KR20120007078A - 항-ｄｋｋ-1 항체의 차단 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Dkk-1에 결합하는 항체 및 그의 단편, 및 구체적으로 Dkk-1에 결합하는 인간화된 항체 및 그의 단편, 및 훨씬 더 구체적으로는 Dkk-1에 결합하는 완전히 인간화된 항체 및 면역학적으로 작용성인 단편에 관한 것이다. Dkk-1+ 세포에 대한 결합에 대해 항-마우스 Dkk-1 단 클론 항체의 결합과 경쟁하는 항체 및 그의 단편을 또한 제공한다. 항-Dkk-1 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산뿐만 아니라, 항-Dkk-1 항체 또는 그의 단편의 재조합 발현을 위해 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 본 발명의 항체 및 그의 단편의 제조 방법을 또한 제공한다. 또한 골형성제를 제공한다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다. 골 손실을 발생시키는 질병, 질환 및 장애, 예를 들어 골 질환의 치료 방법을 또한 제공한다. 골 질량의 손실을 치료하거나 예방하는 방법, 증가된 골 질량을 유도하는 방법, 및 Wnt 활성을 유도하는 방법을 또한 제공한다.

Description

항-ＤＫＫ-1 항체의 차단 및 그의 용도{BLOCKING ANTI-DKK-1 ANTIBODIES AND THEIR USES}
본 발명은 Dkk-1에 결합하는 항체 및 그의 단편, 및 구체적으로 Dkk-1에 결합하는 인간화된 항체 및 그의 단편, 및 훨씬 더 구체적으로는 Dkk-1, 특히 인간 Dkk-1에 특이적으로 결합하는 완전히 인간화된 항체 및 단편에 관한 것이다. 항-Dkk-1 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산뿐만 아니라, 항-Dkk-1 항체의 재조합 발현을 위해 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공한다. 또한 골형성제를 제공한다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 약학 조성물을 또한 제공한다. 골 손실을 발생시키는 질병, 질환 및 장애, 예를 들어 골 질환의 치료 방법을 또한 제공한다. 골 질량의 손실을 치료하거나 예방하는 방법, 증가된 골 질량을 유도하는 방법, 및 Wnt 활성을 유도하는 방법을 또한 제공한다.
본 출원은 2009년 5월 12일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/177,650 호 및 2009년 9월 22일자로 출원된 미국 가 출원 제 61/244,638 호를 우선권 주장하며, 이들 출원 모두는 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
Wnt는 저 밀도 수용체 관련 단백질(LRP5/6) 및 프리즐드(frizzled) 단백질을 포함하는 수용체 복합체에 결합하고 상기 복합체를 활성화하는 분비형 당단백질이다(Cadigan, K.M. and Y.I. Liu(2005) Journal of Cell Science 119, 395-402; Nusse, R.(2003) Development 130(22):5297-305; and Pinson, K.I.(2000) Nature 2000 407(6803):535-8).
Wnt/LRP5는 골 질량을 조절하며 Wnt 신호전달 경로의 활성화는 골 질량의 자연 증가를 이끄는 것으로 개시되었다(Boyden, L.M. et al.(2002) N Engl J Med 346:1513-1521; Little, R.D. et al.(2002) Am J Hum Genet 70:11-19; and Gong, Y. et al.(2001) Cell 107:513-523). Wnt 신호전달은 길항물질들(분비형 분자, 예를 들어 Dickkopf 1(Dkk-1)을 포함한다)에 의해 엄격하게 조절된다(Tian, E. et al.(2003) N Engl J Med 349:2483-2494). 인간에서 관찰되는 높은 골 질량(HBM) 표현형은 LRP5에 결합하는 Dkk-1의 능력을 억제하는 LRP5의 단일 점 돌연변이(G171V)에 기인하는 것으로 밝혀졌다(Zhang, Y. et al.(2004) Mol Cell Biol. 24(11):4677-84).
골 형성 및 골 성장에 있어서 Wnt 신호전달의 중요한 역할은, 예를 들어 치료되지 않은 골다공증의 결과로서 발생하는 골절의 수를 감소시킴을 포함하여, Dkk-1을, 증가된 조골세포 활성(골 재흡수의 상응하는 증가 없이 증가된 골 형성, 증가된 골 질량 밀도)이 환자에게 유리할 수 있는 질병 또는 질환의 치료에 유용한 표적이 되게 한다. WO2006/015373(US2006/0127393)은 골 질환을 비롯하여 다양한 질병들을 치료하기 위한 Dkk-1에 대한 항체를 개시한다. US2008/0193449는 LRP5에 대한 Dkk-1의 결합을 억제하는 Dkk-1에 특이적인 항체, 골 성장을 자극하기 위한 상기와 같은 항체를 포함하는 조성물, 및 골다공증과 같은 골 질환을 치료하기 위한 상기와 같은 항체를 포함하는 조성물을 개시한다.
Dkk-1 활성을 길항함으로써 조골세포 활성을 증가시켜, 골다공증과 같은 질병, 질환 및 장애를 치료하는 신규의 골 형성제가 여전히 필요하며, 이때 상기와 같은 증가된 골 형성은 환자에게 유리할 수 있다.
본 발명은 Dkk-1에 결합하는 항체 및 그의 단편(예를 들어 항원 결합 부분), 및 구체적으로 Dkk-1에 결합하는 인간화된 항체 및 그의 단편, 및 훨씬 더 구체적으로는 Dkk-1에 결합하는 완전히 인간화된 항체 및 면역학적으로 작용성인 단편에 관한 것이다. 상기 항체 및 그의 단편은 Wnt 활성을 억제하는 Dkk-1의 능력을 길항한다. 상기 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편은 뼈에서 상응하는 골 질량의 증가와 함께 Wnt 신호전달 경로를 억제하는 Dkk-1의 능력을 길항한다. 상기 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편은 천연 구조를 갖는 항체뿐만 아니라 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩타이드(예를 들어 도메인 항체)를 포함한다. 상기 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 사용하여, 골다공증과 같은 골 질량의 손실과 관련되는 것들을 포함한 다양한 질병, 질환 및 장애를 치료할 수 있다. 상기 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 2차적인 골 손실, 예를 들어 코르티코스테로이드, 아로마타제 억제제, 또는 티아졸리딘티온(TZD)에 의한 만성 치료; 식욕부진으로부터 생성되거나 이에 수반되는 골 손실; 또는 생식샘 기능저하증 또는 신성 골이영양증과 관련된 골 손실과 관련된 질병, 질환 또는 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
상기 제공되는 항체들 및 그의 작용성 단편들 중 일부는
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 경쇄(LC) 상보성 결정 영역(CDR);
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 중쇄(HC) 상보성 결정 영역(CDR); 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함한다.
상기와 같은 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편은 Dkk-1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편들 중 일부는 상기 CDR 중 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개 전부를 포함한다.
상기 제공된 서열들의 보존적인 변이를 또한 제공한다.
추가로 제공된 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편의 LC 및 HC는 상기 서열들과 90% 이상의 서열 일치성을 갖는다.
CDR1이 서열식별번호: 22에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR2가 서열식별번호: 24에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 및/또는 CDR3이 서열식별번호: 26에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 LC를 갖는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
CDR1이 서열식별번호: 30, 49 또는 50에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR2가 서열식별번호: 32 또는 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 및/또는 CDR3이 서열식별번호: 34 또는 52에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC를 갖는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
CDR1이 서열식별번호: 22에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR2가 서열식별번호: 24에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 및/또는 CDR3이 서열식별번호: 26에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 LC, 및 CDR1이 서열식별번호: 30, 49 또는 50에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR2가 서열식별번호: 32 또는 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, 및/또는 CDR3이 서열식별번호: 34 또는 52에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC를 갖는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
CDR1이 서열식별번호: 22에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR2가 서열식별번호: 24에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, CDR3이 서열식별번호: 26에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 LC, 및 CDR1이 서열식별번호: 30, 49 또는 50에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖고, CDR2가 서열식별번호: 32 또는 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 가지며, CDR3이 서열식별번호: 34 또는 52에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC를 갖는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
(a) 서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 서열과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 LC 가변 영역(VL); (b) 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 서열과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 HC 가변 영역(VH); 또는 (c) (a)의 VL 및 (b)의 VH를 포함하는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
구조적으로 유사하지만 VL이 서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 서열과 90% 이상의 서열 일치성을 갖고 VH가 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 서열과 90% 이상의 서열 일치성을 갖는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
구조적으로 유사하지만 VL이 서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 서열과 95% 이상의 서열 일치성을 갖고 VH가 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 서열과 95% 이상의 서열 일치성을 갖는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 VL을 포함하고 VH가 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다.
상기 제공되는 항체들 및 그의 작용성 단편들 중 일부는 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 42에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 LC 및/또는 서열식별번호: 36 또는 서열식별번호: 40에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어지는 HC를 갖는다.
상기 제공되는 항체들 및 그의 작용성 단편들 중 일부는 서열식별번호: 38 또는 서열식별번호: 42에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 이루어지는 LC 및 서열식별번호: 36 또는 서열식별번호: 40에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 이루어지는 HC를 갖는다.
Dkk-1+ 세포에의 결합에 대해 마우스 MabJC18과 경쟁할 수 있는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다. 하나의 실시태양에서 본 발명은 인간화된 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 Dkk-1 항원에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 LC 가변 영역의 CDR들(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 HC 가변 영역의 CDR들(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 하기의 아미노산 서열들을 가지며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 Dkk-1+ 세포에 대한 결합에 대해 마우스 MabJC18과 경쟁할 수 있다: LC: (i) CDR1(서열식별번호: 22); (ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 26); 및 HC: (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50); (ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52).
본 발명은 또한 인간화된 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 DKK-1 항원에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 LC 가변 영역의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 HC 가변 영역의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 하기의 아미노산 서열들을 가지며: LC: (i) CDR1(서열식별번호: 22); (ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 26); 및 HC: (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50); (ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52), 이때 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크는 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유한다.
본 발명은 또한 인간화된 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 DKK-1 항원에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 LC 가변 영역의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 HC 가변 영역의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 하기의 아미노산 서열들을 가지며: LC: (i) CDR1(서열식별번호: 22); (ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 26); 및 HC: (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50); (ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52), 이때 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크는 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유한다.
본 발명은 또한 인간화된 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 DKK-1 항원에 특이적으로 결합하고, 여기에서 상기 LC 가변 영역의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3) 및 HC 가변 영역의 상보성 결정 영역들(CDR1, CDR2 및 CDR3)은 하기의 아미노산 서열들을 가지며: LC: (i) CDR1(서열식별번호: 22); (ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 26); 및 HC: (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50); (ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및 (iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52), 이때 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크는 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하고 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크는 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유한다.
본 발명의 항체들의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 또한 제공한다. 하나의 실시태양에서 서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 LC 가변 영역의 10 개 이상의 연속적인 아미노산 및/또는 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 HC 가변 영역의 10 개 이상의 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 융합 단백질은 서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 LC 가변 영역 및/또는 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 HC 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시태양에서 상기 융합 폴리펩타이드는 하기 중 하나 이상을 포함한다:
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 경쇄(LC) 상보성 결정 영역(CDR); 또는
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 중쇄(HC) 상보성 결정 영역(CDR).
또 다른 실시태양에서 상기 융합 단백질은 HC CDR3(서열식별번호: 34 또는 52) 및 LC CDR3(서열식별번호: 26)을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 융합 단백질은 본 발명의 하나 이상의 항체 및 고유 분자 중에 결합되어 있지 않은 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 동종 서열 또는 이종 서열을 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 이종 서열은 FLAG태그 또는 6His 태그 중에서 선택된 태그이다.
고체 지지체에의 커플링을 촉진하는 작용제에 접합된 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체 및 그의 단편을 고체 지지체에의 커플링을 촉진하는 작용제에 결합시킨다. 하나의 실시태양에서, 상기 고체 지지체는 비오틴 또는 아비딘이다.
표지 물질(labeling agent)에 결합된 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다. 하나의 실시태양에서 상기 표지 물질은 형광 분자 또는 방사성 분자이다.
상기 제공되는 다양한 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편은 단일의 LC 또는 HC, 또는 단일의 가변 경 도메인 및/또는 단일의 가변 중 도메인을 포함할 수 있다. 제공되는 다른 항체 및 단편은 2 개의 LC 및/또는 2 개의 HC를 포함할 수 있으며, 여기에서 일부 실시태양에서 상기 2 개의 LC는 서로 동일하고/하거나, 일부 실시태양에서 상기 2 개의 HC는 서로 동일하다. 상기 제공되는 항체는 예를 들어 단클론 항체, 인간 항체, 키메릭 항체 또는 인간화된 항체를 포함할 수 있다. 상기 제공되는 항체의 면역학적으로 작용성인 단편은 비 제한적으로 scFv, Fab, Fab', (FAB')2 또는 도메인 항체를 포함할 수도 있다. 하나의 실시태양에서 상기 항체는 약 100 pM 이하의 Kd로 Dkk-1 폴리펩타이드로부터 해리된다.
상기 항체 및 그의 단편을 암호화하는 다양한 핵산들이 또한 제공된다. 일부 핵산은 예를 들어 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 24 또는 서열식별번호: 26에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 LC CDR을 암호화하며, 따라서 상기 암호화된 CDR은 Dkk-1 폴리펩타이드와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 암호화한다. 일부 핵산은 예를 들어 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 32 또는 서열식별번호: 34에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 HC CDR을 암호화하며, 따라서 상기 암호화된 CDR은 Dkk-1 폴리펩타이드와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 암호화한다. 일부 실시태양에서 상기 핵산은 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편의 VL 및/또는 VH 영역을 암호화하는 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지며, 여기에서 상기 VL은 서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 서열과 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 서열 일치성을 가지며 상기 VH는 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 서열과 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는다. 일부 실시태양에서 상기 핵산은 서열식별번호: 20에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VL을 암호화하는 서열 및/또는 서열식별번호: 28에 나타낸 바와 같은 서열을 포함하거나 상기 서열로 이루어지는 VH를 암호화하는 서열을 포함한다. 다른 실시태양에서 상기 핵산은 상기 서열 특징들을 갖는 VL과 VH를 모두 암호화하는 서열들을 포함한다.
하기 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 또한 제공한다: (a) 표 4에 나타낸 huMabJC18 또는 그의 변이체; (b) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 단편 또는 영역; (c) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 경쇄; (c) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 중쇄; (d) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 LC 및/또는 HC로부터의 하나 이상의 가변 영역(들); (e) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 하나 이상의 CDR(들)(1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 CDR); (f) 항체 huMabJC18의 HC로부터의 CDR H3; (g) 항체 huMabJC18의 HC로부터의 CDR H1; (h) 항체 huMabJC18의 HC로부터의 CDR H2(여기에서 아미노산 G57은 G 또는 W이고/이거나 F58은 F, L, G, Y, M 또는 V이고/이거나 Q59는 Q, D, H, G, R 또는 W이다); (i) 항체 huMabJC18의 HC로부터의 CDR H3(여기에서 아미노산 T100은 T 또는 S이고/이거나 아미노산 L102는 L 또는 Y이고/이거나 아미노산 E103은 E, R, Q, D 또는 K이다); (j) 항체 huMabJC18의 LC로부터의 CDR L1(여기에서 아미노산 E27은 E, Q 이고/이거나 아미노산 D30은 D 또는 S이고/이거나 아미노산 D31은 D 또는 S이고/이거나 아미노산 F32는 F 또는 S이고/이거나 아미노산 G33은 G 또는 Y이고/이거나 아미노산 I34는 I 또는 L이고/이거나 아미노산 S35는 S 또는 A이고/이거나 아미노산 F36은 F 또는 W이고/이거나 아미노산 I37은 I 또는 M이다); (k) 항체 huMabJC18의 LC로부터의 CDR L2(여기에서 아미노산 G55는 G 또는 A이고/이거나 아미노산 S56은 S 또는 T이다); (l) 항체 huMabJC18의 LC로부터의 CDR L3(여기에서 아미노산 Q94는 Q 또는 H이고/이거나 아미노산 L95는 L, S, A 또는 G이고/이거나 아미노산 K96은 K, I, L, W, M 또는 S이고/이거나 아미노산 E97은 E 또는 D이고/이거나 아미노산 V98은 V 또는 L이고/이거나 아미노산 P99는 P 또는 W이고/이거나 아미노산 P100은 P, S 또는 G이고/이거나 아미노산 T101은 T, Y 또는 L이다); (m) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 LC로부터의 3 개의 CDR; (n) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 HC로부터의 3 개의 CDR; (o) 표 4에 나타낸 항체 huMabJC18 또는 그의 변이체의 LC로부터의 3 개의 CDR 및 HC로부터의 3 개의 CDR; 및 (p) (b) 내지 (p) 중 어느 하나를 포함하는 항체.
임의의 상기와 같은 핵산 서열에 상보성인 폴리뉴클레오타이드를 또한 제공한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수도 있다. RNA 분자는 예를 들어 HnRNA 분자(인트론을 함유하고 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응한다), 및 mRNA 분자(인트론을 함유하지 않는다)를 포함한다. 추가의 암호화 또는 비 암호화 서열들은 제공된 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수도, 존재할 필요가 없을 수도 있으며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 결합할 수도, 결합할 필요가 없을 수도 있다.
고유 서열(즉 항체 또는 그의 일부를 암호화하는 내생적인 서열)을 포함하거나, 또는 상기와 같은 서열의 변이체를 포함할 수도 있는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 고유의 면역반응성 분자에 비해, 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성이 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수도 있다. 변이체는 바람직하게는 고유 항체 또는 그의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 약 70% 이상의 일치성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 일치성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 95%의 일치성을 나타낸다.
본 발명은 또한
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명은 또한
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명은 또한
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하고 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 제공한다.
본 발명은 또한
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하고 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 제공한다.
상기 DNA 분자의 일부 실시태양에서 상기 LC CDR의 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다:
CDR1: 서열식별번호: 21에 나타낸 바와 같음
CDR2: 서열식별번호: 23에 나타낸 바와 같음
CDR3: 서열식별번호: 25에 나타낸 바와 같음.
상기 DNA 분자의 일부 실시태양에서 상기 HC CDR의 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다:
CDR1: 서열식별번호: 29에 나타낸 바와 같음
CDR2: 서열식별번호: 31에 나타낸 바와 같음
CDR3: 서열식별번호: 33에 나타낸 바와 같음.
상기 DNA 분자의 일부 실시태양에서 상기 LC 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열식별번호: 19에 나타낸 바와 같다.
상기 DNA 분자의 일부 실시태양에서 상기 HC 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열식별번호: 27에 나타낸 바와 같다.
상기 DNA 분자의 일부 실시태양에서 상기 LC 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열식별번호: 37 또는 서열식별번호: 41에 나타낸 바와 같다.
상기 DNA 분자의 일부 실시태양에서 상기 HC 가변 영역의 뉴클레오타이드 서열은 서열식별번호: 35 또는 서열식별번호: 39에 나타낸 바와 같다.
상기 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 DNA 분자 중 임의의 것을 포함하는 벡터, 예를 들어 발현 벡터를 또한 제공한다.
하나의 실시태양에서
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 발현 벡터의 형태로 제공한다.
하나의 실시태양에서,
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 발현 벡터의 형태로 제공한다.
하나의 실시태양에서
(a) (i) 서열식별번호: 22와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 24와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 26과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) 서열식별번호: 30, 49 또는 50과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR1;
(ii) 서열식별번호: 32 또는 51과 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR2; 및
(iii) 서열식별번호: 34 또는 52와 80% 이상의 서열 일치성을 갖는 CDR3
으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하고 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 발현 벡터의 형태로 제공한다.
하나의 실시태양에서
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하고 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 발현 벡터의 형태로 제공한다.
또한 본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 제공한다. 하나의 실시태양에서 (a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR
을 포함하고, 상기 LC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGKV3-11 생식계열 프레임워크 및 IGKJ4 영역을 함유하고 상기 HC의 가변 도메인 프레임워크가 인간 IGHV3-07 생식계열 프레임워크(단일 복귀 돌연변이를 갖는다: R100에서 T로) 및 IGHJ6 영역을 함유하는
인간화된 항체 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 제공한다.
또한 인간화된 항체 또는 그의 단편의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 재조합 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포를 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 DKK-1 항원에 특이적으로 결합하고 상기 LC 및 HC의 CDR들은 하기의 아미노산 서열들을 갖는다:
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR.
인간화된 항체 또는 그의 단편의 제조 방법을 또한 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 Dkk-1 항원에 특이적으로 결합하고 상기 LC 및 HC의 CDR들은 하기의 아미노산 서열들을 가지며:
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR,
상기 방법은 (i) 상기 인간화된 항체 또는 그의 단편의 경쇄를 암호화하는 제 1 발현 벡터 및 상기 인간화된 항체 또는 그의 단편의 중쇄를 암호화하는 제 2 발현 벡터; 또는 (ii) 상기 인간화된 항체 또는 그의 단편의 경쇄 및 중쇄를 모두 암호화하는 단일 발현 벡터로 형질전환된 숙주를 제공하고; 상기 숙주를 각 쇄가 발현되는 조건 하에서 유지시키고 상기와 같이 발현된 쇄들의 조립에 의해 형성된 인간화된 항체 또는 그의 단편을 단리함을 포함한다.
또한 인간 DKK-1 항원에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체 또는 그의 단편을 제조하는 방법을 제공하며, 여기에서 상기 LC 및 HC의 CDR들은 하기의 아미노산 서열들을 가지며:
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR,
상기 방법은 숙주 세포를 배양하고(여기에서 상기 숙주 세포는 상기 항체 또는 그의 단편의 LC 및 HC를 암호화하는 재조합 발현 시스템을 포함한다), 상기 항체 또는 그의 단편을 회수함을 포함한다.
본 발명은 인간화된 항체 또는 그의 단편의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 재조합 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포를 배양함을 포함하는, 상기 인간화된 항체 또는 그의 단편을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 DKK-1 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 LC 및 HC의 CDR들은 하기의 아미노산 서열들을 가지며:
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR,
상기 인간화된 항체 또는 그의 단편은 인간 Dkk-1 항원에 대한 결합에 대해 muMabJC18과 경쟁할 수 있다.
또한 인간화된 항체 또는 그의 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 Dkk-1 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 LC 및 HC의 CDR들은 하기의 아미노산 서열들을 갖는다:
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR.
또한 인간화된 항체 또는 그의 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 Dkk-1 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 LC 및 HC의 CDR들은 하기의 아미노산 서열들을 가지며:
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR,
상기 인간화된 항체 또는 그의 단편은 인간 Dkk-1 항원에 대한 결합에 대해 muMabJC18과 경쟁할 수 있다.
또한 인간화된 항체 또는 그의 단편의 LC 및 HC를 암호화하는 재조합 발현 시스템을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 상기 인간화된 항체 또는 그의 단편을 회수함을 포함하는, 상기 인간화된 항체 또는 그의 단편의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 항체 또는 단편은 인간 Dkk-1 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 LC 및 HC의 CDR들은 하기의 아미노산 서열들을 가지며:
(a) (i) CDR1(서열식별번호: 22);
(ii) CDR2(서열식별번호: 24); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 26)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 LC CDR;
(b) (i) CDR1(서열식별번호: 30, 49 또는 50);
(ii) CDR2(서열식별번호: 32 또는 51); 및
(iii) CDR3(서열식별번호: 34 또는 52)
로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 HC CDR; 또는
(c) (a) 중 하나 이상의 CDR 및 (b) 중 하나 이상의 CDR,
상기 인간화된 항체 또는 그의 단편은 인간 Dkk-1 항원에 대한 결합에 대해 muMabJC18과 경쟁할 수 있다.
본 발명은 또한 골 질량의 손실의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 단편을 투여함을 포함하는 상기 손실의 치료 또는 예방 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 뼈로 전이하는 암을 앓고 있는 환자이다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 다발성 골수종을 앓고 있는 환자이다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 골다공증, 골감소증, 파제트병, 치주염, 류마티스성 관절염, 및 부동화로 인한 골 손실을 앓고 있는 환자들 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 골다공증을 앓고 있다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 에스트로젠 결핍증을 앓고 있다.
본 발명은 또한 증가된 골 질량의 유도가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 인간화된 항체 및 그의 단편을 투여함을 포함하는 상기 유도 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 뼈로 전이하는 암을 앓고 있는 환자이다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 다발성 골수종을 앓고 있는 환자이다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 골다공증, 골감소증, 파제트병, 치주염, 류마티스성 관절염, 및 부동화로 인한 골 손실을 앓고 있는 환자들 중에서 선택된다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 골다공증을 앓고 있다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 골 이식편 수용자 또는 골절을 앓고 있는 환자이다. 하나의 실시태양에서 상기 환자는 코르티코스테로이드, 아로마타제 억제제, 또는 TZD에 의한 만성 치료; 식욕부진으로 인한; 또는 생식샘 기능저하증 또는 신성 골이영양증에 의해 야기된 2차적인 골 손실을 갖는다.
본 발명은 또한 Wnt 활성의 유도가 필요한 환자에게 유효량의 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 단편을 투여함을 포함하는 상기 유도 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 항-Dkk-1 중화 단클론 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 제공한다. 하나의 실시태양에서 상기 항체 또는 그의 단편은 <100 pM의 Kd로 인간 Dkk-1에 결합한다. 하나의 실시태양에서 상기 항체 또는 그의 단편은 작용성 세포 기재 분석에서 IC50 < 100 nM로 Dkk-1의 작용을 길항한다. 하나의 실시태양에서 상기 항체 또는 그의 단편은 ≤250 ㎎의 한 달에 한 번 투여 후에 골 미네랄 밀도(BMD) 측정치를 증가시키는 것으로 예상되는 예측된 인간 노출 프로파일을 갖는다.
또한 Wnt 활성을 억제하는 Dkk-1의 능력을 길항하고, 그 자체가 골 질량을 증가시키며, 질병, 질환 및 장애, 예를 들어 골다공증, 및 2차적인 골 손실(예를 들어 코르티코스테로이드, 아로마타제 억제제, 또는 TZD에 의한 만성 치료; 식욕부진으로 인한; 또는 생식샘 기능저하증 또는 신성 골이영양증에 의해 야기된)을 생성시키는 것들의 치료에 유용한 골 형성제를 제공하며, 이때 상기와 같이 증가된 골 형성은 상기 환자에게 유리할 것이다.
본 발명의 항체 및 그의 단편을 다른 약제들(특히 1차적인 및 2차적인 골 손실, 골 질량의 감소, 및 하기 본 발명에 개시되는 바와 같이 골 강도를 약화시키는 것들을 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 작용제들)과 함께 투여할 수 있다. 상기 복합 요법을 임의의 적합한 방식으로, 예를 들어 (a) 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 단편, 본 발명에 개시된 하나 이상의 추가적인 약제 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 단일 약학 조성물로서; 또는 (b) (i) 본 발명의 인간화된 항체 또는 그의 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 제 1 조성물, 및 (ii) 본 발명에 개시된 하나 이상의 추가적인 약제 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 제 2 조성물을 포함하는 2 개의 별도의 약학 조성물로서 투여할 수 있다. 상기 약학 조성물을 동시에 또는 연속적으로 및 임의의 적합한 순서로 투여할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 항체 및/또는 그의 단편을 포함하거나, 또는 본 발명에 의해 제공된 약학 조성물을 포함하는 키트를 또한 제공한다. 하나의 실시태양에서 상기 키트는 상기 항체 또는 단편을 어떻게 제조하는지 및/또는 상기 항체 또는 단편을 어떻게 투여하는지에 대한 설명서를 추가로 포함한다. 또 다른 실시태양에서 상기 키트를 환자가 상기 Wnt 신호전달 경로를 억제함으로써 골 질량을 증가시키는 능력을 갖는 지의 여부를 측정하는 진단제로서 사용한다.
2009년 2월 18일자로 ATCC(부타페스트 조약 하에서)에 의해 이루어진 2 개의 기탁물을 또한 제공한다. huMabJC18의 HC 가변 영역을 갖는 플라스미드를 갖는 이 콜라이(E. coli) DH5α가 기탁되었다: 숙주 이 콜라이 DH5α 중의 이 콜라이로부터의 pCR2.1 TOPO, UC25553, ATCC 특허 기탁 명칭 PTA-9835. huMabJC18의 LC 가변 영역을 갖는 플라스미드를 갖는 이 콜라이 DH5α가 기탁되었다: 숙주 이 콜라이 DH5α 중의 이 콜라이로부터의 pCR2.1 TOPO, UC25554, ATCC 특허 기탁 명칭 PTA-9836. 상기와 같이 기탁된 플라스미드들의 공개에 대한 유효성에 대한 모든 제한들은 특허의 허여 시 본 발명의 명세서로부터 결정적으로 제거될 것이다.
본 명시의 다른 특징들 및 이점들은 하기의 상세한 설명 및 실시예들(제한으로서 간주해서는 안 된다)로부터 자명해질 것이다. 본 명세서 전체를 통해 인용된 모든 참고문헌들, 진뱅크(Genbank) 기재들, 특허들 및 공개된 특허 출원들은 명백히 그들의 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다.
도 1a 및 1b는 완전한 마우스 모델에서 항-마우스 Dkk-1 단클론 항체(JC18)의 효과를 나타낸다. 원위 대퇴골의 전체 BMD는 모든 용량 수준에서 JC18 처리에 의해 현저하게 증가하였다(도 1a). JC18은 마우스에서 60 ㎎/㎏ 용량 수준에서 골 형성 속도를 또한 현저하게 증가시켰다.
도 2는 완전한 마우스 모델에서 Dkk-1 단클론 항체의 마우스 키메라(마우스 키메라 - 키메릭 인간-마우스 항체)의 효과를 나타낸다. 상기 마우스 키메라는 비히클에 비해 1 내지 30 ㎎/㎏의 용량에서 전체 BMD를 증가시켰다.
도 3은 JC18이 OVX 마우스 모델에서 에스트로젠 결핍에 의해 유도된 골 손실을 방지했음을 보인다. 예상되는 바와 같이, 비히클로 처리된 마우스는 전체 BMD의 현저한 감소에 의해 입증되는 바와 같이 OVX 후 8 주째에 골감소증을 나타내었다. JC18은 원위 대퇴골에서 pQCT에 의해 측정 시 OVX 마우스의 비히클 처리에 비해 전체 BMD를 7 내지 20%까지 용량-반응적으로 증가시켰다. 매주 2 회 15 ㎎/㎏의 JC18로 처리한 마우스에서, 전체 BMD는 비히클-처리된 OVX 마우스보다 더 높을 뿐만 아니라 모의 대조용 수준에서 유지되었으며, 이는 상기 용량 및 투여 섭생에서 JC18이 OVX 마우스에서의 골감소증의 발생을 완전히 방지함을 가리킨다.
도 4는 인간 동족체 Dkk-1, Dkk-3 및 Dkk-4에 대한 JC18의 결합 특이성을 나타낸다. JC18은 5 ug/㎖까지 인간 Dkk-4에 약한 결합을 나타내고 인간 Dkk-3에는 결합하지 않음을 나타내었다.
도 5는 표적 매개된 약물 성향(TMDD) 모델을 나타낸다.
도 6은 1, 5, 10 및 100 ug/㎏의 단일 정맥 내 투여에 따른 래트 중의 V5-His 표지된(tagged) h-DKK-1의 혈청 농도의 그래프를 나타낸다. 0.001 ㎎/㎏에서 > 0.5 시간, 0.005 ㎎/㎏에서 > 1 시간, 및 0.01 및 0.1 ㎎/㎏에서 > 2시간의 시점들에서 샘플은 상기 분석 방법의 정량분석 가능한 한계 아래에 있고 상기 플롯에 포함되지 않았다.
도 7은 스프래그-다우리 래트에게 huMabJC18의 매주 정맥 내 투여에 따른, 관찰 및 모델 예측된 유리/부분 유리 huMabJC18 농도 대 시간의 그래프를 나타낸다. 기호들은 평균 관찰 데이터(±SD)를 나타내고 선들은 상기 모델로부터 예측된 프로파일들을 나타낸다.
도 8a 내지 8e는 스프래그-다우리 래트에게 huMabJC18의 매주 정맥 내 투여에 따른, 관찰 및 모델 예측된 유리 Dkk-1 농도 대 시간의 그래프를 나타낸다. 기호들은 평균 관찰 데이터(±SD)를 나타내고 선들은 상기 모델로부터 예측된 프로파일들을 나타낸다. 검출된 항-huMabJC18 항체를 갖는 샘플들은 상기 분석으로부터 제거되었다.
도 9a 및 9b는 키노몰구스 원숭이에게 huMabJC18의 단일 정맥 내 투여에 따른, 관찰 및 모델 예측된 유리/부분 유리 huMabJC18 농도 대 시간의 그래프를 나타낸다. (a)는 수컷 원숭이이고, (b)는 암컷 원숭이이다. 기호들은 관찰된 개별적인 원숭이 데이터를 나타내고 선들은 상기 모델로부터 예측된 프로파일들을 나타낸다.
도 10a 내지 10e는 키노몰구스 원숭이에게 huMabJC18의 단일 정맥 내 투여에 따른, 관찰 및 모델 예측된 유리 Dkk-1 농도 대 시간의 그래프를 나타낸다. 기호들은 관찰된 데이터를 나타내고 선들은 상기 모델로부터 예측된 프로파일들을 나타낸다.
도 11은 스프래그-다우리 래트에게 huMabJC18의 매주 정맥 내 투여에 따른 1차 투여 후 1.5 및 2.5 주째에 평균 오스테오칼신 농도(±SE)의 그래프를 나타낸다. *는 p<0.05 대 비히클을 가리킨다.
도 12는 6 개월 동안 huMabJC18 1/개월의 피하 투여에 따른 인간에서의 예측된 유리 Dkk-1 농도들의 그래프를 나타낸다. 3 개의 상이한 용량들을 시험하였다: MABEL의 1/10 또는 효과 없는 용량을 나타내는 0.003 ㎎/㎏, MABEL을 나타내는 0.03 ㎎/㎏, 및 골다공증에 대해 예측된 유효 용량을 나타내는 3.57 ㎎/㎏.
도 13은 6 개월 동안 huMabJC18 1/개월의 피하 투여에 따른 인간에서의 예측된 유리 huMabJC18 농도들의 그래프를 나타낸다. 3 개의 상이한 용량들을 시험하였다: MABEL의 1/10 또는 효과 없는 용량을 나타내는 0.003 ㎎/㎏, MABEL을 나타내는 0.03 ㎎/㎏, 및 골다공증에 대해 예측된 유효 용량을 나타내는 3.57 ㎎/㎏. 상기 생물분석학적 분석의 예상된 정량 한계(LOQ)는 예측된 MABEL보다 더 낮은 용량의 무용성을 나타냄을 입증한다.
도 14는 huMabJC18의 수용체 점유율 계산치 대 (1) 정상 상태 평형 방법(Duff, 2006) 및 (2) 기계적인 PK/PD(TMDD) 모델에 근거하여 예측된 인간 용량의 그래프를 나타낸다.
본원은 단리된 항체 및 그의 단편(예를 들어 항원 결합 부분), 특히 Dkk-1에 특이적으로 결합하는 인간화된 단클론 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 일부 실시태양에서 본원의 항체 및 그의 단편은 특정한 중쇄 및 경쇄 생식계열 서열로부터 유도되고/되거나 특정한 아미노산 서열을 포함하는 CDR 영역과 같은 특정한 구조적 특징들을 포함한다. 본원은 예를 들어 단리된 항체 및 그의 단편, 상기와 같은 항체 또는 그의 단편의 제조 방법, 및 상기 항체 또는 그의 단편을 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 본원은 또한 예를 들어 Dkk-1을 검출하기 위해서뿐만 아니라 골 손실을 생성시키는 다양한 질병, 질환 또는 장애, 예를 들어 골 질환을 치료하기 위해서 상기 항체 및 그의 단편을 사용하는 방법에 관한 것이다. 골 질량의 손실을 치료 또는 예방하는 방법, 증가된 골 질량을 유도하는 방법, 및 Wnt 활성을 유도하는 방법을 또한 제공한다.
정의
본 발명에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 기술 용어들은 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 통상적으로 이해되는 의미들을 가질 것이다. 더욱이, 문맥상 달리 필요로 하지 않는 한, 단수의 용어들은 복수를 포함하고 복수의 용어들은 단수를 포함할 것이다. 일반적으로, 본 발명에 개시된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명법 및 이들의 기법은 당해 분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기법들은 당해 분야에 널리 공지되고 달리 나타내지 않는 한 본 명세서 전체를 통해 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 전문적인 참고문헌들에 개시된 바와 같은 통상적인 방법에 따라 일반적으로 수행된다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)] 및 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates(1992)], 및 [Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1990)](이들은 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 효소 반응들 및 정제 기법들은 당해 분야에서 통상적으로 수행되거나 본 발명에 개시되는 바와 같이, 제조자의 명세서에 따라 수행된다. 본 발명에 개시된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 약학 화학과 관련하여 사용된 용어, 및 이들의 실험 과정 및 기법은 당해 분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기법을 화학 합성, 화학 분석, 약제 제조, 제형, 및 전달 및 환자의 치료에 사용할 수 있다.
본 내용에 사용되는 하기 용어들은 달리 나타내지 않는 한 하기의 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:
본 발명에 사용된 바와 같은 "Dkk-1"은 예를 들어 Dkk-1의 쥐 및 인간 고유의 형태들을 포함한다. 예시적인 Dkk-1 단백질 및 뉴클레오타이드 서열들은 예를 들어 US2006/0127393(WO2006/015373) 및 US2008/0193449에 개시되어 있다. 상기 용어는 또한 이들 고유 단백질과 면역학적으로 교차 반응성인 상기와 같은 고유 서열들의 변이체들을 포함한다. 이들 단백질은 LRP5 또는 LRP6과 Wnt와의 상호작용을 억제할 수 있다. 상기 용어는 또한 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프를 함유하는 Dkk-1의 고유 또는 변이 형태의 단편을 지칭할 수 있다.
"폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"이란 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체를 의미한다. 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 상기 어느 한 뉴클레오타이드의 변이된 형태일 수 있다. 상기 변이는 염기 변이, 예를 들어 브로모유리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변이, 예를 들어 2',3'-다이데옥시리보스, 및 뉴클레오타이드간 결합 변이, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로다이셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포라닐-아데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다. 상기 용어는 단일 및 이중 가닥 형태를 모두 포함한다.
"올리고뉴클레오타이드"란 용어는 200 개 이하의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 일부 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 10 내지 60 염기이다. 다른 실시태양에서, 올리고뉴클레오타이드는 길이가 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40 뉴클레오타이드이다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 돌연변이 유전자의 구성에 사용하기 위해 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 검출 분석을 위해 방사성 표지, 형광 표지, 합텐 또는 항원 표지를 포함한 표지를 포함할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오타이드를 예를 들어 PCR 프라이머, 클로닝 프라이머 또는 하이브리드화 탐침으로서 사용할 수도 있다.
"단리된 핵산 분자"는 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 단리된 폴리뉴클레오타이드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오타이드의 전부 또는 일부와 결합되지 않거나 또는 자연에서 결합되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 결합된 합성 기원 또는 그의 일부 조합을 의미한다. 본원의 목적을 위해서, 특정한 뉴클레오타이드 서열을 "포함하는 핵산 분자"가 완전한 염색체를 포함하지 않음은 물론이다. 명시된 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는 상기 명시된 서열 이외에, 10 개 이하 또는 심지어 12 개 이하의 다른 단백질 또는 그의 일부에 대한 암호화 서열을 포함하거나, 또는 상기 인용된 핵산 서열의 암호화 영역의 발현을 조절하는 작동적으로 결합된 조절 서열을 포함하고/하거나 벡터 서열을 포함할 수도 있다.
달리 명시하지 않는 한, 본 발명에서 논의된 임의의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 단부는 5' 단부이며; 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열의 좌측 방향은 5' 방향으로서 지칭된다. 신생 RNA 전사물의 5'에서 3'으로의 첨가 방향은 전사 방향으로서 지칭되며; 상기 RNA 전사물의 5' 단부에 대해 5'인 상기 RNA 전사물과 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "상향 서열"이라 지칭하고; 상기 RNA 전사물의 3' 단부에 대해 3'인 상기 RNA 전사물과 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역을 "하향 서열"이라 지칭한다.
"조절 서열"이란 용어는 연결되는 암호화 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 상기와 같은 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 변할 수 있다. 특정 실시태양에서, 원핵생물에 대한 조절 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물에 대한 조절 서열은 전사 인자에 대한 하나 또는 다수의 인식 부위를 포함하는 프로모터, 전사 인핸서 서열, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 "조절 서열"은 리더 서열 및/또는 융합 상대 서열을 포함할 수 있다.
"벡터"란 용어는 숙주 세포 내로 단백질 암호화 정보를 운반하는데 사용되는 임의의 분자 또는 존재(예를 들어 핵산, 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스)를 의미한다.
"발현 벡터" 또는 "발현 구조물"이란 용어는 숙주 세포의 형질전환에 적합하고 작동적으로 결합되는 하나 이상의 이종 암호화 영역들의 발현을 지시 및/또는 조절하는(숙주 세포와 관련하여) 핵산 서열을 함유하는 벡터를 지칭한다. 발현 구조물은 비 제한적으로 전사, 번역에 영향을 미치거나 이를 조절하고, 인트론이 존재하는 경우, 작동적으로 결합되는 암호화 영역의 RNA 연접에 영향을 미치는 서열들을 포함할 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "작동적으로 결합된"은 상기 용어가 적용되는 성분들이 적합한 조건 하에서 그들 고유의 작용을 수행할 수 있게 하는 관계에 있음을 의미한다. 예를 들어, 단백질 암호화 서열에 "작동적으로 결합된" 벡터 중의 조절 서열은 상기 단백질 암호화 서열의 발현이 상기 조절 서열의 전사 활성에 적합한 조건 하에서 성취되도록 상기 단백질 암호화 서열에 연결된다.
"숙주 세포"란 용어는 핵산 서열에 의해 형질전환되었거나 또는 형질전환될 수 있고 이에 의해 관심 유전자를 발현할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 용어는, 자손이 형태나 유전자 구성에 있어서 원래의 모 세포와 동일한지의 여부와 관계없이, 관심 유전자가 존재하는 한 상기 모 세포의 자손을 포함한다.
"형질도입"이란 용어는 대개 박테리오파지에 의해서 유전자가 하나의 세균에서 또 다른 세균으로 운반됨을 의미한다. "형질도입"은 또한 레트로바이러스에 의한 진핵생물 세포 서열의 획득 및 운반을 지칭한다.
"형질감염"이란 용어는 세포에 의한 외래 또는 외부 DNA의 흡수를 의미하며, 세포는 상기 외부 DNA가 상기 세포막 내부에 도입되었을 때 "형질감염"된 것이다. 다수의 형질감염 기법들이 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 본 발명에 개시되어 있다(Graham et al., 1973, Virology 52:456: Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Id.; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; and Chu et al., 1981, Gene 13:197). 상기와 같은 기법들을 사용하여 하나 이상의 외부 DNA 부분들을 적합한 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다.
