KR20110090810A - Method for proliferating stem cells using genes activating notch signaling - Google Patents

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Abstract

PURPOSE: A method for proliferating stem cells in which notch signaling gene is provided to remarkably enhance proliferation ability of stem cells and to manufacture a cell therapeutic agent for treating neural diseases. CONSTITUTION: A recombinant stem cell has a notch signaling gene. The gene is NICD(Notch intracellular domain) gene. NICD gene has a sequence containing a nucleic acid sequence of sequence number 1. The stem cells are neural stem cells or neural crest stem cells. A cell therapeutic agent for treating neural diseases contains the stem cells as an active ingredient. A method for proliferating the stem cells comprises a step of culturing the stem cells.

Description

노치 신호 활성 유전자를 이용한 줄기세포의 증식 방법{Method for Proliferating Stem Cells Using Genes Activating Notch Signaling}Method for Proliferating Stem Cells Using Genes Activating Notch Signaling}

본 발명은 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자가 도입되어 있는 줄기세포 및 이를 이용한 줄기세포 증식 방법에 관한 것으로, 구체적으로는 줄기세포를 NICD(Notch intracellular domain) 유전자로 형질전환시켜 노치 신호전달체계를 활성화시킴으로써 줄기세포의 증식능을 현저히 높이는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a stem cell into which a gene for activating a Notch signal is introduced and a stem cell proliferation method using the same. Specifically, the Notch signaling system is transformed by transforming the stem cell into a Notch intracellular domain (NICD) gene. It relates to a method of significantly increasing the proliferation capacity of stem cells by activating.

21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터 개발이나 질환 유전자에 대한 지식 부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.Biotechnology in the 21st century presents the possibility of new solutions to food, environment and health problems as the final goal of human welfare. Recently, the use of stem cells has emerged as a new chapter in the treatment of intractable diseases. Previously, organ transplantation and gene therapy have been suggested for the treatment of intractable disease in humans, but effective practical use has been insufficient due to lack of immunity, lack of supply organs, vector development or lack of knowledge of disease genes.

이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다.As interest in stem cell research increased, pluripotent stem cells with the ability to form all organs through proliferation and differentiation were found to be capable of fundamentally solving long-term damage as well as treating most diseases. Stem cells are cells that have the ability of self-replication and differentiate into two or more cells. Totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells can be classified as a multipotent stem cell. Many scientists have suggested the possibility of applying stem cells to almost all organ regeneration of the human body, as well as treatment of Parkinson's disease, which was incurable disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury.

특히, 신경줄기세포는 자기복제능력 및 중추신경계를 구성하는 신경세포, 성상세포(astrocyte), 핍지세포(oligodendrocyte) 등의 세가지 구성세포로 분화하는 다분화능력을 가지고 있어 이러한 신경줄기세포를 이용한 줄기세포의 증식과 분화기전 및 신경계 발달에 관한 기초연구뿐만 아니라, 한번 손상되면 재생되지 않는다고 알려져 있는 신경계질환에서 신경줄기세포의 생물학적 특성을 이용하여 새로운 세포 및 유전자 치료의 가능성에 대한 관심이 증대하고 있다.In particular, the neural stem cells have the ability to differentiate into three constituent cells, such as the self-replicating ability and the neuronal cells, constituent cells (astrocyte), oligodendrocyte (constituting the central nervous system) of the stem cells using these neural stem cells In addition to basic research on proliferation, differentiation and nervous system development, there is increasing interest in the possibility of new cell and gene therapy using the biological properties of neural stem cells in neurological diseases known to not regenerate once damaged.

이러한 줄기세포들은 그 배양에 있어서, 특정한 세포적 미세환경 (microenvironment) 또는 적소 (niche)를 필요로 한다는 것이 줄기세포 생물학의 정설이다. 신경줄기세포를 선택적으로 배양하는 배양 기술도 뉴로스페어 (neurosphere) 형성법, 저밀도 배양법, 고밀도 배양법 등이 보고되었으나, 현재까지 메분화 상태의 대규모 배양에서 세포들을 확장하는 것은 어려운 것으로 알려져 있다. The theory of stem cell biology is that these stem cells require a specific cellular microenvironment or niche in their culture. There have also been reported a culture technique for selectively culturing neural stem cells, such as neurosphere formation method, low density culture method, high density culture method, etc., but it is known that it is difficult to expand the cells in large-scale culture of mesogenic state.

여러 연구자들이 줄기세포의 대량배양을 시도하고 있지만, 특히 인간 성체 신경줄기세포는 기내배양 자체가 매우 어려우며, 또 그 증식능력 또한 제한되어있어 연구의 답보가 거듭되고 있는 실정이다.
Several researchers have attempted mass culture of stem cells, but in particular, adult neural stem cells are very difficult to carry out in-flight culture, and their proliferative capacity is also limited.

이에 본 발명자들은 인간 성체 신경줄기세포의 제한된 증식능의 문제를 극복하기 위해 본 발명자는 일차 배양된 성체 신경줄기세포에 NICD(notch intracellular domain) 유전자를 도입한 후 NICD 유전자가 성체 신경줄기세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
In order to overcome the problem of limited proliferative capacity of human adult neural stem cells, the present inventors introduced NICD (notch intracellular domain) genes into primary cultured adult neural stem cells and then examined the effects of NICD genes on the proliferative capacity of adult neural stem cells. It confirmed and completed this invention.

본 발명의 목적은 노치(Notch) 신호 활성화 유전자가 도입되어 있어, 증식능이 우수한 줄기세포 및 이의 증식방법을 제공하는데 있다.Disclosure of Invention An object of the present invention is to provide a notch signal activating gene, which has excellent proliferative capacity, and a proliferation method thereof.

본 발명의 다른 목적은 NICD(Notch intracellular domain) 유전자가 도입된 신경줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 뇌 신경질환 치료용 세포 치료제를 제공하는데 있다.
Another object of the present invention is to provide a cell therapeutic agent for the treatment of brain neurological diseases, which contains neural stem cells into which the Notch intracellular domain (NICD) gene is introduced as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자가 도입되어 있는, 형질전환된 증식능이 우수한 줄기세포 및 상기 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자가 도입되어 있는(형질전환된) 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention provides a transformed proliferative stem cell having a gene for activating a Notch signal and a gene for activating the Notch signal are introduced (transformation). It provides a method for propagating stem cells, comprising the step of culturing).

본 발명은 또한 NICD(Notch intracellular domain) 유전자가 도입되어 있고 노치 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.
The present invention also provides a cell therapeutic agent for the treatment of cerebral neurological diseases, which comprises a neural stem cell or a neural crest stem cell into which a Notch intracellular domain (NICD) gene is introduced and a Notch signal is activated.

본 발명에 따르면 노치(Notch) 신호의 활성화를 통해, 증식능이 우수한 줄기세포를 대량으로 수득할 수 있다. 특히, 종래 기내 배양이 어려웠던 신경 줄기세포의 대량 증식이 가능하므로 뇌신경질환 치료용 세포치료제의 제조에 더욱 유용하다.
According to the present invention, through the activation of the Notch signal, it is possible to obtain a large amount of stem cells with excellent proliferative capacity. In particular, since it is possible to mass-proliferate neural stem cells, which has been difficult in conventional in-flight culture, it is more useful for the preparation of cell therapy for the treatment of brain neurological diseases.

도 1A는 인간 측두엽 뇌조직 및 해마 뇌조직의 일차배양을 통해 확보한 성체 신경줄기세포의 계대별 사진[P0: 기내 배양 시작 시점의 세포 ; P18: 계대 배양 18회차의 세포] 이고, 도 1B는 기내 계대배양을 통해 증식시킨 성체 신경줄기세포 수를 누적하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간 성체 신경줄기세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법 (innumolcytochemistry)을 통해 검증한 결과를 나타낸 것이다[A:Nestin+/CD133+/GFAP+/Olig2-/Tuj-1- ; B: Sox2+/Sox9+/Vimentin+/Sox10-]
도 3은 인간 성체 신경줄기세포의 분화능을 검증하기 위해 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법 (immunocytochemistry) 통해 검증한 결과를 나타낸 것으로, 기내 배양을 통해 확보한 성체 신경줄기세포가 전 계대에 걸쳐 분화능을 유지하고 있음을 검증한 결과로, 3회 계대 배양을 거친 초기단계의 세포 (Early paggasge) 및 18회 계대 배양을 거친 후기 단계의 세포 (Late passage) 모두 신경세포로의 분화한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 성체 신경줄기세포에 NICD 유전자의 도입을 위해 제작한 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터의 구조(A)와 NICD 유전자가 도입된 성체 신경줄기세포를 대상으로 신경 줄기세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법을 통해 검증한 결과(B, 신경줄기세포 특이적인 마커) 및 이들 세포를 대상으로 하위 신경세포로의 분화능을 검증한 결과이다(C, 아스트로사이트, 올리고덴드로사이트, 뉴런 특이적인 마커).
도 5은 NICD 유전자가 도입된 성체 신경줄기세포의 증식능을 CCK 분석법을 통해 검증한 결과(A)와 계대 배양하여 증식된 총 세포의 숫자를 누적하여 나타낸 그래프(B)이다.1A is a passage-specific photograph of adult neural stem cells obtained through primary culture of human temporal lobe brain tissue and hippocampal brain tissue [P0: cells at the start of in-flight culture; P18: Cell 18 of passage culture], FIG. 1B is a graph showing the cumulative number of adult neural stem cells grown through in-flight passage.
Figure 2 shows the results of verifying the expression of human adult neural stem cell-specific marker protein through the immunocytochemistry (innumolcytochemistry) [A: Nestin + / CD133 + / GFAP + / Olig2- / Tuj-1; B: Sox2 + / Sox9 + / Vimentin + / Sox10-]
Figure 3 shows the results of verifying the expression of the lower neuronal cell specific marker protein through immunocytochemistry (immunocytochemistry) in order to verify the differentiation capacity of human adult neural stem cells, adult neural stem cells secured through in-flight culture passage As a result of verifying that the differentiation capacity was maintained throughout, the early stage cells (Early paggasge) and the late stage cells (Late passage) after 18 passages were differentiated into neurons. It is shown.
Figure 4 shows the structure (A) of the lentivirus vector prepared for the introduction of the NICD gene into adult neural stem cells and the expression of neural stem cell specific marker proteins in adult neural stem cells into which the NICD gene is introduced. These results were verified by chemistry (B, neuron stem cell-specific markers) and the differentiation ability of these cells into lower neurons (C, astrosite, oligodendrosite, neuron-specific markers).
5 is a graph showing the cumulative number of total cells proliferated by passage culture (A) and the results of verifying the proliferative capacity of adult neural stem cells into which the NICD gene was introduced through CCK analysis (B).

