KR20110120007A - 관능성 및 기능성이 뛰어난 발효두유 및 이의 제조방법 - Google Patents

관능성 및 기능성이 뛰어난 발효두유 및 이의 제조방법 Download PDF

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최지명
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Abstract

본 발명은 (1) 두유를 전처리하는 단계, (2) 바실러스 서브틸리스균을 두유에 접종시켜 발효시키는 단계 및 (3) 자색고구마 추출물을 첨가하는 단계를 포함하는 관능성과 기능성이 뛰어난 발효두유의 제조방법 및 발효두유를 제공한다. 보다 구체적으로 상기 제조방법에 의해 제조된 발효두유는 대두의 비린내와 비린맛이 제거되고 종래와는 색다른 맛을 지닐 뿐만 아니라, 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 개선능에 뛰어나기에 상기 발효두유 또는 이의 추출물을 유효성분으로 하여 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 약학조성물로 활용할 수 있다.

Description

관능성 및 기능성이 뛰어난 발효두유 및 이의 제조방법 {Fermented Soymilk with High Fructionality and Sensory properties and the Method thereof}
본 발명은 관능성과 기능성이 동시에 뛰어난 발효두유의 제조방법과 이에 의해 제조된 발효두유에 관한 것이다. 또한, 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.
대두는 우리나라에서는 오래전부터 두부, 된장, 콩 간장 등 여러 형태의 음식과 영양식으로 사용되어 왔으며, 필수 아미노산이 고루 함유되어 있는 양질의 단백질원으로 우유나 계란과 비교해도 거의 대등할 만큼 영양이 풍부하다. 대두에는 그 종류에 상관없이 40% 가량을 차지하는 단백질에는 필수 아미노산이 균형 있게 배합되어 있으며 다른 식품성 단백질에는 부족 되기 쉬운 리신이 많은 것이 특징이다. 지방 함유량은 18% 정도인데, 대부분이 불포화지방산이며 50% 이상이 최상급의 리놀렌산이다. 또 리놀렌산의 작용을 돕는 비타민 E도 충분하여 동물성 지방의 과잉섭취로 인한 콜레스테롤을 제거하는 역할도 한다. 그 외에 비타민 B가 풍부하여 피로회복을 도우며, 칼슘, 철분 등의 영양성분도 풍부하다. 이 밖에도 대두에 함유되어 있는 이소플라본 (isoflavon)은 유방암이나 전립선암과 같은 호르몬 관련 암에 대해서 강한 항암효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있으며, 여성의 갱년기 증상을 완화시켜주는 효과도 있는 것으로 밝혀지고 있다. 대두에 함유되어 있는 레시틴 (lecithin)이나 사포닌 (saponin)등은 체내 콜레스테롤 농도를 낮추어 줌으로써 각종 성인병을 예방하는 효과가 있으며, 이 밖에도 대두에는 각종 암과 성인병을 예방하여 주는 여러 가지 성분이 함유되어 있는 것으로 밝혀지고 있다.
이처럼 대두는 단백질과 지방의 영양공급원으로 중요한 역할을 하지만, 조직이 견고하여 소화 흡수가 매우 어렵다. 또한 풋내와 소화가 잘되지 않는 탄수화물, 트립신 저해제 등의 생리적인 저해 물질로 인하여 가공처리가 잘못될 경우 소화 흡수에 문제가 발생하여 설사 등의 부작용을 유발할 수 있다.
대두를 이용한 음료로는 대표적으로 두유와 두유를 발효시킨 두유발효유 등을 들 수 있는데, 종래의 두유는 대두 특유의 비린 냄새와 같은 대두취와 생두유에 존재하는 소인 (soyin)과 같은 안티트립신으로 소화의 장해를 일으키는 일이 많아서 문제점이 있었다.
발효두유는 대두을 원료로 하여 식품에 사용이 가능한 미생물을 이용하여 발효를 하는 것으로, 콩 자체만을 섭취하였을 경우 약 30%만 흡수되고 나머지 70%는 그냥 배설되어 버리지만 콩을 발효시켰을 경우에는 콩의 영양소가 90% 이상 체내에 흡수될 수 있어 영양분의 흡수의 측면에 있어 우수할 뿐 아니라, 발효두유에는 콩의 영양성분 뿐 아니라 미생물이 생산한 아밀라제, 프로테아제, 리파아제 및 혈전용해 효소 등의 효소와 이들 효소가 분해해서 생성된 펩타이드, 아미노산, 올리고당, 지방산, 활성이소플라본, 피토스테롤, 레시틴, 사포닌 등의 다양한 생리활성물질이 많이 포함되어 있다.
최근 국내에서 생산되고 있는 발효두유는 발효유를 제조하는 일반 유산균을 사용하여 나온 제품이 대부분으로 풍부한 영양분과 다양한 생리활성물질을 포함하고 있어 일반 두유에 비해 뛰어난 품질을 지님에도 불구하고 특유의 비린 냄새인 대두취가 두유와 동일하게 문제가 되고 있으며 거친 조직감으로 인해 마실 때 저항감을 주고 맛 또한 발효로 인해 두유 고유의 맛이 사라져 소비자의 선호를 충족시키지 못하고, 열처리에 의해 제품 중의 균이 파괴될 뿐만 아니라 제품이 응결하거나 불쾌한 맛이 발생하게 되는 문제점이 있었다.
현재시장에 나와 있는 두유 음료는 이러한 불쾌한 맛과 향을 향상시키기에서 위하여 감미료, 코코아, 과즙 등 첨가물의 맛이 확실히 인정될 정도로, 이들의 배합성분이 비교적 다량으로 배합되고, 또 풍미가 강한 향미료가 첨가된 것이 일반적이다. 이와 같이 여러 가지 성분이 비교적 다량으로 배합됨으로써 두유 음료 중에 배합되는 두유성분의 배합량은 저하되고 만다. 따라서 소비자가 두유를 선택하는 주목적은, 대두에 유래하는 단백질이나 이소플라본 등의 유효성분을 섭취하기 위한 것임에도 불구하고, 이와 같은 두유 음료에서는 기호성을 늘리기 위해서 비교적 다량으로 배합되는 상기의 배합성분에 의해 두유 음료 중의 두유함유량이 저하되고 만다는 문제가 있었다. 또, 시중에 유통되는 두유 음료는 비교적 감미가 강하고, 그리고 두유의 비린 맛과 냄새를 마스킹 하기 위해서 대단히 향기가 강한 향미료가 첨가되어 있기 때문에, 최근 소비자에 의해 선호되는 경향이 있는 담박한 느낌이나 뒷맛 양호함이 부족하다는 문제가 있었다.
본 발명에서는 대두의 불쾌취가 제거되고 자색고구마 추출물을 첨가로 인한 색다른 맛을 나타내며 항산화, 기억력과 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방, 개선능이 뛰어난 관능성과 기능성이 강화된 발효두유의 제조방법과 이에 의해 제조된 발효두유를 제공하고자 한다.