"형질전환"이란 용어는 세포의 유전자 특성의 변화를 지칭하며, 세포는 새로운 DNA 또는 RNA를 함유하도록 변이되었을 때 형질전환된 것이다. 예를 들어, 세포는 새로운 유전 물질이 형질감염, 형질도입 또는 다른 기법들을 통해 도입됨으로써 고유의 상태로부터 유전적으로 변이되는 경우 형질전환된다. 형질감염 또는 형질도입에 이어서, 상기 형질전환 DNA는 상기 세포의 염색체에 물리적으로 통합됨으로써 상기 세포의 DNA와 재조합되거나, 또는 복제되지 않고 에피솜 요소로서 일시적으로 유지되거나, 또는 플라스미드로서 독립적으로 복제될 수도 있다. 세포는 상기 형질전환 DNA가 상기 세포의 분열과 함께 복제되는 경우 "안정하게 형질전환"된 것으로 간주된다.
"폴리펩타이드" 또는 "단백질"이란 용어는 고유 단백질, 즉 천연 및 비 재조합 세포에 의해 생산되거나 또는 유전자 조작되거나 재조합 세포에 의해 생산된 단백질의 아미노산 서열을 갖는 거대분자를 의미하며 상기 고유 단백질의 아미노산 서열을 갖는 분자, 또는 상기 고유 서열의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 상기 아미노산에의 첨가 및/또는 상기 아미노산의 치환을 갖는 분자를 포함한다. "폴리펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 구체적으로 항-Dkk-1 항체, 또는 항-Dkk-1 항체의 하나 이상의 아미노산으로부터의 결실, 상기 아미노산에의 첨가 및/또는 상기 아미노산의 치환을 갖는 서열을 포함한다. "폴리펩타이드 단편"이란 용어는 전장 고유 단백질에 비해 아미노-말단 결실, 카복시-말단 결실, 및/또는 내부 결실을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 상기와 같은 단편은 고유 단백질에 비해 변이된 아미노산을 또한 함유할 수도 있다. 몇몇 실시태양에서, 단편은 약 5 내지 500 아미노산 길이이다. 예를 들어 단편은 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450 이상의 아미노산 길이일 수도 있다. 본 발명에 유용한 폴리펩타이드 단편은 결합 도메인을 포함하여, 항체의 면역학적으로 작용성인 단편을 포함한다. 항-Dkk-1 항체의 경우에, 유용한 단편은 비 제한적으로 CDR 영역, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인, 항체 쇄의 일부 또는 2 개의 CDR을 포함하는 바로 그의 가변 영역 등을 포함한다.
본 발명에서 언급된 "단리된 단백질"이란 용어는 주 단백질이 (1) 통상적으로 발견되는 적어도 일부의 다른 단백질들이 없거나, (2) 동일한 출처, 예를 들어 동일한 종들로부터의 다른 단백질들이 필수적으로 없거나, (3) 상이한 종들로부터의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연적으로 결합된 폴리뉴클레오타이드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질들과 약 50% 이상 분리되었거나, (5) 자연적으로 결합되지 않은 폴리펩타이드와 작동적으로 결합되거나(공유 또는 비 공유 상호작용에 의해), 또는 (6) 자연적으로 존재하지 않음을 의미한다. 합성 기원의 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 다른 RNA, 또는 임의의 이들의 조합은 상기와 같은 단리된 단백질을 암호화할 수 있다. 바람직하게는, 상기 단리된 단백질은 그의 치료학적, 진단학적, 예방학적, 연구 용도 또는 다른 용도를 방해할 수 있는 그의 천연 환경에서 발견되는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다른 오염물질들이 실질적으로 없다.
폴리펩타이드(예를 들어 항체)의 "변이체"는 또 다른 폴리펩타이드 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열에 삽입, 상기 서열로부터 결실 및/또는 상기 서열 내로 치환된 상기 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 변이체는 융합 단백질을 포함한다.
폴리펩타이드의 "유도체"는 삽입, 결실 또는 치환 변이체와 다른 일부의 방식으로, 예를 들어 또 다른 화학적 부분에의 접합을 통해 화학적으로 변이된 폴리펩타이드(예를 들어 항체)이다.
"면역 반응"은 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 비 제한적으로 헬퍼 T 세포 또는 세포독성 T 세포 반응의 임의의 검출 가능한 항원-특이적 또는 동종(allogenic) 활성화, 항체의 생산, 알러지 반응의 T 세포-매개된 활성화 등을 포함한다. 상기 용어는 예를 들어 림프구, 항원 제공 세포, 식세포, 과립구, 및 침입 병원체, 병원체에 의해 감염된 세포 또는 조직, 암성 세포, 또는 자가면역 또는 병원성 감염의 경우, 정상 인간 세포 또는 조직의, 인체에 대한 선택적인 손상, 상기 인체의 파괴, 또는 상기 인체로부터의 제거를 생성시키는 상기 세포 또는 간에 의해 생산되는 용해성 거대분자(항체, 사이토킨 및 보체 포함)의 작용을 포함한다.
"신호 전달 경로"는 세포의 한 부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전달에 한 역할을 하는 다양한 신호 전달 분자들 간의 생화학적 관계를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "세포 표면 수용체"란 어구는 예를 들어 신호를 수용하고 상기와 같은 신호를 세포의 혈장 막을 통해 전송할 수 있는 분자 및 분자들의 복합체를 포함한다.
"항체"는 면역글로불린 분자의 가변 영역 중에 위치한, 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예를 들어 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 상기 용어는 완전한 다클론 또는 단클론 항체뿐만 아니라 그의 단편(예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄(ScFv) 및 도메인 항체(상어 및 카멜리드 항체 포함)), 및 항체 부분, 및 항원 인식 부위를 포함하는 상기 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변이된 형태를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예를 들어 IgG, IgA, 또는 IgM(또는 이들의 하위 부류)을 포함하며, 상기 항체는 임의의 특정 부류의 것일 필요는 없다. 면역글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 상이한 부류들로 지정될 수 있다. 면역글로불린의 5 개의 주요 부류들, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 몇몇은 하위 부류들(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수도 있다. 상기 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤라 칭한다. 상기 면역글로불린의 상이한 부류들의 서브유닛 구조 및 3 차원 형태는 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따른 항체는 오로지 단일 출처로부터 유도되거나 또는 "키메릭"일 수 있다, 즉 상기 항체의 상이한 부분들이 2 개의 상이한 항체들로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, CDR 영역은 래트 또는 쥐 출처로부터 유도될 수 있는 반면, V 영역의 프레임워크 부분은 상이한 동물 출처, 예를 들어 인간으로부터 유도된다. 본 발명의 항체 또는 결합 단편을 재조합 DNA 기법에 의해, 또는 완전 항체의 효소 또는 화학적 절단에 의해 하이브리도마 중에 생성시킬 수도 있다. 달리 나타내지 않는 한, "항체"란 용어는 2 개의 전장 중쇄 및 2 개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 이외에, 그의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 이들의 예는 하기에 개시된다.
"경쇄"란 용어는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 경쇄 및 그의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL, 및 불변 영역 도메인 CL을 포함한다. 상기 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩타이드의 아미노 말단에 있다. 본 발명에 따른 경쇄는 카파 쇄 및 람다 쇄를 포함한다.
"중쇄"란 용어는 결합 특이성을 부여하기에 충분한 가변 영역 서열을 갖는 전장 중쇄 및 그의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 상기 VH 도메인은 폴리펩타이드의 아미노 말단에 있고 CH 도메인은 카복시 말단에 있으며, 이때 CH3은 --COOH 단부에 가장 가깝다. 본 발명에 따른 중쇄는 임의의 아이소타입, 예를 들어 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 서브유형을 포함한다), IgA(IgA1 및 IgA2 서브유형을 포함한다), IgM을 가질 수도 있다. 상기 VH 및 VL 영역들을, 프레임워크 영역(FR)이라 지칭되는, 보다 보존된 영역들이 산재된, 상보성 결정 영역(CDR)이라 지칭되는 초가변성의 영역들로 추가로 세분할 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3 개의 CDR, 및 4 개의 FR로 구성되며, 하기의 순서로 아미노 말단에서부터 카복시 말단으로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 상기 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 상기 항체들의 불변 영역들은 면역계의 다양한 세포들(예를 들어 효과기 세포) 및 전통적인 보체 시스템의 제 1 성분(Clq)을 포함하여, 숙주 조직 또는 인자들에 대한 상기 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 상기 가변 및 불변 영역들은 약 12 이상 아미노산의 "J" 영역에 의해 결합되며, 이때 상기 중쇄는 약 10 이상 아미노산의 "D" 영역을 또한 포함한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7(Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989)]을 참조하시오.
본 발명에 사용된 바와 같이, 항체의 "항원 결합 부분"(또는 단순히 "항체 부분")이란 용어는 항원(예를 들어 α5β1)에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하는 항체의 하나 이상의 단편들을 지칭한다. 항체의 항원 결합 작용은 전장 항체의 단편들에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타났다. 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어 내에 포함되는 결합 단편들의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인들로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 다이설파이드 가교에 의해 결합된 2 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인들로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 가지의 VL 및 VH 도메인들로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역(CDR)이 있다. 더욱 또한, 상기 Fv 단편의 2 개 도메인, VL 및 VH는 별도의 유전자들에 의해 암호화되지만, 이들을 재조합 방법을 사용하여, 상기 VL 및 VH 영역들이 짝을 이뤄 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 제조될 수 있도록 합성 링커에 의해 결합시킬 수 있다(단일 쇄 Fv(scFv)로서 공지됨; 예를 들어 문헌[Bird et al.(1988) Science 242:423-426]; 및 [Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조). 상기와 같은 단일 쇄 항체들을 또한 항체의 "항원 결합 부분"이란 용어 내에 포함하고자 한다. 이들 항체 단편들을 임의의 적합한 기법, 예를 들어 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득할 수 있으며, 상기 단편들을 완전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성들을 갖는 다른 항체들이 실질적으로 없는 항체를 지칭함을 의미한다(예를 들어 Dkk-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 Dkk-1 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나 Dkk-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종들로부터의 다른 항원, 예를 들어 Dkk-1에 대해 교차 반응성을 갖는다. 더욱이, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수도 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 면역글로불린 쇄의 "면역학적으로 작용성인 단편"(또는 단순히 "단편")이란 용어는 전장 쇄 중에 존재하는 아미노산들 중 적어도 일부가 없지만 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 경쇄 또는 중쇄의 일부를 지칭한다. 상기와 같은 단편들은 이들이 표적 항원에 특이적으로 결합하고 주어진 에피토프에 대한 특이적인 결합에 대해 완전 항체와 경쟁할 수 있다는 점에서 생물학적으로 활성이다. 본 발명의 하나의 태양에서, 상기와 같은 단편은 상기 전장 경쇄 또는 중쇄 중에 존재하는 하나 이상의 CDR을 유지할 것이며, 일부 실시태양에서 단일 중쇄 및/또는 경쇄 또는 그의 일부를 포함할 것이다. 이들 생물학적으로 활성인 단편들은 재조합 DNA 기법에 의해 생산되거나 또는 완전 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 면역학적으로 작용성인 면역글로불린 단편들로는 비 제한적으로 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 도메인 항체 및 단일 쇄 항체가 있으며, 임의의 포유동물 출처, 예를 들어 비 제한적으로 인간, 마우스, 래트, 카멜리드 또는 토끼로부터 유도될 수 있다. 본 발명 항체들의 작용성 부분, 예를 들어 하나 이상의 CDR이 제 2 단백질 또는 소 분자에 공유적으로 결합되어, 이작용성 치료 성질을 갖거나 또는 연장된 혈청 반감기를 갖는, 체 내 특정 표적에 대해 지정된 치료제를 생성시킬 수 있음이 또한 고려된다.
"Fab 단편"은 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1 및 가변 영역들로 구성된다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 다이설파이드 결합을 형성할 수 없다.
"Fc" 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 2 개의 중쇄 단편들을 함유한다. 상기 2 개의 중쇄 단편들은 2 개 이상의 다이설파이드 결합에 의해서 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해서 함께 유지된다.
"Fab' 단편"은 하나의 경쇄, 및 VH 도메인 및 CH1 도메인 및 또한 상기 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하는 하나의 중쇄의 일부를 함유하여, 2 개의 Fab' 단편들의 2 개의 중쇄 사이에 쇄 간 다이설파이드 결합이 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
"F(ab')2 단편"은 2 개의 경쇄, 및 CH1과 CH.sup.2 도메인 사이의 불변 영역의 일부를 함유하는 2 개의 중쇄를 함유하여, 상기 2 개의 중쇄 사이에 쇄 간 다이설파이드 결합을 형성한다. 따라서 F(ab')2 단편은 2 개의 중쇄 사이에 다이설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 2 개의 Fab' 단편으로 구성된다.
"Fv 영역"은 중쇄 및 경쇄 모두로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 없다.
"단일 쇄 항체"는 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어, 항원-결합 영역을 형성하는 단일의 폴리펩타이드 쇄를 형성하는 Fv 분자이다. 단일 쇄 항체들은 예를 들어 WO 88/01649 및 미국 특허 제 4,946,778 및 5,260,203 호에 상세히 논의되어 있다.
"도메인 항체"는 오직 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역학적으로 작용성인 면역글로불린 단편이다. 일부의 경우, 2 개 이상의 VH 영역들이 펩타이드 링커와 공유적으로 결합되어 2가 도메인 항체를 생성시킨다. 2 가 도메인 항체의 2 개의 VH 영역들은 동일하거나 상이한 항원들을 표적화할 수 있다.
"2가 항체"는 2 개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부의 경우, 상기 2 개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이중 특이성(bispecific)(하기 참조)일 수도 있다
"다중 특이성 항체"는 하나보다 많은 항원 또는 에피토프를 표적화하는 것이다.
"이중 특이성", "이중-특이적" 또는 "이작용성" 항체는 2 개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항체이다. 이중 특이성 항체는 다중 특이성 항체의 종류이며 다양한 방법들, 예를 들어 비 제한적으로 하이드리도마들의 융합 또는 Fab' 단편들의 결합에 의해 생성될 수 있다(예를 들어 문헌[Songsivilai & Lachmann (1990), Clin. Exp. Immunol. 79:315-321]; 및 [Kostelny et al.(1992), J. Immunol. 148:1547-1553] 참조). 이중 특이성 항체의 2 개의 결합 부위들은, 동일하거나 상이한 단백질 표적 상에 존재할 수도 있는 2 개의 상이한 에피토프들에 결합할 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "단클론 항체"는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다, 즉 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 천연 돌연변이를 제외하고 상기 집단을 구성하는 개별적인 항체들이 동일하다. 단클론 항체들은 고도로 특이적이며, 단일 항원 부위에 대해 지정된다. 더욱 또한, 전형적으로 상이한 결정인자들(에피토프들)에 대해 지정된 상이한 항체들을 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지정된다. "단클론"이란 수식 어구는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체의 특성을 가리키며, 임의의 특별한 방법에 의한 상기 항체의 필요 생산으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체는 문헌[Kohler and Milstein(1975) Nature 256:495]에 처음으로 개시된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나; 또는 미국 특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수도 있다. 상기 단클론 항체를 또한 예를 들어 문헌[McCafferty et al.(1990) Nature 348:552-554]에 개시된 기법을 사용하여 생성시킨 파지 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
"인간 항체 유도체"란 용어는 인간 항체의 임의의 변이된 형태, 예를 들어 상기 항체와 또 다른 작용제 또는 항체의 접합체를 지칭한다.
"인간화된 항체"란 용어는 또 다른 포유동물 종들, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열들이 인간 프레임워크 서열들 상에 이식된 항체를 지칭한다. 추가적인 프레임워크 영역 변이들이 상기 인간 프레임워크 서열들 내에서 이루어질 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "인간화된" 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 하위서열들)인 비-인간(예를 들어 쥐) 항체의 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종들(공여 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 면역글로불린(수용 항체)이다. 일부의 경우에서, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 더욱 또한, 상기 인간화된 항체는 수용 항체에서도 유입된 CDR 또는 프레임워크 서열들에서도 발견되지 않지만, 항체 성능을 추가로 다듬고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 하나 이상, 및 전형적으로는 2 개의 가변 도메인들을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 이때 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 비-인간 면역글로불린의 영역들에 상응하며 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 영역들이다. 상기 인간화된 항체는 최적으로는 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 것을 또한 포함할 것이다. WO 99/58572에 개시된 바와 같이 변이된 Fc 영역들을 갖는 항체들이 바람직하다. 인간화된 항체의 다른 형태들은, 또한 존재하는 원래 항체들에 대해 변경된 하나 이상의 CDR들(CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 및/또는 CDR H3)을 갖는다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 항체", 또는 "완전 인간 항체"란 용어는 프레임워크 및 CDR 영역들이 모두 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된 가변 영역들을 갖는 항체를 포함함을 의미한다. 더욱 또한, 상기 항체가 불변 영역을 함유하는 경우, 상기 불변 영역은 또한 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 본원의 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부분들은 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기들(예를 들어 시험관 내에서 랜덤 또는 부위-특이적인 돌연변이에 의해 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)을 포함할 수도 있다. 그러나, 본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 항체"란 용어는 또 다른 포유동물 종, 예를 들어 마우스의 생식계열로부터 유도된 CDR 서열들이 인간 프레임워크 서열들 상에 이식된 항체들을 포함함을 의미하지는 않는다.
"인간 단클론 항체" 또는 "완전 인간 단클론 항체"란 용어는 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 인간 생식계열 면역글로불린 서열들로부터 유도된 가변 영역들을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체들을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 상기 인간 단클론 항체는 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 획득한 B 세포(이때 상기 B 세포는 불멸화된 세포에 융합된다)를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "재조합 인간 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생산되거나 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 (a) 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스염색체인 동물(예를 들어 마우스)로부터 단리된 항체(하기에 추가로 개시됨), (b) 인간 항체를 발현하기 위해 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합체, 조합적인 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역글로불린 유전자 서열의 연접을 수반하는 임의의 다른 수단들에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생산되거나 또는 단리된 항체를 포함한다. 상기와 같은 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유도되는 가변 영역들을 갖는다. 그러나, 몇몇 실시태양에서 상기와 같은 재조합 인간 항체들에 대해 시험관 내 돌연변이(또는 인간 Ig 서열에 트랜스제닉인 동물을 사용하는 경우, 생체 내 체세포 돌연변이)를 가할 수 있으며, 따라서 상기 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유도되고 이들과 관련되었지만 생체 내에서 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수도 있는 서열이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "아이소타입" 또는 "부류"는 상기 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 암호화되는 항체 부류(예를 들어 IgM 또는 IgG)를 지칭한다. 상기 항체의 불변 도메인은 항원에 대한 결합에 관여하지 않고, 다양한 효과기 작용을 나타낸다. 상기 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 주어진 인간 항체 또는 면역글로불린을 면역글로불린의 5 개 주요 부류들, 즉 IgA, IgD, IgE, IgC 및 IgM 중 하나로 지정할 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들의 구조 및 3차원 형태들은 널리 공지되어 있다. 다양한 인간 면역글로불린 부류들 중에서, 오직 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 및 IgM만이 보체를 활성화하는 것으로 공지되어 있다. 인간 IgG1 및 IgG3은 인간에서 ADCC를 매개하는 것으로 공지되어 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "하위 부류"는 중쇄 불변 영역 유전자의 아이소타입 내의 추가적인 열거, 예를 들어 IgG 아이소타입 내의 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위 부류를 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "화합물" 또는 "약학 화합물"이란 용어는 항체, 그의 항원 결합 부분, 면역접합체, 및 이중 특이성 분자를 포함한다.
"항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"란 어구들은 본 발명에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어와 호환적으로 사용된다.
"항체 의존성 세포 세포독성" 또는 "ADCC"란 용어는 비특이적인 세포독성 세포(예를 들어 NK 세포, 호중구, 대식세포 등)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 상기 표적 세포의 용해를 일으키는 세포-매개된 반응을 지칭한다. ADCC를 매개하는 상기와 같은 세포독성 세포는 일반적으로 Fc 수용체(FcR)를 발현한다. ADCC를 매개하는 1차 세포(NK 세포)는 FcγRIII를 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및/또는 FcγRIV를 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)]에 요약되어 있다. 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 시험관 내 ACDD 분석, 예를 들어 미국 특허 제 5,500,362 호 또는 5,821,337 호에 개시된 것을 수행할 수 있다. 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어 문헌[Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 95:652-656(1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"이란 용어는 상기 Fc 영역이 힌지 영역 및 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 개시하는데 사용된다. 예를 들어, 상기 FcR은 고유 서열 인간 FcR일 수 있다. 상기 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것(감마 수용체)일 수 있으며 대립유전자 변이체 및 한편으로 상기 수용체의 연접된 형태들을 포함하여, 상기 FcγRI, FcγRII, FcγRIII 및 FcγRIV 하위 부류의 수용체들을 포함한다. FcγII 수용체는 FcγRIIA("활성화 수용체") 및 FcγRIIB("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 유사한 아미노산 서열들(그들의 세포질 도메인이 주로 상이하다)을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인 중에 면역수용체 타이로신 기재 활성화 동기(ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인 중에 면역수용체 타이로신 기재 억제 동기(ITIM)를 함유한다(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)). FcR들은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991); Capel et al., Immunomethods, 4:25-34(1994)] 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41(1995)]에 고찰되어 있다. 다른 FcR들은, 차후에 동정되는 것들을 포함하여, 본 발명에서 "FcR"이란 용어에 의해 포함된다. 상기 용어는 또한 신생 수용체, FcRn을 포함하며, 상기 수용체는 모체 IgG를 태아에게 운반하는 책임이 있다(Guyer et al., Immunol., 117:587(1976) and Kim et al., J. Immunol., 24:249(1994)). 면역글로불린 Fc 단편 상의 1차 FcR 결합 부위는 CH1과 CH2 도메인 사이의 힌지 영역 중에 존재한다. 상기 힌지 영역은 다양한 백혈구 상의 FcR1-3과 상호작용하며 상기 세포의 표적에 대한 공격을 촉발시킨다(Wines et al., J. Immunol., 164:5313-5318(2000)). 상기 힌지 영역은 비 제한적으로 미국 특허 제 6,165,476 호에 개시된 서열들을 포함한다.
"항체 의존성 세포 세포독성을 유도할 수 있는"이란 용어는 항체와 같은 작용제가, 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 분석(들)에 의해 측정 시, ADCC를 나타내는 능력을 지칭한다. 상기와 같은 활성은 전형적으로는 다양한 FcR들과 상기 Fc 영역의 결합에 의해 특성화된다. 임의의 특정한 기전에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 당해 분야의 숙련가들은 ADCC를 나타내는 항체의 능력이 예를 들어 그의 하위 부류들(예를 들어 IgG1 또는 IgG3)에 의하거나, 상기 Fc 영역 내에 도입된 돌연변이에 의하거나, 또는 상기 항체의 Fc 영역 중의 탄수화물 패턴에 대한 변이에 의한 것일 수 있음을 알 것이다. 상기와 같은 변이들은 예를 들어 미국 특허 출원 공보 제 2007/0092521 호에 개시되어 있다.
"중화 항체"란 용어는 리간드에 결합하여, 상기 리간드가 그의 결합 상대에 결합하는 것을 방지하고, 그렇지 않으면 결합 상대에 대한 상기 리간드 결합으로부터 생성될 수 있는 생물학적 반응을 방해하는 항체를 지칭한다. 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편의 결합 및 특이성의 평가에 있어서, 항체 또는 단편은 과잉의 항체가 리간드에 결합된 결합 상대의 양을 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% 이상까지 감소시키는 경우(시험관 내 경쟁적인 결합 분석에서 측정 시) 상기 리간드의 결합 상대에 대한 결합을 실질적으로 억제할 것이다. Dkk-1에 대한 항체의 경우에, 중화 항체는 LRP5 또는 LRP6에 결합하는 Dkk-1의 능력을 감소시킬 것이며, 이에 의해 Wnt 활성의 측정 가능한 증가가 유도될 것이다.
동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항체들과 관련하여 사용되는 경우 "경쟁하다"란 용어는 항체들간의 경쟁을 의미하며 시험 하의 항체 또는 면역학적으로 작용성인 단편이 기준 항체의 공통 항원(예를 들어 Dkk-1 또는 그의 단편)에의 특이적 결합을 방지 또는 억제하는 분석에 의해 측정된다. 다수의 유형의 경쟁 결합 분석, 예를 들어 고상 직접 또는 간접 방사성면역분석(RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역분석(EIA), 샌드위치 경쟁 분석(예를 들어, 문헌[Stahli et al.(1983) Methods in Enzymology 9:242-253] 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어 문헌[Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619] 참조) 고상 직접 표지된 분석, 고상 직접 표지된 샌드위치 분석(예를 들어 문헌[Harlow and Lane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press] 참조); I-125 표지를 사용하는 고상 직접 표지 RIA(예를 들어 문헌[Morel et al. (1988) Molec. Immunol. 25:7-15] 참조); 고상 직접 비오틴-아비딘 EIA(예를 들어 문헌[Cheung, et al.(1990) Virology 176:546-552] 참조); 및 직접 표지된 RIA(Moldenhauer et al. (1990) Scand. J. Immunol. 32:77-82)를 사용할 수 있다. 전형적으로, 상기와 같은 분석은 표지되지 않은 시험 면역글로불린 및 표지된 기준 면역글로불린 중 어느 하나를 갖는 고체 표면 또는 세포에 결합된 정제된 항원의 사용을 수반한다. 경쟁 억제를, 시험 면역글로불린의 존재 하에서 상기 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정한다. 대개 상기 시험 면역글로불린은 과잉으로 존재한다. 경쟁 분석에 의해 확인된 항체(경쟁하는 항체)는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애를 발생시키기 위해 상기 기준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 경쟁 결합의 측정을 위한 방법에 관한 추가적인 상세한 설명이 본 발명의 실시예에 제공된다. 대개, 경쟁 항체가 과잉으로 존재하는 경우, 상기 항체는 공통 항원에 대한 기준 항체의 특이적인 결합을 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75% 이상까지 억제할 것이다. 일부 예에서, 결합은 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 97% 이상까지 억제된다.
"항원"이란 용어는 선택적인 결합제, 예를 들어 항체에 의해 결합될 수 있고, 추가로 상기 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하는 동물에 사용될 수 있는 분자 또는 분자의 일부를 지칭한다. 항원은 상이한 항체들과 상호작용할 수 있는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.
"에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정인자를 포함한다. 에피토프는 항원을 특이적으로 표적화하는 항체에 의해 결합되는 상기 항원의 영역이며, 상기 항원이 단백질인 경우, 상기 항체와 직접 접촉하는 특정한 아미노산을 포함한다. 대단히 종종, 에피토프는 단백질 상에 존재하나, 일부의 경우에는 다른 종류의 분자, 예를 들어 핵산 상에 존재할 수도 있다. 에피토프 결정인자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐 그룹과 같은 분자들의 화학적으로 활성인 표면 그룹들을 포함할 수 있으며 특정한 3차원 구조 특징 및/또는 특정한 전하 특징을 가질 수도 있다. 일반적으로, 특정 표적 항원에 특이적인 항체는 단백질 및/또는 거대분자들의 복잡한 혼합물 중에서 표적 항원 상의 에피토프를 우선적으로 인식할 것이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "특이적으로 결합하는"이란 어구는 특정한 분자를 인식하고 상기 분자에 결합하지만, 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 화합물, 예를 들어 단백질, 핵산, 항체 등을 의미한다. 예를 들어, 샘플 중의 동족(cognate) 리간드를 인식하고 이에 결합하지만(예를 들어 동족 항원, Dkk-1과 결합하는 항-Dkk-1 항체) 상기 샘플 중의 다른 분자는 실질적으로 인식하거나 결합하지 않는 항체 또는 펩타이드 억제제를 의미한다. 따라서, 지정된 분석 조건 하에서, 명시된 결합 부분(예를 들어 항체 또는 그의 단편(예를 들어 그의 항원 결합 부분))은 특정한 표적 분자, 예를 들어 Dkk-1에 우선적으로 결합하며 시험 샘플 중에 존재하는 다른 성분들에는 현저한 양으로 결합하지 않는다. 다양한 분석 포맷들을 사용하여 관심 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 다수의 분석들 중에서 고상 ELISA 면역분석, 면역침전, 비아코어(BIAcore), FACS, 및 웨스턴 블럿 분석을 사용하여 Dkk-1과 특이적으로 반응하는 항체를 동정할 수 있다. 전형적으로, 특이적이거나 선택적인 반응은 배경 신호 또는 소음의 2 배 이상 및 보다 전형적으로는 상기 배경의 10 배 초과일 것이며, 훨씬 더 구체적으로, 평형 해리 상수(KD)가 ≤1 μM, 예를 들어 ≤100 nM, 및 추가로 예를 들어 ≤10 nM인 경우 항체를 항원에 "특이적으로 결합한다"라고 한다.
본 발명의 항체는 상기 해리 상수(Kd)가 바람직하게는 약 100 pM 이하, 약 1 x 10-9 이하, 또는 1 x 10-8 이하인 경우 그의 표적 항원에 "특이적으로 결합한다"라고 한다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "kon"이란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 진행 속도(on-rate) 또는 결합 속도를 지칭함을 의미하는 반면, "koff"란 용어는 특정 항체-항원 상호작용의 중단 속도(off-rate) 또는 해리 속도를 지칭함을 의미한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "KD"란 용어는 koff 대 kon의 비(즉 koff/kon)로부터 획득되고 몰 농도(M)로서 표현되는 해리 상수를 지칭함을 의미한다. 항체들에 대한 KD 값은 당해 분야에 널리 확립된 방법들을 사용하여 측정될 수 있다. 항체의 KD를 측정하는 한 가지 방법은 표면 플라스몬 공명을 사용함에 의한다, 전형적으로는 바이오센서 시스템, 예를 들어 비아코어(등록상표) 시스템을 사용함에 의한다.
IgG 항체에 대한 "고 친화성"이란 용어는 일반적으로 표적 항원에 대해 1 x 10-7 M 이하, 5 x 10-8 M 이하, 또는 5 x 10-9 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다. 그러나, "고 친화성" 결합은 다른 항체 아이소타입들에 대해 변할 수 있다. 예를 들어, IgM 아이소타입에 대한 "고 친화성" 결합은 10-6 M 이하, 10-7 M 이하, 또는 10-8 M 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.
"일치성"이란 용어는 서열들을 정렬하여 비교함으로써 측정 시, 2 개 이상의 폴리펩타이드 분자들 또는 2 개 이상의 핵산 분자들의 서열들 간의 관계를 지칭한다. "일치율"은 비교된 분자들 중의 아미노산 또는 뉴클레오타이드들 간의 동일한 잔기들의 퍼센트를 의미하며 비교되는 분자들 중 가장 작은 크기를 기준으로 계산된다. 상기 계산의 경우, 정렬들 중의 끊김(존재하는 경우)은 특정한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉 "연산")에 의해 다루어져야 한다. 정렬된 핵산들 또는 폴리펩타이드들의 일치성을 계산하는데 사용될 수 있는 방법은 하기의 문헌들에 개시된 것들을 포함한다: Computational Molecular Biology, (Lesk, A.M., ed.)(1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D.W., 3d.)(1993) New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.)(1994) New Jersey: Humana Press; von Heinje, G.(1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.)(1991) New York: M. Stockton Press; and Carillo et al.(1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073.
일치율의 계산에서, 비교되는 서열들을 상기 서열들 간의 가장 큰 합치를 제공하는 방식으로 정렬시킨다. 일치율 측정에 사용되는 컴퓨터 프로그램은 GCG 프로그램 패키지이며, 이는 GAP(Devereux et al.(1984) Nucl Acid Res 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wisc.)을 포함한다. 상기 컴퓨터 연산 GAP을 사용하여, 서열 일치율을 측정하고자 하는 2 개의 폴리펩타이드들 또는 폴리뉴클레오타이드들을 정렬시킨다. 상기 서열들을 그들 각각의 아미노산 또는 뉴클레오타이드의 최적 합치를 위해 정렬시킨다(상기 연산에 의해 측정된 바와 같은 "합치된 범위"). 끊김 벌점(gap opening penalty)(3 x 평균 대각선으로서 계산되며, 여기에서 "평균 대각선"은 사용되는 비교 행렬의 대각선의 평균이고; "대각선"은 특정 비교 행렬에 의해 각각의 완전한 아미노산 합치에 대해 지정되는 점수 또는 수이다) 및 끊김 확장 벌점(gap extension penalty)(대개는 상기 끊김 벌점의 1/10 배이다)뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM62와 같은 비교 행렬을 상기 연산과 함께 사용한다. 몇몇 실시태양에서, 표준 비교 행렬(상기 PAM 250 비교 행렬의 경우 문헌[Dayhoff et al.(1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352] 참조; 상기 BLOSUM 62 비교 행렬의 경우 문헌[Henikoff et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919] 참조)을 또한 상기 연산에 의해 사용한다.
상기 GAP 프로그램을 사용하여 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 서열들에 대한 일치율을 측정하기 위해 권장되는 매개변수들은 하기와 같다:
연산: Needleman et al.(1970) J. Mol. Biol. 48:443-453;
비교 행렬: 상기 헤니코프 등(Henikoff et al.(1992))으로부터의 BLOSUM 62;
끊김 벌점: 12(그러나 단부 끊김에 대한 벌점은 없다)
끊김 길이 벌점: 4
유사성의 역치: 0
2 개 아미노산 서열들을 정렬시키기 위한 몇몇 정렬 설계는 상기 두 서열들의 단지 짧은 영역들만의 합치를 생성시킬 수 있으며, 이러한 작은 정렬 영역은 상기 두 전장 서열들 간에 현저한 관계가 없다 하더라도 매우 높은 서열 일치성을 가질 수 있다. 따라서, 상기 선택된 정렬 방법(GAP 프로그램)을, 원하는 경우, 표적 폴리펩타이드의 50 개 이상의 연속적인 아미노산들에 걸쳐 있는 정렬을 생성시키도록 조절할 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "실질적으로 순수한"은 개시된 분자 종들이 우세하게 존재하는 종들임을 의미한다, 즉 몰 기준으로 동일한 혼합물 중에서 임의의 다른 개별적인 종들보다 더 풍부함을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 실질적으로 순수한 분자는 대상 종들이, 존재하는 모든 거대분자 종들의 50% 이상(몰 기준으로)을 차지하는 조성물이다. 다른 실시태양에서, 실질적으로 순수한 조성물은 상기 조성물 중에 존재하는 모든 거대분자 종들의 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상을 차지할 것이다. 다른 실시태양에서, 상기 대상 종들은 필수 동종성으로 정제되며, 여기에서 오염 종들은 통상적인 검출 방법에 의해 상기 조성물 중에서 검출될 수 없고 따라서 상기 조성물은 단일의 검출 가능한 거대분자 종들로 이루어진다.
"아미노산"은 당해 분야에서의 그의 통상적인 의미를 포함한다. 20 개의 천연 아미노산 및 그들의 약어는 통상적인 용법에 따른다. 임의의 목적으로 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Immunology -- A Synthesis, 2nd Edition, (E.S. Golub and D.R. Gren, Eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass.(1991)]을 참조하시오. 상기 20 개의 통상적인 아미노산들의 입체 이성체(예를 들어 D-아미노산), 비 천연 아미노산, 예를 들어 α-, α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산, 및 다른 통상적이지 않은 아미노산들도 또한 본 발명의 폴리펩타이드에 적합한 성분들일 수 있다. 통상적이지 않은 아미노산의 예로는 4-하이드록시프롤린, .감마.-카복시글루타메이트, .엡실론.-N,N,N-트라이메틸리신, .엡실론.-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-폼일메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, .시그마.-N-메틸아르기닌, 및 다른 유사한 아미노산 및 이미노산들(예를 들어 4-하이드록시프롤린)이 있다. 본 발명에 사용된 폴리펩타이드 표기에서, 좌측 방향은 표준 용법 및 규약에 따라, 아미노 말단 방향이고 우측 방향은 카복시 말단 방향이다.
"골감소증"이란 용어는 정상적인 골 미네랄 밀도(BMD)를 갖는 것으로 간주되는 표준 환자에 비해 1 이상의 표준 편차의 골 손실을 갖는 환자를 지칭한다. 예를 들어, 상기 크기는 이중 에너지 X-선 흡광 분석법(DEXA)에 의해 측정될 수 있으며, 상기 환자의 BMD를 연령 및 성별-부합 표준(Z 점수)과 비교한다. 골감소증의 측정에서, BMD 측정을 하나 이상의 뼈에서 수행할 수도 있다.
"치료 유효량"이란 용어는 포유동물에게서 치료 반응을 생성시키는 것으로 측정된 항-Dkk-1 항체의 양을 지칭한다. 상기와 같은 치료 유효량은 당해 분야의 통상적인 숙련가에 의해 쉽게 확인된다.
"당형태"는 다양한 탄수화물 단위들의 결합을 포함하는 복합 올리고사카라이드 구조물을 지칭한다. 상기와 같은 구조물은 예를 들어 문헌[Essentials of Glycobiology Varki et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1999)](표준 당생물학 명명법에 대한 개관을 또한 제공한다)에 개시되어 있다. 상기와 같은 당형태는 비 제한적으로 G2, G1, G0, G-1 및 G-2를 포함한다(예를 들어 WO 99/22764 참조).
"글리코실화 패턴"은 상기 당형태(들)가 단백질, 보다 구체적으로 면역글로불린 단백질의 펩타이드 주쇄에 공유 결합되는 부위(들)뿐만 아니라 단백질에 공유 결합되는 탄수화물 단위(예를 들어 당형태)의 패턴으로서 정의된다.
상이한 세포 주들에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현되는 항체들은 서로에 대해 상이한 당형태 및/또는 글리코실화 패턴을 가질 듯하다. 그러나, 본 발명에 제공된 핵산 분자들에 의해 암호화되거나 또는 본 발명에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체들은, 상기와 같은 항체들의 글리코실화와 관계없이, 본 내용의 일부이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "피실험자"란 용어는 임의의 인간 또는 비인간 동물을 포함한다. "비인간 동물"이란 용어는 모든 척추동물들, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 양, 개, 고양이, 말, 소, 닭, 챔팬지, 파충류 등을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "치료하다"는 환자가 경험하는 질병 증상의 빈도를 감소시킴을 의미한다. 상기 용어는 질병의 증상, 합병증 또는 생화학적 표시의 개시를 방지 또는 지연시켜, 상기 증상들을 경감시키거나 또는 상기 질병, 질환 또는 장애의 추가적인 발생을 저지 또는 억제하기 위한 본원의 화합물 또는 작용제의 투여를 포함한다. 치료는 예방학적(상기 질병의 개시를 방지 또는 지연시키거나, 또는 임상 또는 그의 준 임상 증상의 발현을 방지하기 위한) 또는 상기 질병의 발현 후 증상들의 치료학적 억제 또는 경감일 수 있다.
본원의 다양한 일반적인 태양들을 하기 소분류 하에 추가로 상세히 개시한다.
개관
본 발명은 Dkk-1에 특이적인 면역글로불린의 항체 및 항원-결합 부위를 포함하는 신규의 조성물을 제공한다. 이들 항체 및 항체 단편 중 일부는 래트, 마우스 및 인간 Dkk-1을 포함한, 여러 포유동물 출처로부터의 Dkk-1과 교차 반응할 수 있다. 상기 항체 및 단편 중 일부는 또 다른 것보다 하나의 종으로부터의 Dkk-1에 대해 더 높은 친화성을 갖는다. 본 발명은 또한 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편뿐만 아니라 키메릭, 인간화된 및 인간 항체를 포함한 신규의 중화 항체들을 제공한다. 상기 항체 및 단편을 암호화하는 핵산뿐만 아니라 이들 핵산을 사용하여 상기 항체를 발현하는 방법을 또한 개시한다. 또 다른 태양에서, 본 발명은 항체 항원-결합 부위의 면역학적 결합 성질을 나타낼 수 있는 분자(예를 들어 면역학적으로 작용성인 단편 및 폴리펩타이드)에 관한 것이다.
본 발명에 개시된 항체 및 면역학적으로 작용성인 단편은 다양한 유용성을 갖는다. 예를 들어 상기 항체 및 단편 중 일부는 특정한 결합 분석, Dkk-1 또는 그의 리간드의 친화성 정제 및 Dkk-1 활성의 다른 길항물질들을 확인하기 위한 선별 분석에 유용하다. 상기 항체들 중 몇몇을 사용하여 Dkk-1의 활성과 관련 있는 다양한 질병들을 치료할 수 있다. 따라서 일부 항체 및 단편을 BMD 증가, 새로운 뼈의 합성, 전신 골 손실(예를 들어 골 미란)의 치료, 골 보수, 및 다양한 형태의 관절염의 치료와 같이 뼈와 관련된 다양한 치료들에 사용할 수 있다. 개시되는 항체 및 단편 중 몇몇은 그러나 골 질병과 관련되지 않은 다양한 다른 질병들의 치료에 사용될 수 있다.
항체 및 단편
Dkk-1의 활성을 조절하는데 유용한 다양한 선택적인 결합제들을 제공한다. 이들 작용제는 예를 들어 항원 결합 도메인(예를 들어 단일 쇄 항체, 도메인 항체, 면역부착, 및 항원 결합 영역을 갖는 폴리펩타이드)을 함유하고 Dkk-1 폴리펩타이드(예를 들어 인간, 래트 및/또는 쥐 Dkk-1 폴리펩타이드)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 포함한다. 상기 작용제들 중 일부는 예를 들어 LRP5 및/또는 LRP6에 대한 Dkk-1의 결합을 억제하는데 유용하며, 따라서 Wnt 신호전달과 관련된 하나 이상의 활성들을 자극하는데 사용될 수 있다.
천연 항체 구조
상기 제공되는 결합제들 중 일부는 전형적으로는 천연 항체와 관련된 구조를 갖는다. 이들 항체의 구조 단위는 전형적으로는 하나 이상의 사량체를 포함하며, 이들은 각각 2 개의 동일한 한 쌍의 폴리펩타이드 쇄로 구성되지만, 일부 포유동물 종들은 또한 오직 단일 중쇄만을 갖는 항체를 생산한다. 전형적인 항체에서, 각각의 쌍 또는 한 쌍은 하나의 전장 "경" 쇄(몇몇 실시태양에서 약 25 kDa) 및 하나의 전장 "중" 쇄(몇몇 실시태양에서 약 50 내지 70 kDa)를 포함한다. 각각의 개별적인 면역글로불린 쇄는 여러 개의 "면역글로불린 도메인들"로 구성되며, 이들은 각각 대략 90 내지 110 개 아미노산으로 이루어지고 특징적인 접힘 패턴을 나타낸다. 이들 도메인은 항체 폴리펩타이드들을 구성하는 기본 단위들이다. 각 쇄의 아미노 말단 부분은 전형적으로는 항원 인식을 책임지는 가변 도메인을 포함한다. 카복시 말단 부분은 진화상 상기 쇄의 다른 단부보다 더 보존되며 "불변 영역" 또는 "C 영역"이라 지칭된다. 인간 경쇄는 일반적으로 카파 및 람다 경쇄로서 분류되고, 이들은 각각 하나의 가변 도메인 및 하나의 불변 도메인을 함유한다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론 쇄로서 분류되며, 이들은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 상기 항체의 아이소타입을 한정한다. IgG는 여러 개의 서브유형들, 예를 들어 비 제한저으로 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 갖는다. IgM 서브유형은 IgM 및 IgM2를 포함한다. IgA 서브유형은 IgA1 및 IgA2를 포함한다. 인간에서, 상기 IgA 및 IgD 아이소타입은 4 개의 중쇄 및 4 개의 경쇄를 함유하고; 상기 IgG 및 IgE 아이소타입은 2 개의 중쇄 및 2 개의 경쇄를 함유하며; 상기 IgM 아이소타입은 5 개의 중쇄 및 5 개의 경쇄를 함유한다. 상기 중쇄 C 영역은 전형적으로는 효과기 작용을 책임질 수 있는 하나 이상의 도메인들을 포함한다. 중쇄 불변 영역 도메인의 수는 상기 아이소타입에 따라 변할 것이다. 예를 들어 IgG 중쇄는 각각 CH1, CH2 및 CH3로서 공지된 3 개의 C 영역 도메인들을 함유한다. 상기 제공되는 항체는 이들 아이소타입 및 서브유형들 중 임의의 유형을 가질 수 있다.