본 발명은 일 관점에서 노치(Notch) 신호 활성화 유전자가 도입되어 있는, 증식능이 우수한 줄기세포 및 상기 줄기세포 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식방법에 관한 것이다.The present invention relates to a stem cell having a proliferative capacity, and a method for proliferating a stem cell comprising the step of culturing the stem cell, into which a Notch signal activating gene is introduced.

에 관한 것이다. 즉, 다양한 조직으로의 분화능을 가지고 있어 세포 치료에 효과적인 줄기세포에 관한 것이다.It is about. That is, the present invention relates to stem cells effective for cell therapy because they have differentiation ability into various tissues.

'줄기세포 (stem cell)'란 조직을 구성하는 각 세포로 분화 (differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 나눌 수 있는데, 본 발명에서는 생물학적, 윤리적, 그리고 법적인 문제가 많아 임상적용에 제한이 많은 배아 줄기세포가 아닌, 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 'Stem cell' refers to the undifferentiated cells of the stage before the differentiation (differentiation) to each cell constituting the tissue, and is differentiated to a specific cell by a specific differentiation stimulus (environment). Stem cells, unlike differentiated cells that have ceased cell division, are capable of self-renewal by cell division and thus proliferation (expansion). It is characterized by having plasticity in differentiation because it can be differentiated into other cells by different environment or differentiation stimulus. These stem cells can be divided into embryonic stem cells and adult stem cells according to their origin, but in the present invention, adult stem cells are used instead of embryonic stem cells, which have many biological, ethical and legal problems, and thus have many limitations in clinical applications. It is desirable to.

상기 "성체 줄기세포 (adult stem cell)"는 성장한 신체조직으로부터 추출해낸 줄기세포로서, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포다. 성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 인체에 내재된 조직 특이적 전구세포로 분화할 수 있다. 성체 줄기세포는 분화하여 다양한 특성을 가지는 세포가 될 수 있고, 심장, 췌장, 신경 조직, 근육, 연골 등과 같은 광범위하게 위치한 조직 및 기관에 대한 대체 세포를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있다.The "adult stem cells" are stem cells extracted from grown body tissues, which are primitive cells just before being differentiated into cells of specific organs. Adult stem cells are difficult to proliferate and have a strong tendency to differentiate, but instead can differentiate into tissue-specific progenitor cells inherent in the human body. Adult stem cells can be differentiated to become cells having various properties, and have the ability to generate replacement cells for a wide range of tissues and organs such as the heart, pancreas, nerve tissue, muscle, cartilage, and the like.

상기와 같은 성체 줄기세포는 인간, 영장류, 설치류, 및 조류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 포유류, 특히, 마우스, 랫트 및 인간으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간의 골수, 지방, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 뇌, 췌장, 간, 눈 및 태아 조직 등 대부분의 조직으로부터 성체 줄기세포를 수득할 수 있다. Such adult stem cells may be derived from humans, primates, rodents, and birds. Preferably, they may be derived from mammals, in particular mice, rats and humans. For example, adult stem cells can be obtained from most tissues such as human bone marrow, fat, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus, brain, pancreas, liver, eyes and fetal tissue.

인간의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 각 조직에 적절한, 당업계에 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수득한 특정 조직을, 트립신 용액 및/또는 콜라게나아제 등을 처리하여 단일 세포체로 분리한 후, bFGF, EGF등의 성장인자 (growth factor)를 적합한 양으로 첨가한 적합한 배지에서 배양한 다음, FACS 등으로 분리하거나 성장속도에 따라 성체 줄기세포를 분리하는 방법 등을 사용할 수 있다. As a method for separating adult stem cells from various tissues of humans, methods conventional in the art, which are appropriate for each tissue, can be used. For example, the obtained specific tissues are separated into single cell bodies by treatment with trypsin solution and / or collagenase and the like, and then cultured in a suitable medium in which growth factors such as bFGF and EGF are added in an appropriate amount. Then, it can be separated by FACS or the like, or a method of separating adult stem cells according to the growth rate.

본 발명의 가장 바람직한 예로는 성체 신경줄기세포 (Neural stem cells) 또는 신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells;. NCSCs)를 들 수 있다. Most preferred examples of the invention include neural stem cells or neural crest stem cells (NCSCs).

"신경줄기세포 (Neural stem cells)"는 20-30회 이상 세포 분열을 수행할 수 있고, 뉴런 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능 (potency)을 유지하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는 50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 다분화능 (multipotent)으로 정의되고, 즉, 다수의 신경세포 유형들(예를 들면, 뉴런/신경아교세포)로 분화할 수 있다. 신경줄기세포는 중추신경계 (Central nervous system: CNS)와 말초신경계 (peripheral nervous system: PNS)의 조직을 일차 배양하여 확보할 수 있으며, 이 세포는 특정 분화 조건에서 glial lineage와 neural lineage 등으로 분화하게 된다(Sally Temple et al. 2001). "신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells;. NCSCs)"는 초기 배 발생 과정 중 한시적으로 나타나는 줄기세포로서, 마찬가지로 다분화능 줄기세포이다."Neural stem cells" refers to cells that can perform cell division more than 20-30 times and maintain potency capable of producing neurons and glial cells. Preferably, the cells are capable of performing at least 40, more preferably at least 50, most preferably unlimited cell division. The neural stem cells are defined as multipotent, that is, they can differentiate into multiple neuronal cell types (eg neurons / glia). Neural stem cells can be secured by primary culture of the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS), which differentiate into glial lineage and neural lineage under specific differentiation conditions. (Sally Temple et al. 2001). "Nural crest stem cells (NCSCs)" are stem cells that appear temporarily during early embryonic development and are likewise multipotent stem cells.

다양한 출처로부터 신경줄기세포를 수득하는 것이 가능하다. 예를 들어 인간 성체 뇌조직으로부터 수득할 수 있는데, 상기 뇌는 대뇌, 간뇌, 중뇌, 소뇌, 연수, 뇌교 및 척수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 대뇌로부터 유래한 것, 구체적 예로는 측두엽 조직 또는 해마 조직일 수 있다. 인간의 신경줄기세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 바람직하게는 인간 성체의 뇌조직으로부터 얻은 세포를 신경줄기세포 성장인자가 첨가된 배지에서 배양하여 제조할 수 있다(실시예 1).It is possible to obtain neural stem cells from various sources. For example, it can be obtained from human adult brain tissue, the brain may be any one selected from the group consisting of cerebral, hepatic brain, midbrain, cerebellum, soft water, pontoon and spinal cord, preferably derived from the cerebrum, Specific examples may be temporal lobe tissue or hippocampal tissue. Human neural stem cells may be purchased and used commercially, preferably cells obtained from adult human brain tissue may be prepared by culturing in a medium to which the neural stem cell growth factor is added (Example 1).

특히, 상기 성체 신경줄기세포는 기내 배양 자체가 매우 어려우며 그 증식능력 또한 제한되어 있어 기존의 배양 방법으로는 미분화 상태의 신경줄기세포를 대량으로 증식하는 것이 곤란했다. In particular, the adult neural stem cells are difficult to culture in-flight itself and its proliferative capacity is also limited, making it difficult to multiply large amounts of undifferentiated neural stem cells by conventional culture methods.

신경줄기세포들의 대칭적 분열을 촉진하는 방법을 개시하고 있는 WO 2005/121318에서는 EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성 및 FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성을 이용하고 있으나, 이와 달리, 본 발명에서는 줄기세포를 노치 신호 활성화 유전자로 형질전환시켜, 노치 신호전달체계를 활성화시킴으로써 줄기세포, 특히 신경줄기세포의 증식능을 개선하여, 대량으로 수득할 수 있게 함으로써 상기 문제점을 해결하고 있다.WO 2005/121318, which discloses a method for promoting symmetrical division of neural stem cells, utilizes the activity of signaling pathways downstream of the EGF family of receptors and the activity of signaling pathways downstream of FGF receptors. In order to solve the above problem by transforming stem cells with a Notch signal activating gene, and by activating the Notch signaling system, the proliferation ability of stem cells, particularly neural stem cells, can be obtained in large quantities.

