규조류, 녹색을 띤 청색의 그리고 질소를 고정하는 해초), 물 및 레시틴의 혼합물을 포함한다.

DNA 복구 효소의 또 다른 유형으로는 다양한 불활성화 박테리아 용해물, 예컨대 비피다 (Bifida) 용해물 또는 비피다 발효물 용해물의 성분일 수 있으며, 후자는 비피도 (Bifido) 박테리아를 배양하고, 불활성화시키고, 그 후 붕해시킬 때의 세포질 분획물 및 대사 산물을 포함하는, 비피도 박테리아 유래의 용해물이다. 이 물질의 INCI명은 비피다 발효물 용해물이다.

다른 적합한 DNA 복구 효소는 엔도뉴클레아제 V를 포함하며, 이는 박테리오파지 T4의 denV 유전자에 의해 생성될 수 있다. 또한 적합한 것은 T4 엔도뉴클레아제; O⁶-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제; 포토라이아제, 예컨대 우라실- 및 하이포잔틴-DNA 글리코실라제; 피리미딘 제거 (apyrimidinic)/퓨린 제거 (apurinic) 엔도뉴클레아제; DNA 엑소뉴클레아제, 손상 염기 글리코실라제 (예를 들어, 3-메틸아데닌-DNA 글리코실라제); 단독 또는 복합체 형태 (예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli) uvrA/uvrB/uvrC 엔도뉴클레아제 복합체)의 코르엔도뉴클레아제; "APE"로 흔히 칭해지는 다기능성 DNA 복구 효소인 APEX 뉴클레아제; 디히드로폴레이트 리덕타제; 말단 트랜스퍼라제; 토포이소머라제; O⁶ 벤질 구아닌; DNA 글리코실라제이다.

적합한 DNA 복구 효소의 다른 유형은 촉진되는 복구의 유형에 의해 분류될 수 있으며, BER (염기 절제 복구 (base excision repair)) 또는 BER 인자 효소, 예컨대 우라실-DNA 글리코실라제 (UNG); 단일 가닥 선택성 1기능성 우라실 DNA 글리코실라제 (SMUG1); 3,N(4)-에테노시토신 글리코실라제 (MBD4); 티민 DNA-글리코실라제 (TDG); A/G-특이적 아데닌 DNA 글리코실라제 (MUTYH); 8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제 (OGG1); 엔도뉴클레아제 III-유사체 (NTHL1); 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다제 (MPG); DNA 글리코실라제/AP 라이아제 (NEIL1 또는 2); AP 엔도뉴클레아제 (APEX 1 및 2), DNA 리가제 (LIG3), 리가제 보조 인자 (XRCC1); DNA 5'-키나제/3'-포스파타제 (PNKP); ADP-리보실트랜스퍼라제 (PARP1 또는 2)를 포함할 수 있다.

DNA 복구 효소의 또 다른 카테고리는 손상을 직접적으로 역전시키는 것으로 생각되는 것, 예컨대 O⁶-MeG 알킬 트랜스퍼라제 (MGMT); 1-meA 디옥시게나제 (ALKBH2 또는 ALKBH3)를 포함한다.

DNA/단백질 가교결합을 복구하기 위하여 작동가능한 효소의 또 다른 카테고리는 Tyr-DNA 포스포디에스테라제 (TDP1)를 포함한다.

또한 적합한 것은 MMR (미스매치 절제 복구 (mismatch exision repair)) DNA 복구 효소, 예컨대 MutS 단백질 동족체 (MSH2); 미스매치 복구 단백질 (MSH3); mutS 동족체 4 (MSH4); MutS 동족체 5 (MSH5); 또는 G/T 미스매치-결합 단백질 (MSH6); DNA 미스매치 복구 단백질 (PMS1, PMS2, MLH1, MLH3); 감수분열 후 분리 증가 2-유사 단백질 (Postmeiotic segregation increased 2-like protein, PMS2L3); 또는 감수분열 후 분리 증가 2-유사 4 위유전자 (postmeiotic segregation increased 2-like 4 pseudogene, PMS2L4)이다.