전장 경쇄 및 중쇄에서, 상기 가변 및 불변 영역들은 약 12 개 이상 아미노산들의 "J" 영역에 의해 결합되며, 이때 상기 중쇄는 약 10 개 이상 아미노산의 "D" 영역을 또한 포함한다. 예를 들어 문헌[Fundamental Immunology, 2nd ed., Ch.7(Paul, W., ed.)(1989) New York: Raven Press](모든 목적을 위해 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)을 참조하시오. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역들은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다.
면역글로불린 쇄의 가변 영역은 일반적으로 3 개의 초가변성 영역들, 보다 종종 "상보성 결정 영역" 또는 CDR이라 불리는 영역들에 의해 결합되는 비교적 보존된 프레임워크 영역(FR)을 포함하여, 동일한 전체 구조를 나타낸다. 상기 언급된 각각의 중쇄/경쇄의 2 개 쇄로부터의 CDR들은 전형적으로 상기 프레임워크 영역들에 의해 정렬되어 표적 단백질(예를 들어 Dkk-1) 상의 특정 에피토프와 특이적으로 결합하는 구조를 형성한다. N 말단에서부터 C 말단으로, 천연 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 모두 전형적으로 하기 요소들의 하기 순서를 따른다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 넘버링 시스템은 이들 각 도메인 중의 자리를 차지하는 아미노산들에 대해 번호를 지정하기 위해 고안되었다. 상기 넘버링 시스템은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987 and 1991) National Institutes of Health, Bethesda, Md.] 또는 [Chothia & Lesk(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917]; [Chothia et al.(1989) Nature 342:878-883]에 정의되어 있다. 본원에 의해 제공된 각각의 경쇄들은 본원에 의해 제공된 중쇄들 중 임의의 쇄와 결합하여 항체를 형성할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 항체는 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄를 함유한다. 제공되는 다른 항체들은 상기 제공되는 중쇄 및 경쇄의 조합에 의해 형성된 항체들의 변이체이며 쇄 각각이 이들 쇄의 아미노산 서열에 대해 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99% 이상의 일치성을 갖는 경쇄 및/또는 중쇄를 포함한다. 일부의 경우, 상기와 같은 항체는 적어도 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄를 포함하는 반면, 다른 경우에 상기와 같은 변이체 형태들은 2 개의 동일한 경쇄 및 2 개의 동일한 중쇄를 함유한다.
항체의 CDR
주어진 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 및 프레임워크 영역(FR)을 문헌[Kabat et al., in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242(1991)]에 개시된 시스템을 사용하여 동정할 수 있다. 본 발명에 개시된 몇몇 항체들은 상기 제공된 바와 같은 CDR 중 하나 이상의 아미노산 서열과 동일하거나 상당한 서열 일치성을 갖는 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 제공되는 항체 및 단편은 상기 나열한 CDR 중 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 개 전부를 포함할 수 있다. 일부 항체들은 표 4에 나열한 CDR들의 변이체 형태를 가지며, 이때 상기 CDR들 중 하나 이상(즉 2, 3, 4, 5 또는 6)은 각각, 제공되는 특정한 CDR 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상의 서열 일치성을 갖는다.
경쟁 항체 및 단편
Dkk-1에 대한 특이적인 결합에 대해 상기 예시되는 항체 또는 작용 단편과 경쟁하는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 및 단편은 상기 예시된 항체들 중 하나와 동일한 에피토프에도 또한 결합할 수도 있다. 상기 예시되는 항체 또는 단편과 동일한 에피토프와 경쟁하거나 이에 결합하는 항체 및 단편은 유사한 작용성 성질을 나타낼 것으로 예상된다.
단클론 항체
상기 제공되는 항체는 Dkk-1에 결합하는 단클론 항체를 포함한다. 단클론 항체는 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여, 예를 들어 면역 스케줄의 완료 후에 트랜스제닉 동물로부터 수확한 비장 세포를 불멸화시킴으로써 생성시킬 수 있다. 상기 비장 세포는 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여, 예를 들어 상기 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시킴으로써 불멸화시킬 수 있다. 하이브리도마 생산 융합 과정에 사용하기 위한 골수종 세포는 바람직하게는 비 항체 생산성이며, 높은 융합 효율, 및 상기 세포를 오직 원하는 융합된 세포(하이브리도마)의 생육만을 지원하는 몇몇 선택성 배지 중에서 생육할 수 없게 만드는 효소 결핍성을 갖는다. 마우스 융합에 사용하기에 적합한 세포 주의 예로는 Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 및 S194/5XXO Bul이 있으며; 래트 융합에 사용되는 세포 주의 예로는 R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F 및 4B210이 있다. 세포 융합에 유용한 다른 세포 주들은 U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 및 UC729-6이다.
몇몇 예에서, 하이브리도마 세포 주는 동물(예를 들어 인간 면역글로불린 서열을 갖는 트랜스제닉 동물)을 Dkk-1 면역원으로 면역시키고; 상기 면역된 동물로부터 비장 세포를 수확하고; 상기 수확된 비장 세포를 골수종 세포 주에 융합시켜, 하이브리도마 세포를 생성시키고; 상기 하이브리도마 세포로부터 하이브리도마 세포 주를 확립시키고, Dkk-1 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 주를 동정함으로써 생성시킨다. 상기와 같은 하이브리도마 세포 주, 및 이에 의해 생산되는 항-Dkk-1 단클론 항체는 본 발명에 의해 포함된다.
하이브리도마 세포 주에 의해 분비되는 단클론 항체를 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여 정제할 수 있다. 하이브리도마 또는 Mab를, 특별한 성질들, 예를 들어 Wnt 유도된 활성을 차단하는 능력을 갖는 Mab를 동정하기 위해서 추가로 선별할 수도 있다. 상기와 같은 선별의 예는 하기 실시예에 제공된다.
키메릭 및 인간화된 항체
상기 서열들을 기본으로 하는 키메릭 및 인간화된 항체를 또한 제공한다. 치료제로서 사용하기 위한 단클론 항체를 사용 전에 다양한 방식으로 변이시킬 수도 있다. 일례는 "키메릭" 항체이며, 이는 작용성 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 또는 그의 면역학적으로 작용성인 부분들을 생산하도록 공유 결합되는 상이한 항체들로부터의 단백질 분절들로 구성된 항체이다. 일반적으로, 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정한 종으로부터 유도되거나 특정한 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체들 중의 상응하는 서열과 일치하거나 상동성인 반면, 상기 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체들 중의 상응하는 서열과 일치하거나 상동성이다. 키메릭 항체에 관한 방법들에 대해서 예를 들어 미국 특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1985)]을 참조하시오. CDR 이식(grafting)은 예를 들어 미국 특허 제 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; 및 5,530,101 호에 개시되어 있다.
일반적으로, 키메릭 항체의 제조 목적은 의도된 환자 종으로부터의 아미노산의 수가 최대화된 키메라를 생산하는 것이다. 일례는 "CDR-이식된" 항체이며, 여기에서 상기 항체는 특정 종으로부터 또는 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 반면, 상기 항체 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체들 중의 상응하는 서열과 일치하거나 상동성이다. 인간에게 사용하기 위해서, 설치류 항체로부터의 V 영역 또는 선택된 CDR들을 종종 인간 항체에 이식하여, 인간 항체의 천연 V 영역 또는 CDR을 대체한다.
키메릭 항체의 한 가지 유용한 유형은 "인간화된" 항체이다. 일반적으로, 인간화된 항체는 처음에 비인간 동물 중에서 키운 단클론 항체로부터 생산된다. 상기 단클론 항체 중의, 전형적으로는 상기 항체의 비-항원 인식 부분으로부터의 몇몇 아미노산 잔기들을 상응하는 아이소타입의 인간 항체 중의 상응하는 잔기에 상동성이도록 변이시킨다. 인간화를 예를 들어 인간 항체의 상응하는 영역 대신 설치류 가변 영역의 적어도 일부를 치환함으로써 다양한 방법들을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 미국 특허 제 5,585,089 호 및 5,693,762 호; 문헌[Jones et al.(1986) Nature 321:522-25]; [Riechmann et al.(1988) Nature 332:323-27]; [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-36]을 참조하시오). 일부 실시태양에서 인간 이외의 종들로부터의 불변 영역들을 인간 가변 영역(들)과 함께 사용하여 하이브리드 항체를 생성시킬 수 있다.
완전 인간 항체
완전 인간 항체를 또한 제공한다. 인간을 항원에 노출시킴 없이 주어진 항원에 특이적인 완전 인간 항체("완전 인간 항체")를 제조하는 방법을 이용할 수 있다. 완전 인간 항체의 제조를 실행하기 위한 한 가지 수단은 마우스 체액 면역계의 "인간화"이다. 내생적인 Ig 유전자가 불활성화된 마우스 내로 인간 면역글로불린(Ig) 유전자 좌를 도입하는 것이, 임의의 바람직한 항원으로 면역될 수 있는 동물인 마우스에 완전 인간 단클론 항체(Mab)를 생성시키는 한 가지 수단이다. 완전 인간 항체를 사용하는 것은 때때로 마우스 또는 마우스 유도체화된 Mab를 치료제로서 인간에게 투여함으로써 야기될 수 있는 면역원 및 알러지 반응을 최소화시킬 수 있다.
완전 인간 항체는 내생적인 면역글로불린 생산의 부재 하에서 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(대개는 마우스)을 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다. 상기 목적을 위한 항원은 전형적으로는 6 개 이상의 연속적인 아미노산을 가지며, 임의로 담체, 예를 들어 합텐에 접합된다. 예를 들어 문헌[Jakobovits et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555]; [Jakobovits et al.(1993) Nature 362:255-258] 및 [Bruggermann et al.(1993) Year in Immunol. 7:33]을 참조하시오. 상기와 같은 방법의 일례로, 트랜스제닉 동물을, 상기 중의 마우스 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 내생적인 마우스 면역글로불린 유전자 좌를 무력화하고 상기 마우스 게놈 내에 인간 중쇄 및 경쇄 단백질을 암호화하는 유전자 좌를 함유하는 인간 게놈 DNA의 큰 단편을 삽입함으로써 생성시킨다. 이어서, 인간 면역글로불린 유전자 좌의 전체 보체보다 적게 갖는 부분 변이된 동물들을 잡종 교배하여 목적하는 면역계 변이를 모두 갖는 동물을 획득한다. 면역원 투여 시 이들 트랜스제닉 동물은 상기 면역원에 대해서는 면역특이적이지만 가변 영역들을 포함하여, 쥐보다는 인간 아미노산 서열을 갖는 항체를 생산한다. 상기와 같은 방법의 추가의 상세한 내용에 대해서는 예를 들어 WO 96/33735 및 WO 94/02602(본 발명에 참고로 인용된다)를 참조하시오. 인간 항체 제조용 트랜스제닉 마우스와 관련된 추가적인 방법들은 미국 특허 제 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299 및 5,545,806 호; WO 91/10741 및 WO 90/04036, 및 EP 546073B1 및 EP 546073A1에 개시되어 있다.
상술한 트랜스제닉 마우스(본 발명에서는 "HuMab" 마우스라 지칭한다)는 내생적인 μ 및 κ 쇄 유전자 좌를 불활성화하는 표적화된 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄(μ 및 γ) 및 κ 경쇄 면역글로불린 서열들을 암호화하는 인간 면역글로불린 유전자의 작은 유전자 좌(minilocus)를 함유한다(Lonberg et al.(1994) Nature 368:856-859). 따라서, 상기 마우스는 면역화에 반응하여 마우스 IgM 및 κ의 감소된 발현을 나타내며, 상기 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스유전자는 종류 변환(class switching) 및 체세포 돌연변이를 겪어 고 친화성 인간 IgGκ 단클론 항체를 생성시킨다(상기 Lonberg et al.,; Lonberg and Huszar(1995) Intern. Rev. Immunol., 13:65-93; Harding and Lonberg(1995) Ann. N.Y Acad. Sci 764:536-546). HuMab 마우스의 제조는 하기의 문헌들에 상세히 개시되어 있다: Taylor et al.(1992) Nucleic Acids Research, 20:6287-6295; Chen et al.(1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al.(1994) J. Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al.(1994) Nature 368: 856-859; Lonberg(1994) Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49-101; Taylor et al.(1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg and Huszar (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764: 536-546; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; 상기 참고문헌들은 모든 목적을 위해 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 또한 미국 특허 제 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 및 5,770,429 호뿐만 아니라 미국 특허 제 5,545,807 호 및 WO 93/1227; WO 92/22646; 및 WO 92/03918을 참조하시오. 이들 트랜스제닉 마우스 중의 인간 항체를 생성시키기 위해 사용되는 기술들은 또한 WO 98/24893 및 문헌[Mendez et al.(1997) Nature Genetics 15: 146-156](본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있다. 예를 들어, HCo7 및 HCo12 트랜스제닉 마우스 균주를 사용하여 인간 항-Dkk-1 항체를 생성시킬 수 있다.
하이브리도마 기술을 사용하여, 목적하는 특이성을 갖는 항원-특이적 인간 MAb를 생성시킬 수 있으며 상술한 바와 같은 트랜스제닉 마우스로부터 선택할 수 있다. 상기와 같은 항체를 클로닝하고 적합한 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 발현시키거나, 또는 상기 항체를 배양된 하이브리도마 세포로부터 수확할 수 있다.
완전 인간 항체를 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유도할 수 있다(Hoogenboom et al.(1991) J. Mol. Biol. 227:381; and Marks et al.(1991) J. Mol. Biol. 222:581). 파지 디스플레이 기법은 섬유상 박테리오파지의 표면상의 항체 레퍼토리의 디스플레이를 통한 면역 선택, 및 선택 항원에의 결합에 의한 파지의 후속적인 선택을 모방한다. 하나의 상기와 같은 기법이 WO 99/10494(본 발명에 참고로 인용된다)에 개시되어 있으며, 여기에는 상기와 같은 접근법을 사용하여 MPL- 및 msk-수용체에 대한 고 친화성 및 작용성 작용물질 항체의 단리가 개시되어 있다.
이중 특이성 또는 이작용성 항체
상기 제공되는 항체는 또한 상술한 바와 같은 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 영역을 포함하는 이중 특이성 및 이작용성 항체를 포함한다. 일부의 경우 이중 특이성 또는 이작용성 항체는 2 개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2 개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다. 이중 특이성 항체를 다양한 방법들, 예를 들어 비 제한적으로 하이브리도마들의 융합 또는 Fab' 단편들의 결합에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어 문헌[Songsivilai & Lachmann(1990) Clin. Exp. Immunol. 79:315-321]; [Kostelny et al.(1992) J. Immunol. 148:1547-1553]을 참조하시오.
다양한 다른 형태들
상기 제공되는 항체 또는 면역학적으로 작용성인 단편들 중 일부는 상기 개시된 항체 및 단편들의 변이체 형태들이다. 천연 아미노산은 공통의 측쇄 성질을 기준으로 하기의 부류들로 분류될 수 있다: [0149] 1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile; [0150] 2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; [0151] 3) 산성: Asp, Glu; [0152] 4) 염기성: His, Lys, Arg; [0153] 5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및 [0154] 6) 방향족: Trp, Tyr, Phe. 보존적 아미노산 치환은 이들 부류 중 한 구성원의 동일한 부류의 또 다른 구성원과의 교환을 수반할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 비 천연 아미노산 잔기를 포함할 수도 있으며, 상기 잔기는 전형적으로는 생물학적 시스템에서의 합성에 의해서보다는 화학적 펩타이드 합성에 의해 통합된다. 여기에는 펩타이드 유사물질 및 아미노산 부분의 다른 역전된 또는 전화된 형태들이 포함된다. 비 보존적 치환은 상기 부류들 중 한 구성원의 또 다른 부류로부터의 구성원에 대한 교환을 수반할 수 있다. 상기와 같이 치환된 잔기를 인간 항체와 상동성인 항체의 영역 또는 상기 분자의 비 상동성 영역 내로 도입시킬 수 있다.
상기와 같이 변화시킴에 있어서, 몇몇 실시태양에 따라, 아미노산의 소수친수 지수(hydropathic index)를 고려할 수도 있다. 단백질의 소수친수성 프로파일을, 각 아미노산에 수치("소수친수 지수")를 지정하고 이어서 상기 값들을 펩타이드 쇄에 따라 반복적으로 평균함으로써 계산한다. 각각의 아미노산은 그의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 소수친수 지수가 지정되었다. 이는 하기와 같다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라진(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 상호작용하는 생물학적 작용을 부여함에 있어서 상기 소수친수성 프로파일의 중요성은 당해 분야에 이해되어 있다(예를 들어 문헌[Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131] 참조). 몇몇 아미노산들을 유사한 소수친수 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산들 대신 사용할 수 있으며 이들은 여전히 유사한 생물 활성을 유지함은 공지되어 있다. 상기 소수친수 지수를 근거로 변화시킴에 있어서, 몇몇 실시태양에서, 소수친수 지수가 ±2 이내에 있는 아미노산들의 치환이 포함된다. 본 발명의 일부 태양에서, ±1 이내에 있는 것들이 포함되고, 본 발명의 다른 태양에서 ±0.5 이내에 있는 것들이 포함된다.
상기와 같은 아미노산들의 치환을, 특히 상기에 의해 생성되는 생물학적으로 작용성인 단백질 또는 펩타이드를 본 발명의 경우에서와 같이 면역학적 실시태양에 사용하고자 하는 경우, 친수성에 기초하여 유효하게 수행할 수 있음도 또한 당해 분야에서 이해되고 있다. 일부 실시태양에서, 인접한 아미노산들의 친수성에 의해 좌우되는 바와 같은, 단백질의 가장 큰 국소적인 평균 친수성은 그의 면역원성 및 항원-결합 또는 면역원성, 즉 상기 단백질의 생물학적 성질과 상관 있다.
하기의 친수성 값들이 이들 아미노산 잔기들에 지정되었다: 아르기닌(+0.3); 리신(+0.3); 아스파테이트(+0.3±1); 글루타메이트(+0.3±1); 세린(+0.3); 아스파라진(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 유사한 친수성 값들을 근거로 변화시킴에 있어서, 몇몇 실시태양에서, 친수성 값이 ±2 이내에 있는 아미노산들의 치환이 포함되고, 다른 실시태양에서, ±1 이내에 있는 것들이 포함되며, 더욱 다른 실시태양에서 ±0.5 이내에 있는 것들이 포함된다. 일부의 경우, 친수성을 기초로 1차 아미노산 서열들로부터 에피토프를 또한 동정할 수도 있다. 이들 영역을 또한 "에피토프 코어 영역"이라 칭한다.
숙련가는 널리 공지된 기법을 사용하여 본 발명에 나타낸 바와 같은 폴리펩타이드의 적합한 변이체들을 결정할 수 있을 것이다. 당해 분야의 숙련가는 활성에 중요하지 않은 것으로 여겨지는 영역들을 표적화함으로써 활성의 파괴 없이 변화시킬 수 있는 분자의 적합한 영역들을 확인할 수 있다. 상기 숙련가는 또한 유사한 폴리펩타이드들 중에서 보존되는 분자들의 잔기 및 부분들을 확인할 수 있을 것이다. 추가의 실시태양에서, 생물학적 활성에 또는 구조에 중요할 수 있는 영역들조차 상기 생물학적 활성의 파괴 없이 또는 상기 폴리펩타이드 구조에 불리한 영향을 미치지 않으면서 보존적인 아미노산 치환을 가할 수 있다.
또한, 당해 분야의 숙련가는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩타이드들 중의 잔기를 확인하는 구조-작용 연구들을 재검토할 수 있다. 상기와 같은 비교에 비추어, 유사한 단백질 중의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 상응하는 단백질 중의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 상기와 같은 예측되는 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수도 있다.
당해 분야의 숙련가는 또한 3차원 구조 및 아미노산 서열을 유사한 폴리펩타이드 중의 상기 구조와 관련하여 분석할 수 있다. 상기와 같은 정보에 비추어, 당해 분야의 숙련가는 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 상기 항체의 3차원 구조에 관하여 예측할 수도 있다. 당해 분야의 숙련가는 상기 단백질의 표면상에 있는 것으로 예측되는 아미노산 잔기에 대해 라디칼 변화가 일어나지 않도록 선택할 수도 있는데, 그 이유는 상기와 같은 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용을 수반할 수도 있기 때문이다. 더욱이, 당해 분야의 숙련가는 각각의 목적하는 아미노산 잔기에 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체들을 생성시킬 수도 있다. 이어서 이들 변이체를 Dkk-1 중화 활성에 대한 분석을 사용하여 선별할 수 있으며(하기 실시예 참조), 따라서 아미노산을 변화시킬 수 있는 것과 변화시켜서는 안 되는 것에 관한 정보를 제공할 수 있다. 즉, 상기와 같은 통상적인 실험들로부터 모은 정보를 근거로, 당해 분야의 숙련가는 추가의 치환들을 단독으로 또는 다른 돌연변이와 함께 피해야 하는 아미노산 위치를 쉽게 측정할 수 있다.
다수의 과학 발행물들이 2차 구조의 예측에 쏟아졌다(Moult (1996) Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al. (1974) Biochemistry 13:222-245; Chou et al.(1974) Biochemistry 113:211-222; Chou et al.(1978) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al.(1979) Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; and Chou et al.(1979) Biophys. J. 26:367-384). 더욱이, 2차 구조의 예측을 지원하는 컴퓨터 프로그램들을 현재 이용할 수 있다. 2차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모델링에 근거한다. 예를 들어, 30%가 넘는 서열 일치성, 또는 40%가 넘는 유사성을 갖는 2 개의 폴리펩타이드 또는 단백질은 종종 유사한 구조 위상을 갖는다. 최근의 단백질 구조 데이터베이스(PDB)의 성장은 폴리펩타이드 또는 단백질 구조 내의 가능한 접힘(fold) 수를 포함하여, 2차 구조의 증대된 예측 가능성을 제공해 왔다. 문헌[Holm et al. (1999) Nucl. Acid. Res. 27:244-247]을 참조하시오. 주어진 폴리펩타이드 또는 단백질 중에 제한된 수의 접힘이 존재하며 일단 임계 수의 구조가 분석되었으면, 구조적 예측은 극적으로 더 정확해질 것임이 제시되었다(Brenner et al. (1997) Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376).
2차 구조의 추가적인 예측 방법은 "스레딩(threading)"(Jones (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-87; Sippl et al. (1996) Structure 4:15-19), "프로파일 분석"(Bowie et al. (1991) Science 253:164-170; Gribskov et al. (1990) Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), 및 "진화 연관"(상기 Holm(1999); 및 상기 Brenner(1997) 참조)을 포함한다.
본 발명의 일부 실시태양에서, (1) 단백질분해에 대한 감수성을 감소시키고, (2) 산화에 대한 감수성을 감소시키고, (3) 단백질 복합체의 형성에 대한 결합 친화성을 변경시키고, (4) 리간드 또는 항원 결합 친화성을 변경시키고, 및/또는 (4) 상기와 같은 폴리펩타이드에 다른 물리화학적 또는 작용성 성질들을 부여하거나 또는 변경시키는 아미노산 치환들이 이루어진다. 예를 들어, 단일 또는 다 수의 아미노산 치환(몇몇 실시태양에서, 보존적 아미노산 치환)이 천연 서열 중에서 이루어질 수 있다. 분자 간 접촉을 형성하는 도메인(들) 밖에 놓인 항체의 부분에서 치환이 이루어질 수 있다. 상기와 같은 실시태양에서, 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않는 보존적 아미노산 치환(예를 들어 모 항체 또는 고유 항체를 특성화하는 2차 구조를 파괴하지 않는 하나 이상의 아미노산 치환)을 사용할 수 있다. 당해 분야-인식된 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조들의 예들이 하기의 문헌들에 개시되어 있다: Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.)(1984) W.H. New York; Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.)(1991) New York: Garland Publishing; and Thornton et al. (1991) Nature 354:105.
본 발명은 또한 글리코실화 부위(들)의 수 및/또는 유형이 모 폴리펩타이드의 아미노산 서열에 비해 변경된 본 발명 항체의 글리코실화 변이체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 항체 단백질 변이체는 고유 항체보다 많거나 적은 수의 N-결합된 글리코실화 부위를 포함한다. N-결합된 글리코실화 부위는 서열: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 특징으로 하며, 여기에서 X로서 표시된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 상기 서열을 생성시키기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-결합된 탄수화물 쇄의 잠재적인 새로운 첨가 부위를 제공한다. 한편으로, 상기 서열을 제거하거나 변경시키는 치환은 고유 폴리펩타이드 중에 존재하는 N-결합된 탄수화물 쇄의 첨가를 방지할 것이다. 예를 들어, 상기 글리코실화는 Asn의 결실에 의해서 또는 상기 Asn의 상이한 아미노산으로의 치환에 의해 감소될 수 있다. 다른 실시태양에서, 하나 이상의 새로운 N-결합된 부위들을 생성시킨다. 항체는 전형적으로는 Fc 영역에 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는다.
추가의 바람직한 항체 변이체는 모 또는 고유 아미노산 서열 중의 하나 이상의 시스테인 잔기가 또 다른 아미노산(예를 들어 세린)으로부터 결실되거나 또는 상기 아미노산으로 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 특히 항체가 생물학적으로 활성인 형태로 다시 접혀야할 때 유용하다. 시스테인 변이체는 고유 항체보다 더 적은 시스테인 잔기를 가질 수도 있으며, 전형적으로는 짝이 없는 시스테인으로부터 생성되는 상호작용을 최소화하기 위해서 짝수를 갖는다.
상기 개시되는 중쇄 및 경쇄, 가변 영역 도메인 및 CDR을 사용하여 Dkk-1 폴리펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 제조할 수 있다. 예를 들어, 표 4에 나열된 CDR들 중 하나 이상을 분자(예를 들어 폴리펩타이드)에 공유 또는 비 공유 결합시켜 면역 부착을 만들 수 있다. 면역 부착은 보다 큰 폴리펩타이드 쇄의 일부로서 CDR(들)을 통합하거나, 상기 CDR(들)을 또 다른 폴리펩타이드 쇄에 공유 결합시키거나, 또는 상기 CDR(들)을 비 공유적으로 통합할 수 있다. 상기 CDR(들)은 상기 면역 부착이 특별한 관심 항원(예를 들어 Dkk-1 폴리펩타이드 또는 그의 에피토프)에 특이적으로 결합할 수 있게 한다.
본 발명에 개시된 가변 영역 도메인 및 CDR에 근거한 유사물질(예를 들어 펩타이드 유사물질)을 또한 제공한다. 이들 상사형(analog)들은 펩타이드, 비 펩타이드 또는 펩타이드와 비 펩타이드 영역들의 조합일 수 있다(Fauchere (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber and Freidinger (1985) TINS p. 392; and Evans et al.(1987) J. Med. Chem. 30:1299(이들 문헌은 임의의 목적을 위해 본 발명에 참고로 인용된다)). 치료학적으로 유용한 펩타이드들과 구조적으로 유사한 펩타이드 유사물질들을 사용하여 유사한 치료 또는 예방 효과를 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 화합물들은 종종 컴퓨터화된 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 일반적으로, 본 발명의 펩타이드 유사물질은 목적하는 생물 활성, 예를 들어 본 발명의 경우 Dkk-1에 특이적으로 결합하는 능력을 나타내는 항체와 구조적으로 유사하지만, 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해, --CH2NH--, --CH2S--, CH2--CH2--, -CH=CH-(시스 및 트랜스), --COCH2--, -CH(OH)CH2--, 및 --CH2SO-- 중에서 선택된 결합에 의해 임의로 치환되는 하나 이상의 펩타이드 결합을 갖는 단백질들이다. 공통 서열의 하나 이상의 아미노산의, 동일한 유형의 D-아미노산으로의 체계적 치환(예를 들어 L-리신 대신 D-리신)을 본 발명의 몇몇 실시태양들에 사용하여 보다 안정한 단백질을 생성시킬 수 있다. 또한, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변화를 포함하는 구속 펩타이드를, 당해 분야에 공지된 방법(Rizo and Gierasch (1992) Ann. Rev. Biochem. 61:387(본 발명에 참고로 인용된다))에 의해, 예를 들어 펩타이드를 환화시키는 분자 내 다이설파이드 가교를 형성시킬 수 있는 내부 시스테인 잔기를 첨가함으로써 생성시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 항체 및 면역학적으로 작용성인 단편의 유도체를 또한 제공한다. 상기 유도체화된 항체 또는 단편은 상기 항체 또는 단편에 목적하는 성질, 예를 들어 특정 용도에 증가된 반감기를 부여하는 임의의 분자 또는 물질을 포함할 수 있다. 상기 유도체화된 항체는 예를 들어 검출 가능한(또는 표지화) 부분(예를 들어 방사성, 비색, 항원 또는 효소 분자, 검출 가능한 비드(예를 들어 자기 또는 전자 고밀도(예를 들어 금) 비드), 또는 또 다른 분자에 결합하는 분자(예를 들어 비오틴 또는 스트렙트아비딘)), 치료 또는 진단 부분(예를 들어 방사성, 세포독성, 또는 약학적으로 활성인 부분), 또는 특정 용도(예를 들어 환자, 예를 들어 인간 환자에의 투여, 또는 다른 생체 내 또는 시험관 내 용도)에 대해 상기 항체의 적합성을 증가시키는 분자를 포함할 수 있다. 항체의 유도체화에 사용될 수 있는 분자의 예는 알부민(예를 들어 인간 혈청 알부민) 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 항체의 알부민 결합된 및 PEG화된 유도체들을 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 항체를 트랜스타이레틴(TTR) 또는 TTR 변이체에 접합시키거나 또는 달리 결합시킨다. 상기 TTR 또는 TTR 변이체를 예를 들어 덱스트란, 폴리(n-비닐 피롤리돈), 폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올 및 폴리비닐 알콜로 이루어진 그룹 중에서 선택된 화학물질로 화학적으로 개질시킬 수 있다.
다른 유도체는, 예를 들어 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 이종 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 융합 단백질의 발현에 의한 항-Dkk-1 항체 또는 그의 단편과, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드와의 공유 또는 집합성 접합체를 포함한다. 예를 들어, 상기 접합된 펩타이드는 이종 신호(또는 리더) 폴리펩타이드, 예를 들어 효모 알파-인자 리더, 또는 에피토프 태그와 같은 펩타이드일 수 있다. 항-Dkk-1 항체-함유 융합 단백질은 상기 항-Dkk-1 항체의 정제 또는 확인을 촉진하기 위해 첨가되는 펩타이드를 포함할 수 있다(예를 들어 폴리-His). 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드를 또한 문헌[Hopp et al., Bio/Technology 6:1204(1988)] 및 미국 특허 제 5,011,912 호에 개시된 바와 같은 FLAG 펩타이드에 결합시킬 수 있다. 상기 FLAG 펩타이드는 고도로 항원성이며 특이적인 단클론 항체(Mab)에 의해 가역적으로 결합되어, 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 용이한 정제를 가능하게 하는 에피토프를 제공한다. 상기 FLAG 펩타이드가 주어진 폴리펩타이드에 융합된 융합 단백질의 제조에 유용한 시약들을 상업적으로 입수할 수 있다(Sigma, St. Louis, Mo. USA).
하나 이상의 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이들 함유하는 올리고머가 Dkk-1 길항물질로서 사용될 수 있다. 올리고머는 공유 결합되거나 비 공유 결합된 이량체, 삼량체 또는 보다 고급 올리고머의 형태로 존재할 수 있다. 2 개 이상의 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드를 포함하는 올리고머들의 사용이 고려되며, 일례로 동종이량체가 있다. 다른 올리고머로는 이종이량체, 동종삼량체, 이종삼량체, 동종사량체, 이종사량체 등이 있다.
하나의 실시태양은 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드에 융합된 펩타이드 부분들 간의 공유 또는 비 공유 상호작용을 통해 결합된 다수의 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드를 포함하는 올리고머에 관한 것이다. 상기와 같은 펩타이드는 펩타이드 링커(이격자), 또는 올리고머화를 촉진하는 성질을 갖는 펩타이드일 수 있다. 항체로부터 유도된 몇몇 폴리펩타이드 및 류신 지퍼가 하기에 보다 상세히 개시되는 바와 같이, 결합된 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드의 올리고머화를 촉진할 수 있는 펩타이드들 중에 있다.
특정 실시태양에서, 상기 올리고머는 2 내지 4 개의 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 올리고머의 항-Dkk-1 항체 부분은 상술한 형태들 중 임의의 형태, 예를 들어 변이체 또는 단편으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 올리고머는 Dkk-1 결합 활성을 갖는 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 올리고머를 면역글로불린으로부터 유도된 폴리펩타이드를 사용하여 제조한다. 항체-유도된 폴리펩타이드의 다양한 부분들(Fc 도메인 포함)에 융합된 몇몇 이종 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질의 제조가 예를 들어 하기 문헌들에 의해 개시되었다: Ashkenazi et al., (1991) PNAS USA 88:10535; Byrn et al., (1990) Natrue 344:677; and Hollenbaugh et al., (1992) "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11.
본 발명의 하나의 실시태양은 항체의 Fc 영역에 항-Dkk-1 항체의 Dkk-1 결합 단편을 융합시킴으로써 생성되는 2 개의 융합 단백질을 포함하는 이량체에 관한 것이다. 상기 이량체는 예를 들어 융합 단백질을 암호화하는 유전자 융합을 적합한 발현 벡터에 삽입하고, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에서 상기 유전자 융합을 발현시키고, 상기 발현된 융합 단백질이 항체 분자와 매우 흡사하게 조립되게 하여, 쇄 간 다이설파이드 결합이 상기 Fc 부분들 사이에 형성되어 이량체를 제공함으로써 제조될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은 "Fc 폴리펩타이드"란 용어는 항체의 Fc 영역으로부터 유도된 폴리펩타이드의 고유 및 뮤테인 형태를 포함한다. 이량화를 촉진하는 힌지 영역을 함유하는 상기와 같은 폴리펩타이드의 절두된 형태가 또한 포함된다. Fc 부분(및 그로부터 형성된 올리고머)을 포함하는 융합 단백질은 프로틴 A 또는 프로틴 G 컬럼 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의한 용이한 정제의 이점을 제공한다.
PCT 출원 WO 93/10151 및 미국 특허 제 5,426,048 및 5,262,522 호에 개시된 하나의 적합한 Fc 폴리페타이드는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역의 N-말단 힌지 영역으로부터 고유 C-말단까지 연장되는 단일 쇄 폴리펩타이드이다. 또 다른 유용한 Fc 폴리펩타이드는 미국 특허 제 5,457,035 호 및 문헌[Baum et al. (1994) EMBO J. 13:3992-4001]에 개시된 Fc 뮤테인이다. 상기 뮤테인의 아미노산 서열은, 19 번 아미노산이 Leu에서 Al로 바뀌고, 20 번 아미노산이 Leu에서 Glu로 바뀌고, 22 번 아미노산이 Gly에서 Ala로 바뀐 것을 제외하고, WO 93/10151에 제공된 고유 Fc 서열의 경우와 동일하다. 상기 뮤테인은 Fc 수용체에 대해 감소된 친화성을 나타낸다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 항-Dkk-1 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분을 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 부분 대신 사용할 수도 있다.
한편으로, 상기 올리고머는 펩타이드 링커(이격자 펩타이드)와 함께 또는 상기 없이 다수의 항-Dkk-1 항체 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질이다. 적합한 펩타이드 링커 중에는 미국 특허 제 4,751,180 호 및 4,935,233 호에 개시된 것들이 있다.
올리고머성 항-Dkk-1 항체 유도체의 또 다른 제조 방법은 류신 지퍼의 사용을 포함한다. 류신 지퍼 도메인은 상기 도메인들이 발견되는 단백질의 올리고머화를 촉진하는 펩타이드이다. 류신 지퍼는 몇몇 DNA-결합 단백질들에서 최초로 동정되었으며(Landschulz et al.(1988) Science 240:1759), 지금까지 여러 가지 상이한 단백질들에서 발견되어 왔다. 공지된 류신 지퍼들 중에는 이량화하거나 삼량화하는 천연 펩타이드 및 그의 유도체가 있다. 용해성 올리고머 단백질의 생산에 적합한 류신 지퍼 도메인의 예는 WO 94/10308에 개시되어 있으며, 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Hoppe et al. (1994) FEBS Letters 344:191]에 개시된 폐 계면활성제 단백질 D(SPD)로부터 유도된 류신 지퍼이다. 류신 지퍼에 융합된 이종 단백질의 안정한 삼량화를 허용하는 변이된 상기 류신 지퍼의 용도가 문헌[Fanslow et al. (1994) Semin. Immunol. 6:267-78]에 개시되어 있다. 하나의 접근법에서, 류신 지퍼 펩타이드에 융합된 항-Dkk-1 항체 단편 또는 유도체를 포함하는 재조합 융합 단백질을 적합한 숙주 세포에 발현시키고, 형성되는 용해성 올리고머 항-Dkk-1 항체 단편 또는 유도체를 상기 배양 상등액으로부터 회수한다.
핵산
본 발명 항체 또는 그의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체의 하나 또는 2 개의 쇄를 암호화하는 핵산, 하이브리드화 탐침으로서 사용하기에 충분한 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 확인, 분석, 돌연변이 또는 증폭하기 위한 PCR 프라이머 또는 서열화 프라이머, 폴리뉴클레오타이드의 발현을 억제하기 위한 안티센스 핵산, 및 이들의 상보성 서열들을 또한 제공한다. 상기 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 이들은 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 이상 뉴클레오타이드 길이일 수 있고/있으며 하나 이상의 추가적인 서열, 예를 들어 조절 서열을 포함하고/하거나 보다 큰 핵산, 예를 들어 벡터의 일부일 수 있다. 상기 핵산은 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있으며 RNA 및/또는 DNA 뉴클레오타이드 및 그의 인공 변이체(예를 들어 펩타이드 핵산)를 포함할 수 있다. 이들 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 또한 제공한다.
항체 폴리펩타이드(예를 들어 중쇄 또는 경쇄, 가변 도메인만, 또는 전장)를 암호화하는 DNA를 Dkk-1 또는 그의 면역원 단편으로 면역시킨 마우스의 B-세포로부터 단리할 수 있다. 상기 DNA를 통상적인 과정, 예를 들어 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 단리할 수 있다. 파지 디스플레이가 항체의 유도체를 제조할 수 있는 공지된 기법의 또 다른 예이다. 하나의 접근법에서, 관심 항체의 성분인 폴리펩타이드를 임의의 적합한 재조합 발현 시스템에서 발현시키고, 상기 발현된 폴리펩타이드가 조립되게 하여 항체 분자를 형성시킨다.
상기 항체 및 면역학적으로 작용성인 단편의 경쇄 및 중쇄, 가변 영역 및 CDR을 암호화하는 예시적인 핵산을 제공한다. 상기 유전자 암호의 퇴보로 인해, 상기 각각의 폴리펩타이드 서열은 나열된 것들 이외의 다수의 다른 핵산 서열들에 의해 또한 암호화된다. 본 발명은 본 발명의 각각의 항체를 암호화하는 각각의 퇴보 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명은 또한 특정한 하이브리드화 조건 하에서 다른 핵산에 하이브리드화하는 핵산을 제공한다. 핵산의 하이브리드화 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiely & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6]을 참조하시오. 공지된 보통 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 5 x 염화 나트륨/나트륨 시트레이트(SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0), 약 50% 폼아미드의 하이브리드화 완충제, 6 x SSC, 및 55 ℃의 하이브리드화 온도를 함유하는 예비 세척액(또는 다른 유사한 하이브리드화 용액, 예를 들어 42 ℃의 하이브리드화 온도와 함께 약 50% 폼아미드를 함유하는 것), 및 0.5 x SSC, 0.1% SDS 중에서 60 ℃의 세척 조건을 사용한다. 공지된 엄격한 하이브리드화 조건의 예는 45 ℃에서 6 x SSC에서의 하이브리드화에 이어서, 68 ℃에서 0.1 x SSC, 0.2% SDS에서의 1 회 이상의 세척이다. 더욱 또한, 당해 분야의 숙련가는 상기 하이브리드화 및/또는 세척 조건을, 서로 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이상 동일한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로는 서로 하이브리드화한 채로 남아 있도록 상기 하이브리드화의 엄격성이 증가 또는 감소하게 조작할 수 있다.
하이브리드화 조건의 선택 및 적합한 조건의 고안을 위한 지침에 영향을 미치는 기본 매개변수들이 예를 들어 하기의 문헌들에 나열되어 있으며: Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Maunal, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11; and Current Protocols in Molecular Biology(1995) Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., section 2.10 and 6.3-6.4, 예를 들어 상기 DNA의 길이 및/또는 염기 조성을 근거로 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
변화는 돌연변이에 의해 핵산 내로 도입될 수 있으며, 이에 의해 상기 핵산이 암호화하는 폴리펩타이드(예를 들어 본 발명의 항체 또는 항체 유도체)의 아미노산 서열이 변화하게 된다. 돌연변이를 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여 도입할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 하나 이상의 특정 아미노산 잔기를 예를 들어 부위 지정 돌연변이 프로토콜을 사용하여 변화시킨다. 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 랜덤하게 선택된 잔기를 예를 들어 랜덤 돌연변이 프로토콜을 사용하여 변화시킨다. 그러나 돌연변이 폴리펩타이드가 제조되면, 이를 발현시키고 목적하는 성질에 대해 선별할 수 있다.