본 발명의 줄기세포는 구조적으로는 노치 (Notch) 신호를 활성화시키는 유전자로 형질전환되어 있고, 기능적으로는 노치 신호전달체계가 활성화되어 있다.Stem cells of the present invention are structurally transformed with a gene that activates Notch signaling, and functionally Notch signaling is activated.

노치 (Notch)는 변이 시 초파리의 날개의 과잉성장을 유도하여 날개의 홈을 만드는 유전자에서 유래한 이름이며, 다세포동물에서 세포간의 빠른 신호전달과 증폭을 목적으로 하는 신호체계이다. 노치 (Notch)는 세포에 부착된 Delta 또는 Serrate ligand를 통하여 세포와 세포의 접촉에 의한 신호를 보내게 되고, 본 발명에서는 이러한 노치 신호전달체계를 활성화시키기 위하여 이에 관여하는 유전자를 줄기세포에 도입하였다.Notch is a name derived from a gene that makes a wing groove by inducing overgrowth of a fruit fly's wing during mutation. It is a signaling system aimed at rapid signal transmission and amplification between cells in multicellular animals. Notch transmits a signal by contacting a cell with a cell through a delta or serrate ligand attached to the cell, and in the present invention, a gene involved in the notch signaling system is introduced into a stem cell to activate the notch signaling system. .

줄기세포를 노치 (Notch) 신호 활성화 유전자로 형질전환한다는 것은 상기 유전자를 암호화하는 핵산을 줄기세포에 도입하는 것을 말한다. Transforming stem cells with Notch signal activating genes introduces a nucleic acid encoding the gene into the stem cells.

본 발명에서는 노치 (Notch) 신호를 활성화시키는 유전자라면 제한없이 사용할 수 있지만, 바람직하게는 NICD 유전자를 사용할 수 있다. NICD를 암호화하는 핵산으로는, 당업계에 공지된 NICD를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열을 포함하는 NICD를 암호화하는 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 NICD의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. In the present invention, any gene that activates a Notch signal can be used without limitation, but preferably a NICD gene can be used. As the nucleic acid encoding the NICD, any one having a nucleotide sequence encoding the NICD can be used without limitation. Preferably may have a sequence encoding a NICD comprising a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1, may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. That is, it may have a base sequence encoding a functional equivalent of the NICD.

상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％, 바람직하게는 80％,보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 NICD과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70％,71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％,88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. NICD와 '동등한 생리활성'이란 노치(Notch) 신호전달체계를 활성화하는 활성을 의미한다. 또한 상기 NICD을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다.The functional equivalent means having at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more of the sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. 2 as a result of the addition, substitution or deletion of amino acids. It refers to a polypeptide exhibiting a physiological activity substantially equivalent to the NICD. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 %, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% sequence homology It includes a polypeptide having a. 'Equivalent physiological activity' with NICD refers to the activity of activating the Notch signaling system. In addition, the nucleic acid encoding the NICD may be prepared by genetic recombination methods known in the art.

본 발명에서, 노치 (Notch) 신호를 활성화시키는 유전자, 예를 들어 NICD을 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. '발현 조절 서열 (expression control sequence)'이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 그리고 '발현 벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.In the present invention, a nucleic acid encoding a gene that activates a Notch signal, such as a NICD, may be operably linked to an expression control sequence and inserted into an expression vector. An 'expression control sequence' refers to a DNA sequence that controls the expression of a nucleic acid sequence operably linked in a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for initiating transcription, any operator sequence for regulating transcription and sequences regulating termination of transcription and translation. And "expression vector" refers to a plasmid, viral vector or other media known in the art that can be inserted nucleic acid encoding a structural gene, and can express the nucleic acid in a host cell. Preferably it may be a viral vector.

상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 등이 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 렌티 바이러스 벡터를 사용하였다. The viral vectors include, but are not limited to, retrovirus vectors, adenovirus vectors, herpes virus vectors, abipox virus vectors, Epstein-Barr virus vectors, lentivirus vectors, and the like. In one embodiment of the invention a lentiviral vector was used.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용한 렌티 바이러스를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 줄기세포 내로 도입할 수 있다.The method for producing a lentivirus using the recombinant expression vector of the present invention may use a method known in the art. Expression vectors comprising nucleic acids according to the invention are methods known in the art, such as, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation Methods, liposome-mediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation Can be introduced into stem cells by gene guns and other known methods for introducing nucleic acids into cells.

본 발명의 일 구체예인 노치(Notch) 신호 활성화 유전자로 형질전환된 신경줄기세포는 예를 들어, 이하와 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. Neural stem cells transformed with a Notch signal activating gene, which is one embodiment of the present invention, may be prepared by, for example, a method comprising the following steps.

(a) NICD을 암호화하는 핵산을 함유한 DNA 구조물을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계;(a) preparing a recombinant viral vector comprising a DNA construct containing a nucleic acid encoding a NICD;

(b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 NICD 발현 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및(b) transfecting said recombinant viral vector into a virus producing cell line to produce a NICD expressing recombinant virus; And

(c) 상기 NICD 발현 재조합 바이러스로 신경줄기세포를 감염시키는 단계.(c) infecting neural stem cells with the NICD expressing recombinant virus.

상기 바이러스 생산 세포주는 사용한 바이러스 벡터에 해당하는 바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있으며, 예컨대 렌티 바이러스 벡터를 사용한 경우에는 렌티 바이러스 생산세포주인 293FT 세포를 사용할 수 있다. 그리고 나서, NICD을 발현하는 재조합 렌티 바이러스 벡터를 인간의 신경줄기세포에 감염시킨다. 본 발명에서는 특히, 일차 배양된 줄기세포에 노치 (Notch) 신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자를 도입하는 것이 바람직하다.The virus producing cell line may be a cell line producing a virus corresponding to the used viral vector. For example, when a lentivirus vector is used, 293FT cells which are lentiviral producing cell lines may be used. Then, a recombinant lentiviral vector expressing NICD is infected with human neural stem cells. In the present invention, it is particularly preferred to introduce Notch signal activating genes, such as NICD genes, into primary cultured stem cells.

렌티 바이러스를 인간의 신경줄기세포에 감염시키기 위해서는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 신경줄기세포를 성장인자 함유 배지에 플레이팅하고, 폴리브렌 (polybrene)을 처리한 후 적정 MOI (multiplicityof infection)에 해당하는 바이러스성 입자를 배지에 첨가하여 세포를 감염시킨다. 감염 후 기존 바이러스 포함 배지를 새로운 신경줄기세포 배양 배지로 교체하여 배양하는 방법에 의해 수행될 수 있다.To infect the lentiviral virus to human neural stem cells, a method known in the art, for example, but not limited thereto, is plated in a growth factor-containing medium, treated with polybrene, followed by titration of MOI. Viral particles corresponding to (multiplicity of infection) are added to the medium to infect the cells. After infection, the virus-containing medium may be replaced with a new neural stem cell culture medium.

상기와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 노치 신호 활성화 유전자 과발현 줄기세포주는 증식 능력이 매우 우수하다. 즉, 줄기세포에 노치 신호 활성화 유전자를 도입시킴으로써 노치 신호전달체계가 활성화되면 해당 줄기세포의 증식이 활발해진다. 이와 같은 본 발명의 증식능이 우수한 줄기세포의 가장 바람직한 예는, NICD 유전자가 도입되어 있고 노치 신호전달체계가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포이다.Notch signal activating gene overexpressing stem cell line of the present invention prepared by the above method is very excellent in proliferative capacity. In other words, when the Notch signaling system is activated by introducing a Notch signal activating gene into the stem cells, the stem cells proliferate. The most preferable example of the stem cells excellent in the proliferative capacity of the present invention is a neural stem cell or a neural crest stem cell in which the NICD gene is introduced and the Notch signaling system is activated.

본 발명의 일 태양으로, 상기 방법으로 제조된 NICD 유전자가 도입되어 있고 노치 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포는 이하와 같은 특성을 가진다. In one aspect of the present invention, the neural stem cells to which the NICD gene produced by the above method is introduced and the Notch signal is activated have the following characteristics.

(i) 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin, CD133 및 을 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP를 발현함.(i) Nestin, CD133, known as neural stem cell specific marker protein, express GFAP, an astrosite specific marker.

(ii) 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 Olig2, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질은 발현하지 않음.(ii) does not express Olig2, an oligodendrosite specific marker, and Tuj-I protein, a neuron specific marker.

(iii) 신경원세포, 희소돌기아교세포 및 성상세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 분화할 수 있는 능력을 가짐.(iii) has the ability to differentiate into any one selected from the group consisting of neuronal cells, oligodendrocytes and astrocytic cells.

(iv) NICD를 과발현함.(iv) overexpress NICD.

(iv) 노치 신호 전달체계가 활성화되어 있음.(iv) Notch signaling is activated.

본 발명의 일 실시예에서는 NCID 유전자가 도입된 신경줄기세포를 배양한 결과, 야생형 세포주에 비하여 세포증식이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(실시예 4-3 참조).In one embodiment of the present invention, as a result of culturing neural stem cells into which the NCID gene was introduced, it was confirmed that cell proliferation was significantly increased as compared with the wild type cell line (see Example 4-3).