또한 적합한 것은 뉴클레오티드 절제 복구 (nucleotide excision repair, NER) 효소로 공지된 것인 DNA 복구 효소이며 이는 색소성 건피증 그룹 C-상보 단백질 (Xeroderma pigmentosum group C-complementing protein, XPC); RAD23 (에스. 세레비지애 동족체 (RAD23B); 칼트락틴 이소형 (CETN2); RFA 단백질 1, 2 또는 3 (RPA1, 2 또는 3); 3'에서 5'으로의 DNA 헬리카제 (ERCC3); 5'에서 3'으로의 DNA 헬리카제 (ERCC2); 베이직 전사 인자 (basic transcription factor) (GTF2H1, GTF2H2, GTF2H3, GTF2H4, GTF2H5); CDK 활성화 키나제 (CDK7, CCNH); 시클린 G1-상호작용 단백질 (MNat1); DNA 절제 복구 단백질 ERCC-51; 절제 복구 상호 상보 1 (excision repair cross-complementing 1, ERCC1); DNA 리가제 1 (LIG1); ATP-의존성 헬리카제 (ERCC6) 등과 같은 것을 포함한다.

또한 적합한 것은 상동 재조합을 용이하게 하는 카테고리의 DNA 복구 효소일 수 있으며, 이는 DNA 복구 단백질 RAD51 동족체 (RAD51, RAD51L1, RAD51B 등); DNA 복구 단백질 XRCC2; DNA 복구 단백질 XRCC3; DNA 복구 단백질 RAD52; ATPase (RAD50); 3' 엑소뉴클레아제 (MRE11A) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

DNA 폴리머라제인 DNA 복구 효소가 또한 적합하며, 이는 DNA 폴리머라제 베타 서브유닛 (POLB); DNA 폴리머라제 감마 (POLG); DNA 폴리머라제 서브유닛 델타 (POLD1); DNA 폴리머라제 II 서브유닛 A (POLE); DNA 폴리머라제 델타 보조 단백질 (PCNA); DNA 폴리머라제 제타 (POLZ); MAD2 동족체 (REV7); DNA 폴리머라제 에타 (POLH): DNA 폴리머라제 카파 (POLK) 등을 포함한다.

흔히 편집 (editing) 및 프로세싱 (processing) 뉴클레아제로 칭해지는 다양한 유형의 DNA 복구 효소는 3'-뉴클레아제; 3'-엑소뉴클레아제; 5'-엑소뉴클레아제; 엔도뉴클레아제 등을 포함한다. DNA 복구 효소의 다른 예는 ATP DNA 헬리카제 등과 같은 것을 포함하는 DNA 헬리카제를 포함한다. DNA 복구 효소는 식물 추출물, 박테리아 용해물, 생물 물질 등의 성분으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 식물 추출물은 DNA 복구 효소를 포함할 수 있다.

실시예 1: Sirt 1 활성자 ( 오르시르틴 ^TM 및 레스베라트롤 )는 각질세포 생존성을 상승작용적으로 향상시킨다

오르시르틴^TM (

) 및 레스베라트롤, 유사분열 지연제를 UVB 조사한 인간 각질세포의 생존성을 향상시키는 그의 능력에 대하여 시험하였다.

방법:

정상적인 인간 각질세포를 인간 각질세포 성장 보충제를 포함하는 에피라이프 (Epilife) 배지에서 배양하였다. 세포를 96웰 플레이트 (코스타 (Costar)) 내로 계대배양하였다. 각질세포를 레스베라트롤 (25 μM) 및 오르시르틴 (1%, 3%) 단독으로 그리고 레스베라트롤 (25 μM) 및 오르시르틴^TM (3%)의 복합물 중에서 전처리하였다. 각질세포를 희석하지 않은 복합물로 그리고 1:2, 1:4 및 1:8 (복합물 : 에피라이프 배지)의 희석물로 처리하였다.

각질세포를 37℃; 5% CO₂에서 하룻밤 이들 처리제와 함께 인큐베이션하였다. 24시간 후, 처리제를 흡인하고, 각질세포를 D-PBS에서 1회 세척하였다. 100 ㎕의 D-PBS를 조사를 위하여 첨가하였다. 세포를 0, 45, 90 및 135 mJ/cm²의 UVB에서 UVB로 조사하였다. 조사 후, D-PBS를 제거하였다. 각질세포를 적절하게 후처리하고, 37℃; 5% CO₂에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 다음날, 세포를 MTS 시약 (셀타이터96 (CellTiter96), 프로메가 (Promega))을 이용하여 생육성에 대하여 분석하였다. 흡광도 판독치는 37℃; 5% CO2에서 대략 2시간 인큐베이션한 후 490 nm에서 스펙트라맥스 190 (SpectraMax 190) 분광광도계 (몰레큘러 디바이시즈 (Molecular Devices))에서 취하였다.