돌연변이를, 핵산이 암호화하는 폴리펩타이드의 생물 활성을 현저하게 변경시키지 않으면서 상기 핵산에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 치환을 수행하여 불 필수 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 유도할 수 있다. 한편으로, 하나 이상의 돌연변이를, 핵산이 암호화하는 폴리펩타이드의 생물 활성을 선택적으로 변화시키도록 상기 핵산에 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 생물 활성을 정량적으로 또는 정성적으로 변화시킬 수 있다. 정량적인 변화의 예는 상기 활성의 증가, 감소 또는 제거를 포함한다. 정성적인 변화의 예는 항체의 항원 특이성의 변화를 포함한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 하이브리드화 탐침으로서 사용하기에 적합한 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 전장 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 일부만, 예를 들어 탐침 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편 또는 본 발명의 폴리펩타이드의 활성 부분(예를 들어 Dkk-1 결합 부분)을 암호화하는 단편만을 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산의 서열에 근거한 탐침을 사용하여 핵산 또는 유사한 핵산, 예를 들어 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 전사물을 검출할 수 있다. 상기 탐침은 표지 그룹, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자를 포함할 수 있다. 상기와 같은 탐침을 사용하여 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포를 동정할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 그의 일부(예를 들어 하나 이상의 CDR 또는 하나 이상의 가변 영역 도메인을 함유하는 단편)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 예로는 비 제한적으로 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터 및 발현 벡터, 예를 들어 재조합 발현 벡터가 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 본 발명의 핵산을 숙주 세포에서의 핵산의 발현에 적합한 형태로 포함할 수 있다. 상기 재조합 발현 벡터는 발현에 사용되는 숙주 세포에 근거하여 선택된, 발현되는 핵산 서열에 작동적으로 결합된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 조절 서열은 다수 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오타이드 서열의 구성 발현을 지정하는 것들(예를 들어 SV40 초기 유전자 인핸서, 라우스 육종 바이러스 프로모터 및 거대세포바이러스 프로모터), 오직 몇몇 숙주 세포에서만 뉴클레오타이드 서열의 발현을 지정하는 것들(예를 들어 조직 특이성 조절 서열, 문헌[Voss et al. (1986) Trends Biochem. Sci. 11:287, Maniatis et al.(1987) Science 236:1237](내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다) 참조), 및 특정한 치료 또는 조건에 반응하여 뉴클레오타이드 서열의 유도성 발현을 지정하는 것들(예를 들어 포유동물 세포 중의 메탈로티오닌 프로모터 및 원핵 및 진핵생물 계 모두 중의 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신 반응성 프로모터(상기 참조))을 포함한다. 당해 분야의 숙련가들은 상기 발현 벡터의 디자인이 형질전환시키려는 숙주 세포의 선택, 목적하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 변할 수 있음을 알 것이다. 본 발명의 발현 벡터를 숙주 세포에 도입시키고, 이에 의해 본 발명에 개시된 바와 같은 핵산에 의해 암호화되는, 융합 단백질 또는 펩타이드를 포함한 단백질 또는 펩타이드를 생성시킬 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 임의의 원핵생물 세포(예를 들어 이 콜라이) 또는 진핵생물 세포(예를 들어 효모, 곤충, 또는 포유동물 세포(예를 들어 CHO 세포))일 수 있다. 벡터 DNA를 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기법을 통해 원핵생물 또는 진핵생물 세포에 도입시킬 수 있다. 포유동물 세포의 안정한 형질감염을 위해서, 사용되는 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라, 세포의 단지 작은 분획만이 외래 DNA를 그의 게놈에 통합시킬 수 있음은 공지되어 있다. 이러한 전환세포(integrant)를 동정하고 선택하기 위해서, 선택성 마커(예를 들어 항생제에 대한 내성에 대해서)를 암호화하는 유전자를 일반적으로 관심 유전자와 함께 상기 숙주 세포 내에 도입시킨다. 바람직한 선택성 마커는 약물, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 상기 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포를, 다른 방법들 중에서도 특히 약물 선택(예를 들어 상기 선택성 마커 유전자가 통합된 세포는 생존하는 반면, 다른 세포들은 죽을 것이다)에 의해 동정할 수 있다.
항체의 제조
상기 제공되는 비인간 항체는 예를 들어 임의의 항체 생산 동물, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼, 염소, 당나귀, 또는 비인간 영장류(예를 들어 원숭이(예를 들어 키노몰구스 또는 붉은 털 원숭이) 또는 유인원(예를 들어 챔팬지))로부터 유도될 수 있다. 비인간 항체를 예를 들어 시험관 내 세포 배양 및 세포 배양 기반 용도, 또는 항체에 대한 면역 반응이 일어나지 않거나 사소하거나 예방될 수 있거나 중요하지 않거나 또는 상기 반응을 원하는 임의의 다른 용도에 사용할 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 상기 항체를 전장 Dkk-1 또는 Dkk-1의 카복시 말단 절반으로 면역시킴으로써 생성시킬 수 있다. 상기 항체는 다클론, 단클론이거나, 또는 재조합 DNA의 발현에 의해 숙주 세포에서 합성될 수도 있다.
완전 인간 항체를, 인간 면역글로불린 유전자 좌를 함유하는 트랜스제닉 동물을 면역시키거나 또는 인간 항체의 레퍼토리를 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리를 선택함으로써 상술한 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 단클론 항체(Mab)를 통상적인 단클론 항체 방법, 예를 들어 문헌[Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 표준 체세포 하이브리드화 기법을 포함한 다양한 기법들에 의해 생성시킬 수 있다. 한편으로, 단클론 항체의 다른 생성 기법들, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 종양유전자 형질전환을 사용할 수 있다. 하이브리도마의 제조에 적합한 한 가지 동물계는 쥐계로, 매우 잘 확립된 과정이다. 융합용 면역 비장 세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기법들은 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 과정을 위해서, 면역된 마우스로부터의 B 세포를 적합한 불멸화된 융합 상대, 예를 들어 쥐 골수종 세포주와 융합시킨다. 경우에 따라, 그 밖에 래트 또는 다른 포유동물을 마우스 대신에 면역시킬 수 있으며 상기와 같은 동물로부터의 B 세포를 상기 쥐 골수종 세포 주와 융합시켜 하이브리도마를 형성시킬 수 있다. 한편으로, 마우스 이외의 출처로부터의 골수종 세포 주를 사용할 수도 있다. 하이브리도마의 제조를 위한 융합 과정도 또한 널리 공지되어 있다.
상기 제공되는 단 쇄 항체는, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(Fv 영역) 단편들을 아미노산 가교(짧은 펩타이드 링커)를 통해 결합시켜, 단일 폴리펩타이드 쇄를 생성시킴으로써 형성시킬 수 있다. 상기와 같은 단 쇄 Fv(scFv)는 상기 2 개의 가변 도메인 폴리펩타이드(VL 및 VH)를 암호화하는 DNA들 사이에 펩타이드 링커를 암호화하는 DNA를 융합시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 생성되는 폴리펩타이드는 자신 위에서 다시 접어(fold back) 항원-결합 단량체를 형성하거나, 또는 상기 두 가변 도메인들 사이의 가요성 링커의 길이에 따라 다량체(예를 들어 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다(Kortt et al. (1997) Prot. Eng. 10:423; Kortt et al. (2001) Biomol. Eng. 18:95-108). 상이한 VL 및 VH-포함 폴리펩타이드들을 결합시킴으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다량체성 scFV를 형성시킬 수 있다(Kriangkum et al. (2001) Biomol. Eng. 18:31-40). 단 쇄 항체의 생성을 위해 개발된 기법들은 미국 특허 제 4,946,778 호; 문헌[Bird (1988) Science 242:423]; [Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879]; [Ward et al. (1989) Nature 334:544, de Graaf et al. (2002) Methods Mol Biol. 178:379-87]에 개시된 것들을 포함한다.
하나의 하위 부류의 것인 본 발명에 제공된 항체들을 하위종류 변환 방법을 사용하여 상이한 하위 부류로부터의 항체로 변화시킬 수 있다. 따라서, IgG 항체를 예를 들어 IgM 항체로부터 유도할 수 있으며, 이와 역으로도 가능하다. 상기와 같은 기법은 주어진 항체(모 항체)의 항원 결합 성질을 갖지만, 상기 모 항체의 경우와 상이한 항체 아이소타입 또는 하위 부류와 관련된 생물학적 성질들은 또한 나타내는 새로운 항체의 제조를 허용한다. 재조합 DNA 기법들을 사용할 수도 있다. 특정한 항체 폴리펩타이드를 암호화하는 클로닝된 DNA, 예를 들어 목적하는 아이소타입의 항체의 불변 도메인을 암호화하는 DNA를 상기와 같은 과정에 사용할 수도 있다. 예를 들어 문헌[Lantto et al. (2002) Methods Mol. Biol. 178:303-16]을 참조하시오.
더욱이, 상이한 성질들(즉 결합하는 항원에 대한 다양한 친화성)을 갖는 항체들을 유도하는 방법이 또한 공지되어 있다. 하나의 상기와 같은 기법(쇄 셔플링이라 지칭된다)은 섬유상 박테리오파지의 표면상의 면역글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리의 표시(종종 파지 디스플레이라 칭함)를 수반한다. 문헌[Marks et al. (1992) BioTechnology, 10:779]에 개시된 바와 같이, 쇄 셔플링을 사용하여 합텐 2-페닐옥사졸-5-온에 대한 고 친화성 항체를 제조하였다.
보존적 변이(및 암호화 핵산에 대한 상응하는 변이)를 표 1에 개시된 중쇄 및 경쇄에 대해 수행하여 작용성 및 생화학적 특성들을 갖는 항-Dkk-1 항체를 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 변이를 성취하기 위한 방법은 상기에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 항체 및 그의 작용성 단편을 다양한 방식들로 추가로 변이시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 및 단편을 치료용으로 사용하고자 하는 경우, 이들을 폴리에틸렌 글리콜과 접합시켜(peg화시켜) 혈청 반감기를 연장하거나 단백질 전달을 향상시킬 수 있다. 한편으로, 상기 항체 또는 그의 단편의 V 영역을 상이한 항체 분자의 Fc 영역과 융합시킬 수도 있다. 상기 목적에 사용된 Fc 영역을, 상기 영역이 보체와 결합하지 않고 따라서 상기 융합 단백질이 치료제로서 사용되는 경우 환자에게서 세포 용해를 유발할 가능성을 감소시키도록 변이시킬 수도 있다. 또한, 상기 항체 또는 그의 작용성 단편을 인간 혈청 알부민과 접합시켜 상기 항체 또는 그의 단편의 혈청 반감기를 향상시킬 수도 있다. 본 발명의 항체 또는 그의 단편에 유용한 또 다른 융합 상대는 트랜스타이레틴(TTR)이다. TTR은 사량체를 형성하는 능력을 가지며, 따라서 항체-TTR 융합 단백질은 그의 결합 욕구를 증가시킬 수 있는 다가 항체를 형성할 수 있다.
한편으로, 본 발명의 항체 및 단편의 작용성 및/또는 생화학적 특성들의 실질적인 변이를, (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서, 치환 구역 중의 분자 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서 상기 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 상기 측쇄의 부피감을 유지함에 대한 영향이 현저하게 상이한 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열에 치환을 생성시킴으로써 성취할 수 있다. "보존적인 아미노산 치환"은 고유 아미노산 잔기의, 상기 위치에서의 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 영향을 미치지 않거나 거의 미치지 않는 비 고유 잔기에 의한 치환을 포함할 수 있다. 더욱 또한, 상기 폴리펩타이드 중의 임의의 고유 잔기를 또한, 알라닌 스캐닝 돌연변이에 대해 앞서 개시된 바와 같이, 알라닌으로 치환시킬 수도 있다.
상기 항체의 아미노산 치환(보존적이든 보존적이지 않든 간에)을 통상적인 기법의 적용에 의해 당해 분야의 숙련가들에 의해 실행할 수 있다. 아미노산 치환을 사용하여 본 발명에 제공된 항체의 중요한 잔기들을 동정하거나, 또는 인간 Dkk-1에 대한 이들 항체의 친화성을 증가 또는 감소시키거나, 또는 본 발명에 개시된 다른 항-Dkk-1 항체의 결합 친화성을 변경시킬 수 있다.
항- Dkk -1 항체의 발현
상기 항-Dkk-1 항체 및 면역학적 작용성 단편을 다수의 통상적인 기법들 중 임의의 기법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 항-Dkk-1 항체를 당해 분야에 공지된 임의의 기법을 사용하여, 재조합 발현 시스템에 의해 생성시킬 수 있다. 예를 들어 하기 문헌들을 참조하시오: Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al.(eds.) Plenum Press, New York(1980): and Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1988).
본 발명의 항체를 하이브리도마 세포 주 또는 하이브리도마 이외의 세포 주에서 발현시킬 수 있다. 상기 항체를 암호화하는 발현 구조물을 사용하여 포유동물, 곤충 또는 미생물 숙주 세포를 형질전환시킬 수 있다. 형질전환을, 숙주 세포 내로 폴리뉴클레오타이드를 도입시키는 임의의 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어 미국 특허 제 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455 호에 예시된 바와 같이, 바이러스 또는 박테리오파지 중에 상기 폴리뉴클레오타이드를 패키징하고 숙주 세포를 당해 분야에 공지된 형질감염 과정에 의해 상기 구조물로 형질도입시킴을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 사용되는 최적의 형질전환 과정은 형질전환하려는 숙주 세포의 유형에 따라 변할 것이다. 이종 폴리뉴클레오타이드의 포유동물 세포 내로의 도입 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 덱스트란-매개된 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌 매개된 형질감염, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 리포솜 중의 폴리뉴클레오타이드(들)의 캡슐화, 핵산과 양으로 하전된 지질과의 혼합, 및 DNA의 핵 내로의 직접적인 미세주입을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 구조물은 전형적으로는 하기 중 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다: 중쇄 불변 영역; 중쇄 가변 영역; 경쇄 불변 영역; 경쇄 가변 영역; 항-Dkk-1 항체의 경쇄 또는 중쇄의 하나 이상의 CDR. 이들 핵산 서열을 표준 연결 기법을 사용하여 적합한 발현 벡터 내에 삽입한다. 상기 벡터는 전형적으로는 사용되는 특정 숙주 세포에 작용성인 것으로 선택된다(즉 상기 벡터는 상기 숙주 세포 기관과 양립성이어서, 상기 유전자의 증폭 및/또는 발현을 허용할 수 있다). 일부 실시태양에서, 단백질 리포터, 예를 들어 다이하이드로폴레이트 리덕타제를 사용하는 단백질-단편 상보성 분석을 사용하는 벡터들을 사용한다(예를 들어 본 발명에 참고로 인용된 미국 특허 제 6,270,964 호를 참조하시오). 적합한 발현 벡터를 예를 들어 인비트로젠 라이프 테크놀로지스(Invitrogen Life Technologies) 또는 BD 바이오사이언시스(Biosciences)(이전에는 "클론테크(Clontech)")로부터 구입할 수 있다. 본 발명의 항체 및 단편의 클로닝 및 발현에 유용한 다른 벡터는 문헌[Bianchi and McGrew, Biotech Biotechnol Bioeng 84(4):439-44(2003)](본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 것들을 포함한다. 추가의 적합한 발현 벡터들이 예를 들어 문헌[Methods Enzymol, vol. 185(D.V. Goeddel, ed.) (1990) New York: Academic Press]에 논의되어 있다.
전형적으로, 상기 숙주 세포들 중 임의의 세포에 사용되는 발현 벡터들은 플라스미드 또는 바이러스 유지 및 외부 뉴클레오타이드 서열의 클로닝 및 발현을 위한 서열들을 함유한다. 상기와 같은 서열(집합적으로 "측면 서열"이라 지칭된다)은 전형적으로는 하기의 작동적으로 결합된 뉴클레오타이드 서열들 중 하나 이상을 포함한다: 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열, 복제 기원, 전사 종결 서열, 공여체 및 수용체 연접 부위를 함유하는 완전 인트론 서열, 폴리펩타이드 분비용 리더 서열을 암호화하는 서열, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 서열, 발현시키려는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 삽입하기 위한 다중 링커 부위, 및 선택성 마커 요소.
임의로, 상기 벡터는 "태그"-암호화 서열, 즉 상기 암호화 서열의 5' 또는 3' 단부에 위치한 올리고뉴클레오타이드 분자, 폴리His(예를 들어 헥사His)를 암호화하는 올리고뉴클레오타이드 서열, 또는 상업적으로 입수할 수 있는 항체가 존재하는 또 다른 "태그", 예를 들어 FLAG(등록상표), HA(인플루엔자 바이러스로부터의 헤마글루티닌), 또는 myc를 함유할 수 있다. 상기 태그는 전형적으로는 발현 시 항체 단백질에 융합되며, 숙주 세포로부터 상기 항체의 친화성 정제를 위한 수단으로서 작용할 수 있다. 친화성 정제를, 예를 들어 친화성 기질로서 상기 태그에 대한 항체를 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의해 수행할 수 있다. 임의로, 상기 태그를 후속적으로, 몇몇 절단용 펩티다제를 사용하는 등과 같은 다양한 수단에 의해 상기 정제된 항체 폴리펩타이드로부터 제거할 수 있다.
상기 발현 벡터 중의 측면 서열은 동종(즉 숙주 세포와 동일한 종 및/또는 균주로부터), 이종(즉 숙주 세포 종 또는 균주 이외의 종으로부터), 하이브리드(즉 하나보다 많은 출처로부터의 측면 서열들의 조합), 합성 또는 천연일 수 있다. 그 자체로서, 상기 측면 서열의 출처는, 상기 측면 서열이 작용성이고 숙주 세포 기관에 의해 활성화될 수 있는 한, 임의의 원핵 또는 진핵생물 유기체, 임의의 척추동물 또는 무척추동물 유기체, 또는 임의의 식물일 수 있다.
본 발명의 벡터에 유용한 측면 서열들을 당해 분야에 널리 공지된 임의의 다수의 방법들에 의해 획득할 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 유용한 측면 서열들은 지도작성 및/또는 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 앞서 동정되었을 수도 있으며 따라서 적합한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 적합한 조직 출처로부터 단리할 수 있다. 일부의 경우, 측면 서열의 완전 뉴클레오타이드 서열은 공지되었을 수도 있다. 본 발명에서, 상기 측면 서열을, 핵산 합성 또는 클로닝에 대해 본 발명에 개시된 방법들을 사용하여 합성할 수도 있다.
상기 측면 서열의 전부 또는 단지 일부가 공지된 경우, 이를 PCR에 의해서 및/또는 동일하거나 또 다른 종으로부터의 적합한 올리고뉴클레오타이드 및/또는 측면 서열 단편을 갖는 게놈 라이브러리를 선별함으로써 획득할 수 있다. 상기 측면 서열이 공지되어 있지 않은 경우, 측면 서열을 함유하는 DNA의 단편을, 예를 들어 암호화 서열 또는 심지어 또 다른 유전자 또는 유전자들을 함유할 수도 있는 보다 큰 DNA 조각으로부터 단리할 수도 있다. 단리는 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의해 적합한 DNA 단편을 생성시킨 다음 아가로스 젤 정제, 퀴아겐(Qiagen)(등록상표) 컬럼 크로마토그래피(Chatsworth, Calif. USA), 또는 숙련가에게 공지된 다른 방법들을 사용하여 단리함으로써 수행될 수 있다. 상기 목적을 수행하기에 적합한 효소의 선택은 당해 분야의 숙련가들에게 쉽게 자명할 것이다.
복제 기원은 전형적으로는 원핵생물 발현 벡터, 특히 상업적으로 구입된 것들의 일부이며, 상기 기원은 숙주 세포에서 상기 벡터의 증폭을 돕는다. 상기 선택 벡터가 복제 부위 기원을 함유하지 않는 경우, 이를 공지된 서열에 근거하여 화학적으로 합성하고 상기 벡터에 연결할 수 있다. 예를 들어 플라스미드 pBR322(New England Biolabs, Beverly, Mass. USA)로부터의 복제 기원은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하며, 다양한 기원들(예를 들어 SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, 수포성 구내염 바이러스(VSV), 또는 파필로마바이러스, 예를 들어 HPV 또는 BPV)이 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 포유동물 복제 기원은 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다(예를 들어, SV40 기원은 종종 상기 기원이 초기 프로모터를 함유하므로 유일하게 사용된다).
본 발명의 발현 및 클로닝 벡터는, 전형적으로는 숙주 유기체에 의해 인식되고 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결된 프로모터를 함유할 것이다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 조절하는 구조 유전자(일반적으로 약 100 내지 1000 pb 이내)의 출발 코돈에 대해 상부(즉 5')에 위치한 전사되지 않은 서열이다. 프로모터는 통상적으로 2 개의 부류들, 즉 유도성 프로모터 및 구성 프로모터 중 하나로 분류된다. 유도성 프로모터는 배양 조건의 일부 변화, 예를 들어 영양소의 존재 또는 부재 또는 온도의 변화에 반응하여 상기 프로모터의 조절 하에서 DNA로부터 증가된 수준의 전사를 개시시킨다. 다른 한편으로, 구성 프로모터는 연속적인 유전사 산물 생성을 개시시킨다, 즉 유전자 발현에 대한 실험적인 조절은 거의 또는 전혀 없다. 다양한 잠재적인 숙주 세포들에 의해 인식되는 다수의 프로모터들이 널리 공지되어 있다. 적합한 프로모터는, 제한 효소 절단에 의해 소스 DNA로부터 프로모터를 제거하거나, 폴리머라제 쇄 반응에 의해 상기 프로모터를 증폭시키고 목적하는 프로모터 서열을 상기 벡터 내에 삽입함으로써 항-Dkk-1 항체를 암호화하는 DNA에 작동적으로 결합된다.
효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터가 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 효모 인핸서는 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다. 포유동물 숙주 세포와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 널리 공지되어 있으며 비 제한적으로 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스(예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포 바이러스, 레트로바이러스, 간염-B 바이러스, 및 가장 바람직하게는 유인원 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스들의 게놈으로부터 수득된 것들을 포함한다. 다른 적합한 포유동물 프로모터는 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 열 충격 프로모터 및 액틴 프로모터가 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터의 실시에 유용한 특정 프로모터는 비 제한적으로 SV40 초기 프로모터 영역(Bemoist and Chambon (1981) Nature 290:304-10); CMV 프로모터; 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부 중에 함유된 프로모터(Yamamoto et al., (1980) Cell 22:787-97); 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(Wagner et al.(1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-45); 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열(Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42); 원핵생물 발현 벡터, 예를 들어 베타-락타마제 프로모터(Villa-Kamaroff et al.(1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75:3727-31); 또는 tac 프로모터(DeBoer et al.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)를 포함한다. 또한 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에 사용되어왔던 하기의 동물 전사 조절 영역들을 이용할 수 있다: 췌장 샘꽈리 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(Swift et al. (1984) Cell 38: 63946; Ornitz et al. (1986) cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399409; MacDonald, 1987, Hapatology 7: 425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(Hanahan (1985) Nature 315: 115-22); 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역(Leder et al. (1986) Cell 45: 485-95); 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(Pinkert et al. (1987) Genes and Devel. 1: 268-76); 간에서 활성인 알파 태아 단백질 유전자 조절 영역(Krumlauf et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987) Science 235: 53-58); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역(Kelsey et al. (1987) Genes and Devel. 1: 161-71); 골수 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역(Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al. (1986) Cell 46: 89-94); 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 마이엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역(Readhead et al. (1987) Cell 48: 703-12); 골격 근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(Sani (1985) Nature 314:283-86); 시상하부에서 활성인 고나도트로핀 방출 호르몬 유전자 조절 영역(Mason et al. (1986) Science 234: 1372-78); 및 가장 특히 림프 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(Grosschedl et al.(1984) Cell 38: 647-58; Adams et al. (1985) Nature 318: 533-38; Alexander et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7:1436-44).
인핸서 서열을 상기 벡터에 삽입하여 본 발명의 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 암호화하는 핵산의 보다 고등 진핵생물에서의 전사를 증가시킬 수도 있다. 인핸서는 전사를 증가시키기 위해 프로모터 상에서 작용하는, 대개 약 10 내지 300 bp 길이의, DNA의 시스-작용 요소이다. 인핸서는 비교적 배향성이며 위치 독립적이다. 상기 인핸서는 전사 단위에 대해 5' 및 3'에서 발견되었다. 포유동물 유전자들로부터 입수할 수 있는 여러 인핸서 서열들이 공지되어 있다(예를 들어 글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파 태아 단백질 및 인슐린). 바이러스로부터의 인핸서 서열도 또한 사용될 수 있다. SV40 앤핸서, 거대세포바이러스 초기 프로모터 인핸서, 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 예시적인 증강 요소들이다. 인핸서는 핵산 분자에 대해 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 연접될 수 있지만, 전형적으로는 상기 프로모터에 대해 5' 부위에 놓인다.
발현 벡터에서, 전사 종결 서열은 전형적으로는 폴리펩타이드 암호화 영역의 단부의 3'에 위치하며 전사를 종결시키는 작용을 한다. 원핵생물 세포에서의 발현에 사용되는 전사 종결 서열은 전형적으로는 G-C 풍부 단편에 이은 폴리-T 서열이다. 상기 서열은 라이브러리로부터 쉽게 클로닝되거나 심지어 벡터의 일부로서 상업적으로 구입되지만, 본 발명에 개시된 바와 같은 핵산 합성 방법을 사용하여 쉽게 합성할 수도 있다.
선택 마커 유전자 요소는 선택성 배양 배지에서 생육되는 숙주 세포의 생존 및 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 발현 벡터에 사용되는 전형적인 선택 마커 유전자는 (a) 원핵생물 숙주 세포에 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 테트라사이클린, 또는 가나마이신에 대한 내성을 부여하거나; (b) 상기 세포의 영양요구성 결핍을 보충하거나; 또는 (c) 복합 배지로부터 입수할 수 없는 부족한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다. 선택 마커의 예로는 가나마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자가 있다. 세균성 네오마이신 내성 유전자를 또한 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포 모두에서의 선택에 사용할 수 있다.
다른 선택 유전자를 사용하여, 발현하려는 유전자를 증폭시킬 수 있다. 증폭은, 단일 사본으로는 몇몇 선택 조건 하에서 세포의 생존 및 성장을 허용할 정도로 충분히 높은 수준으로 발현될 수 없는 유전자를, 재조합 세포의 연속하는 세대의 염색체들 내에서 나란히 되풀이시키는 과정이다. 포유동물 세포에 적합한 증폭가능한 선택 마커의 예는 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 프로모터없는(promoterless) 티미딘 키나제를 포함한다. 이들 마커의 사용에서 포유동물 세포 형질전환체를 도태압(selection pressure) 하에 두며, 여기에서 오직 상기 형질전환체만이 벡터 중에 존재하는 선택 유전자에 의해 유일하게 생존하기에 적합하다. 도태압은, 형질전환된 세포를 배지 중의 선택제의 농도가 연속적으로 증가하는 조건 하에서 배양하여 상기 선택 유전자가 증폭된 세포들만이 생존할 수 있게 함으로써 부과된다. 이러한 상황 하에서, 상기 선택 유전자에 인접한 DNA, 예를 들어 본 발명의 항체를 암호화하는 DNA가 상기 선택 유전자와 함께 증폭된다. 그 결과, 상기 증폭된 DNA로부터 증가된 양의 항-Dkk-1 폴리펩타이드가 합성된다.
리보솜 결합 부위는 대개 mRNA의 번역 개시에 필요하며 샤인-달가노(Shine-Dalgarno) 서열(원핵생물) 또는 코작(Kozak) 서열(진핵생물)을 특징으로 한다. 상기 요소는 전형적으로는 상기 프로모터에 대해 3' 및 발현하려는 폴리펩타이드의 암호화 서열에 대해 5'에 위치한다.
일부의 경우, 예를 들어 진핵생물 숙주 세포 발현 시스템에서 글리코실화를 원하는 경우, 다양한 예비서열들을 글리코실화 또는 수율을 개선시키기 위해 조작할 수 있다. 예를 들어, 특정 신호 펩타이드의 펩티다제 절단 부위를 변경시키거나, 또는 전구 서열을 첨가할 수 있으며, 이는 글리코실화에 또한 영향을 미칠 수 있다. 최종 단백질 산물은 -1 번 위치(성숙한 단백질의 첫 번째 아미노산에 대해)에, 발현되기 쉬운 하나 이상의 추가적인 아미노산(이는 완전히 제거되지 않았을 수도 있다)을 가질 수 있다. 예를 들어, 최종 단백질 산물은 아미노 말단에 결합된, 펩티다제 절단 부위에서 발현되는 하나 또는 2 개의 아미노산 잔기를 가질 수도 있다. 한편으로, 일부 효소 절단 부위의 사용은, 상기 효소가 상기 성숙한 폴리펩타이드 내의 상기와 같은 영역에서 절단되는 경우, 약간 절두되었지만 여전히 활성인 형태의 목적하는 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다.
상업적으로 입수할 수 있는 발현 벡터가 상술한 바와 같은 목적하는 측면 서열의 일부가 없는 경우, 상기 서열을 상기 벡터에 개별적으로 연결시킴으로써 상기 벡터를 변이시킬 수 있다. 상기 벡터를 선택하고 목적하는 바와 같이 변이시킨 후에, 본 발명의 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 암호화하는 핵산 분자를 상기 벡터의 적합한 부위에 삽입시킨다.
본 발명의 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 암호화하는 완성 벡터를 증폭 및/또는 폴리펩타이드 발현을 위해 적합한 숙주 세포에 삽입시킨다. 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편에 대한 발현 벡터의 선택된 숙주 세포 내로의 형질전환을 널리 공지된 방법, 예를 들어 형질감염, 감염, 염화 칼슘, 일렉트로포레이션, 미세 주입, 리포펙션, DEAE-덱스트란 방법, 또는 다른 공지된 기법에 의해 수행할 수 있다. 상기 선택된 방법은 부분적으로는 사용되는 숙주 세포 유형의 함수일 것이다. 상기 방법 및 다른 적합한 방법들은 숙련가에게 널리 공지되어 있다.
상기 형질전환된 숙주 세포는 적합한 조건 하에서 배양 시, 배양 배지로부터(숙주 세포가 상기 배지 내로 항-Dkk1- 항체 또는 그의 작용 단편을 분비하는 경우) 또는 상기 항체 또는 그의 작용 단편을 생산하는 숙주 세포로부터 직접(상기 항-Dkk-1 항체 또는 그의 작용 단편이 분비되지 않는 경우) 후속 수거될 수 있는 상기 항체 또는 그의 작용 단편을 합성한다. 적합한 숙주 세포의 선택은 다양한 인자들, 예를 들어 목적하는 발현 수준, 활성에 바람직하거나 필요한 폴리펩타이드 변이(예를 들어 글리코실화 또는 인산화) 및 생물학적으로 활성인 분자로의 접힘 용이성에 따라 변할 것이다.
발현용 숙주로서 입수할 수 있는 포유동물 세포 주는 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 비 제한적으로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)으로부터 입수할 수 있는 다수의 불멸화된 세포 주, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어 Hep G2), 및 다수의 다른 세포 주들을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 다양한 세포 주들을 이들이 최고 수준의 발현 수준을 가지며 구성적인 Dkk-1 결합 성질을 갖는 항체를 생산하는 지를 측정하기 위해 시험함으로써, 특정 DNA 구조물을 발현하는 최상의 세포 주를 선택할 수 있다.
약학 조성물
또 다른 태양에서, 본원은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화된 조성물, 예를 들어 본원의 단클론 항체들 또는 그의 항원 결합 부분(들) 중 하나 또는 이들의 조합을 함유하는 약학 조성물을 제공한다. 상기와 같은 조성물은 본원의 (예를 들어 2 개 이상의 상이한) 항체 또는 면역접합체 또는 이중 특이성 분자 중 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원의 약학 조성물은 표적 항원 상의 상이한 에피토프들에 결합하거나 상보적인 활성을 갖는 항체들(또는 면역접합체들 또는 이중 특이성 분자들)의 조합을 포함할 수 있다.
본원의 약학 조성물을 또한 복합 요법으로, 즉 다른 작용제들과 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 복합 요법은 하나 이상의 다른 소염제 또는 면역억제제와 병용된 본원의 항-Dkk-1 항체를 포함할 수 있다. 복합 요법에 사용될 수 있는 치료제들의 예를 하기 본원의 항체들의 용도에 대한 부분에서 보다 상세히 개시한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생리학적으로 적합한 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 전형적으로, 상기 담체는 정맥 내, 근육 내, 피하, 비 경구, 척추 또는 표피 투여(예를 들어 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 그의 항원 결합 부분, 면역접합체 또는 이중 특이성 분자를, 화합물을 불활성화시킬 수도 있는 산 및 다른 천연 조건들의 작용으로부터 상기 화합물을 보호하는 물질로 코팅할 수도 있다.
일부 실시태양에서, 본원의 항체는 중성 형태(양쪽성 이온 형태)로 또는 양으로 또는 음으로 하전된 종들로 존재할 수 있다. 일부의 경우, 상기 항체는 대이온과 착화되어 약학적으로 허용 가능한 염을 형성할 수도 있다. 따라서, 본원의 약학 화합물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다.
"약학적으로 허용 가능한 염"은 모 화합물(예를 들어 항체)의 목적하는 생물 활성을 유지하고 바람직하지 못한 독성학적 영향을 미치지 않는 염을 지칭한다(Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). 예를 들어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 용어는 하나 이상의 항체 및 하나 이상의 대이온을 포함하는 복합체를 포함하며, 이때 상기 대이온은 약학적으로 허용 가능한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도된다.
상기와 같은 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 있다. 산 부가염은 무독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 뿐만 아니라 무독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐 치환된 알칸산, 하이드록시알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 설폰 산 등으로부터 유도된 염들을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토 금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등으로부터 뿐만 아니라 무독성 유기산, 예를 들어 N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 프로카인 등으로부터의 염들을 포함한다.
더욱 또한, 약학적으로 허용 가능한 무기 염기는 금속 이온을 포함한다. 금속 이온은 비 제한적으로 적합한 알칼리 금속염, 알칼리 토금속 염 및 다른 생리학적으로 허용 가능한 금속 이온을 포함한다. 무기 염기로부터 유도된 염은 알루미늄, 암모늄, 칼슘, 코발트, 니켈, 몰리브덴, 바나듐, 망간, 크로뮴, 셀레늄, 주석, 구리, 제 1 철, 제 2 철, 리튬, 마그네슘, 망간산염, 제 1 망간, 칼륨, 루비듐, 나트륨 및 아연을 이들의 통상적인 원자가로 포함한다.
본원의 항체의 약학적으로 허용 가능한 산 부가염은 하기의 산들, 예를 들어 비 제한적으로 폼산, 아세트산, 아세트아미도벤조산, 아디프산, 아스코르브산, 붕산, 프로피온산, 벤조산, 캄포르산, 카본산, 사이클람산, 데하이드로콜산, 말론산, 에데트산, 에틸황산, 펜디조산, 메타인산, 숙신산, 글리콜산, 글루콘산, 락트산, 말산, 타타르산, 탄닌산, 시트르산, 질산, 아스코르브산, 글루쿠론산, 말레산, 폴산, 퓨마르산, 프로피온산, 피루브산, 아스파트산, 글루탐산, 벤조산, 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 리신, 아이소시트르산, 트라이플루오로아세트산, 파모산, 프로피온산, 안트라닐산, 메실산, 오로트산, 옥살산, 옥살아세트산, 올레산, 스테아르산, 살리실산, 아미노살리실산, 실리케이트, p-하이드록시벤조산, 니코틴산, 페닐아세트산, 만델산, 엠본산, 설폰산, 메탄설폰산, 인산, 포스폰산, 에탄설폰산, 에탄다이설폰산, 암모늄, 벤젠설폰산, 판토텐산, 나프탈렌설폰산, 톨루엔설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 설판산, 황산, 질산, 아질산, 황산 모노메틸 에스터, 사이클로헥실아미노설폰산, β-하이드록시부티르산, 글리신, 글리실글리신, 글루탐산, 카코딜레이트, 다이아미노헥산산, 캄포설폰산, 글루콘산, 티오시안산, 옥소글루타르산, 피리독살 5-포스페이트, 클로로페녹시아세트산, 운데칸산, N-아세틸-L-아스파트산, 갈락타르산 및 글락튜론산으로부터 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 유기 염기는 트라이메틸아민, 다이에틸아민, N,N'-다이벤질에틸렌다이아민, 클로로프로카인, 콜린, 다이벤질아민, 다이에탄올아민, 에틸렌다이아민, 메글루민(N-메틸글루카민), 프로카인, 사이클릭 아민, 4급 암모늄 양이온, 아르기닌, 베타인, 카페인, 클레미졸, 2-에틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 2-다이메틸아미노에탄올, 에탄다이아민, 부틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, N-에틸모폴린, N-에틸피페리딘, 에틸글루카민, 글루카민, 글루코스아민, 히스티딘, 하이드라바민, 이미다졸, 아이소프로필아민, 메틸글루카민, 모폴린, 피페라진, 피리딘, 피리독신, 네오디뮴, 피페리딘, 폴리아민 수지, 프로카인, 퓨린, 테오브롬, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, 메틸아민, 타우린, 콜레이트, 6-아미노-2-메틸-2-헵탄올, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판다이올, 2-아미노-2-메틸-1-프로판올, 지방족 모노- 및 다이카복실산, 페닐-치환된 알칸산, 하이드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산, 스트론튬, 트리신, 하이드라진, 페닐사이클로헥실아민, 2-(N-모폴리노)에탄설폰산, 비스(2-하이드록시에틸)아미노-트리스(하이드록시메틸)메탄, N-(2-아세트아미도)-2-아미노에탄설폰산, 1,4-피페라진다이에탄설폰산, 3-모폴리노-2-하이드록시프로판설폰산, 1,3-비스[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]프로판, 4-모폴린프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산, 2-[(2-하이드록시-1,1-비스(하이드록시메틸)에틸)아미노]에탄설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노에탄설폰산, 4-(N-모폴리노)부탄설폰산, 3-(N,N-비스[2-하이드록시에틸]아미노)-2-하이드록시프로판설폰산, 2-하이드록시-3-[트리스(하이드록시메틸)메틸아미노]-1-프로판설폰산, 4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-(2-하이드록시프로판설폰산), 피페라진-1,4-비스(2-하이드록시프로판설폰산) 다이하이드레이트, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진프로판설폰산, N,N-비스(2-하이드록시에틸)글리신, N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(4-부탄설폰산), N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]-3-아미노프로판설폰산, N-트리스(하이드록시메틸)메틸-4-아미노부탄설폰산, N-(1,1-다이메틸-2-하이드록시에틸)-3-아미노-2-하이드록시프로판설폰산, 2-(사이클로헥실아미노)에탄설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-2-하이드록시-1-프로판설폰산, 3-(사이클로헥실아미노)-1-프로판설폰산, N-(2-아세트아미도)이미노다이아세트산, 4-(사이클로헥실아미노)-1-부탄설폰산, N-[트리스(하이드록시메틸)메틸]글리신, 2-아미노-2-(하이드록시메틸)-1,3-프로판다이올 및 트로메타몰을 포함한다.
본원의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 산화방지제를 또한 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 산화방지제의 예는 (1) 수용성 산화방지제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 나트륨 바이설페이트, 나트륨 메타바이설파이트, 나트륨 설파이트 등; (2) 유용성 산화방지제, 예를 들어 아스코빌 팔미테이트, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타타르산, 인산 등을 포함한다.
본원의 약학 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비 수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브유, 및 주사 가능한 유기 에스터, 예를 들어 에틸 올리에이트를 포함한다. 적합한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예를 들어 레시틴에 의해서, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다.
이들 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제와 같은 보조제들을 함유할 수도 있다. 상기 멸균 과정과 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등을 포함시켜 미생물의 존재를 확실히 방지할 수 있다. 등장성 작용제, 예를 들어 당, 염화 나트륨 등을 상기 조성물에 포함시키는 것도 또한 바람직할 수 있다. 또한, 상기 주사 가능한 약제 형태의 연장된 흡수는 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같이 흡수를 지연시키는 작용제의 포함에 의해 발생시킬 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말 및 멸균 수용액 또는 분산액을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 대한 상기와 같은 매질 및 작용제의 용도는 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제의 사용이, 상기 활성 화합물과 상용성이지 않은 경우를 제외하고, 본원의 약학 조성물에서 고려된다. 보충적인 활성 화합물을 또한 상기 조성물에 혼입시킬 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로는 제조 및 보관 조건 하에서 멸균성이고 안정해야 한다. 상기 조성물을 용액, 미세유화액, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로서 제형화할 수 있다. 상기 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예를 들어 레시틴에 의해서, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해서, 및 계면활성제의 사용에 의해서 유지될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 솔비톨, 또는 염화 나트륨을 상기 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 상기 주사용 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시킴으로써 발생시킬 수 있다.
멸균 주사용 용액은 상기 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거한 성분들 중 하나 또는 조합과, 적합한 용매 중에서 필요량으로 혼입한 다음 멸균 미세여과에 의해 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 상기 활성 화합물을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것들로부터의 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 비 제한적으로 상기 활성 성분 + 앞서 멸균 여과된 그의 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적하는 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
단일 투여형을 생성시키기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 환자, 및 특정한 투여 방식에 따라 변할 것이다. 단일 투여형을 생성시키기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성시키는 상기 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 상기 량은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 1% 내지 약 30%의 활성 성분의 범위일 것이다.
투여 섭생을 최적의 목적하는 반응(예를 들어 치료 반응)을 제공하기 위해서 조절한다. 예를 들어 일시 주사를 투여하거나, 수 회의 분할 용량을 시간에 걸쳐 투여하거나 또는 상기 용량을 치료 상황의 위급성이 지시하는 대로 비례하여 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해서 비 경구 조성물을 투여 단위로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본 발명에 사용된 투여 단위형은 치료하려는 환자에 대한 단위 투여형으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정 량의 활성 화합물을 함유한다. 본원의 투여 단위형의 명시는 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 성취하고자 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 개인에서의 민감성의 치료를 위해 상기와 같은 활성 화합물을 배합하는 분야의 고유의 제한에 의해 지시되며 이에 직접 의존한다.
항체의 투여를 위해서, 상기 투여량 범위는 숙주 체중의, 약 0.0001 내지 100 ㎎/㎏, 및 보다 대개는 0.01 내지 5 ㎎/㎏이다. 예를 들어 투여량은 0.3 ㎎/㎏ 체중, 1 ㎎/㎏ 체중, 3 ㎎/㎏ 체중, 5 ㎎/㎏ 체중 또는 10 ㎎/㎏ 체중 또는 1 내지 10 ㎎/㎏의 범위 이내일 수 있다. 예시적인 치료 섭생은 1 주일에 1 회, 매 2 주마다 1 회, 매 3 주마다 1 호, 매 4 주마다 1 회, 1 개월에 1 회, 매 3 개월마다 1 회, 또는 매 3 내지 6 개월마다 1 회의 투여를 수반한다. 본원의 항-Dkk-1 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 투여량 섭생은 예를 들어 피하 투여를 통해 1 ㎎/㎏ 체중 또는 3 ㎎/㎏ 체중을 포함하고, 이때 항체는 하기의 투여 스케줄들 중 하나를 사용하여 제공된다: (i) 6 회의 투여량에 대해 매 4 주마다, 이어서 매 3 개월마다; (ii) 매 3 주마다; (iii) 3 ㎎/㎏ 체중 1 회에 이어서 매 3 주마다 1 ㎎/㎏ 체중.