본 발명에서는 상기 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 치매 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 상기 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명은,
(1) 두유를 전처리하는 단계;
(2) 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균을 두유에 접종시켜 발효시키는 단계; 및
(3) 자색고구마 추출물을 첨가하는 단계;
를 포함하는 기능성과 관능성이 뛰어난 발효두유의 제조방법을 제공한다.
상기 두유는
(a) 대두를 물에 불리는 단계;
(b) 대두 중량의 7 배 내지 11배의 열수를 첨가하여 마쇄하는 단계; 및
(c) 상기 대두 마쇄물을 열처리하여 추출한 후 여과하는 단계;
를 포함하는 두유의 제조방법에 의해 얻어진 것이 바람직하다.
상기 (1)단계의 전처리는 121℃에 5분 내지 60분간 열처리하는 것을 특징으로 한다.
상기 (2)단계의 두유에는 바실러스 서브틸리스균 접종전에 두유에는 0.5 내지 2 중량%의 당이 첨가되는 것이 바람직하다
상기 (2)단계에서 상기 바실러스 서브틸리스균은 수탁번호 KCCM 42923인 것이 바람직하다.
상기 (2)단계에서 접종하는 바실러스 서브틸리스균의 수는 6 내지 9 logCFU/ml인 것이 바람직하다.
상기 (2)단계에서 바실러스 서브틸리스균을 접종한 두유를 30 내지 45℃에서 pH 4.5 내지 6.5에 도달하도록 발효시킨 것이다.
상기 (3)단계에서 자색고구마 추출물의 함량은 전체 발효두유 함량의 1 내지 10중량%가 되는 것이다.
상기 자색고구마 추출물의 농도는 60 내지 80o Brix인 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기 제조방법에 의해 제조된 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 개선용 발효두유를 제공한다.
본 발명에서는 상기 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출한 것이 바람직하다.
본 발명에서는 상기 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 대두의 불쾌취를 제거하고 섭취시 소화력이 향상되며 색다른 맛을 첨가하여 관능성을 향상시킴과 동시에 항산화, 기억력과 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방, 개선 등의 기능성이 뛰어난 발효두유를 제공하고, 상기 발효두유를 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 치매 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 발효두유 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 부작용이 없으며 안정적이어서, 식품, 의약품 등 다양한 분야에 활용가능하기에 본 발명의 산업적 가치는 클 것이다.
도 1은 강화사자발쑥, 마늘, 산수유, 자색고구마의 DPPH 소거효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 강화사자발쑥, 마늘, 산수유, 자색고구마의 OH 소거효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 강화사자발쑥, 마늘, 산수유, 자색고구마를 첨가한 발효두유의 관능평가를 나타낸 것이다.
도 4는 자색고구마 열수 추출물을 1%, 5%, 10% 첨가했을 때의 관능평가를 나타낸 것이다.
도 5는 알츠하이머 유발 마우스의 물체인지능력을 실험한 결과이다.
도 6은 알츠하이머 유발 마우스의 T-maze 실험결과로서 기억손상보호효과를 알 수 있다.
도 7은 물 미로 (Morris Water Maze) 실험에서 3일동안 마우스의 학습진행을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 물 미로 (Morris Water Maze) 실험에서 마지막 날에 도피대를 숨겼을 때와 숨기지 않고 드러냈을 때 마우스가 도피대를 찾아가는 시간을 비교한 그래프이다.
도 9는 물 미로 (Morris Water Maze) 실험에서 도피대를 치웠을 때 마우스가 도피대가 위치한 구역에 머무는 시간을 측정한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하도록 하겠다.
본 발명자는 양질의 단백질이 풍부한 두유를 발효시킴으로 맛, 향 등 관능성이 뛰어날 뿐만 아니라 종래의 두유와는 다른 기능성이 뛰어난 두유제품을 제조하고자 하였다. 이러한 두유의 제조를 위해 일반적으로 발효두유를 만들때 사용하는 우유발효시 사용되는 동물성 유산균이 아닌 식물 발효시 사용되는 발효균을 선택하였고, 항산화능력의 테스트 및 관능검사를 통하여 가장 뛰어난 맛과 생체내 유용한 기능을 나타낼 수 있는 균주로 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균을 선별할 수 있었다. 특히 바실러스 서브틸리스균 중에서 신규주인 바실러스 서브틸리스 2805-PNU 014, 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015, 바실러스 서브틸리스 2825-PNU 016로 발효된 발효두유가 가장 관능성과 기능성 면에서 뛰어났으나, 이러한 발효과정을 거쳐도 바실러스에 의한 발효과정에서 발생하는 다소의 냄새와 두유 자체의 콩비린내와 맛이 완전히 사라지지 않으며, 발효로 인한 형성된 신맛이 소비자에게 어필하기엔 다소 부족함을 확인하였다. 여러 식물군 중에서 상기 발효두유의 맛과 가장 조화를 이루면서 불쾌취와 맛을 제거하며 기능성을 살릴 수 있는 첨가가능한 첨가 식품을 찾고자 노력하던 중 자색고구마를 선별할 수 있었으며, 상기 발효두유에 자색고구마 추출물을 첨가하면 소화에 두유의 불쾌취가 크게 감소되고 색상, 맛 등 기호성이 뛰어나며 기억력, 인지능력 및 치매 치료 효과가 뛰어남을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 관능성과 기능성이 뛰어난 발효두유는 하기 단계를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
(1) 두유를 전처리하는 단계,
(2) 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균을 두유에 접종시켜 발효시키는 단계 및
(3) 자색고구마 추출물을 첨가하는 단계.
상기 (1)단계에서, 사용가능한 두유는 그 종류에 있어서 특별히 한정되지 않는다. 시판되는 것을 구입할 수도 있고 당업계에서 통상 사용되는 두유의 제조공정을 거칠 수 있으나, 바람직하게는 (a) 대두를 물에 불리는 단계, (b) 대두 중량의 7 배 내지 11배의 열수를 첨가하여 마쇄하는 단계 및 (c) 상기 대두 마쇄물을 열처리하여 추출한 후 여과하는 단계를 포함하는 두유의 제조방법에 의해 얻을 수 있다.
이때 대두를 정선하여 물에 불릴 수 있으며, 물에 불리는 온도는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 90 내지 150℃에서 불릴 수 있다. 상기 불린 대두를 대두 중량의 7 배 내지 11 배, 바람직하게는 8 내지 10배의 물을 첨가할 수 있으며, 상기 물의 온도는 열수, 바람직하게는 90 내지 120℃의 열수, 보다 바람직하게는 95℃의 열수를 첨가하여 마쇄를 함으로 두유의 품질향상과 높은 수율의 유효성분을 추출할 수 있다. 상기 대두 마쇄물을 열처리하여 추출한 후 여과를 거친 여과물을 두유로 수득할 수 있다.
상기 (1)단계에서의 전처리를 통해 멸균, 탈취 및 두유의 흡수력을 향상시킬 수 있다. 이러한 전처리 단계는 특별히 한정되는 것은 아니나, 열처리를 통해 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 121℃에 5 내지 60분, 더욱 바람직하게는 10분 내지 20분간 열처리할 수 있다.