결과 및 결론:

도 2를 참조하면, 낮은 UV 조사량 (45 mJ/cm²)에서 세포는 강한 손상을 나타내지 않음이 문서화되었으며, 따라서 생존능의 향상은 사소한 것으로 기대되었다. 그러나, 본 발명자가 관찰한 것은, 단지 레스베라트롤로 처리한 세포는 20% 감소 생존률을 나타내고 단지 오르시틴^TM 3%로 처리한 세포는 8% 감소 생존률을 나타낸다는 것이었다. 그럼에도 불구하고, 1:2로 희석한 복합물 (레스베라트롤 25 μM 및 오르시르틴^TM 3%)로 처리하거나 희석하지 않은 복합물로 처리한 세포를 대조와 동일하게 시험하였다. 또한, 복합물을 1:4, 그 후 1:8로 희석시키면 생존능은 감소하였다. 따라서, 레스베라트롤 단독, 및 오르시르틴 3% 단독은 세포 생존성을 감소시켰다. 그러나, 레스베라트롤과 오르시르틴 3%의 조합물은 세포 생존성을 감소시키지 않았다. 그러나 상기 조합물은 대조에 비하여 세포 생존률을 향상시킬 수 있을까?

90 mJ/cm²의 UV 조사량에서, 미처리 세포의 생존률은 47%였다. 이와 비교하여, 희석되지 않은 그리고 희석된 복합물 (레스베라트롤 25 μM 및 오르시르틴^TM 3%)로 처리한 세포의 생존능은 하기와 같이 용량 의존적 관계를 따랐으며:

한편, 단지 오르시르틴^TM 또는 단지 레스베라트롤로 처리한 세포의 생존능은 하기와 같았다.

135 mJ/cm²의 UV 조사량에서, 미처리 세포의 생존률은 19%였다. 이와 비교하여, 희석되지 않은 그리고 희석된 복합물로 처리한 세포의 생존능은 하기와 같이 용량 의존적인 것과 유사한 관계를 따랐으며:

복합물 (레스베라트롤 25 μM 및 오르시르틴^TM 3%)은 UVB 유발된 세포독성에 대하여 유의한 보호를 제공하였고 레스베라트롤 및 오르시르틴^TM 단독에 비하여 세포 생존성을 증가시켰다고 결론지을 수 있었다.

또한 이들 수는 각질세포 생존능에 대한 오르시르틴^TM 및 레스베라트롤의 조합물의 영향이 상승작용적임을 시사하는 것으로 보였다. 예를 들어, 3% 오르시르틴^TM 단독은 생존능을 (90 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 11%만큼, 그리고 (135 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 26%만큼 증가시켰다. 25 μM 레스베라트롤 단독은 (90 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 생존능을 15%만큼 감소시켰고 (135 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 생존능을 22%만큼 증가시켰다. 그러나, 희석하지 않은 조합물인 3% 오르시르틴^TM 및 25 μM 레스베라트롤은 거대한 그리고 기대되지 않은 64%만큼 (90 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 및 131%만큼 (135 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 각질세포 생존능을 증가시켰다. 심지어 1:8로 희석시킬 때, 상기 조합물은 각질세포 생존능을 28%만큼 (90 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 및 11%만큼 (135 mJ/cm²의 UVB에 대하여) 여전히 증가시켰다. 이는 전적으로 기대되지 않은 것이었다. 오르시르틴^TM은 공지된 시르투인 활성자이고 레스베라트롤은 의심되는 시르투인 활성자이기 때문에, 각질세포 생존능의 엄청난 향상은 당업계의 숙련자에 의해 기대되지 않았다. 기껏해야 부가 효과가 기대되었을 수 있지만, 상승 효과는 아니었다.

