CN106361590A - 一种用于衰老基因表达调控的组合物及其在化妆品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于衰老基因表达调控的组合物及其在化妆品应用，属于化妆品和生物工程技术交叉领域。本发明用于衰老基因表达调控的组合物含有下述组分：小肽，白藜芦醇，β‑羟基‑β‑甲基丁酸盐；所述组合物还包括聚肌苷酸‑聚胞苷酸和/或亮氨酸。本发明用于衰老基因表达调控的组合物够激活HSF1及其编码的HSPs，通过直接激活抗衰老酶通路或者间接调控抗衰老、抗凋亡信号通路激活的方式减缓肌体衰老。

Description

一种用于衰老基因表达调控的组合物及其在化妆品中的应用
技术领域
本发明涉及一种用于衰老基因表达调控的组合物及其在化妆品中的应用，尤其涉及一种以HSF1及HSPs为靶点的衰老基因表达调控的组合物及其在化妆品中的应用。
背景技术
应激(stress)是细胞应对生存环境中多种不利因素的反应,温度变化、蛋白质错误折叠、氧化性损伤及病毒入侵都可以引起细胞应激，它通过改变机体内稳态,启动相应信号传导途径,引起一系列分子事件，产生广泛而深刻的影响。
应激反应的典型特征之一是激活细胞热应激因子(heat shock factor,HSF)，进而表达一种或数种热激蛋白(heat shock protein,HSP)。热激转录因子是一类高度保守的蛋白，其在细胞生长、发育以及应激反应和疾病进程中都发挥重要作用。在人类基因组中，已发现4个热激转录因子基因，已知热激转录因子1(HSF1)在热激反应中起关键作用，热激转录因子2(HSF2)在发育和神经分化中起作用，热激转录因子4(HSF4)则对晶状体形成非常重要。体内的HSF1可被多条压力通路激活，包括热激、蛋白错误折叠、重金属、氧应激等。在应激条件下，HSF1发生磷酸化形成活性三聚体，入核与热激因子效应区(heat shockelement,HSE)结合，激活/抑制相应基因表达。
HSF1调控了应激表达网络，约占人类全基因组3％的基因座在热激条件下被HSF1结合，其可与暂停的聚合酶Ⅱ结合，募集转录延伸因子P-TEFb、Cdk9-Cyclin T二聚体，以形成新的转录延伸复合物。Rawat和Mitra通过凝胶迁移实验(EMSA)也已证实HSF1可以激活绝大多数衰老相关基因，是衰老的重要调控因子。
由HSF1编码的热激蛋白(heat shock proteins，简称HSP)是生物体在高温、盐渍、干旱、渗透胁迫等环境条件下诱导合成的一类应激蛋白。其在细胞内起分子伴侣功能，参与新生肽链折叠、蛋白质组装与转运。同时，在细胞发生应激反应时，热激蛋白还可以与那些由于环境刺激而自身构象发生改变的蛋白相互作用，防止非特异性蛋白聚集，维持信号转导蛋白的活性。HSPs属于高度保守蛋白，约占细胞总蛋白的5-20％。其根据分子量大小分类为6类：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子HSPs。
HSP90家族成员即使在无胁迫的条件下，在真核生物体内也有一定量的表达，是真核生物必不可少的因子。从晶体结构来看，HSP90的N末端是一个二聚体，由含有一个配基“口袋”的αβ三明治结构组成，其一侧是一高度扭曲的，有8条链组成的β折叠，另一侧则被9条α螺旋所覆盖，在螺旋的中心有一个“口袋”，β折叠的表面透过这个“口袋”形成一个ATP/ADP结合域。现已明确这个25kD的N-末端具有格尔德霉素结合位点和根赤霉素结合位点。HSP90是一种钙结合蛋白，其N末端可使C末端二聚化，而C末端具有钙调蛋白结合位点，同时也是蛋白激酶、肌动蛋白、微管蛋白及类固醇激素受体等信号转到蛋白的结合位点。HSP90其主要功能为胞内信号传导。如它可与甾体受体结合并维持一种特定的构型，当受体与甾体激素结合后，HSP90从复合物中游离出来。
HSP70家族则是研究最多的一类热激蛋白，在生物体内分布最广，进化上最保守的一类蛋白质。HSP70具有两个主要的结构域，N端是高度保守的44kD结构域，且是ATP结合区，C端是25kD的肽链识别结合区。其中C末端又可分为一个保守的15kD多肽结合功能域和一个不保守的近C端10kD的可变功能域。DnaK(HSC70)的底物结合功能域和部分可变功能域重组片段的结构主要由两部分组成，N端折叠成一个紧密的β三明治结构；C端由5个α螺旋组成，形成一个松弛的α螺旋结构。N端部分的β三明治结构由底部和上部2个片层结构组成，每个片层结构都含有4条反向平行的β折叠链，其中三明治结构底部片层结构由4条链组成，而上部的片层结构由另外4条链组成。在生物体内，热激蛋白主要是充当分子伴侣的角色，参与新生肽的跨膜运输和折叠。在酵母体内，含有两种HSP70的成员SSa和SSc，分别在细胞浆和细胞核内表达。肽链刚产生时，依赖ATP酶的活性与SSa集合，当穿过线粒体膜时，进入线粒体内与体内合成的SSc结合，当ATP水解后，将结合的SSa释放，在依赖Mg-ATP酶的条件依赖HSP60、HSP10分子伴侣的帮助下完成折叠并释放到线粒体内。同时HSP70也参与胞内信号转导过程。