상기보다 가열시간이 짧으면 잡균의 멸균이 충분히 이루어지지 않아 두유를 바실러스 서브틸리스균으로의 발효시 부패균이나 오염균 등 원치 않는 잡균이 동시에 성장할 수 있으며, 상기 가열시간보다 길면 두유 내의 영양분이 파괴될 수가 있다. 또한, 콩의 비린내는 헥사놀 (hexanol)을 포함한 다양한 물질들에 의해 이루어지는 것으로 상기 고온으로의 열수의 첨가를 통해, 탈취의 효과도 얻을 수 있으며 프로테아제 인히비터 (protease inhibitor)나 피테이트 (phytate)와 같은 대두에 포함되어 있는 소화방해물질들을 파괴시킬 수 있기 때문에 상기 열처리를 거친 두유는 소화율을 높 수 있다.
상기(2)단계의 상기 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균은 그 종류에 있어서 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 2805-PNU 014, 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015 및 바실러스 서브틸리스 2825-PNU 016로 이루어진 것 중에서 선택된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015 (한국미생물보존센터, 수탁번호 KCCM 42923)일 수 있다.
본 발명에서는 상기 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균을 접종한 두유와 접종하지 않은 두유를 비교해 보았을때 접종한 균의 항산화 능력이 좋으며, 바실러스 서브틸리스균 중에서 바실러스 서브틸리스 2805-PNU 014, 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015 및 바실러스 서브틸리스 2825-PNU 016가 항산화 능력이 뛰어나다. 일반적으로 바실러스는 발효시 강한 암모니아취를 생성하는데 반해, 상기 바실러스 서브틸리스 2805-PNU 014, 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015 및 바실러스 서브틸리스 2825-PNU 016는 항산화력이 강하면서도 암모니아취가 불쾌하지 않으며 단백질 분해효소역가 또한 높았다. 이들 중 특히 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015는 DPPH와 OH 소거능 효과가 가장 뛰어날 뿐 아니라 발효시 발효취가 두유의 향미를 가릴 정도로 불쾌하지 않은 균주로서, 발효를 거친 두유는 종래의 두유에 비해 콩 비린내 및 비린 맛이 감소하였을 뿐만 아니라 섭취시 소화력이 약한 성인이나 어린이나 환자들도 적합할 정도로 흡수력이 향상될 수 있다.
상기 바실러스 서브틸리스의 접종전에, 바실러스 서브틸리스 생육에 적절한 온도를 선택할 수 있으며, 본 발명의 일례로 바실러스 서브틸리스 2805-PNU 014, 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015 또는 바실러스 서브틸리스 2825-PNU 016의 경우 상기 (1)단계에서 전처리 된 두유를 바실러스 서브틸리스의 최적생육온도인 30 내지 45℃, 바람직하게는 37 내지 40℃로 냉각시킬 수 있다.
또한, 바실러스 서브틸리스균의 접종전 두유내 0.5 내지 2%, 바람직하게는 1%의 당을 함유시킬 수 있다. 이때 상기 당은 포도당이 적절할 수 있다. 상기 당의 농도는 발효두유의 맛을 훼손시키지 않으면서 발효가 일어나는데 적절한 양분을 공급하여 발효의 원활한 진행을 도와주고 발효시간의 단축시킬 수 있다.
본 발명의 발효시 전체 발효두유의 1 중량% 바실러스 서브틸리스균으로 접종할 수 있는데, 이때의 균수는 6 내지 9 logCFU/ml, 바람직하게는 7 내지 8 logCFU/ml일 수 있다.
상기 발효온도는 특별히 한정되는 것은 아니나 30 내지 45℃, 바람직하게는 37 내지 40℃에서 5시간 내지 24시간을 발효하는 것이 바람직할 수 있는데, 상기 발효시간은 pH 4.5 내지 6.5, 바람직하게는 pH 5.3 내지 5.7이 되는 시점의 시간으로 결정하는 것이 바람직하다. pH4.5 이하에서 콩단백질의 두유내 용해률이 현저히 감소되어 바람직하지 못하며, 산이 형성되어 맛이 시큼하고 커드가 형성되어 관능성이 현저하게 떨어지는 반면, 본 발명의 상기 범위는 산과 커드 (curd)의 생성이 적어 향, 맛, 삼키는 감촉이 가장 우수할 뿐만 아니라 비린 맛과 향이 크게 감소되어 관능성이 가장 뛰어난 pH 범위이다.
또한, 발효 종료후 발효두유를 냉장보관시 6일 내지 15일, 바람직하게는 7일 내지 10일간 바실러스 서브틸리스균의 수는 6 logCFU/ml 이상으로 유지는 것이 바람직하다. 상기 기간 동안의 발효균수의 유지는 발효두유의 입맛을 돋구는 신맛을 제공하고 pH를 낮추어 장기간 부패균의 성장을 방지할 뿐 아니라 생체내에서 몸의 균형과 건강을 유지하는 등 발효두유의 프로바이오틱 (probiotics) 효과를 나타내도록 하기에 중요하다.
기술한 바와 같이바실러스 서브틸리스균으로 두유를 발효시키는 (2)단계를 거칠 경우, 두유의 소화흡수률이 향상되고 비린맛과 냄새가 종래의 두유에 비해 감소되어 종래의 두유에 비해 맛, 향 등의 관능성이 향상되며, 발효과정 중 바실러스 서브틸리스균에 의해 다양한 생리활성물질이 생성되어 기능성이 향상되지만, 종래 두유의 비린 맛과 냄새가 완전히 사라지지 않으며, 발효두유를 차가운 곳에 저장하면 콩의 비린 냄새가 다소 강해졌다.
상기 (3)단계의 자색고구마 추출물의 추출방법은 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법으로 추출할 수 있으나, 바람직하게는 열추출일 수 있다.
상기 발효두유 첨가물로의 자색고구마의 선정은 발효두유와 혼합시 가장 선호되는 맛, 외관, 향, 조직감 및 종합적 선호도를 고려한 것일 뿐만 아니라, 발효두유와 혼합됨으로 시너지 효과를 내어 높은 항산화력, 기억력과 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방, 개선능을 강화시키는 식품을 선정한 것이다.
상기 자색고구마 열추출물을 발효두유의 전체의 1 내지 10%, 바람직하게는 4 내지 6 중량%, 가장 바람직하게는 5%가 되도록 첨가할 수 있는데, 이때 추출물의 농도는 60 내지 80°Brix, 바람직하게는 65 내지 75°Brix, 가장 바람직하게는 70°Brix 일 수 있다. 즉 특히 자색고구마 열추출물의 농도는 70°Brix이고 함량은 5 %일때가 관능성이 최적으로 극대화된 지점일 수 있다.
상기 농도와 함량보다 추출물의 농도와 함량이 낮으며 두유의 비린 맛과 냄새를 완전히 감추지 못하고 단맛보다는 신맛이 강하여 맛이 균형을 이루지 못할 수 있으며, 이보다 높으면 두유의 비린 맛과 냄새는 사라지지만 색상이 지나치게 진한 보라색을 띠어 식욕을 돋구지 못하고 단맛이 강해지며 두유 고유의 맛과 단백한 맛이 손실될 수 있다.