및 레스베라트롤의 어떠한 상대적인 농도가 각질세포 생존성에 대하여 상당한 상승 효과를 생성할 것인가? 이 물음에 대해서는 일상적인 실험에 의해 답할 수 있으며, 현재 그 효과는 확인하였다. "sirt1 활성자 및 레스베라트롤의 상승작용적 조합물"은

및 레스베라트롤 또는 그의 유도체의 조합물을 의미하며, 이는 개별적으로 각각의 물질의 효과의 합보다 큰 양만큼 각질세포 생존률 (그와 같이 생존률은 당업계에 공지된 방법에 의해 측정함)을 증가시켰다.

실시예 2: 올바른 농도의 SIRT1 활성자는 UVB 노출과 관련하여 DNA 복구 효소 및 일주기 유전자 활성자의 성능을 향상시킨다

실시예 1에 기술한 방법에 따라 두 복합물을 UV 노출 후 각질세포 생존성에 대한 그의 영향에 대하여 다양한 희석비로 시험하였다. 복합물 I은 록시좀 (0.05%), 아다좀 (0.05%), 비피더스 (Bifidus) 추출물 (12.4%), 크로놀룩스 (0.1%) 및 인간 각질세포 성장 보충제를 포함하는 에피라이프 배지로 이루어졌다. 복합물 II는 복합물 I + 오르시르틴^TM (0.08%) 및 레스베라트롤 (25 μM)로 이루어졌다. 복합물 I을 희석하지 않고서 그리고 1:2 및 1:4 (복합물:에피라이프 배지)로 희석시켜 시험하였다. 복합물 II를 희석하지 않고서 그리고 1:2, 1:4 및 1:8로 희석시켜 시험하였다. 배지를 대조로 사용하였다. 각질세포를 100, 150 및 200 mL/cm²의 수준으로 UVB에 노출시켰다.

결과 및 결론:

도 3을 참조하면, 그리고 동일 UVB 내에서 복합물 II를 복합물 I과 비교하면 다음과 같았다.

두 가지를 제외한 모든 경우에 있어서, 오르시르틴^TM 및 레스베라트롤은 일주기 유전자 활성자 단독과 비교하여 UVB 노출 후 각질세포 생존성을 향상시켰다. 그러나, 첫 번째의 두 컬럼 (100 mJ/cm²)으로 내려가면, 이들 데이터는 일주기 유전자 활성자와 조합된 sirt1 활성자가 더 적으면 더 좋음을 시사하는 것으로 보였다. 그러나, 상기 패턴은 컬럼 2 및 3 (150 mJ/cm² 및 200 mJ/cm²)에서 파괴되며, 이는 sirt1과 일주기 유전자 활성자의 최적 조합이 각질세포가 노출되는 UVB의 양에 의존적임을 시사하였다. 사실상, 좌측으로부터 우측으로 줄 3을 가로질러 이동하면 (희석하지 않음), 데이터는 오르시르틴^TM 및 레스베라트롤의 첨가가 더 많은 양의 UVB 노출에 대하여 보증함을 시사하는 것이었다. 상기 패턴은 1:2의 희석 샘플에서도 보이지만, 1:4의 희석 샘플에서는 역전되었으며, 이는 더욱 적은 UVB 노출에서 더 적은 sirt1 활성화가 필요함을 시사하는 것이었다. 따라서, 총체적으로 취하면, 이들 실험의 결과는 일주기 유전자 활성자와 sirt1 활성자의 최적의 상대적인 농도가 UVB 노출량에 의존함을 시사하였다. 그러나, 모든 복합물 II 시험 샘플 (일주기성 활성자 + sirt1 활성자)은 대조에 비하여 각질세포 생존능의 향상을 나타냈다. 일주기 유전자 활성자 및 sirt1 활성자의 최적의 상대적인 농도의 결정은 단지 일상적인 실험을 필요로 할 수 있지만, 현재 당업계의 숙련자라면 상대적인 농도가 결과-유효 변수임을 알고 있으며, 이는 지금까지는 공지되지 않은 것이었다.

