KR20110125221A - 도데칸디오익 산 및 이의 유도체들의 생산 방법 - Google Patents

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존 더블유. 프로스트
제임스 밀리스
젠유 탕
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Abstract

생원료 도데칸디오익 산을 생산하는 방법 및 생원료 도데칸디오익 산을 포함하는 조성물들이 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 먼저 재생가능한 탄소 소스로부터 뮤콘산을 생물학적으로 형성하는 단계, 상기 뮤콘산을 헥센디오익 산으로 환원하는 단계 및 이어서 상기 헥센디오익 산을 복분해 반응을 통해 불포화 지방산, 전형적으로 Δ9 불포화 지방산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성하는 단계를 포함한다. 도데센디오익 산은 이어서 도데칸디오익 산으로 환원된다. 도데칸디오익 산은 폴리아미드와 같은 고분자들을 형성하는데 사용될 수 있다. 폴리아미드의 예로서, 나일론 6,12 와 같은 나일론을 들 수 있다. 나일론 6,12 는 도데칸디오익 산을 1,6-헥사메틸렌 디아민과 반응시켜 형성될 수 있다.

Description

도데칸디오익 산 및 이의 유도체들의 생산 방법{METHODS FOR PRODUCING DODECANEDIOIC ACID AND DERIVATIVES THEREOF}
본 발명은 재생가능한 원료로부터 도데칸디오익 산의 생산과 관련되며, 폴리아미드(polyamide) 형성과 같은 이의 후속 용도에 관한 것이다.
나일론(Nylon)은 일부 예를 들자면, 직물, 악기 스트링, 로프, 스크류, 기어등을 제조하는데 사용되는 합성 열가소성 폴리아미드 패밀리를 일반적으로 지칭한다. 나일론은 유리 및 몰리브덴 황화물 필러(filler) 변이체들과 같은 필러들과도 사용가능하다.
나일론 6은 성형 나일론의 가장 상용화된 제품이다. 접미의 숫자는 단량체들로부터 제공되는 탄소 원자의 숫자를 지칭한다. 먼저 디아민(diamine)이 지칭되고 다음으로 디애시드(diacid)가 지칭된다. 예를 들어, 나일론 6,6 에서, 디아민은 전형적으로 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine)이며, 디애시드는 아디프산(adipic acid)이다. 상기 단량체들의 각각은 고분자 사슬에 6 개의 탄소원자를 제공한다.
유용한 나일론의 또 다른 예로서 나일론 6,12 를 들 수 있으며, 이는 6-탄소인 디아민과 12-탄소인 디카르복실산의 코폴리머(copolymer)이다. 나일론 6,12 의 제조를 위한 하나의 방법은 1,6-헥사메틸렌 디아민 및 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid)의 중축합(polycondensation) 생성물을 형성하는 단계를 포함한다, 상기와 같은 고분자성 물질의 상업적 생산을 위해, 개시물질이 탄화수소 원료로부터 실질적으로 수득되어야 한다.
따라서, 도데칸디오익 산은 매우 중요한 화학물질이다. 이는 고분자 가소제, 에폭시 경화제, 접착제 및 파우더 코팅제, 가공 플라스틱, 향수 및 약제품 등 다양한 산업적 용도로 사용된다. 연간 15,000,000,000 파운드의 도데칸디오익 산이 석유화학 원료로부터 합성되고 있다. 이러한 석유화학 원료들은 주로 부족한 천연 원료이며, 이들 원료의 사용은 전세계적으로 환경에 대한 파괴적 변화와 연관된다.
따라서, 나일론 생산에 유용한 상기의 원료 물질들은 접근성이 제한되며 가격 변동에 실질적으로 노출되어 있다. 결과적으로, 재생가능하며, 지속가능하고 환경에 덜 위해적인 폴리아미드 뿐만 아니라 도데칸디오익 산의 대체적인 생산 방법이 요청되고 있다.
본 발명은 재생가능한 원료로부터 도데칸디오익 산의 생산방법 및 폴리아미드(polyamide) 형성과 같은 이의 후속 용도를 제공한다.
본 발명의 측면들은 석유제품 혹은 기타 화석 탄소 원료들과 같은 비재생가능한 원료로부터 유도되는 개시 물질을 사용하는 것과는 반대로, 재생가능한 원료로부터 생물학적 공정에 의해 생성되는 물질들로 출발하여 폴리아미드와 같은 유용한 상업 제품들의 생산과 연관된다. 보다 상세하게는, 본 발명의 측면들은 재생가능한 바이오매스-유도 탄소 소스로부터 디카르복실산 및 이의 유도체들의 생산과 연관된다. 보다 상세하게는, 본 발명의 일부 측면들은 재생가능한 바이오매스-유도 탄소 소스로부터 도데칸디오익 산 및 이의 전구체 및 유도체들의 생산과 연관된다. 보다 상세하게는, 본 발명의 방법들은 재생가능한 생원료로부터 도데칸디오익 산과 같은 생원료 디카르복실산을 생산하기 위해 올레핀 화합물들의 복분해 단계를 활용한다. 수득되는 재생가능한 도데칸디오익 산은 다른 복분해 반응의 산물들 및 잔여 개시 물질들로부터 분리될 수 있다. 도데칸디오익 산 및 이의 유도체들은 폴리아미드 및 다른 고분자들의 생산에 활용성을 갖는다.
일부 측면들에 있어서, 본 발명은 먼저 재생가능한 원료로부터 생물학적으로 뮤콘산을 생성하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 뮤콘산은 헥센디오익 산의 이성질제 혹은 이성질체들로 환원된다. 상기 뮤콘산의 환원은 아연 할라이드 제제, 전기화학적 환원 혹은 선택적 수소화와 같은 당해 기술 분야에 공지된 방법들을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 헥센디오익 산은 에스테르, 아미드 혹은 염과 같은 유도체로서 존재할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 헥센디오익 산은 복분해 반응을 통해 불포화 지방산과 반응하여 도데센디오익 산을 생성하며, 이는 도데칸디오익 산으로 환원된다. 상기 반응은 전형적으로 Grubbs 촉매와 같은 복분해 촉매 사용을 수반하며, 이는 벤질리덴-비스(트리시클로헥실포스핀)디클로로루테늄(benzylidene-bis(tricyclohexylphosphine)dichlororuthenium) 또는 벤질리덴[1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)-2-이미다졸리디닐리덴]디클로로(트리시클로헥실포스핀)루테늄(benzylidene[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)-2- imidazolidinylidene]dichloro(tricyclohexylphosphine)ruthenium)을 포함한다.
뮤콘산을 생물학적으로 형성하는 단계는 Escherichia, Klebsiella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, 또는 Serratia 속(genera)에 속하는 원핵세포들을 사용하거나 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 속에 속하는 이스트들을 사용하여 뮤콘산을 형성하는 단계를 포함한다.
뮤콘산은 적절한 제제를 사용하여 3-헥센디오익 산과 같은 헥센디오익 산의 이성질체로 환원된다. 상기 적절한 제제의 예로서, 피리딘 내의 아연 클로라이드와 같은 아연 할라이드 제제를 들 수 있다.
상기 헥센디오익 산 또는 이의 유도체는 불포화 지방산과 반응하여 불포화 디카르복실산 또는 이의 유도체를 형성한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 불포화 지방산은 먼저 자기 복분해 반응을 통해 Δ9 옥타데센디오익 산을 생성한다. Δ9 옥타데센디오익 산은 헥센디오익 산과 반응하여 도데센디오익 산을 생성한다. 바람직하게는, 상기 불포화지방산은 Δ9 불포화 지방산이다. 상기 Δ9 불포화 지방산의 비제한적인 예로서, 미리스트올레산(myristoleic acid), 팔미트올레산(palmitoleic acid), 엘라이드산(elaidic acid) 및 올레산(oleic acid)을 들 수 있다. 상기 복분해 반응에 의해 생성되는 상기 불포화 디카르복실산 또는 이의 유도체는 포화 디카르복실산으로 환원될 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 형성되는 상기 불포화 디카르복실산은 도데센디오익 산이며, 이어서 포화된 동족화합물인 도데칸디오익 산으로 환원된다. 이는, 예를 들면, 귀금속 수소화 촉매를 사용하여 상기 도데센디오익 산을 수소화하여 수행될 수 있다.
또 다른 실시예에 있어서, 상기 Δ9 불포화 지방산은 먼저 자기 복분해 반응을 경유하여 대칭 Δ9 불포화 디카르복실산 옥타데센디오익 산으로 변형된다. 상기 대칭 Δ9 옥타데센디오익 산은 이어서 대칭 3-헥센디오익 산과 교차-복분해 반응에 사용되어 복분해 반응의 단일 산물로서 원하는 도데센디오익 산을 생성한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 도데칸디오익 산은 폴리아미드와 같은 고분자들을 형성하는데 사용된다. 폴리아미드의 예로서, 나일론 6,12 와 같은 나일론을 들 수 있다. 나일론 6,12 는 1,6-헥사메틸렌 디아민을 도데칸디오익 산과 반응시켜 형성될 수 있다.
개시된 발명의 특정한 일 실시예는 먼저 Escherichia, Klebsiella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, 또는 Serratia 속(genera)에 속하는 원핵세포 또는 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 속에 속하는 이스트들을 사용하여 생물학적으로 뮤콘산을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 뮤콘산은 아연 할라이드 제제를 사용하여 3-헥센디오익 산으로 환원된다. 상기 3-헥센디오익 산은 복분해 촉매를 사용하는 복분해 반응을 통해 미리스트올레산, 팔미트올레산, 엘라이드산, 올레산 혹은 이들의 조합들과 같은 Δ9 불포화 지방산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성한다. 상기 도데센디오익 산은 수소화에 의해 환원되어 도데칸디오익 산을 형성한다. 이후, 상기 도데칸디오익 산은 1,6-헥사메틸렌 디아민과 같은 적절한 디아민과의 반응에 의해 나일론 6,12 와 같은 폴리아미드를 형성하는데 사용된다.
본 발명의 측면들은 생원료 블포화 디카르복실산 혹은 이의 유도체 및 바이오매스로부터 유도되는 재생가능한 원료로부터 생성되는 이들의 포화 동족화합물을 포함하는 조성물들과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 생원료 도데센디오익 산 혹은 이의 도데센디오익 산 유도체들을 포함한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 탄소 동위원소 분포 혹은 재생가능한 탄소 소스들로부터 합성되는 산물의 14C/12C 비율 특성을 갖는 생원료 산물들이 개시된다. 일부 실시예들에 있어서, 재생가능한 분리된 도데센디오익 산 혹은 이의 도데센디오익 산 유도체들은 0 보다 크거나, 0.9 X 10-12 보다 크거나, 약 1.2 X 10-12 인 14C/12C 비율에 의해 특징된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 도데센디오익 산 유도체는 디메틸 도데센디오익 산이다. 다른 실시예들에 있어서, 생원료 도데칸디오익 산 또는 이의 유도체들들 포함하는 조성물들이 개시된다. 본 발명의 다른 측면들은 재생가능한 분리된 3-헥센디오익 및 이의 3-헥센디오익 유도체들을 포함하는 조성물들과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 생원료 3-헥센디오익 및 이의 3-헥센디오익 유도체들은 약 1.2 X 10- 12 인 14C/12C 동위원소 비율에 의해 특징된다. 본 발명의 다른 측면들은 생원료 폴리아미드를 포함하는 조성물들과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 6,12 고분자이며, 재생가능한 탄소 소스들로부터 유도된 모노머 유닛들 마다 적어도 12 개의 탄소원자들을 갖는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 나일론 6,12 는 14C 의 검측가능한 트레이스를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기에 개시된 재생가능한 화합물들은 약 1ppt 까지의 14C 를 함유한다.
본 발명의 측면들은 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체 및 상기 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 하나의 불포화 디카르복실산 또는 불포화 디카르복실산 유도체 부산물(byproduct)을 포함하는 조성물들과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 상기 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9의 부산물들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 불포화 디카르복실산 또는 불포화 디카르복실산 유도체 부산물은 약 7 내지 약 16의 탄소 원자들을 갖는 알켄 사슬을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물들은 상기 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 9의 부산물들을 포함하며, 상기 부산물들은 약 7 내지 약 16의 탄소 원자들을 갖는 알켄 사슬을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 도데센디오익 산 유도체는 도데센디오익 산 디에스테르이다. 바람직한 실시예들에 있어서, 상기 도데센디오익 산 또는 도데센디오익 산 유도체는 약 1ppt 까지의 14C 를 함유한다. 바람직하게는, 상기 알켄 사슬은 C3-C4 위치에 탄소 이중 결합을 포함한다.
본 발명의 다른 측면들은 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체 및 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 하나의 옥타데센디오익 산 또는 옥타데센디오익 산 유도체 부산물을 포함하는 조성물들과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 1, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 16의 부산물들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 옥타데센디오익 산 혹은 옥타데센디오익 산 유도체 부산물들은 C1-C2, C2-C3, C3-C4, C4-C5, C5-C6,, C6-C7, C7-C8, C8-C9, C10-C11, C11-C12, C12-C13, C13-C14, C14- C15, C15-C16, C16-C17 혹은 C17-C18 위치에 탄소 이중 결합을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체는 약 1ppt 까지의 14C 를 함유한다.