상기 자색고구마 추출물의 첨가순서는 생성공정의 단계의 순서에 크게 제한되는 것은 아니며, 두유를 제조하는 단계, 두유를 발효시키는 단계 또는 발효가 끝난 단계의 어느 단계에서도 첨가할 수 있으나, 바람직하게는 두유의 발효가 끝난 후에 첨가하는 것이 바람직하다.
두유를 제조하는 단계나 발효시키는 단계에서 자색고구마 추출물을 첨가할 경우 두유의 비린 맛과 향을 제거하기 위해서는 자색고구마 추출물의 첨가량이 발효단계가 끝난 후의 추출물의 첨가량보다 많아야 동일한 효과를 나타내기에, 상대적으로 두유의 배합량이 감소되어 대두에서 유래하는 단백질이나 이소플라본 등의 유효성분의 함량이 감소되고, 자색고구마의 단맛이 두유 자체의 고유한 맛과 단백한 맛을 가리게 되며, 발효두유의 색상이 자색으로 지나치게 강하게 되어 시각적으로 식욕을 감소시키기에, 자색고구마 추출물을 두유의 발효가 끝난 후에 첨가하는 것이 적당할 수 있다.
상기 (3)단계의 자색고구마 추출물 첨가로 (2)단계의 발효처리로 인한 신맛이 상쇄되고 자색고구마 맛과 조화를 이루어 달작지근하면서도 단백한 맛을 느낄 수 있으며, 발효 후에도 다소 남아있던 두유의 비린 맛과 냄새를 크게 상쇄시킬 수 있다.
본 발명은 상기 제조방법에 따라 제조된 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 및 치료용 발효두유를 제공한다.
본 발명의 발효두유는 자색고구마의 맛과 조화를 이루어 달작지근하면서도 단백한 맛을 느낄 수 있어 종래 발효두유와는 색다른 맛을 제공하고 발효두유의 문제점으로 지적되었던 두유의 비린 맛과 냄새가 크게 감소 되었으며, 또한 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선, 지질과산화 억제, NO 생성의 억제 그리고 치매 질환의 예방 및 개선에 뛰어남을 확인할 수 있다.즉, 본 발명의 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 또는 치매 질환의 예방 및 개선용 발효두유는 바실러스 서브틸리스, 바람직하게는 신규한 균주들인 바실러스 서브틸리스 2805-PNU 014, 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015 또는 바실러스 서브틸리스 2825-PNU 016, 더욱 바람직하게는 바실러스 서브틸리스 2829-PNU 015에 의해 발효된 것으로 항산화능이 뛰어나며 상기 바실러스균에 의해 다양한 생리활성물질이 생성되고 자색고구마 추출물을 첨가함으로 발효두유의 기능성이 향상되며 또한 색다른 맛을 선보임으로 관능성이 강화될 수 있다.
본 발명은 상기 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 발효두유의 추출물은 당업계에 사용되는 일반적 방법에 따라 추출될 수 있으나, 바람직하게는 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메탄올로 추출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일례로, 제조된 발효두유을 동결건조시키고 분말화한 것을 메탄올을 사용하여 추출할 수 있으며, 분말화된 발효두유 중량의 2 배 내지 20배, 바람직하게는 5배 내지 15배의 메탄올을 첨가하여 추출할 수 있다.
상기 조성물은 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 및 개선능이 뛰어나고 부작용이 적으면서도 안정적이어서, 식품, 의약품, 화장품 등 원료로서 사용 가능하며, 또한 약학적으로 허용되는 범위에서 직접 복용할 수도 있을 것이다.
본 발명은 상기 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 발효두유 추출물을 0.1 내지 90 중량%로 포함한다.
본 발명의 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 예를 들면 과립제, 세립제, 산제, 경질캡슐제, 연질캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제 또는 액제 등의 경구 투여용 약학 조성물로서 투여해도 되고, 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 피하 투여용 주사제, 점액제, 좌제, 경피흡수제, 경점막 흡수제, 점비제, 점이제, 점안제, 흡입제, 크림제, 연고제, 파프제 등의 비경구 투여용 의약조성물로서 투여하는 것도 가능하다. 분말형태의 약학조성물로서 조제된 제제를 사용시에 용해하여 주사제 또는 점액제로서 사용해도 된다.
약학 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 즉, 경구용 고형제제를 제조하는 경우는, 주약에 부형제, 추가로 필요에 따라 결합제, 붕괴제, 활택제, 착색제 등을 첨가한 후, 통상적인 방법에 의해 정제, 피복정제, 과립제, 산제, 캡슐제 등 형태의 제제를 조제할 수 있다. 사용되는 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분 (corn starch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘, 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스 (tragacanth), 젤라틴, 셀락 (shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린, 펙틴 (pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의 (糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.
경구 투여를 위한 액체제제, 예를 들면 유제, 시럽제, 현탁제, 액제의 제조에는 일반적으로 사용되는 불활성인 희석제, 예를 들면 물 또는 식물유를 사용할 수 있다. 이 제제에는 불활성인 희석제 이외에 보조제, 예를 들면 습윤제, 현탁 보조제, 감미제, 방향제, 착색제 또는 보존제를 배합할 수 있다. 액체제제를 조제한 후, 젤라틴과 같은 흡수될 수 있는 물질의 캡슐 속에 충전해도 된다. 비경구 투여용 제제, 예를 들면 주사제 또는 좌제 등의 제조에 사용되는 용제 또는 현탁제로서는, 예를들면 물, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 벤질알코올, 올레산에틸, 레시틴을 들 수 있다. 좌제의 제조에 사용되는 기제로서는, 예를 들면 카카오버터, 유화 카카오버터, 라우린버터, 위텝졸을 들 수 있다. 제제의 조제방법은 특별히 한정되지 않고, 당업계에서 범용되고 있는 방법은 모두 이용 가능하다.
주사제의 형태로 하는 경우에는, 담체로서 예를 들면 물, 에틸알코올, 마크로골 (macrogol), 프로필렌글리콜, 구연산, 초산, 인산, 젖산, 젖산나트륨, 황산 및 수산화나트륨 등의 희석제; 구연산나트륨, 초산나트륨 및 인산나트륨 등의 pH 조정제 및 완충제; 피로아황산나트륨, 에틸렌디아민사초산, 티오글리콜산 및 티오젖산 등의 안정화제 등을 사용할 수 있다. 또한, 이 경우, 등장성 용액을 조제하기 위해 충분한 양의 식염, 포도당, 만니톨 또는 글리세린을 제제 중에 배합해도 되고, 통상의 용해 보조제, 무통화제 또는 국소 마취제 등을 사용하는 것도 가능하다.