조성물

본 발명의 조성물의 형태는 일반적으로 한정되지 않는다. 예를 들어 본 발명의 조성물은 에멀젼, 수성 용액 또는 분산액, 겔 또는 무수 시스템의 형태일 수 있다. 에멀젼의 형태일 경우, 조성물은 유중수 또는 수중유 에멀젼일 수 있다. 에멀젼의 형태일 경우, 조성물은 약 1-99%, 바람직하게는 약 5-90%, 더 바람직하게는 약 10-85%의 물 및 약 1-99%, 바람직하게는 약 5-90%, 더 바람직하게는 약 5-75%의 오일을 포함할 수 있다. 수성 현탁액 또는 분산액의 형태의 경우, 조성물은 일반적으로 약 1-99.9%, 바람직하게는 약 5-95%, 더 바람직하게는 약 10-90%의 물을 함유할 수 있으며, 이때 나머지 성분은 활성 성분 또는 기타 제형 성분이다.

바람직하게는 본 조성물은 화장용으로 허용되는 또는 제약상 허용되는 생성물을 제공할 다른 성분을 함유한다. 그러한 성분류는 습윤제, UVA 및 UVB 선스크린, 계면활성제, 식물 추출물, 생물 물질, 수성상 구조화제 (즉, 폴리사카라이드, 아크릴레이트 중합체, 고분자량 PEG 또는 폴리글리세린), 휘발성 및 비휘발성 오일 (실리콘을 포함함), 비타민 및 항산화제를 포함할 수 있다.

일주기 유전자 활성자 및 sirt1 활성자는 별도의 조성물 형태로 존재하며 이는 피부의 동일 영역에 연속적으로 적용될 수 있거나, 유효량의 각각의 조성물을 분배하고, 조성물들을 혼합하고 그 후 이 혼합물을 피부에 적용함으로써 적용할 수 있음이 또한 가능하다.

바람직한 조성물

바람직한 조성물은 수성 용액 또는 에멀젼 형태로 있으며, 적어도 하나의 비이온성 유기 계면활성제, 적어도 하나의 화학적 선스크린, 적어도 하나의 clock 또는 per1 유전자 활성자, 적어도 하나의 펩티드성 sirt1 활성자 및 적어도 하나의 DNA 복구 효소를 함유한다. 적어도 하나의 식물 추출물 및 적어도 하나의 오일이 또한 바람직할 수 있다.

더 바람직한 것은 비이온성 유기 계면활성제가 알콕실화 알콜이고, 화학적 선스크린이 UVB 선스크린이고, clock 또는 per1 각질세포 유전자 활성자가 트리펩티드-32이고, sirt1 활성자가 오르시르틴^TM-유사 분자와 레스베라트롤의 조합물이고, DNA 복구 효소가 아라비돕스 탈리아나 (Arabidopsis Thaliana) 추출물, 마이크로코쿠스 (Micrococcus) 용해물, 비피다 (Bifida) 발효 용해물, 락토바실루스 (Lactobacillus) 발효물, 및 플랑크톤 추출물의 혼합물이고, 상기 적어도 하나의 오일이 유기 에스테르 또는 탄화수소인 조성물이다.

본 발명의 방법

본 발명의 방법은 주로 인간 각질세포, 바람직하게는 얼굴 각질세포에 대한 손상을 복구시키는 것에 관한 것이며, 상기 손상은 환경적 공격자에 응답하여 일어난다. 한 가지 방법은 손상된 인간 피부에 적어도 하나의 각질세포 clock 또는 per1 유전자 활성자 및 적어도 하나의 sirt1 활성자를 포함하는 조성물 또는 조성물들을 적용하는 것으로 이루어진다. 임의로, 본 방법의 조성물(들)은 적어도 하나의 DNA 복구 효소를 포함할 수 있다. 손상이 일어난 후 조성물을 적용함으로써 정상적인 일주기성 주기가 더욱 빠르게 회복된다. 그러나, 유사분열 이전에 세포 주기가 저지되는 것은 DNA 복구에 더 많은 시간을 허용한다. 이 방법에 의하면, 상당한 세포 손상이 딸세포에 넘어가는 것으로부터 견제되고/되거나 역전된다. 또한 이 방법은 각질세포 생육성 및 장수를 향상시킨다.

