KR20110137384A - 분석 방법 및 분석 디바이스 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 분석 디바이스는 용액을 균일하게 전개할 수 있고, 고정밀도 및 고감도 측정을 행할 수 있다. 제 1 디바이스 부품(10)은 제 2 불용성 담체(12) 및 제 3 불용성 담체(13)를 제 1 불용성 담체(11)의 검출 부위(14)에서 서로 오버랩핑되는 방식으로 유지한다. 이들 3개의 담체(11, 12, 13)는 서로 접촉하지 않는 상태로 수용된다. 검출 부위(14)와 대향하는 제 2 디바이스 부품(20)의 내면 상에는 검출 부위(14)와 평행한 가압면(18a)을 갖는 가압부(18)가 제공된다. 상기 가압면(18a)은 상기 검출 부위(14)를 향해서 가압함으로써 변위되고, 상기 제 1 불용성 담체(11) 위로부터 상기 제 2 불용성 담체(12)와 상기 제 3 불용성 담체(13)를 상기 제 1 불용성 담체(11)로 가압한다. 상기 제 1 디바이스 부품(10) 및 상기 제 2 디바이스 부품(20)을 조합한다.

Description

분석 방법 및 분석 디바이스{METHOD AND DEVICE FOR ASSAY}
본 발명은 분석 대상물을 포함하는 시료를 고감도 및 고정밀도로 정성 분석 및 정량 분석을 행할 수 있는 분석 방법 및 분석 디바이스에 관한 것이다.
최근에는 시료 용액을 개발함으로써 시료 용액에 함유된 피분석물을 검출할 수 있는 간단한 각종 디바이스가 제안되어 있다. 또한, 체외 진단 시약 및 각종 독 검출 디바이스 등이 시판되고 있다. 일례로는 면역 크로마토그래피를 사용한 디바이스가 있다. 면역 크로마토그래피에 있어서는 판정 및 측정에 중후한 설비/기기를 필요로 하지 않고, 조작이 간단하다. 면역 크로마토그래피에 있어서, 측정 결과는 피분석물을 포함할 수도 있는 시료 용액을 담체 상에 적하하고, 상기 시료 용액을 약 5~10분 동안 방치하여 유지함으로써만 얻을 수 있다. 따라서, 면역 크로마토그래피는 간단하고 신속한 방법이고, 높은 특이성으로의 판정 및 측정이 가능하다. 따라서, 면역 크로마토그래피는 예를 들면 병원에서의 임상 검사 또는 연구실에서의 검정 시험 등에 널리 사용되고 있다.
한편, 천연물, 독소, 호르몬, 및 살충제 등의 많은 생리 활성 물질 및 환경 오염 물질은 그 물질의 양이 극미량이어서 종래의 일반적인 면역 크로마토그래피 방법을 사용하여 검출할 수 없는 경우라도 생체에 작용한다. 따라서, 물질을 신속하고 용이하게 그리고 고감도로 검출할 수 있는 면역 크로마토그래피가 요구된다. 이 목적을 위해서, 피분석물을 포함하는 시료 용액을 담체에 적하하는 간단한 공정 이외에 예를 들면 하기 방법을 이용하여 피분석물을 검출한다. 피분석물을 포함하는 시료 용액을 담체에 적하하여 피분석물을 담체에 고정화한 후, 시료 용액을 세정 용액(세정액)으로 세정한다. 또한, 고정화된 피분석물을 반응 기질 용액, 증폭 용액 등과 접촉하도록 배치시켜 피분석물로부터 출력된 증폭 신호를 검출한다.
예를 들면, 일본 미심사 특허 공개 No. 2002-202307(특허 문헌 1)에는 피분석물을 고감도로 분석할 수 있는 면역 크로마토그래피가 개시되어 있다. 이 방법에 있어서는 검출 부위에 금속 콜로이드 등의 증폭액을 적하한다. 또한, 일본 특허 No. 3309977(특허 문헌 2)에는 신호를 검출하는 방법이 개시되어 있다. 이 방법에 있어서는 피분석물을 포함하는 시료 용액을 효소 표지 항체와 접촉되도록 배치한 후, 상기 시료 용액을 피분석물 포착 시약이 결합된 고상 담체에 흘려 보낸다. 따라서, 피분석물-효소 표지 항체가 담체에 결합한다. 또한, 효소 기질 용액을 고상 담체에 흘려 효소 기질 반응을 일으키고, 신호를 검출한다.
상기 특허 문헌 1 및 특허 문헌 2에 개시되어 있는 면역 크로마토그래피에 있어서, 신호는 효소 또는 은에 의해 증폭될 수 있다. 따라서, 미량의 피분석물을 분석하는 것이 가능하다.
그러나, 상기 특허 문헌 1 및 특허 문헌 2에 개시되어 있는 면역 크로마토그래피에 있어서는 친수성/소수성 및 정전적 상호 작용 등의 분자간 상호 작용의 차로 인해서 효소 기질 용액, 금속 콜로이드 증폭액 등의 신호 증폭액, 또는 세정액 등의 다른 용액의 성분이 고상 담체에 균일하게 송액되지 않을 수도 있다. 따라서, 고상 담체에 있어서 반응을 평등하게 또는 균일하게 진행하는 것이 곤란하다. 그러므로, 고정밀도 및 고감도 검출이 제한된다.
상기 상황의 관점에서, 본 발명의 목적은 용액(액체)을 균일하게 전개할 수 있고, 고정밀도 및 고감도 측정을 행할 수 있는 분석 방법 및 분석 디바이스를 제공하는 것이다.
본 발명의 분석 방법은 하기 공정:
적어도 1종의 피분석물을 포함하는 시료 용액을 피분석물과 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 불용성 담체 상의 검출 부위에 송액하는 공정; 및
시약 용액, 증폭 용액, 및 검출 용액 중 적어도 1종을 상기 검출 부위에 송액하는 공정을 포함하는 시료 용액에 포함된 피분석물의 정량 또는 정성 분석을 행하기 위한 분석 방법으로서, 상기 불용성 담체와 상기 불용성 담체와 대향하는 면을 갖는 부재 사이의 간극에 상기 시약 용액, 증폭 용액, 및 검출 용액 중 적어도 1종을 주입하여 충전하는 분석 방법이다.
본 발명의 분석 디바이스는:
피분석물에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 검출 부위를 갖는 제 1 불용성 담체가 수용된 제 1 디바이스 부품 및 상기 제 1 디바이스 부품에 용액을 주입하기 위한 구멍을 갖는 제 2 디바이스 부품을 포함하는 복합 부품을 포함하는 분석 디바이스로서, 상기 제 2 디바이스 부품이 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위와 대향하는 면을 갖는 부위를 포함하는 분석 디바이스이다.
본 발명의 분석 디바이스는:
피분석물에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 검출 부위를 갖는 제 1 불용성 담체가 수용된 제 1 디바이스 부품 및 상기 제 1 디바이스 부품에 용액을 주입하기 위한 구멍을 갖는 제 2 디바이스 부품을 포함하는 복합 부품에 용액을 전개하기 위한 제 2 불용성 담체 및 용액을 흡수하기 위한 제 3 불용성 담체가 수용된 분석 디바이스로서, 상기 제 2 불용성 담체 및 상기 제 3 불용성 담체를 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위에서 서로 오버랩핑시키는 방식으로 유지하는 동시에 상기 제 1 불용성 담체, 상기 제 2 불용성 담체 및 상기 제 3 불용성 담체는 서로 접촉하지 않는 방식으로 수용되고, 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위와 대향하는 가압면을 갖는 가압부가 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위와 대향하는 상기 제 2 디바이스 부품에 설치되어 있고, 상기 가압면은 상기 검출 부위를 향해서 가압됨으로써 변위되어 상기 제 1 불용성 담체 상측으로부터 상기 제 2 불용성 담체와 상기 제 3 불용성 담체를 상기 제 1 불용성 담체에 대해 가압하는 것을 특징으로 하는 분석 디바이스이어도 좋다.
상기 가압부가 상기 검출 부위를 향해서 가압되었을 때의 상기 검출 부위와 상기 가압면 사이의 간극은 0.01~1mm 범위인 것이 바람직하다.
상기 가압부와 대향하는 상기 제 1 디바이스 부품의 내면에는 상기 가압부의 일부와 접촉함으로써 상기 가압면의 변위를 규제하는 리브가 설치되어 있는 것이 바람직하다.