연고제, 예를 들면 페이스트, 크림 및 겔의 형태로 하는 경우에는, 통상 사용되는 기제, 안정제, 습윤제 및 보존제 등을 필요에 따라 배합할 수 있어, 통상적인 방법에 의해 성분을 혼합하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학의 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 추출물을 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 그러나, 본 발명의 추출물의 상기 투여량은 투여 경로, 투여자의 연령, 성별, 체중, 질환의 중증도, 건강상태 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.
본 발명은 상기 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능 식품류 등이 있다.본 발명의 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 재료의 준비
실시예1 -1 청국장
청국장은 순창지역의 대표적인 6가지 청국장을 구입하여 그 중에서 관능평가를 통해 선별된 3가지 청국장 중에서 가장 항산화능이 우수한 청국장을 Bacillus균 분리를 위한 청국장으로 사용하였다.
실시예1 -2 두유
발효두유 제조를 위하여 동화식품(양산, 한국)에서 구입하여 사용하였다.
실시예1 -3 Bacillus 균
순창지역의 대표적인 6가지 청국장중 관능평가를 통해 선별된 3가지 청국장 중 항산화능이 가장 우수한 청국장 중에서 Bacilllus subtilis 2805- PNU 014, Bacillus subtilis 2829- PNU 015, Bacillus subtilis 2825- PNU 016을 분리, 동정하여 사용하였다.
실시예1 -4 기능성소재
항산화, 인지능력 개선 및 알츠하이머 질환 예방용 발효두유의 제조를 위하여 공동연구를 수행하고 있는 (주)천호식품에서 강화사자발쑥, 마늘, 산수유, 자색고구마 열수추출물을 공급받아 사용하였다.
실시예2 : 발효두유 제조
전북 순창지역에서 6종류의 청국장을 구입하여 관능검사를 통해 관능성이 가장 우수한 3종류의 청국장을 선별하고, 이들의 항산화 활성 측정을 통하여 효과가 가장 뛰어난 1종류의 청국장을 선별하였다. 이 청국장에서 3종류의 Bacillus subtilis균을 분리하였고 이것과 활성을 비교하기 위해 공시균주로 한국 미생물 보존 센터에서 분양받은 Bacillus subtilis균, 그리고 상업적으로 이용되는 Bacillus subtilis균 등 5종류의 균으로 두유를 발효하여 항산화 활성을 측정한 결과, 청국장에서 분리한 3종류의 균 중 Bacillus subtilis 2829 PNU - 015균의 항산화활성이 가장 뛰어난 결과를 보였으므로 항산화 활성을 증진 시킬 수 있는 최적의 발효균주로서 본 두유 발효에 사용하였다 (기탁번호:KCCM 42923, 기탁일자 2009년 3월 26일).
두유를 발효하기 위해서 두유에 1%의 포도당을 첨가한 뒤에 121℃에서 15분간 멸균하고 37℃로 냉각한다. 그러한 다음에 발효균주로 선정한 Bacillus subtilis 2829 PNU - 015균을 1% 접종하였다. 이를 37℃의 shaking water bath에서 약 8시간 발효하여 pH가 5.5±0.2에 도달하면 발효를 멈추었다. 기능성 발효두유제조는 상기에서 서술한바와 같이 발효시킨 두유에 70°Brix 자색고구마 열수추출물이 최종농도가 5%가 되도록 첨가한다. 제조된 발효두유는 동결건조와 분말화 과정을 거쳐 10배 중량의 100%메탄올로 실온에서 24시간동안 3회 추출한 후, 그 여과추출물을 진공회전농축기로 36-40℃에서 감압 농축하여 추출물을 수득하여 항산화 활성의 실험에 사용하였다.
실시예3 : Bacillus subtilis 균의 항산화 효과
상기에 서술한 항산화 활성이 가장 우수한 청국장으로부터 분리한 Bacillus subtilis 2805 PNU -014, Bacillus subtilis 2829 PNU -015, Bacillus subtilis 2825 PNU-016과 한국미생물보존센터에서 분양받은 균과 상업성 Bacillus subtilis균 중에서 항산화 활성이 가장 뛰어난 균을 선정하고자 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) 소거 효과, OH (hydroxyl radical) 소거 효과로 Bacillus subtilis균주의 항산화 활성을 알아보았다.
하기 표1과 2에 각각의 Bacilllus subtilis균으로 발효한 발효두유의 DPPH 소거 효과와 OH 소거 효과를 나타내었다.
Treatment(μg/mL) DPPH radical scavenging activity(%)
SM FSM-1 FSM-2 FSM-3 FSM-4 FSM-5
100 23.6±0.3d 25.4±0.3bc 20.0±0.2e 28.1±0.6a 24.6±0.1c 25.7±0.1b
500 50.2±0.4e 59.2±0.5d 61.0±0.4d 78.9±0.2a 69.6±0.4b 65.2±2.1c
1000 68.4±0.7d 74.0±0.7c 77.3±1.0c 98.1±3.1b 104.1±0.6a 97.3±2.2b
SM : Soymilk
FSM-1 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis 11316 from KCCM
FSM-2 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis from Vilac　
FSM-3 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis PNU 2805-014　
FSM-4 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis PNU 2829-015
FSM-5 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis PNU 2825-016
Values are mean ± SD
a-eMeans with the different letters are signigicantly different (p<0.05) by Ducan's multiple range test.
Treatment(μg/mL) OH radical scavenging activity(%)
SM FSM-1 FSM-2 FSM-3 FM-4 FSM-5
100 85.7±0.0d 86.8±0.2cd 82.7±0.2e 89.4±0.2a 88.8±0.4ab 87.7±0.7bc
500 90.0±0.2b 83.3±0.2c 82.1±0.9c 88.0±0.1b 89.8±0.7b 97.1±2.6a
1000 82.6±0.3b 89.5±0.6a 83.8±1.4b 84.6±1.1b 90.8±2.2a 84.5±0.7b
SM : Soymilk
FSM-1 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis 11316 from KCCM
FSM-2 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis from Vilac　
FSM-3 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis PNU 2805-014
FSM-4 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis PNU 2829-015
FSM-5 : Fermented soymilk by Bacillus subtilis PNU 2825-016
Values are mean ± SD
a- eMeans with the different letters are signigicantly different (p<0.05) by Ducan's multiple range test.
상기 표 1과 2에서 알 수 있듯이 Bacillus subtilis 2829 PNU -015의 DPPH 소거 효과는 104.1%, OH 소거 효과는 90.8%로 실험한 5종의 Bacillus 균주 중 항산화 활성이 가장 뛰어난 것으로 나타났다. 그리하여 항산화 활성이 가장 우수한 균주인 Bacillus subtilis 2829 PNU -015를 2009년 3월 26일자로 기탁하였다 (한국미생물보존센터, 기탁번호 :KCCM 42923).
실시예4 : 항산화 기능성이 우수한 기능성 재료의 선정 및 첨가량 결정
실시예 4-1 항산화능 측정
건강기능식품으로 제조되어 사용되고 있는 강화사자발쑥, 마늘, 산수유, 자색고구마의 추출물의 DPPH 소거효과와 OH 소거 효과를 측정하여 도1, 도2에 정리하였다. 강화사자발쑥, 마늘, 산수유, 자색고구마는 농축액을 천호식품 (부산, 한국)으로부터 공급받았다.