또한 본 발명은 인간 각질세포, 바람직하게는 얼굴 각질세포에 대한 손상을 예방 또는 저해하는 방법에 관한 것이며, 이 손상은 환경적 공격자에 응답하여 일어난다. 본 방법은 환경적 손상을 경험할 위험이 있는 인간 피부에 적어도 하나의 각질세포 clock 또는 per1 유전자 활성자 및 적어도 하나의 sirt1 활성자를 포함하는 조성물 또는 조성물들을 적용하는 것으로 이루어진다. 임의로, 본 방법의 조성물(들)은 적어도 하나의 DNA 복구 효소를 함유할 수 있다. 손상이 일어나기 전에 조성물을 적용함으로써 정상적인 일주기성 주기가 더욱 면밀히 유지될 수 있으며, 정상적인 세포 주기 복구 과정이 더욱 면밀히 유지될 수 있다. 이 방법에 의하면, 상당한 세포 손상이 딸세포에 넘어가는 것을 견제하고/하거나 방지한다. 또한 이 방법은 각질세포 생육성 및 장수를 향상시킨다.

본 발명의 방법에서, 조성물(들)은 피부에 일일 1회 이상 적용될 수 있다. 예를 들어, 조성물(들)은 매일의 활동을 시작하기 전 아침에 및/또는 잠자리에 들기 직전 밤에 피부에 적용될 수 있다. 이들 시점이 바람직하며, 그 이유는 일반적으로 피부가 가장 적은 양의 환경적 공격하에 있기 때문인데, 이는 피부 세포 복구가 최대화될 수 있음을 의미한다. 이들 시점에서 "잠자리에 들기 직전" 또는 "밤잠 직전"은 취침전 1시간 이내, 더 바람직하게는 취침전 30분 이내를 의미한다. 아침은 오히려 예방적 접근법인 반면, 잠자리에 들기 직전 또는 저녁은 오히려 복구 접근법이다. 조성물(들)은 요법의 일부로서 적용할 수 있으며, 즉, 피부를 클렌징하고, 토너로 처리하고, 그 후 본 발명의 조성물(들)을 적용한다. 조성물(들)은 클렌저, 토너 및 본 발명의 조성물(들)을 포함하는 키트의 일부일 수 있다.

바람직하게는 조성물(들)은 DNA 손상된 각질세포를 복구하고 피부의 전반적인 개선을 제공하기 위하여 잠자리에 들기 직전에 얼굴 및/또는 목의 피부 및 데콜테에 적용된다. 잠자리에 들기 직전 밤에 얼굴 피부 처리를 위하여 사용되는 조성물에서 clock 및 per1 유전자 활성자를 sirt1 활성자 (바람직하게는, DNA 복구 효소)와 조합하는 것은 DNA 손상의 각질세포 복구를 최대화하며, 또한 세포 생육성, 장수 및 건강을 촉진한다.

상기에 나타낸 바와 같이, 일주기 유전자 활성자 및 sirt1 활성자는 별도의 조성물 형태로 존재하는 것이 또한 가능하다. 상기의 경우, 본 발명의 방법은 동일한 피부 영역에 각각의 조성물을 연속적으로 적용하거나 유효량의 각각의 조성물을 분배하는 단계, 조성물을 혼합하는 단계, 및 그 후 혼합물을 피부에 적용하는 단계를 포함한다.

실시예

본 발명을 하기 실시예와 관련하여 추가로 기술하며, 하기 실시예는 예시 목적으로만 나타낸다. 피부 처리 조성물을 하기와 같이 제조할 수 있다.

실시예 1

실시예 2 내지 실시예 4

clock 유전자 활성자 (크로놀룩스^？, 트리펩티드-32)를 함유하지만 sirt1 활성자(들)는 함유하지 않는 제1 피부 처리 조성물을 제형 A에 따라 제조할 수 있었다 (실시예 2). clock 유전자 활성자 (크로놀룩스^？) 및 sirt1 활성자 (오르시르틴^TM 및 레스베라트롤)를 함유하는 제2 피부 처리 조성물을 제형 B에 따라 제조할 수 있었다 (실시예 3). sirt1 활성자 (오르시르틴^？)를 함유하지만 일주기 유전자 활성자는 함유하지 않는 제3 피부 처리 조성물을 제형 C에 따라 제조할 수 있었다 (실시예 4). 조성물들은 성분들을 합하고 잘 혼합하여 액체를 형성함으로써 제조하였다. 조성물들을 갈색 유리병애 보관할 수 있었다.