상기 제 1 디바이스 부품 및/또는 상기 상기 제 2 디바이스 부품 중 적어도 하나에는 상기 검출 부위와 상기 가압면 사이의 간극에 용액을 송액할 수 있는 용액 저장 포트가 설치되어 있다. 또한, 상기 용액 저장 포트는 라미네이트 필름으로 밀봉되는 것이 바람직하고, 상기 용액 저장 포트에는 은 이온을 포함하는 증폭 용액이 주입되어 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 분석 방법에 있어서, 적어도 1종의 피분석물을 포함하는 시료 용액을 및 시약 용액, 증폭 용액, 및 검출 용액 중 적어도 1종을 피분석물과 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 불용성 담체 상의 검출 부위에 송액함으로써 상기 시료 용액에 포함된 피분석물의 정량 또는 정성 분석을 행한다. 상기 분석법에 있어서는 상기 불용성 담체와 상기 불용성 담체와 대향하는 면을 갖는 부재 사이의 간극에 시약 용액, 증폭 용액, 및 검출 용액 중 적어도 1종을 주입하여 충전하고, 이것은 상기 간극의 모세관 작용 또는 힘에 의해 용액을 균일하게 전개할 수 있다. 따라서, 고밀도 및 고감도의 측정을 행하는 것이 가능해진다.
도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 분석 디바이스의 분해 개략 모식도이다.
도 2는 불용성 담체가 저장되기 전에 제 1 디바이스 부품의 구조를 나타내는 개략 모식도이다.
도 3은 제 2 디아비스 부품의 내면의 구조를 나타내는 개략 모식도이다.
도 4는 도 1의 IV-VI선에 따른 단면도이다.
도 5는 가압부와 밀봉 파열부가 모두 가압된 상태를 나타내는 개략 단면도이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 따른 분석 디바이스를 도면을 참조하여 상세하게 설명할 것이다. 도 1은 본 발명의 분석 디바이스의 일례를 나타내는 개략 모식도이다. 도 1은 면역 분석(면역학적 분석)을 행할 수 있는 분석 디바이스의 분리 상태를 설명한다. 도 2는 불용성 담체가 장전되기 전의 제 1 디바이스 부품의 구조를 나타내는 개략 모식도이다. 도 3은 제 2 디바이스 부품의 내면의 구조를 나타내는 개략 모식도이다. 도 4는 도 1의 IV-VI선에 따른 디바이스의 단면을 나타내는 도면이다. 하기 설명에 있어서, 샌드위치 분석을 면역 분석의 일례로서 사용한다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 샌드위치 분석에 특별하게 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 경쟁 분석 등의 다른 종류의 면역 분석에 적절하게 적용되어도 좋다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 분석 디바이스(1)는 수직으로 결합된 제 1 디바이스 부품(10) 및 제 2 디바이스 부품(20)을 포함한다. 제 1 디바이스 부품(10)은 제 1 불용성 담체(11), 용액(도포 또는 분배 용액 또는 액체)을 전개하기 위한 제 2 불용성 담체 및 용액(액체)을 흡수하기 위한 제 3 불용성 담체를 수용한다. 제 1 불용성 담체(11)는 피분석물에 특이적으로 결합하는 특이 결합 물질을 포함하는 검출 부위(14)를 갖는다.
제 1 디바이스 부품(10)은 제 2 불용성 담체(12) 및 제 3 불용성 담체(13)를 제 1 불용성 담체(11)의 측면에 제공되는 리브(15)의 오목부(절단 또는 흠집)에 의해 유지된다. 제 2 불용성 담체(12) 및 제 3 불용성 담체(13)는 그들이 제 1 불용성 담체(11)의 검출 부위(14)에서 서로 오버랩핑시키는 방식으로 유지한다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이 제 1 불용성 담체(11), 제 2 불용성 담체(12) 및 제 3 불용성 담체(13)는 그들이 서로 접촉하지 않는 상태로 수용된다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이 제 1 불용성 담체(11) 아래에는 제 1 불용성 담체(11)의 검출 부위(14)를 제 1 디바이스 부품(10)의 외면(외부)(분석 디바이스(1)의 이면 또는 저면)으로부터 관찰하기 위한 관찰 윈도우(16)가 제공된다. 또한, 제 2 불용성 담체(12) 아래에는 세정 용액 저장 포트(17)가 제공되고, 세정 용액 저장 포트(17)의 상부는 라미네이트 필름으로 밀봉되어 있다.
제 2 디바이스 부품(20)의 외면 상에 시료 용액 주입 구멍(31) 및 증폭 용액 저장 포트 수용 부위(33)가 제공된다. 시료 용액 주입 구멍(31)은 제 1 디바이스 부품(10)에 수용되는 제 1 불용성 담체(11)를 향해서 피분석물을 포함하는 시료 용액을 주입하는데 사용된다. 제 1 불용성 담체(11)에 증폭 용액을 공급하기 위한 증폭 용액 저장 포트(32)는 증폭 용액 저장 포트 수용 부위(33)에 설치된다. 증폭 용액 저장 포트(32)는 증폭 용액 저장 포트(32)에 증폭 용액이 충전된 상태로 라미네이트 필름으로 밀봉된다. 증폭 용액 저장 포트(32)는 증폭 용액 저장 포트의 밀봉 부위가 아래를 향하도록 해서 증폭 용액 저장 포트 수용 부위(33)에 설치된다. 또한, 증폭 용액 저장 포트 수용 부위(33)에 밀봉 파열 추정 부위(도시하지 않음)가 제공된다. 증폭 용액 저장 포트(32)에 충전된 증폭 용액이 제 1 불용성 담체에 공급되는 경우, 증폭 용액 저장 포트(32)가 가압되면 밀봉 파열 추정 부위는 증폭 용액 저장 포트(32)의 라미네이트 필름을 파열시킬 수 있다.
또한, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이 제 2 디바이스 부품(20)의 내면에 가압면(18a)을 갖는 가압부(18)가 제공된다. 가압부(18)는 제 1 불용성 담체(11)의 검출 부위(14)와 대향하고, 가압면(18a)은 제 1 불용성 담체(11)의 검출 부위(14)와 평행하다. 가압부(18)가 검출 부위(14)를 향해서 가압되는 경우, 가압면(18a)이 변위하고, 제 1 불용성 담체(11)의 상부로부터 제 1 불용성 담체(11) 상으로 제 2 불용성 담체(12) 및 제 3 불용성 담체(13)를 그들이 제 1 불용성 담체(11)와 접촉하도록 가압한다. 또한, 가압부(18)는 제 1 불용성 담체(11)와 가압면(18a) 사이에 간극을 형성한다.
또한, 제 2 디바이스 부품(20)의 내명 상에는 증폭 용액 주입 구멍(35)이 제공된다. 증폭 용액 주입 구멍(35)은 증폭 용액 저장 포트 수용 부위(33)에 상응하는 위치에 제공된다. 밀봉 파열 추정 부위가 증폭 용액 저장 포트(32)의 라미네이트 필름을 파열하는 경우, 증폭 용액 주입 구멍(35)을 통해 증폭 용액 저장 포트(32)의 증폭 용액이 제 1 불용성 담체(11)와 가압면(18a) 사이에 형성된 간극으로 송액된다. 증폭 용액이 제 1 디바이스 부품(11)의 제 1 불용성 담체(11)의 검출 부위(14)로 송액되는 위치에 증폭 용액 주입 구멍(35)이 제공된다.
제 2 디바이스 부품(20)의 외면 상에 가압 부위(34)가 제공된다. 가압 부위(34)는 가압부(18)에 상응하는 위치에 제공된다. 또한, 제 2 디바이스 부품(20)의 내면 상에는 세정 용액 저장 포트(17)의 상부를 밀봉하는 라미네이트 필름을 파열하기 위한 밀봉 파열 부위(19a)가 제공된다. 제 1 디바이스 부품(10)의 세정 용액 저장 포트(17)를 대향하는 위치에 밀봉 파열 부위(19a)가 제공된다. 또한, 제 2 디바이스 부품(20)의 외면에 밀봉 파열 부위(19a)를 가압하기 위한 밀봉 파열부(19)가 제공된다.
제 1 불용성 담체(11)는 시료 첨가 패드(21), 표지 물질 유지 패드(22), 크로마토그래피 담체(23), 및 흡수 패드(24)를 포함한다. 시료 용액은 시료 첨가 패드(21) 상에 적하된다. 피분석물 또는 특이적 결합 물질에 결합할 수 있는 표지 물질, 특히 피분석물에 특이적으로 결합하는 표지 물질은 표지 물질 유지 패드(22)에 고정화된다. 크로마토그래피 담체(23)는 피분석물에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 검출 부위(14)를 포함한다. 흡수 패드(24)는 흡수 패드(24)로 송액된 시료 용액을 흡수한다. 여기에서, 설명을 간단히 하기 위해서 검출 부위(14)에 1개의 검출 라인(14a)만이 제공되는 경우를 설명할 것이다. 그러나, 각각 다른 특이적 결합 물질을 포함하는 복수개의 검출 라인이 제공되어도 좋다. 복수개의 검출 라인이 제공되는 경우, 시료 용액에 포함된 복수종의 피분석물은 하나의 분석법(프로세스)로 검출할 수 있다. 또한, 제어를 위한 특이적 결합 물질이 고정화된 부위(제어 부위 또는 영역)가 필요에 따라 크로마토그래피 담체(23)에 제공되어도 좋다.