상술한 본 발명의 이점들은 본 명세서에 포함되는 하기의 상세한 설명 및 도면들로부터 보다 완전하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1a 및 도 1b는 방향족 아미노산의 생합성의 공통 경로 및 3-디하이드로시키메이트(3-dehydroshikimate)로부터 시스,시스-뮤콘산(cis,cis-muconic acid)의 분기 경로를 나타낸다.
도 2는 일 실시예에 따른 도데칸디오익 산 합성을 나타내는 흐름도이다. 도 2는 대칭 Δ9 옥타데센디오익 산(octadecenedioic acid)을 형성하는 자기-복분해(self-metathesis) 반응 및 3-헥센디오익 산(3-hexenedioic acid)과의 후속 교차 복분해(cross metathesis) 반응을 나타낸다.
도 3은 자기 복분해 반응에서 이중 결합 전이(double bond migration)의 효과를 나타낸다.
도 4는 교차 복분해 반응에서 이중 결합 전이의 효과를 나타낸다.
본 발명의 측면들은 도데센디오익 산(dodecenedioic acid) 및 이이 유도체 및/또는 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid) 및 이의 유도체들을 생산하는 방법 및 조성물들과 연관된다. 일부 측면들에 있어서, 본 발명은 2-헥센디오익 산(3-hexenedioic acid) 및 옥타데센디오에이트(octadecenedioate)로부터 도데센디오익 산을 생산하는 방법 및 조성물들과 연관된다. 바람직한 실시예에 있어서, 도데센디오익 산은 디메틸 헥센디오에이트(dimethyl hexenedioate) 및 디메틸 옥타데센디오에이트로부터 생산된다. 바람직한 실시예들에 있어서, 디메틸 도데센디오익 산의 환원에 의해 디메틸 도데칸디오익 산이 생성된다. 본 명세서에서, 용어 헥센디오익 산 및 헥산디오에이트는 교호적으로 사용되며, 6 개의 탄소 원자, 8 개의 수소 원자 및 4 개의 산소 원자를 함유하며 화학식 HOOC-CH2-CH=CH-CH2-COOH 로 표시되는 분자를 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 도데센디오익 산 및 도데센디오에이트(dodecenedioate)는 교호적으로 사용되며, 12 개의 탄소 원자, 20 개의 수소 원자 및 4 개의 산소 원자를 함유하며 화학식 HOOC-CH2-CH=CH-(CH2)7-COOH 로 표시되는 분자를 지칭한다. 본 명세서에서, 용어 도데칸디오익 산 및 도데칸디오에이트는 교호적으로 사용되며, 12 개의 탄소 원자, 22 개의 수소 원자 및 4 개의 산소 원자를 함유하며, 화학식 HOOC-(CH2)10-COOH 로 표시되는 분자를 지칭한다.
보통 시클로헥사논(cyclohexanone), 시클로도데카디엔(cyclododecadiene) 또는 시클로도데카트리엔(cyclododecatriene)으로부터 도데칸디오익 산을 제조하는 일부 다단계 화학 공정들이 채용되어 왔다. 도데칸디오익 산은 1,5,9 시클로데카트리엔을 과산화수소 및 아세트산을 사용한 에폭시화 반응으로부터 생성되며, 이에 상응하는 에폭시 화합물은 이어서 수소화되어 알코올을 형성하며, 산화되어 원하는 생성물을 형성한다. 또 다른 화학공정에 있어서, 도데칸디오익 산은 1,5,9 시클로도데카트리엔을 유기 히드로퍼옥사이드(hydroperoxide)로 에폭시화하여 1,2-에폭시-5,9-시클로도데카디엔을 형성하고 상기 화합물을 고리형유도체 산화를 통해 도데칸디오익 산으로 전환함으로써 제조된다. 일부 측면들에 있어서, 본 발명은 오일(oils) 혹은 지방(fats) 및 뮤콘산(muconic acid)을 디카르복실산, 옥소 알데히드 및 옥소 에스테르와 같은 옥소 화합물 생산을 위한 대체적인 개시 물질로서 사용한다.
본 명세서에서, 용어 "바람직한" 및 "바람직하게"는 특정 환경에서 특정한 이점을 제공하는 본 발명의 실시예들을 지칭한다. 그러나, 동일한 혹은 다른 환경에서 다른 실시예들 역시 바람직한 것일 수 있다. 더욱이, 일 혹은 일 이상의 바람직한 실시예들의 인용은 다른 실시예들은 유용하지 않음을 암시하는 것이 아니며, 본 발명의 범위로부터 다른 실시예들을 배제하는 것을 의도하는 것이 아니다.
단수 형태로 사용된 용어들은 문맥상에서 명확히 지시하지 않는한 복수의 의미를 포함한다.
용어 "포함하다" 또는 "포함하는" 는 개방적으로 사용되며, 추가적인 구성 요소들이 포함될 수 있음을 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 "포함하나 이에 제한되지 않는"의 의미로 사용되며, 상기 두 용어는 교호적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 용어 및 어구들에 대한 의미가 하기에 제공된다. 다르게 정의되지 않는 한, 모든 기술적 및 과학적 용어들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 수치들은 하한 및 상한 사이의 모든 값들을 포함한다. 상기 상한 및 하한 사이의 수치의 모든 가능한 조합들은 명확히 본 출원에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "알데히드(aldehyde)"는 다음의 화학식을 갖는 카르보닐 함유 작용기를 지칭한다.
Figure pct00001
R은 비제한적인 예로서, 지방족(aliphatic), 치환된 지방족, 아릴(aryl), 아릴알킬(arylalkyl), 헤테로아릴(heteroaryl) 등을 포함하는 임의의 그룹이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "지방족"은 실질적으로 탄화수소 계열의 화합물 혹은 이의 라디칼(예를 들면, 헥산 라디칼인 C6H13)을 지칭하며, 이는 알칸, 알켄 및 알킨과 선형사슬 혹은 가지사슬 배열, 입체 및 위치 이성질체들을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "알킬"은 일반식 CnH2n+1 의 동등한 나열 구조를 갖는 탄화수소 사슬을 지칭한다. 알킬 치환체는 메틸(CH3-), 에틸(C2H5-), 프로필(C3H7-), 부틸(C4H9-), 펜틸(C5H11-) 등을 포함한다. 알킬기의 구조는 대응하는 알칸과 유사하나, 수소 원자 하나를 덜 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "아릴"은 실질적으로 벤젠(benzene), 나프탈렌(naphthalene), 페난트렌(phenanthrene), 안트라센(anthracene) 등과 같은 고리 구조를 가지며, 다른 그룹, 특히 다른 유기 그룹에 결합되는 치환체로서 탄화수소 계열의 방향족 화합물 혹은 이의 라디칼(예를 들면, C6H5)을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "아릴알킬"은 지방족 및 방향족 구조를 모두 함유하며, 다른 그룹, 특히 다른 유기 그룹들에 결합하는 치환체로서의 화합물 혹은 이의 라디칼(예를 들면, 톨루엔에 해당하는 C7H7)을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "카르복실 산(carboxylic acid)"은 R-COOH 구조를 갖는 화합물을 지칭한다. 여기서, R은 비제한적인 예로서, 지방족, 치환된 지방족, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "사이클릭(clyclic)"은 실질적으로 탄화수소 폐쇄형-고리 화합물 혹은 이의 라디칼을 지칭한다. 사이클릭 화합물 혹은 치환체들은 일 이상의 불포화 사이트를 포함할 수 있다. 예시적인 사이클릭 화합물들은 전형적으로 3 이상의, 보다 전형적으로 4 이상의, 더욱 전형적으로 5 이상의 탄소 원자를 고리 구조 안에 함유하는 화합물들을 포함한다. 상기 사이클릭 화합물의 비제한적인 예로서, 시클로펜텐(cyclopentene), 시클로펜타디엔(cyclopentadiene), 시클로헥센(cyclohexene), 시클로헥사디엔(cyclohexadiene) 및 이들의 콘쥬게이션 유도체들을 들 수 있다. 상기 콘쥬게이션 유도체들의 예로서, 카르복실산, 아미드 및 에스테르와 같은 카르보닐 작용기와 콘쥬게이션되는 올레핀(olefin)을 함유하는 화합물들을 들 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "유도체(derivative)"는 모화합물(parent compound)과 화학적 구조가 상이한 분자를 지칭한다. 유도체의 비제한적인 예로서, 지방족 사슬의 길이에서의 차이와 같은 모체의 화학적 구조와 상이한 동족체; 분자 절편; 모체 분자의 산 작용기를 산 할라이드(acid halide), 아미드, 혹은 에스테르로 변형시키는 것과 같이 모체의 일 이상의 작용기를 변형시킴으로 생성되는 모체 화합물과 일 이상의 작용기가 상이한 구조; 산을 짝염기로 이온화하는 것과 같은 모체의 이온화 상태의 변화; 위치, 기하 및 입체이성질체를 포함하는 이성질체; 및 이들의 결합 등을 들 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "에스테르(ester)"는 하기의 구조를 갖는 화합물을 지칭한다.
Figure pct00002
R 및 R'은 각각 독립적으로 지방족, 치환된 지방족, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴 등을 포함하는 그룹에서 선택될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "헤테로아릴"은 다른 그룹, 특히 다른 유기 그룹에 결합되는 치환체로서 방향족의 폐쇄형 고리화합물 혹은 이의 라디칼을 지칭하며, 방향족 고리 내에 최소한 하나의 원자가 탄소가 아닌 산소(O), 황(S) 및/또는 질소(N)이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "헤테로사이클릭(heterocyclic)"은 다른 그룹, 특히 다른 유기 그룹에 결합되는 치환체로서 사이클릭, 즉 폐쇄형 고리, 지방족 화합물 혹은 이의 라디칼을 지칭하며, 상기 고리 구조 내의 적어도 하나의 원자가 탄소가 아닌 산소, 황 및/또는 질소이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "케톤(ketone)"은 하기의 구조를 갖는 화합물을 지칭한다.
Figure pct00003
R 및 R'은 각각 독립적으로 비제한적인 예로서, 지방족, 치환된 지방족, 아릴, 아릴알킬, 헤테로 아릴 등을 포함하는 그룹에서 선택된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "저급(lower)" 유기 화합물은 사슬 내에 10 이하의 탄소원자를 가지며 모든 분지(branched) 및 입체화학 변이체들을 포함하며, 특히, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐 및 데실을 포함하는 유기 화합물 혹은 이의 라디칼을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "치환된(substituted)"은 지방족, 아릴, 아릴지방족, 헤테로사이클릭, 헤테로아릴 혹은 헤테로아릴지방족 화합물 혹은 이들의 라디칼 등과 같은 기초 화합물에 결합하며, 전형적으로 수소 원자를 대체하는 제2 원자, 치환체, 작용기 등을 지칭한다. 예를 들면, 치환된 아릴 화합물 혹은 치환체들은 벤젠의 일 수소원자를 대체하는 메틸기를 갖는 톨루엔과 같이 아릴계의 폐쇄형 고리에 결합된 지방족 기를 가질 수 있다. 비제한적인 예시로서, 장쇄(long-chain)의 탄화수소는 이에 결합된 할라이드, 헤테로원자, 작용기, 아릴기, 사이클릭기, 헤테로아릴기 혹은 헤테로사이클릭기와 같은 원자 혹은 치환체를 가질 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "불포화 지방산(unsaturated fatty acid)"은 말단에 카르복실산 작용기를 갖는 알켄 사슬을 함유하는 화합물을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "불포화 디카르복실산(unsaturated dicarboxylic acid)"은 분지되지 않은 탄소 사슬의 각 말단에 카를복실산 작용기를 가지며 상기 탄소 사슬 내에 적어도 하나의 이중 결합을 포함하는 화합물을 지칭한다.
뮤콘산(Muconic Acid)
본 발명의 상세한 설명에서는 "뮤코네이트(muconate)" 및 "뮤콘산(muconic acid)" 이라는 용어가 사용된다. 용어 "뮤콘산"은 두 카르복실산 기가 양성자화된 화학종을 지칭하며, 이는 전형적인 중성종이다. 용어 "뮤코네이트"는 하나 혹은 양쪽 모두의 카르복실산 기가 탈양성자화되어 뮤콘산의 음이온 혹은 2가 음이온 형태를 보이며 생리학적 pH 값에서 우세한 화학종을 지칭한다. 그러나, 용어 "뮤콘산" 및 "뮤코네이트"는 동일한 분자의 양성자화 혹은 탈양성자화된 형태를 지칭하므로, 상기 용어들은 동일한 의미로 사용되며 양성자화 및 탈양성자화(예를 들면, 비이온화 및 이온화) 분자 형태 사이의 차이는 유용하게 구별되지 않는다.
뮤콘산으로 공통적으로 지칭되는 헥사-2,4-디엔디오익 산(hexa-2,4-dienedioic acid)은 3 개의 이성질체가 존재한다. 이들은 트랜스,트랜스(2E,4E); 시스,트랜스(2Z, 4E); 시스,시스(2Z,4Z) 이성질체들을 포함한다,
Figure pct00004
trans , trans (2E,4E) Muconic Acid
Figure pct00005
cis,trans (2Z,4E) Muconic Acid
Figure pct00006
cis , cis (2Z,4Z) Muconic Acid
시스,시스-뮤콘산 및 트랜스,트랜스-뮤콘산은 소량으로 상업적으로 얻을 수 있으나(예를 들어, Sigma-Aldrich), 매우 비싸다. 그러나, 시스,시스-뮤콘산은 방향족 화합물들의 효소 분해를 통해 일부 박테리아로부터 생산될 수도 있다. 일부 실시예들에 있어서, 시스,시스-뮤콘산은 본 출원에 참조로서 병합되는 미국 등록 특허 US 5,487,987 및 US 5,616,496 호에 개시된 특정한 박테리아에서 생합성된다. 산업적 규모의 시스,시스-뮤콘산은 상기의 생합성에 의해 생산될 수 있다. 시스,시스-뮤콘산의 생합성에 사용될 수 있는 박테리아는 방향족 아미노산 생합성의 내생의 공통 경로를 갖는 속(genera)의 멤버이다. 적절한 박테리아는 Escherichia, Klebsiella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus 혹은 Serratia 속에 속하는 원핵세포를 포함한다. 진핵 호스트 세포들 역시 활용될 수 있으며, 특히 Saccharomyces 혹은 Schizosaccharomyces 속의 이스트(yeast)를 활용할 수 있다.