上述HSP分子在不同的环境和信号通路中参与了细胞衰老、凋亡的调控过程。例如HSP90与IKKα结合，曾强了IKK活性，降解胞内IκB，激活NF-κB，抑制了细胞凋亡。而HSP70通过激活HSF1参与了抗衰老基因激活的过程。除此以外，HSP还广泛参与机体免疫以及能量代谢过程，通过调控相关因子减少细胞损伤，减缓细胞衰老。
总体而言，HSF1及其编码的HSPs以直接激活抗衰老酶通路或者间接调控抗衰老、抗凋亡信号通路激活的方式参与了细胞衰老进程。这类因子尚未开发但有广阔前景的靶点，但目前，国内外都未见有调控HSF1及其编码的HSPs阻止或延缓细胞衰老与死亡的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种用于衰老基因表达调控的组合物，该组合物具有激活HSF-1及HSP转录的功能。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述组合物的化妆品及上述组合物在化妆品中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于衰老基因表达调控的组合物，含有下述组分：小肽，白藜芦醇，β-羟基-β-甲基丁酸盐；所述组合物还包括聚肌苷酸-聚胞苷酸(Poly(I:C))和/或亮氨酸。
本发明的组合物由于包含特异应激信号激活小肽和抗衰老途径激活剂，其能高效激活HSF-1及HSP转录的功能，实现体外HSF-1及HSP的高效调控。HSF-1及其转录的热激蛋白HSPs密切参与抗衰老酶表达及活性调节过程，该过程通过激活体内应激效应因子，特异激活抗氧化、抗凋亡途径，达到抗衰老的目的。体内HSF-1活性的增加，可以竞争协同转录增强子NF-κB，从而特异增加腺苷酸环化酶、Sirt1和Sirt3活性，同时协同HSPs协助蛋白折叠和保护特性，激活抗衰老酶途径。
本发明的组合物获得方便，且易于通过皮下渗透吸收。
作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的更优选实施方式，所述组合物中各组分的重量份为：小肽3.0～5.0份，白藜芦醇0.030～0.6份，β-羟基-β-甲基丁酸盐0.1～4.0份，聚肌苷酸-聚胞苷酸0.6～4.0份，亮氨酸0.6～4.0份。
作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的更优选实施方式，所述白藜芦醇为0.035～0.5重量份，所述β-羟基-β-甲基丁酸盐为0.2～3.0重量份。当白藜芦醇与β-羟基-β-甲基丁酸盐为特定的重量份时，二者产生协同作用，本发明组合物调控衰老基因表达的效果更佳。
作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的更优选实施方式，所述白藜芦醇为0.035～0.5重量份，所述亮氨酸为0.75～3.0重量份。当白藜芦醇与亮氨酸为特定的重量份时，二者产生协同作用，本发明组合物调控衰老基因表达的效果更佳。
作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的优选实施方式，所述小肽由JKB-A1和JKB-A2组成，所述JKB-A1与JKB-A2的重量比为2：1；所述JKB-A1为Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro(SEQ ID：5)所示的序列组成的小肽，所述JKB-A2为Glu-Glu-Lys-Ala-Asn(SEQ ID：6)所示的序列组成的小肽。
作为本发明所述用于衰老基因表达调控的组合物的优选实施方式，所述组合物还含有烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、鸢尾素中的至少一种。
另外，本发明还提供了一种含有上述组合物的化妆品。上述组合物在化妆品中的用量为美容有效量。
作为本发明所述化妆品的优选实施方式，所述化妆品还包含辅料。其中，辅料为化妆品领域中常用的辅料，例如：防腐剂、抗氧化剂、保湿剂等，且本领域技术人员可根据化妆品的剂型、用途等按照常规选择适宜的辅料用量。