본 발명의 줄기세포의 배양에 사용할 수 있는 배지는 당업계에서 줄기세포의 종류에 따라 공지되어 있는 적절한 배지를 사용할 수 있고, 아스코르브산, 표피성장인자 (EGF), 인슐린, 항생제 및 FBS (Fetal bovine serum) 등을 첨가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 신경줄기세포인 경우에는 성장인자 함유 NBE 배지, 보다 구체적으로 B27 TM supplement, N2 TM supplement, bFGF 및 EGF 등을 함유하는 배지를 사용할 수 있다. As a medium that can be used for culturing the stem cells of the present invention, any suitable medium known according to the type of stem cells in the art can be used, and ascorbic acid, epidermal growth factor (EGF), insulin, antibiotics and FBS (Fetal bovine) serum) and the like can be used. For example, in the case of neural stem cells, a growth factor-containing NBE medium, more specifically, a medium containing a B27 ™ supplement, an N2 ™ supplement, bFGF, and EGF may be used.

줄기세포를, 노치신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자로 형질전환시켜 배양하면, 형질전환하지 않은 줄기세포와 비교하여 세포 증식이 매우 활발히 이루어진다. 그리고, 계대 배양을 진행함에 따라 줄기세포수의 누적 증가율 또한 현저하게 차이가 나타난다. 이때, 3대 계대 이상 배양하는 것이 바람직하다.When the stem cells are cultured by transforming them with a Notch signal activating gene such as the NICD gene, the cell proliferation is more actively compared with the stem cells which are not transformed. In addition, the cumulative increase rate of the stem cell number also appears significantly as the passage passage. At this time, it is preferable to culture three generations or more.

즉, 본 발명의 줄기세포 증식 방법에서는 노치 신호 활성화 유전자를 줄기세포에 도입시켜 노치 신호전달체계가 활성화시킴으로써, 줄기세포가 미분화 상태로 대량으로 증식시키도록 한다. 노치 신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자의 줄기세포로의 도입은 상기에서 설명한 바와 같다. In other words, in the stem cell proliferation method of the present invention, the Notch signal activating gene is introduced into the stem cells to activate the Notch signaling system, thereby allowing the stem cells to proliferate in large numbers in an undifferentiated state. Introduction of the Notch signal activating gene, for example the NICD gene, into stem cells is as described above.

본 발명은 다른 관점에서, 구조적으로는 노치(Notch) 신호를 활성화시키는 유전자로 형질전환되어 있고, 기능적으로는 노치 신호전달체계가 활성화되어 있는 줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 세포 치료제에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a cell therapeutic agent, which contains, as an active ingredient, stem cells that are structurally transformed with a gene that activates a Notch signal, and that is functionally activated by a Notch signaling system. .

특히, NICD 유전자가 도입되어 있고 노치 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 함유하는 뇌신경질환 치료용 세포 치료제로 사용할 수 있다. 상기 뇌신경질환으로는 대표적으로 신경퇴행성 질환이 있다. 신경퇴행성 질환 또는 질병은 뉴런 소실 또는 기능장애와 관련된 질환 또는 의학적 상태이다. In particular, the NICD gene is introduced and can be used as a cell therapeutic agent for the treatment of cerebral neurological diseases containing neural stem cells or neural crest stem cells in which Notch signaling is activated. The neurological diseases are typically neurodegenerative diseases. Neurodegenerative diseases or conditions are diseases or medical conditions associated with neuronal loss or dysfunction.

신경퇴행성 질환 또는 질병의 예로는 신경퇴행성 질환, 중추신경계 손상 또는 기능장애가 포함된다. 신경퇴행성 질환으로는, 예를 들면, 알츠하이머병 또는 기타 치매, 다발성 경화증 (MS), 정신분열증, 시력 감퇴, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 말초신경 장애, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병이 포함된다. CNS 손상으로는, 예를 들면, 뇌졸중과 같은 뇌혈관 사고 (예를 들면, 출혈성 뇌졸중, 국소 허혈성 뇌졸중, 또는 전뇌 허혈성 뇌졸중), 안허혈, 및 경막 정맥동 혈전증; 외상성 뇌 또는 척수 손상 (예를 들면, 뇌 또는 척수 수술 또는 신체 사고에 의해 야기된 손상); 뇌진탕; 약물(예를 들면, 화학치료제, 기분전환용 약물, 및 신경이완제)에 의해 야기된 손상; 관상동맥 우회로 이식 (CABG) 수술; 및 분만시 허혈이 포함된다. CNS 기능장애로는, 예를 들면, 우울증, 간질, 신경증 및 정신병이 포함된다Examples of neurodegenerative diseases or disorders include neurodegenerative diseases, central nervous system damage or dysfunction. Neurodegenerative diseases include, for example, Alzheimer's disease or other dementia, multiple sclerosis (MS), schizophrenia, decreased vision, glaucoma, diabetic retinopathy, peripheral neuropathy, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and Parkinson's disease. Included. CNS injuries include, for example, cerebrovascular accidents such as stroke (eg, hemorrhagic stroke, local ischemic stroke, or whole cerebral ischemic stroke), eye ischemia, and dural venous sinus thrombosis; Traumatic brain or spinal cord injury (eg, damage caused by brain or spinal cord surgery or physical accidents); Concussion; Damage caused by drugs (eg, chemotherapeutic agents, recreational drugs, and neuroleptics); Coronary artery bypass graft (CABG) surgery; And ischemia at delivery. CNS dysfunctions include, for example, depression, epilepsy, neurosis and psychosis

상기에서 '치료 (treatment)'는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화 (palliation),(일부 또는 완전한) 완화 (remission)를 포함한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다.The term 'treatment' refers to alleviation of symptoms, reduction in the extent of disease, maintenance of a disease that does not worsen, delay in the progression of the disease, improvement or palliation of the disease state, or (partial or complete) reduction. Include. Treatment can also mean increased survival compared to the expected survival if untreated. Treatment includes simultaneously prophylactic measures in addition to therapeutic means. Cases in need of treatment include those already with the disease and cases in which the disease should be prevented. Alleviation of a disease is when the clinical manifestations of the undesired disease are delayed or the progress of the disease is delayed or prolonged compared to the untreated situation.

또한, 본 발명은 세포 치료제를 제조하기 위한 노치 신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자로 형질전환된, 줄기세포 특히, 신경줄기세포의 용도를 제공한다. 본 발명의 줄기세포 및 이의 효과에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.The present invention also provides the use of stem cells, in particular neural stem cells, transformed with Notch signal activating genes, such as the NICD gene, for the preparation of cellular therapeutics. Stem cells of the present invention and their effects are as described above.

본 발명에 따른 줄기세포는 원하는 조직 부위로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여되어, 기능적으로 결핍된 부위를 재구성하거나 재생한다. 예를 들어, NICD 유전자가 도입되어 있고 노치신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선 줄기세포를 인간의 신경줄기세포를 중추신경계의 유조직 또는 수막강내 부위로직접 이식한다. 이식은 단세포 현탁액 또는 ㎕ 당 1×105~1.5×105세포 밀도의 작은 집합체를 이용하여 수행할 수 있다. 세포치료제의 통상적인 투여량은 104~1010 cells/body, 바람직하게는 106~108 cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.Stem cells according to the invention are administered in a manner that is directly transplanted or migrated to a desired tissue site, to reconstruct or regenerate a functionally deficient site. For example, the neural stem cells or the neural crest stem cells, in which the NICD gene has been introduced and the Notch signal is activated, are directly transplanted with human neural stem cells into the milk tissue of the central nervous system or the intramedullary region. Transplantation can be performed using single cell suspensions or small aggregates of 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 cell density per μl. Typical dosages of cell therapy products may be administered 10 4 to 10 10 cells / body, preferably 10 6 to 10 8 cells / body, one or several times.

그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.However, it should be understood that the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease, and therefore the dosage may be determined in any way. Also, the scope of the present invention is not limited.

본 발명에 따른 줄기세포는 인간 내로의 투여를 위해 약학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 의약 제형의 일반적인 원리에 대해서는 공지의 문헌을 참고할 수 있다.Stem cells according to the invention can be supplied in the form of a pharmaceutical composition for administration into a human. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. The term 'pharmaceutically acceptable' refers to a cell or human being exposed to the composition, which is not toxic. The carrier can be used without limitation so long as it is known in the art such as buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like. The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared according to techniques commonly used in the form of various formulations. For example, injectables can be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple dose inclusions. For a general principle of the pharmaceutical formulation of the pharmaceutical composition according to the present invention, reference may be made to known documents.

아울러, 본 발명은 노치신호가 활성화되어 있는 줄기세포, 특히 신경줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 종양의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 '유효한 양'이라 함은 본 발명의 줄기세포가 투여 대상인 개체 내에서 치료하는 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체(subject)'란 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물을 의미한다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다. 본 발명의 줄기세포는 상기 기재한 효과 중에서 원하는 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다.In addition, the present invention provides a method for treating a tumor comprising administering a stem cell, particularly a neural stem cell, in which a Notch signal is activated, to an individual in need thereof. In the present invention, the term "effective amount" refers to an amount showing the effect of treating the stem cells of the present invention in the subject to be administered, and the term "subject" refers to an animal including a mammal, particularly a human. . The subject may be a patient in need of treatment. Stem cells of the present invention may be administered until the desired effect is derived from the effects described above, and may be administered by various routes according to methods known in the art.