DPPH 소거능 측정은 Hatano등 (Hatano T, Edamatsu R, Hiramatsu M, Fujita Y, Yasuhara T, Yoshida T, Okuda T. : Effects of the interaction of tannins with co-existing substances, Ⅵ. Effects of tannins and related polyphenols on superoxide anion radical, and on 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical. Chem. Pharm. Bull. 37:2016-2021 (1989))의 측정법을 이용하였다.
농도별로 ethanol (EtOH)에 녹인 시료 100μM과 60μM DPPH 용액 100μM을 96-well plate에 혼합하여 30분간 실온에 방치시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 free radical 소거효과를 백분율(%)로 나타내었다.
OH 소거능 측정은 Chung등 (Chung SK, Osawa T, Kawajusgu S. : Hydroxyl radical-scavenging effects of spices and scavengers fro brown musard(Brassica nigra). J. Biosci. Biotech. Biochem. 61:118-123 (1997))의 측정법을 이용하였다.
Fenton 반응에 따라 10mM FeSO4 7H2O-EDTA에 10mM의 2-deoxyribose solution과 농도별 시료용액을 혼합한 다음, 10mM의 H2O2를 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양한다. 이 혼합액에 2.8% trichloroacetic acid (TCA)와 1.0% thiobarbituric acid(TBA) solution을 각각 첨가하여 10분간 boiling한 후 cooling하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다.
하기 도1, 도2 에서 나타난 바와 같이, DPPH 소거 효과에서 자색고구마 열수추출물이 90%이상의 높은 소거 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있고, OH 소거능 역시 80% 이상의 소거능을 보이는 것을 확인할 수 있다. 그리고 관능성 또한 뛰어난 발효두유의 제조를 위하여 강화사자발쑥, 마늘, 산수유, 자색 고구마 각각의 열수 추출물 5%를 섞어 관능성을 평가하였다.
실시예 4-2 관능성 측정
관능특성을 측정하기 위해 부산대학교 식품영양학과 대학원생(20대 여성 10명)의 panel을 대상으로 하였다. 평가 항목은 외관 (appearance), 향 (flavor), 맛 (taste), 조직감 (texture) 및 종합적 기호도 (overall acceptability)의 5개 항목으로 1점은 가장 나쁘다, 9점은 가장 좋다로 나타낸 9점 척도법으로 평가하고 그 평균값을 구하여 QDA profile로 나타내었다.
하기 도 3에서 나타난 바와 같이, 자색 고구마 열수추출물을 첨가한 발효두유의 관능평가가 다른 기능성 재료들에 비하여 월등히 높았다.
상기의 내용에 의하여 선정된 자색고구마 열수 추출물을 발효두유에 첨가할 농도를 결정하기 위하여 70°Brix 농도의 자색고구마 열수 추출물을 발효두유에 1%, 5%, 10%이 농도별로 첨가하여 관능평가를 실시하였다.
하기 도 4에서 나타난 바와 같이, 실시 결과 5%>10%>1%의 첨가량 순서로 관능성이 좋은 것을 확인할 수 있었는데, 5%와 10% 첨가 수준에서는 대부분의 항목에서 비슷한 점수를 나타냈지만 외관상 보이는 색과 향이 10% 첨가했을 때보다 5%를 첨가했을 경우가 더욱 높게 나타났다.
실시예5 : 기능성 발효두유의 항산화 효과
70°Brix 자색 고구마 열수 추출물을 두유에 5% 첨가하여 Bacillus subtilis균으로 발효시킨 기능성 발효두유의 항산화 효과를 알아보기 위하여 상기의 실시예3에서 행하였던 것과 마찬가지로 DPPH 소거 효과와 OH 소거 효과를 실험하고 얻어진 결과를 하기 표3에 정리하였다.
Treatment(μg/ml) Scavenging activity(%)
DPPH OH
100 14.3±0.2d 92.8±0.2d
250 47.8±0.7c 96.2±0.2c
500 70.5±0.3b 97.4±0.2b
1000 131.0±7.5a 102.8±0.4a
Values are mean ± SD.
a- dMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan'smultiplerangetest.
상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 기능성 발효두유의 DPPH 및 OH 소거 효과는 농도 의존적으로 증가하는 것으로 나타나 자색 고구마 열수 추출물 첨가 발효두유의 항산화 기능성을 확인하였다.
실시예6 : 기능성 발효두유의 알츠하이머 유발 마우스에서 인지능력 개선 효과
실시예6 -1 실험동물 및 사육
5주령의 ICR 마우스 (25~27g, 수컷) 32마리를 (주)오리엔트바이오에서 구입하여 1주일간 일반식이로 안정화시킨 후 실험에 사용하였다. 사육실의 온도 및 습도는 20±2℃, 50±10%로 유지하였고, 명암은 12시간 간격으로 light-dark cycle을 유지하였다. 사료로는 퓨리나 (한국, 조단백질 21.1%, 조지방 3.5%, 조섬유 5.0%, 조회분 8.0%, 칼슘 0.6%, 인 0.6%)의 고형사료를 이용하였고 음용수는 생수를 이용하였다.
실험동물은 1주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 각 군의 체중이 동일하게 조정하여 정상군 (Normal), 대조군(Amyloid-β25- 35처리군, Control), Aβ25- 35처리후 자색고구마 열수 추출물 첨가 발효두유를 100mg/kg/day 경구 투여군, Aβ처리 후 자색고구마 열수 추출물 첨가 발효두유 200mg/kg/day 경구 투여군으로 나누었다. 그런 다음에 normal군은 정수리에 멸균시킨 생리식염수를 주입하였고 나머지 군 (control, 100mg/kg/day, 200mg/kg/day)들은 Aβ25-35를 주입하였다.
실시예6-2 실험동물의 기억 손상 유발
각 군당 8마리씩 총 32마리의 ICR 마우스를 ether로 마취시킨 다음, Laursen과 Belknap방법 (Laursen SE, Belknap JK. : Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. J. Pharmacol. Methods 16:355-357 (1986))에 따라 Aβ25-35를 26-gauge needle이 달려있는 10μL Hemilton micro-syringe로 각 실험동물의 정수리에 2.2 mm 깊이로 Aβ25-35를 5μL 주입하여 기억 손상을 유발하였다. 이 때에 Normal군은 멸균시킨 생리식염수를 주입하였다.
실시예6 -3 실험동물의 인지능력 행동실험
① 물체인지 실험
물체인지 능력을 관찰하기 위하여 뚜껑이 없는 검은 박스를 사용하였다. 실험 하루 전날 박스에 똑같은 물체 (A1 과 A2)를 양쪽에 두고 10분간 두 물체에 대한 적응 시간을 갖게 한다. 24시간 후, 전날 두 물체 중 하나의 물체를 새로운 물체로 바꾸고 (A1 과 B) 기존 물체와 새 물체에 대한 탐색정도를 수치화하여 비교하였다. 본 실험에 사용되는 물체 A1, A2 그리고 B는 모두 플라스틱 재질로 사용했으며 크기와 색상은 비슷한 것으로 사용하였다. 물체는 검은 박스에 대각선 방향에 따라 놓았고 마우스는 두 물체의 가운데에서 출발시켰다. 실험이 끝날 때마다 70% 알코올로 박스와 물체를 소독하였다.