이어서, 본 발명의 분석 디바이스를 사용함으로써 피분석물을 검출하는 방법의 순서를 설명할 것이다. 여기에서, 용액으로서 시료 용액이 사용되고, 시약 용액으로서 세정 용액 및 증폭 용액이 사용되는 경우를 예로서 설명할 것이다. 우선, 시료 용액을 제 2 디바이스 부품(20)의 시료 용액 주입 구멍(31)을 통해 주입하고, 제 1 디바이스 부품(10)에 수용된 제 1 불용성 담체(11)의 시료 추가 패드(21) 상으로의 스팟 적용에 의해 적하한다. 적하된 시료 용액은 제 1 불용성 담체(11)의 모세관력에 의해 표지 물질 유지 패드(22)를 향해서 송액된다. 표지 물질 유지 패드(22)는 피분석물에 결합할 수 있는 표지 물질을 포함하므로, 시료 용액의 피분석물은 시료 용액이 표지 물질 유지 패드(22)를 통해 송액되는 동안 상기 표지 물질에 의해 표지된다.
표지 피분석물은 모세관력 의해 크로마토그래피 담체(23)를 향해서 더 이동하고, 특이적 결합 물질이 고정화된 부위인 검출 라인(14a)에서 포착된다. 구체적으로는 검출 라인(14a)에 (특이적 결합 물질)-피분석물-(표지 물질)의 복합체가 형성된다. 검출 라인(14a)에 포착되지 않은 피분석물, 피분석물에 결합되지 않은 미반응 표지 물질 등은 흡수 패드(24)에 의해 흡수된다. 시료 용액을 송액하는 공정에 있어서, 도 4에 나타낸 바와 같이 제 1 불용성 담체(11)는 제 2 불용성 담체(12)와도 제 3 불용성 담체(13)와도 접촉하지 않는다. 제 1 불용성 담체(11)는 제 2 불용성 담체(12)와도 제 3 불용성 담체(13)와도 접촉하지 않으므로, 제 1 불용성 담체(11)에만 시료 용액을 송액할 수 있다. 시료 용액은 제 2 불용성 담체 및 제 3 불용성 담체(13)에 침윤되지 않는다. 그러므로, 그 양이 미량이고 한정되어 있는 시료 용액을 낭비하지 않고 검출 라인(14a)에 포착할 수 있다.
이어서, 피분석물에 특이적으로 결합하지 않고 검출 라인(14a)에 잔존하고 있는 미반응 표지 물질 등은 세정에 의해 크로마토그래피 담체(23)로부터 제거한다. 그 프로세스는 도 5를 참조하여 설명할 것이다. 도 5는 도 4에 있어서 가압부 및 밀봉 파열부가 모두 가압되는 상태를 나타내는 개략적 단면도이다. 세정 공정에 있어서, 제 2 디바이스 부품(20)의 외면 상에 제공되는 가압 부위(34)는 제 1 디바이스 부품(10)을 향해서 가압된다. 따라서, 제 2 디바이스 부품(20)의 내면 상에 제공되는 가압부(18)의 가압면(18a)이 변위하고, 크로마토그래피 담체(23)는 제 2 불용성 담체 및 제 3 불용성 담체(13)와 부분적으로 접촉하게 된다.
이 때, 가압부(18)에 형성된 오목부(18b)가 리브(15)에 접촉하므로 가압면(18a)의 변위가 조절된다. 따라서, 크로마토그래피 담체(23)와 가압면(18a) 사이에 간극(틈)(P)이 형성된다. 간극(P)은 약 0.01mm~1mm 범위인 것이 바람직하다. 간극이 0.1mm 미만인 경우, 후술되는 증폭 용액 등이 간극에 침윤되는 것이 곤란하다. 간극이 1mm를 초과하는 경우, 모세관력이 작용하지 않고, 세정 용액, 증폭 용액 등을 균일하게 전개하는 것이 곤란하다. 따라서, 리브(15) 및 가압부(18)는 크로마토그래피 담체(23)와 가압면(18a) 사이의 간극이 상기 범위 내가 되도록 구성되는 것이 바람직하다.
한편, 제 1 디바이스 부품(10)에 있어서의 세정 용액 저장 포트(17)에 세정 용액이 충전된다. 제 2 디바이스 부품(20)의 외면 상에 제공되는 밀봉 파열부(19)가 가압되는 경우, 밀봉 파열 부위(19a)는 세정 용액 저장 포트(17)의 상부를 밀봉하는 라미네이트 필름을 파열한다. 또한, 제 2 불용성 담체(12)의 일단이 세정 용액 저장 포트(17)의 세정 용액에 침지된다. 또한, 세정 용액은 제 2 불용성 담체(12), 제 1 불용성 담체(11), 및 제 3 불용성 담체(13)의 모세관련에 의해 제 2 불용성 담체(12)로부터 제 1 불용성 담체(11) 및 제 3 불용성 담체(13)로 송액된다.
또한, 상술한 바와 같이 시료 용액의 유로(제 1 불용성 담체(11))와 세정 용액의 유로(제 2 불용성 담체(12) 및 제 3 불용성 담체(13)) 사이의 겹침 정도는 최소이다. 따라서, 시료 용액이 송액되는 동안 미결합 피분석물 및 시료 용액에 포함된 불순물은 시료 용액이 송액되는 방향에 있어서 하류(흡수 패드(24))에 축적되더라도 그들은 다시 검출 부위에 흐르지 않는다. 그러므로, 다량의 세정 용액을 사용하지 않고 검출 부위를 효율적으로 세정하여 고정밀도의 검출을 행할 수 있다.
이어서, 검출 부위(14)에 제 2 디바이스 부품(20)에 제공된 증폭 용액 저장 포트(32)로부터 증폭 용액이 송액된다. 제 1 디바이스 부품(10)을 향해서 증폭 용액 저장 포트(32)를 가압함으로써 증폭 용액이 송액된다. 증폭 용액 저장 포트(32)가 가압되는 경우, 증폭 용액 저장 포트 수용 부위(33)에 제공되는 밀봉 파열 추정 부위는 증폭 용액 저장 포트(32)의 바닥의 라미네이트 필름을 파열한다. 따라서, 증폭 용액은 제 2 디바이스 부품(20)의 내면 상에 제공되는 증폭 용액 주입 구멍(35)을 통해 제 1 불용성 담체(11)의 검출 부위(14)를 향해서 송액된다. 이 때, 크로마토그래피 담체(23)와 가압면(18a) 사이에는 간극이 존재한다. 상기 간극(P)이 존재하므로 증폭 용액가 크로마토그래피 담체(23)로 균일하게 송액된다. 따라서, 검출 부위(14)에 포착된 복합체의 표지 물질은 균일하게 증폭된다. 또한, 증폭 용액은 검출 부위(14)에 수직으로 송액된다. 증폭 용액이 이러한 방법으로 송액되는 경우, 증폭 용액의 사용량을 감소시킬 수 있다.
증폭 후, 제 1 디바이스 부품(10)의 관찰 윈도우(16)를 통해 검출 라인(14)을 시각적으로 또는 광원 등을 이용하여 관찰 및 측정한다. 따라서, 고정밀도 및 고감도로 피분석물을 검출할 수 있다.
상기 실시형태에는 복수종의 용액(이 경우 3종의 용액), 즉 시료 용액, 세정 용액(시약 용액) 및 증폭 용액을 사용하는 경우가 기재되어 있다. 그러나, 복수종의 용액의 조합은 시료 용액이 포함되지 않는 한 한정되지 않는다. 본 발명은 예를 들면 시료 용액, 증폭 용액 및 검출 용액의 조합, 또는 시료 용액, 시약 용액 및 검출 용액의 조합 등에 적용되어도 좋다.
이어서, 본 발명의 분석 디바이스에 사용되는 시료 용액 및 시약 용액 등의 각종 용액, 표지 물질, 불용성 담체 등이 설명될 것이다.
(시료 용액)
본 발명의 분석 디바이스에 의해 분석될 수 있는 시료 용액은 시료 용액이 피분석물(천연물, 독소 및 호르몬 등의 생리 활성 물질 또는 환경 오염 물질 등)을 포함할 수 있는 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 시료 용액은 생물학적 시료이어도 좋다. 구체적으로는 생물학적 시료의 희석액 또는 건조된 생물학적 시료의 희석액은 후술되는 희석제를 사용하여 얻어져도 좋다. 예를 들면, 생물학적 시료는 동물(특히, 인간)의 체액(예를 들면, 혈액, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 눈물액, 땀, 뇨, 고름, 콧물, 및 객담), 배설물(예를 들면, 대변), 장기, 조직, 점막, 피부, 장기, 조직, 점막 또는 스킨을 포함할 수도 있는 스와브 시료(스와브), 양치 시료, 식물, 동물 등이어도 좋다.