또한, 본 발명은 세포 치료제를 제조하기 위한 노치 신호 활성화 유전자, 예를 들어 NICD 유전자로 형질전환된, 줄기세포 특히, 신경줄기세포의 용도를 제공한다. 본 발명의 줄기세포 및 이의 효과에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
The present invention also provides the use of stem cells, in particular neural stem cells, transformed with Notch signal activating genes, such as the NICD gene, for the preparation of cellular therapeutics. Stem cells of the present invention and their effects are as described above.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1 : 인간 신경줄기세포의 획득
Example 1 Acquisition of Human Neural Stem Cells

1-1: 인간 신경줄기세포의 분리 및 배양1-1: Isolation and Culture of Human Neural Stem Cells

간질 환자의 외과적 수술을 통해(삼성 서울병원 신경외과) 측두엽(temporal lobe) 및 해마(hippocampus) 조직을 수득하였다. Temporal lobe and hippocampus tissues were obtained through surgical operation of the epileptic patient (Samsung Seoul Hospital Neurosurgery).

각 조직을 수술 후 3 시간 이내에 PBS로 수세한 후 수술용 가위 또는 면도칼 등을 사용해 기계적으로 분쇄하고, 37 ℃ 하에서 Collagenase(0.4 ㎎/㎖, Gibco) 와 DNaseI(0.01-1 ㎎/㎖, Roche) 또는 Papain(10 unit/㎖, Sigma), D-L-Cystein(400 ng/ml, Sigma)과 DNaseI(0.01-1 ㎎/㎖, Roche)를 혼합하여 제조한 효소액에 1 시간 이내로 처리하였다. 이후 혈청 피펫을 사용해 단세포 수준으로 해리시킨 후 나일론 메쉬(nylon mesh)를 통과시켜 단일 세포들을 확보하였다.Each tissue was washed with PBS within 3 hours after surgery, and then mechanically crushed using surgical scissors or a razor, and collagenase (0.4 mg / ml, Gibco) and DNaseI (0.01-1 mg / ml, Roche) at 37 ° C. Or Papain (10 unit / ㎖, Sigma), DL-Cystein (400 ng / ml, Sigma) and DNase I (0.01-1 mg / ㎖, Roche) prepared by mixing the enzyme solution within 1 hour. The cells were then dissociated to single cell level using a serum pipette and passed through a nylon mesh to obtain single cells.

상기 단일 세포현탁액을 퍼콜 (Percoll, Sigma) 농도 구배 원심분리하여 적혈구 및 죽은 세포들을 제거하였다. 최종 수득한 세포들을 FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco), bFGF(R&D), EGF(R&D)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후, Poly-L-Ornithine(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여, 일차 배양된 신경줄기세포를 수득하였다.
The single cell suspension was centrifuged with Percoll (Sigma) concentration gradient to remove red blood cells and dead cells. The final cells were suspended in Neurobasal-A (Gibco) culture or DMEM: F12 (Gibco) culture containing FBS, B27 supplement (Gibco), N2 supplement (Gibco), bFGF (R & D), EGF (R & D). And cultured in a cell culture vessel pre-treated with Poly-L-Ornithine (Sigma), to obtain a primary cultured neural stem cells.

1-2 : 1-2: 계대배양Subculture

실시예 1-1에서 수득한 신경 줄기세포에 대하여 약 10 일 마다 계대배양을 실시하였다. 계대배양은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.The neuronal stem cells obtained in Example 1-1 were passaged about every 10 days. Subculture was carried out in the following manner.

세포 배양 플레이트에서 배지를 모두 제거하고, 세포에 0.05% 트립신/EDTA(T/E, Gibco) 2 ㎖를 처리하고, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 1 분간 반응시켰다.이후, 트립신의 작용을 중단시키기 위하여 FBS가 1% 함유된 배양액 2.5 ㎖를 첨가하여 잘 혼합하였다. 세포 현탁액을 15 ㎖ 코니컬 튜브(cornical tube, Falcon)에 옮겼다. 원심분리를 하여 상층액을 제거하였다. 세포를 Neurobasal-A(Gibco) 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액 1 ㎖로 재부유 시킨 다음 세포수를 측정한 후, 약 1×105~ 5×105개의 세포를 포함하고 있는 세포 현탁액을 기존의 배지가 50% 포함되어 있는 새로운 세포 배양 플레이트에 옮기고, 50 ng/㎖ bFGF, 50 ng/㎖ EGF를 첨가한 후, 계속하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다.Remove all medium from the cell culture plate, treat cells with 2 ml of 0.05% trypsin / EDTA (T / E, Gibco) and react for 1 minute at 37 ° C., 5% CO 2 incubator. To stop, 2.5 ml of the culture solution containing 1% of FBS was added and mixed well. The cell suspension was transferred to a 15 ml cornical tube (Falcon). The supernatant was removed by centrifugation. The cells were resuspended in 1 ml of Neurobasal-A (Gibco) or DMEM: F12 (Gibco) culture, the cell number was measured, and a cell suspension containing about 1 × 10 5 to 5 × 10 5 cells was prepared. The cells were transferred to a new cell culture plate containing 50% of medium, 50 ng / ml bFGF, 50 ng / ml EGF were added, and then cultured in a 5% CO 2 incubator.

도 1A는 분리한 인간 측두엽 및 해마 뇌조직의 성체 신경줄기세포의 계대별 사진을 나타내었다.FIG. 1A shows passage images of adult neural stem cells of isolated human temporal and hippocampal brain tissues.

신경줄기세포의 계대 배양을 수행하며 증식하는 세포의 개수를 누적하여 분석한 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 기울기가 일정한 세포의 성장곡선을 확인하였다.
As a result of accumulating the number of proliferating cells while performing passage culture of neural stem cells, as shown in FIG. 1B, the growth curve of the cells having a constant slope was confirmed.

1-3 : 인간 신경줄기세포의 특성 분석1-3: Characterization of human neural stem cells

상기에서 수득한 신경줄기세포를 4% 파라포름알데히드 (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) 또는 아세톤/메탄올 고정액을 사용하여 고정시킨 후, 0.05% Triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 15 분간 permiablization을 진행하고 5% normal horse serum/1% normal goat serum(Vector lab.)으로 상온에서 1 시간 동안 조직을 blocking하였다.The neural stem cells obtained above were fixed using 4% paraformaldehyde (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) or acetone / methanol fixative, followed by 15 minutes permiablization with PBS containing 0.05% Triton X-100 (Sigma). The tissues were blocked with 5% normal horse serum / 1% normal goat serum (Vector lab.) For 1 hour at room temperature.

이후, 0.01% triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 anti-CD133(Abcam),anti-musashi (Chemicon),anti-nestin(Abcam or Millipore), anti-Sox2(R&D), anti-Sox9(Abcam), anti-Sox10(Abcam), anti-Vimentin(Millipore), anti-GFAP(Sigma or Abcam), anti-Olig2(Millipore), anti-O4(Chemicon), anti-Tuj-I(Millipore) 각각의 항체를 조합하여 처리한 후 4℃에서 overnight로 반응을 시켰다. After washing several times with PBS containing 0.01% triton X-100 (Sigma), anti-CD133 (Abcam), anti-musashi (Chemicon), anti-nestin (Abcam or Millipore), anti-Sox2 (R & D) , anti-Sox9 (Abcam), anti-Sox10 (Abcam), anti-Vimentin (Millipore), anti-GFAP (Sigma or Abcam), anti-Olig2 (Millipore), anti-O4 (Chemicon), anti-Tuj-I (Millipore) Each antibody was treated in combination and then reacted overnight at 4 ° C.

그리고, 0.01% triton X-100을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 상온에서 1시간 동안 처리한 1차 항체에 대응되는 anti-mouse-488(BD), anti-mouse-594(BD), anti-rabbit-488(BD), anti-rabbit-594(BD), anti-rat-488(BD), anti-rat-594(BD) 2차 항체를 처리한 후 마지막으로 DAPI(Sigma)를 사용하여 핵 염색을 시행하였고, 최종 형광 발현은 형광현미경(Axiovert, Zeiss)하에서 검증하였다.After washing several times with PBS containing 0.01% triton X-100, anti-mouse-488 (BD), anti-mouse-594 (BD), and anti-mouse corresponding to the primary antibody treated at room temperature for 1 hour. -rabbit-488 (BD), anti-rabbit-594 (BD), anti-rat-488 (BD), anti-rat-594 (BD) secondary antibody and then DAPI (Sigma) Nuclear staining was performed and final fluorescence expression was verified under fluorescence microscopy (Axiovert, Zeiss).

그 결과, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin, CD133 및 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP의 발현이 확인되었고, 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 Olig2, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질은 발현되지 않음을 확인하였으며(도 2A), Sox2, Sox9, 및 Vimentin은 강하게 발현하였다(도 2B). 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 신경 줄기세포의 특성 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, expression of Nestin, CD133 and astrolase-specific marker GFAP, which are known as neural stem cell specific marker proteins, was confirmed, and oligodendrosite-specific marker Olig2 and neuron-specific marker Tuj-I protein were not expressed. (FIG. 2A), Sox2, Sox9, and Vimentin were strongly expressed (FIG. 2B). Through this, it was confirmed that the characteristics of neural stem cells were maintained throughout the passage.