물체인지 검사는 주로 시각 인지기억을 측정하는데 유용한 검사로 알려져 있다.(Tang YP, Shimiqu E, Dube GR, Rampon C, Kerchner GA, Zhuo M. : Genetic enhancement of learning and memory in mice. Nature 401:63-69 (1999)) 마우스에게 동일한 두 물체를 제시하면 두 물체를 만지는 횟수가 비슷하지만 24시간 후 두 물체 중 하나를 새로운 물체로 바꿔 놓으면 보통 마우스는 새로운 물체에 대해 더 많은 호기심을 가지는 습성 때문에 새로운 물체를 만지는 비율이 더 크게 된다. 그러나 기억력 손상이 있는 마우스는 새로운 물체를 구분하지 못해 만지는 비율의 증가가 없다.
자색고구마 열수추출물 첨가 발효두유의 메탄올 추출물을 생수에 녹여 경구투여한 마우스의 물체인지 실험 결과는 도 5에 나타내었다.
하기 도 5에서 나타난 바와 같이, Control군은 A1과 B에 대한 접촉 빈도가 43.57%와 44.67%로 거의 차이가 없음을 알 수 있다. 하지만 자색고구마 첨가 발효두유 추출물을 100mg/kg/day로 경구투여한 군은 새로운 물체를 인지하는 정도가 54.67%, 200mg/kg/day로 경구투여한 군은 54.74%로 normal군이 인지한 정도인 59.32%과 비슷함으로써 모두 새로운 물체에 대한 접촉 빈도가 높은 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과를 바탕으로 자색고구마 열수추출물 첨가 발효두유의 시각인지 기억능력 손상에 대한 보호효과가 있음을 알 수 있다.
② T-maze 실험
Montgomery의 방법(Montgomery KC. : A test of two explanations of spontaneous alternation. J. Comp. Physiol. 45:287-293 (1952))에 따라, T-maze 실험을 실시하였다. 검정색으로 제작된 T-maze 형 미로로서 출발상자, 왼쪽 팔, 오른쪽 팔로 구성하여 오른쪽 팔 통로부분에는 분리할 수 있는 차단문을 설치하였다. 실험 하루 전날 차단문으로 T-maze의 오른쪽 팔 통로를 막고, 왼쪽 팔은 개방한 상태로 마우스를 출발지점에서 출발시킨다. 10분 동안 마우스를 자유롭게 이동하면서 적응시간을 갖도록 한다. 24시간 후 왼쪽 팔과 함께 오른쪽 팔의 통로도 함께 개방하여 마우스가 10분 동안 왼쪽 팔과 오른쪽 팔에 들어간 횟수를 기록하여 비교한다. 마우스 몸통의 이분의 일까지 통로로 들어간 경우 통과한 것으로 간주하였다.
마우스는 새로운 물체나 새로운 공간에 대한 호기심이 많은 동물이다. T-maze 의 실험 결과는 도 6에 나타내었다.
하기 도 6에서 나타난 바와 같이, Control군의 경우에는 왼쪽 팔 (old route)과 오른쪽 팔 (new route)의 접근 정도가 47.85%와 52.15%였다. 하지만 자색고구마 첨가 발효두유 추출물을 100mg/kg/day로 경구투여한 군은 new route를 인지하는 정도가 54.57%, 200mg/kg/day로 경구투여한 군은 54.75%로 normal군이 인지한 정도인 57.02%와 비슷한 결과를 나타내었다. 이로써 자색고구마 열수추출물을 첨가한 발효두유의 알츠하이머 유발 마우스의 기억 손상에 대한 보호효과가 있다는 것을 알 수 있다.
③ 물 미로 (Morris water maze) 실험
Morris의 실험방법 (Morris R. : Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci. Methods 11:47-60 (1984))에 따라 수조를 준비하여 가상적인 선을 그어 균등하게 사등분하고, 그 중 한 구역 중간에 물 수면으로부터 5mm 정도 아래에 원형 도피대를 위치시켰다. 22±2℃의 물에 탈지분유를 타서 도피대가 보이지 않게 하여 마우스가 수영할 때 직접 도피대를 보고 찾아갈 수 없게 하였다. 마우스가 수조 주위에 공간 단서를 사용하여 도피대를 찾아가도록 사등분한 수조 벽면에는 서로 다른 모양의 스티커를 붙였다. 또한 실험이 진행되는 동안에는 수조 주변에 모든 대상들, 즉 기구, 선반, 실험자도 항상 동일한 위치에서 실험을 실시하였다.
실험은 2단계로 첫 번째 단계에는 미로에서 도피대를 찾아가는 학습단계를 관찰하였고 (3일간) 두 번째 단계에서는 4일째 되는 날에 기억 검사를 실시하였다. 실험은 마우스를 수조벽을 따라 수조에 넣는 것으로 시작되었고, 수조에 넣을 때 출발점은 각 사분면의 중앙 벽이고, 출발된 사분면은 정해진 순서없이 랜덤으로 선택하고, 학습기간 동안 도피대의 위치는 변경시키지 않았다. 마우스는 하루에 3번 (4시간 간격으로 12시간 이내에 실시) 3일 동안 도피대의 공간위치를 인지하는 학습을 하였다. 만일 60초가 경과하여도 도피대를 찾지 못하면 실험자가 마우스를 도피대로 부드럽게 유도하여 도피대의 위치를 알 수 있게 하였다. 마우스가 도피대에 올라가면 반응에 대한 보상으로 30초간 그곳에서 쉬게 하였다. 마우스를 3일간 학습시킨 후 4일째에는 기억능력을 확인할 수 있는 세가지 수치를 측정하였다.
3일동안 마우스가 60초 안에 도피대를 찾아가는 학습단계의 결과를 도 7에 나타내었다. 이 결과는 마우스가 학습되는 정도를 보여주는 것이다.
하기 도 7에서 나타난 바와 같이, Control군이 도피대를 찾아가는 시간이 정상군이나 자색고구마 첨가 발효두유 추출물을 경구투여한 군보다 오래 걸린 것을 알 수 있다. 이런 결과로 볼 때 자색고구마 첨가 발효두유가 기억능력의 손상을 보호한다는 것을 알 수 있다.
첫 번째는 탈지분유를 탄 수조에 도피대를 위치시키고 마우스가 도피대에 찾아가는 시간을 측정하였다. 두 번째는 탈지분유를 탄 수조에 도피대를 제거하고 마우스를 출발시켜 원래 도피대가 있었던 영역에 머문 시간을 측정하였다. 세 번째는 탈지분유를 타지 않은 수조에 도피대를 위치시키고 60초 이내에 마우스가 도피대에 찾아가는 시간을 측정하였다. 첫 번째와 두 번째의 실험결과를 도8에 비교하여 나타내었다.