적절한 원핵세포 종의 예로서, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium herculis, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lichenformis, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus pumilis, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas angulata, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas tabaci, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces kasugensis, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lipmanii, Streptomyces Iividans, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus saprophyticus, Serratia marcescens 등을 들 수 있다. 적절한 진핵세포 종의 예로서 Saccharomyces cerevisiae 및 Saccharomyces carlsbergensis 를 들 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법들은 용이하게 수득가능하며, 재생가능한 탄소 소스들로부터의 생원료 뮤콘산의 미생물 생합성을 포함한다(예를 들면, 본 출원에 참조로서 병합되는 미국 등록 특허 US 5,616,496 호 참고). 본 명세서에 사용되는 용어 "생원료(biosourced)"는 합성, 화학 공정과 같이 비-생물학적 공정과 반대되는 생물학적 공정을 사용하여 유도되는 물질을 지칭한다. 예를 들면, "생원료" 뮤콘산은 발효가능한 탄소 소스를 활용하여 발효공정을 통해 유도된다. "생원료"화합물 혹은 제품은 전체적으로 혹은 부분적으로 생원료 물질을 포함하는 제품을 지칭한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 용도로서 바람직한 호스트 세포들은 탄소 소스들을 D-에리트로오스-4-포스페이트(D-erythrose-4-phosphate : E4P) 및 포스포엔올피루베이트(phosphoenolpyruvate : PEP)로 전환시킬 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, E4P 및 PEP는 이어서 최종적으로 방향족 아미노산을 생성하는 대사 경로를 경유하여 아미노산으로 전환된다. 발효가능한 탄소 소스들은 본질적으로 생촉매에 의해 E4P 및 PEP로 전환가능한 임의의 탄소 소스를 포함할 수 있으며, 두 전구체 화합물들은 방향족 아미노산 생합성의 공통 경로로 도입된다. 적절한 탄소 소스들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말(starch), 셀룰로오스(cellulose), 글리세롤과 같은 폴리올(polyol), 아라비노스(arabinose) 및 자일로오스(xylose)와 같은 5탄당, 글루코오스(glucose) 및 프럭토오스(fructose)와 같은 6탄당, 수크로오스(sucrose) 및 락토오스(lactose)와 같은 이당류(disaccharide) 등과 같은 바이오매스 유도의 재생가능 소스들을 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 일산화탄소와 같은 미생물 대사를 지지할 수 있는 다른 탄소 소스들을 포함할 수도 있다. 예시적인 탄소 소스들은 글루코오스, 글리세롤, 수크로오스, 자일로오스 및 아라비노스를 포함한다. 일 실시예에 있어서, D-글루코오스가 바이오매스 유도의 탄소 소스일 수 있다.
본 발명에 사용되는 적절한 호스트 세포들은 아미노산과 같은 방향족 화합물의 생합성에 있어서 원하는 중간체의 생물학적 생산을 위해 활용될 수 있는 속의 구성들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기의 호스트 세포들은 산업적으로 유용한 방향족 화합물들 및 상기의 유용한 화합물들로 유도되는 중간체들의 산업적 규모의 생합성 혹은 생물학적 생산에 적합하다. 방향족 아미노산 생합성 경로에서 하나의 중간체는 3-디하이드로시키메이트(3-dehydroshikimate : DHS)이다. 특히, 적절한 호스트 세포들은 최소한 상기 DHS의 생산에 기능하는 방향족 아미노산 생합성의 내생의 공통 경로를 보유할 수 있다. 방향족 아미노산의 생합성을 위한 공통 경로들은 다양한 미생물에 있어서 내생적이며, 다양한 방향족 화합물들의 생산을 위해 사용될 수 있다. 특정한 실시예들에 있어서, 3-디하이드로시키메이트(DHS)의 코리스메이트(chorismate)으로의 전환을 차단하는 돌연변이를 갖는 영양요구성 돌연변이체 세포주(auxotrophic mutant cell lines)가 사용될 수 있다. 상기의 돌연변이체는 시키메이트 탈수소효소(shikimate dehydrogenase), 시키메이트 키나아제(shikimate kinase), EPSP 합성효소(synthase) 혹은 코리스메이트 합성효소를 인코딩하는 일 이상의 유전자들에 대한 돌연변이를 포함한다. 이러한 돌연변이체들은 세포 내의 DHS 레벨을 상승시킨다. 적절한 돌연변이체 세포주들은 Escherichia coli 계통인 AB2834, AB2829 및 AB2849 를 포함한다.
예를 들면, E. coli AB2834 는 시키메이트 탈수소효소를 인코딩하는 aroE 좌(locus) 내에 돌연변이를 가지며, 세포들이 DHS를 시키믹산(shikimic acid)으로 전환시키는 것을 방지한다. 결과적으로, 방향족 아미노산 생합성 내부로 향하는 탄소 플로우가 DHS를 넘어서 가공되지 않는다. 유사하게, E. coli AB2829 는 DHS를 축적시킨다. 이는, E. coli AB2829 는 EPSP 합성효소를 인코딩하는 aroA 좌의 돌연변이에 기인하여 시키메이트 3-포스페이트(shikimate 3-phosphate, S3P)를 5-엔올피루빌시키메이트(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate : EPSP)로 전환시키지 못하기 때문이다. E. coli AB2849 는 코리스메이트 합성효소를 인코딩하는 aroC 좌의 돌연변이에 기이하여 EPSP의 코리스믹산(chorismic acid)으로의 전환을 촉매하지 못한다. 따라서, 세포 내의 DHS 레벨을 증가시킨다.
호스트 세포들은 변형되어 세포 내의 DHS 가 카테콜(catechol)로의 생촉매적 전환을 위한 기질(substrate)로 사용될 수 있고, 이는 이후 뮤콘산으로 전환된다. 예를 들면, 호스트 세포들은 재조합 DNA로 변형되어 탄소 플로우를 DHS가 생성된 이후 방향족 아미노산 생합성의 공통 경로로부터 벗어나도록 강제하며, 뮤콘산 생성을 위한 분기 경로로 유도한다.
탄소 플로우를 상기 분기 경로로 유도하는 호스트 세포의 변형을 위한 메커니즘은 3-디하이드로시키메이트 탈수효소(3-dehydroshikimate dehydratase), 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제(protocatechuate decarboxylase) 및 카테콜 1,2-디옥시지나아제(catechol 1,2-dioxygenase) 코딩을 위한 발현가능한 서열들을 포함하는 유전 요소들의 삽입과 연관될 수 있다. 이에 활용되는 정확한 메커니즘이 무엇인지에 무관하게, 상기의 효소 활성들의 발현은 호스트 세포 내로의 재조합 유전 요소들의 전달에 의해 영향을 받으며 중재되는 것으로 판단된다. 여기서 정의되는 유전 요소들은 효소 작용 경로를 수행하거나 조절할 수 있는 단백질, 아포단백질(apoprotein) 혹은 안티센스 RNA와 같은 생성물들을 위한 발현가능한 코딩 서열들을 갖는 핵산들(일반적으로 DNA 혹은 RNA)을 포함한다. 발현된 단백질들은 효소로서 작용하며, 효소 활성을 억제 혹은 촉진하거나 효소 발현을 조절할 수 있다. 상기의 발현가능한 서열들을 코딩하는 핵산들은 염색체에 있거나(예를 들어, 호스트 세포 염색체에 병합되어) 염색체 외부에(예를 들어, 플라스미드, 코스미드 등에 의해 운반되어) 있을 수 있다.
본 발명의 상기 유전 요소들은 플라스미드, 코스미드, 파아지(phage), 이스트 인공 염색체 혹은 유전 요소들의 호스트 세포 내로의 전달을 중재하는 다른 벡터들에 의해 호스트 세포 내부로 도입될 수 있다. 이러한 벡터들은 벡터 및 상기 벡터에 의해 운반되는 상기 유전 요소들의 복제를 조절하는 시스-작용 조절 요소(cis-acting control elements)와 함께 복제 원점을 포함할 수 있다. 선택 표지들(selectable markers)이 벡터 상에 존재하여 유전 요소들이 도입된 호스트 세포들의 식별을 보조할 수 있다. 예를 들면, 선택 표지들은 테트라사이클린(tetracycline), 암피실린(ampicillin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 카나마이신(kanamycin) 혹은 네오마이신(neomycin)과 같은 특정 항생제들에 저항성을 수여할 수 있다.
호스트 세포 내에 유전 요소를 도입하기 위해 유전 요소들이 삽입된 염색체외 다중-복사 플라스미드 벡터를 활용할 수 있다. 호스트 세포 내부에 유전 요소의 플라스미드를 도입하는 것은 초기에 제한 효소로 플라스미드를 절단하고 본 발명에 따른 플라스미드 및 유전 요소들을 접합한다. 상기 접합된 재조합 플라스미드의 재환형화(recircularization) 시, 플라스미드 전달을 위한 형질도입(transduction) 혹은 다른 메커니즘(예를 들면, 전기천공법(electroporation), 미세주입법(microinjection) 등)이 상기 플라스미드를 호스트 세포 내부로 전달하기 위해 활용될 수 있다. 상기 호스트 세포 내부에 유전 유소들의 삽입을 위한 적절한 플라스미드들은, 이에 제한되는 것은 아니나, pBR322 및 이의 유도체들인 pAT153, pXf3, pBR325, pBr327, pUC 벡터들, pACYC 및 이의 유도체들, pSC101 및 이의 유도체들 및 ColE1 등을 포함할 수 있다. 추가적으로, pLAFR3 과 같은 코스미드 벡터들 또한 호스트 세포 내부에 유전 요소들의 삽입을 위해 적합하다. 플라스미드 구조물의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, p2-47, pKDS.243A, pKD8.243B 및 pSUaroZY157-2 등을 들 수 있으며, 이들은 Klebsiella pneumoniae 로 부터 분리되며 각각 3-디하이드로시키메이트 탈수효소 및 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제를 인코딩하는 aroZ 및 aroY 좌들을 보유한다. 플라스미드 구조물의 추가적인 예로서, Acinetobacter calcoaceticus catA 에 내생적인 유전자 절편을을 보유하며 카테콜 1,2-디옥시지나아제를 인코딩하는 pKDS.292 를 들 수 있다.
호스트 세포를 변형하는 방법들은 효소를 인코딩하는 유전자들의 삽입을 포함하며, 이는 방향족 아미노산 생합성의 공통 경로 내부로의 탄소의 기여를 증가시킨다. 특정 유전자의 발현은 억제자(repressor)와 같은 선택적인 발현 조절 서열들을 포함하는 유전 요소들 및 인핸서(enhancer)들이 포함되어 단백질, 아포단백질 혹은 안티센스 RNA 에 대한 코딩 서열들의 발현 혹은 탈억제를 조절하나, 일차적으로 그 프로모터에 의해 지시된다. 추가적으로, 재조합 DNA 구조물들이 생성되어 유전자의 천연 프로모터가 대체의 프로모터로 치환되어 유전자 산물의 발현을 증가시킬 수 있다. 프로모터들은 구성성(constitutive) 혹은 유도성(inducible)일 수 있다. 구성성 프로모터는 세포의 주기 동안 일정한 속도로 유전자의 전사를 조절하는 반면, 유도성 프로모터의 활성은 특정 유도인자(inducer)의 존재(혹은 부재)에 의해 결정되어 변동한다. 예를 들면, 조절 서열들은 야생형의 호스트 세포 내부에 삽입되어 호스트 세포 게놈에서 이미 인코딩된 선택된 효소들의 과잉발현을 촉진할 수 있으며, 혹은 이와는 달리 염색체 외에서 인코딩된 효소들의 합성을 조절하는데 사용될 수 있다.
DHS의 과잉생산을 촉진하는 조절 서열들이 사용될 수 있다. 상술한 것과 같이, DHS는 5탄당 인산경로(the pentose phosphate pathway) 효소인 트랜스케톨라아제(transketolase, tkt에 의해 인코딩)와 함께 3-디옥시-D-아라비노헵툴로소닉 산 7-포스페이트(3-deoxy-D-arabinoheptulosonic acid 7-phosphate, DAHP) 합성효소(aroF 에 의해 인코딩) 및 3-디하이드로퀴네이트(3-dehydroquinate, DHQ) 합성효소(aroB 에 의해 인코딩)의 티로신-민감성(tyrosine-sensitive) 이소자임의 순차적 촉매 활성에 의한 공통 경로 내에서 합성된다. 이러한 생합성 효소들의 발현은 증폭되어 D-글루코오스의 DHS 로의 전환을 증가시킬 수 있다. 상기 공통 경로의 첫번째 효소인 DAHP 합성효소의 생체 내 촉매 활성을 증가시킴으로써 방향족 생합성 경로로 유도되는 D-글루코오스 균등물들의 플로우를 증가시킬 수 있다. 그러나, DAHP 합성효소의 촉매 활성 레벨이 상기 방향족 생합성 경로에 기여하는 D-글루코오스의 비율에 있어서 더 이상 진전이 없는 지점을 넘을 수 있다. 이러한 방향족 아미노산 생합성 경로의 한계 레벨에서, 5탄당 인산경로 효소인 트랜스케톨라아제의 촉매 레벨의 증폭에 의해 상기 경로로 도입되는 D-글루코오스의 비율의 상당한 증가를 얻을 수 있다.
증폭된 트랜스케톨라아제 활성은 D-에리트로오스-4-포스페이트 농도를 증가시킬 수 있다. DAHP 합성효소에 대한 두 기질중의 하나로서, 제한된 D-에리트로오스-4-포스페이트 접근성은 DAHP 합성효소 촉매 활성을 제한할 수 있다. 따라서, DAHP 합성효소, DHQ 합성효소 및 DHQ 탈수효소의 촉매 활성을 증폭하는 하나의 방법은 상기의 효소들을 인코딩하는 재조합 DNA 서열로 미생물 촉매를 변형함으로써 상기의 효소종들을 과잉발현시키는 것이다.