1-4 : 인간 신경줄기세포의 1-4: of human neural stem cells 분화능Eruption 검증 Verification

상기에서 획득한 성체 신경줄기세포가 하위 신경세포로의 분화능력을 가지며, 계대 배양기간 중 분화능이 유지되는 것을 확인하기 위하여, FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후 Poly-L-Ornithine(Sigma) 및 Laminin(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여 부착시켰다. 이후 10%FBS를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액이나 Nerve growth factor(R&D), IBMX, dcAMP를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액에 1-2주일간 배양하여 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포를 대상으로 실시예 1-3에 기재된 방식으로 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역염색화학법을 이용해 분석하였고 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 분화능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
Neurobasal-A including FBS, B27 supplement (Gibco) and N2 supplement (Gibco) in order to confirm that the adult neural stem cells obtained above have differentiation capacity to lower neurons and maintain differentiation capacity during subculture. The cells were suspended in (Gibco) culture medium or DMEM: F12 (Gibco) culture medium, and then cultured and attached to cell culture containers pretreated with Poly-L-Ornithine (Sigma) and Laminin (Sigma). Then incubate for 1-2 weeks in Neurobasal-A (Gibco) medium containing 10% FBS or DMEM: F12 (Gibco) medium or Neurobasal-A (Gibco) medium containing Nerve growth factor (R & D), IBMX, dcAMP Differentiation was induced. The expression of sub-neuronal cell specific marker proteins in these differentiated cells was analyzed by immunostaining chemistry in the manner described in Examples 1-3, and it was confirmed that the differentiation capacity was maintained throughout the passage. 3).

실시예 2 : NICD ( Notch intracellular domain ) 발현 재조합 렌티 바이러스 제작
Example 2 NICD ( Notch intracellular domain ) expression recombinant lentivirus production

2-1 : 재조합 바이러스 벡터 제조2-1: Recombinant Virus Vector Preparation

먼저, 서열번호 1의 NICD 유전자는 신경 줄기세포로부터 RT-PCR로 증폭하였다. 실시예 1의 신경 줄기세포로부터 total RNA는 Rneasy kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였고, 이후 역 전사효소인 Superscript III (Invitrogen)를 처리 cDNA를 합성하여 PCR 증폭의 주형으로 사용하였으며, EmGFP (Invitrogen) 유전자는 pLenti6.3/V5-GW/EmGFP (Invitrogen) 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머는 두 유전자 모두 lentivirus 벡터에서의 아미노산 발현을 개시하기 위해 CACC 서열을 포함하고 있다. 구체적으로 서열은 아래와 같다:First, the NICD gene of SEQ ID NO: 1 was amplified by RT-PCR from neural stem cells. Total RNA was extracted from the neural stem cells of Example 1 using Rneasy kit (Qiagen), and then a reverse cDNA superscript III (Invitrogen) was synthesized using cDNA as a template for PCR amplification, and EmGFP (Invitrogen) Genes were amplified by PCR from pLenti6.3 / V5-GW / EmGFP (Invitrogen) vector. Both primers contain a CACC sequence for initiating amino acid expression in lentivirus vectors. Specifically, the sequence is as follows:

Forward primer: CACC ATG　 CGG CGG CAG CAT GGC CAG (서열번호 3)Forward primer: CACC ATG CGG CGG CAG CAT GGC CAG (SEQ ID NO: 3)

Reverse primer: TTA CTT GAA GGC CTC CGG AAT G　　(서열번호 4)Reverse primer: TTA CTT GAA GGC CTC CGG AAT G (SEQ ID NO: 4)

PCR 반응은 94 ℃에서 5 분간 초기 변성; 94 ℃에서 1 분간 변성, 60 ℃에서 30 초간 어닐링(annealing) 및 72 ℃에서 3 분간 신장 (extension)의 15 사이클; 및 72 ℃에서 10 분간 최종 신장으로 수행되었다. 증폭된 PCR 산물을 pENTR-D-TOPO(Invitrogen) 벡터에 클로닝하였다. PCR reactions were initially denatured at 94 ° C. for 5 minutes; 15 cycles of denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 60 ° C. for 30 seconds and extension at 72 ° C. for 3 minutes; And final elongation at 72 ° C. for 10 minutes. The amplified PCR product was cloned into pENTR-D-TOPO (Invitrogen) vector.

그리고, 신경줄기세포에서의 안정적인 도입 유전자의 발현을 위해 인간 ubiquitin C (UbC) 유전자의 프로모터 부분을 pLenti6/UbC/V5-DEST (Invitrogen) 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 이때 사용한 프라이머는 용이한 클로닝을 위해 ClaI 및 SpeI 제한효소 서열을 포함하고 있다. 상기에서 증폭된 UbC 유전자 프로모터 부분을 pGEM-T easy (Promega) 벡터에 클로닝하였고, 이후 ClaI 및 SpeI 제한효소를 처리를 통해 유전자 단편을 확보하였으며, 동일한 제한 효소를 사용하여 pLenti7.3/V5-DEST (Invitrogen) 벡터의 CMV 프로모터 부위를 제거하여 벡터의 단편을 확보하였다. 이후 상기의 유전자 단편과 벡터 단편을 Ligase(promega) 처리를 통해 UbC 프로모터가 삽입된 발현 벡터를 확립하였다.Then, the promoter portion of the human ubiquitin C (UbC) gene was amplified by PCR from the pLenti6 / UbC / V5-DEST (Invitrogen) vector for stable expression of the transgene in neural stem cells. The primers used here contain the ClaI and SpeI restriction enzyme sequences for easy cloning. The amplified UbC gene promoter portion was cloned into pGEM-T easy (Promega) vector, and then the gene fragments were obtained by treating with ClaI and SpeI restriction enzymes, and pLenti7.3 / V5-DEST using the same restriction enzymes. The fragment of the vector was obtained by removing the CMV promoter region of the (Invitrogen) vector. Thereafter, the gene fragment and the vector fragment were treated with Ligase (promega) to establish an expression vector into which the UbC promoter was inserted.

Reporter 유전자의 삽입을 위해 상기의 벡터에 KpnI 제한효소를 처리해 벡터의 절편을 확보하였고, 동일한 제한 효소의 처리를 통해 pSuper-retro (Oligoengine) 벡터에서 항생제 발현 프로모터 및 유전자 단편을 확보하였다. 이후 상기의 유전자 단편과 벡터 단편을 Ligase(promega) 처리를 통해 UbC 프로모터가 삽입된 발현 벡터를 확립하였다. 확립된 발현 벡터에 LR clonase (Invitrogen)를 이용하여, NICD 및 EmGFP 유전자를 전달하여 최종 발현벡터를 확립하였다.For insertion of the reporter gene, the vector was treated with KpnI restriction enzyme to obtain a fragment of the vector. Through the same restriction enzyme treatment, an antibiotic expression promoter and gene fragment were obtained from the pSuper-retro (Oligoengine) vector. Thereafter, the gene fragment and the vector fragment were treated with Ligase (promega) to establish an expression vector into which the UbC promoter was inserted. The final expression vector was established by transferring the NICD and EmGFP genes using LR clonase (Invitrogen) to the established expression vector.

상기 방법으로 제조한 렌티 바이러스 벡터의 구조를 도 4-A에 도시하였다.
The structure of the lentiviral vector prepared by the above method is shown in FIGS. 4-A.

2-2 : 2-2: NICDNICD 발현 재조합  Expression recombination 렌티Lenti 바이러스 제조 Virus manufacturing

(1) 렌티 바이러스(Lentivirus)의 생산 (1) Production of lentiviruses

Virus packaging 세포주로는 293FT (Invitrogen) 세포주를 사용하였다. 상기293FT 세포주에 실시예 2-1에서 제작한 NICD 과발현 벡터 및 virus packaging 관련 벡터 3종을 (pLP-1, pLP-2, pLP/VSVG) (Invitrogen) Lipofectamine reagent (Invitrogen)를 이용해 co-transfection 하여 virus 생산을 유도하였다.
Virus packaging cell line was used 293FT (Invitrogen) cell line. The 393FT cell line was co-transfected with three NICD overexpression vectors and virus packaging-related vectors (pLP-1, pLP-2, pLP / VSVG) (Invitrogen) using Lipofectamine reagent (Invitrogen). Induced virus production.

(2) Lentivirus particle의 수거 (2) Collection of Lentivirus particles

상기에서 확보한 virus 생산 세포주의 세포 배양액을 co-transfection 후 72 시간까지 수거하였다. Virus가 생산되어 나오는 배양액을 새로운 배양 배지로 12 시간 간격으로 교체하며 상층 배양액을 6 회 수거하였다. 이 기간 중 수거한 virus는 4 ℃에서 보관하였다.
Cell cultures of the virus-producing cell lines obtained above were harvested up to 72 hours after co-transfection. The culture medium from which the virus was produced was replaced with fresh culture medium every 12 hours, and the supernatant culture was collected 6 times. Viruses collected during this period were stored at 4 ° C.

(3) Lentivirus particle의 적정 (titration) (3) titration of Lentivirus particles

상기에서 수거한 virus를 포함하는 상층 배양액을 0.22 ㎛ syringe filter를 통과시켜 세포 부유물을 제거하였다. 24-well plate에 1x104 cells/ml의 세포농도로 배양된 293FT 세포에 6 ㎍/㎖ 농도의 polybrene (Sigma)을 처리하고, 준비한 virus를 10x, 1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x의 농도로 순차적으로 희석하여 감염시켰다. The cell suspension was removed by passing the supernatant culture solution containing the virus collected above through a 0.22 μm syringe filter. 293FT cells incubated in a 24-well plate at a cell concentration of 1x10 4 cells / ml were treated with 6 μg / ml polybrene (Sigma), and the prepared virus was 10x, 1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625. Infection was carried out by serial dilution to a concentration of x.