하기 도 8에서 나타난 바와 같이, 도피대가 탈지분유로 인해 숨겨져 있든지 드러나 있든지 간에 마우스가 도피대를 찾는 시간은 Control군이 가장 오래 걸리는 것을 알 수 있다.
세 번째의 결과는 도 9에 나타내었다. 마우스가 도피대가 있었던 장소에 머무는 시간을 나타낸 것이다.
하기 도 9에서 나타난 바와 같이, Control군이 도피대가 있었던 장소에 머문 시간이 가장 짧은 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 Control군이 도피대가 있었던 장소를 기억하고 있지 못하다는 것을 알 수 있고, 다른 자색고구마 첨가 발효두유 추출물을 경구투여한 군들은 도피대가 위치했던 영역에 머문 시간이 Control군보다 더 오랜시간인 것으로 보아 도피대의 위치를 기억하고 있다고 여겨진다. 이로써 자색고구마 첨가 발효두유가 기억 손상에 대한 보호효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예6 -4 실험동물의 지질 과산화 및 NO 생성 억제 측정
① TBARS 측정
마우스의 간, 뇌, 신장의 조직을 생리식염수로 균질화시킨 후, 조직 균질액과 1% 인산 그리고 0.67%의 thiobarbubituric acid (TBA) 용액을 혼합한다. 이 혼합액을 45분간 boiling 한 후 아이스에서 냉각시키고 이 혼합액에 1-butanol 2ml를 첨가한 뒤 3000rpm에서 10분간 원심분리 시킨다. 상층액을 535nm, 520nm 흡광도에서 측정하였다.
각 조직에서의 지질과산화 억제 정도는 하기 표4에 나타내었다.
Normal Control 100mg/kg/day 200mg/kg/day
Liver 19.15±1.25ab 28.33±8.14a 19.83±1.89ab 14.17±1.51b
Brain 11.70±0.73b 36.90±3.61a 11.81±0.43b 9.56±1.13b
Kidney 5.39±0.66b 9.74±0.93a 9.32±0.46a 5.88±0.64b
( 단위:nmole/mg protein )
Normal : Amyloid-β25-35 처리 안한 정상군
Control : Amyloid-β25-35 처리군
100mg/kg/day : Amyloid-β25-35 처리 후 자색고구마 첨가 발효두유 100mg/kg/day 경구투여군
200mg/kg/day : Amyloid-β25-35 처리 후 자색고구마 첨가 발효두유 200mg/kg/day 경구투여군
Values are mean ± SD
a- bMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Ducan's multiple range test.
상기 표 4에서 알 수 있듯이 실험동물의 간, 뇌, 신장을 적출하여 지질과산화물 생성량을 측정한 결과, 자색고구마 열수추출물 첨가 발효두유의 추출물을 경구투여한 마우스에서 각 장기의 지질과산화 정도가 낮게 나타나는 것을 볼 수 있다. 이러한 결과를 볼 때 자색고구마 첨가 발효두유의 지질과산화에 대한 보효효과가 있음이 확인되었다.
② NO 생성 억제 측정
조직을 생리식염수로 균질화시킨 후, 3000rpm에서 10분간 원심분리 시켜 얻은 조직 상층액 150μL와 2차 증류수 130μL를 혼합한다. 이후 1% sulfanilic acid를 함유하는 5% 인산용액과 0.1% N-(1-naphthyl) ethlene-dianide dihydrochloride 용액을 사용직전에 1:1(v/v)로 혼합하여 20μL 첨가하였다. 실온에서 30분 방치한 뒤 540nm 흡광도에서 측정하였다.
각 조직의 NO 생성 억제 정도는 하기 표4에 나타내었다.
Normal Control 100mg/kg/day 200mg/kg/day
Liver 79.51±4.31b 93.23±1.16a 84.25±3.07b 71.73±4.38b
Brain 23.49±1.49b 29.95±1.51a 23.18±1.18b 14.81±0.8b
Kidney 33.3±2.56ab 35.5±2.05a 29.68±6.59ab 27.17±3.4b
(단위:μmol/L/mg protein)
Normal : Amyloid-β25-35 처리 안한 정상군
Control : Amyloid-β25-35 처리군
100mg/kg/day : Amyloid-β25-35 처리 후 자색고구마 첨가 발효두유 100mg/kg/day 경구투여군
200mg/kg/day : Amyloid-β25-35 처리 후 자색고구마 첨가 발효두유 200mg/kg/day 경구투여군
Values are mean ± SD
a-bMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Ducan's multiple range test.
상기 표 5에서 나타난 바와 같이, 실험동물의 간, 뇌, 신장을 적출하여 NO 생성정도를 측정한 결과 자색고구마 첨가 발효두유 추출물을 경구투여한 마우스에서의 생성량이 Amyloid-β25-35만 처리한 Control군보다 적게 생성되었고 Normal군의 생성량과 비슷한 결과를 나타낸 것을 알 수 있다. 특히 뇌에서는 자색고구마 첨가 발효두유 추출물을 200mg/kg/day 경구투여한 마우스에서는 Normal군보다 더 적은 NO 생성량을 나타내었다. 이러한 결과를 볼 때 자색고구마 첨가 발효두유가 NO 생성 억제 효과를 보이는 것을 알 수 있다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM42923 20090326

Claims (13)

  1. (1) 두유를 전처리하는 단계;
    (2) 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)균을 두유에 접종시켜 발효시키는 단계; 및
    (3) 자색고구마 추출물을 첨가하는 단계;
    를 포함하는 기능성과 관능성이 뛰어난 발효두유의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (1)단계의 두유는
    (a) 대두를 물에 불리는 단계;
    (b) 대두 중량의 7 배 내지 11배의 열수를 첨가하여 마쇄하는 단계; 및
    (c) 상기 대두 마쇄물을 열처리하여 추출한 후 여과하는 단계;
    를 포함하는 두유의 제조방법에 의해 얻어진 것을 특징을 하는 발효두유의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (1)단계의 전처리는 121℃에 5분 내지 60분간 열처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (2)단계의 두유에는 바실러스 서브틸리스균 접종전에 0.5 내지 2 중량%의 당이 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 상기 바실러스 서브틸리스균은 수탁번호 KCCM 42923인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 접종하는 바실러스 서브틸리스균의 수는 6 내지 9 logCFU/ml인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (2)단계에서 바실러스 서브틸리스균을 접종한 두유를 30 내지 45℃에서 pH 4.5 내지 6.5에 도달하도록 발효시킨 것을 특징으로 하는 제조방법
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (3)단계에서 자색고구마 추출물의 함량은 전체 발효두유 함량의 1 내지 10중량%가 되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (3)단계에서 자색고구마 추출물의 농도는 60 내지 80o Brix인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따라 제조된 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 개선용 발효두유.
  11. 제10항에 따른 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 추출물은 물, 알코올 또는 이들의 혼합용매를 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제10항에 따른 발효두유의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화, 기억력 개선, 인지능력 개선 및 치매 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.










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