DAHP 합성효소 및 트랜스케톨라아제의 증폭된 발현은 방향족 아미노산 생합성의 공통 경로 내부로 인도되는 탄소 플로우 서지(surge)를 생성할 수 있으며, 이는 상기 경로로 인도되는 통상의 탄소보다 과잉의 탄소를 갖는다. 상기 공통 방향족 아미노산 경로 내에서 개별 효소들에 의해 촉매되는 기질에서 생성물로의 전환의 개별 속도들이 DAHP 합성의 속도보다 작다면, 이러한 속도 제한 효소들의 기질은 세포 내에 축적될 수 있다.
E. coli 와 같은 미생물들이 상기의 기질들을 벌크 발효 배지와 같은 외부 환경으로 배출함으로써 축적된 기질들을 처리하는데 흔히 사용된다. 배출된 기질들은 전형적으로 미생물의 대사에 의해 손실되므로 이는 상기 공통 경로로부터 탄소 플로우의 손실을 야기한다. DHQ 합성효소는 속도 제한 공통 경로 효소의 예이다. DHQ 합성효소의 증폭된 발현은 상기 효소의 속도 제한 성격을 제거하며 DAHP 및 이의 비인산화된 유사체인 DAH의 축적을 억제한다. DHQ 탈수효소는 속도 제한 효소가 아니다. 그러므로, aroF-인코딩 DAHP 합성효소, tkt-인코딩 트랜스케톨라아제 및 aroB-인코딩 DHQ 합성효소의 증폭된 발현은 DHS의 생산을 증가시키며, 이는 DHS 탈수효소 및 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제의 존재 하에 카테콜로 전환되며, 이어서 생촉매적으로 시스,시스-뮤콘산으로 전환된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, DHS 탈수효소, 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제 및 카테콜 1,2-디옥시지나아제를 인코딩하는 유전자를 발현하는 Escherichia coli 의 이형 균주(heterologous strain)가 설계되었으며, D-글루코오스의 시스,시스-뮤콘산으로의 생촉매적 전환을 가능케하였다. D-글루코오스의 DHS로의 효율적인 전환이 pKD136 에 의한 호스트 세포의 변형 시 얻어졌다. 이어서, E. coli AB2834/pKD136 균주가 플라스미드 pKD8.243A 및 pKDS.292 로 변형되었다. 그 결과, 3-디하이드로시키메이트 탈수효소(aroZ), 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제(aroY) 및 카테콜 1,2-디옥시지나아제(catA) 효소들을 발현하는 E. coli AB2834/pKD136/pKDS.243A/pKDS.292 가 얻어졌다. 이러한 박테리아 세포주는 1995년 8월 1일 수탁번호 69875로 American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville MD 20852에 기탁되었다.
또 다른 실시예에 있어서, E. coli AB2834/pKD136 은 플라스미드 p2-47 및 pKD8.292 로 변형되어 E. coli AB2834/pKD136/p2-47/pKDS.292를 생성한다. 또 다른 실시예에 있어서, E. coli AB2834/pKD136 은 플라스미드 pKD8.243B 및 pKDS.292 로 변형되어 E. coli AB2834/pKD136/p2-47/pKDS.292 를 생성한다. 상기의 이형 호스트 세포주들 각각은 D-글루코오스의 시스,시스-뮤콘산으로의 전환을 촉매한다. 합성된 시스, 시스-뮤콘산은 세포 외에서 축적되어 세포들로부터 분리될 수 있다. 이어서, 시스, 시스-뮤콘산은 시스 ,트랜스-뮤콘산으로 이성질화 될 수 있으며, 원하는 경우 트랜스,트랜스-뮤콘산으로 추가적으로 이성질화 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 측면들은 내생의 방향족 아미노산 생합성 공통 경로를 갖는 호스트 세포의 변형체와 연관된다. 상기 변형체는 3-디하이드로시키메이트 탈수효소, 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제 및 카테콜 1,2-디옥시지나아제를 인코딩하는 이종 유전자들의 구성적 발현의 특징을 갖는다. 일 실시예에 있어서, 상기 세포 변형체는 트랜스케톨라아제, DAHP 합성효소 및 DHQ 합성효소를 인코딩하는 발현가능한 재조합 DNA 서열들에 의해 추가적으로 변형될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 호스트 세포는 3-디하이드로시키메이트의 코리스메이트(chorismate)로의 전환을 차단하는 아미노산 생합성 공통 경로내의 돌연변이를 함유하는 돌연변이들을 포함하는 돌연변이 세포주들의 그룹에서 선택된다. 또 다른 실시예에 있어서, 3-디하이드로시키메이트 탈수효소 및 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제를 인코딩하는 유전자들은 Klebsiella pneumoniae 에 내생적이다. 또 다른 실시예에 있어서, 카테콜 1,2-디옥시지나아제를 인코딩하는 이종 유전자들은 Acinetobacter calcoaceticus 에 내생적이다.
도 1a 및 도 1b를 참조하면, 분기 경로에서 중간체는 프로토카테큐에이트, 카테콜 및 시스,시스-뮤콘산이다. DHS의 프로토카테큐에이트로의 생촉매적 전환을 담당하는 효소는 도 1a 및 도 1b에서 "aroZ"로 표시된 3-디하이드로시키메이트 탈수효소이다. 프로토카테큐에이트의 탈카르복실화에 의해 카테콜 형성을 담당하는 효소는 도 1a 및 도 1b에서 "aroY"로 표시된 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제이다. 마지막으로, 카테콜의 산화를 촉매하여 시스,시스-뮤콘산을 생성하는 효소는 도 1a 및 도 1b에서 "catA"로 표시된 카테콜 1,2-디옥시지나아제이다. 표준적인 표기법에 따르면, 상기의 효소들의 발현을 위한 유전자들은 이탤릭체로 표기되며, 따라서 각각 aroZ, aroY 및 catA 로 표기된다. 시스,시스-뮤콘산은 이어서 이성질화(도시하지 않음) 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 호스트 세포들은 유전자 aroZ, aroY 및 catA 의 구성적 발현을 나타낼 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 호스트 세포들은 유전자 aroZ, aroY 및 catA 중 일 이상 혹은 이들 중 2 이상의 조합의 구성적 발현을 나타낼 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 호스트 세포들은 유전자 aroZ, aroY 및 catA 중 어느 구성적 발현도 나타내지 않을 수 있다.
3-디하이드로시키메이트 탈수효소 및 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제 효소들은 Neurospora, Aspergillus, Acinetobacter, Klebsiella 및 Pseudomonas 와 같은 미생물들이 하이드로방향족(시키메이트 및 퀴네이트) 뿐만 아니라 방향족 화합물들(벤조에이트 및 p-히드록시벤조에이트)을 성장을 위한 독립적인 탄소 소스로 사용할 수 있도록 하는 오르토 절단 경로들(ortho cleavage pathways)로부터 수득될 수 있다. DHS 탈수효소는 퀸산(quinic acid) 및 시킴산(shikimic acid)의 미생물 이화작용(catabolism)에서 중요한 역할을 수행한다. 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제는 Klebsiella aerogenes 에 의한 p-히드록시벤조에이트(p-hydroxybenzoate)의 이화작용 수행시 프로토카테큐에이트의 카테콜로의 전환을 촉매하도록 Patel에 의해 구성되었다. Patel의 균주(현재 Enterobacter aerogenes 으로 지칭됨)[(a) Grant, D. J. W.; Patel, J. C. Antonie van Leewenhoek 1969, 35, 325. (b) Grant, D. J. W. Antonie van Leewenhoek 1970, 36, 161]에 대한 재실험결과, 최근에 Ornston 은 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제는 p-히드록시벤조에이트의 이화작용에 대사적으로 중요하지 않다고 결론지었다 [Doten, R. C.; Ornston, N. J. Bacteriol. 1987, 169, 5827].
재생가능한 화합물들
재생가능하며, 생물학적으로 유도된 탄소 소스들로부터 생성되는 뮤콘산, 도데칸디오익 산, 도데센디오익 산, 3-헥센디오익 산 및 이들의 유도체들과 같은 적어도 하나의 탄소 원자를 포함하는 관심 대상 화합물들은 식물들에 의해 흡수되어왔던 대기의 이산화탄소로부터의 탄소로 구성될 것이다(예를 들면, 글루코오스, 수크로오스, 글리세린 혹은 식물 오일과 같은 탄소 소스). 그러므로, 상기의 화합물들은 이들의 분자 구조내에 화석 연료 기반 혹은 석유 기반의 탄소보다는 재생가능한 탄소를 포함한다. 따라서, 생원료의 도데칸디오익 산 혹은 도데칸디오익 산으로부터 합성된 생성물 및 연관된 유도체 생성물들은 화석 연료 및 석유 매장량을 고갈시키지 않으며, 탄소 주기에서 탄소의 양을 증가시키지 않으므로(예를 들면, 생활주기 분석 결과 전세계 탄소 균형에 어떠한 탄소 증가도 나타내지 않았다), 종래의 방법들에 의해 생산되는 도데칸디오익 산 및 연관 산물에서 보다 적은 탄소 발자국을 가질 수 있다.
뮤콘산과 같은 개시 화합물 혹은 3-헥센디오익 산과 같은 중간 산물들 뿐만 아니라 상기 생원료 도데칸디오익 산 및 연관 산물들은 듀얼 탄소-동위원소 핑거프린팅(dual carbon-isotopic finger printing)과 같은 당해 기술 분야에 공지된 방법에 의해 화석 연료 혹은 석유화학 탄소 소스로부터 생성된 산물들로부터 구별될 수 있다. 이러한 방법에 의해 14C 및 13C 동위원소 비율을 사용하여 화학적으로는 동일한 물질들을 구별할 수 있으며, 생물학적 혹은 비생물학적 소스에 의한 물질에서 탄소 원자들을 구별할 수 있다. 탄소 동위원소 14C 는 불안정하며 5730 년의 반감기를 갖는다. 안정한 13C 동위원소 대비 불안정한 14C 동위원소의 상대적 양을 측정함으로써 화석(오래전에 사멸한) 및 생물계(생존하며 재생가능한) 원료 사이에서 시료의 탄소를 구별할 수 있다(Currie, L. A. "Source Apportionment of Atmospheric Particles," Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc) (1992) 3-74 참조). 방사성 탄소 연대 측정에서 기본적 가정은 대기 내에 14C 농도의 항상성에 의해 생물체 내의 14C 항상성이 유지된다는 것이다.
분리된 샘플에 대하여, 샘플의 나이(t)는 하기의 식에 의해 추정될 수 있다.
t = (-5730/0.693)ln(A/Ao)
5730년은 불안정한 14C 동위원소의 반감기이며, A 및 Ao 는 각각 샘플 및 현대 표준의 특정한 14C 활성을 나타낸다(Hsieh, Y., Soil ScL Soc. Am J., 56, 460, (1992)). 그러나, 1950년 이후로 대기의 핵 테스트 및 1850년 이후로의 화석 연료의 연소에 기인하여, 14C 는 2차의 지구화학적 연대 특성을 획득하였다. 1960년대 중반의 핵 테스트의 절정기에서 대기 CO2 내의 14C 의 농도 및 이에 따른 생물계 내의 농도는 대략 2 배가 되었다. 이후 점진적으로 약 7-10 년의 이완(relaxation) 반감기를 가지고, 정상상태의 우주기원(대기의) 기저 동위원소 비율(14C/12C)인, 약 1.2 X 10-12 로 회복되고 있다 (후자의 반감기는 동위원소 반감기와 구별되어야 한다. 즉, 핵 시대의 시작 이후로, 상세한 대기 핵 투입/소멸 함수를 사용하여 대기 및 생물계의 14C 의 변이를 추적해야 한다.). 최근의 생물계 탄소의 연대 측정에서 유효한 것은 상기와 같은 후자의 생물계 14C 연대 특성이다. 14C 는 가속 질량 분광법(accelerator mass spectrometry : AMS)에 의해 측정될 수 있으며, 현대 탄소 분율(fraction of modern carbon : fM)의 단위로 결과가 주어진다. fM 은 National Institute of Standards and Technology (NIST) Standard Reference Materials (SRMs) 4990B 및 4990C(각각 옥살산 표준 HOxI 및 HOxII 로 알려진)에 의해 정의된다. 기초적 정의는 14C/12C 동위원소 비율 HOxI(AD 1950년 기준)의 0.95 배와 연관된다. 현재 생물계(식물 물질)에서 fM 은 약 1.1 이다.
안정한 동위원소 13C 및 12C 의 비율은 소스 분별 및 할당의 상보적 경로를 제공한다. 주어진 생원료 물질의 13C/12C 비율은 이산화탄소가 고정된 시점에서 대기내 이산화 탄소의 13C/12C 비율을 반영하며, 또한 정확한 대상 경로를 반영한다. 지역적 편차가 발생할 수도 있다. 석유, C3 식물(광엽(broadleaf)), C4 식물(잔디(grass)) 및 해양 탄산염(marine carbonates) 모두 13C/12C 에 있어서 상당한 차이를 나타내며, 상응하는 13C 값의 차이, 즉, δ13C 값을 나타낸다. 13C 측정 스케일은 PDB (pee dee belemnite) 석회암에 의해 영(zero)으로 최초에 정의되었으며, 측정값은 상기 물질로부터 천분율 편차로 주어진다. 상기 δ13C 값은 천분율(퍼밀, ‰)로 나타나며, 하기의 식에 의해 계산된다.
δ13C = (13C/12C)sample - (13C/12C)standard / (13C/12C)standard x 1000 ‰