本发明的化妆品可制成很多种形式，例如，包括溶液、混悬液、乳状液、膏、油膏、凝胶、霜、洗剂、粉、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、乳状液粉底、蜡状粉底和喷雾剂。具体而言，可以将本发明的化妆品可制成以下形式：营养液、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜等。
最后，本发明还提供了上述用于衰老基因表达调控的组合物在化妆品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明用于衰老基因表达调控的组合物够激活HSF-1及其编码的HSPs，通过直接激活抗衰老酶通路或者间接调控抗衰老、抗凋亡信号通路激活的方式减缓肌体衰老。
附图说明
图1为本发明用于衰老基因表达调控的组合物处理的HeLa细胞系中，HSF-1及其编码的HSPs的相对表达水平图；
图2为本发明用于衰老基因表达调控的组合物激活抗衰老酶通路关键基因mRNA表达水平的检测结果图；
图3为经实施例1～9所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对比例1所述组合物处理的HeLa细胞系中，HSF-1的相对表达水平图；
图4为经实施例1～9所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对比例1所述组合物处理的HeLa细胞系中，HSP-27的相对表达水平如图4所示。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例中，JKB-A1为Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro(SEQ ID：5)所示的序列组成的小肽，JKB-A2为Glu-Glu-Lys-Ala-Asn(SEQ ID：6)所示的序列组成的小肽。
实施例1
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物含有下述重量份的组分：小肽3.0份，白藜芦醇0.6份，β-羟基-β-甲基丁酸盐0.1份，聚肌苷酸-聚胞苷酸4.0份，亮氨酸4.0份；其中，所述小肽由JKB-A1和JKB-A2组成，JKB-A1与JKB-A2的重量比为2：1。
实施例2
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物含有下述重量份的组分：小肽5.0份，白藜芦醇0.030份，β-羟基-β-甲基丁酸盐4.0份，聚肌苷酸-聚胞苷酸0.6份，亮氨酸0.6份；其中，所述小肽由JKB-A1和JKB-A2组成，JKB-A1与JKB-A2的重量比为2：1。
实施例3
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物含有下述重量份的组分：小肽4.0份，白藜芦醇0.030份，β-羟基-β-甲基丁酸盐3.0份，聚肌苷酸-聚胞苷酸2.0份，亮氨酸0.6份；其中，所述小肽由JKB-A1和JKB-A2组成，JKB-A1与JKB-A2的重量比为2：1。
对比例1
本对比例的一种组合物，其与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物相比，不同之处仅在于：本对比例的组合物不含小肽。
实施例4
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白藜芦醇和β-羟基-β-甲基丁酸盐的重量份不同，本实施例中，白藜芦醇为0.035重量份，β-羟基-β-甲基丁酸盐为1.5重量份。
实施例5
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白藜芦醇和β-羟基-β-甲基丁酸盐的重量份不同，本实施例中，白藜芦醇为0.5重量份，β-羟基-β-甲基丁酸盐为3.0重量份。
实施例6
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白藜芦醇和β-羟基-β-甲基丁酸盐的重量份不同，本实施例中，白藜芦醇为0.042重量份，β-羟基-β-甲基丁酸盐为0.2重量份。
实施例7
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白藜芦醇和亮氨酸的重量份不同，本实施例中，白藜芦醇为0.035重量份，亮氨酸为1.5重量份。
实施例8