그 다음, FACS (FACS Calibur., BD) 분석을 통해 EGFP 발현 세포의 계수 또는 puromycin 항생제 선발을 통해 virus particle의 수와 세포의 수가 1:1이 되는 농도를 선택하였다. 이때의 농도를 기준으로 각 virus particle의 개수를 일량화 시켰다.
Next, the concentration of the virus particles and the number of cells were selected to be 1: 1 by counting EGFP-expressing cells or selecting puromycin antibiotics by FACS (FACS Calibur., BD) analysis. Based on the concentration at this time, the number of each virus particle was equalized.

실시예 3 : NICD 발현 재조합 렌티 바이러스에 의한 신경줄기세포의 감염 및 감염 세포 주 선발 Example 3 Infection of Neural Stem Cells by NICD Expression Recombinant Lenti Virus and Selection of Infected Cell Lines

Poly-L-Ornithine으로 전 처리한 24-well plate에 1x104 cells/ml의 세포농도로 배양된 신경줄기세포에 6 ㎍/㎖ 농도의 polybrene (Sigma)을 처리하였다. 그 후, 실시예 2에서 준비한 NICD 발현 재조합 렌티 바이러스를 1x103 Transducing unit (TU)으로 희석하여 감염시켰다. A 24-well plate pre-treated with Poly-L-Ornithine was treated with 6b / ml polybrene (Sigma) in neural stem cells cultured at a cell concentration of 1x10 4 cells / ml. Thereafter, the NICD expressing recombinant lenti virus prepared in Example 2 was infected by dilution with 1 × 10 3 Transducing unit (TU).

감염 시작 3 시간 후 기존 바이러스 포함 배지를 새로운 신경줄기세포 배양배지로 교체하고, 이후 12 시간 배양을 진행하였다. 배양 후 Puromycin (Sigma) 항생제를 1 ㎍/㎖의 농도로 첨가하여 5 일간 항생제 선발을 진행하였다.
Three hours after the start of infection, the existing virus-containing medium was replaced with a new neural stem cell culture medium, and then cultured for 12 hours. After incubation, Puromycin (Sigma) antibiotics were added at a concentration of 1 μg / ml for antibiotic selection for 5 days.

실시예 4 : NICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인
Example 4 : Confirmation of characteristics of neural stem cells into which the NICD gene is introduced

4-1 : 4-1: NICDNICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인 Characterization of Neural Stem Cells Introduced by Genes

실시예 3에서 선발된 NICD 발현 재조합 렌티 바이러스로 감염된 신경줄기세포주에 대하여, 실시예 1-2와 같은 방법으로 NICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인을 확인하였다. About the neural stem cell line infected with the NICD-expressing recombinant lenti virus selected in Example 3, the characteristics of the neural stem cells into which the NICD gene was introduced were confirmed in the same manner as in Example 1-2.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Musashi, Nestin, Sox2, CD133의 강하게 발현 (도 4-B)되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figure 4, it was confirmed that the strong expression of Musashi, Nestin, Sox2, CD133 known as neural stem cell specific marker protein (Fig. 4-B).

4-2 : 4-2: NICDNICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의  Of neural stem cells 분화능Eruption 검증 Verification

상기에서 획득한 NICD 과발현 성체 신경줄기세포가 하위 신경세포로의 분화능력을 가지며, 계대 배양기간 중 분화능이 유지되는 것을 확인하기 위해 FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후 Poly-L-Ornithine(Sigma) 및 Laminin(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여 부착시켰다. 이후, 10% FBS를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액이나 Nerve growth factor(R&D), IBMX, dcAMP를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액에 1-2주일간 배양하여 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포를 대상으로 실시예 1-3에 기재된 방식으로 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역염색화학법을 이용해 분석하였고 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 분화능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4C; 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP, 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 O4, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질)
Neurobasal-containing FBS, B27 supplement (Gibco) and N2 supplement (Gibco) to confirm that the obtained NICD overexpressing adult neural stem cells have differentiation ability to lower neurons and maintain differentiation ability during subculture. The cells were suspended in A (Gibco) culture medium or DMEM: F12 (Gibco) culture medium, and then cultured and attached to cell culture containers pretreated with Poly-L-Ornithine (Sigma) and Laminin (Sigma). Then, incubate for 1-2 weeks in Neurobasal-A (Gibco) medium containing 10% FBS or DMEM: F12 (Gibco) medium or Neurobasal-A (Gibco) medium containing Nerve growth factor (R & D), IBMX, dcAMP Differentiation was induced. The expression of sub-neuronal cell specific marker proteins in these differentiated cells was analyzed by immunostaining chemistry in the manner described in Examples 1-3, and it was confirmed that the differentiation capacity was maintained throughout the passage. Fig. 4C; Astrosite-specific marker GFAP, oligodendrosite-specific marker O4, neuron-specific marker Tuj-I protein)

4-3 : 4-3: NICDNICD 유전자가 도입된 신경줄기세포의 세포  Cells of neural stem cells into which genes are introduced 증식능Proliferative capacity 검증 Verification

실시예 3에서 선발된 NICD 발현 재조합 렌티 바이러스로 감염된 신경줄기세포주에 대하여, Poly-L-Ornithine으로 전 처리한 24-well plate에 5x103 cells/ml의 세포농도로 배양하였다. 그 후, CCK-8 (Dojindo) 시약을 동량 처리하고 37 ℃ 5% CO2 세포배양기에서 2-4 시간 동안 배양하고, 상층액을 96-well plate에 옮긴 후 micro well plate reader 기기를 이용하여 460 nm의 파장 영역에서 흡광도를 측정하였다.The neural stem cell line infected with the NICD expressing recombinant lenti virus selected in Example 3 was cultured at a cell concentration of 5 × 10 3 cells / ml in a 24-well plate pre-treated with Poly-L-Ornithine. Thereafter, the same amount of CCK-8 (Dojindo) reagent was treated and incubated for 2-4 hours in a 37 ° C. 5% CO 2 cell incubator, the supernatant was transferred to a 96-well plate, and then 460 using a micro well plate reader. Absorbance was measured in the wavelength region of nm.

그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, wild type 및 EmGFP 발현 세포주에 비해 NICD 발현 세포주에서 세포 증식이 현저하게 증가하는 것을 확인하였다. 이 후, 계대 배양을 진행하면서 신경줄기세포의 증식 정도를 관찰하였다. 증식되는 세포의 개수를 계수한 결과, 도 5-B에 나타난 바와 같이, 세포수 누적 증가율 또한, NICD 발현 세포주에서 대조군과 비교하여, 확연히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in FIG. 5A, it was confirmed that the cell proliferation was significantly increased in the NICD expressing cell line compared to the wild type and EmGFP expressing cell line. Subsequently, passage of culture was observed to observe the extent of neural stem cell proliferation. As a result of counting the number of cells to proliferate, as shown in FIG.