PDB 참조 물질(refernece material : RM)이 소진된 이후, 일련의 대체적인 RM들이 IAEA, USGS, NIST 및 다른 국제 동위원소 실험실들과의 협조아래 개발되고 있다. PDB로부터 퍼밀 편차를 나타내는 기호는 δ13C 이다. 고 정밀도의 안정한 비율의 질량 분광법(IRMS)에 의해 분자이온 질량이 44, 45 및 46인 CO2 에 대해 측정이 행해진다. 또한, 대사 경로의 결과로, C3 및 C4 식물의 지질 물질이 동일한 식물들의 탄수화물 구성으로부터 유도된 물질들과 다르게 분석된다. 측정의 정확도 범위내에서, 13C 는 동위원소 분류 효과에 의해 큰 변이를 보이며, 본 발명에 있어서 가장 중요한 것은 광합성 메커니즘이다. 식물들 내의 탄소 동위원소 비율의 차이의 주요한 원인은 식물들 내에서 광합성 탄소 대사 경로의 차이, 특히 초기의 카르복실화(예를 들면, 초기의 대기 CO2 고정) 동안 일어나는 반응의 차이와 밀접하게 연관된다. 식생(vegetation)의 두 큰 분류는 C3(혹은 Calvin-Benson) 광합성 주기를 사용하는 것들과 C4(혹은 Hatch-Slack) 광합성 주기를 사용하는 것들이다. 견목(hardwood) 및 침엽수(conifer)와 같은 C3 식물들은 온화한 기후의 지역에서 우세하다. C3 식물들에 있어서, 주요한 CO2 고정 혹은 카르복실화 반응은 효소 리불로오스-1,5-디포스페이트 카르복실라아제(ribulose-1,5-diphosphate carboxylase)와 연관되며, 첫 번째의 안정한 산물은 3-탄소 화합물이다. 이와는 달리, C4 식물들은 열대의 잔디, 옥수수 및 사탕수수와 같은 식물들을 포함한다. C4 식물들에 있어서, 또 다른 효소인 포스포엔올-피루베이트 카르복실라아제(phosphoenol-pyruvate carboxylase)와 연관되는 추가적인 카르복실화 반응이 주요한 카르복실화 반응이다. 첫 번째의 안정한 탄소 화합물은 4-탄소산이며, 이는 이어서 탈카르복실화된다. 이에 따라 방출된 CO2 는 C3 주기에 의해 재고정된다. C4 및 C3 식물들 모두 특정 범위의 13C/12C 동위원소 비율을 나타내며, 전형적인 값은 약 -10 내지 -14 퍼밀(C4) 및 -21 내지 -26 퍼밀(C3) 이다(Weber et al., J. Agric. Food Chem., 45, 2942 (1997)). 석탄 및 석유는 일반적으로 후자의 범위에 해당한다.
그러므로, 생원료 뮤콘산, 도데칸디오익 산 및 본 발명의 도데칸디오익 산을 포함하는 조성물들은 이들의 고대 화석 연료 및 석유화학적으로 유도된 대응물들과 14C(fM) 및 듀얼 탄소-동위원소 핑거프린팅을 기초로 구별되며, 새로운 물질의 조성물임을 알 수 있다(예를 들면 미국등록특허 제 7,169,588, 7,531,593, 및 6,428,767호). 상기 산물들을 구별하는 능력은 상업화된 상기의 물질들을 추적하는데 유용하다. 예를 들면, 신구의 탄소 동위원소 프로파일 모두를 포함하는 산물들은 고대의 물질들로만 구성된 산물들과 구별될 수 있다. 따라서, 생원료 도데칸디오익 산 및 이의 유도체 물질들은 이들의 고유한 프로파일에 기초하여 상업화될 수 있다.
그러므로, 뮤콘산 및 이의 유도체, 지방산 및 이의 유도체, 3-헥센디오익 산 및 이의 유도체, 도데센디오익 산 및 이의 유도체, 도데칸디오익산 및 이의 유도체, 디카르복실산(dicarboxylic acid) 및 이의 유도체, 폴리아미드 및 이의 유도체, 나일론 및 이의 유도체 등과 같은 적어도 하나의 탄소 원자를 함유하는 분자 혹은 화합물은 이들의 탄소 동위원소 분포(예를 들면, 14C, 13C 혹은 12C) 또는 14C/12C 비율에 의해 설명될 수 있음을 이해해야 한다. 화합물 내의 각각의 탄소 원자는 자연적으로 발생하는 탄소 동위원소로부터 유래한 것이므로, 탄소 원자들의 소스는 화합물의 탄소 동위원소 분포 또는 14C/12C 비율에 영향을 미친다. 보다 구체적으로, 석유화학 원료로부터 합성된 화합물의 상기 탄소 동위원소 분포 또는 14C/12C 비율은 재생가능한 탄소 소스들로부터 생성된 탄소 동위원소 분포 또는 14C/12C 비율과 구별된다. 기본적인 가정은 대기중의 14C 농도의 항상성에 의해 생물체 내의 14C의 항상성이 유지되며, 반면 무기 탄소 소스들(석유화학 원료와 같은)에서는 모든 14C 들이 소멸되고 있다는 것이다. 따라서, 재생가능한 탄소 소소로부터 생성된 화합물은 무기 탄소 소스로부터 생성된 산물과 구별될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 14C/12C 비율은 본 출원에 참조로서 병합되는 Determining the Biobased Content of Natural Range Materials Using Radiocarbon and Isotope Ratio Mass Spectrometry Analysis 의 ASTM 테스트 방법 D 6866-05 를 사용하여 측정된다. 화합물 내의 재생가능 베이스의 탄소의 평가는 표준 테스트 방법들을 통해 수행될 수 있다. 방사성탄소 및 동위원소 비율 질량 분광법 분석을 사용하여, 물질들의 생원료 베이스의 함량이 결정된다. 공식적으로 American Society for Testing and Materials 로 알려진 ASTM International은 물질의 생원료 베이스의 함량을 평가하는 표준 방법을 설계하였다. 상기 테스트 방법은 샘플내의 14C/12C 동위원소 비율을 측정하고 이를 표준 100% 생원료 물질의 14C/12C 동위원소 비율과 비교하여 상기 샘플 내의 생원료 함량비율을 도출한다.
일부 실시예들에 있어서, 생원료의 도데칸디오익 산, 도데센디오익 산, 3-헥센디오익 산, 폴리아미드를 포함하는 조성물들은 14C 분포 또는 14C/12C 비율을 사용하여 대응하는 비재생가능한 화합물들로부터 구별될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 14C/12C 비율은 재생가능한 탄소 소스로부터 유래하는 탄소 원자의 분율의 지표이다. 예시적인 일 실시예에 따르면, 도데칸디오익 산 생산을 위한 개시 물질은 뮤콘산 및 올레산과 같은 Δ9 불포화 지방산이다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 뮤콘산은 생물학적으로 유래된 탄소 소스들로부터 생성되며, 상기 Δ9 불포화 지방산은 채소 혹은 동물 소스로부터 얻어진다. 그러므로, 교차 복분해 반응으로부터 생성되는 도데칸디오익 산 산물은 모든 탄소 원자들이 재생가능한 탄소 소스들로부터 유래하며 어떠한 탄소 원자도 고대의 탄소(예를 들면, 석탄, 오일 혹은 천연가스로부터의 탄소)로부터 유래되지 않았음을 나타내는 14C/12C 비율을 갖는다. 14C 를 함유하는 재생가능한 탄소 소스 및 방사성 탄소를 함유하지 않는 고대의 탄소 소스로부터 유래하는 개시 물질들로부터의 화합물 합성은 전체적으로 생원료 물질을 포함하는 화합물의 14C/12C 비율에 비해 14C/12C 비율이 감소할 것이다. 1.2 X 10-12 가 전체적으로 생원료 물질을 포함하는 화합물의 14C/12C 비율을 나타내며, 고대 탄소로부터 유래된 화합물의 14C/12C 비율은 0 이라는 추정하에, 부분적으로 생원료 물질로부터 형성된 화합물은 1.2 X 10-12 보다 낮은 방사성 탄소 지표 혹은 핑거프린트를 가질 수 있다. 예시적인 일 실시예에 따르면, 나일론 6,12 는 1,6-헥사메틸렌 디아민 및 도데칸디오익 산의 축합을 야기한다. 1,6-헥사메틸렌 디아민이 석유화학 원료(예를 들면, 석탄, 오일 및 천연가스)로부터 생성되며, 도데칸디오익 산이 전체적으로 생원료 물질로부터 형성되는 경우, 탄소 원자 함량의 2/3 가 재생가능한 탄소 소스로부터 유래될 것이다. 일부 실시예에 있이서, 바람직한 산물의 14C/12C 비율은 0 보다 크며, 0.9 X 10-12 보다 크다. 일부 실시예들에 있어서, 화합물의 생원료 탄소 함량이 분석될 수 있으며, 14C 함량의 비율이 생원료 참조 표준의 비율(현대 탄소의 비율)로 보고될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 생원료 산물의 탄소 함량은 100%, 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 적어도 50%, 적어도 40%, 적어도 30% 이다.
본 발명의 측면들은 본 명세서에서 설명되는 공정들에 의해 제조되는 산물들과 연관된다. 개시 뮤콘산이 바이오매스로부터 제조되는 일부 실시예들에 있어서, 본 공정에서 수득되는 산물들은 재생가능한 원료로부터 유래되는 상당한 비율의 탄소를 함유한다. 이러한 산물들은 ASTM D6866-08 에 의해 결정되는 바에 따르면, 바람직하게는 약 1 ppt(part per trillion) 까지의 14C 함량 또는 관측가능한 트레이스를 함유하는 고유한 특징을 갖는다. 상기의 산물들은 바이오매스, 바람직하게는 미생물 합성에 의한 재생가능한 원료로부터 유래된 바람직하게는 3 이상, 보다 바람직하게는 9 이상, 더욱 바람직하게는 12 이상의 탄소 원자들을 함유한다. 상기 산물들은 발효기-제어 조건 하에서 미생물 합성에 의해 제조된 재생가능한 원료들로부터 제조된다. 상기 산물들이 고분자들 제조에 활용되는 실시예들에 있어서, 모노머 단위는 바람직하게는 12 이상의, 바이오매스와 같은 재생가능한 원료들로부터 유래된 탄소들을 함유한다.
뮤콘산 유도체
본 발명의 일부 측면들에 있어서, 뮤콘산은 3-헥센디오익 산으로 환원된다. 일부 실시예들에 있어서, 재조합 호스트 세포 배양에 의해 생물학적으로 생성된 시스,시스-뮤콘산 및 이의 유도체들은 먼저 3-헥센디오익 산으로 환원된다. 일부 실시예들에 있어서, 3-헥센디오익 산은 복분해 반응에 사용되어 소정의 화합물들을 형성한다. 본 발명의 범위에 있는 일반 화학식 1로 예시되는 뮤콘산들 및 뮤콘산 유도체들이 하기에 제공된다.
Figure pct00007
화학식 1
화학식 1을 참조하면, R1 내지 R6은 각각 독립적으로 지방족, 치환된 지방족, 알콕시, 아미노, 아민, 치환된 아민, 보호된 아민, 아릴, 치환된 아릴, 아릴알킬, 치환된 아릴알킬, 카르보닐-함유 잔기(알데히드, 아미드, 카르복실 산, 에스테르, 케톤, 티오에스테르 등과 같은), 사이클릭, 치환된 사이클릭, 에테르, 치환된 에테르, 할라이드, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 헤테로사이클릭, 치환된 헤테로사이클릭, 수소, 히드록실, 히드록실아민 및 질소-함유 잔기(니트릴(RCN), 니트로(NO2) 및 니트로소(RNO)와 같은) 중에서 선택된다. 바람직하게는, R1 내지 R6은 각각 독립적으로 지방족, 전형적으로 저급 지방족, 보다 바람직하게는 저급 알킬 및 수소 중에서 선택된다. R1 및 R6은 가장 전형적으로 각각 수소 혹은 저급 알킬이다. R2 내지 R5 는 가장 전형적으로 수소이다. 화학식 1 및 여기서 제공되는 특정한 다른 구조식들은 직선과 대비되는 물결 모양의 선에 의해 표시되는 결합들을 포함하며, 이는 특정 일반식에 포함되는 모든 가능한 입체 이성질체들을 가리킨다.
일부 실시예들에 있어서, 뮤콘산으로부터 생성되는 주요한 유도체들은 (1) 짝염기, (2) 모체 화합물의 이성질화 반응에 의해 생성되는 다양한 입체 이성질체들, 및/또는 (3) 일 이상의 카르복실 산 작용기들을 다른 작용기로 변형함으로써 생성되는 화합물들이다. 일부 실시예들에 있어서, 시스,시스-뮤콘산은 시스,시스-뮤콘산을 요오드 트레이스와 함께 메탄올에 녹이고 빛에 노출시킴으로써 트랜스,트랜스-뮤콘산으로 이성질화될 수 있다. 시스,시스-뮤콘산 및 트랜스,트랜스-뮤콘산의 메탄 용해도는 실질적으로 상이하다. 그 결과, 트랜스,트랜스-뮤콘산은 형성되면서 용액으로부터 침전된다.
일부 실시예들에 있어서, 시스,시스-뮤콘산은 당해 기술 분야에서 알려진 방법을 사용하여 시스,트랜스-뮤콘산으로 이성질화될 수 있다. 시스,트랜스-뮤콘산은 유기 용매 및 수용성 배지 양쪽에서 시스,시스- 혹은 트랜스,트랜스- 이성질체들 보다 용해도가 높으므로, 시스,트랜스-뮤콘산은 용이한 가공 및 회수를 가능케하는 유리한 개시 화합물이다.
다양한 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법은 3-디하이드로시키메이트 탈수효소, 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제 및 카테콜 1,2-디옥시지나아제를 발현하는 재조합 세포들을 재생가능한 탄소 소스를 포함하는 배지 내에서, 상기 재생가능한 탄소 소스가 상기 세포의 방향족 아미노산 생합성의 공통 경로 내에서 발견되는 효소들에 의해 DHS로 전환되는 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 생성되는 DHS는 생촉매적으로 시스,시스-뮤콘산으로 전환된다. 특정 실시예들에 있어서, 발효액이 발효기 용기와 같은 용기(vessel) 내에 제공되고 상기 용기 내에서 이성질화 반응이 수행될 수 있다.
상기 재생가능한 탄소 소스의 발효에 의한 시스,시스-뮤콘산의 생성은 상기 재조합 세포 및 세포외의 시스,시스-뮤콘산을 포함하는 용액을 생성할 수 있다. 상기 생성 과정은 상기 용액으로부터 상기 재조합 세포들, 세포 잔해물, 불용성 단백질 및 다른 원하지 않은 고체들을 제거하여 상기 발효에 의해 형성된 모든 혹은 대부분의 시스,시스-뮤콘산을 함유하는 정화된 발효액을 얻는 단계를 포함한다. 뮤콘산이 생성된 이후, 이는 세포외 배지(예를 들면, 발효액) 내에 축적될 수 있으며, 원심분리, 여과 혹은 다른 공지된 방법들에 의해 상기 세포들로부터 분리될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 시스,시스-뮤콘산은 먼저 시스,트랜스-뮤콘산으로 이성질화되고, 상기 발효액 혹은 침전, 추출, 여과 혹은 다른 공지된 방법들에 의해 세포가 제거된 발효액으로부터 분리된다.
본 발명의 다른 측면들에 있어서, 뮤콘산의 카르복실산 작용기는 고리첨가(cycloaddition) 반응을 촉진하는 다양한 작용기들로 전환된다. 상기의 전환은 상기 고리첨가 반응에 의해 형성되는 화합물들 혹은 고리첨가에 의해 생성되는 상기 화합물들을 모노머로 사용하여 형성되는 유도체들 또는 고분자들의 바람직한 물리적 특성을 향상시킨다. 예시적인 카르복실산 작용기의 변형들은 티오닐 클로라이드(thionyl chloride), 오염화인(phosphorous pentachloride) 혹은 펜타브로마이드(pentbromide)와 같은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 적절한 제제를 사용하여 산 클로라이드(acid chloride)와 같은 산 할라이드(acid halide)의 형성을 포함한다. 뮤콘산의 카르복실산 작용기는 또한 메틸 혹은 에틸 에스테르와 같은 에스테르로 전환될 수 있다. 예시적인 에스테르, 특히 저급 알킬 에스테르의 형성 방법들은 다음과 같은 방법을 포함한다: 수행이 간편하나 이중 결합 이성질화가 수반될 수 있는, 메탄올 혹은 에탄올 및 촉매로서 황산을 사용하여 대응하는 메틸 및 에틸 에스테르를 형성하는 알코올/H+ 전달; 디아조메탄(diazomethane)으로 메틸화(methylation)하여 메틸 에스테르를 형성; 혹은 어두운 용기 내에서 MeI/Et4NOH 와 같은 요오드화 알킬로 산을 처리. 바람직한 실시예들에 있어서, 시스,시스-뮤콘산으로부터 출발하여 디메틸 설페이트(dimethyl sulfate) 및 탄산 칼륨(potassium carbonate)을 사용하여 디메틸 에스테르 유도체가 수득된다.
하기의 표 1은 예시적인 뮤콘산들 및 저급 알킬 뮤콘산 에스테르, 특히 메틸 및 에틸 뮤콘산 에스테르의 부분적인 목록을 이들의 녹는점 및 재결정화에 의한 정제에 유용한 용매들과 함께 제공한다.
화합물 녹는점 재결정화 용매
Figure pct00008