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白藜芦醇和亮氨酸的重量份不同，本实施例中，白藜芦醇为0.5重量份，亮氨酸为3.0重量份。
实施例9
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于白藜芦醇和亮氨酸的重量份不同，本实施例中，白藜芦醇为0.042重量份，亮氨酸为0.75重量份。
实施例10
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于：本实施例用于衰老基因表达调控的组合物不含聚肌苷酸-聚胞苷酸。
实施例11
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于：本实施例用于衰老基因表达调控的组合物不含亮氨酸。
实施例12
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于：本实施例用于衰老基因表达调控的组合物还含有鸢尾素。
实施例13
本发明用于衰老基因表达调控的组合物的一种实施例，本实施例所述用于衰老基因表达调控的组合物与实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物的不同之处仅在于：本实施例用于衰老基因表达调控的组合物还含有泛酸。
实施例14
本发明化妆品的一种实施例，本实施例所述化妆品含有实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物和辅料。
实施例15
本发明化妆品的一种实施例，本实施例所述化妆品含有实施例2所述用于衰老基因表达调控的组合物和辅料。
实施例16
本发明化妆品的一种实施例，本实施例所述化妆品含有实施例3所述用于衰老基因表达调控的组合物和辅料。
实施例17
本实施例对实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物激活HSF-1mRNA转录水平进行了研究，具体研究方法如下：
提取经实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物处理的HeLa细胞系不同时间点的总RNA，利用反转录酶合成相关基因的cDNA第一链，在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如β-actin)的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。其中，内参基因为β-actin，上游引物：5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’(如SEQ ID：1所示),下游引物5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’(如SEQ ID：2所示),HSF-1上游引物5’-GCCTTCCTGACCAAGCTGT-3’(如SEQ ID：3所示),下游引物：5’-AAGTACTTGGGCAGCACCTC-3’(如SEQ ID：4所示),PCR实验方法参照Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Pr；3rd edition.标准操作进行，采用ABI 7300实时荧光定量PCR仪进行检测。经不同含量(0、20ng/μL、100ng/μL)实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物处理的HeLa细胞系中，HSF-1及其编码的HSPs的相对表达水平如图1所示。由图1可见，在本发明用于衰老基因表达调控的组合物加入的条件下，热激蛋白HSF-1的转录水平随着抗衰老酶通路激活水平的提高而逐渐升高。
实施例18
本实施例对实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物激活抗衰老酶通路进行了研究，具体研究方法如下：
将实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物在适当稀释比例梯度下与生理盐水混匀，肌肉注射给雌性4周龄Wistar大鼠，每隔24小时注射一次，共注射3次。最后一次注射后12小时检测大鼠组织细胞中抗衰老酶通路关键基因mRNA表达水平。实施例1所述用于衰老基因表达调控的组合物激活抗衰老酶通路关键基因mRNA表达水平的检测结果如图2所示。由图2可知，本发明用于衰老基因表达调控的组合物在体内存在的条件下，基因Bdnf、lgf1、Arc、cFOS、Npas4、和Zif268的表达量都出现明显上调。