조성물 A는 일주기 유전자 활성자 및 sirt1 활성자, 오르시르틴^TM 및 레스베라트롤을 함유하였다. 따라서, 조성물 A를 단독으로 사용하고자 하였다. 조성물 B는 크로놀룩스^？ (일주기 유전자 활성자)를 함유하지만 sirt1 유전자 활성자는 함유하지 않았다. 따라서 조성물 B는 sirt1 유전자 활성화 능력을 갖는 별도의 조성물, 예컨대 조성물 C와 함께 사용하고자 하였다.

본 발명을 바람직한 실시양태와 관련하여 기술하였지만, 이는 나타낸 특정 형태에 본 발명의 범주를 한정시키려는 것은 아니다. 이와는 대조적으로, 이러한 설명은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 사상 및 범주 내에 포함될 수 있는 그러한 대안, 변경 및 등가물을 커버하고자 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Maes, Daniel H. Pernodet, Nadine A. Mammone, Thomas Slutsky, Lenny Collins, Donald F. Goldgraben, Kerri Pelle, Edward McCarthy, James T. <120> Skin Repair Compositions Comprising Circadian Gene Activators And A Synergistic Combination Of Sirt1 Gene Activators <130> 09.11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK and/or PER1 gene activator <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or no amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5) <223> Xaa can be threonine or serine or no amino acid <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> Xaa can be isoleucine, leucine, proline, valine, alanine, glycine or no amino acid <220> <221> misc_feature <222> (10)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or no amino acid <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Thr Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK and/or PER1 gene activator <400> 2 Tyr Val Ser Thr Pro Tyr Asn 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK and/or PER1 gene activator <400> 3 Val Ser Thr Pro Glu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK and/or PER1 gene activator <400> 4 Leu His Ser Thr Pro Pro 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK and/or PER1 gene activator <400> 5 Arg His Ser Thr Pro Glu 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CLOCK and/or PER1 gene activator <400> 6 His Ser Thr Pro Glu 1 5 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 gene activator <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or no amino acid <220> <221> misc_feature <222> (11)..(13) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or no amino acid <400> 7 Xaa Xaa Xaa Gly Leu Tyr Asp Asn Leu Glu Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SIRT1 gene activator <400> 8 Gly Leu Tyr Asp Asn Leu Glu 1 5

Claims

적어도 하나의 각질세포 일주기 (circadian) 유전자 활성자 및 적어도 하나의 각질세포 sirt1 유전자 활성자를 포함하는 피부 관리 조성물.
제1항에 있어서, 각질세포 일주기 유전자 활성자가 3 내지 13개의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 포함하는 하기 화학식 I의 것인 조성물.
<화학식 I>

[상기 식에서,
X₁은 트레오닌, 세린을 나타내거나 0이고;
X₂는 이소류신, 류신, 프롤린, 발린, 알라닌, 글리신을 나타내거나 0이며;
AA는 임의의 아미노산 또는 그의 유도체를 나타내고;
n 및 p는 0 내지 4의 정수이며;
R₁은 자유이거나, 또는 아세틸기, 벤조일기, 토실기 또는 벤질옥시카르보닐기로부터 선택될 수 있는 보호기에 의해 치환된, N-말단 아미노산의 1차 아민 관능기를 나타내고;
R₂는 C₁ 내지 C₂₀ 알킬쇄 또는 NH₂, NHY 또는 NYY기 (이때 Y는 C₁ 내지 C₄ 알킬쇄를 나타냄)로부터 선택될 수 있는 보호기에 의해 치환될 수 있는, C-말단 아미노산의 카르복실 관능기의 히드록실기를 나타내며;
화학식 I의 서열은 아미노산 X₁ 및 X₂가 다른 화학적으로 등가인 아미노산으로 치환된 것을 포함할 수 있음].
제2항에 있어서, 일주기 유전자 활성자가

및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제3항에 있어서, 일주기 유전자 활성자가 트리펩티드 (Tripeptide)-32를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 각질세포 sirt1 유전자 활성자가 하나 이상의 트랜스-스틸벤 또는 그의 유도체, 각질세포 sirt1 유전자를 활성화시킬 수 있는 하나 이상의 펩티드 또는 그의 조합물인 조성물.
제5항에 있어서, 레스베라트롤과 하기 화학식 II의 펩티드의 상승작용적 조합물을 포함하는 조성물.