시료 용액은 더 가공하지 않고 직접 사용되어도 좋다. 또한, 적절한 추출용 용매를 사용함으로써 시료 용액으로부터 추출 용액을 얻음으로써 추출 용액을 사용해도 좋다. 또한, 적절한 희석제를 사용하여 추출 용액을 희석함으로써 추출 용액의 희석액을 사용해도 좋다. 또한, 적절한 방법을 사용하여 추출 용액을 농축함으로써 추출 용액의 농축 용액을 사용해도 좋다. 검출 용매로서는 일반적으로 면역 분석에 사용되는 용매(예를 들면, 물, 생리 식염수, 완충 용액 등)를 사용해도 좋다. 또한, 상기 용매로 희석함으로써 특이적 결합 반응(예를 들면, 항원-항체 반응)을 직접 행할 수 있는 수혼화성 유기 용매를 사용해도 좋다.
(표지 물질)
본 발명에서 사용되어도 좋은 표지 물질은 그 물질이 색에 의해 구별할 수 있거나 또는 반응에 의해 검출할 수 있는 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 면역 크로마토그래피에서 일반적으로 사용되는 금속 미립자, 착색 라텍스 입자, 효소 등을 사용해도 좋다. 촉매로서 표지 물질을 사용한 금속 이온의 환원 반응을 이용하여 표지 물질 상에 금속을 증착시켜 신호를 증폭시키는 경우, 금속 미립자의 촉매 활성이 높으므로 표지 물질은 금속 미립자인 것이 바람직하다.
금속 미립자로서는 금속 콜로이드, 금속 황화물, 다른 금속 합금, 금속을 함유하는 폴리머 입자 표지 등을 사용해도 좋다. 입자(또는 콜로이드)의 평균 입경은 1nm~10㎛ 범위인 것이 바람직하다. 금속 미립자의 예로는 금 콜로이드, 은 콜로이드, 백금 콜로이드, 철 콜로이드, 알루미늄히드록시드 콜로이드, 그들의 착체 콜로이드 등이 있다. 금속 미립자는 금 콜로이드, 은 콜로이드, 백금 콜로이드 또는 그들의 착체 콜로이드인 것이 바람직하다. 선택적으로, 적절한 직경을 갖는 금 콜로이드 및 은 콜로이드는 각각 적색 및 황색이고, 쉽게 동정할 수 있고 구별할 수 있으므로 금 콜로이드 및 은 콜로이드를 사용해도 좋다. 금속 콜로이드의 평균 입경은 약 1~500nm 범위인 것이 바람직하다. 선택적으로, 평균 입경은 1~100nm 범위이어도 좋다.
(특이적 결합 물질)
특이적 결합 물질은 그 특이적 결합 물질이 피분석물에 대해 친화성을 갖는 한 특별하게 한정되지 않는다. 특이적 결합 물질의 일례로는 항체가 있다. 예를 들면, 피분석물로 면역화된 동물의 혈청으로부터 제조되는 항혈청, 항혈청으로부터 정제되는 면역 글로불린 획분, 피분석물로 면역화된 동물의 비장 세포를 사용한 세포 융합에 의해 얻어지는 단일 클론 항체, 및 그 단편(예를 들면, F(ab')2, Fab, Fab' 또는 Fv)을 사용해도 좋다. 이러한 항체는 일반적인 방법을 사용하여 제조해도 좋다.
(표지 물질의 신호 증폭)
표지 물질로서 금속 콜로이드 표지, 금속 황화물 표지, 금속 합금 표지, 금속 등을 포함하는 폴리머 입자 표지를 사용하여 분석을 행하는 경우, 금속계 표지의 신호를 증폭할 수 있다. 구체적으로, 피분석물과 표지 물질의 복합체가 형성된 후 상기 복합체는 은 이온 및 환원제와 접촉된다. 은 이온은 무기 은염 및 유기 은염 등의 은을 포함하는 화합물로부터 공급된다. 은 이온이 환원제에 의해 환원되어 은 입자가 형성된다. 은 입자는 핵으로서 금속계 표지 상에 침착된다. 따라서, 금속계 표지로부터의 신호가 증폭되어 피분석물의 고감도 분석이 가능하다.
(제 1 불용성 담체)
도 1에 나타낸 바와 같이, 제 1 불용성 담체(이하, 면역 크로마토그래피용 스트립이라고도 칭함)는 피분석물에 결합할 수 있는 특이적 결합 물질을 포함하는 적어도 1개의 검출 라인을 포함한다. 제 1 불용성 담체는 전개 방향의 상류측으로부터 하류측을 향해서 시료 첨가 패드, 표지 물질 유지 패드, 크로마토그래피 담체, 및 흡수 패드로 나누어진다. 시료 첨가 패드, 표지 물질 유지 패드, 크로마토그래피 담체, 및 흡수 패드는 이 순서로 점착 시트 상에 배치된다. 면역 크로마토그래피용 스트립으로서 다공성 물질을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 니트로셀룰오로스막, 셀룰로오스막, 아세틸셀룰로오스막, 폴리술폰막, 폴리에테르술폰막, 나일론막, 유리 섬유, 부직포, 천, 실 등을 사용해도 좋다(각각의 패드 및 크로마토그래피 담체용 재료는 후술될 것이다).
크로마토그래피 담체에 있어서, 피분석물에 특이적으로 결합하는 특이적 결합 물질을 고정화함으로써 검출 라인을 형성한다. 선택적으로, 필요에 따라 크로마토그래피 담체에 컨트롤 부위가 형성되어도 좋다. 특이적 결합 물질은 물리적 결합(흡착 등) 또는 화학적 결합에 의해 크로마토그래피 담체의 일부에 직접 고정화되어도 좋다. 또한, 특이적 결합 물질은 라텍스 입자 등의 미립자에 물리적 또는 화학적으로 결합되어도 좋고, 상기 미립자는 크로마토그래피 담체의 일부에 포착 또는 고정화되어도 좋다. 선택적으로, 특이적 결합 물질이 크로마토그래피 담체에 고정된 후, 크로마토그래피 담체는 예를 들면 불활성 단백질 등을 사용함으로써 비특이적 흡착을 방지하도록 가공되어도 좋다.
표지 물질 유지 패드는 상기 표지 물질을 포함하는 현탁액을 제조하고, 적절한 패드를 상기 현탁액으로 코팅하고, 상기 현탁액이 도포된 패드를 건조함으로써 제조되어도 좋다. 표지 물질 유지 패드의 재료는 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유, 부직포 등이어도 좋다.
시료 첨가 패드는 피분석물을 포함하는 시험 시료가 스폿 적용 등에 의해 적하되는 부분이다. 또한, 시료 첨가 패드는 시료 중의 불용성 입자 등을 여과하는 기능도 갖는다. 시료 첨가 패드의 재료는 셀룰로오스 여과지, 유리 섬유, 폴리우레판, 폴리아세테이트, 셀룰로오스아세테이트, 나일론, 및 면포 등의 균일한 특성을 갖는 재료이어도 좋다. 그러나, 시료 첨가 패드의 재료는 이들 재료에 한정되는 것은 아니다. 선택적으로, 시료 첨가 패드 상에 비특이적 흡착 방지 프로세스가 미리 행해져도 좋다. 비특이적 흡착 방지 프로세스를 행하여 분석 동안 시료 첨가 부위(패드)의 재료 상에 시료 중에 존재하는 피분석물이 비특이적으로 흡착하는 것을 방지하고, 분석의 정확도가 저하되는 것을 방지한다.
흡수 패드는 첨가된 시료가 크로마토그래피 이동에 의해 물리적으로 흡수되는 부위이다. 또한, 흡수 패드는 크로마토그래피 담체의 검출 부위에 고정화되지 않은 미반응 표지 물질 등을 제거한다. 흡수 패드의 재료는 예를 들면 셀룰로오스 여과지, 부직포, 천 및 셀룰로오스아세테이트 등의 흡수성 재료이어도 좋다. 첨가된 시료의 선단이 흡수 부위(패드)에 이른 후 크로마토그래피의 속도는 흡수 재료의 종류, 크기 등에 따라 다르다. 따라서, 적절하게 흡수 패드를 선택함으로써 피분석물의 측정에 적절한 속도를 설정할 수 있다.