일부 실시태양에서, 상이한 결합 특이성을 갖는 2 개 이상의 항체 또는 그의 단편을 동시에 투여하며, 상기 각각의 경우에 투여되는 각 항체의 투여량은 상기 나타낸 범위 내에 있다. 항체를 대개는 수 회 투여한다. 단일 투여량 들 간의 간격은 예를 들어 매주, 매달, 매 3 개월마다 또는 매년일 수 있다. 간격은 또한 환자의 표적 항원에 대한 항체의 혈액 수준을 측정함으로써 지시되는 바와 같이 불규칙할 수도 있다. 일부의 방법에서, 투여량을 약 1 내지 1000 ㎍/㎖의 혈장 항체 농도 및 일부의 방법에서 약 25 내지 300 ㎍/㎖의 농도를 성취하도록 조절한다.
한편으로, 상기 항체를 서방성 제형으로서 투여할 수 있으며, 이 경우 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 회수는 환자 중의 항체의 반감기에 따라 변한다. 일반적으로, 인간 항체는 가장 긴 반감기를 나타내며, 다음으로 인간화된 항체, 키메릭 항체 및 비인간 항체의 순이다. 투여량 및 투여 회수는 치료가 예방학적인지 치료학적인지에 따라 변할 수 있다. 예방학적 용도에서, 긴 기간에 걸쳐 비교적 적은 투여량이 비교적 덜 빈번한 간격으로 투여된다. 일부 환자는 그의 나머지 삶 동안 계속해서 치료를 받는다. 치료학적 용도에서, 질병의 진행이 감소되거나 종결될 때까지, 및 바람직하게는 환자가 질병의 부분적이거나 완전한 개선을 보일 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 투여량이 때때로 요구된다. 그 후에, 상기 환자는 예방학적 섭생이 투여될 수 있다.
본원의 약학 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에 대한 독성 없이, 특정한 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 성취하기에 유효한 활성 성분의 양을 획득하기 위해 변화될 수 있다. 상기 선택되는 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자들, 예를 들어 사용되는 본원의 특정 조성물, 또는 그의 에스터, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료의 지속기간, 상기 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 조건, 일반적인 건강 및 선행 병력, 및 의료 분야에 널리 공지된 유사한 인자들에 따라 변할 것이다.
본원의 항-Dkk-1 항체의 "치료 유효 투여량"은 질병 증상 중증도의 감소, 질병 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질병 고통으로 인한 장애 또는 불능의 방지를 생성시킨다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 상기와 같은 양을 환자의 크기, 환자 증상의 중증도, 및 선택되는 특정 조성물 또는 투여 경로를 근거로 결정할 수 있다.
항-Dkk-1 항체의 투여량을 표적 매개된 약물 성향(TMDD) PK/PD 모델과 같은 방법을 사용하여 계산할 수 있다. 상기와 같은 모델을 항체 농도 반응 관계의 계산에 사용할 수 있다. PK/PD 모델을 사용하여 항체 비-표적 매개된 제거, 항체 대사회전 및 복합체 형성 및 제거를 평가할 수 있다. 상기 TMDD 모델을 사용하여, 동물 모델(예를 들어 래트 또는 원숭이)을 사용하여 측정한 데이터를 인간 데이터로 번역하여 유효 용량을 예측할 수 있다. MABEL 모델은 발현 및 대사회전율을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 PK/PD 모델을 사용하여 Kd 값에 근거한 수용체 점유율을 계산할 수 있다. 수용체 점유율을 측정하기 위해서 표적의 대사회전율 및/또는 항체-표적 복합체의 동역학을 고려한다. 상기 PK/PD 모델을 사용하여 임상 연구의 안전성 및 효율을 예측할 수 있다.
본원의 조성물을 당해 분야에 공지된 다양한 방법들 중 하나를 사용하여 하나 이상의 투여 경로를 통해 투여할 수 있다. 숙련가들에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 변할 것이다. 본원의 항체 또는 항원 결합 부분의 투여 경로는 정맥 내, 근육 내, 경피, 복강 내, 피하, 척추 또는 다른 비 경구 투여 경로, 예를 들어 주사 또는 주입에 의한 투여를 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "비 경구 투여"란 어구는 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 대개는 주사에 의한 투여를 의미하며, 비 제한적으로 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 경막 내, 관절 내, 안 내, 심장 내, 피 내, 복강 내, 기관지 내, 피하, 각피하, 관절 내, 피막하, 지주막하, 척수 내, 경막 외 및 흉골 안 주사 및 주입을 포함한다.
한편으로, 본원의 항체 또는 항원 결합 부분을 비 경구 경로, 예를 들어 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비 내, 구강, 질 내, 직장 내, 설 하 또는 국소에 의해 투여할 수 있다.
상기 활성 화합물을, 급속 방출, 예를 들어 조절된 방출 제형에 대해 상기 화합물을 보호하는 담체, 예를 들어 임플란트, 경피 패치, 및 미세캡슐화된 전달 시스템과 함께 제조할 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오쏘에스터, 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 상기와 같은 제형의 다수의 제조 방법들이 특허를 얻거나 또는 당해 분야의 숙련가들에게 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York(1978)]을 참조하시오.
치료 조성물을 당해 분야에 공지된 의료 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어 본원의 치료 조성물을 무바늘 피하 주사 장치, 예를 들어 미국 특허 제 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; 또는 4,596,556에 개시된 장치로 투여할 수 있다. 본원에 유용한 널리 공지된 임플란트 및 모듈의 예는 조절된 속도로 약물을 분배하는 이식 가능한 미세주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제 4,487,603 호; 피부를 통해 약물을 투여하기 위한 치료 장치를 개시하는 미국 특허 제 4,486,194 호; 정확한 주입속도로 약물을 전달하기 위한 약물 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제 4,447,233 호; 연속적인 약물 전달을 위한 가변 유동의 이식 가능한 주입 장치를 개시하는 미국 특허 제 4,447,224 호; 다수의 챔버 구획을 갖는 삼투 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제 4,439,196 호; 및 삼투 약물 전달 시스템을 개시하는 미국 특허 제 4,475,196 호를 포함한다. 다수의 다른 상기와 같은 임플란트, 전달 시스템, 및 모듈들이 당해 분야의 숙련가들에게 공지되어 있다.
일부 실시태양에서 본원의 항체 또는 그의 단편을 생체 내 적합한 분배를 보장하도록 제형화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB)은 다수의 고도로 친수성인 화합물들을 배제시킨다. 본원의 치료 화합물이 상기 BBB를 가로지를 수 있도록(경우에 따라), 상기 화합물을 예를 들어 리포솜으로 제형화할 수 있다. 리포솜의 제조 방법에 대해서, 예를 들어 미국 특허 제 4,522,811; 5,374,548; 및 5,399,331 호를 참조하시오. 상기 리포솜은 특정 세포 또는 기관으로 선택적으로 운반되어, 표적화된 약물 전달을 향상시키는 하나 이상의 부분들을 포함할 수 있다(V.V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). 예시적인 표적화 부분은 폴레이트 또는 비오틴(로우(Low) 등의 미국 특허 제 5,416,016 호); 만노사이드(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); 항체(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); 계면활성제 단백질 A 수용체(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)을 포함한다. 또한 문헌[K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123]; [J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273]을 참조하시오.
본 발명에 제공된 바와 같이, 상기 제공되는 약학 조성물을 예방학적 및/또는 치료학적 치료를 위해 투여할 수 있다. "유효량"은 일반적으로 목적하는 효과(증상의 중증도 및/또는 빈도의 감소 또는 제거 및/또는 손상의 개선 또는 교정이다)를 성취하기 위한 활성 성분(즉 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편)의 충분하지만 무독성인 양을 지칭한다. "치료 유효량"은 질병 상태 또는 증상의 개선, 또는 달리 질병의 진행 또는 임의의 다른 바람직하지 못한 증상의 예방, 방해, 지연 또는 역전에 충분한 양을 지칭한다. "예방 유효량"은 질병 상태 또는 증상의 개시의 방지, 방해 또는 지연에 유효한 양을 지칭한다.
일반적으로, 상기 항체 또는 단편의 독성 및 치료 효능을 세포 배양물 및/또는 실험 동물에서 표준 약학 과정에 따라 측정할 수 있다, 예를 들어 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료학적으로 유효한 용량)을 측정함을 포함한다. 독성과 치료 효과 간의 용량 비가 치료 지수이며 이를 LD50/ED50 비로서 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물이 바람직하다.
상기 세포 배양 및/또는 동물 연구로부터 획득된 데이터를 인간에 대한 투여량 범위를 공식화하는데 사용할 수 있다. 상기 활성 성분의 투여량은 전형적으로는 독성이 거의 또는 전혀 없이 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 투여량을 사용되는 투여형 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변화시킬 수 있다.
본 발명에서 언급한 바와 같이, 상기 치료학적으로 또는 예방학적으로 사용되는 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 포함하는 약학 조성물의 유효량은 예를 들어 치료 상황 및 목적들에 따라 변할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 따라서 몇몇 실시태양에 따라 치료에 적합한 투여량 수준이 부분적으로, 전달되는 분자, 상기 항-Dkk1-1 항체가 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 크기(체중, 체 표면 또는 기관 크기) 및/또는 조건(연령 및 일반적인 건강)에 따라 변함을 알 것이다. 임상의는 상기 투여량을 적정할 수 있고 최적의 치료 효과를 획득하기 위해서 투여 경로를 변경시킬 수 있다.
투여 회수는 상기 제형 중의 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편의 약동학 매개변수에 따라 변할 것이다. 예를 들어 임상의는 상기 조성물을 목적하는 효과를 성취하는 투여량에 도달할 때까지 투여할 것이다. 따라서 상기 조성물을 시간에 따라 단일 용량으로서 또는 2 회 이상의 용량(동일한 양의 목적하는 분자를 함유할 수도 함유하지 않을 수도 있다)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속적인 주입으로서 투여할 수 있다. 치료는 시간에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 적합한 투여량에 대한 추가의 정제를 당해 분야의 통상적인 숙련가들에 의해 통상적으로 수행하며 이는 이들 숙련가에 의해 통상적으로 수행되는 임무의 범위 내에 있다. 적합한 투여량을 적합한 용량 반응 데이터의 사용을 통해 확인할 수 있다.
Dkk-1의 이상 또는 과잉 발현을 특징으로 하는 의학적 질환을 치료하기 위해서, 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 포함하는 조성물을 환자에게 상기 질환의 중증도를 반영하는 하나 이상의 지표의 지속적인 개선을 유도하기에 충분한 양으로 상기에 충분한 시간 동안 투여할 수 있다. 개선은 상기 환자가 적어도 1 내지 7일까지, 또는 일부의 경우 1 내지 6주까지 분리된 2 회의 시기에 개선을 나타내는 경우 "지속되는" 것으로 간주한다. 적합한 간격은 질병 상태가 치료되는 정도에 따라 다를 것이며; 상기 개선의 지속 여부를 결정하기에 적합한 간격을 결정하는 것은 숙련된 의사의 권한 내에 있다. 상기 개선의 정도는 징후나 증상을 근거로 측정되며, 환자에게 가해지는 질문서, 예를 들어 삶의 질 질문서를 또한 사용할 수도 있다.
환자 질병의 정도를 반영하는 다양한 지표들을 상기 치료의 양 및 시간이 충분한지를 결정하기 위해 평가할 수도 있다. 선택되는 지표 또는 지표들에 대한 기준선 값은 항체의 첫 번째 용량의 투여 전에 환자의 검사에 의해 설정된다. 바람직하게는, 상기 기준선 검사를 상기 첫 번째 용량 투여 약 60일 이내에 수행한다. 상기 항체가 급성 증상을 치료하기 위해서, 예를 들어 골절된 뼈의 치료를 위해 투여되는 경우, 상기 첫 번째 용량은 상기 상해가 발생한 후에 실행 가능한 한 빨리 투여된다.
개선은 환자가 상기 선택된 지표 또는 지표들에 대한 기준선 이상의 개선을 나타낼 때까지 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편을 투여함으로써 유도된다. 만성 상태의 치료에서, 상기 개선의 정도는 상기 약제를 적어도 1 개월 이상의 기간에 걸쳐, 예를 들어 1, 2 또는 3 개월 또는 그 이상, 또는 무한정 반복 투여함으로써 획득된다. 급성 상태의 치료에는 종종 1 내지 6 주의 기간, 또는 심지어 단일 용량으로 충분하다. 상해 또는 급성 상태의 경우, 단일 용량이 충분할 수 있다.
치료 후 환자의 질병 정도가 하나 이상의 지표들에 따라 개선되는 것으로 보일 수도 있지만, 치료를 동일한 수준으로 또는 감소된 용량 또는 회수로 무한정 계속할 수도 있다. 일단 치료를 줄이거나 중단하면, 나중에 증상들이 다시 나타나는 원래의 수준으로 되돌아갈 수도 있다.
항- Dkk -1 항체에 대한 예시적인 유용성
검출 및 선별
항-Dkk-1 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 사용하여 생물학적 샘플에서 Dkk-1을 검출할 수 있다. 상기와 같은 사용은 Dkk-1을 과 생산하거나 부족하게 생산하는 병적인 상태를 검출하기 위한 진단제로서 사용되거나 상기 단백질을 생산하는 세포 또는 조직을 동정할 수 있게 한다.
상기 제공되는 항체 및 단편을 또한 Dkk-1에 결합하는 분자를 선별하는 방법에 사용할 수 있다. 예를 들어 다양한 경쟁적인 선별 방법들을 사용할 수 있다. 일부의 방법에서, 항-Dkk-1 항체가 결합하는 Dkk-1 분자 또는 그의 단편을 또 다른 분자(즉 후보 분자)와 함께 본 발명에 개시된 항체 또는 단편과 접촉시킨다. 상기 항체 또는 단편과 Dkk-1 간의 결합의 감소는 상기 분자가 Dkk-1과 결합함을 가리킨다. 상기 항체 또는 단편의 결합을 다양한 방법들, 예를 들어 ELISA를 사용하여 검출할 수 있다. 상기 항-Dkk-1 항체 또는 단편과 Dkk-1 간의 결합에 대한 검출은 상기 항체를 검출 가능하게 표지함으로써 단순화할 수 있다. 일부의 방법에서, 초기 선별에서 결합을 나타내는 분자를 추가로 분석하여 상기 분자가 Dkk-1 활성을 억제하는 지의 여부(예를 들어 상기 분자가 Wnt 신호전달을 활성화하는 지의 여부)를 측정한다.
골 관련 질환의 치료
다른 태양에서, 상기 제공되는 항체 및 면역학적으로 작용성인 단편들 중 몇몇을 사용하여, 예를 들어 Dkk-1 활성의 억제에 반응하는 질병을 포함한 각종 상이한 질병들이 있는 환자를 치료할 수 있다. 이들 항체 및 단편을 또한 Wnt 신호전달의 유도에 반응하는 질병의 치료에 사용할 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "환자"란 용어는 달리 나타내지 않는 한 인간 및 동물 환자를 포함한다. 상기와 같은 질병의 예로는 비 제한적으로 낮은 골 질량 상태, 전신 골 손실, 억제된 골 형성 및 골 미란을 포함한 골 질환을 수반하는 다양한 질병들이 있다. 상기 항체 및 단편의 일부를 또한 골 치유에 사용할 수도 있다.
일부 실시태양에서 상기 항체 또는 단편은 조골세포 활성을 자극하고 골 미네랄 밀도 또는 골 질량을 증가시킴에 있어서 치료학적 용도를 갖는다. 따라서 이들 항체 및 단편은 과도한 골 손실을 수반하는 다양한 의학적 질환을 앓고 있는 환자 또는 반드시 과도한 파골세포 활성이 있는 것은 아님에도 새로운 골 형성이 필요한 환자의 치료에 유용하다. Dkk-1 활성을 차단한 결과 Wnt 단백질에 의해 전달된 신호전달을 통해 조골세포가 활성화된다. 과도한 파골세포 활성은 다수의 골감소 질환, 예를 들어 골감소증, 골다공증, 치주염, 파제트병, 부동화로 인한 골 손실, 용해성 골 전이 및 관절염, 예를 들어 류마티스성 관절염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 및 골 미란을 수반하는 다른 상태들과 관련이 있으며, 상기 질환들은 상기 제공되는 항체 및 면역학적으로 작용성인 단편에 의해 치료될 수 있다.
다양한 형태의 골다공증, 예를 들어 비 제한적으로 글루코코르티코이드 유발된 골다공증, 이식 후 유발된 골다공증, 화학요법과 관련된 골다공증(즉 화학요법 유발된 골다공증), 부동화 유발된 골다공증, 기계적 하적으로 인한 골다공증, 및 간질치료제 사용과 관련된 골다공증을 포함한 다양한 다른 저 골 질량 상태들이 또한 치료될 수 있다. 상기 항체 또는 단편 중 일부로 치료될 수 있는 추가의 골 질병은 신부전과 관련된 골 질병 및 영양, 위장 및/또는 간 관련된 골 질병을 포함한다.
상이한 형태의 관절염들, 예를 들어 골관절염 및 류마티스성 관절염을 또한 치료할 수 있다. 상기 항체 및 단편을 또한 관절염과 관련된 전신 골 손실(예를 들어 류마티스성 관절염)의 치료에 사용할 수 있다. 관절염 치료에서, 환자들은 상기 항체 또는 그의 단편의 병변 주변 또는 병변 내 주사가 이로울 수 있다. 예를 들어 상기 항체 또는 그의 단편을 염증 관절에 인접하여 주사하거나 또는 상기 관절에 직접 주사하여, 상기 부위의 손상된 뼈의 치유를 자극할 수 있다.
일부의 암, 예를 들어 유방암 및 전립선암은 파골세포 활성을 증가시키고 골 재흡수를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 다발성 골수종(골수에서 발생한다)이 또한 부분적으로, 추정 상 혈장 세포에 의한 Dkk-1의 증가된 발현(이어서 부근의 조골세포의 골 형성 활성을 억제한다)으로 인해 골 손실과 관련이 있다. 상기 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 투여함으로써 Dkk-1 활성을 감소시킨 결과 상기 과도한 파골세포 활성을 방해하고, 이에 의해 상기 언급한 질환의 중증도를 감소시키고, 골 미란을 감소시키고 상기 환자에게서 새로운 골 형성을 유도하는 작용을 하는 조골세포 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 항-Dkk-1 특이 항체 또는 면역학적으로 작용성인 단편 중 몇몇에 의한 치료는 골 감소 질환을 앓고 있는 환자에게서 골 미네랄 밀도의 현저한 증가를 유도할 수 있다.
본 발명에 개시된 항체 또는 면역학적으로 작용성인 단편에 의한 Dkk-1의 억제를 또한 다양한 골 치유 용도들에 사용할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 항체 및 단편은 인공 관절과 관련된 마모 입자 골 용해를 지연시키고, 골절의 치유를 가속화하고, 이식 주변의 살아있는 뼈로의 골 이식편의 통합을 향상시키는데 유용할 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같이, 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 단독으로 또는 다른 치료제들과 함께, 예를 들어 암 치료제, 파골세포 활성을 억제하는 작용제, 또는 조골세포 활성을 향상시키는 작용제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체를 방사선 요법 또는 화학요법을 겪고 있는 암 환자에게 투여할 수 있다. 본 발명의 항체와 함께 사용되는 화학요법은 안트라사이클린, 탁솔, 타목시펜, 독소루비신, 5-플루오로유라실, 옥살로플라틴, 벨케이드(Velcade)(등록상표) ([(1R)-3-메틸-1-[[((2S)-1-옥소-3-페닐-2-[(피라지닐카보닐)아미노]프로필]아미노]부틸]보론산) 및/또는 암 치료에 사용되는 다른 소 분자 약물을 포함할 수 있다. 유방암 환자는 화학요법제 및 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 포함하는 복합 치료와 동반하여 아로마타제 억제제의 투여가 이로울 것이다.
항-Dkk-1 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 골 질량의 손실을 생성시키는 상기 언급한 상태의 치료를 위해 단독으로 또는 치료 유효량의 골 성장 촉진(골형성)제 또는 골-재흡수 억제제, 예를 들어 비 제한적으로 BMP-1 내지 BMP-12로 표시되는 골형성제; 형질전환 성장 인자-β 및 TGF-β 패밀리 구성원; 섬유아세포 성장 인자 FGF-1 내지 FGF-10; 인터류킨-1 억제제(IL-1ra, IL-1에 대한 항체 및 IL-1 수용체에 대한 항체 포함); TNFα 억제제(에타너셉트, 아달리부맵 및 인플릭시맵 포함); RANK 리간드 억제제(용해성 RANK, 오스테오프로테게린, 및 RANK 또는 RANK 리간드에 특이적으로 결합하는 길항 항체 포함), 부갑상선 호르몬, E 시리즈 프로스타글란딘, 비스포스포네이트 및 골 증강 미네랄, 예를 들어 플루오라이드 및 칼슘과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 항체 및 작용 단편과 함께 사용될 수 있는 골형성제는 부갑상선 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자(IGF)를 포함하며, 여기에서 상기 성장 인자는 바람직하게는 IGF 결합 단백질과 착화된다. 상기와 같은 복합 치료에 적합한 IL-1 수용체 길항물질은 WO 89/11540에 개시되어 있고 적합한 용해성 TNF 수용체-1은 WO 98/01555에 개시되어 있다. 예시적인 RANK 리간드 길항물질은 예를 들어 WO 03/086289, WO 03/002713, 미국 특허 제 6,740,511 및 6,479,635 호에 개시되어 있다. 상기 언급한 특허 및 특허 출원들은 모두 본 발명에 참고로 인용된다.
또한, 항-Dkk-1 항체를, 종양 세포에 결합하여 종양 성장에 대해 세포독성 및/또는 세포생육정지 효과를 유발하는 항체와 함께 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 항체의 예로는 세포 표면 단백질 Her2, CDC20, CDC33, 뮤신 유사 당단백질 및 종양 세포 상에 존재하는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하고 상기 단백질을 나타내는 종양 세포 상에서 세포생육 정지 및/또는 세포독성 효과를 유발하는 것들이 있다. 상기와 같은 항체의 예는 유방암의 치료를 위한 허셉틴(HERCEPTIN)(등록상표) 및 비호지킨 림프종의 치료를 위한 리툭산(RITUXAN)(등록상표)을 포함하며, 항체 기재 약물, 예를 들어 에르비툭스(ERBITUX)(등록상표) 및 아바스틴(AVASTIN)(등록상표)을 또한 포함한다. 또한, 복합 요법은 암 치료제로서 종양 세포에서 세포사멸을 선택적으로 유발하는 폴리펩타이드, 예를 들어 TNF-관련된 폴리펩타이드 TRAIL을 포함할 수 있다.
상기 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 동일한 병에 대해 투여되는 다른 치료 및 치료제들과 동반하여 투여할 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "동반 투여"는 동시에 또는 연속적으로 투여되는 치료들을 포함한다. 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을 초기 단계 암(I 또는 II 기)에 의한 골 질량 손실의 개시를 방지하거나 완화시키기 위해 예방학적으로 투여하거나, 또는 뼈로의 전이로 인한 기존의 골 질량 손실 상태를 개선시키기 위해 제공할 수 있다.
본 발명의 항-Dkk-1 항체를 사용하여 뼈 중의 종양 세포의 성장을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 뼈로 전이하는 암은 종양 세포가 파골세포를 자극하여 내부 골 기질을 재흡수하므로 쉽게 퍼질 수 있다. 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편에 의한 치료는 증가된 조골세포 활성을 자극함으로써 상기와 같은 전이 부위에서 골 미네랄 밀도가 유지되는 것을 도울 것이다. 뼈로의 전이 가능성을 갖는 임의의 암은 전이 발생 전 또는 후에 투여되는 항-Dkk-1 항체에 의해 예방되거나 치료될 수 있다.
다발성 골수종은 항-Dkk-1 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로 예방되고/되거나 치료될 수 있는 암의 일례이다. 병든 환자는 전형적으로는 상기 뼈의 국소화된 영역 중의 증가된 파골세포 활성화로 인해 골 질량의 손실을 나타낸다. 골수종 세포는, 골수 공간 중에 매몰되어 있는 골수종 세포를 둘러싸고 있는 뼈를 용해시키는 파골세포를 활성화하는 단백질인 RANK 리간드를 직접적으로 또는 간접적으로 생산한다. 차례로 상기 골수종 세포에 인접한 정상적인 파골세포는 IL-6을 생산하고, 이는 골수종 세포의 성장과 증식을 유도한다. 또한 다발성 골수종 세포는 Dkk-1을 생산하고 이에 의해 조골세포 활성을 억제하고 상기 질병에서 골 재흡수 활성을 더욱 촉진한다. 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편에 의한 동물의 치료는 조골세포 활성을 부추겨, 상기 종양 부위의 골 질량을 증가시킬 것이다. 상기와 같은 치료는 골 통증을 감소시킬 수 있으며, 상기 종양 세포에 의해 사용되는 골 영양소를 방출하는 재흡수 활성을 방지함으로써 뼈로의 추가적인 전이를 차단할 수 있다. 상기 질병의 치료에서, 상기 항-Dkk-1 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편을, RANK 리간드에 대해 지정된 길항 항체 또는 IL-6에 대한 항체와 동반 투여할 수 있다.
다른 질환들의 치료
골 질환들과 관련된 상기 용도 이외에, 상기 제공되는 항체 및 그의 면역학적으로 작용성인 단편들 중 몇몇을 다른 질병들의 치료에 사용할 수 있다. 이들 다양한 질병들에서 Dkk-1의 역할은 부분적으로, 다양한 상이한 조직에서의 그의 발현에 의해 지지된다. 상기 항체 및 단편을, 예를 들어 줄기세포 재생을 촉진하는 것이 바람직한 질병들의 치료에 사용할 수 있다. 상기와 같은 질병은 비 제한적으로 당뇨병, 만성 심부전 및 다양한 근육 질병[예를 들어 부동화 또는 장기 요양으로부터 발생하는 무위 위축; 노쇠(노인의 근육 감소증); 근 이영양증; 암, AIDS 또는 염증과 관련된 악액질; 신부전/요독증에서 단백질 에너지 영양실조, 및 비만증에서 근육 소모]을 포함한다. 다양한 염증성 질병들, 예를 들어 크론병, 대장염, 및 염증성 장 질병을 또한 치료할 수 있다. 상기 항체 및 단편을 또한 다양한 신경학적 질병들(예를 들어 알쯔하이머병, 파킨슨병, 및 헌팅톤병)의 치료에 사용할 수 있다. 눈 질환(예를 들어 황반 변성 및 다양한 망막병증)을 또한 상기 항체 및 단편들 중 몇몇으로 치료할 수 있다. 상이한 신장 질병들(예를 들어 말기 신장 질병, 만성 신장 질병, 사구체신염, 간질성 신염 및 IgA 신장병증)을 또한 일부 항체로 치료할 수 있다. 또한, 다양한 폐 질병(예를 들어 만성 폐색성 폐 질병, 특발성 폐 섬유증 및 낭성 섬유증) 및 다양한 피부 질환들, 예를 들어 피부 및 상피 질병이 또한 치료될 수 있다. 치료될 수 있는 피부 질환의 예는 손상된 장 상피(예를 들어 화학요법 유발된 손상), 및 장 상피의 성장 및 생존을 자극하는 것이 바람직한 다른 질병들이 있다.
키트
본 발명에 개시된 항체 또는 면역학적으로 작용성인 단편 또는 약학 조성물을 포함하는 키트를 또한 제공한다. 일부 키트는 상기와 같은 항체, 단편 또는 조성물을 용기(예를 들어 바이알 또는 앰풀) 중에 포함하며, 상기 개시된 다양한 검출, 선별 및 치료 용도에서의 상기 항체 또는 단편의 사용에 대한 설명서를 또한 포함할 수 있다. 상기 항체, 단편 또는 조성물은 다양한 형태로, 예를 들어 용액의 일부로서 또는 고체(예를 들어 동결건조된 분말)로서 존재할 수 있다. 상기 설명서는 상기 항체 또는 단편을 적합한 유체 중에서 어떻게 제조하는가(예를 들어 용해 또는 재현탁), 및/또는 상술한 질병들(예를 들어 낮은 골 질량, 전신 골 손실, 억제된 골 형성 및 골 미란과 같은 골 질환; 줄기 세포 재생; 염증성 질병; 신경학적 질병; 눈 질병; 신장 질병 및 피부 질환)의 치료를 위해 상기 항체 또는 단편을 어떻게 투여하는가에 대한 설명을 포함할 수 있다.
상기 키트는 다양한 다른 성분들, 예를 들어 완충제, 염, 착화 금속 이온, 및 약학 조성물 부분에서 상술한 다른 작용제들을 또한 포함할 수 있다. 이들 성분을 상기 항체 또는 단편과 함께 포함하거나 또는 별도의 용기에 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 상기 항체 또는 단편과 함께 투여하기 위한 다른 치료제들을 포함할 수도 있다. 상기와 같은 작용제의 예로는 비 제한적으로 암을 치료하기 위한 작용제, 골 촉진제, 및 종양 세포와 결합하는 항체, 및 상기 나열된 다른 작용제들이 있다.
항- Dkk -1 항체에 대한 추가의 구체적인 설명
Fc γ 부분에 대한 변이
재조합 인간화된 항체에서, Fcγ 부분을 Fcγ 수용체 및 보체 면역계와의 상호작용을 피하도록 변이시킬 수 있다. 이러한 유형의 변이는 캠브리지 대학 병리과의 마이크 클락(Mike Clar) 박사에 의해 구상되었으며, 상기와 같은 항체의 제조 기법은 예를 들어 1999년 11월 18일자로 공개된 WO 99/58572에 개시되어 있다. 예를 들어, 상기 항체를 인간의 치료에 사용하는 경우, 불변 영역을 인간 불변 영역과 보다 닮도록 조작하여 면역 반응을 피하게 할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제 5,997,867 및 5,866,692 호를 참조하시오.
huMabJC18에 대한 변이
huMabJC18은 완전 인간화된 항-Dkk-1 단클론 항체이다. 본원은 성질에 현저하게 영향을 미치지 않는 작용상 동등한 항체 및 향상된 또는 감소된 활성 및/또는 친화성을 갖는 변이체를 포함한, huMabJC18에 대한 변이를 포함한다. 예를 들어, 당해 분야의 숙련가들은 huMabJC18의 아미노산 서열을 돌연변이시켜 Dkk-1에 대해 목적하는 결합 친화성을 갖는 항체를 수득할 수 있음을 알 것이다. 폴리펩타이드의 변이는 당해 분야에서 통상적인 실시이며 본 발명에서 상세히 개시할 필요가 없다. 폴리펩타이드의 변이를 실시예에 예시한다. 변이된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존 치환, 작용 활성을 현저히 유해하게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 첨가를 갖는 폴리펩타이드, 또는 화학 동족체의 사용을 포함한다.
아미노산 서열 삽입은, 하나의 잔기에서부터 100 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열 내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.
치환 변이체는, 항체 분자 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 제거되고 그 자리에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이에 가장 중요한 부위들은 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크(FR) 변경도 또한 고려된다. 보존 치환을 표 1에서 "보존 치환"의 표제 하에 나타낸다. 상기와 같은 치환이 생물 활성의 변화를 생성시키는 경우, 보다 실질적인 변화(표 1에서 "예시적인 치환"이라 명명되거나 또는 아미노산 부류를 참고로 하기에 추가로 개시되는 바와 같이)가 도입되며 생성물들이 선별될 수 있다.
Figure pct00001
상기 항체의 생물학적 성질들의 실질적인 변화는, (a) 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서 치환 구역 중의 폴리펩타이드 주쇄의 구조, (b) 표적 부위에서 상기 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측 쇄의 부피를 유지하는 것에 대한 상기 항체의 영향이 현저하게 상이한 치환들을 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기들을 공통 측쇄 성질들을 근거로 하기의 그룹들로 분류한다:
(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 전하 없이 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성(음으로 하전됨): Asp, Glu;
(4) 염기성(양으로 하전됨): Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기들: Gly, Pro; 및
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.
비 보존 치환은 이들 부류들 중 하나의 구성원을 또 다른 부류와 교환함으로써 수행된다.
상기 항체의 적합한 형태를 유지하는데 관련되지 않은 임의의 시스테인 잔기를 또한, 일반적으로는 세린으로 치환시켜 상기 분자의 산화 안정성을 개선시키고 이상 가교결합을 방지할 수 있다. 환언하면, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우, 시스테인 결합(들)을 상기 항체에 첨가하여 그의 안정성을 개선시킬 수 있다.
아미노산 변이는 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 변이에서부터 가변 영역과 같은 영역의 완전한 재구상에 이르는 범위일 수 있다. 상기 가변 영역의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 1 내지 5 개 이하의 보존적인 아미노산 치환을 CDR 영역 내에서 수행한다. 다른 실시태양에서, 1 내지 3 개 이하의 보존적인 아미노산 치환을 CDR 영역 내에서 수행한다. 더욱 다른 실시태양에서, 상기 CDR 도메인은 CDR H3 및/또는 CDR L3이다.
huMabJC18의 글리코실화
변이는 또한 글리코실화 및 비 글리코실화된 폴리펩타이드뿐만 아니라, 다른 번역 후 변이, 예를 들어 상이한 당들에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화된 폴리펩타이드를 포함한다. 항체는 그의 불변 영역 중의 보존된 위치에서 글리코실화된다(예를 들어 문헌[Jefferis and Lund(1997) Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison (1997) TibTECH 15:26-32]을 참조하시오). 상기 면역글로불린의 올리고사카라이드 측 쇄는 단백질의 작용(Boyd et al. (1996) Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard (1990) Biochem. 29:4175-4180) 및 당단백질의 부분들 간의 분자 내 상호작용에 영향을 미치며, 이는 상기 당단백질의 형태 및 존재하는 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있다(상기 Hefferis and Lund; Wyss and Wagner (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416). 올리고사카라이드는 또한 주어진 당단백질을, 특정한 인식 구조를 근거로 몇몇 분자에 표적화하는 작용을 할 수 있다. 항체의 글리코실화가 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)에 영향을 미치는 것이 또한 보고되었다. 특히, 이분하는 GlcNAc의 형성을 촉매화하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다(예를 들어 문헌[Umana et al. (1999) Nature Biotech. 17:176-180)]을 참조하시오).
항체의 글리코실화는 전형적으로는 N-결합되거나 O-결합된다. N-결합은 탄수화물 부분의 아스파라진 잔기의 측쇄에의 결합을 지칭한다. 트라이펩타이드 서열 아스파라진-X-세린, 아스파라진-X-쓰레오닌, 및 아스파라진-X-시스테인(여기에서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 상기 탄수화물 부분의 상기 아스파라진 측쇄에의 효소 결합에 대한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드 중의 이들 트라이펩타이드 서열들 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-결합된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 쓰레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스 및 자일로스 중 하나의 결합을 지칭하지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신을 또한 사용할 수도 있다.
상기 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가는 편의상 상술한 트라이펩타이드 서열들 중 하나 이상을 함유하도록 상기 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행된다(N-결합된 글리코실화 부위의 경우). 상기 변경을 또한 원래 항체의 서열에 하나 이상의 세린 또는 쓰레오닌 잔기의 첨가 또는 치환에 의해 수행할 수도 있다(O-결합된 글리코실화 부위의 경우).
항체의 글리코실화 패턴을 또한, 근원적인 뉴클레오타이드 서열을 변경시키지 않고 변경시킬 수 있다. 글리코실화는 주로 상기 항체의 발현에 사용되는 숙주 세포에 따라 변한다. 잠재적인 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용되는 세포 유형은 천연 세포가 드물기 때문에, 상기 항체의 글리코실화 패턴의 변화가 예상될 수 있다(예를 들어 문헌[Hse et al.(1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070]을 참조하시오).
숙주 세포의 선택 이외에, 항체의 재조합 생산 도중 글리코실화에 영향을 미치는 인자들로는 성장 방식, 배지 제형, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 설계 등이 있다. 올리고사카라이드 생산에 관여하는 몇몇 효소들의 도입 또는 과발현을 포함하여, 특정한 숙주 유기체에서 성취된 글리코실화 패턴을 변경시키는 다양한 방법들이 제안되었다(예를 들어 미국 특허 제 5,047,335; 5,510,261; 및 5,278,299 호를 참조하시오). 글리코실화, 또는 글리코실화의 몇몇 유형들은 예를 들어 엔도글리코시다제 H(엔도 H)를 사용하여 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포를 몇몇 유형의 폴리사카라이드의 가공에서 결함이 있도록 유전자 조작할 수 있다. 이들 및 유사한 기법들이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
커플링 기법
상기 나타낸 바와 같이, 다른 변이 방법들은 당해 분야에 공지된 커플링 기법, 예를 들어 비 제한적으로 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함한다. 변이를 예를 들어 면역분석용 표지의 결합에 사용할 수 있다. 변이된 huMabJC18 폴리펩타이드를 당해 분야에 확립된 과정을 사용하여 제조할 수 있으며 당해 분야에 공지된 표준 분석을 사용하여 선별할 수 있고, 상기 분석들 중 일부는 하기 및 실시예에 개시된다. 당해 분야의 숙련가들은 상기와 같은 변이의 임의의 적합한 제조 및 선별 방법을 알 것이다.
변이된 불변 영역
본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 항체는 변이된 불변 영역, 예를 들어 면역학적으로 불활성이거나 부분 불활성인, 예를 들어 보체 매개된 용해를 촉발하지 않거나, 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 미세아교세포를 활성화하지 않는 불변 영역을 포함하거나; 또는 하기 중 임의의 하나 이상에서 감소된 활성(변이되지 않은 항체에 비해)을 갖는다: 보체 매개된 용해의 촉발, 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC)의 자극, 또는 미세아교세포의 활성화. 상기 불변 영역의 상이한 변이들을 사용하여 효과기 작용의 최적의 수준 및/또는 조합을 성취할 수 있다. 예를 들어 하기의 문헌들을 참조하시오: Morgan et al., Immunology 86:319-324(1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969(1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184(2000); Tao et al., J. Immunology 143:2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76(1998). 하나의 실시태양에서, 상기 불변 영역을 문헌[Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624]; PCT 출원 제 PCT/GB99/01441 호; 및/또는 영국 특허 출원 제 9809951.8 호에 개시된 바와 같이 변이시킨다.
하나의 실시태양에서, 상기 항체는 하기의 돌연변이들을 포함하는 인간 중쇄 IgG2a 불변 영역을 포함한다: A330P331에서 S330S331로(야생형 IgG2a 서열을 기준으로 한 아미노산 넘버링)(Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). 또 다른 실시태양에서, 상기 불변 영역은 아글리코실화(aglycosylated)된다. 또 다른 실시태양에서, 상기 불변 영역은 상기 불변 영역 중의 글리코실화된 아미노산 잔기를 돌연변이시킴으로써 아글리코실화된다. 예를 들어 N-글리코실화 부위 N297을 A, Q, K 또는 H로 돌연변이시킬 수도 있다. 예를 들어 문헌[Tao et al., J. Immunology 143:2595-2601 (1989)] 및 [Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76(1998)]을 참조하시오. 하나의 실시태양에서, 상기 불변 영역은 효소에 의해(예를 들어 효소 PNG아제에 의한 탄수화물의 제거) 아글리코실화된다.
효과기 도메인
다른 항체 변이는 예를 들어 1999년 11월 18일자로 공개된 WO 99/58572에 개시된 바와 같이 변이된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지정된 결합 도메인 이외에, 인간 면역글로불린 중쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부와 실질적으로 상동성인 아미노산 서열을 갖는 효과기 도메인을 포함한다. 이들 항체는 현저한 보체 의존성 용해, 또는 표적의 세포 매개된 파괴를 촉발하지 않으면서 상기 표적 분자와 결합할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 효과기 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb와 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로는 2 개 이상의 인간 면역글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유도된 키메릭 도메인을 기본으로 한다. 이러한 방식으로 변이된 항체는 통상적인 항체 요법에 대한 염증 및 다른 불리한 반응들을 피하기 위해서, 만성적인 항체 요법에 사용하기에 특히 적합하다.
친화성 성숙된
하나의 실시태양에서 상기 항체는 친화성 성숙된 항체이다. 예를 들어 친화성 성숙된 항체는 당해 분야에 공지된 과정에 의해 생산될 수 있다(Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al. (1994) Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al. (1995) Gene, 169:147-155; Yelton et al. (1995) J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al. (1995) J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol., 226:889-896).
라이브러리 스캐닝 돌연변이
하기의 방법들을 항체의 친화성 조절 및 CDR 특성화에 사용할 수 있다. 항체의 CDR을 특성화하고/하거나 폴리펩타이드, 예를 들어 항체의 결합 친화성을 변경(예를 들어 개선)시키는 한 가지 방식을 "라이브러리 스캐닝 돌연변이"라 칭한다. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이는 하기와 같이 실행된다. CDR 중의 하나 이상의 아미노산 위치들을 당해 분야에 인식된 방법들을 사용하여 2 개 이상(예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개) 아미노산으로 치환한다. 이는 클론들의 작은 라이브러리(일부 실시태양에서 분석되는 모든 아미노산 위치들에 대한 것)를 생성시키며, 각각 2 개 이상의 구성원들의 복잡성을 갖는다(2 개 이상의 아미노산들이 모든 위치에서 치환되는 경우). 일반적으로, 상기 라이브러리는 고유(비 치환된) 아미노산을 포함하는 클론을 또한 포함한다. 각각의 라이브러리로부터 작은 수의 클론들, 예를 들어 약 20 내지 80 개의 클론들(상기 라이브러리의 복잡성에 따라)을 표적 폴리펩타이드(또는 다른 결합 표적), 및 후보들에 대한 결합 친화성에 대해 선별하고, 결합이 증가하거나, 동일하거나 감소하거나 또는 결합이 없는 후보들을 동정한다.
결합 친화성 측정
결합 친화성의 측정 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 결합 친화성을 비아코어(BIAcore) 또는 프로테온(ProteOn) 표면 플라스몬 공명 분석(약 2 배 이상의 결합 친화성 차이를 검출한다)을 사용하여 측정할 수 있다. 이러한 유형의 분석은 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화성, 예를 들어 약 10 nM 이하의 KD로 결합하는 경우 특히 유용하다. 비아코어 또는 프로테온 표면 플라스몬 공명을 사용하는 선별은 본 발명에서 실시예에 개시되어 있다.
결합 친화성을 키넥사(Kinexa) 바이오센서, 섬광 근접 분석, ELISA, ORIGEN 면역분석(IGN), 형광 급냉, 형광 전달, 및/또는 효모 디스플레이를 사용하여 측정할 수 있다. 결합 친화성을 또한 적합한 생물분석을 사용하여 선별할 수 있다.
일부 실시태양에서, CDR 중의 모든 아미노산 위치를 당해 분야 인식된 돌연변이 방법(이들 중 일부는 본 발명에 개시되어 있다)을 사용하여 20 개 천연 아미노산 전부로 치환시킨다(일부 실시태양에서, 한 번에 하나). 이는 클론들의 작은 라이브러리를 생성시키며(일부 실시태양에서, 분석되는 모든 아미노산 위치에 대해 하나), 이들은 각각 20 개 구성원의 복잡성을 갖는다(20 개 아미노산이 전부 모든 위치에서 치환되는 경우).