(상기 식에서,
(AA)는 임의의 특정 아미노산 또는 그의 유도체이며;
n은 0 내지 3의 정수임).
제6항에 있어서, 펩티드가

인 조성물.
최종 조성물의 총 중량에 대하여 0.00001 내지 25%의 트리펩티드-32;
최종 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 내지 5%의
; 및
최종 조성물의 총 중량에 대하여 0.001 내지 약 95%의 레스베라트롤
을 포함하는 피부 관리 조성물.
제8항에 있어서, 최종 조성물의 총 중량에 대하여 0.0001 내지 25%의 적어도 하나의 DNA 복구 효소를 추가로 포함하는 조성물.
제9항에 있어서, DNA 복구 효소가 염기 절제 복구 (base excision repair, BER) 효소, 뉴클레오티드 절제 복구 (nucleotide excision repair, NER) 효소, DNA 폴리머라제, DNA 헬리카제, 미스매치 복구 (mismatch repair, MMR) 효소 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제9항에 있어서, DNA 복구 효소가 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis Thaliana) 추출물, 락토바실루스 (Lactobacillus) 발효물, 마이크로코쿠스 (Micrococcus) 용해물, 플랑크톤 추출물, 비피다 (Bifida) 발효물 용해물 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
각질세포 손상 위험이 있는 피부에 0.00001 내지 25%의 적어도 하나의 각질세포 일주기 유전자 활성자를 포함하는 조성물을 적용하는 단계; 및
각질세포 손상 위험이 있는 피부에 0.0001 내지 5%의 적어도 하나의 각질세포 sirt1 유전자 활성자를 포함하는 조성물을 적용하는 단계
를 포함하는, 환경적 공격자로 인한 인간 각질세포에 대한 손상을 저해하는 방법.
제12항에 있어서, 적어도 하나의 각질세포 일주기 유전자 활성자 및 적어도 하나의 각질세포 sirt1 유전자 활성자가 연속적으로 적용되는 별도의 조성물 형태로 존재하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 적어도 하나의 각질세포 일주기 유전자 활성자 및 적어도 하나의 각질세포 sirt1 유전자 활성자가 화학적으로 안정하고 열역학적으로 안정하며 광에 안정하고 국소용으로 안전한 단일 조성물의 일부이고, 부작용이 거의 없거나 전혀 없으며, 개인 관리 시장에서 상업적으로 실현가능한 것인 방법.
얼굴에 0.00001 내지 25%의 적어도 하나의 각질세포 일주기 유전자 활성자를 포함하는 조성물을 적용하는 단계; 및
얼굴에 0.0001 내지 5%의 적어도 하나의 각질세포 sirt1 유전자 활성자를 포함하는 조성물을 적용하는 단계
를 포함하는, 환경적 공격자로 인한 인간 각질세포에 대한 손상을 복구하는 방법.
제15항에 있어서, 일주기 및 sirt1 유전자 활성자를 취침전 30분 이내에 적용하는 방법.
제15항에 있어서,
인간 피부의 일부를 클렌징하는 단계;
그 후 피부의 일부에 토너를 적용하는 단계; 및
그 후 일주기 및 sirt1 유전자 활성자를 적용하는 단계
를 포함하는 방법.
화학식 II의 화합물 및 레스베라트롤 또는 그의 유도체의 상승작용적 조합물을 포함하는, 화학적으로 안정하고 열역학적으로 안정하며 광에 안정하고 국소용으로 안전한 국소 조성물.
인간 각질세포에 대한 UVB 손상을 복구하기 위한 제1항에 따른 조성물의 용도.
인간 각질세포에 대한 UVB 손상을 복구하기 위한 제18항에 따른 조성물의 용도.
제1항에 있어서,
폴리사카라이드, 아크릴 중합체 또는 그의 혼합물을 포함하는 적어도 하나의 수성상 구조화제;
알콕실화 알콜인 적어도 하나의 비이온성 유기 계면활성제; 및
C2-4 알킬렌 글리콜 또는 글리세린인 적어도 하나의 습윤제 (humectant)
를 추가로 포함하는 조성물.