트랜스,트랜스-뮤콘산
300-305℃
H2O, MeOH, EtOH
Figure pct00009

시스,트랜스-뮤콘산
190℃
H2O, EtOH
Figure pct00010

시스,시스-뮤콘산
187℃
MeOH, EtOH
Figure pct00011

모노-메틸 트랜스,트랜스-뮤콘산
162-165℃
MeOH, Ph
Figure pct00012

모노-메틸-시스,트랜스-뮤콘산
100-106℃
PhH
Figure pct00013

모노-메틸-시스,트랜스-뮤콘산
95-101℃
CCl4, PE, PhH, Et2O
Figure pct00014

모노-메틸 시스,시스-뮤콘산
78-81℃
헥산, PhH
Figure pct00015

디메틸 트랜스,트랜스-뮤콘산
154-164℃
MeOH, EtOH, 다이옥산, PE
Figure pct00016

디메틸 시스,트랜스-뮤콘산
72-76℃
헥산, Et2O, MeOH, H2O, PE
Figure pct00017

디메틸 시스,시스-뮤콘산
73-75℃
헥산, Et2O, MeOH, H2O, PE
Figure pct00018

모노-에틸-트랜스,트랜스-뮤콘산
146℃
Figure pct00019

모노-에틸-시스,트랜스-뮤콘산
73-75℃
비공지 화합물
Figure pct00020

모노-메틸-시스,트랜스-뮤콘산
90-92℃
Figure pct00021

모노-에틸 시스,시스-뮤콘산
101-102℃
Figure pct00022

디에틸 시스,시스-뮤콘산
60-64℃
EtOH, H2O, pentane, Et2O, PE
Figure pct00023

디에틸 시스,트랜스-뮤콘산
27℃
Figure pct00024

디에틸 트랜스,트랜스-뮤콘산

48-54℃

EtOH
뮤콘산의 환원
하기의 반응식 1은 뮤콘산 혹은 뮤콘산 유도체를 3-헥센디오익 산 또는 모노- 혹은 디에스테르와 같은 이의 유도체로 환원하기 위한 방법의 일 실시예를 나타낸다. 반응식 1에 나타나듯이, 뮤콘산 디엔(diene)은 피리딘과 같은 적절한 용매에서 아연 할라이드(zinc halide) 제제를 사용하여 3-헥센디오익 산으로 환원될 수 있다(Kotora et al., Chem. Lett., p. 236-237 (2000) 참조).
Figure pct00025
반응식 1
올레핀 복분해(Olefin Metathesis)
본 출원에 사용되는 용어 "올레핀(olefin)"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 불포화 화합물을 지칭한다. 예시적인 일 실시예에 있어서, 오직 하나의 이중 결합을 가지며 다른 작용기들은 포함하지 않는 가장 간단한 올레핀은 CnH2n의 일반식을 갖는 일련의 탄화수소 계열을 화합물을 형성한다. 용어 "저급 올레핀"은 10 개 미만의 탄소원자를 가지며 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 유기 화합물을 지칭한다. 저급 올레핀은 1, 2 혹은 그 이상의 불포화 결합들을 갖는다. 바람직하게는, 상기 저급 올레핀은 하나의 불포화 결합을 갖는다. 저급 올레핀들은 탄소 사슬을 따라 임의의 위치에 일 이상의 치환기들로 치환될 수 있으며, 상기 일 이상의 치환기들은 복분해 반응에 실질적으로 불활성이다. 적절한 치환기들은, 알킬기에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 메틸기와 히드록시, 에테르, 케토 및 알데히드를 포함한다.
올레핀 복분해는 유기 합성에 사용되는 중요한 반응이다. 올레핀 복분해는 트랜스알킬리데네이션(transalkylidenation) 유기 반응으로도 알려져 있으며, 알켄 이중 결합의 절단과 이어서 알킬렌 절편들의 재분배를 수반한다. 상기의 반응은 2005년에 노벨 화학상을 공동 수상한 Yves Chauvin, Richard R. Schrock 및 Robert H. Grubbs에 의해 개발되었다. 올레핀 복분해 반응은 복분해 촉매의 촉매 유효량의 존재하에 진행된다. 예시적인 복분해 촉매들은 루테늄(ruthenium), 니켈(nickel), 텅스텐(tungsten), 오스뮴(osmium), 크롬(chromium), 레늄(rhenium) 및 몰리브덴(molybdenum)과 같은 촉매 전이 금속들에 기초한 금속 카르벤(carbene) 촉매들을 포함한다. 본 발명에 따른 공정에 채용될 수 있는 복분해 촉매들은 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있으며, 복분해 반응들에 적합한 모든 복분해 촉매들 혹은 적어도 두 촉매들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 올레핀 복분해 반응은 제1 발생 Grubbs 촉매들(first generation Grubbs catalysts), 상기 제1 발생 Grubbs 타입 촉매의 변이체 혹은 유도체를 사용한다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 올레핀 복분해 반응은 제2 발생 Grubbs 촉매들, 상기 Grubbs 타입 촉매의 변이체 혹은 유도체를 사용한다. Grubbs 촉매들의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 벤질리덴-비스(트리시클로헥실포스핀)디클로로루테늄(benzylidene-bis(tricyclohexylphosphine)dichlororuthenium) 및 벤질리덴[1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)-2-이미다졸리디닐리덴]디클로로(트리시클로헥실포스핀)루테늄(benzylidene[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)-2-imidazolidinylidene]dichloro(tricyclohexylphosphine)ruthenium 을 들 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, Schrock 촉매들 혹은 상기 Schrock 촉매들의 변이체 혹은 유도체가 상기 복분해 반응의 촉매로서 사용된다. 또 다른 실시예들에 있어서, 상기 촉매는 Hoveyda-Grubbs 촉매들 혹은 Hoveyda-Grubbs 촉매의 변이체이다. 일부 실시예들에 있어서, 카르벤 혹은 카르빈(carbyne) 착체 혹은 상기 착체들의 혼합물로부터 선택된 적어도 하나의 복분해 촉매가 채용된다. 본 출원에서 사용되는 용어 "착체(complex)"는 적어도 하나의 리간드 혹은 착화제(complexing agent)가 결합된 금속 원자를 지칭한다. 복분해 촉매들은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 공지된 기술들을 사용하여 활용된다.
Figure pct00026
반응식 2
상기 반응식 2에 나타난 바와 같이, 3-헥센디오익 산 혹은 이의 저급 알킬 에스테르와 같은 이의 유도체들은 복분해 촉매의 존재 하에 불포화 디카르복실 산, 특히 Δ9 디카르복실 지방산과 반응하여 도데센디오익 산을 생성한다. 그러나, 본 발명의 공정에 있어서 적절한 임의의 불포화 지방산이 채용될 수 있다.
상기 불포화 지방산의 알켄 사슬은 선형 혹은 분지형(branched)일 수 있으며, 카르복실산 기에 부가적으로 일 이상의 작용기들을 선택적으로 포함할 수 있다. 예를 들면, 일부 카르복실산들은 일 이상의 히드록실기를 포함할 수 있다. 상기 알켄 사슬은 전형적으로 약 4 내지 약 30 개의 탄소 원자들을 포함하며, 보다 전형적으로 약 4 내지 약 22 개의 탄소 원자들을 포함한다. 다수의 실시예들에 있어서, 상기 알켄 사슬은 18 개의 탄소 원자들을 포함한다(즉, C18 지방산). 상기 불포화 지방산은 알켄 사슬 내에 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 가지며(즉, 모노불포화 지방산), 둘 이상의 이중 결합을 가질 수도 있다(즉, 다중불포화 지방산). 예시적인 실시예들에 있어서, 상기 불포화 지방산은 Δ9 불포화 지방산이다. Δ9 불포화 지방산은 불포화 지방산의 알켄 사슬의 C9 및 C10 사이에 위치한 탄소-탄소 이중 결합을 갖는다. 상기의 위치를 결정함에 있어서, 상기 알켄 사슬은 불포화 지방산의 카르보닐 기의 탄소원자로부터 시작하여 번호를 매긴다. 바람직한 실시예들에 있어서, Δ9 불포화 개시 물질은 직선형의 알켄 사슬을 갖는다. 적절한 Δ9 불포화 지방산들의 비제한적인 예로서, 미리스트올레산(myristoleic acid, H3C(CH2)3 CH=CH(CH2)7COOH), 팔미트올레산(palmitoleic acid, H3C(CH2)5 CH=CH(CH2)7COOH), 엘라이드산(elaidic acid, H3C(CH2)7 CH=CH(CH2)7COOH) 및 올레산(oleic acid, H3C(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH) 등을 들 수 있으며, 이들 각각은 C9-C10 불포화 결합(Δ9 올레핀)을 갖는다. 다수의 실시예들에 있어서, 유용한 Δ9 불포화 지방산들은 식물-기반 오일 혹은 동물 지방과 같은 천연 오일로부터 유래된다. 재생가능한 식물 기반 오일들의 대표적인 예들로서 올리브유, 땅콩유, 포도씨유, 비타민나무유(sea buckthorn oil) 및 참기름, 양귀비씨유, 육두구 버터(nutmeg butter), 팜유, 코코넛 기름, 마카다미아 기름(Macadamia oil), 비타민나무유 등을 들 수 있다. 동물 지방의 대표적인 예들로서, 돼지기름(lard) 및 우지(tallow fats)를 들 수 있다. 불포화 지방산들은 상업적으로 수득될 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 방법들을 사용하여 지방산 에스테르의 비누화에 의해 합성될 수 있다.
바람직한 일 실시예에 있어서, 도데센디오익 산 혹은 이의 유도체(예를 들면, (Z)-디메틸도데센디오익 산)은 도 2에 도시된 복분해 촉매를 사용하여 교차-복분해 반응에 의해 합성된다.
예시적인 일 실시예에 있어서, 올레산(oleic acid)은 Ngo 및 Foglia(JAOCS, 1985, 84:777-784)에서 설명되는 2-단계 합성 공정에 의해 디메틸 옥타데센디오에이트(dimethyl octadecenedioate)로 전환된다. 예를 들면, 올레산은 복분해 촉매의 존재 하에 위치하여 디메틸 9-옥타데센디오에이트를 형성한다. 이어서, 옥타데센디오익 산은 당해 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 정제될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 개시 물질들은 디메틸-헥센디오에이트 및 디메틸-옥타데센디오에이트를 포함한다. 디메틸-옥타데센디오에이트의 존재 하에서 디메틸-헥센디오에이트의 교차 복분해 반응 후에, 디메틸-도데센디오에이트가 형성된다. 도데센디오익 산은 수소화에 의한 올레핀 포화 반응에 의해 도데칸디오익 산으로 전환될 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 디메틸 도데센디오에이트는 환원되어 디메틸 도데칸디오에이트를 형성한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 생원료 디메틸-헥센디오에이트는 뮤콘산 유도체들의 환원에 의해 생성된다. 상기 복분해 반응으로부터 생성되는 산물은 생원료 디메틸 도데칸디오에이트 화합물을 포함하는 조성물이다.