일부 실시태양에서, 상기 선별되는 라이브러리는 2 개 이상의 위치에서 치환을 포함하며, 상기 위치는 동일한 CDR 중에 또는 2 개 이상의 CDR 중에 있을 수 있다. 따라서, 상기 라이브러리는 하나의 CDR 중 2 개 이상의 위치의 치환을 포함할 수 있다. 상기 라이브러리는 2 개 이상의 CDR 중 2 개 이상의 위치의 치환을 포함할 수도 있다. 상기 라이브러리는 3, 4, 5 또는 그 이상의 위치의 치환을 포함할 수 있으며, 상기 위치들은 2, 3, 4, 5, 또는 6 개 CDR 중에서 발견된다. 상기 치환을 낮은 잉여 코돈을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어 문헌[Balint et al. Table 2, (1993) Gene 137(1):109-18]을 참조하시오.
상기 CDR은 CDRH3 및/또는 CDRL3일 수 있다. 상기 CDR은 CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 및/또는 CDRH3 중 하나 이상일 수 있다. 상기 CDR은 카밧(Kabat) CDR, 코티아(Chothia) CDR, 또는 연장된 CDR일 수 있다.
개선된 결합을 갖는 후보들을 서열화하고, 이에 의해 친화성이 개선된 CDR 치환 돌연변이체(또한 "개선된" 치환이라 칭한다)를 동정할 수 있다. 결합하는 후보들을 또한 서열화하고, 이에 의해 결합을 유지하는 CDR 치환을 동정할 수 있다.
수회 라운드의 선별을 수행할 수 있다. 예를 들어 개선된 결합을 갖는 후보들(각각 하나 이상의 CDR 중의 하나 이상의 위치에서 아미노산 치환을 포함한다)이 또한 각각의 개선된 CDR 위치(즉 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타낸 CDR 중의 아미노산 위치)에서 적어도 원래 및 치환된 아미노산을 함유하는 제 2 라이브러리의 디자인에 유용하다. 상기 라이브러리의 제조, 및 선별 또는 선택을 하기에 추가로 논의한다.
라이브러리 스캐닝 돌연변이는 또한, 개선된 결합, 동일한 결합, 감소된 결합 또는 무 결합을 갖는 클론들의 빈도가 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각 아미노산 위치의 중요성과 관련된 정보를 또한 제공하는 한에서는, CDR을 특성화하는 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 20 개 아미노산 전부로 변화되었을 때 결합을 유지하는 경우, 상기 위치는 항원 결합에 필요할 것 같지 않은 위치로서 식별된다. 환언하면, CDR의 한 위치가 단지 작은 퍼센트의 치환 시에 결합하는 경우, 상기 위치는 CDR 작용이 중요한 위치로서 식별된다. 따라서, 상기 라이브러리 스캐닝 돌연변이 방법은 다수의 상이한 아미노산(20 개 아미노산 전부 포함)으로 변화될 수 있는 CDR 중의 위치들, 및 변화될 수 없거나 또는 단지 몇 개의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 중의 위치들에 관한 정보를 생성시킨다.
개선된 친화성을 갖는 후보들을, 목적하는 라이브러리의 복잡성, 또는 허용되는 목적하는 선별 또는 선택 방법의 사용에 따라, 개선된 아미노산, 상기 위치의 원래의 아미노산을 포함하고, 상기 위치에 추가적인 치환을 또한 포함할 수도 있는 제 2 라이브러리에 결합시킬 수 있다. 또한, 경우에 따라, 인접한 아미노산 위치를 2 개 이상의 아미노산에 대해 랜덤화할 수 있다. 인접 아미노산의 랜덤화는 돌연변이체 CDR 중의 추가적인 형태적 융통성을 허용하며, 이는 차례로 보다 많은 수의 개선 돌연변이의 도입을 허용하거나 촉진할 수도 있다. 상기 라이브러리는 또한 첫 번째 라운드의 선별 시 개선된 친화성을 나타내지 않은 위치에 치환을 포함할 수 있다.
상기 제 2 라이브러리는 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 비아코어 표면 플라스몬 공명 분석을 사용하는 선별, 및 선택에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 파지 디스플레이, 효모 디스플레이트, 및 리보솜 디스플레이를 사용하는 선택을 사용하여 개선된 및/또는 변경된 결합 친화성을 갖는 라이브러리 구성원들에 대해 선별되거나 선택된다.
융합 단백질
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 항체(예를 들어 huMabJC18) 또는 폴리펩타이드로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. huMabJC18 융합 폴리펩타이드를 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성에 의해 또는 재조합에 의해 생성시킬 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 hMabJC18 융합 단백질을, 본 발명에 개시된 재조합 방법을 사용하여 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제조 및 발현시킴으로써 제조하지만, 상기 단백질을 또한 당해 분야에 공지된 다른 수단, 예를 들어 화학 합성에 의해 제조할 수도 있다.
접합
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 또한 고체 지지체(예를 들어 비오틴 또는 아비딘)에 대한 결합을 촉진하는 작용제에 접합된(예를 들어 결합된) huMabJC18 항체 또는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 간단히 하기 위해서, huMabJC18 또는 항체를 언급할 것이며, 상기 방법을 본 발명에 개시된 Dkk-1 결합 실시태양들 중 임의의 실시태양에 적용함을 알 것이다. 접합은 일반적으로 본 발명에 개시된 바와 같이 이들 성분을 결합시킴을 지칭한다. 결합(일반적으로 상기 성분들을 적어도 투여를 위해 근접하게 회합하여 고정하는 것이다)을 임의의 수의 방식으로 성취할 수 있다. 예를 들어, 작용제와 항체가 각각 다른 하나와 결합할 수 있는 치환체를 갖는 경우 이들 간의 직접 반응이 가능하다. 예를 들어, 상기 중 하나 위의 친핵성 그룹, 예를 들어 아미노 또는 설프하이드릴 그룹은 다른 하나 위의 카보닐 함유 그룹, 예를 들어 무수물 또는 산 할라이드와, 또는 양호한 이탈 그룹(예를 들어 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
표지 물질
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 폴리펩타이드를 임의의 적합한 표지 물질(달리 "표지"라 칭한다), 예를 들어 형광 분자, 방사성 분자 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 표지에 결합시킬 수 있다. 일반적으로 신호를 제공하는(직접 또는 간접적으로) 표지가 당해 분야에 공지되어 있다.
조성물
상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 예를 들어 huMabJC18, 또는 본 명세서가 분명히 하는 바와 같이, 본 발명에 개시된 항체 및/또는 폴리펩타이드들 중 임의의 것 또는 전부를 포함하는 조성물(약학 조성물 포함) 및 키트를 또한 제공한다.
폴리뉴클레오타이드 , 벡터(예를 들어 발현) 및 숙주 세포
상기 제공된 몇몇 특정한 실시태양들과 함께 상기에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 또한 본 발명의 항체 및 폴리펩타이드(도 1에 도시된 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 항체 포함)를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 항체들(항체 단편들 포함) 중 임의의 항체 및 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 당해 분야의 숙련가들이 인식하게 되는 바와 같이, 상기 제공되는 폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드들 중 임의의 것을 포함하는 조성물(상기 및 하기에 보다 상세히 개시하는 약학 조성물 포함)을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 조성물은 본 발명에 개시된 바와 같은 huMabJC18을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 조성물은 본 발명에 개시된 항체 또는 폴리펩타이드들 중 임의의 것을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 조성물은 서열식별번호: 19 및 서열식별번호: 28에 나타낸 폴리뉴클레오타이들 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 조성물의 발현 벡터 및 투여를 본 발명에서 추가로 개시한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드들 중 임의의 것을 제조하는 방법들을 제공한다.
임의의 상기와 같은 서열들에 상보성인 폴리뉴클레오타이드가 또한 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있으며, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 HnRNA 분자(인트론을 함유하며 1 대 1 방식으로 DNA 분자에 상응한다), 및 mRNA 분자(인트론을 함유하지 않는다)를 포함한다. 추가의 암호화 또는 비 암호화 서열들이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수도 있지만, 필요하지는 않으며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 결합할 수도 있지만, 필요하지는 않다.
폴리뉴클레오타이드는 고유 서열(즉 항체 또는 그의 일부를 암호화하는 내생 서열)을 포함하거나 또는 상기와 같은 서열의 변이체를 포함할 수도 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는, 상기 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성이 고유의 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 하나 이상의 치환, 첨가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 상기 암호화된 폴리펩타이드의 면역반응성에 대한 효과를 본 발명에 개시된 바와 같이 일반적으로 평가할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 고유 항체 또는 그의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 대해 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 일치성을 나타낸다.
2 개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열들 중의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열들이, 이들을 하기에 개시하는 바와 같이 최대의 대응으로 정렬시킬 때 동일한 경우, "일치한다"라고 한다. 두 서열 간의 비교를 전형적으로는 상기 서열들을 서열 유사성의 국소 영역들을 확인하고 비교하기 위한 비교 창에 대해 비교함으로써 수행한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "비교 창"은, 2 개의 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 하나의 서열을 동일한 수의 연속되는 위치들의 비교 서열에 대해 비교할 수 있는, 약 20 개 이상, 대개는 30 내지 약 75, 또는 40 내지 약 50 개의 연속되는 위치의 분절을 지칭한다.
비교를 위한 서열들의 최적의 정렬은 디폴트 매개변수들을 사용하여, 더 레이저진 스위트 오브 바이오인포매틱스 소프트웨어(the Lasergene suite of bioinformatics software(DNASTAR, Inc., Madison, WI, USA))의 메그얼라인(Megalign) 프로그램을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 프로그램은 하기의 참고문헌들에 개시된 여러 정렬 설계들을 실현한다: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R.(1973) Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Fancisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J.(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730.
바람직하게는 "서열 일치 백분율"은 2 개의 최적으로 정렬된 서열들을 20 개 이상의 위치들의 비교 창에 대해 비교함으로써 측정되며, 여기에서 상기 비교 창 중의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분은 상기 두 서열의 최적의 정렬을 위한 기준 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않는다)에 비해, 20% 이하, 대개는 5 내지 15%, 또는 10 내지 12 퍼센트의 첨가 또는 결실(즉 끊김)을 포함할 수도 있다. 상기 백분율은, 일치하는 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 상기 두 서열 모두에 존재하는 위치들의 수를 측정하여 합치하는 위치의 수를 제공하고, 상기 합치된 위치의 수를 기준 서열 중의 전체 위치들의 수(즉 창 크기)로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 일치성의 백분율을 제공함으로써 계산된다.
변이체는 또한, 또는 한편으로, 고유 유전자 또는 그의 일부 또는 보체와 실질적으로 상동성일 수 있다. 상기와 같은 폴리뉴클레오타이드 변이체는 보통 엄격성 조건 하에서 고유 항체를 암호화하는 천연 DNA 서열(또는 상보성 서열)에 하이브리드화할 수 있다.
적합한 "보통 엄격성 조건"은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서의 예비 세척; 50 내지 65 ℃, 5X SSC에서의 밤새 하이브리드화; 이어서 65 ℃에서 20 분간 2 회 세척을 포함하며, 이때 2X, 0.5X 및 0.2X SSC는 각각 0.1%의 SDS를 함유한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, "매우 엄격한 조건" 또는 "고 엄격성 조건"은 (1) 세척에 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50 ℃에서 0.015 M 염화 나트륨/0.0015 M 나트륨 시트레이트/0.1% 나트륨 도데실 설페이트를 사용하거나; (2) 하이브리드화 동안 변성제, 예를 들어 42 ℃에서 750 mM 염화 나트륨, 75 mM 나트륨 시트레이트와 함께 pH 6.5에서 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50 mM 나트륨 포스페이트 완충제와 폼아미드, 예를 들어 50%(v/v) 폼아미드를 사용하거나; 또는 (3) 42 ℃에서 0.2X SSC(염화 나트륨/나트륨 시트레이트) 및 55 ℃에서 50% 폼아미드 중에서의 세척, 이어서 55 ℃에서 EDTA를 함유하는 0.1X SSC로 이루어지는 고-엄격성 세척과 함께, 42 ℃에서 50% 폼아미드, 5X SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 나트륨 시트레이트), 50 mM 나트륨 포스페이트(pH 6.8), 0.1% 나트륨 피로포스페이트, 5X 덴하르트 용액, 초음파 처리된 연어 정액 DNA(50 ㎍/㎖), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하는 것들이다. 숙련가는 목적하는 인자들, 예를 들어 탐침 길이 등을 도모하기 위해서 필요에 따라 상기 온도, 이온 강도 등을 조절하는 방법을 알 것이다.
당해 분야의 숙련가들은 상기 유전자 암호의 퇴보의 결과로서, 본 발명에 개시된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 다수의 뉴클레오타이드 서열들이 존재함을 알 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드들 중 일부는 임의의 고유 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 대해 최소의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 암호 사용의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오타이드들이 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 더욱이, 본 발명에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열들을 포함하는 유전자의 대립유전자가 본 발명의 범위 내에 있다. 대립유전자는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들어 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내생적인 유전자이다. 상기 생성되는 mRNA 및 단백질은 변경된 구조 또는 작용을 가질 수도 있으나, 필요하지는 않다. 대립유전자를 표준 기법(예를 들어 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 동정할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 화학 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 사용하여 수득할 수 있다. 화학적인 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 여기에서 상세히 개시할 필요는 없다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명에 제공된 서열 및 상업적인 DNA 합성기를 사용하여 목적하는 DNA 서열을 생성시킬 수 있다.
재조합 방법을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 제조하기 위해서, 목적하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 적합한 벡터에 삽입하고, 차례로 상기 벡터를 본 발명에서 추가로 논의되는 바와 같이, 복제 및 증폭에 적합한 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있다. 폴리뉴클레오타이드를 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포에 삽입할 수 있다. 세포를, 직접 흡수, 세포 이물 흡수, 형질감염, F-교배 또는 일렉트로포레이션에 의해 외부 폴리뉴클레오타이드를 도입시킴으로써 형질전환시킨다. 상기 외부 폴리뉴클레오타이드는 일단 도입되면, 상기 세포 내에 통합되지 않은 벡터(예를 들어 플라스미드)로서 또는 숙주 세포 게놈에 통합된 채로 유지될 수 있다. 상기와 같이 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 상기 숙주 세포로부터 단리할 수 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (1989)]을 참조하시오.
한편으로, PCR은 DNA 서열의 재생을 허용한다. PCR 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 미국 특허 제 4,683,195; 4,800,159; 4,754,065; 및 4,683,202 호뿐만 아니라 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston(1994)]에 개시되어 있다.
RNA를, 적합한 벡터에 상기 단리된 DNA를 사용하고 이를 적합한 숙주 세포에 삽입함으로써 수득할 수 있다. 상기 세포가 복제되고 상기 DNA가 RNA로 전사되는 경우, 상기 RNA를 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (1989)]에 나열된 바와 같이, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 단리할 수 있다.
적합한 클로닝 벡터를 표준 기법에 따라 제작하거나, 또는 당해 분야에서 입수할 수 있는 다수의 클로닝 벡터들 중에서 선택할 수 있다. 상기 선택되는 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 다양할 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자기 복제 능력을 가질 것이며, 특정한 제한 엔도뉴클레아제에 대해 단일 표적을 가질 수 있고/있거나 상기 벡터를 함유하는 클론들의 선택에 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 지닐 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, Bluescript(예를 들어 pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예를 들어 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이들 및 다수의 다른 클로닝 벡터들을 상업적인 판매사들, 예를 들어 바이오래드(BioRad), 스트라타진(Stratagene), 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수할 수 있다.
발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 복제 가능한 폴리뉴클레오타이드 구조물이다. 이는 발현 벡터가 숙주 세포에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 필수 부분으로서 복제 가능해야 함을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 비 제한적으로 예를 들어 플라스미드, 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함한다. 벡터 성분은 일반적으로, 비 제한적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수도 있다: 신호 서열; 복제 기원; 하나 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 조절 요소(예를 들어 프로모터, 인핸서 및 종결자). 발현(즉 번역)을 위해서, 하나 이상의 번역 조절 요소들, 예를 들어 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위, 및 정지 코돈이 또한 대개 필요하다.
관심 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 벡터를 다수의 적합한 수단들 중 임의 수단, 예를 들어 일렉트로포레이션, 염화 칼슘, 염화 루비듐, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질들을 사용하는 형질감염; 미세입자투사법; 리포펙션; 및 감염(예를 들어 상기 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염제인 경우)에 의해 숙주 세포에 도입시킬 수 있다. 도입되는 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드의 선택은 종종 상기 숙주의 특징에 따라 변할 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 개시된 폴리뉴클레오타이드들 중 임의의 것을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포를, 관심 항체, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 유전자의 단리를 위해 사용할 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비 제한적인 예로는 비 제한적으로 COS, HeLa 및 CHO 세포가 있다. 또한 예를 들어 WO 87/04462를 참조하시오. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물(예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis)) 및 효모(예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 폼베(Saccharomyces pombe); 또는 클렙시엘라 락티스(Klebsiella lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 상기 숙주 세포 중의 cDNA를 상응하는 관심 내생 항체 또는 단백질(존재하는 경우)의 경우보다 약 5 배 이상, 보다 바람직하게는 10 배 이상, 훨씬 더 바람직하게는 20 배 이상의 수준으로 발현한다.
Figure pct00002
에 대한 특이적인 결합에 대해 숙주 세포를 선별하는 것은 예를 들어 면역분석 또는 FACS에 의해 수행된다. 상기 관심 항체 또는 단백질을 과발현하는 세포를 동정할 수 있다.
본원은 하기의 실시예들에 의해 추가로 예시되며, 이들 실시예는 추가적인 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 본원 전체를 통해 인용된 모든 도면, 표 및 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원들의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 명확히 인용된다.
실시예
실시예 1: muMabJC18 의 생성
제조
A. 면역원
R&D 시스템스로부터 수득한 재조합 인간 Dkk-1(rhuDkk-1)(C 말단에서 10X His 태그와 융합된 인간 Dkk-1의 aas2-266에 상응하는 카탈로그 번호 1096-DK/CF)을 mcKLH(카탈로그 번호 77622)를 갖는 피어스 임젝트(Pierce Imject) 면역원 EDC 키트를 사용하여 KLH에 접합시켰다. 상기 KLH 접합된 단백질은 제노백(Genovac) GmbH에 의해 제조되었으며 서브클론 JC9H3을 생성시키는 융합에 대한 면역원(JC18)으로서 사용되었다.
서열식별번호: 1 인간 Dkk-1(10His) aa 서열
(굵은 이탤릭체 형태의 아미노산은 정제된 단백질의 실제 N-말단을 나타낸다)
Figure pct00003
서열식별번호: 2 인간 Dkk-1(10His) nt 서열
(뉴클레오타이드 서열, 이때 굵은 이탤릭체 형태의 뉴클레오타이드는 R&D가 서열 정보를 제공하지 않기 때문에 단지 상기 서열에 대한 추정이다)
Figure pct00004
B. 면역화 및 하이브리도마 생성
Balb/c 마우스를 KLH-접합된 rhuDkk-1 단백질의 50 ug/용량/마우스로 복강 내 면역시켰다. 상기 용량을 4 주의 기간에 걸쳐 3 회 반복하였다. 융합 2일 및 1일 전에 상기 마우스에게 50 ug의 단백질의 최종 추가접종을 제공하였다. 비장 림프구를 비 분비성 sp2/0 골수종 세포 주와 융합시키고 앞서 개시된 바와 같이 HAT 선택을 수행하였다(Galfre and Milstein, Methods Enzymol 73 3-46(1981)). Dkk1-특이적인 IgG를 분비하는 하이브리도마를 회수하고, 서브클로닝하고, 하기 개시되는 분석을 사용하여 검출하였다.
Dkk -1 특이성( ELISA 분석)
A. 검출
Dkk-1 특이 항체를 하기의 ELISA 기재 방법을 사용하여 검출하였다. rhuDkk-1 단백질(R&D 시스템스 카탈로그 번호 1096 DK/CF)을 코팅 완충제(제조자의 설명에 따라 제조된 시그마(Sigma) 카보네이트/바이카보네이트 코팅 완충제 pH 9.6 카탈로그 번호 C-3041) 중에서 1 ug/㎖로 희석하였다. 넝크 맥시솝(Nunc Maxisorp) 96 웰 플레이트에 웰 당 100 ul의 Dkk-1을 가하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 웰들을 250 u/웰의 세척 완충제(Ca/Mg++ 없이 dPBS(시그마 카탈로그 번호 D8537) 중의 0.05% (v/v) 트윈-20(시그마 카탈로그 번호 P2287))로 4 회 세척하고 이어서 차단 완충제(dPBS(시그마 카탈로그 번호 D8537) 중의 1% PVA(시그마 카탈로그 번호 363170)(중량/부피))로 실온에서 2 시간 동안 차단하였다. 이어서 차단 완충제를 신속한 경사분리에 의해 제거하였다. 항체를 차단 완충제 중에서 연속적인 2배 연속 희석에 의해 희석하고 이를 웰 당 100 ul로 각 플레이트에 적용하였다. 플레이트를 RT에서 1 시간 동안 배양하고 이어서 상술한 바와 같이 세척하였다.
상기 시험 항체의 Dkk에 대한 결합은 상기 항체 종들에 특이적인 2차 항체의 첨가에 의해 측정되었다. 쥐 항체를 시험하는 경우, 100 ul/웰의 HRP 접합된 염소 항-마우스 IgG(H&L)를 차단 완충제(잭슨 임뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch) 카탈로그 번호 115-035-146) 중에서 4000 중의 1의 희석으로 사용하였다. 인간화된 항체를 시험하는 경우, 100 ul/웰의 HRP 접합된 염소 항-인간 IgG F(ab')2를 차단 완충제(잭슨 임뮤노리써치 카탈로그 번호 109-035-097) 중에서 4000 중의 1의 희석으로 사용하였다. 상기 플레이트를 실온에서 30 분간 배양하고 이어서 상술한 바와 같이 2X 세척하였다. 100 ul의 새로 제조한 기질(제조자의 설명에 따라 제조된 KPL ABTS 퍼옥시다제 기질 2-성분 카탈로그 50-62-00)을 웰 당 첨가하고 색상을 전개시켰다. 일단 전개되었으면, 상기 플레이트 흡광도를 405 및 490 ㎚에서 측정하였다. 흡광도 값을 상기 두 파장에서의 흡광도 간의 차이로서 나타내었다. JC18은 5 ug/㎖까지 rhuDkk-1에 대한 결합을 나타내었다.
B. 다른 인간 Dkk 동족체들에 대한 결합의 특이성
다른 인간 Dkk 단백질에 결합하는 JC18의 능력을, 플레이트를 또한 재조합 인간 Dkk3(R&D 시스템스 카탈로그 번호 1118-DK/CF) 및 Dkk4(R&D 시스템스 카탈로그 번호 1269-DK/CF)로 코팅함을 제외하고 상술한 ELISA 프로토콜을 사용하여 평가하였다. JC18은 5 ug/㎖까지 인간 Dkk-4에 대해 약한 결합 및 인간 Dkk-3에 대해 무 결합을 나타내었다.
JC18 (ng/㎖) 인간 DKK-1(OD) 인간 DKK-3(OD) 인간 DKK-4(OD)
5000 2.07215 0.0289 0.5088
1250 2.06405 0.0244 0.3366
31 1.934 0.0226 0.24585
8 1.42005 0.02255 0.14735
2 0.7559 0.02065 0.07895
0.5 0.2986 0.02325 0.0431
0.125 0.11785 0.02265 0.0325
0.03 0.0593 0.02345 0.02715
C. 종 교차 반응성
다른 종 Dkk 단백질에 결합하는 JC18의 능력을, 플레이트를 또한 재조합 래트 Dkk-1(R&D 시스템스 카탈로그 번호 4010-DK/CF), 마우스 Dkk-1(R&D 시스템스 카탈로그 번호 1765-DK/CF), 마우스 Dkk-1(R&D 시스템스 카탈로그 번호 2435-DK/CF) 및 마우스 Dkk-4(R&D 시스템스 카탈로그 번호 3105-DK/CF)로 코팅함을 제외하고 상술한 ELISA 프로토콜을 사용하여 평가하였다. JC18은 (1) 5 ug/㎖까지 마우스 및 래트 Dkk-1에 대해 인간 Dkk-1과 유사한 결합; (2) 5 ug/㎖까지 마우스 Dkk-1에 대해 무 결합; 및 (3) 5 ug/㎖까지 마우스 Dkk-4에 대해 약한 결합을 나타내었다.
클로닝 및 서열화
100 만개의 하이브리도마 세포를 퀴아슈레더(QIAshredder) 회전 컬럼을 사용하여 균질화하고 전체 RNA를 퀴아겐(QIAGEN)으로부터의 RNAeasy 미니 키트에 따라 추출하였다. cDNA를 인비트로젠으로부터의 수퍼스크립트(SuperScript) III RT를 사용하여 합성하였다. Dkk-1 항체로부터의 가변 영역들을 노바겐(Novagen)으로부터의 마우스 IgG-프라이머 세트(마우스 IgG 중쇄 유전자 및 마우스 카파 또는 람다 경쇄를 클로닝하기 위한 퇴보 프라이머들로 이루어진다)를 사용하여 클로닝하였다. PCR 순환 조건은 하기와 같았다: 94 ℃에서 2분간 1 주기; 94 ℃에서 30 초, 44 ℃에서 30 초, 및 68 ℃에서 60 초간 5 주기; 이어서 94 ℃에서 30 초, 54 ℃에서 30 초 및 68 ℃에서 60 초간 25 주기. 생성되는 PCR 산물들을 인비트로젠으로부터의 토포-TA 클로닝 벡터에 클로닝하고 서열화하였다. 상기 클로닝된 항체 서열들을, 상기 클로닝된 항체 서열과 복수로부터 생성된 원래 항체의 질량 분광(MS) 분석을 사용하여 직접 비교에 의해 확인하였다.
상기 JC18 야생형(마우스) 단클론 항체의 가변 영역의 경쇄 및 중쇄의 예측되는 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열을 하기에 제공한다.
서열식별번호: 3 JC18 경쇄 가변 영역 nt 서열
Figure pct00005
서열식별번호: 4 JC18 경쇄 가변 영역 aa 서열
Figure pct00006
서열식별번호: 5 JC18 경쇄 가변 영역 CDR1 nt 서열
Figure pct00007
서열식별번호: 6 JC18 경쇄 가변 영역 CDR1 aa 서열
RASESVDDFGISFMN
서열식별번호: 7 JC18 경쇄 가변 영역 CDR2 nt 서열
GCT GCA TCC AAG CAG GGA TCC
서열식별번호: 8 JC18 경쇄 가변 영역 CDR2 aa 서열
AASKQGS
서열식별번호: 9 JC18 경쇄 가변 영역 CDR3 nt 서열
CAG CAA AGT AAG GAG GTT CCT CCC ACG
서열식별번호: 10 JC18 경쇄 가변 영역 CDR3 aa 서열
QQSKEVPPT
서열식별번호: 11 JC18 중쇄 가변 영역 nt 서열
Figure pct00008
서열식별번호: 12 JC18 중쇄 가변 영역 aa 서열
Figure pct00009
서열식별번호: 13 JC18 중쇄 가변 영역 CDR1 nt 서열
AAT TAT GCC ATG TCT
서열식별번호: 14 JC18 중쇄 가변 영역 CDR1 aa 서열
NYAMS
서열식별번호: 15 JC18 중쇄 가변 영역 CDR2 nt 서열
Figure pct00010
서열식별번호: 16 JC18 중쇄 가변 영역 CDR2 aa 서열
SISGGGDTYYPDSVKG
서열식별번호: 17 JC18 중쇄 가변 영역 CDR3 nt 서열
TCC CTT GAG AAC TAT GCT ATG GAC TAC
서열식별번호: 18 JC18 중쇄 가변 영역 CDR3 aa 서열
SLENYAMDY
실시예 2: muMabJC18 의 돌연변이를 통해 획득된 인간화된 항- Dkk -1 단클론 항체( huMabJC18 )의 생성 및 시험
상기 인간화된 항체 및 그의 변이체 의 결합 친화성 측정
본 실시예에 사용된 일반적인 방법:
A. 클론 특성화에 사용된 발현 벡터
상기 항체의 Fab 단편의 발현은 문헌[Barbas(2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X]에 개시된 바와 유사한 IPTG 유도성 lacZ 프로모터의 조절하에 있으나, 변이는 하기의 추가적인 도메인들의 첨가 및 발현을 포함하였다: IgG2a 인간 면역글로불린. Ig 감마-2 쇄 C 영역, 단백질 수납 번호 P01859; 면역글로불린 카파 경쇄(호모 사피엔스), 단백질 수납 번호 CAA09181의 인간 카파 경쇄 불변 도메인 및 CHI 불변 도메인.
B. 소규모 Fab 제조
96 웰 플레이트에서 Fab의 소규모 발현을 하기와 같이 수행하였다. Fab 라이브러리로 형질전환된 이 콜라이로부터 출발하여, 콜로니들을 피킹하여 마스터(master) 플레이트(아가 LB + 암피실린(50 ㎍/㎖) + 2% 글루코스) 및 실행(working) 플레이트(2 ㎖/웰, 96 웰/플레이트(1.5 ㎖의 LB + 암피실린(50 ㎍/㎖) + 2% 글루코스 함유)) 모두를 접종하였다. 상기 두 플레이트를 모두 30 ℃에서 8 내지 12 시간 동안 증식시켰다. 상기 마스터 플레이트를 4 ℃에서 보관하고 상기 실행 플레이트로부터의 세포를 5000 rpm에서 펠릿화하고 1 ㎖의 LB + 암피실린(50 ㎍/㎖) + 1 mM IPTG로 재현탁하여 Fab의 발현을 유도하였다.
세포를 30 ℃에서 5 시간의 발현 시간 후에 원심분리에 의해 수확하고, 이어서 500 ㎕의 완충제 HBS-EP(100 mM HEPES 완충제 pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% P20)에 재현탁하였다. HBS-EP 재현탁된 세포의 용해를, 1 주기의 동결(-80 ℃), 이어서 37 ℃에서의 해동에 의해 달성하였다. 세포 용해물을 5000 rpm에서 30 분간 원심분리시켜 Fab를 함유하는 상등액으로부터 세포 찌꺼기들을 분리시켰다. 상등액을 96-웰 멀티스크린(Multiscreen) HTS 필터 플레이트(Millipore, cat# MSFBN6B50)를 사용하여 여과하였다. 이어서 상기 상등액을 비아코어 플라스몬 공명 장치에 주입하여 각 Fab의 친화성 정보를 획득하였다. Fab를 발현하는 클론들을 상기 마스터 플레이트로부터 구제하여 DNA를 서열화하였으며, 대규모 Fab 생산 및 상세한 특성화는 하기에 개시하였다.
C. 대규모 Fab 제조
상세한 동역학 매개변수들을 획득하기 위해서, Fab를 발현시키고 큰 배양물로부터 정제하였다. 200 ㎖의 LB + 암피실린(50 ㎍/㎖) + 2% 글루코스를 함유하는 삼각 플라스크를, 선택된 Fab-발현 이 콜라이 클론으로부터의 하룻밤 배양물 5 ㎖로 접종하였다. 클론들을 1.0의 OD550 ㎚가 획득될 때까지 30 ℃에서 배양하고 이어서 상기 배지를 200 ㎖의 LB + 암피실린(50 ㎍/㎖) + 1 mM IPTG로 대체함으로써 유도하였다. 30 ℃에서 5 시간의 발현 시간 후에, 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 이어서 10 ㎖의 PBS(pH 8)에 재현탁하였다. 세포들의 용해를 2 주기의 동결/해동(각각 -80 ℃ 및 37 ℃)에 의해 획득하였다.
상기 세포 용해물의 상등액을 PBS(pH 8)로 평형화시킨 Ni-NTA 슈퍼플로우 세파로스(Qiagen, Valencia. CA, USA) 컬럼 상에 부하하고, 이어서 5 컬럼 부피의 PBS(pH 8)로 세척하였다. 개별적인 Fab들이 PBS(pH 8) + 300 mM 이미다졸에 의해 상이한 분획들로 용출되었다. Fab를 함유하는 분획들을 모으고 PBS 중에서 투석시키고, 이어서 친화성 특성화 전에 ELISA에 의해 정량분석하였다.
D. 완전 항체 제조
완전 항체의 발현을 위해서, 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 포유동물 발현 벡터에 클로닝하고 일시적인 발현을 위해 리포펙타민을 사용하여 HEK 293 세포 내로 형질감염시켰다.
항체들을 표준 방법을 사용하여 단백질 A로 정제하였다.
비아코어 분석:
인간, 마우스 또는 래트 Dkk1에 대한 huMabJ18의 친화성을, CM5 센서 칩(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)이 구비된 비아코어3000TM 표면 플라스몬 공명(SPR) 시스템(BIAcore Inc., Piscataway, NJ, USA)을 사용함으로써 측정하였다. 상기 huMabJC18-인간 Dkk1 상호작용 분석을 위해서, 3 개의 유동 세포(Fc2, Fc3 및 Fc4)에 대한 huMabJC18의 아민 커플링에 의해 반응 표면을 생성시켰다. CM5 칩을 공급자의 설명에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이나이드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시켰다. 상기 huMabJC18 IgG를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.)로 희석하고 상기 활성화된 칩 위에 30 ㎍/㎖의 농도로 주입하였다.
개별적인 칩 채널을 횡단하는 가변 유동 시간을 사용하여, 일련의 항체 밀도를 성취하였다: 200 내지 800 반응 단위(RU). 이어서 상기 IgG 및 기준 표면을 염소 Fab2 항-인간 Fc(Cappel 55053)로 포화시켜 상기 칩 표면에의 Dkk-1에 의한 비특이적인 결합을 방지하였다. 이어서 상기 칩을 에탄올아민으로 차단시켰다. 분석을 25 ℃에서 수행했으며, 이때 비아코어 실행 완충제는 HBS-EP(0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) + 2 ㎎/㎖ BSA + 2 ㎎/㎖ CM 덱스트란으로 구성되었다. 30.9 nM의 정제된 인간 Dkk1(R&D 시스템스) 단백질에서 출발하는 5원의, 일련의 3 배 희석물을 100 ㎕/분으로 1.5 분간 주입하고 해리를 8 시간 동안 모니터하였다. 동역학적인 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를, BIA 평가(BIAevaluation) 프로그램을 사용하여 상기 데이터를 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B.(1994). Methods Enzymology 6. 99-110)에 대입하여 동시에 획득하였다. 평형 해리 상수(KD) 값을 koff/kon로서 계산하였다.
huMabJC18과 마우스 또는 래트 Dkk-1과의 상호작용 분석을 위해서, 낮은 수준의 huMabJC18(전형적으로는 100 내지 400 반응 단위)을 염소 Fab2 항-인간 Fc(CM5 칩 표면에 예비 고정화되었다)에 의해 개별적인 유동 세포 상에 포획하였다. 인간화된 항체를 함유하지 않는 염소 Fab2 항-인간 Fc-포화된 유동 세포는 기준 채널로서 작용하였다. 마우스 또는 래트 Dkk-1(R&D 시스템스)을 각각 최고 농도로서 70.1 nM 또는 30.2 nM의 일련의 3 배 희석물을 사용하여 상기 칩 상에서 적정하였다. 결합 및 해리 단계를 각각 90 초 및 30 분간 100 ㎕/분에서 모니터하였다. 모든 실험들에 대한 포획 표면들을, 인간 Dkk-1 실험에 사용된 아민-커플링된 huMabJC18 표면(재생되지 않았다)을 제외하고, 0.75 mM H3PO4의 2 개의 30 초 펄스로 재생시켰다.
상기 결합 반응들을 이중-참조하고 Bia 평가 v.4.0 소프트웨어를 사용하여 간단한 모델에 전체적으로 대입하였다. 친화성을 상기 동역학적 속도 상수(KD = koff/kon)의 몫으로부터 추론하였다.
인간 Dkk1에 대한 huMabJC18 변이체의 결합 및 해리 속도를 측정하기 위한 선별 분석에 대해서, 비아코어 또는 프로테온 XPR36(BioRad, Inc.) 시스템을 사용하였다. 상기 비아코어 분석을 위해서, 비오틴화된-인간 Dkk1을 공급자의 설명에 따라 SA(스트렙트아비딘) 비아코어칩 상에 포획하였다. 비오틴화된 인간 Dkk-1 단백질을 HBS-EP로 희석하고, 상기 칩 상에 5 ㎍/㎖의 농도로 주입하였다. 상기 개별적인 칩 채널을 횡단하는 유동 시간을 대략 500 내지 600 반응 단위(RU)의 항원 밀도가 성취되도록 선택하였다. HBS-EP 완충제를 실행 완충제로서 사용하였다. 여과된 재조합 이 콜라이 용해물을 고온(37 ℃)에서 1 분간 30 ul/분으로 주입하여, 1 내지 5 분 해리 단계를 허용하였다. 표면을 8 mM NaOH + 8% 에탄올로 재생시켰다. 양성 대조군 Fab(클론 24)를 상기 실험의 출발 시에 2 회 주입하고, 다시 상기 분석의 끝에서 주입하여 재현성을 평가하였다.
상기 프로테온 분석에서, 비오틴화된 인간 Dkk-1을 실험적으로 측정된 일련의 배수의 희석비로 1 분간 주입하여 프로테온 NLC 뉴트라비딘(Neutravidin) 센서 칩의 5 개 채널 상에 상이한 수준의 고정화(150 내지 3000 RU)를 제공하였다. 6 번째 채널은 변경되지 않은 채로 두어 기준 표면으로서 사용하였다. 여과된 이 콜라이 용해물 중의 재조합 Fab를 고온(37 ℃)에서 50 초간 20 ㎕/분으로 주입하였다. 실행(running) 완충제는 PBS + 1 ㎎/㎖ BSA + 0.005% 트윈-20으로 이루어졌다. 상기 프로테온은 각 주입이 기준 채널뿐만 아니라 5 개의 Dkk-1 채널들 각각 위를 흐르고 6 개의 Fab 샘플들을 동시에 주입할 수 있도록 구성된다. 상기 Dkk-1 표면으로부터의 Fab 해리를 20 분간 모니터하였다. 상기 칩 표면을 8% EtOH, 8 mM NaOH의 30초 주입에 의해 재생시켰다. 클론 24 Fab를 대조군으로서 사용하였다. 결합 도중 결합 수준, 및 각 클론에 대한 해리 속도는 상이한 리간드 채널들 간에 매우 일정하였다.
Dkk1 에 대한 huMabJC18 및 그의 변이체 의 결합 친화성
huMabJC18의 아미노산 서열들은 서열식별번호: 40(HC 가변 영역) 및 서열식별번호: 42(LC 가변 영역)에 나타낸 바와 같다. 상술한 바와 같이 비아코어를 사용하여 측정된 Dkk-1에 대한 huMabJC18의 결합 친화성을 하기 표 3에 나타낸다.
인간, 마우스 및 래트로부터의 Dkk1에 대한 huMabJC18 IgG의 결합 친화성
DKK-1 종 kon(1/Ms) Koff(1/s) T1 /2(h) KD(nM)
인간 > 1.3 x 106* < 2.0 x 10-6^ > 96.27 < 0.002
마우스 > 1.3 x 106* < 3.9 x10-5^ > 4.94 < 0.03
래트 > 1.3 x106* 2.1 x 10-4 0.92 < 0.1
*진행 속도는 측정하기에 너무 빠르다
^중단 속도는 측정하기에 너무 느리다
KD = koff/kon
T1 /2(S) = In2/koff(1/s)
상기 huMabJC18 변이체들의 CDR들의 아미노산 서열들을 하기 표 4에 나타낸다. 표 4에 나타낸 모든 아미노산 치환들은 huMabJC18의 서열에 대해 개시된다. huMabJC18 및 그의 변이체의 hDkk-1 결합 친화성을 또한 표 4에 나타낸다.
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
표 4에서, #는 그 위치(들)에서의 끊김을 나타내고; n.d.은 측정되지 않음을 나타낸다.
상기 CDR들은 연장된 CDR들이며, 이들은 카밧 규정인 CDRH1을 제외하고, 카밧과 코티아 규정 모두를 포함한다. 아미노산 잔기를 연속적으로 넘버링한다(H2 및 H3 컬럼 중의 잔기들의 넘버링에 대해 서열식별번호: 28을, L1, L2 및 L3 컬럼 중의 잔기들의 넘버링에 대해 서열식별번호: 20을 참조하시오). 모든 클론들은 huMabJC18과 일치하는 CDR H1 서열 및 프레임워크를 갖는다. KD = koff/kon. 모든 koff 값을 밑줄 그은 것들(상기 비아코어 칩 또는 프로테온 표면상에 포획된 IgG를 가로질러 흐르는 일련의 hDkk-1 농도의 전체적인 분석에 의해 획득되었다)을 제외하고 선별 방식으로 측정하였다. 따라서 밑줄 그은 KD 값들은 kon을 측정함으로써 실험적으로 측정되었다. 다른 KD 값들은 1 x 106(1/Ms)의 추정된 kon 값에 근거한, 이론적인 것이다. 모든 분석된 클론들에 대한 진행 속도는 매우 빠르고 따라서 확산 제한되기 때문에(>1 x 106, 정확하게 측정하기에 너무 빠르다), 친화성은 나타낸 것보다 훨씬 더 높을 듯하다.
huMabJC18 과 Dkk 동족체와의 상호작용
huMabJC18을 인간 Dkk-3, 인간 Dkk-4, 마우스 Dkk-2 및 마우스 Dkk-4(R&D 시스템스)를 포함하여 다른 입수할 수 있는 Dkk 동족체들에 대한 결합에 대해 분석하였다. 결과를 표 5에 요약한다.
huMabJC18과 Dkk 동족체와의 상호작용
DKK 동족체 kon(1/Ms) koff(1/s) T1 /2(h) KD(nM)
hDkk-3 - - - 무 결합
hDkk-4 1.50 x 104 1.72 x 10-4 1.12 11
mDkk-2 1.80 x 104 1.69 x 10-4 1.14 9
mDkk-4 > 1.3 x 106* < 3.9 x 10-5^ > 4.94 < 0.03
*진행 속도 측정하기에 너무 빠르다
^중단 속도는 측정하기에 너무 느리다
huMabJC18과 Dkk-1 동족체와의 상호작용 분석을 예비 고정화된 포획 시약으로서 염소 Fab2 항-인간 Fc를 사용하여 상술한 바와 같이 실행하였다. 인간 Dkk-4, 마우스 Dkk-2, 또는 마우스 Dkk-4를 일련의 5 배 희석으로, 최고 농도로서 각각 76.3 nM, 88.8 nM 또는 32.3 nM을 사용하여, 상기 칩 상에서 적정하였다. 인간 Dkk-3은 특정한 결합 반응을 나타내지 않았다.