(제 2 불용성 담체-송액용 불용성 담체)
제 2 불용성 담체는 세정액 등이 모세관력에 의해 제 1 불용성 담체에 송액되는 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 유리 섬유 패드, 셀룰로오스막, 니트로셀룰로오스막 등이 사용되어도 좋다.
(제 3 불용성 담체-흡수용 불용성 담체)
제 3 불용성 담체는 제 1 불용성 담체에 침윤된 세정액 등을 흡수할 수 있는 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스, 유리 섬유, 또는 그들의 혼합물을 사용해도 좋다.
(시약 용액)
용어 "시약 용액"은 증폭 용액 또는 검출 용액의 보충 기능을 갖는 시약(약품 등)을 포함하는 용액을 나타낸다. 분석에 있어서 세정 기능을 갖는 용액, 즉 세정 용액도 시약 용액이다. 예를 들면, 증폭 용액이 후술되는 은 이온 용액인 경우, 은 이온의 환원제로서 작용하는 하이드로퀴논 용액, 철 이온 용액 등이 시약 용액으로서 사용되어도 좋다. 증폭을 위해 퍼옥시다아제(퍼옥시다아제 효소)를 사용하는 경우, 과산화수소 용액이 시약 용액이다. 또한, 분석 시스템에 있어서 세정 기능을 갖는 세정 용액도 시약 용액이다.
세정 용액은 특이적으로 결합하지 않고 크로마토그래피 담체 내에 잔존하는 표지 물질, 즉 크로마토그래피 담체 내에 비특이적으로 잔존하는 표지 물질이 세정될 수 있는 한 특별하게 한정되지 않는다. 예를 들면, 단순한 물, 또는 에탄올 등의 용매를 단독으로 사용해도 좋다. 또한, 1% BSA를 포함하는 PBS 완충액, 계면활성제 용액(계면활성제) 등을 사용해도 좋다. 또한, 세정 용액으로서 후술되는 은 이온을 포함하는 용액, 또는 은 이온의 환원제를 포함하는 용액을 사용해도 좋다. 전개 동안에 세정 용액은 비특이적으로 잔존하는 표지 물질을 세정한다. 따라서, 표지 물질은 전개 프로세스 도중의 세정 용액에 포함되게 된다. 그러나, 세정 용액의 세정 효과는 표지 물질을 포함하지 않는 경우 보다 높으므로 전개 이전의 표지 물질을 포함하지 않는 세정 용액을 사용한다. 또한, 세정 효과를 증가시키기 위해서 세정 용액의 pH를 조정해도 좋다. 또한, 계면활성제, BSA 등의 단백질, 폴리에틸렌글리콜 등의 고분자 폴리머를 포함하는 세정 용액을 사용해도 좋다.
(증폭 용액)
증폭 용액은 표지 물질 또는 피분석물을 갖는 용액 중에 있어서 시약 또는 약품의 촉매 반응에 의해 착색 화합물, 발광 등을 제조한다. 증폭 용액은 신호를 증폭시킬 수 있다. 증폭 용액은 예를 들면 은 이온 용액, 페닐렌디아민 화합물 및 나프톨 화합물 용액 등이다. 은 이온 용액은 물리적 현상에 의해 금속 은을 금속 표지 상에 석출시킨다. 페닐렌디아민 화합물 및 나프톨 화합물의 용액은 퍼옥시다아제 표지 및 과산화수소의 작용에 의해 염료가 된다.
구체적으로, 사진 화학 분야의 일반 서적(예를 들면, "Revised Basic Photographic Engineering, Silver Salt Photography", Society of Photograhic Science and Technology of Japan, Colona Publishing Co., Ltd., "Phtographic Chemistry", A. Sasai, Shashin Kogyo Shuppan, 또는 "Latest Formulation Handbook", S. Kikuchi, et al., Amiko Shuppan)에 기재되어 있는 소위 현상액(현상 용액)을 사용해도 좋다. 본 발명에 있어서, 증폭 용액은 특별하게 한정되지 않는다. 은 이온을 포함하고, 금속 콜로이드 등을 현상 핵으로서 사용하여 용액 중 은 이온을 환원하는 소위 임의의 물리적 현상액을 증폭 용액으로서 사용해도 좋다.
이어서, 증폭 용액으로서 은 이온 포함 화합물, 은 이온의 환원제 등을 설명할 것이다.
(은 이온 포함 화합물)
은 이온 포함 화합물로서는 유기 은염, 무기 은염, 또는 은 착체를 사용해도 좋다. 선택적으로, 예를 들면 물 등의 용매에 용해도가 높은 은 이온 포함 화합물인 질산은, 아세트산은, 락트산은, 티오황산은 등을 사용해도 좋다. 질산은을 상기 화합물로서 사용하는 것이 바람직하다. 은 착체는 히드록실기 또는 술폰기 등의 수용성기를 포함하는 리간드로 배위된 것이 바람직하다. 예를 들면, 히드록시티오에테르은 등을 사용해도 좋다.
유기 은염 및 은 착체 중의 은은 검출 영역의 면적당 일반적으로 0.001mol/㎡~0.2mol/㎡이고, 선택적으로 0.01mol/㎡~0.05mol/㎡이다.
(은 이온의 환원제)
은 이온의 환원제로서, 은 이온이 은으로 환원될 수 있는 한 임의의 종류의 무기 재료 또는 유기 재료 또는 그들의 혼합물을 사용해도 좋다.
무기 환원제로서, Fe2 +, V2 + 및 Ti3 + 등의 금속 이온에 의해 원자가가 변화될 수 있는 환원성 금속염 또는 환원성 금속 착체를 사용하는 것이 바람직하다. 무기 환원제를 사용하는 경우, 산화된 이온과 착체를 형성하거나 또는 산화된 이온을 환원함으로써 산화된 이온을 제거 또는 무해화할 필요가 있다. 예를 들면, 환원제로서 Fe2 +를 사용하는 시스템에 있어서 산화된 이온은 시트르산 또는 EDTA를 사용하여 산화물인 Fe3 +와의 착체를 형성함으로써 무해화해도 좋다. 본 발명의 시스템에 있어서, 상술한 바와 같은 무기 환원제를 사용하는 것이 바람직하다. 선택적으로, Fe2 +를 포함하는 금속염을 사용해도 좋다.
습식 할로겐화은 감광 재료로서 사용되는 현상 기제(예를 들면, 메틸갈레이트, 하이드로퀴논, 치환 하이드로퀴논, 3-피라졸리돈, p-아미노페놀, p-페닐렌디아민, 힌더드 페놀, 아미도옥심, 아진, 카테콜, 피로갈롤, 아스코르브산(또는 그 유도체), 및 류코 염료)를 사용해도 좋다. 또한, 미국 특허 No. 6,020,117에 기재되어 있는 재료 등 본 분야의 당업자에게 잘 알려져 있는 다른 재료를 사용해도 좋다.
환원제로서 아스코르브산 환원제를 사용하는 것이 바람직하다. 유효한 아스코르브산 환원제는 아스코르브산, 그 상동체, 그 이성체, 및 그 유도체이어도 좋다. 예를 들면, D-아스코르브산 또는 L-아스코르브산 및 그들의 당 유도체(예를 들면, γ-락토아스코르브산, 글루코아스코르브산, 퓨코아스코르브산, 글루코헵타아스코르브산, 및 말토아스코르브산), 아스코르브산나트륨, 아스코르브산칼륨, 이소아스코르브산(또는 L-에리스로아스코르브산), 및 그 염(예를 들면, 알칼리 금속염, 암모늄염, 또는 본 분야에 공지되어 있는 염), 및 엔디올형 아스코르브산, 엔아미놀형 아스코르브산, 티오엔올형 아스코르브산 등을 사용해도 좋다. 이들 환원제 중에서도, D-아스코르브산, L-아스코르브산, 및 D,L-아스코르브산(및 그들의 알칼리 금속염), 및 이소아스코르브산(및 그들의 알칼리 금속염)이 바람직하다. 또한, 나트륨염도 바람직한 염이다. 또한, 이들 환원제의 혼합물을 필요에 따라 사용해도 좋다.
(검출 용액)
용어 "검출 용액"은 표지 물질, 피분석물 등에 반응하는 제제를 포함하는 용액을 나타내고, 이러한 반응에 의해 검출 용액은 변화한다. 예를 들면, 용액 중의 착색 화합물의 제조 또는 발광의 발생 등에 의해 검출 용액의 색이 변화한다. 예를 들면, 검출 용액은 피분석물로서의 칼슘 이온과 착체를 형성함으로써 색을 나타내는 오르토크레졸프탈레인컴플렉손이어도 좋다. 또한, 검출 용액은 피분석물로서의 단백질과 반응하여 색을 변화하는 구리 이온 용액이어도 좋다. 또한, 피분석물에 특이적으로 결합하는 표지화 착체의 용액도 검출 용액으로서 사용해도 좋다. 예를 들면, 하이브리다이제이션에 의한 DNA 및 RNA 검출을 위한 표지화 DNA 및 표지화 RNA, 항원 감지 입자 및 항원 검출을 위한 항체 표지화 효소 등을 사용해도 좋다.