복분해 반응들은 적절한 조건 하에서 수행되어 원하는 복분해 산물들을 생성한다. 일부 실시예들에 있어서, 복분해 반응들은 불활성 분위기에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 불활성 분위기는 복분해 촉매의 작용을 방해하지 않는 불활성 기체이다. 상기 불활성 기체들의 비제한적인 예로서, 질소, 아르곤, 네온, 헬륨 및 이들의 조합을 들 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 복분해 반응들은 소정의 압력 하에서 처리될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 복분해 반응들은 촉매작용을 지연시키지 않는 불활성 용매 내에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 불활성 용매는, 이에 제한되는 것은 아니나, 벤젠 혹은 톨루엔과 같은 방향족 탄화수소, 할로젠화된 방향족 탄화수소, 메탄올과 같은 지방족 탄화수소 등을 포함한다. 용매는 반응물들이 전체적으로 혼화되지 않으면서 적절한 용매 내에서 용해될 수 있는 경우 바람직하다. 바람직하게는 상기 용매는 열적으로 안정하고 공정 온도에서 분해되지 않는다. 그러나, 일부 다른 실시예들에 있어서, 복분해 반응들은 무용매(solvent-free) 반응으로 진행될 수 있다. 상기 복분해 반응들은 원하는 산물들을 형성하고 원하지 않는 부산물들의 형성을 감소시키도록 선택된 온도에서 수행된다. 전형적으로, 상기 온도는 0℃ 이상, 20℃ 이상, 40℃ 이상, 50℃ 이상이다. 예시적인 일 실시예에 있어서, 상기 복분해 반응 온도는 약 20℃ 내지 약 100℃ 일 수 있다. 예를 들면, 상기 공정 온도는 약 45℃ 내지 약 50℃ 일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 복분해 반응에 사용되는 촉매의 양은 원하는 산물을 형성하고 원하지 않는 부산물의 형성을 감소시키도록 선택된다. 예를 들면, 디오익 산의 촉매에 대한 몰비(molar ratio)는 5:1 내지 20:1 또는 100:1 또는 1,000:1 또는 100,000:1 일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 반응 시간은 약 1 시간, 약 2 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 10 시간, 약 15 시간 혹은 그 이상이다.
교차 복분해(cross metathesis) 이후에, 산물들은 개시 물질 및 촉매로부터 분리된다. 원하는 산물들을 개시 물질 및 다른 원하지 않는 부산물로부터 분리 및 정제하는 유용한 기술들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 증류, 크로마토그래피, 분별 결정, 액체-액체 추출 혹은 이들의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 원하는 산물들은 높은 순도, 예를 들면 90% 이상으로 정제된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 전환은 가스 크로마토그래피-질량 분광법(gas chromatography-mass spectrometry)에 의해 체크될 수 있다. 예를 들면, 반응 혼합물의 여과액(디메틸 헥센디오에이트 및 디메틸 옥타데센디오에이트의 교차 복분해 및 후속의 수소화)은 가스 크로마토그래피-질량 분광법에 의해 체크되고 표준 디메틸 도데칸디오에이트 검정 곡선과 비교될 수 있다.
올레산, 옥타도세-9-엔디오익 산(octadoc-9-enedioic acid) 및 3-헥센디오익 산은 카르복실 혹은 에스테르 말단 그룹들에 대해 대칭 분자들이므로 올레산의 자기 복분해 반응들 또는 옥타도세-9-엔디오익 산 및 3-헥센디오익 산의 교차 복분해는 이론적으로 비대칭 분자가 사용되는 경우보다 더 적은 산물들을 형성할 수 있다. 예를 들면, 3-헥센디오익 산의 디메틸 옥타도세-9-엔디오익 산(dimethyl octadoc-9-enedioic acid)과의 교차 복분해 반응은 이론적으로 오직 디메틸 도데센디오익 산을 형성할 수 있다. 이러한 반응 타입에서 시스 이성질체 혹은 트랜스 이성질체가 형성되는지는 새롭게 형성되는 분자의 탄소-탄소 이중 결합 상의 치환기의 입체 장애 뿐만 아니라 촉매에 배열될 때의 분자의 배향에 의해 결정된다.
복분해 공정을 위해 사용되는 복분해 촉매가 이중 결합 전이(double bond migration)를 촉진하는 경우, 즉, 상기 복분해 촉매가 이중 결합이 불포화 지방산의 원래 위치에서 카르복실산 작용기로부터 더 가까운 혹은 더 떨어진 위치로 이동시키는 경우, 복분해 반응은 디카르복실산 산물의 혼합물을 생성할 수 있다. 예를 들면, 상기 복분해 촉매가 옥타데세-9-엔디오에이트(octadec-9-enedioate)의 중앙 이중 결합 전이를 촉진하여 옥타데세-8-엔디오에이트(octadec-8-enedioate), 옥타데세-7-엔디오에이트(octadec-7-enedioate) 및 옥타데세-6-엔디오에이트(octadec-6-enedioate) 등을 형성하는 경우(도 3 참조), 상기의 옥타데센디오에이트들은 디메틸 헥센디오에이트와 교차-복분해(cross metathesis)를 일으켜 7 내지 16 개의 탄소 길이의 서로 다른 주쇄를 갖는 디메틸 불포화 지방산 에스테르 부산물을 형성할 수 있다(도 4 참조). 일부 실시예들에 있어서, 반응 조건은 이중 결합 전이를 억제하도록 조절될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 불포화 지방산 혹은 이의 유도체에 대한 저급 올레핀의 비율은 이중 결합 전달을 억제하기 위해 선택된다. 일 실시예에 있어서, 디메틸 헥센디오익 산이 과량의 디메틸 옥타데센디오익 산에 첨가된다. 예를 들면, 반응물인 디메틸 헥센디오에이트/디메틸 옥타데센디오에이트의 몰비는 2:1, 3:1, 4:1 혹은 그 이상일 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 산성 첨가제가 이중 결합 전달 및 원하지 않는 부산물 형성을 방지하기 위해 첨가된다. 산성 첨가제의 예로서, 이에 제한되는 것은 아니나, 벤조익산(benzoic acid) 및 그 염들, 인산(phosphoric acid) 및 그 염들을 들 수 있다.
본 발명의 측면들은 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체 및 상기 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 하나의 불포화 디카르복실산 혹은 불포화 디카르복실산 유도체 부산물을 포함하는 조성물들과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 상기 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9 개의 부산물들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 불포화 디카르복실산 혹은 불포화 디카르복실산 유도체 부산물은 약 7 내지 약 16 개의 탄소원자를 갖는 알켄 사슬을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물들은 상기 도데센디오익 산 혹은 도데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 9 개의 부산물들을 포함하며, 상기 부산물들은 약 7 내지 약 16 개의 탄소원자들을 갖는 알켄 사슬을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 도데센디오익 산 유도체는 도데센디오익 산 디에스테르(dodecenedioic acid diester)이다. 바람직하게는, 상기 알켄 사슬은 C3-C4 위치에 탄소 이중 결합을 포함한다.
본 발명의 다른 측면들은 9-옥타데센디오익 산 혹은 9-옥타데센디오익 산 유도체 및 9-옥타데센디오익 산 혹은 9-옥타데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 하나의 옥타데센디오익 산 혹은 옥타데센디오익 산 유도체 부산물을 포함하는 조성물들과 연관된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 9-옥타데센디오익 산 혹은 9-옥타데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 1, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 16 개의 부산물들을 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 옥타데센디오익 산 혹은 옥타데센디오익 산 유도체 부산물들은 C1-C2, C2-C3, C3-C4, C4-C5, C5-C6,, C6-C7, C7-C8, C8-C9, C10-C11, C11-C12, C12-C13, C13-C14, C14- C15, C15-C16, C16-C17, 혹은 C17-C18 위치에 탄소 이중 결합을 포함한다.
폴리아미드 생성
본 출원에 사용되는 용어 "폴리아미드(polyamide)"는 아민 및 카르복실산 혹은 이의 유도체를 반응시켜 얻어지는 아미드 결합들에 의해 연결되는 아미드 모노머들을 포함하는 고분자이다. 폴리에스테르와 함께, 공업용 폴리아미드는 아라미드(aramide), 나일론 및 폴리아스파르테이트(polyaspartate)를 포함하는 다양한 용도를 갖는다. 아라미드(하기에 도시됨)는 테레프탈릭 산(terephthalic acid) 혹은 테레프탈로일 클로라이드(terephthaloyl chloride)와 같은 이의 유도체 및 1,4-페닐디아민(파라-페닐렌디아민)과 같은 디아민(diamine)을 중합하여 얻어지는 방향족 폴리아미드이다.
나일론은 일부 예들을 들자면, 직물, 악기 스트링, 로프(rope), 스크류(screw) 및 기어(gear) 등을 제조하기 위해 사용되는 합성 열가소성 폴리아미드들의 패밀리를 일반적으로 지칭한다. 나일론은 유리 및 몰리브덴 황화물 필러(molybdenum sulfide-filled) 변이체들과 같은 필러들과도 사용가능하다. 나일론 6은 성형 나일론의 가장 상용화된 제품이다. 접미의 숫자는 단량체들로부터 제공되는 탄소 원자의 숫자를 지칭한다. 먼저 디아민(diamine)이 지칭되고 다음으로 디애시드(diacid)가 지칭된다. 예를 들면, 나일론 6,6 에서, 디아민은 전형적으로 헥사메틸렌디아민(hexamethylenediamine)이며, 디애시드는 아디프산(adipic acid)이다. 상기 단량체들의 각각은 고분자 사슬에 6 개의 탄소원자를 제공한다.
유용한 나일론의 또 다른 예로 나일론 6,12 를 들 수 있으며, 이의 유리 전이 온도는 46℃ 이고, 310.48 g/mol 의 반복 단위의 분자량을 갖는다. 나일론 6,12의 구조식은 하기와 같다.
Figure pct00027
나일론 6,12 를 제조하는 하나의 방법은 1,6-헥사메틸렌 디아민 H2N-(CH2)6-NH2 및 도데칸디오익 산 HOOC-(CH2)10-COOH 의 중축합(polycondensation) 산물을 형성하는 것을 포함한다(예를 들면, 본 출원에 참조로서 병합되는 미국 등록 특허 제3,903,152호 참조). 미국 등록 특허 제3,903,152호는 도데칸디오익 산으로부터 나일론 6,12를 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 20g의 도데칸디오익 산이 20g의 물과 함께 70℃ 로 가열되고 50wt% 의 헥사메틸렌디아민 수용액으로 중화되었다. pH는 8로 조절되어 50% 나일론 염 수용액을 제조하였다. 이어서, 상기 나일론 염 수용액은 질소 분위기 하의 염욕로 내에서 상온에서 250℃로 가열되었고, 통상의 압력하에 5 시간동안 250℃의 온도에서 중합되었다. WO/2000/009586 은 나일론 6,12 를 제조하기 위한 또 다른 방법을 제공한다. 상기 문헌에 따르면, 나일론 6,12 는 데칸디오익(decanedioic) 및 1,6-헥산 디아민 수용액을 90℃의 온도에서 30분 동안 오토클레이브(autoclave)내에서 교반하여 결합함으로써 제조될 수 있으며, 이에 따라 55wt% 의 염 용액이 얻어진다. 먼저 10분 동안 180℃로 승온시켜 증류에 의해 물을 제거하며, 이 때 증류를 통해 절반에 해당하는 양의 물이 제거된다. 이어서, 200℃로 승온시켜 증류를 통해 물을 제거함으로써 90wt% 의 염 수용액을 수득한다. 반응기는 완전히 폐쇄되고, 증류를 중단하고 온도를 227℃로 승온시켜 예비중합(prepolymerization)이 개시된다. 잔류하는 물과 고온은 압력이 서서히 상승하도록 유도한다. 상기 예비중합 종료시의 압력은 약 12X105 Pa 이다. 상기 예비중합은 1/2 시간 동안 일정한 온도에서 수행되며, 이후에 오토클레이브의 내용물은 질소 분위기에서 플래시된다. 예비고분자는 질소 분위기에서 냉각된다. 수득된 예비고분자 그래뉼은 체로 걸러져 1 내지 2mm의 직경을 갖는 조각들이 얻어진다. 상기 조각은 고정상(static bed)(대략 50g의 고체 물질 용량) 혹은 텀블 건조기(tumble dryer)(약 10리터 용량) 내부로 도입되고, 24시간동안 질소/물 증기(75/25%의 부피비) 분위기에서 승온(고분자의 녹는점 아래로 약 25℃)되어 후축합된다. 이어서, 상기 고분자 그래뉼은 상온으로 냉각되었다. 상기 고분자로부터 다수의 로드 및 플레이트들이 사출 성형되었다.
특정한 실시예들을 참조로 본 발명에 대해 설명하였으나, 당해 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자라면 첨부된 청구항들에 의해 정의되는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 다양한 변경이 가능함을 이해하여야 한다.