实施例19
本实施例比较了实施例1～9所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对比例1所述组合物激活HSF-1mRNA转录的效果，具体比较的方法如下：
将实施例1～9所述用于衰老基因表达调控的组合物(含量为100ng/μL)以及对比例1所述组合物(含量为100ng/μL)分别用于处理HeLa细胞，提取经处理的HeLa细胞系不同时间点的总RNA，利用反转录酶合成相关基因的cDNA第一链，在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如β-actin)的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。其中，内参基因为β-actin，上游引物：5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’(如SEQ ID：1所示),下游引物5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG-3’(如SEQ ID：2所示),HSF-1上游引物5’-GCCTTCCTGACCAAGCTGT-3’(如SEQ ID：3所示),下游引物：5’-AAGTACTTGGGCAGCACCTC-3’(如SEQ ID：4所示),PCR实验方法参照Sambrook,Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Pr；3rd edition.标准操作进行，采用ABI 7300实时荧光定量PCR仪进行检测。经实施例1～9所述用于衰老基因表达调控的组合物以及对比例1所述组合物处理的HeLa细胞系中，HSF-1的相对表达水平如图3所示，HSP-27的相对表达水平如图4所示；图3和图4中，NT表示未经本发明用于衰老基因表达调控的组合物或对比例1所述组合物处理的组别。
由图3和图4可见，当白藜芦醇为0.035～0.5重量份且β-羟基-β-甲基丁酸盐为0.2～3.0重量份或者白藜芦醇为0.035～0.5重量份且亮氨酸为0.75～3.0重量份或者时，HSF-1和HSP-27的相对表达水平较高；尤其是当白藜芦醇为0.5重量份且β-羟基-β-甲基丁酸盐为3.0重量份或者白藜芦醇为0.042重量份且亮氨酸为0.75重量份或者时，HSF-1和HSP-27的相对表达水平达更高。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (9)

1.一种用于衰老基因表达调控的组合物，其特征在于：所述组合物含有下述组分：小肽，白藜芦醇，β-羟基-β-甲基丁酸盐；所述组合物还包括聚肌苷酸-聚胞苷酸和/或亮氨酸。
2.如权利要求1所述的用于衰老基因表达调控的组合物，其特征在于：所述组合物中各组分的重量份为：小肽3.0～5.0份，白藜芦醇0.030～0.6份，β-羟基-β-甲基丁酸盐0.1～4.0份，聚肌苷酸-聚胞苷酸0.6～4.0份，亮氨酸0.6～4.0份。
3.如权利要求2所述的用于衰老基因表达调控的组合物，其特征在于：所述白藜芦醇为0.035～0.5重量份，所述β-羟基-β-甲基丁酸盐为0.2～3.0重量份。
4.如权利要求2所述的用于衰老基因表达调控的组合物，其特征在于：所述白藜芦醇为0.035～0.5重量份，所述亮氨酸为0.75～3.0重量份。
5.如权利要求1～4任一项所述的用于衰老基因表达调控的组合物，其特征在于：所述小肽由JKB-A1和JKB-A2组成，所述JKB-A1与JKB-A2的重量比为2：1；所述JKB-A1为Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro所示的序列组成的小肽，所述JKB-A2为Glu-Glu-Lys-Ala-Asn所示的序列组成的小肽。
6.如权利要求1或2所述的用于衰老基因表达调控的组合物，其特征在于：所述组合物还含有烟酸、维生素B6、维生素B12、泛酸、鸢尾素中的至少一种。
7.一种化妆品，其特征在于：所述化妆品含有如权利要求1～6任一项所述用于衰老基因表达调控的组合物。
8.如权利要求7所述的化妆品，其特征在于：所述化妆品还包含辅料。
9.一种如权利要求1～6任一项所述用于衰老基因表达调控的组合物在化妆品中的应用。
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