JC18 Dkk -1 결합 항체
25 ℃에서 비아코어 분석에 의해 측정된 바와 같은, 인간, 마우스 또는 래트 Dkk1(R&D 시스템스)에 대한 마우스 항체 JC18의 결합 친화성을 하기 표 6에 나타낸다. 상기 분석을 위해서, 다클론 항-마우스 IgG를 비아코어 칩에 아민-결합시켰다. 항-Dkk-1 항체 JC18은 6.53 ㎍/㎖이고, 5 ㎕/분에서 1 분간 포획되었다. 인간, 마우스 또는 래트 Dkk-1(R&D 시스템스; 0.4 내지 250 nM)의 일련의 5 배 희석물을 1 분간 50 내지 100 ㎕/분으로 주입하였다. 해리를 3 내지 5 분간 모니터하였다. 상기 칩을 2 회의 30 초 펄스의 100 mM H3PO4로 재생시켰다.
25 ℃에서 바이코어에 의해 측정된 바와 같은 인간, 마우스 또는 래트 Dkk-1에 대한 마우스 항체 JC18 결합에 대한 동역학 데이터
Dkk-1 종 Kon (1/Ms) Koff(1/s) Kd(nM)
인간 3.18 x 106 2.07 x 10-4 0.65
마우스 1.74 x 106 2.54 x 10-3 1.5
래트 3.8 x 106 2.75 x 10-3 0.72
huMabJC18에 대한 서열
서열식별번호: 19 huMabJC18 경쇄 가변 영역 nt 서열
Figure pct00018
서열식별번호: 20 huMabJC18 경쇄 가변 영역 aa 서열
Figure pct00019
서열식별번호: 21 huMabJC18 경쇄 가변 영역 CDR1 nt 서열
Figure pct00020
서열식별번호: 22 huMabJC18 경쇄 가변 영역 CDR1 aa 서열
RASESVDDFGISFIN
서열식별번호: 23 huMabJC18 경쇄 가변 영역 CDR2 nt 서열
GCCGGCAGCAAGCAGGGCAGC
서열식별번호: 24 huMabJC18 경쇄 가변 영역 CDR2 aa 서열
AGSKQGS
서열식별번호: 25 huMabJC18 경쇄 가변 영역 CDR3 nt 서열
CAGCAGCTGAAAGAGGTGCCCCCCACC
서열식별번호: 26 huMabJC18 경쇄 가변 영역 CDR3 aa 서열
QQLKEVPPT
서열식별번호: 27 huMabJC18 중쇄 가변 영역 nt 서열
Figure pct00021
서열식별번호: 28 huMabJC18 중쇄 가변 영역 aa 서열
Figure pct00022
서열식별번호: 29 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR1 nt 서열
AGCAGCTACGCCATCAGC
서열식별번호: 30 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR1 aa 서열
SSYAIS
서열식별번호: 49 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR1 aa 서열(카밧)
SYAIS
서열식별번호: 50 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR1 aa 서열(코티아)
GFTFSSY
서열식별번호: 31 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR2 nt 서열
Figure pct00023
서열식별번호: 32 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR2 aa 서열
SVSGTGLGFQTYYPDSVKG
서열식별번호: 51 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR2 aa 서열(코티아)
SVSGTGLGFQTY
서열식별번호: 33 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR3 nt 서열
TCCCTGGAAAACTACGCCTTCGACTAC
서열식별번호: 34 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR3 aa 서열
TSLENYAFDY
서열식별번호: 52 huMabJC18 중쇄 가변 영역 CDR3 aa 서열(짧은)
SLENYAFDY
서열식별번호: 35 리더 서열을 갖는 huMabJC18 중쇄 nt 서열
Figure pct00024
서열식별번호: 36 리더 서열을 갖는 huMabJC18 중쇄 aa 서열(*Δa 돌연변이(A329S, P330S)를 굵은 이탤릭체로 나타낸다)
Figure pct00025
글리코실화 부위: HC, N296
서열식별번호: 37 리더 서열을 갖는 huMabJC18 경쇄 nt 서열
Figure pct00026
서열식별번호: 38 리더 서열을 갖는 huMabJC18 카파 경쇄 aa 서열
Figure pct00027
huMabJC18의 아이소타입: IgG2(Δa)*, 카파
huMabJC18의 알로타입: G2(n-), Km3
서열식별번호: 39 리더 서열이 없는 huMabJC18 중쇄 nt 서열
Figure pct00028
서열식별번호: 40 리더 서열이 없는 huMabJC18 중쇄 aa 서열((*Δa 돌연변이(A329S, P330S)를 굵은 이탤릭체로 나타낸다)
Figure pct00029
글리코실화 부위: HC, N296
서열식별번호: 41 리더 서열이 없는 huMabJC18 경쇄 nt 서열
Figure pct00030
서열식별번호: 42 리더 서열이 없는 huMabJC18 카파 경쇄 aa 서열
Figure pct00031
실시예 3: huMabJC18 의 시험관 내 작용 활성: 세포 기재 작용 분석에서 Wnt 활성에서의 JC18 의 효과 측정
TCF 결합 부위를 갖는 TK 프로모터의 조절 하에서 루시페라제 정보제공 유전자를 함유하는 안정한 U2OS 세포 주(U2OS TF)를 세포 기재 작용 분석을 위해 선택하였다. 상기 프로모터는, 세포를 Wnt3a 처리된 매질로 처리할 때 Wnt 신호전달 경로를 통해 활성화된다. 상기 활성화는 Dkk-1에 의해 길항된다. 차례로 상기 Wnt 신호전달의 Dkk-1 매개된 억제는 Dkk-1 중화 mAb를 첨가함으로써 역전될 수 있다.
구체적으로, JC18은 마우스 및 인간 Dkk-1에 높은 친화성으로 결합하는 단클론 항체이다. Dkk-1에 의한 Wnt 3a 신호전달의 억제를 역전시키는 능력을 U2OS 탑플래시(TOPFlash) 세포에서 검사하였다. U2OS 세포를 ATCC로부터 획득하고 TCF-루시페라제 정보제공 구조물인 탑플래시 플라스미드(Upstate)로 안정하게 형질감염시켰다. 세포를 10% 송아지 태아 혈청, 1% 펜 스트렙(Pen Strep), 및 2 mM 글루타민이 보충된 맥코이스(McCoys) 5A 배지에서 37 ℃, 5% CO2에서 유지시켰다. U2OS 탑플래시 세포를 31,250 세포/㎠ 의 밀도로 정규 생육 배지에 도말하고 밤새 배양하였다. 세포를 0.25 ug/㎖의 rhDkk-1 단백질 또는 비히클(PBS, Gibco) 및 다양한 농도의 옵티멤(Optimem)(Gibco) 중의 Dkk-1 mAb로 처리하였다. 밤새 배양 후, 세포를 리포터(Reporter) 용해 완충제(Promega)로 용해시키고 루시페라제 발현을 루시페라제 시약(Promega)을 사용하여 정량분석하였다.
완전히 인간화된 항 Dkk-1 mAb인 huMabJC18은 1.3 nM의 IC50으로 상기 작용 분석에서 양호한 효능을 나타내었다(표 7).
세포 기재 작용 분석에서 Dkk-1 항체에 대한 IC50 값
항체 IC50
huMabJC18 1.3 nM
실시예 4: muMabJC18 및 마우스 키메라의 골 효능에 대한 생체 내 평가
다자란 암컷 C57BL/6 마우스를 생체 내에서 시험 Dkk-1 항체의 골격 효과의 평가에 사용하였다. 상기 동물을 24 ℃에서 12 시간 명/12 시간 암 주기로 수용하고 물과 상업적인 식사(퓨리나 실험용 설치류 사료 5001, Purina-Mills, St. Louis, MO, USA)에 자유롭게 접근하게 하였다. 상기 실험을 화이자 동물 보호-승인된 프로토콜에 따라 수행하며, 동물들을 실험 동물 관리 및 이용에 관한 ILAR(실험 동물 연구소) 지침에 따라 유지시켰다. 상기 마우스를 다양한 주 수 동안 주당 1 회 또는 2 회 경구 위관영양에 의해 비히클 또는 항체로 처리한다. 상기 연구의 종료 시, 상기 마우스를 안락사시키고 유리 항체 및 유리 Dkk-1 수준의 측정을 위해 혈청을 수확한다. 또한, 골 샘플을, 말단 골 정량적 전산화 단층 촬영(pQCT), 마이크로-CT 및 조직형태측정에 의해 골 질량 및 골 형성의 변화를 평가하기 위해 수확한다.
우측 대퇴골을 소프트웨어 버전 5.40으로 pQCT(Stratec XCT Research M; Norland Medical Systems, Fort Atkison, WI, USA)에 의해 스캐닝한다. 각 원위 대퇴골 골간단의 1 ㎜-두께 횡단면을 원위 단부에 가까운 2.5 ㎜(망상 조직의 골 풍부 부위인 성장판까지 약 1.5 ㎜)에서 취하고, 각 대퇴골 골간의 1 ㎜-두께 횡단면을 0.10 ㎜의 복셀 크기로 원위 단부로부터 가까운 8 ㎜(골 피질 풍부 부위)에서 취한다. 부피 골 함량, 밀도 및 면적을 전체, 망상 및 피질 골에 대해 측정한다.
우측 대퇴골을 소프트웨어 버전 3.1로 마이크로CT 기계(Micro-CT40, Scanco Medical, Auenring 6-8, Bassersdorf, Switzerland)에 의해 스캐닝한다. 원위 대퇴골 골간단의 횡단면(각각 16 ㎛ 두께의, 총 50 조각, 전체 두께 = 0.8 ㎜)을 망상 골 부피의 측정을 위해서 상기 원위 단부에 가까운 2.3 내지 3.1 ㎜(성장판으로부터 약 1.3 내지 2.1 ㎜)에서 취한다.
좌측 대퇴골을 망상조직 골에 대한 조직형태측정 평가를 위해 처리한다. 간단히, 좌측 대퇴골을 등급화된 농도의 에탄올 중에서 탈수시키고 메틸 메트아크릴레이트에 매몰하여 칼슘 제거한다. 상기 원위 대퇴골의 장축 전방 절편을 라이케르트-정 폴리컷(Reichert-Jung Polycut) S 마이크로톰(Leica Corp., Heidelberg, Germany)을 사용하여 4- 및 10-㎛ 두께로 절단한다. 상기 4-㎛ 절편을 변형된 메이슨의 트라이크롬(Masson's Trichrome) 색소로 염색하고 상기 10-㎛ 절편은 염색하지 않은 채로 둔다. 모든 조직형태 측정을 상 분석 시스템(Osteomeasure, Inc., Altanta, GA, USA)을 사용하여 성장판-골단 관절에 인접한 0.375 내지 0.875 ㎜ 면적의 원위 대퇴골 골간단의 망상 골 조직에서 수행한다. 골 조직 면적의 백분율로서 망상조직 골 부피 및 전체 망상조직 둘레의 백분율로서 파골세포 표면을 4-㎛ 두께의 염색된 절편에서 측정한다. 망상조직 수, 두께 및 분리를 계산한다. 이중 형광색소 표지를 갖는 망상 골 표면(무기질화 표면)의 백분율, 미네랄 부착률, 골 형성률(골 표면 및 조직 부피 지시대상)을 포함한 골 형성의 형광색소-계 지수를 10- ㎛ 두께의 염색되지 않은 절편에서 획득한다.
완전 마우스 모델에서 연구 프로토콜 및 결과
A. 완전 마우스 모델에서 항 마우스 Dkk-1 단클론 항체(JC18)의 효과
다자란 암컷 C57BL/6 마우스에게 비히클 또는 마우스 IgG1 또는 JC18을 6 주간 주당 1 회, 10, 30 및 60 ㎎/㎏으로 경구 투여하였다. 우측 및 좌측 대퇴골을 모두 부검 시 각 마우스로부터 수거하였다. 우측 대퇴골을 pQCT를 사용하여 분석하고 좌측 대퇴골은 조직형태분석 방법을 사용하여 분석하였다. 원위 대퇴골들의 전체 BMD는 모든 용량 수준에서 JC18 처리에 의해 현저하게 증가하였다(도 1a). JC18은 또한 골 형성률을 마우스에서 60 ㎎/㎏에서 현저하게 증가시켰다(도 1b).
B. 완전 마우스 모델에서 Dkk-1 단클론 항체의 마우스 키메라(마우스 키메라 - 키메릭 인간-마우스 항체)의 효과
4 개월 된 완전 암컷 C57BL/6 마우스를 6주간 매주 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 마우스 키메라로 처리하였다. 하나의 마우스 그룹을 6주간 주당 2 회, 5 ㎎/㎏의 마우스 키메라로 처리하였다. 각 동물의 우측 원위 대퇴골을 pQCT를 사용하여 분석하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 마우스 키메라는 전체 BMD를 비히클 처리에 비해 1 내지 30 ㎎/㎏의 용량에서 증가시켰다.
서열식별번호: 43 키메릭 항체(hu-mu): 키메릭 huMabJC18L변종-마우스 카파 aa 서열
Figure pct00032
서열식별번호: 44 키메릭 항체(hu-mu): 키메릭 huMabJC18H변종-마우스 IgG1 불변 aa 서열
Figure pct00033
서열식별번호: 45 키메릭 항체(hu-mu): huMabJC18L변종 nt 서열
Figure pct00034
서열식별번호: 46 키메릭 항체(hu-mu): 마우스 카파 nt 서열
Figure pct00035
서열식별번호: 47 키메릭 항체(hu-mu): huMabJC18H변종 nt 서열
Figure pct00036
서열식별번호: 48 키메릭 항체(hu-mu): 마우스 IgG1 CH1-CH2-CH3 nt 서열
Figure pct00037
C. 난소절제된 마우스 모델
다자란 암컷 C57BL/6 마우스에게 에스트로젠 결핍 조건(폐경 후 골 손실을 모방한다)에서 시험 Dkk-1 항체의 골격 효과의 평가를 위해 모의 또는 난소절제(OVX) 술을 가한다. 상기 동물을 24 ℃에서 12 시간 명/12 시간 암 주기로 수용하고 물과 상업적인 식사(퓨리나 실험용 설치류 사료 5001, Purina-Mills, St. Louis, MO, USA)에 자유롭게 접근하게 하였다. 상기 실험을 화이자 동물 보호-승인된 프로토콜에 따라 수행하며, 동물들을 실험 동물 관리 및 이용에 관한 ILAR(실험 동물 연구소) 지침에 따라 유지시켰다. 상기 마우스를 다양한 주 수 동안 주당 1 회 또는 2 회 경구 위관영양에 의해 비히클 또는 항체로 처리한다. 상기 연구의 종료 시, 상기 마우스를 안락사시키고 골 샘플을, 말단 골 정량적 전산화 단층 촬영(pQCT), 마이크로-CT 및 조직형태측정에 의해 골 질량의 변화를 평가하기 위해 수확한다. 이들 측정 방법은 선행 섹션에서 개시되었다.
연구 프로토콜 및 결과
항 마우스 Dkk-1 단클론 항체(JC18)는 OVX 마우스 모델에서 에스트로젠 결핍에 의해 유발된 골 손실을 방지하였다.
4 개월 된 암컷 C57B/6 마우스에게 모의 또는 난소절제(OVX) 술을 가하고 수술 후 당일에 출발하여 8주간 매주 비히클 또는 0.3, 1, 3, 10 및 30 ㎎/㎏의 JC18, 또는 매주 2 회 15 ㎎/㎏의 JC18로 처리하였다. 예상된 바와 같이, 비히클로 처리된 마우스는 전체 BMD의 현저한 감소에 의해 입증되는 바와 같이(도 3) OVX 후8 주째에 골감소증을 나타내었다. JC18은 OVX 마우스의 비히클 처리에 비해 원위 대퇴골에서 pQCT에 의해 측정된 바와 같이 전체 BMD를 7 내지 20%까지 용량-반응적으로 증가시켰다. 매주 2 회 15 ㎎/㎏의 JC18로 처리된 마우스에서, 전체 BMD는 비히클 처리된 OVX 마우스보다 높을 뿐만 아니라 모의 대조용 수준에서 유지되었으며, 이는 상기 용량 및 투여 섭생에서 JC18이 OVX 마우스에서 골감소증의 발생을 완전히 방지함을 가리킨다(도 3).
실시예 5: 완전 래트 모델에서 huMabJC18 은 골 질량을 증가시켰다
다자란 암컷 래트에게 6주간 매주 1 회 0, 0.1, 1, 10 또는 100 ㎎/㎏의 huMabJC18을 정맥 내 투여하였다. 골 형성 생물마커인 혈청 오스테오칼신이, 1, 10 및 100 ㎎/㎏으로 처리된 래트에서 처리 후 2주째에 각각 30, 26 및 25%까지 증가되었으며 이는 처리 후 4주째에 대조용 값과 다르지 않았다. 골 재흡수 마커인 혈청 CTX는 처리에 이어서 일관된 변화를 보이지 않았다. 혈청 생물마커의 이러한 변화는 뼈에 대한 huMabJC18의 골 형성 작용을 지지한다. 원위 대퇴골 BMD 및 대퇴골 골간 BMC(골 미네랄 함량)가 10 및 100 ㎎/㎏ 용량의 huMabJC18로 처리된 래트에서 각각 11 및 16% 또는 7 및 8%까지 증가되었으며 이는 상기 동물에서 망상조직 및 피질 골 질량의 증가를 가리킨다.
실시예 6: Wnt -신호전달 경로의 길항물질인 용해성 항원 Dkk -1을 표적화하는 단클론 항체 요법과 관련된 시스템 역학을 이해하기 위한 방법: IgG2 항체의 인간에서 첫 번째( FIH ) 출발 용량을 선택하기 위한 기계적인 전임상 약동학/ 약역학 ( PK / PD ) 모델의 적용
골다공증은 골 취약 및 후속적으로 골절에 이르는 낮은 골 미네랄 밀도를 특징으로 하는 골 질병이다. 비스포스포네이트, 칼시토닌, HRT 및 선택적인 에스트로젠 수용체 조절제(SERM)를 포함한 약물학적 골다공증 요법의 대부분은 골 재흡수를 감소시킴으로써 골 손실을 방지한다. 골다공증을 앓고 있는 환자의 골 질량의 복원은 충족되지 않은 의학적 필요 분야이다.
Dkk-1의 LRP5/6 수용체 및 크레멘-1/2 보조 수용체에의 결합은 상기 수용체 복합체의 내면화를 촉진하여 상기 Wnt 신호의 완충을 생성시킨다(Diarra et al. (2007) Nat Med 13:156-163).
골 질량의 유지에 있어서 상기 Wnt 경로의 중심 역할에 대한 유전적 증거는 상기 Wnt 수용체 LRP5의 돌연변이의 활성화 및 불활성화 모두의 확인으로부터 나왔다. LRP5의 불활성화는 골 질량의 감소를 생성시키고 인간에게서 상염색체 열성 질환: 골다공성 가성신경교종(OPPG) 증후군(Gong et al. (2001) Cell 107:513-523) 및 LRP5 녹아웃 마우스에서 유사한 표현형(Holmen et al.(2004) J Bone Miner Res 19:2033-2040)을 유발한다.
HBM 을 갖는 개인은 골절 위험성이 현저하게 감소되었다
중화 Dkk-1 항체는 조골세포에 의해 증가된 골 형성으로 인해 골 질량이 증가하고 따라서 골다공성 골절이 방지되는 것으로 예상된다. huMabJC18은 다른 질환들 중에서도 특히 골다공증의 치료를 위한 인간화된 원형 항-Dkk-1 단클론 항체이다. 상기 항체는 시험관 내에서 인간, 마우스, 래트 및 키노몰구스 원숭이 Dkk-1과 고 친화성(Kd < 100 pM)으로 결합한다. 상기 항체는 완전 마우스에서 골 질량을 증가시키고, 폐경 후 골 질량 모델(Li et al., 2009; 준비 중인 원고)인 난소절제된 마우스의 골감소성 골격에 대해 골 질량을 복원시킨다.
개발중인 다수의 항체들에도 불구하고, 항체의 임상적인 약동학 또는 유효 용량을 예측하는 전 임상 데이터를 사용하는 소수의 보고서만이 공개되었다(Lobo et al. (2004) J Pharm Sci 93:2645-2668; Agoram, (2009) Br J Clin Pharmacol 67:153-160). 선형 PK가 예상되는 경우 상대성장력(allometric power) 모델이 항체 약동학(PK)의 종간 기준화(scaling)에 통상적으로 사용된다(Wang et al. (2008) Clin Pharmacol Ther 84:548-558). 그러나, 소 분자들과 달리, 항체와 그의 표적과의 상호작용은 종종 상기 항체의 PK에 영향을 미친다. 약동학(PK) 및 약역학(PD)은 긴밀히 연관되며 PK/PD 이해는 항체, 표적 및 항체-표적 상호작용에 대한 지식을 요한다. 최고의 값은 주어진 용량에 따른 약물 노출 및 효과를 예측하는 PK와 PD 반응의 연계로부터 나온다(Agoram et al. (2007) Drug Discov Today 12:1018-1024). 따라서 기계적인 PK/PD 모델링은 인간 PK 및 항체의 임상적으로 유효한 용량 모두의 예측에 합리적이고 유효한 수단을 제공한다.
본 연구에서, 래트 및 원숭이에서 항체 huMabJC18 표적(Dkk-1)의 동시적인 특성화는 상기 반응의 약동학과 약역학에 대한 깊은 이해를 가능하게 하였다. 이를 건강한 피실험자 대 병든 환자의 표적 수준, 표적 대사회전율 및 임상에서 PK/PD의 기계적인 예측을 위한 항체-표적 결합/해리 속도에 대한 지식과 결부시켰다.
상기 연구의 목적은 하기의 계산에 의해 획득된 항-Dkk-1 IgG2 항체(huMabJC18)의 예측된 임상 출발 용량을 비교하고 대조하는 것이었다: (1) 독성 종들에서 부작용 수준이 없음(NOAEL), (2) 전통적인 더프(Duff) 식을 사용하는 최소 예상 생물학적 효과 수준(MABEL) 및 (3) 표적 매개된 약물 성향(TMDD) 모델을 사용하는 MABEL.
래트 및 원숭이에 대한 전 임상 안전성 연구를 사용하여 NOAEL을 측정하였다. 100배 안전성 인자를 상기 NOAEL에 적용하여 권장되는 출발 용량을 생성시켰다. 전통적인 더프 식을 사용하여 수용체 점유율을 계산하고 상기 MABEL을 10% 수용체 점유율을 생성시키는 용량으로서 정의하였다. TMDD 모델을 사용하여 래트 및 원숭이 연구에서 시간에 대한 유리 Dkk-1 및 항체 농도를 대입하였다. 상기 모델을 인간에 대해 외삽하고 MABEL을 Dkk-1의 10% 감소를 제공하는 용량인 것으로 평가하였다.
시험 물질
단클론 항-Dkk-1 항체를, Balb/C 마우스를 전장 재조합 인간 Dkk-1 단백질(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)로 면역시킴으로써 제노백(Genovac)(Germany)에서 제조하였다. 단일 마우스 IgG1/카파 아이소타입 항체(JC18)를 인간화하고 라이브러리 스캐닝 돌연변이 전략(Pons et al., 2009; 준비 중인 원고)을 사용하여 친화성 성숙시켰다. 모 마우스 항체에 비해, 상기 인간화되 항체(huMabJC18)는 인간 및 마우스 Dkk-1 모두에 있어서 >100 배의 친화성의 증가를 나타내었다.
상기 Dkk-1 동역학 연구에 사용된 hDkk-1-V5-6His(인간) 및 rDkk-1-TEV-V5-6His(래트)를 클로닝하고 내부 발현시키고 TOPFLASH 분석(Ai et al., 2005)에 의해 작용성으로서 정성 분석하였다.
비아코어 실험
huMabJC18과 인간 또는 마우스 또는 래트 또는 키노몰구스 원숭이 Dkk-1 간의 상호작용을 CM5 센서 칩(BIAcore AB, Uppsala, Sweden)이 구비된 비아코어 3000TM 시스템을 사용하여 분석하였다. 결합 및 해리 단계들을 상기 상호작용 분석 동안 모니터하였다. 상기 결합 반응들을 이중-참조하고 Bia 평가 v.4.0 소프트웨어를 사용하여 간단한 모델에 전체적으로 대입하였다. 친화성을 상기 동역학적 속도 상수(KD = koff/kon)의 몫으로부터 추론하였다.
동물 연구
모든 동물 연구를 동물 실험 위원회(IACUC)에 의해 승인된 동물 관리 및 이용 프로토콜에 따라 수행하였다.
래트에서의 Dkk -1 동역학 연구
hDkk-1-V5-6His를 단일 정맥 내 일시주사 용량으로서 1, 5, 10 및 100 ㎍/㎏으로 수컷 스프래그 다우리 래트(n = 3/용량)에게 투여하였다. 일련의 혈액 샘플을 사전-용량 및 0.083, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8 및 24 시간 후-용량으로 채혈하였다. rDkk-1-TEV-V5-6His를 단일 정맥 내 일시주사 용량으로서 100 ㎍/㎏으로 수컷 스프래그 다우리 래트(n = 3/용량)에게 투여하였다. 일련의 혈액 샘플(300 ㎕)을 사전-용량 및 0.083, 0.17, 0.33, 0.5, 1, 2, 4 및 6 시간 후-용량으로 채혈하였다. 혈청을 원심분리에 의해 수득하고 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
래트에서의 약동학/ 약역학 연구
실험을 암컷 스프래그 다우리 래트(n = 40, 연구 지속 기간에 걸쳐 체중 250 내지 350 g, Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA)에서 수행하였다. huMabJC18을 암컷 스프래그 다우리 래트(n = 8/용량)에게 연속적으로 6 주 동안 매주 1 회 0.1, 1, 10 및 100 ㎎/㎏으로 정맥 내 경로에 의해 투여하였다. 하나의 래트 그룹(n = 8)에게 비히클 대조군(140 mM NaCl과 함께 20 mM 히스티딘 pH 6.5)을 투여하였다.
일련의 혈액 샘플을 각 처리 그룹으로부터 사전-용량 및 1, 3, 8, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 408, 504, 576, 672, 744, 840, 912 및 1008 시간 후 제 1 용량으로 채혈하였다. 혈청을 원심분리에 의해 수득하고 Dkk-1 및 huMabJC18 농도에 대한 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
래트에서 골 미네랄 밀도 측정
골 질량에 대한 항-Dkk-1 mAb 처리의 효과를 평가하기 위해서, 절제된 우측 대퇴골을 소프트웨어 버전 5.40으로 말단 골 정량적 전산화 단층 촬영(pQCT, Stratec XCT Research M, Norland Medical Systems, Fort Atkinson, WI, USA)에 의해 스캐닝하였다. 각 원위 대퇴골 골간단의 1 ㎜-두께 횡단면을 망상 조직의 골 풍부 부위인 원위 단부에 가까운 2.5 ㎜에서, 0.10 ㎜의 복셀 크기로 스캐닝하였다. 부피 전체 골 미네랄 밀도(BMC)를 앞서 개시된 바와 같이 측정하였다(Ke et al., 2001).
키노몰구스 원숭이에서 약동학/ 약역학 연구
본 연구의 동물 관리 실험 과정을 미국 동물 복지법 및 실험 동물 관리 및 이용에 관한 지침(실험 동물 연구소, 1996)에 명시된 조건을 준수하여 수행하였다.
체중 3.2 내지 5.2 ㎏의 2 내지 5 세 된, 5 마리의 수컷 및 5 마리의 암컷 키노몰구스 원숭이(Macaca fascicularis)를 본 연구에 사용하였다. 동물들(n = 1/성별/그룹)을 5 개의 그룹으로 할당하였다. huMabJC18를 수컷 원숭이 1 마리 및 암컷 원숭이 1 마리씩 4 개의 그룹에 0.1, 1, 10 또는 100 ㎎/㎏의 단일 용량으로서 느린 정맥 주사에 의해 투여하였다. 나머지 그룹에게는 동일한 방식으로 비히클 대조군을 투여하였다.
전혈 샘플(약 2 ㎖)을 대퇴골 정맥 천자를 통해 각 처리 그룹으로부터 처리 전 및 0.1, 0.5, 1, 3, 8, 24, 48, 72, 168, 240, 336, 408, 504, 576 및 672 시간 후-용량으로 채혈하였다. 혈청을 원심분리에 의해 전혈로부터 분리시키고 그 후에 샘플을 분석시까지 -80 ℃에서 보관하였다. 샘플들을 나중에 Dkk-1 및 huMabJC18 농도에 대해 분석하였다.
유리 Dkk -1 분석
분석 디자인(Ann Arbor, Michigan, USA) 인간 Dkk01 ELISA 시스템(Cat# 900-151)은, 약간 변경시켜 제조자의 설명에 따라 인간 혈청 중의 총 Dkk-1을 측정하는데 타당한 것으로 인정되었다: R&D 시스템스(Minneapolis, MN, USA) 재조합 인간 Dkk-1(Cat# 1096-dk-10/cf)을 분석 기준으로서 사용하였다.
래트 및 원숭이 혈청 중의 유리 Dkk-1(치료항체에 결합되지 않은 것)을 분석하기 위해서, 항-Dkk-1 항체를 결합되지 않은 혈청 Dkk-1의 포획에 사용하였으며, 상기 분석 디자인 인간 Dkk-1 ELISA 시스템(카탈로그 # 900-151)으로부터의 시약을 나머지 단계들에 대해 하기와 같이 변경시켜 상기 키트의 설명서에 따라 사용하였다: R&D 시스템스(Minneapolis, MN, USA) 재조합 래트 Dkk-1(Cat# 4010-dk-10/cf) 및 인간 Dkk-1(Cat# 1096-dk-10/cf)을 각각 래트 및 원숭이 분석에 대한 분석 기준으로서 사용하였다.
건강한 피실험자 및 병든 환자로부터의 인간 혈청 샘플을 바이오레클러메이션 인코포레이티드(Bioreclamation Inc.)(Nassau, NY, USA)로부터 구입하였다.
V5 표지된 Dkk -1 분석
V5 표지된 Dkk-1의 혈청 농도들을 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 샘플들을, 배경을 감소시키고 농도들을 상기 분석의 선형 범위(분석 플레이트 상에서 약 0.195 내지 25 ng/㎖) 내에 있게 할 수 있는데 사용되는 PBS 완충제(3% BSA 및 0.05% 트윈-20 함유)에서 1/4 내지 1/40의 최종 최소 필요 희석(MRD) 범위로 희석하였다. hDkk-1-V5-6His 또는 rDkk-1-TEV-V5-6His 눈금화 및 품질 조절 표준들을 샘플과 동일한 기질 조성물로 희석하였다. 상기 96-웰 면역흡수 분석 플레이트(Nalgene Nunc, Rochester, NY, USA)를 4 ℃에서 50 ㎕의 항-V5 항체(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 2 ㎍/㎖로 밤새 코팅하고, 이어서 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 완충제로 세척한 다음 3% BSA 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 완충제로 차단하였다. 상기 희석된 샘플 및 표준을 플레이트(50 ㎕/웰)에 가하고 실온에서 1 시간 동안 진탕시키면서 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 2 회의 세척 주기로 세척한 다음 1 시간 동안 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 항-Dkk-1 2차 항체(Assay Designs kit, Ann Arbor, MI, USA로부터)와 함께 배양하였다. 세척 후에, 상기 플레이트를 약 10 분간 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질(KPL, Gaithersburg, MD, USA)과의 색상 반응에 의해 전개시키고, 2M H2SO4로 정지시켰다. 빈 기질 OD 값을 450 ㎚의 파장에서 흡광도 OD 판독을 측정한 후에 배경 공제하였다(650 ㎚의 공제와 함께). 상기 V5 표지된 Dkk-1 눈금화 표준을 사용하여 소프트맥스 프로(SoftMax Pro) 4.8에서 균일하게 칭량하면서 4-매개변수 대입을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 미지 샘플 중의 V5 표지된 Dkk-1의 혈청 농도들을 상기 표준 곡선으로부터 보간 삽입하였다.
오스테오칼신 분석
혈청 오스테오칼신 농도를 래트-MIDTM 오스테오칼신 ELISA 키트(Nordic Bioscience Diagnostics A/S, Herlev, Denmark)를 사용하여 측정하였다.
래트 PK / PD 샘플에 대한 유리/부분 유리 huMabJC18 항체 분석
hMabJC18의 혈청 농도를 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)(MSD) 시스템(Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 전기화학발광(ECL) 방법에 의해 측정하였다. 샘플들을 1% BSA를 함유하는 PBS 완충제에서 1/2 내지 1/150의 최종 최소 필요 희석(MRD)으로 희석한 다음 배경 간섭을 감소시키고 상기 분석의 선형 범위(분석 플레이트 상에서 약 5 내지 1300 ng/㎖) 내에 있도록 하기 위해서 추가로 10 내지 4000 배 희석하였다. huMabJC8 눈금화 및 품질 조절 표준들을 샘플과 동일한 기질 조성물로 희석하였다. 96-웰 MSD 고 결합 플레이트(Cat# L11XB-3)를 4 ℃에서 hDkk-1-V5-6His(내부적으로 발생됨) 5 ㎍/㎖로 밤새 코팅하였다. 상기 플레이트를 뒤집어 상기 피막을 제거한 후에, 플레이트를 PBS 중의 1% BSA로 차단하였다. 상기 희석된 샘플 및 표준을 플레이트(25 ㎕/웰)에 가하고 실온에서 2 시간 동안 진탕시키면서 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 완충제로 3 회의 세척 주기로 세척한 다음 1 시간 동안 MSD 루티닐화된 염소 항-인간 IgG 항체(Cat# R32AJ-1)와 함께 배양하였다. 세척 후에, 계면활성제(Cat# R92TC-1)가 있는 MSD 판독 완충제 T(4x)를 각 웰에 가하고 MSD 섹터 이미저(Sector Imager) 6000 상에서 즉시 판독하였다. 빈 기질 값을 샘플 값으로부터 배경 공제하였다. 상기 항-Dkk-1 인간화된 항체 눈금화 표준을 사용하여 MSD 디스커버리 워크벤치(Discovery Workbench) v 3.0 소프트웨어에서 칭량하면서 1/y2 에 4-매개변수 대입을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 미지 샘플 중의 항-Dkk-1 인간화된 항체의 혈청 농도들을 상기 표준 곡선으로부터 보간 삽입하였다.
원숭이 샘플에 대한 유리/부분 유리 huMabJC18 항체 분석
huMabJC18의 혈청 농도를 ELISA 방법에 의해 측정하였다. 샘플들을 3% BSA 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 완충제에서 1/4 내지 1/100의 최종 최소 필요 희석(MRD)으로 희석한 다음 배경 간섭을 감소시키고 상기 분석의 선형 범위(분석 플레이트 상에서 약 8 내지 100 ng/㎖) 내에 있도록 하기 위해서 추가로 10 내지 500 배 희석하였다. huMabJC8 눈금화 및 품질 조절 표준들을 샘플과 동일한 기질 조성물로 희석하였다. 상기 96-웰 면역흡수 분석 플레이트를 4 ℃에서 hDkk-1-V5-6His(내부적으로 발생됨) 1.5 ㎍/㎖로 밤새 코팅하고, 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS 완충제로 세척한 후에, 3% BSA 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 PBS로 차단하였다. 상기 희석된 샘플 및 표준을 플레이트(100 ㎕/웰)에 가하고 실온에서 1 시간 동안 진탕시키면서 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를 3 회의 세척 주기로 세척한 다음 1 시간 동안 비오틴화된 마우스 항-인간 IgG2(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 함께 배양하고, 그 후에 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 스트렙트아비딘(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)을 가하고 상기 플레이트를 30 분간 추가로 배양하였다. 세척 후에, 상기 플레이트를 약 10 분간 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질과의 색상 반응에 의해 전개시키고, 2M H2SO4로 정지시켰다. 빈 기질 OD 값을 450 ㎚에서의 파장에서 흡광도 OD 판독을 측정한 후에 배경 공제하였다(650 ㎚의 공제와 함께). 상기 항-Dkk-1 인간화된 항체 눈금화 표준을 사용하여 소프트맥스 프로 4.8에서 균일하게 칭량하면서 4-매개변수 대입을 사용하여 표준 곡선을 작성하였다. 미지 샘플 중의 항-Dkk-1 인간화된 항체의 혈청 농도들을 상기 표준 곡선으로부터 보간 삽입하였다.
항-약물 항체( ADA ) 분석
래트 및 원숭이에서 huMabJC18에 대한 항-약물 항체(ADA)의 존재를 메조 스케일 디스커버리(MSD) 플랫폼(Gaithersburg, MD, USA)을 사용하여 가교 리간드 결합 분석(LBA)으로 측정하였다. 분석 희석제(3% BSA, 0.05% 트윈 20, PBS)로 1:10 희석된 혈청 샘플(25 ㎕)을 pH 9.6 카보네이트 완충제 중의 1 ㎍/㎖의 huMabJC18로 코팅된 96-웰 MSD 고 결합 플레이트에 가하였다. 실온에서 1 시간 동안 배양 후, 상기 플레이트를 세척하고 루테늄 표지된 huMabJC18 25 ㎕를 각 웰에 1 ㎍/㎖로 가하고 다시 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 플레이트를 세척하고 150 ㎕의 MSD 판독 완충제(2X)를 첨가한 다음 상기 플레이트를 MSD 섹터 이미저 6000 상에서 판독하였다.
비-구획화 약동학 분석
약동학적 분석을 윈놀린 엔터프라이즈 에디션(WinNonLin Enterprise Edition) 컴퓨터 소프트웨어, 버전 5.2(Pharsight Corp., Cary, NC, USA)를 사용하여 수행하였다. 최종 단계 속도 상수(kel)를 로그 혈장 농도 시간 프로파일의 선형 회귀에 의해 측정하였다. 최종 제거 반감기(t1 /2)를 0.693/kel로부터 계산하였다. Cmax, Tmax, 및 Cmin 값들을 기록된 데이터로부터 직접 획득하였다. 혈청-농도 시간 곡선 아래 면적(AUC0 - tlast)을 선형 사다리꼴 법칙을 사용하여 계산하고 kel을 사용하여 무한대(AUC0 - inf)로 외삽하였다. 제거(CL)를 용량/AUC0 - inf 관계를 사용하여 계산하였다. 분배 부피(Vc)를 CL/kel 관계를 사용하여 계산하였다. 함몰부(Cave)를 1차 투여 간격의 AUC(1차 투여 간격)/tlast로서 계산하였다.
래트에서의 Dkk-1 동역학 연구에서, h-Dkk-1에 대해 인용된 제거 반감기 값은 5, 10 및 100 ㎍/㎏ 용량 수준에서 측정된 반감기 값들의 평균이다. 불충분한 데이터 점들을 1 ㎍/㎏ 용량 수준에서 제거 반감기 값을 계산하는데 이용할 수 있었다. r-Dkk-1의 경우 제거 반감기를 100 ㎍/㎏(투여된 유일한 용량이다)에서 3 마리 래트들에 대한 고유 풀 분석으로부터 계산하였다.
약동학/ 약역학 분석
개별적인 래트 및 원숭이 항체 농도 대 시간 데이터의 예비 비-구획화 분석(Jusko, 1992)을 수행하여, 상기 항체의 비-선형 약동학을 밝혔다. 기계적인 표적-매개된 약물 성향 모델(Mager and Jusko, 2001)을 사용하여 래트 및 원숭이에서의 huMabJC18의 PK/PD 프로파일을 개시하였다(도 5). 간단히, 상기 TMDD 모델은 표적(Dkk-1)에 대한 항체(huMabJC18)의 포화 가능한 고 친화성 결합이 관찰 가능한 비선형 약동학 양상에 원인이 될 수 있음을 나타낸다. 중심 구획(부피 V1) 중의 항체는 유리 Dkk-1에 결합하여(속도 상수, kon) 항체-Dkk-1 수용체 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 일단 형성되면 해리되거나(속도 상수, koff) 또는 상기 항체-Dkk-1 복합체가 제거될 수도 있다(속도 상수, kel ,복합체). 결합되지 않은 항체는 또한 1차 속도(kel)로 상기 중심 구획으로부터 직접 제거될 수 있다. 상기 모델을 확장시켜 속도 상수 k12 및 k21에 의해 개시되는 비-특이적 조직 부위로의 항체 분포를 밝혔다.
상기 모델을 하기 일련의 미분 방정식으로서 실행하였다:
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
상기에서,
CmAb혈청는 huMabJC18의 유리 농도이고, Kd = koff/kon 및 [mAb전체] = CmAb 혈청 + C복합체 및 [표적전체] = C표적 + C복합체 이다.
상기 미분 방정식의 시스템을, 콤패크 비주얼 포트란(Compaq Visual Fortran) 버전 6.6을 사용하는 윈도우 XP 하에서 DOS 쉘에서 실행하는 NONMEM 소프트웨어, 버전 V에서 수치적으로 풀었다. ADVAN 8 TOL = 3을 상기 난해한 문제에 사용하였다. 상기 유리 Dkk-1 구획을 t = 0에서 단위 용량을 사용하고 t = 0에서 추정되는 유리 Dkk-1 농도에 F3(유리 Dkk-1)을 넣어 초기화하였다. 비히클 원숭이에서의 Dkk-1 반응의 변화성을 4차 다항식 모델을 사용하여 특성화하였다:
Y = A*TIME^4 - B*TIME^3 + C*TIME^2 - D*TIME + DKK0
상기에서,
A, B, C 및 D는 비히클 데이터로부터 측정되고 상기 모델에서 결정된 상수들이며 Dkk0는 Dkk-1 투여 전(t = 0 시간)의 농도와 같다. 이를 약물의 덧셈 효과와 함께 NONMEM에서 $ERROR 블록에서 실행하였다.
비히클 래트에서 Dkk-1 반응의 변화성을 약물의 곱셈 효과와 함께 간단한 코사인 함수를 사용하여 특성화하였다(Chakraborty et al. (1999) J Pharmacokinet Biopharm 27:23-43):
F = 기준선 + 진폭*Cos((시간-피크 시간)*(2*π/24))
적합도를, NONMEM에서 $COV 아래 경로에 의해 제공된 매개변수들의 상관 행렬 및 매개변수 평가의 정밀도, 시간에 대한 칭량된 잔기의 랜덤 확산에 대한 가시적인 검사 및 예측된 농도로부터, 예측된 개별적인 피실험자의 가시적인 검사 대 임의의 시점들에서 체계적인 치우침 결여에 대한 실제 농도-시간 플롯과 함께 평가하였다.
골다공증 환자에서 Dkk-1 및 huMabJC18 농도의 시뮬레이션을 버클리-마돈나(Berkeley-Madonna)(v8.3.9, University of California, Berkeley, CA, USA)의 TMDD 모델을 사용하여 수행하였다. 상기 인간 시뮬레이션에 사용된 매개변수들을 표 14에 나타낸다. PK, 표적 및 복합체 매개변수들을 하기 형태의 간단한 파워 모델을 사용하여 상대성장의 원리를 통해 래트 및 원숭이로부터 인간으로 기준화하였다: Y = aBWb(여기에서 Y는 관심 매개변수이고, BW는 체중이고, a는 상대성장 계수이고, b는 상대성장 지수이다). 반감기의 기준화를 위해서, b를 0.25인 것으로 가정하였으며, 제거 및 흡수 속도 상수(kel 및 kel)의 경우 b를 -0.25인 것으로 가정하였고, 분배 부피의 경우 b를 1인 것으로 가정하였다(Wang et al., 2008).