(기타 조제)
시약 용액, 검출 용액, 및 증폭 용액 이외에 기타 조제를 사용해도 좋다. 용액은 상기 조제로서 완충제, 항산화제 또는 유기 안정제 등의 방부제, 또는 속도 조절제를 포함해도 좋다. 완충제의 예로는 아세트산, 시트르산, 수산화나트륨, 그 염, 또는 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 사용한 완충제, 및 일반적 화학 실험에 사용되는 다른 완충제가 있다. 완충제를 사용하여 증폭 용액의 pH를 적절한 값으로 조정할 수 있다.
이어서, 본 발명의 분석 디바이스의 실시예를 상세하게 설명할 것이다.
[실시예 1]
(1) A형 및 B형 인플루엔자 검출용 면역 크로마토그래피용 스트립의 제작
(1-1) 항 A형 인플루엔자 및 항 B형 인플루엔자 항체 수식 금 콜로이드의 제작
(1-1-1) 항 A형 인플루엔자 항체 수식 금 콜로이드의 제작
50mM KH2PO4 완충제(pH 7.5) 1ml를 지름 50nm 금 콜로이드 용액(EM. GC50, BBI, Ltd.) 9ml에 첨가하여 용액의 pH를 조정했다. 또한, 상기 금 콜로이드 용액에 90㎍/ml 항 A형 인플루엔자 모노클로날 항체(Anti-Influenza A SPTN-57307, Medix Biochemica) 용액 1ml를 첨가하고 교반했다. 교반 후, 혼합물을 10분 동안 방치하여 유지하고, 1% 폴리에틸렌글리콜(PEG Mw. 20000, Product No. 168-11285, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 수용액 550㎕를 상기 혼합물에 첨가하고, 교반했다. 또한, 10% 소 혈청 알부민(BSA Fraction V, Product No. A-7906, SIGMA) 수용액 1.1ml를 첨가하고, 교반했다. 상기 용액을 8000xg, 4℃에서 30분 동안 원심분리(himacCF16RX, Hitachi)했다. 약 1ml의 용액이 남도록 상청을 제거했다. 초음파 세정기를 사용하여 금 콜로이드를 재분산시켰다. 이어서, 금 콜로이드 보존 용액(20mM Tris-HCl 완충제(pH 8.2), 0.05% PEG(Mw. 20000), 150mM NaCl, 1% BSA, 및 0.1% NaN3) 20ml에 상기 용액을 분산시키고, 약 1ml의 용액이 남도록 재차 원심분리했다. 초음파 세정기를 이용하여 금 콜로이드를 재차 분산시켜 항체 수식 금 콜로이드(50nm) 용액을 얻었다.
(1-1-2) 항 B형 인플루엔자 항체 수식 금 콜로이드의 제작
50mM KH2PO4 완충제(pH 8.0) 1ml를 지름 50nm 금 콜로이드 용액(EM. GC50, BBI, Ltd.) 9ml에 첨가하여 용액의 pH를 조정했다. 또한, 상기 금 콜로이드 용액에 80㎍/ml 항 B형 인플루엔자 모노클로날 항체(MONOTYPE aby Influenza B Virus(nuclear) Purified 1131, ViroStar, Inc.) 용액 1ml를 첨가하고 교반했다. 교반 후, 혼합물을 10분 동안 방치하여 유지하고, 1% 폴리에틸렌글리콜(PEG Mw. 20000, Product No. 168-11285, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 수용액 550㎕를 상기 혼합물에 첨가하고, 교반했다. 또한, 10% 소 혈청 알부민(BSA Fraction V, Product No. A-7906, SIGMA) 수용액 1.1ml를 첨가하고, 교반했다. 상기 용액을 8000xg, 4℃에서 30분 동안 원심분리(himacCF16RX, Hitachi)했다. 약 1ml의 용액이 남도록 상청을 제거했다. 초음파 세정기를 사용하여 금 콜로이드를 재분산시켰다. 이어서, 금 콜로이드 보존 용액(20mM Tris-HCl 완충제(pH 8.2), 0.05% PEG(Mw. 20000), 150mM NaCl, 1% BSA, 및 0.1% NaN3) 20ml에 상기 용액을 분산시키고, 약 1ml의 용액이 남도록 재차 원심분리했다. 초음파 세정기를 이용하여 금 콜로이드를 재차 분산시켜 항체 수식 금 콜로이드(50nm) 용액을 얻었다.
(1-2) 금 콜로이드 항체 유지 패드(표지 물질 유지 패드)의 제작
상기 프로세스 (1-1)에서 제작된 항 A형 인플루엔자 항체 수식 금 콜로이드 용액 및 항 B형 인플루엔자 항체 수식 금 콜로이드 용액을 1:1로 혼합하고, 520nm에서 희석 용액의 OD(광학 밀도)가 3.0이 되도록 금 콜로이드 코팅액(20mM Tris-HCl 완충제(pH 8.2), 0.05% PEG(Mw: 20000) 및 5% 슈크로오스) 및 물로 희석했다. 8mm×150mm 크기로 자른 유리 섬유 패드(Glass Fiber Conjugated Pad, Millipore)에 상기 용액을 균일하게 도포하고, 용액 0.8ml를 각각의 패드에 도포했다. 상기 패드를 감압 하에 하룻밤 건조하여 금 콜로이드 항체 유지 패드를 얻었다.
(1-3) 항체 고정화막(크로마토그래피 담체)의 제작
하기와 같이 25mm×200mm로 자른 니트로셀룰로오스막(HiFlow Plus HF120 with plastic lining, Millipore) 상에 항체를 고정화함으로써 항체 고정화막을 제작했다. 상기 막의 긴변을 하측으로 배치하고, 1.5mg/ml로 조제된 고정화용 항 A형 인플루엔자 모노클로날 항체(Anti-Influenza A SPTN-5 7307, Medix Biochemica)의 용액을 막의 바닥으로부터 7mm 위치에 도포했다. 잉크젯 방식의 도포기(BioDot Ltd.)를 이용하여 상기 용액을 약 0.7mm의 폭을 갖는 라인 형태로 도포했다. 마찬가지로, 막의 바닥으로부터 10mm 위치에 1.5mg/ml로 조제된 고정화용 항 B형 인플루엔자 모노클로날 항체(MONOTOPE aby Influenza B Virus (nuclear) Purified 1131, ViroStat, Inc.)의 용액을 약 0.7mm의 폭을 갖는 라인 형태로 도포했다. 마찬가지로, 막의 바닥으로부터 13mm 위치에 0.5mg/ml로 조제된 컨트롤용 항 마우스 IgG 항체(항 마우스 IgG(H+L), 토끼 F(ab')2, Product No. 566-70621, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)의 용액을 라인 형태로 도포했다. 도포막을 50℃에서 30분 동안 열풍 건조기에 의해 건조했다. 상기 막을 배트 중에서 블로킹 용액(0.5wt% 카세인(우유 유도 제품, Product No. 030-01505, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))을 포함하는 50mM 붕산 완충액(pH 8.5) 500ml에 침지하고, 30분 동안 방치하여 유지했다. 이어서, 막을 상기 배트와 동일한 다른 배트로 이동시키고, 배트 중에서 세정 안정화 용액(0.5wt% 슈크로오스 및 0.05wt% 콜산나트륨을 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충액) 500ml에 침지하고, 40분 동안 방치하여 유지했다. 막을 용액으로부터 제거하고, 실온에서 하룻밤 건조하여 항체 고정화막(라인 코팅 또는 도포)을 제공했다.
(1-4) 면역 크로마토그래피용 스트립의 제작
상기 (1-3) 프로세스에서 제작된 항체 고정화막을 백 점착 시트(20mm×150mm, ARcare9020, NIPPN TechnoCluster, Inc.)에 서로 3mm 오버랩핑되도록 부착시켰다. 이 때, 백 점착 시트를 항 A형 인플루엔자 항체측 상의 막의 긴변에 부착시켰다. 이어서, 상기 (1-2) 프로세스에서 제작된 금 콜로이드 항체 유지 패드를 항체 고정화막에 서로 3mm 겹치도록 부착시켰다. 시료 첨가 패드(18mm×150mm로 자른 유리 섬유 패드(Glass Fiber Conjugate pad, Millipore))를 백 점착 시트의 막이 부착되지 않은 긴 변에 맞추어 금 콜로이드 항체 유지 패드가 시료 첨가 패드에 의해 고정 또는 피복되도록 부착했다. 또한, 백 점착 시트(20mm×150mm) 및 흡수 패드(20mm×150mm)를 막의 부위가 백 점착 시트와 흡수 패드 사이에 고정되도록 막의 컨트롤 라인을 위한 항 마우스 IgG 항체에 부착시켰다. 상술한 바와 같이 이들 요소를 경쟁하도록 위치시킨 부재(면역 크로마토그래피 주요 부재)를 guillotine 커터(CM4000, NIPPN TechnoCluster, Inc.)를 이용하여 잘라냈다. 얻어진 스트립의 폭이 7mm가 되도록 그 짧은 변에 평행하게 상기 부재를 잘라냈다. 따라서, 7mm×60mm의 크기를 갖는 면역 크로마토그래피용 스트립을 제작했다.