Claims (70)

  1. 뮤콘산(muconic acid)을 헥센디오익 산(hexenedioic acid)으로 환원시키는 단계;
    상기 헥센디오익 산을 복분해 반응에 의해 불포화 지방산과 반응시켜 도데센디오익 산(dodecenedioic acid)을 생성하는 단계; 및
    상기 도데센디오익 산을 도데칸디오익 산(dodecanedioic acid)으로 환원시키는 단계를 포함하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 불포화 지방산을 자기 복분해(self metathesis) 반응시켜 Δ9 옥타데센디오익 산(octadecenedioic acid)을 생성하는 단계; 및
    상기 헥센디오익 산을 상기 Δ9 옥타데센디오익 산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 뮤콘산을 제공하는 단계를 포함하며,
    뮤콘산은 시스,트랜스-뮤콘산인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 뮤콘산은 생촉매 전환을 통해 재생가능한 탄소 소스로부터 생성되는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 3-디하이드로시키메이트 탈수효소(3-dehydroshikimate dehydratase), 프로토카테큐에이트 디카르복실라아제(protocatechuate decarboxylase) 및 카테콜 1,2-디옥시지나아제(catechol 1,2-dioxygenase)를 발현하는 재조합 세포들을 상기 재생 가능한 탄소 소스를 포함하는 배지 내에서 상기 재생 가능한 탄소 소스가 상기 세포의 방향족 아미노산 생합성 공통 경로 내의 효소들에 의해 3-디하이드로시키메이트로 전환되며, 상기 3-디하이드로시키메이트는 생촉매적으로 시스,시스-뮤콘산으로 전환되는 조건 하에서 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 실질적으로 모든 시스,시스-뮤콘산이 시스,트랜스-뮤콘산으로 이성질화되는 반응 조건 하에서 시스,시스-뮤콘산을 시스,트랜스-뮤콘산으로 이성질화시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 상기 재조합 세포는 원핵 세포 혹은 이스트 세포인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 원핵 세포는 Escherichia, Klebsiella, Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Staphylococcus, 또는 Serratia 속(genera)에 속하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 이스트 세포는 Saccharomyces 또는 Schizosaccharomyces 속에 속하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, 상기 배양하는 단계는 상기 재조합 세포들 및 세포외 뮤콘산을 포함하는 액(broth)을 생성하며, 상기 액으로부터 상기 재조합 세포들을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 뮤콘산을 헥센디오익 산으로 환원시키는 단계는 상기 뮤콘산을 아연 할라이드(zinc halide)와 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 불포화 지방산은 Δ9 불포화 지방산인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 Δ9 불포화 지방산은 미리스트올레산(myristoleic acid), 팔미트올레산(palmitoleic acid), 엘라이드산(elaidic acid), 올레산(oleic acid) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 복분해 촉매를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 촉매는 Grubbs 촉매인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 촉매는 벤질리덴-비스(트리시클로헥실포스핀)디클로로루테늄(benzylidene-bis(tricyclohexylphosphine)dichlororuthenium) 또는 벤질리덴[1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)-2-이미다졸리디닐리덴]디클로로(트리시클로헥실포스핀)루테늄(benzylidene[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)-2- imidazolidinylidene]dichloro(tricyclohexylphosphine)ruthenium)인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 도데센디오익 산을 수소화하여 도데칸디오익 산을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 도데칸디오익 산을 사용하여 폴리아미드를 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 6,12 인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  20. 제 18 항에 있어서, 1,6-헥사메틸렌 디아민(1,6-hexamethylene diamine)을 도데칸디오익 산과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 헥센디오익 산은 3-헥센디오익 산의 이성질체인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 재생가능한 탄소 소스는 D-글루코오스(D-glucose)인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  23. 헥센디오익 산을 복분해 반응에 의해 불포화 지방산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성하는 단계; 및
    상기 도데센디오익 산을 도데칸디오익 산으로 환원시키는 단계를 포함하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 헥센디오익 산을 복분해 반응에 의해 Δ9 옥타데센디오익 산과 반응시키기 전에, 상기 불포화 지방산을 자기 복분해(self metathesis) 반응시켜 Δ9 옥타데센디오익 산을 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 헥센디오익 산은 3-헥센디오익 산의 이성질체이며, 상기 불포화 지방산은 Δ9 불포화 지방산인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  26. 생촉매 전환을 통해 재생가능한 탄소 소스로부터 생성된 뮤콘산을 제공하는 단계;
    상기 뮤콘산을 아연 할라이드 제제를 사용하여 헥센디오익 산으로 환원시키는 단계;
    상기 헥센디오익 산을 복분해 반응에 의해 Δ9 불포화 지방산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성하는 단계;
    상기 도데센디오익 산을 도데칸디오익 산으로 환원시키는 단계; 및
    상기 도데칸디오익 산을 사용하여 폴리아미드를 형성하는 단계를 포함하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 Δ9 불포화 지방산을 자기 복분해 반응시켜 Δ9 옥타데센디오익 산을 생성하는 단계; 및
    상기 헥센디오익 산을 상기 Δ9 옥타데센디오익 산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 상기 Δ9 불포화 지방산은 미리스트올레산(myristoleic acid), 팔미트올레산(palmitoleic acid), 엘라이드산(elaidic acid), 올레산(oleic acid) 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 복분해 촉매를 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 촉매는 벤질리덴-비스(트리시클로헥실포스핀)디클로로루테늄(benzylidene-bis(tricyclohexylphosphine)dichlororuthenium) 또는 벤질리덴[1,3-비스(2,4,6-트리메틸페닐)-2-이미다졸리디닐리덴]디클로로(트리시클로헥실포스핀)루테늄(benzylidene[1,3-bis(2,4,6-trimethylphenyl)-2- imidazolidinylidene]dichloro(tricyclohexylphosphine)ruthenium)인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  31. 제 26 항에 있어서, 상기 폴리아미드는 나일론 6,12 인 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산의 생산 방법.
  32. 구조식 HOOC-(CH2)n-COOH 로 표시되는 생원료 디카르복실산(dicarboxylic acid)을 포함하며, n은 4 내지 22의 정수인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 디카르복실산은 도데칸디오익 산 혹은 이의 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 32 항에 있어서, 상기 생원료 디카르복실 산은 0 보다 큰 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 32 항에 있어서, 상기 생원료 디카르복실산은 약 1.2 X 10-12 의 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 도데칸디오익 산 유도체는 디메틸 도데칸디오익 산(dimethyl dodecanedioic acid)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 구조식 R1-OOC-(CH2)n-COO-R2 로 표시되는 생원료 디카르복실산 디에스테르(diester)를 포함하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소 혹은 지방족 그룹이며, n은 4 내지 22의 정수인 것을 특징으로 하는 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 디카르복실산 디에스테르는 0 보다 큰 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 37 항에 있어서, 상기 디카르복실산 디에스테르는 약 1.2 X 10-12 의 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 구조식 HOOC-(CH2)7-CH=CH-(CH2)7-COOH 로 표시되는 생원료 도데센디오익 산을 포함하는 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 도데센디오익 산은 0 보다 큰 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제 40 항에 있어서, 상기 도데센디오익 산은 약 1.2 X 10-12 의 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 구조식 R1-OOC-CH2-CH=CH-(CH2)7-COO-R2 로 표시되는 생원료 도데센디오익 산 디에스테르를 포함하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소 혹은 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 도데센디오익 산 디에스테르는 0 보다 큰 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. 제 43 항에 있어서, 상기 도데센디오익 산 디에스테르는 약 1.2 X 10-12 의 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 구조식 R1-OOC-CH2-CH=CH-CH2-COO-R2 로 표시되는 생원료 3-헥센디오익(3-hexenedioic) 또는 이의 3-헥센디오익 유도체를 포함하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로, 수소 혹은 지방족 그룹인 것을 특징으로 하는 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 3-헥센디오익 또는 이의 3-헥센디오익 유도체는 약 1.2 X 10-12 의 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  48. 생원료 나일론 6,12 를 포함하며, 상기 나일론 6,12 는 0 보다 큰 14C/12C 비율을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 14C/12C 비율은 0.9 X 10-12 보다 큰 것을 특징으로 하는 조성물.
  50. 구조식 HOOC-(CH2)n-COOH 로 표시되는 생원료 디카르복실산을 포함하며, n은 4 내지 22의 정수이며, 상기 생원료 디카르복실산은 약 1ppt(part per trillion) 까지의 14C를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 구조식 R1-OOC-(CH3)n-COOR2 로 표시되는 생원료 디카르복실산 디에스테르를 포함하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 혹은 지방족 그룹이며, n은 4 내지 22의 정수이며, 상기 생원료 디카르복실산은 약 1ppt(part per trillion) 까지의 14C를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 구조식 R1-OOC-(CH2)n-COO-R2 로 표시되는 생원료 도데칸디오익 산 디에스테르를 포함하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 혹은 지방족 그룹이며, 상기 생원료 도데칸디오익 산 디에스테르는 약 1ppt까지의 14C를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. 구조식 R1-OOC-CH2-CH=CH-CH2-COO-R2 로 표시되는 생원료 3-헥센디오익 산 또는 이의 3-헥센디오익 산 유도체를 포함하며, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소 혹은 지방족 그룹이며, 상기 생원료 3-헥센디오익 산은 약 1ppt까지의 14C를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  54. 생원료 나일론 6,12 를 포함하며, 상기 나일론 6,12 는 14C의 검측가능한 트레이스를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  55. 뮤콘산을 헥센디오익 산으로 환원시키는 단계;
    상기 헥센디오익 산을 복분해 반응을 통해 불포화 지방산과 반응시켜 불포화 디카르복실산을 생성하는 단계; 및
    상기 불포화 디카르복실산을 환원시켜 디카르복실산을 형성하는 단계를 포함하며,
    상기 디카르복실산은 구조식 HOOC-(CH2)n-COOH 로 표시되며, n은 4 내지 22의 정수인 것을 특징으로 하는 공정에 의해 생산되는 디카르복실산.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 뮤콘산은 생촉매 전환을 통해 재생가능한 탄소 소스로부터 생성되는 것을 특징으로 하는 디카르복실산.
  57. 제 55 항에 있어서, 상기 불포화 지방산은 Δ9 불포화 C18 지방산이며, 상기 디카르복실산은 도데칸디오익 산인 것을 특징으로 하는 디카르복실산.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 도데칸디오익 산은 약 1ppt까지의 14C를 함유하는 것을 특징으로 하는 도데칸디오익 산.
  59. 뮤콘산을 헥센디오익 산으로 환원시키는 단계;
    상기 헥센디오익 산을 복분해 반응을 통해 불포화 지방산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성하는 단계; 및
    상기 불포화 디카르복실산을 환원시켜 디카르복실산을 형성하는 단계를 포함하는 디카르복실산의 생산 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 불포화 지방산을 자기 복분해 반응시켜 Δ9 옥타데센디오익 산을 생성하는 단계; 및
    상기 헥센디오익 산을 Δ9 옥타데센디오익 산과 반응시켜 도데센디오익 산을 생성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 디카르복실산의 생산 방법.
  61. 도데센디오익 산 또는 도데센디오익 산 유도체 및 상기 도데센디오익 산 또는 도데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 하나의 불포화 디카르복실산 또는 불포화 디카르복실산 유도체 부산물을 포함하는 조성물.
  62. 제 61 항에 있어서, 적어도 2의 불포화 디카르복실산 또는 불포화 디카르복실산 유도체 부산물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제 61 항에 있어서, 적어도 9의 불포화 디카르복실산 또는 불포화 디카르복실산 유도체 부산물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. 제 61 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 불포화 디카르복실산 또는 불포화 디카르복실산 유도체 부산물은 약 7 내지 약 16개의 탄소 원자들을 갖는 알켄 사슬을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  65. 제 61 항에 있어서, 상기 도데센디오익 산 유도체는 도데센디오익 산 디에스테르인 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. 제 61 항에 있어서, 상기 도데센디오익 산 또는 도데센디오익 산 유도체는 약 1ppt 까지의 14C를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  67. 제 61 항에 있어서, 상기 알켄 사슬은 C3-C4 위치에 탄소 이중 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  68. 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체 및 C1-C2, C2-C3, C3-C4, C4-C5, C5-C6, C6-C7, C7-C8, C8-C9, C10-C11, C11-C12, C12-C13, C13-C14, C14- C15, C15-C16, C16-C17 혹은 C17-C18 위치에 탄소 이중 결합을 갖는 적어도 하나의 옥타데센디오익 산 또는 옥타데센디오익 산 유도체 부산물을 포함하며,
    상기 적어도 하나의 부산물은 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  69. 제 68 항에 있어서, 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체로부터 유도되는 적어도 2의 부산물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  70. 제 68 항에 있어서, 상기 9-옥타데센디오익 산 또는 9-옥타데센디오익 산 유도체는 약 1ppt 까지의 14C를 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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