상기 예측된 임상 출발 용량의 추정은 5 이상 정도의 크기까지 상이한 상기 3 개의 접근법들로부터 유도되었다. 최고 출발 용량은 NOAEL 계산으로부터 유도되었다(1 ㎎/㎏). 최저 출발 용량은 더프 식을 사용한 MABEL 계산으로부터 유도되었다(0.00003 ㎎/㎏). TMDD 모델을 사용한 MABEL 계산으로부터 유도된 출발 용량은 상기 범위의 중간 부근에 있다(0.03 ㎎/㎏).
비아코어 데이터
비아코어 표면 결합 기술에 의해 측정된 인간, 마우스, 래트 및 원숭이 Dkk-1에 대한 huMabJC18의 시험관 내 Dkk-1 결합 동역학의 요약을 표 8에 나타낸다. huMabJC18은 인간, 마우스 및 래트 Dkk-1과 고 친화성으로 결합한다(각각 Kd <2 pM, <30 pM, 및 <100 pM). 대부분의 경우에, 진행 속도(kon)는 상기 비아코어 장비에 의해 정확하게 측정하기에는 너무 빠르고 중단 속도(koff)는 너무 느리다. huMabJC18은 또한 키노몰구스 원숭이 Dkk-1과 결합하지만, 상기 Dkk-1 샘플의 불순물로 인해 Kd를 측정할 수 없었다.
huMabJC18의 시험관 내 Dkk-1 결합 동역학
Dkk-1 종 kon(1/Ms) koff(1/s) T1 /2 Kd(nM)
인간 > 1.3e6a < 2.0e -6b > 96.27 < 0.002
마우스 > 1.3e6a < 3.9e -5b > 4.94 < 0.03
래트 > 1.3e6a 2.1e -4 0.92 < 0.1
원숭이 -c < 6.0e -5b > 5 -d
a진행 속도는 정확하게 측정하기에 너무 빠르다
b중단 속도는 정확하게 측정하기에 너무 느리다
c진행 속도는 대량 수송 한계 및 불순한 샘플로 인해 측정할 수 없었다
d측정 안 됨
폐경 전, 폐경 후, 골감소증 및 골다공증 여성에서의 Dkk -1 발현
폐경 전(n = 50), 폐경 후(n = 50), 골감소증(n = 50) 및 골다공증(n = 50) 여성들로부터의 혈청 샘플 중의 Dkk-1의 농도를 표 9에 나타낸다. 상기 시험된 샘플 세트에서 폐경 전후 여성들 간의 Dkk-1 농도에 있어서 현저한 차이는 없었으며, 이는 연령이 Dkk-1 농도에 영향을 미치지 않음을 암시한다. 폐경 전 여성의 Dkk-1 수준(평균 2.2 ng/㎖)은 골감소증 여성으로부터의 샘플(T 점수 -2.2, 평균 Dkk-1 9.0 ng/㎖) 및 골다공증 여성(T 점수 -3.0, 평균 Dkk-1 10.5 ng/㎖)에 비해 현저한 차이가 있었다(p<0.01). 이들 값을 상기 PK/PD 모델에 포함시켜 골다공증 여성에서의 huMabJC18의 유효 용량을 예측하였다.
폐경 전, 폐경 후, 골감소증 및 골다공증 여성 피실험자들에서의 Dkk-1 농도
환자 N 연령 T-점수 혈청 Dkk-1 (ng/㎖) P-값
폐경전 50 33.3 ± 13 > -1.0 2.2 ± 2.2 -
폐경후 50 54.7 ± 4.4 > -1.0 2.9 ± 4.3 0.35
골감소증 50 61.3 ± 10.6 -2.2 ± 0.5 9.0 ± 4.3 < 0.01
골다공증 50 67.4 ± 7.7 -3.0 ± 0.5 10.6 ± 6.5 < 0.01
a정상 T-점수는 >-0.1이고, 골감소증은 <-1.0 및 >-2.5의 T-점수로서 한정되며, 골다공증은 -2.5 이하의 T-점수로서 한정된다.
래트에서 Dkk-1 표적 동역학:
V5-His 표지된 인간(h-) Dkk-1 및 래트(r-) Dkk-1을 수컷 스프래그 다우리 래트에게 1, 5, 10 및 100 ㎍/㎏(h-Dkk-1) 또는 100 ㎍/㎏(r-Dkk-1)으로 정맥 내 일시주사 투여에 의해 투여하였다. h-Dkk-1 동역학은 시험된 용량 범위에 걸쳐 선형이었다. 평균 제거 반감기는 h-Dkk-1의 경우 22.3±6.4 분이고 r-Dkk-1의 경우 34 분이었다.
래트 약동학 및 약역학
암컷 스프래그 다우리 래트에의 매주 정맥 내 투여에 따른 평균 유리/부분 유리 huMabJC18 농도 대 시간 프로파일을 도 7에 나타낸다. 비-구획화 약동학 매개변수를 표 10에 나타낸다. huMabJC18의 약동학은 10 ㎎/㎏까지의 용량에 대해 AUC의 초 비례적인 증가와 함께 용량 범위에 걸쳐 비선형이었다. 이는 보다 높은 용량(10 및 100 ㎎/㎏)에 비해 보다 낮은 용량(0.1 및 1 ㎎/㎏)에서의 보다 높은 제거율을 가리킨다. 나중의 시점에서, 래트들 중 일부에서 혈청 huMabJC18 농도는 예상된 것보다 더 낮거나 상기 분석의 정량분석 한계 이하였다. 래트 항-huMabJC18 항체를 상기 샘플 중에서 정성적인 항-약물 항체(ADA) 분석을 사용하여 확인하였으며 상기 래트로부터의 데이터를 상기 분석 및 플롯으로부터 제거하였다.
huMabJC18의 정맥 내 투여에 따른 스프래그 다우리 래트에서의 유리/부분 유리 huMabJC18 농도에 대한 비 구획화 약동학 매개변수a
용량 (㎎/㎏) AUC
0-168hrs
(㎍.hr/mL)		 Cmaxb
(㎍/㎖)		 Cavec
(㎍/㎖)		 Cmind
(㎍/㎖)
0.1 21.2 ± 2.20 1.81 ± 0.156 0.127 ± 0.0133 <LLOQ
1 850 ± 88.8 24.6 ± 1.60 5.06 ± 0.528 0.205 ± 0.172
10 13300 ± 1000 252 ± 29.7 79.0 ± 5.94 38.7 ± 8.50
100 141000 ± 18700 2660 ± 313 841 ± 110 439 ± 116
a값들을 평균±표준 편차로서 기록하였다
bTmax = 100 ㎎/㎏ 그룹(이때 Tmax 는 하나의 래트에 대해 3 시간이다)을 제외하고 모든 래트에 대해 1 시간
cCave = 1차 투여 간격의 AUC(1차 투여 간격)/tlast(드문드문한 샘플링으로 인해 전체 연구 지속기간에 대한 것은 아님)
dC = 1차 투여 간격(0 내지 168 시간).
동일한 연구에서 평균 유리 Dkk-1 농도를 도 8a 내지 8e에 플롯팅한다. 유리 Dkk-1 농도는 huMabJC18의 래트에의 투여에 이어서 급속히 감소하였다. 거의 최저 용량에서, 유리 Dkk-1 농도는 상기 연구의 지속기간 동안 억제된 채로 치료 유지되었다.
키노몰구스 원숭이 약동학 및 약역학
키노몰구스 원숭이에서 개별적인 유리/부분 유리 혈청 huMabJC18 농도 대 시간 프로파일을 도 9a 및 9b에 나타내고, 키노몰구스 원숭이의 huMabJC18의 비 구획화 약동학 매개변수들을 표 11에 나타낸다. 상기 huMabJC18의 약동학은 상기 시험된 용량 범위에 걸쳐 비선형이었으며 이때 더 높은 제거율 및 더 짧은 반감기가 더 낮은 용량에서 관찰되었다. 키노몰구스 원숭이의 huMabJC18의 반감기 범위는 상기 용량 범위에 걸쳐 1 내지 13일이었다.
단일 정맥 내 투여(n = 1/성별/용량 그룹)에 따른 키노몰구스 원숭이에서의 유리/부분 유리 huMabJC18 농도에 대한 평균 비 구획화 약동학 매개변수
용량
(㎎/㎏)		 AUC
(0-tlast)
(㎍.hr/mL)		 AUC
(0-inf)
(㎍.hr/mL)		 CL
(mL/day/kg)		 Vc
(L/㎏)		 종결
t1/2
(day)		 Cmax
(㎍/mL)
0.1 36.4 37.2a 64.6a 46.3a ~1a 2.32
1 1720 1810 13.8 41.3 2.6, 4.4b 22.3
10 48100 55900 4.56 41.1 12.5 242
100 643000 845000 2.85 32.5 13.3 3040
an = 1, AUC(0-inf) > 120% AUC(0-tlast)로 인해
b개별적인 t½ 값들은 상이한 시간 간격으로부터의 계산들에 기인하여 보고되었다
14일 부근에서 1 ㎎/㎏ 그룹 및 투여 후 21일 부근에서 10 ㎎/㎏ 그룹의 한 마리의 원숭이에서 노출의 손실은 항-huMabJC18 항체의 형성에 기인하는 듯하며 이들 데이터를 상기 분석 및 플롯에서 제거하였다. 그러나, 이를 정성적인 ADA 분석을 사용하여 확인할 수 없었다.
키노몰구스 원숭이에서의 동일한 연구에서 유리 Dkk-1의 평균 혈청 농도를 도 10a 내지 10e에 나타낸다. 유리 Dkk-1 농도는 huMabJC18의 투여에 이어서 급속히 감소하였다. Dkk-1 억제의 지속은 용량 의존적이었으며 더 낮은 용량에서는 기준선으로 복귀하였다. 최고 용량에서, Dkk-1은 전체 투여 간격에 대해 억제된 채로 유지되었다.
PK/PD 모델링
기계적인 TMDD 모델(Mager and Jusko, 2001)을 사용하여 상기 원숭이 및 래트 모두에서의 시간에 대한 유리 huMabJC18 및 유리 Dkk-1 농도를 동시에 대입하였다(도 5). 상기 모델은 항체 비-표적 특이적 제거, 표적 합성 및 대사회전, 및 복합체 형성 및 제거를 설명하므로 선택되었다. 래트에서의 huMabJC18 및 Dkk-1의 관찰 대 예측 PK/PD 프로파일을 도 7 및 8a 내지 8e에 나타내고 원숭이의 경우는 도 9a 및 9b 및 도 10a 내지 9e에 나타낸다. 래트 및 원숭이에 대한 상기 TMDD 모델로부터의 매개변수 추정을 표 12에 나타낸다.
원숭이 및 래트에서 추정된 PK/PD 매개변수들
매개변수 래트 모델로부터 추정 CV(%) 원숭이 모델로부터 추정 CV(%)
V1 mAb (L/㎏) 0.147 1.74 0.052 2.02
kel mAb (일-1) 0.278 3.52 0.051 1.54
t1 /2 mAb (일)a 2.5 유도됨 13.6 유도됨
k12(일-1) 1.03 5.82 0.285 2.70
k21(일-1) 0.842 9.73 0.277 1.25
kon(nM-1일-1)b 49.4 고정됨 316 고정됨
koff(일-1)b 1.72 고정됨 16.2 고정됨
Kd(pM)c 34.8 유도됨 51.3 유도됨
kel 표적(일-1) 93.1 1.05 39 2.18
t1 /2 표적(분)a 11 유도됨 26 유도됨
kel 복합체(일-1) 9.54 1.75 0.613 1.57
t1 /2 복합체(hr)a 1.74 유도됨 26.4 유도됨
a2차 매개변수들을 t1 /2 = 0.693/kel로서 계산하였다
bkon 및 koff을 선행 실험(이때 $COV를 NONMEM에서 획득할 수 없었다)에서 측정하였다. 최종 실험에서, kon 및 koff 추정을 상기 값으로 정하여 $COV를 성취하였다.
c2차 매개변수를 Kd = Koff/Kon로서 계산하였다
래트 및 원숭이의 PK/PD 모델로부터 분배 부피(V1) 및 반감기에 대한 추정은 래트 및 원숭이의 IgG2 항체의 약동학과 일치한다(Peppard and Orlans, 1980; Hinton et al., 2004). 래트 생체 내 효능(Kd = 34.8 pM)의 추정은 상기 래트의 시험관 내에서 획득한 값(Kd < 100 pM, 상기 비아코어 데이터 참조)과 일치한다. 상기 Dkk-1 kel로부터 측정된 Dkk-1 반감기 추정(원숭이에서 26 분, 및 래트에서 11 분)은 상기 V5-his 표지된 h-Dkk-1 및 r-Dkk-1 대사회전 연구(각각 22.3 분 및 34 분, 상기 표적 동역학 섹션 참조)로부터 추정된 값들과 유사하다. 상기 복합체의 반감기(상기 복합체 kel로부터 추정됨)는 상기 항체, huMabJC18과 표적, Dkk-1의 추정된 반감기 사이의 중간이다.
래트의 골 생물 마커 :
상기 표적 Dkk-1 이외에, 골 형성의 잘 확립된 생물 마커인 오스테오칼신, 및 골다공증의 인정된 생물 마커인 골 미네랄 밀도(BMD)를 포함한 다른 생물 마커들을 래트 연구에서 정량분석하였다(Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism(Rosen CJ ed) pages 152-163 and 174-179, American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C, USA). 상기 래트 연구에서 1.5 및 2.5 주 후 1 차 용량에서 오스테오칼신 농도 대 용량의 플롯을 도 11에 나타낸다. 2.5 주 후 1 차 용량에서 1 ㎎/㎏/주 용량 그룹 및 1.5 주 후 용량에서 10 및 100 ㎎/㎏/주 용량 그룹에서 오스테오칼신 농도의 통계학적으로 의미 있는(p<0.05) 증가가 존재한다.
표 13에 나타낸 바와 같이, 전체 골 미네랄 밀도는 10 및 100 ㎎/㎏/주에서 huMabJC18로 처리된 래트에서, 비히클 대조군에 비해 각각 11% 및 16%까지 현저하게 증가하였다.
huMabJC18로 6주간 처리한 암컷 래트의 원위 대퇴골에서 전체 골 미네랄 밀도(BMD)의 변화a
그룹 비히클 0.1 ㎎ 1 ㎎ 10 ㎎ 100 ㎎
BMD 675 ± 18 677 ± 22 713 ± 28 746 ± 24* 784 ± 19**
a데이터를 평균±SE로서 나타낸다
*: p<0.05 대 비히클; **: p<0.01 대 비히클
암컷 래트를 6주간 매주 다양한 용량의 huMabJC18로 정맥 주사에 의해 처리하였다. BMD를 상기 연구의 끝에서 측정하였다.
인간 PKPD 시뮬레이션
메커니즘 기반 PK/PD(TMDD) 모델(도 5)을 사용하여 인간에서의 huMabJC18의 PK/PD를 시뮬레이션하고 다른 질환들 중에서도 특히 골다공증의 치료에 유효한 용량을 예측하였다. IgG2 항체 PK 매개변수(비-표적 매개된)의 문헌 보고된 값들을 상기 원숭이 및 래트 PK/PD 모델링(표 14)으로부터 획득한 Dkk-1 표적 동역학 및 huMabJC18-Dkk-1 복합체 동역학의 지식과 합하여 인간 PK/PD 시뮬레이션에 대한 정보를 제공하였다.
인간 PK/PD 시뮬레이션에 사용된 매개변수 추정
매개변수 값 참고문헌/출처
mAb SC 생물학적 이용효능(%) 75 (Tang et al., 2004)
mAb SC 흡수율 상수(일-1) 0.5 (Tang et al., 2004; Agoram et al., 2007)
mAb 분배 부피(㎖/㎏) 50 (Tang et al., 2004; Agoram et al., 2007)
래트 및 원숭이로부터 상대성장 기준화
mAb(비-특이적) 제거율 상수(일-1) 0.03 (Tang et al., 2004; Hayashi et al., 2007)
래트 및 원숭이로부터 상대성장 기준화
골다공증 환자에서 Dkk-1 수준(ng/㎖) 10.6±6.5
Dkk-1 반감기(분) 49 래트 및 원숭이로부터 상대성장 기준화
mAb-Dkk-1 결합 속도(kon, nM-1 일-1) 112.3 인간 비아코어 데이터
mAb-Dkk-1 해리 속도(koff, 일-1) 0.1728 인간 비아코어 데이터
mAb-Dkk-1 제거율 상수(일-1) 0.3 원숭이로부터 상대성장 기준화
OVX 마우스 질병 모델에서 종래의 실험들은 Dkk-1의 50% 감소가 골 미네랄 밀도의 통계학적으로 의미 있는 증가에 필요함을 가리켰다(데이터 도시 안 됨). 투여 간격에 걸쳐 Dkk-1을 >50% 까지 감소시키는 huMabJC18의 예측된 유효 용량은 매달 1 회 제공 시 3.57 ㎎/㎏이다. 상기 투입된 용량은 내생적인 Dkk-1의 동역학 및 상기 매개변수에 대한 Dkk-1 억제(및 따라서 용량)의 높은 감수성에 대한 불확실성으로 인해 상기 용량과 관련된 불확실성을 갖는다. 최소 예상 생물 효과(MABEL)를 제공하는 것으로 예측된 용량은 0.03 ㎎/㎏이었다. 상기 용량은 Dkk-1 수준을 일시적으로 <20%까지 감소시킨 다음 기준선으로 회복할 것으로 예측된다. 0.003 ㎎/㎏(MABEL의 1/10)의 용량은 효과가 없는 것으로 예측되었다. 이들 Dkk-1 농도의 인간 시뮬레이션을 도 12에 나타내며 이는 임상에서 용량 지정에 큰 가치가 있을 것이다.
huMabJC18의 비선형 약동학은 MABEL(0.03 ㎎/㎏) 및 예측된 유효 용량(3.57 ㎎/㎏)을 포함한 용량 범위에 걸쳐 예측된다. 이는 TMDD에 기인하며 이를 도 13에 나타낸다.
표적 이해
마우스에서의 데이터는 Dkk-1이 골 재형성의 주 조절인자이며(Diarra et al.(2007) Nat Med 13:156-163) Dkk-1 기준선 수준은 건강한 마우스에 비해 질병 상태(난소 절제된, OVX) 마우스에서 대략 5 배 더 높음(내부 데이터)을 가리킨다. Dkk-1 수준은 또한 골 병변을 갖는 다발성 골수종 환자의 골수 혈장 및 말초 혈액에서 상승되는 것으로 나타났다(Tian et al., 2003). 감수성 분석은 항-Dkk-1 단클론 항체(huMabJC18)의 예측된 인간 용량이 Dkk-1 기준선 수준에 매우 민감함을 보였다. 상기 기준선 Dkk-1 수준이 높을수록, Dkk-1을 감소시키는데 필요한 항체의 농도가 커진다. 상기 표적의 기준선 수준은 종종 선행의 임상 측정으로부터 공지되지만, Dkk-1에 대한 상기 정보의 결여는 상이한 임상 개발 단계에서 보다 많은 정보제공 용량 예측에 사용될 수 있는 건강한 피실험자 및 환자 집단(골감소증 및 골다공증 환자) 모두에서 인간 Dkk-1 수준에 대한 기준 범위의 확립을 촉구하였다. 상기 분석은 Dkk-1 수준이 건강한 여성에 비해 골감소증 및 골다공증 여성(T 점수 < -1)에서 더 높음을 보였다.
표적 리간드의 대사회전율은 수분에서 수일까지 다양할 수 있으며 이는 상기 표적의 유효 용량 및 심지어 잠재력에 중대한 영향을 미쳐 임상적 이익을 교란시킬 수 있다. 일부 리간드는 종들 간에 유사한 동역학을 갖지만, 다른 것들의 경우 상기 대사회전은 선험적으로 예측될 수 없다. 문헌[Meno-Tetang and Lowe (2005) Basic Clin Pharmacol Toxicol 96:182-192]은 IgE 대사회전율이 마우스의 5 내지 8 시간에서부터 인간의 2.7일까지의 범위이고 이는 항-IgE 항체의 인간 영향에 대한 예측에 현저하게 영향을 미치는 것을 입증하였다. Dkk-1의 경우 감수성 분석은 항-Dkk-1 단클론 항체(huMabJC18)의 예측 용량이 Dkk-1 반감기에 민감하며 이때 보다 높은 몰 과잉의 항체는 보다 높은 표적 대사회전율을 필요로 함을 입증하였다. 상기 참고문헌으로부터 Dkk-1 대사회전율에 대한 정보를 입수할 수 없었으며 따라서 래트에게 정맥 내로 제공된 V5-his 표지된 인간 및 래트 Dkk-1을 내부적으로 사용하여 실험을 완료하였다. 상기 실험은 Dkk-1이 높은 대사회전율(h-Dkk-1의 경우 22.3 분의 반감기 및 r-Dkk-1의 경우 34 분)을 가지며 Dkk-1의 인간 및 래트 형태는 상기 래트에서 유사한 대사회전율을 가짐을 나타내었다. Dkk-1의 빠른 대사회전율은 huMabJC18을 투여한 래트 및 원숭이에서 Dkk-1 반감기를 평가하기 위한 PK/PD 모델링의 사용에 의해 나중에 확인되었다.
래트 및 원숭이에서 huMabJC18 의 PK / PD 이해
래트 및 원숭이 연구에서, huMabJC18은 보다 낮은 용량에서 보다 높은 제거율 및 보다 짧은 제거 반감기 값을 갖는 비선형 약동학을 나타내었다. 이는 항체와 그의 약물학적 표적과의 상호작용이 보다 낮은 용량에서 약물 성향에 영향을 미치는 표적 매개된 약물 성향(TMDD)을 가리킨다(Tabrizi et al. (2006) Drug Discov Today 11:81-88; Wang et al. (2008) Clin Pharmacol Ther 84:548-558). 상기 경로는 상기 표적의 유한 발현으로 인해 보다 높은 용량에서 포화된다. 상기 표적 매개된 경로의 포화 시, 전형적인 IgG FcRn 이화작용 제거 기전이 우세하며, 이는 상기 항체에게 그의 특징적인 긴 반감기를 제공한다. TMDD는, 수용체 매개된 세포 이물 흡수가 약물 제거를 생성시키는 세포막 상에서 발현되는 단백질에 대해 지정된 단클론 항체에 보다 통상적이다. 그러나, TMDD는 또한 용해성 표적에 대해 관찰될 수 있다, 즉 오말리주맵 및 데노수맵은 비선형 제거 동역학을 나타내는 용해성 표적들(각각 IgE 및 NFkB의 수용체 활성화제)에 대한 항체이다(Hayashi et al., 2007; Marathe et al., 2008).
전신 약물 농도(PD를 개시하는 강제 함수로서 사용된다)를 개시하는 PK 모델로 이루어진 실험적인 PK/PD 모델은 종종 PK와 PD의 상호의존성을 설명하지 못하므로 TMDD를 특성화하는데 적합하지 않다. 약물 PK, 표적 역학 및 이들의 상호작용을 개시하는 단일 모델이 문헌[Mager and Jusko (2001) J Pharmacokinet Pharmacodyn 28:507-532]에 제안되었다. 상기 모델은 약물 분자의 특정 및 불특정 분포 및 제거를 설명할 뿐만 아니라 표적 역학을 설명하기 위한 융통성을 제공한다. PK 및 PD가 동시에 분석된 다른 경우에, 상기 모델을 사용하여 용량, 노출 및 반응 간의 직접적인 연계를 제공하였다(Meno-Tetang and Lowe (2005) Basic Clin Pharmacol Toxicol 96:182-192; Ng et al. (2006) Pharm Res 23:95-103; Wu et al. (2006) J Pharm Sci 95:1258-1268). 이 경우에 상기 TMDD 모델을 또한 여러 용량 수준의 huMabJC18의 IV 투여에 따른 항체, huMabJC18, 및 표적, Dkk-1, 래트 및 원숭이 중의 농도를 동시에 대입하는데 사용하였다. 상기 모델은 각 종들에서 전형적인 IgG2 약동학과 상당히 일치하는 huMabJC18의 비 표적 매개된 약동학의 평가를 제공하였다(Peppard and Orlans (1980) Immunology 40:683-686; Hinton et al. (2004) J Biol Chem 279:6213-6216). 따라서, 상기 제거 반감기는 래트에서 2.5일이고 원숭이에서 13.6일이었다. 분배 부피는 원숭이에서 혈장 부피(0.052 ℓ/㎏)와 대략 동등하였으나 래트의 혈장 부피(0.147 ℓ/㎏)보다는 더 높았다.
표적 Dkk-1의 제거 반감기는 상기 PK/PD 모델링으로부터 래트에서 11 분이고 원숭이에서 26 분인 것으로 평가되었다. 이는 래트에서 측정된 V5-his 표지된 h-Dkk1의 제거 반감기(반감기 = 25 분)와 같은 정도의 크기였다. 상기 huMabJC18-Dkk-1 복합체의 반감기는 huMabJC18 반감기와 Dkk-1 반감기 사이의 중간인 것으로 평가되었으며 이는 표적 매개된 제거 기전을 반영하는 듯하다. 그러나, 상기 항체에 대한 표적의 결합이 FcRn에 대한 항체 결합을 방해하는 것이 가능하며 상기 가설을 시험하기 위해 내부 연구가 실행중이다.
상기 래트에서, 표적 생물 마커, Dkk-1의 감소 이외에 골 형성의 생물 마커(오스테오칼신 및 골 미네랄 밀도)의 증가가 관찰되었다. 상기 데이터는 골다공증과 같은 골격 질환의 치료를 위한 huMabJC18의 용도에 대해 추가의 지지를 제공하였다.
인간 유효 용량의 예측 및 MABEL 의 계산
단클론 항체의 경우, PK/PD 모델링을 기초로 하여 안전한 인간에서 처음 용량의 합리적인 선택이 필수적임은 널리 인식되고 있는 중이다(예를 들어 문헌[the UK government website on Publications policy and guidance: Department of Health - Publication]을 참조하시오). 새로운 매개변수인 최소 예상 생물 효과 수준(MABEL)은 관찰된 전임상 PK/PD 데이터를 PK/PD 모델링 접근법을 기초로 하여 임상 예측에 외삽함을 수반한다. MABEL은, 부작용 수준이 없는 것(NOAEL) 이외에, 최근의 유럽 규제 지침에서 고 위험 치료제의 인간에서 처음 용량 수준을 구상하는데 고려되는 것으로 제시되었다(EMEA (2007) 연구중인 의약품을 사용한 인간에서 처음 임상 시험에 대한 위험을 확인하고 경감시키기 위한 전략에 관한 지침, in (EMEA ed), London).
huMabJC18의 유효 용량을 예측하기 위해서, 래트 및 원숭이에서의 전임상 데이터를 대입하기 위해 사용되는 기계적인 TMDD 모델이 인간 PK/PD 시뮬레이션에 적합하였다. IgG2 항체 약동학 매개변수(비 표적 매개된)의 문헌 보고된 값들을 상기 래트 및 원숭이 PK/PD 모델링으로부터 획득된 Dkk-1 표적 동역학 및 huMabJC18-Dkk-1 복합체 동역학에 대한 지식과 결합시켰다.
인간 Dkk-1에 대한 시험관 내 비아코어 값을 사용하여 상기 모델에서 상기 복합체의 결합 및 해리 속도(kon 및 koff)를 측정하였다. 감수성 분석을 kon 및 koff에 대해 수행하였으며, 인간에서 상기 항체에 대해 예측된 빠른 진행 속도 및 느린 중단 속도와 함께, Dkk-1 억제 및 따라서 용량은 Kd의 꽤 큰 변화에 민감하지 않다. 실제로 Kd 값 <10 pM에서, 예측된 용량의 변화는 없다. 이는 상기 huMabJC18-Dkk-1 복합체의 대사회전율이 상기 수용체로부터의 중단 속도보다 더 빠르기 때문이다. 상기와 같은 경우에, 후보 선택에서 친화성 성숙 단계들을 피할 수 있다.
골다공성 환자로부터의 샘플에서 측정된 평균 Dkk-1 기준선 농도(결과 섹션 참조)를 상기 시뮬레이션에 사용하였다. Dkk-1은 원숭이 또는 래트에 비해 인간에서 더 느린 대사회전율을 갖는 것으로 추정되었다. 따라서, 상기 인간 Dkk-1 반감기를 원숭이 및 래트 반감기 값의 상대성장 기준화를 사용하여 계산하였다. 이는 49 분의 인간에서의 Dkk-1의 추정된 반감기를 제공하였다. Dkk-1은 빠르게 대사 회전하는 항원이므로, Dkk-1의 전체 억제, 및 따라서 용량은 상기 시뮬레이션에 사용된 Dkk-1 반감기에 매우 민감함에 주의해야 한다.
인간에서 상기 huMabJC18-Dkk-1 복합체의 반감기는 상기 원숭이 PK/PD 모델에 의해 추정된 복합체 반감기의 상대성장 기준화에 의해 2.3 일(ke1 = 0.3 일-1)인 것으로 예측되었다. 인간에서 더 짧은 복합체 반감기는 상기 래트 PK/PD 모델링에 의해 추정된 복합체 반감기의 상대성장 기준화에 의해 예측될 수 있다. 그러나, 감수성 분석을 수행하고 Dkk-1 억제(및 따라서 용량)가 래트 대 원숭이로부터 예측된 복합체 반감기의 변화에 민감하지 않았다.
폐경 후 골 손실의 모델인 OVX 마우스에서의 종래의 실험들은 Dkk-1 수준의 대략 50% 감소가 골 미네랄 밀도의 통계학적으로 의미 있는 증가와 관련이 있음을 가리켰다(데이터 도시 안 됨). 따라서, huMabJC18에 대한 용량 예측을, Dkk-1 수준이 상기 투여 간격에 걸쳐(1 개월) 기준선으로부터 >50%까지 억제하는데 필요함을 기초로 하여 수행하였다. 이러한 완화 하에서 상술한 가정과 함께, huMabJC18의 예측된 유효 용량은 개월당 1 회 피하 제공 시 3.57 ㎎/㎏이었다. 시뮬레이션에 의해, 인간에서 최소 효과(MABEL)(Dkk-1에서 <20% 감소)를 제공하는데 예측되는 용량은 0.03 ㎎/㎏이다. 비선형 약동학이 임상에서 예측되며(도 13), 이때 huMabJC18은 TMDD로 인해 더 낮은 용량에서 더 높은 제거 및 더 짧은 반감기를 나타낸다.
인간 약물학을 예측하기 위한 또 다른 접근법은 평형-약물 상호작용 이론에 기초한 식을 사용하여 최대 수용체 점유율(RO)을 예측하는 것이다:
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(도 14, (Duff (2006) Expert Scientific Group on Phase One Clinical Trials: Final Report, in, Department of Health, UK, London)). 상기 방법을 사용한 RO의 추정은 Kd에만 의존하며 표적 또는 mAb-표적 복합체 동역학은 고려하지 않는다. Dkk-1은 높은 대사회전율을 갖는 것으로 나타났으며, huMabJC18에 의한 Dkk-1의 결합은 상기 표적의 동역학(TMDD)을 변화시킨다. 이러한 조건 하에서, RO는 종종 약물학적 평형 접근법에 의해 예측될 수 없으며, 간단한 Kd 근거 RO 계산이 특정한 용량에서 RO를 실질적으로 과 예측하는 것으로 나타났다(Agoram (2009) Br J Clin Pharmacol 67:153-160). Dkk-1의 경우, 상기 평형 식을 사용하여 계산된 RO는 0.00001 ㎎/㎏의 ED50를 추정하는 반면, 기계적인 PK/PD 모델은 0.01 ㎎/㎏의 ED50을 추정한다(도 14). 평형 계산의 사용은 임상에서 너무 느리고 인간에서 처음 연구의 진행을 지연시키는 용량을 선택하게 할 수 있다. 다른 극단에서, 래트 및 원숭이에서 관찰된 NOAEL(100 ㎎/㎏)은 항체에 대한 표적의 100% 결합에 필요한 경우를 초과하며, 이는 임상적인 출발 용량 추정치를 제공하는데 권장될 수 없다. MABEL 용량 계산에 대한 PK/PD 모델 기반 접근법이 Dkk-1을 보다 유사하게 예견하고 임상 연구의 안전성 및 효율을 보장하는 듯하다는 결론을 내렸다.
상기 관찰된 NOAEL(100 ㎎/㎏)은 항체에 대한 Dkk-1의 100% 결합에 필요한 경우를 초과한다. 다른 극단에서, 상기 더프 식에 따라 계산된 MABEL은 Dkk-1의 빠른 대사회전의 고려 부족으로 인해 심하게 과소평가되는 듯하다. 그 자체로서 상기 방법은 상기 경우에 출발 임상 용량을 정하기 위해 허용 가능한 접근법이 아니다. 대조적으로, 상기 TMDD 모델은 Dkk-1의 결합% 측정에 있어서 표적 대사회전의 역할을 가리키는 전임상 데이터의 탁월한 특성화를 제공하였다. 따라서, 상기 TMDD 모델로부터 유도된 MABEL 추정치(0.03 ㎎/㎏)는 FIH 연구의 안전성 및 효율을 모두 보장할 것이다.
결론적으로, huMabJC18은 다른 질환들 중에서도 특히 골다공증의 치료를 위한 인간화된 원형 항-Dkk-1 항체이다. 기계적인 TMDD 모델을 사용하여 래트 및 원숭이에서 huMabJC18 대 Dkk-1 농도 반응 관계를 특성화하였다. 상기 모델을 인간으로 번역하여 표적 발현 및 대사회전율에 대한 정보를 통합시킴으로써 유효 용량 및 MABEL을 예측하였다. 이러한 매개변수들은 상기 기전에 대한 친화성보다 용량 반응 관계에 더 큰 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.
기탁 정보
출원인들은 본 발명에서 huMabJC18로서 표시한 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역들을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC)(미국 버지니아주 20110-2209 만나사스)에 기탁하였다. 상기에 나타낸 바와 같이 상기 huMabJC18 HC 가변 영역은 2009년 3월 19일자로 기탁되었으며 ATCC 기탁 번호 제 PTA-9835 호로 지정되었고, 상기 huMabJC18 LC 가변 영역은 2009년 3월 19일자로 기탁되었으며 ATCC 기탁 번호 제 PTA-9836 호로 지정되었다. 이들 기탁은 특허 절차 및 그에 따른 규제(부다페스트 조약)를 목적으로 미생물의 기탁에 관한 국제 승인에 대한 부다페스트 조약의 조항 하에서 이루어졌다. 이들 기탁은 30년의 기간 또는 가장 최근의 의뢰 후 5년 또는 유효 특허 수명 동안(어느 것이든 더 긴 것) 상기 ATCC 기탁기관에서 제한 없이 유지될 것이며, 상기 기탁물이 상기 기간 동안 비실용적으로 되는 경우 대체될 것이다. 상기 기탁된 물질의 이용성을 임의의 정부의 권한 하에서 상기 정부의 특허법에 따라 허여된 권리에 위반하여 본원의 임의의 태양을 실행할 허가로서 해석해서는 안 된다. 상기 서면의 명세서는 당해 분야의 숙련가가 본원의 모든 태양들을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 생각된다. 본원은, 상기 기탁된 실시태양이 본원의 몇몇 태양들의 단일 예시로서 의도되기 때문에, 상기 기탁된 물질에 의한 범위로 제한되지 않으며 작용적으로 동등한 임의의 구조물들은 본원의 범위 내에 있다. 본 발명 물질의 기탁은 본 발명의 서면 설명이 최선의 방식을 포함하여 본원의 임의의 태양의 실시를 가능하게 하기에 부적합하다는 인정을 구성하는 것도 아니고, 청구의 범위를 상기가 나타내는 특정 예시들로 제한하는 것으로서 해석해서도 안 된다. 실제로, 본 발명에 도시되고 개시된 것들 이외에 본원의 다양한 변경들은 상기 설명으로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것이며 이는 첨부된 청구의 범위 내에 있다.
본 발명에 사용된 섹션 제목들은 단지 편성을 목적으로 하며 개시된 주제를 어떠한 식으로도 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 본 발명의 교시에 논의된 온도, 농도, 시간 등의 앞에 "약"이 수반되며, 따라서 약간의 실질적이지 않은 일탈이 본 발명의 교시의 범위 내에 있음을 알 것이다. 본 출원에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 나타내지 않는 한 복수를 포함한다. 또한 "포함하다", "포함하는", "함유하다", "함유하는", "구성하다", 및 "구성하는"의 사용은 제한을 의미하는 것이 아니다. 전술한 일반적인 설명 및 다음의 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적인 것이며 본 발명을 제한하는 것이 아니다.
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아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA-9835 20090319 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 PTA-9836 20090319
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atgccaagac aaagccacgg gaggagcagt tcaacagcac gttccgtgtg 960 gtcagcgtcc tcaccgtcgt gcaccaggac tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag 1020 gtctccaaca aaggcctccc atcctccatc gagaaaacca tctccaaaac caaagggcag 1080 ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac caagaaccag 1140 gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1200 agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacacctc ccatgctgga ctccgacggc 1260 tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1320 ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa gagcctctcc 1380 ctgtctccgg gtaaa 1395 <210> 36 <211> 465 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequence <400> 36 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Val Ser Gly 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sequence <400> 43 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asp Phe 20 25 30 Gly Ile Ser Phe Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Gly Ser Lys Gln Gly Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Lys 85 90 95 Glu Val Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 115 120 125 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 145 150 155 160 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 180 185 190 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 195 200 205 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 44 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric human mouse sequence <400> 44 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Val Ser Gly Thr Gly Leu Gly Phe Gln Thr Tyr Tyr Pro Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Thr Ser Leu Glu Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val 115 120 125 Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala 195 200 205 Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 210 215 220 Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro 290 295 300 Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val 305 310 315 320 Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr 325 330 335 Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys 340 345 350 Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp 355 360 365 Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser 385 390 395 400 Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala 405 410 415 Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His 420 425 430 His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 45 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized sequence <400> 45 gagatcgtgc tgacccagag ccccgccacc ctgagcctga gccctggcga gcgggccacc 60 ctgtcctgcc gggccagcga gagcgtggac gacttcggca tcagcttcat caactggtat 120 cagcagaagc ccggccaggc ccccagactg ctcatctacg ccggcagcaa gcagggcagc 180 ggcatccccg ccaggttcag cggcagcggc tccggcaccg acttcaccct gaccatctcc 240 agcctcgaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agctgaaaga ggtgcccccc 300 accttcggcg gtgggaccaa ggtggaaatc aaa 333 <210> 46 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric human mouse sequence <400> 46 gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga 60 ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg 120 aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc 180 aaagacagca cctacagcat gagcagcacc ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga 240 cataacagct atacctgtga ggccactcac aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc 300 ttcaacagga atgagtgtta g 321 <210> 47 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric human mouse sequence <400> 47 gaggtgcagc tggtcgagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc agctacgcca tcagctgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtggccagc gtgagcggca ccggcctggg cttccagacc 180 tactaccccg acagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacaacgc caagaacagc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgcgggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccacc 300 tccctggaaa actacgcctt cgactactgg ggccagggaa ccacggtcac cgtctcctca 360 <210> 48 <211> 975 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chimeric human mouse sequence <400> 48 gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60 tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120 tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct ggagtctgac 180 ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagcc ctcggcccag cgagaccgtc 240 acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300 gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360 cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420 gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480 gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540 agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600 aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660 aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720 agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780 aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatgaacac gaatggctct 840 tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900 acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960 tctcctggta aatga 975 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huMabJC18 Kabat heavy chain CDR1 <400> 49 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huMabJC18 Chothia heavy chain CDR1 <400> 50 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 1 5 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huMabJC18 Chothia heavy chain CDR2 <400> 51 Ser Val Ser Gly Thr Gly Leu Gly Phe Gln Thr Tyr 1 5 10 <210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> huMabJC18 Chothia heavy chain CDR3 <400> 52 Ser Leu Glu Asn Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5

Claims (18)

  1. Dickkopf(Dkk-1) 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하고, 단클론 항체 JC18과 동일한 Dkk-1 상의 에피토프에 결합하는 항원 결합 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 면역학적으로 작용성인 단편.
  2. 서열식별번호: 30, 49 또는 50에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 상보성 결정 영역 1(CDR1), 서열식별번호: 32 또는 51에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 및/또는 서열식별번호: 34 또는 52에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 또는 VH CDR1, VH CDR2 및/또는 VH CDR3 중에 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는, Dkk-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    서열식별번호: 22에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) CDR1, 서열식별번호: 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열식별번호: 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 추가로 포함하는 항체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역이 서열식별번호: 28에 나타낸 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 가변 영역이 서열식별번호: 20에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 항체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    서열식별번호: 40 또는 36의 C-말단 리신과 함께 또는 상기 리신 없이, 서열식별번호: 42 또는 38에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열식별번호: 40 또는 36에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  6. 서열식별번호: 22에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL) 상보성 결정 영역 1(CDR1), 서열식별번호: 24에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및/또는 서열식별번호: 26에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3, 또는 VL CDR1, VH CDR2 및/또는 VL CDR3 중에 하나 이상의 보존적인 아미노산 치환을 포함하는 그의 변이체를 포함하는, Dkk-1에 특이적으로 결합하는 단리된 항체.
  7. 제 3 항에 따른 항체 또는 면역학적으로 활성인 단편의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및/또는 VL CDR3을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
  8. 제 4 항에 따른 항체 또는 면역학적으로 활성인 단편의 VH, VL, 또는 상기 VH와 VL 모두를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
  9. 제 5 항에 따른 항체 또는 면역학적으로 활성인 단편의 경쇄, 중쇄, 또는 상기 경쇄와 중쇄 모두를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
  10. 제 6 항에 따른 항체 또는 면역학적으로 활성인 단편의 VL CDR1, VL CDR2 및/또는 VL CDR3을 암호화하는 서열을 포함하는 핵산.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  12. 제 11 항에 따른 발현 벡터를 포함하는 단리된 세포.
  13. 제 12 항에 따른 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 항체 또는 그의 면역학적으로 활성인 단편의 제조 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편 및 약학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 조성물.
  15. 골 질량 손실의 치료 또는 예방이 필요한 환자에게 유효량의 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 투여함을 포함하는, 골 질량 손실의 치료 또는 예방 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    환자가 골다공증, 골감소증, 파제트병, 치주염, 류마티스성 관절염, 및 부동화로 인한 골 손실을 앓고 있는 환자들 중에서 선택되는 방법.
  17. 증가된 골 질량의 유도가 필요한 환자에게 유효량의 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 투여함을 포함하는, 증가된 골 질량의 유도 방법.
  18. Wnt 활성의 유도가 필요한 환자에게 유효량의 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 단편을 투여함을 포함하는, Wnt 활성의 유도 방법.
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