(1-5) 은 증폭 용액의 제작
(1-5-1-1) 환원제 용액 A의 제작
물 290g에 질산철(III) 9수화물(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 095-00995)을 용해시킴으로써 1mol/l 질산철 수용액 23.6ml를 제작했다. 또한, 시트르산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 038-06925) 13.1g을 상기 용액에 첨가했다. 이들을 모두 용해시킨 후, 교반기를 사용하여 교반하면서 질산(10wt%) 36ml를 첨가했다. 또한, 황산암모늄철(II) 6수화물(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 091-00855) 60.8g을 상기 용액에 첨가하여 환원제 용액 A를 얻었다.
(1-5-1-2) 환원제 용액 B의 제작
물 290g에 질산철(III) 9수화물(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 095-00995)을 용해시킴으로써 1mol/l 질산철 수용액 23.6ml를 제작했다. 또한, 시트르산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 038-06925) 13.1g, 도데실아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 123-00246) 0.2g, 및 1,12-도데칸디아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 042-25702) 0.2g을 상기 용액에 첨가했다. 이들을 모두 용해시킨 후, 교반기를 사용하여 교반하면서 질산(10wt%) 36ml를 첨가했다. 또한, 황산암모늄철(II) 6수화물(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 091-00855) 40.5g을 상기 용액에 첨가하여 환원제 용액 B를 얻었다.
(1-5-1-3) 환원제 용액 C의 제작
물 320g에 질산(10wt%) 36ml, 도데실아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 123-00246) 0.2g, 및 1,12-도데칸디아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 042-25702) 0.2g을 상기 용액에 용해시켰다. 이들을 모두 용해시킨 후, 교반기를 사용하여 교반하면서 질산(10wt%) 36ml를 첨가했다. 또한, 황산암모늄철(II) 6수화물(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 091-00855) 30.4g을 상기 용액에 첨가하여 환원제 용액 C를 얻었다.
(1-5-2-1) 은 이온 용액 A의 제작
물 66g에 질산은 용액(질산은 10g 포함) 8ml 및 1mol/l 질산철 수용액 24ml를 첨가했다. 또한, 물 47.6g에 질산 5.9ml, 도데실아민(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 123-00246) 0.1g, 및 계면활성제 C12H25-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.1g을 용해시켜 미리 제조한 용액과 상기 용액을 혼합하여 은 이온 용액 A를 얻었다.
(1-5-2-2) 은 이온 용액 B의 제작
물 90g에 질산은 용액(질산은 10g 포함) 8ml를 첨가했다. 또한, 물 47.6g에 질산(10wt%) 5.9ml, 및 계면활성제 C12H25-C6H4-O-(CH2CH2O)50H 0.1g을 용해시켜 미리 제조한 용액과 상기 용액을 혼합하여 은 이온 용액 B를 얻었다.
(1-5-2-3) 은 이온 용액 C의 제작
물 82g에 질산은 용액(질산은 10g 포함) 16ml를 첨가했다. 또한, 물 47.6g에 질산(10wt%) 5.9ml, 및 아세틸렌글리콜계 계면활성제, Surfinol 465(Nisshin Chemical Industry Co., Ltd.) 0.1g을 용해시켜 미리 제조한 용액과 상기 용액을 혼합하여 은 이온 용액 C를 얻었다.
<실시예 1>
(분석 디바이스의 제작)
도 1에 나타낸 바와 같이, 면역 크로마토그래피용 스트립을 도 2에 나타낸 제 1 디바이스 부품(10)(사출 성형에 의해 폴리프로필렌으로 이루어짐)에 장전했다. 또한, 제 2 불용성 담체(12) 및 제 3 불용성 담체(13)로서 유리 섬유 패드(Glass Fiber Conjugated Pad, Millipore)를 제 1 디바이스 부품(10)에 장전했다. 한편, 상기 (1-5-1) 프로세스에서 제조된 환원제 용액 150㎕를 세정 용액 저장 포트(17)에 넣고, 세정 용액 저장 포트(17)를 알루미늄 라미네이트 시트(NewADM, Sunrise Co.)를 이용하여 열 라미네이트에 의해 밀봉했다. 또한, 제 2 디바이스 부품(20)을 제 1 디바이스 부품(10)에 맞추었다. 한편, 상기 (1-5-2) 프로세스에서 제조된 은 이온 용액 110㎕를 증폭 용액 저장 포트(32)에 넣고, 증폭 용액 저장 포트(32)를 알루미늄 라미네이트 시트로 밀봉했다. 증폭 용액 저장 포트(32)는 도 1에 나타낸 바와 같이 포트 수용 부위(33)에 장착되었다.
(항원 용액의 스폿 적용 및 전개)
시료 용액으로서 Quick S-Influ AㆍB "Seiken" 음성/양성 컨트롤(Product No. 322968, DENKA SEIKEN Co., Ltd.)을 사용했다. 1질량% BSA를 포함하는 PBS 완충액으로 양성 컨트롤 용액을 희석했다. 시판 면역 크로마토그래피 검출 키트 "Capillia Flu AㆍB(Alfresa Pharma Corporation)를 사용한 Quick S-Influ AㆍB "Seiken"의 검출 한계는 A형 및 B형 모두 1/40이었다. 여기에서, 1질량% BSA를 포함하는 PBS 완충액을 사용하여 A형 양성 컨트롤 희석 계열 1/80, 1/160, 1/320, 1/640, 1/1280, 1/2560, 1/5120을 시료 용액으로서 조제했다. 또한, 조제된 시료 용액 140㎕를 시료 용액 주입 구멍을 통해 적하하고, 10분 동안 방치하여 유지했다.
(제 2 불용성 담체 및 제 3 불용성 담체의 가압)
시료 용액을 10분 동안 전개한 후, 제 2 디바이스 부품(20)의 가압 부위(34)를 10N의 힘으로 가압하여 제 2 디바이스 부품(20)을 굽혀서 송액용 불용성 담체를 막 상으로 가압했다. 이 때, 가압량(가압에 의한 변위의 거리)은 제 1 디바이스 부품(10)의 리브(15)와 제 2 디바이스 부품(20) 사이의 접촉에 의해 제한된다. 리브(15)의 높이는 제 2 디바이스 부품(20)에 의해 면역 크로마토그래피용 스트립(제 1 불용성 담체(11))의 막 표면과 접촉하도록 배치되는 송액용 불용성 담체의 부위가 두께 0.2mm로 압출되도록 조정했다. 또한, 제 2 디바이스 부품(20)의 가압부의 형상은 면역 크로마토그래피용 스트립(제 1 불용성 담체(11))의 막 표면과 제 2 디바이스 부품의 가압면(18a) 사이의 간극이 0.005mm가 되도록 조정했다.
(세정)
송액용 불용성 담체를 가압한 후 30초가 지났을 때, 제 2 디바이스 부품(20)의 밀봉 파열부(19)를 가압했다. 밀봉 파열부(19)는 송액용 불용성 담체와 함께 알루미늄 시트를 파열시키고, 상기 불용성 담체(12)는 환원제 용액에 침지시켰다. 따라서, 환원제 용액을 면역 크로마토그래피용 스트립에 전개하고, 상기 용액을 3분 동안 송액했다. 이 공정을 통해, 면역 크로마토그래피용 스트립을 환원제 용액 A에 침지시켰다. 또한, 특이적으로 흡착되지 않은 재료를 세정했다.
(증폭 용액에 의한 신호의 증폭)
제 2 디바이스 부품(20)에 장전된 용액 저장 포트(32)를 가압하여 볼록부에 의해 밀봉을 파열시켰다. 따라서, 은 이온 용액 A를 용액 저장 포트(32)로부터 배출시켜 주입 구멍을 통해 투입했다. 은 이온 용액 A를 막 표면과 제 2 디바이스 부품의 가압부 사이의 간극에 장전하고, 1분 동안 검출 라인에 흡착된 금 콜로이드 표지를 증폭시켰다.
환원제 용액 B 및 은 이온 용액 B의 조합에 관해서, (세정) 및 (증폭 용액에 의한 신호의 증폭)은 상기 프로세스와 동일하게 행했다. 또한, 환원제 용액 C와 은 이온 용액 C의 조합에 관해서 (세정) 및 (증폭 용액에 의한 신호의 증폭)은 상기 프로세스와 동일하게 행했다.
<실시예 2>
면역 크로마토그래피용 스트립(제 1 불용성 담체(11))의 막 표면과 제 2 디바이스 부품의 가압부 사이의 간극이 0.2mm가 되도록 제 2 디바이스 부품의 가압부의 형태를 조정하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증폭을 행했다.
<실시예 3>
면역 크로마토그래피용 스트립(제 1 불용성 담체(11))의 막 표면과 제 2 디바이스 부품의 가압부 사이의 간극이 1mm가 되도록 제 2 디바이스 부품의 가압부의 형태를 조정하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증폭을 행했다.
<실시예 4>
면역 크로마토그래피용 스트립(제 1 불용성 담체(11))의 막 표면과 제 2 디바이스 부품의 가압부 사이의 간극이 1.2mm가 되도록 제 2 디바이스 부품의 가압부의 형태를 조정하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증폭을 행했다.
<비교예 1>
제 2 디바이스 부품의 가압부를 제거하고, 막 표면으로부터의 간극이 형성되지 않으며, 은 이온 용액 110㎕를 막 표면에 적하함으로써 공급하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증폭을 행했다.
<비교예 2>
용액 저장 포트로부터 은 이온 용액이 공급되지 않고, 은 이온 용액 110㎕를 시료 패드에 적하함으로써 공급하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증폭을 행했다.
<비교예 3>
용액 저장 포트로부터 은 이온 용액이 공급되지 않고, 은 이온 용액과 환원제 용액을 1:4로 혼합함으로써 제조된 증폭 용액 110㎕를 시료 패드에 직접 적하함으로써 공급하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 증폭을 행했다.
<평가>
증폭 후, 디바이스를 제 1 디바이스 부품(10)의 관찰 윈도우(16)로부터 시각적으로 관찰했다. 양성 반응이 확인된 시료의 희석 계열의 최저 농도는 검출 감도 한계로서 확인되었다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
표 1에 명백하게 나타낸 바와 같이, 실시예 1~실시예 4의 검출 감도는 1/2560~1/5120 범위이었고, 이것은 매우 고감도를 나타낸다. 또한, 증폭 용액이 간극 부위(P)에 균일하게 충전되었다. 실시예 1에 있어서, 간극 부위(P)의 틈(거리)은 0.005mm였고, 이것은 좁은 것이다. 따라서, 매우 드물지만 소정 경우 소정 부위에 증폭 용액이 도포되지 않았다. 실시예 4에 있어서, 간극 부위의 틈(거리)는 1.2mm였고, 이것은 넓은 것이다. 그러므로, 모세관력이 충분히 작용하지 않았다. 따라서, 매우 드물지만 소정 경우 소정 부위에 증폭 용액이 도포되지 않았다. 이러한 결과는 간극 부위(P)가 0.01~1mm 범위로 조정되는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다.
반면, 비교예 1에 있어서는 간극 부위(P)가 제공되지 않아 증폭 용액을 제 1 디바이스 부품(10)의 상부측으로부터 적하했다. 비교예 1에 있어서의 검출 감도는 실질적으로 실시예의 검출 감도와 동일했다. 그러나, 비교예 1에 있어서는 증폭 용액이 균일하게 도포되지 않아 미증폭 부위가 검출 라인에 잔존하고 있었다. 시료 패드에 직접 증폭 용액을 적하한 비교예 2에 있어서는 증폭 용액이 제 1 불용성 담체인 막 중에 흘러 막 중에 존재하는 환원제 용액이 흡수 패드를 밀어내었으므로 증폭이 전혀 행해지지 않았다. 따라서, 환원 반응이 진행되지 않아 증폭을 행할 수 없었다. 또한, 시험 시약 용액과 증폭 용액의 혼합물을 시료 패드에 적하하여 증폭을 행했지만, 이것은 매우 불균일했다. 증폭이 불균일한 이유는 막과의 분자 상호 작용의 차로 인해 반응이 균일하게 진행되지 않았으므로 환원제 용액 및 증폭 용액에 포함된 성분이 막 중에 균일하게 도포되지 않았기 때문이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 분석 디바이스에 있어서 제 1 불용성 담체의 검출 부위와 대향하는 제 2 디바이스 부품의 내면 상에 가압면을 갖는 가압부가 제공된다. 또한, 제 1 불용성 담체의 검출 부위와 평행한 가압면은 검출 부위를 향해서 가압됨으로써 변위하고, 제 1 불용성 담체의 상부측으로부터 제 2 불용성 담체 및 제 3 불용성 담체를 제 1 불용성 담체 상으로 가압한다. 따라서, 가압 부위가 제 2 디바이스 부품의 외면으로부터 제 1 디바이스 부품을 향해서 가압되는 경우 가압부의 가압면이 변위하고, 가압 부위의 가압면과 검출 부위 사이에 간극이 형성된다. 따라서, 간극의 모세관력에 의해 용액을 균일하게 전개할 수 있다. 그러므로, 고정밀도 및 고감도 측정이 가능해진다.

Claims (7)

  1. 적어도 1종의 피분석물을 포함하는 시료 용액을 피분석물과 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 불용성 담체 상의 검출 부위에 송액하는 공정; 및
    시약 용액, 증폭 용액, 및 검출 용액 중 적어도 1종을 상기 검출 부위에 송액하는 공정을 포함하는 시료 용액에 포함된 피분석물의 정량 또는 정성 분석을 행하기 위한 분석 방법으로서:
    상기 불용성 담체와 상기 불용성 담체와 대향하는 면을 갖는 부재 사이의 간극에 상기 시약 용액, 증폭 용액, 및 검출 용액 중 적어도 1종을 주입하여 충전하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
  2. 피분석물에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 검출 부위를 갖는 제 1 불용성 담체가 수용된 제 1 디바이스 부품 및 상기 제 1 디바이스 부품에 용액을 주입하기 위한 구멍을 갖는 제 2 디바이스 부품을 포함하는 복합 부품을 포함하는 분석 디바이스로서:
    상기 제 2 디바이스 부품은 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위와 대향하는 면을 갖는 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 분석 디바이스.
  3. 피분석물에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 검출 부위를 갖는 제 1 불용성 담체가 수용된 제 1 디바이스 부품 및 상기 제 1 디바이스 부품에 용액을 주입하기 위한 구멍을 갖는 제 2 디바이스 부품을 포함하는 복합 부품에 용액을 전개하기 위한 제 2 불용성 담체 및 용액을 흡수하기 위한 제 3 불용성 담체가 수용된 분석 디바이스로서:
    상기 제 2 불용성 담체 및 상기 제 3 불용성 담체를 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위에서 서로 오버랩핑시키는 방식으로 유지하는 동시에 상기 제 1 불용성 담체, 상기 제 2 불용성 담체 및 상기 제 3 불용성 담체는 서로 접촉하지 않는 방식으로 수용되고, 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위와 대향하는 가압면을 갖는 가압부가 상기 제 1 불용성 담체의 상기 검출 부위와 대향하는 상기 제 2 디바이스 부품에 설치되어 있고, 상기 가압면은 상기 검출 부위를 향해서 가압됨으로써 변위되어 상기 제 1 불용성 담체 상측으로부터 상기 제 2 불용성 담체와 상기 제 3 불용성 담체를 상기 제 1 불용성 담체에 대해 가압하는 것을 특징으로 하는 분석 디바이스.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 가압부가 상기 검출 부위를 향해서 가압되었을 때의 상기 검출 부위와 상기 가압면 사이의 간극은 0.01~1mm 범위인 것을 특징으로 하는 분석 디바이스.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 가압부와 대향하는 상기 제 1 디바이스 부품의 내면에는 상기 가압부의 일부와 접촉함으로써 상기 가압면의 변위를 규제하는 리브가 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 디바이스.
  6. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 제 1 디바이스 부품 및 상기 제 2 디바이스 부품 중 적어도 하나에는 상기 검출 부위와 상기 가압면 사이의 간극에 용액을 송액할 수 있는 용액 저장 포트가 설치되어 있고, 상기 용액 저장 포트는 라미네이트 필름으로 밀봉되는 것을 특징으로 하는 분석 디바이스.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 용액 저장 포트에는 은 이온을 포함하는 증폭 용액이 주입되어 있는 것을 특징으로 하는 분석 디바이스.
KR1020117025751A 2009-03-30 2010-03-30 분석 방법 및 분석 디바이스 KR101636804B1 (ko)

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JP2009081388A JP5430995B2 (ja) 2009-03-30 2009-03-30 アッセイ方法およびアッセイ用デバイス
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