이러한 결과를 통해, NICD 유전자의 도입을 통한 노치 신호전달체계의 활성화는 성체 신경줄기세포의 증식능을 획기적으로 향상시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는 성체 신경줄기세포의 대량증식을 통한 세포치료제로의 응용 가능성을 시사한다.
Through these results, activation of Notch signaling system through the introduction of NICD gene was confirmed to dramatically improve the proliferative capacity of adult neural stem cells. This suggests the possibility of application as a cell therapy through mass proliferation of adult neural stem cells.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the contents of the present invention in detail, it will be apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. . Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Samsung Life Welfare Foundation <120> Method for Proliferating Stem Cells Using Genes Activating Notch Signaling <130> P11-B010 <150> KR10-2010-0010117 <151> 2010-02-03 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caccatgcgg cggcagcatg gccagctctg gttccctgag ggcttcaaag tgtctgaggc 60 cagcaagaag aagcggcggg agcccctcgg cgaggactcc gtgggcctca agcccctgaa 120 gaacgcttca gacggtgccc tcatggacga caaccagaat gagtgggggg acgaggacct 180 ggagaccaag aagttccggt tcgaggagcc cgtggttctg cctgacctgg acgaccagac 240 agaccaccgg cagtggactc agcagcacct ggatgccgct gacctgcgca tgtctgccat 300 ggcccccaca ccgccccagg gtgaggttga cgccgactgc atggacgtca atgtccgcgg 360 gcctgatggc ttcaccccgc tcatgatcgc ctcctgcagc gggggcggcc tggagacggg 420 caacagcgag gaagaggagg acgcgccggc cgtcatctcc gacttcatct accagggcgc 480 cagcctgcac aaccagacag accgcacggg cgagaccgcc ttgcacctgg ccgcccgcta 540 ctcacgctct gatgccgcca agcgcctgct ggaggccagc gcagatgcca acatccagga 600 caacatgggc cgcaccccgc tgcatgcggc tgtgtctgcc gacgcacaag gtgtcttcca 660 gatcctgatc cggaaccgag ccacagacct ggatgcccgc atgcatgatg gcacgacgcc 720 actgatcctg gctgcccgcc tggccgtgga gggcatgctg gaggacctca tcaactcaca 780 cgccgacgtc aacgccgtag atgacctggg caagtccgcc ctgcactggg ccgccgccgt 840 gaacaatgtg gatgccgcag ttgtgctcct gaagaacggg gctaacaaag atatgcagaa 900 caacagggag gagacacccc tgtttctggc cgcccgggag ggcagctacg agaccgccaa 960 ggtgctgctg gaccactttg ccaaccggga catcacggat catatggacc gcctgccgcg 1020 cgacatcgca caggagcgca tgcatcacga catcgtgagg ctgctggacg agtacaacct 1080 ggtgcgcagc ccgcagctgc acggagcccc gctggggggc acgcccaccc tgtcgccccc 1140 gctctgctcg cccaacggct acctgggcag cctcaagccc ggcgtgcagg gcaagaaggt 1200 ccgcaagccc agcagcaaag gcctggcctg tggaagcaag gaggccaagg acctcaaggc 1260 acggaggaag aagtcccagg acggcaaggg ctgcctgctg gacagctccg gcatgctctc 1320 gcccgtggac tccctggagt caccccatgg ctacctgtca gacgtggcct cgccgccact 1380 gctgccctcc ccgttccagc agtctccgtc cgtgcccctc aaccacctgc ctgggatgcc 1440 cgacacccac ctgggcatcg ggcacctgaa cgtggcggcc aagcccgaga tggcggcgct 1500 gggtgggggc ggccggctgg cctttgagac tggcccacct cgtctctccc acctgcctgt 1560 ggcctctggc accagcaccg tcctgggctc cagcagcgga ggggccctga atttcactgt 1620 gggcgggtcc accagtttga atggtcaatg cgagtggctg tcccggctgc agagcggcat 1680 ggtgccgaac caatacaacc ctctgcgggg gagtgtggca ccaggccccc tgagcacaca 1740 ggccccctcc ctgcagcatg gcatggtagg cccgctgcac agtagccttg ctgccagcgc 1800 cctgtcccag atgatgagct accagggcct gcccagcacc cggctggcca cccagcctca 1860 cctggtgcag acccagcagg tgcagccaca aaacttacag atgcagcagc agaacctgca 1920 gccagcaaac atccagcagc agcaaagcct gcagccgcca ccaccaccac cacagccgca 1980 ccttggcgtg agctcagcag ccagcggcca cctgggccgg agcttcctga gtggagagcc 2040 gagccaggca gacgtgcagc cactgggccc cagcagcctg gcggtgcaca ctattctgcc 2100 ccaggagagc cccgccctgc ccacgtcgct gccatcctcg ctggtcccac ccgtgaccgc 2160 agcccagttc ctgacgcccc cctcgcagca cagctactcc tcgcctgtgg acaacacccc 2220 cagccaccag ctacaggtgc ctgagcaccc cttcctcacc ccgtcccctg agtcccctga 2280 ccagtggtcc agctcgtccc cgcattccaa cgtctccgac tggtccgagg gcgtctccag 2340 ccctcccacc agcatgcagt cccagatcgc ccgcattccg gaggccttca agtaa 2395 <210> 2 <211> 795 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser 1 5 10 15 Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val 20 25 30 Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp 35 40 45 Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg 50 55 60 Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Asp Asp Gln Thr Asp His 65 70 75 80 Arg Gln Trp Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser 85 90 95 Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met 100 105 110 Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala 115 120 125 Ser Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu Glu 130 135 140 Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala Ser Leu 145 150 155 160 His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala 165 170 175 Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu Ala Ser Ala 180 185 190 Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro Leu His Ala Ala 195 200 205 Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg 210 215 220 Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile 225 230 235 240 Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Leu Glu Asp Leu Ile Asn 245 250 255 Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu 260 265 270 His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu 275 280 285 Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln Asn Asn Arg Glu Glu Thr Pro 290 295 300 Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu 305 310 315 320 Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu 325 330 335 Pro Arg Asp Ile Ala Gln Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu 340 345 350 Leu Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Ala Pro 355 360 365 Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly 370 375 380 Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly Lys Lys Val Arg Lys 385 390 395 400 Pro Ser Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys Asp Leu 405 410 415 Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly Cys Leu Leu Asp 420 425 430 Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Gly 435 440 445 Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro Phe Gln 450 455 460 Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met Pro Asp Thr 465 470 475 480 His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala 485 490 495 Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu Thr Gly Pro Pro Arg 500 505 510 Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr Ser Thr Val Leu Gly Ser 515 520 525 Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly Gly Ser Thr Ser Leu 530 535 540 Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser Arg Leu Gln Ser Gly Met Val Pro 545 550 555 560 Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser 565 570 575 Thr Gln Ala Pro Ser Leu Gln His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser 580 585 590 Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu 595 600 605 Pro Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln 610 615 620 Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro Ala 625 630 635 640 Asn Ile Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln 645 650 655 Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu Gly Arg Ser 660 665 670 Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val Gln Pro Leu Gly Pro 675 680 685 Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln Glu Ser Pro Ala Leu 690 695 700 Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr Ala Ala Gln 705 710 715 720 Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser Tyr Ser Ser Pro Val Asp Asn 725 730 735 Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro 740 745 750 Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn 755 760 765 Val Ser Asp Trp Ser Glu Gly Val Ser Ser Pro Pro Thr Ser Met Gln 770 775 780 Ser Gln Ile Ala Arg Ile Pro Glu Ala Phe Lys 785 790 795 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NICD sense primer <400> 3 caccatgcgg cggcagcatg gccag 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NICD anti-sense primer <400> 4 ttacttgaag gcctccggaa tg 22 <110> Samsung Life Welfare Foundation <120> Method for Proliferating Stem Cells Using Genes Activating Notch          Signaling <130> P11-B010 <150> KR10-2010-0010117 <151> 2010-02-03 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2395 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caccatgcgg cggcagcatg gccagctctg gttccctgag ggcttcaaag tgtctgaggc 60 cagcaagaag aagcggcggg agcccctcgg cgaggactcc gtgggcctca agcccctgaa 120 gaacgcttca gacggtgccc tcatggacga caaccagaat gagtgggggg acgaggacct 180 ggagaccaag aagttccggt tcgaggagcc cgtggttctg cctgacctgg acgaccagac 240 agaccaccgg cagtggactc agcagcacct ggatgccgct gacctgcgca tgtctgccat 300 ggcccccaca ccgccccagg gtgaggttga cgccgactgc atggacgtca atgtccgcgg 360 gcctgatggc ttcaccccgc tcatgatcgc ctcctgcagc gggggcggcc tggagacggg 420 caacagcgag gaagaggagg acgcgccggc cgtcatctcc gacttcatct accagggcgc 480 cagcctgcac aaccagacag accgcacggg cgagaccgcc ttgcacctgg ccgcccgcta 540 ctcacgctct gatgccgcca agcgcctgct ggaggccagc gcagatgcca acatccagga 600 caacatgggc cgcaccccgc tgcatgcggc tgtgtctgcc gacgcacaag gtgtcttcca 660 gatcctgatc cggaaccgag ccacagacct ggatgcccgc atgcatgatg gcacgacgcc 720 actgatcctg gctgcccgcc tggccgtgga gggcatgctg gaggacctca tcaactcaca 780 cgccgacgtc aacgccgtag atgacctggg caagtccgcc ctgcactggg ccgccgccgt 840 gaacaatgtg gatgccgcag ttgtgctcct gaagaacggg gctaacaaag atatgcagaa 900 caacagggag gagacacccc tgtttctggc cgcccgggag ggcagctacg agaccgccaa 960 ggtgctgctg gaccactttg ccaaccggga catcacggat catatggacc gcctgccgcg 1020 cgacatcgca caggagcgca tgcatcacga catcgtgagg ctgctggacg agtacaacct 1080 ggtgcgcagc ccgcagctgc acggagcccc gctggggggc acgcccaccc tgtcgccccc 1140 gctctgctcg cccaacggct acctgggcag cctcaagccc ggcgtgcagg gcaagaaggt 1200 ccgcaagccc agcagcaaag gcctggcctg tggaagcaag gaggccaagg acctcaaggc 1260 acggaggaag aagtcccagg acggcaaggg ctgcctgctg gacagctccg gcatgctctc 1320 gcccgtggac tccctggagt caccccatgg ctacctgtca gacgtggcct cgccgccact 1380 gctgccctcc ccgttccagc agtctccgtc cgtgcccctc aaccacctgc ctgggatgcc 1440 cgacacccac ctgggcatcg ggcacctgaa cgtggcggcc aagcccgaga tggcggcgct 1500 gggtgggggc ggccggctgg cctttgagac tggcccacct cgtctctccc acctgcctgt 1560 ggcctctggc accagcaccg tcctgggctc cagcagcgga ggggccctga atttcactgt 1620 gggcgggtcc accagtttga atggtcaatg cgagtggctg tcccggctgc agagcggcat 1680 ggtgccgaac caatacaacc ctctgcgggg gagtgtggca ccaggccccc tgagcacaca 1740 ggccccctcc ctgcagcatg gcatggtagg cccgctgcac agtagccttg ctgccagcgc 1800 cctgtcccag atgatgagct accagggcct gcccagcacc cggctggcca cccagcctca 1860 cctggtgcag acccagcagg tgcagccaca aaacttacag atgcagcagc agaacctgca 1920 gccagcaaac atccagcagc agcaaagcct gcagccgcca ccaccaccac cacagccgca 1980 ccttggcgtg agctcagcag ccagcggcca cctgggccgg agcttcctga gtggagagcc 2040 gagccaggca gacgtgcagc cactgggccc cagcagcctg gcggtgcaca ctattctgcc 2100 ccaggagagc cccgccctgc ccacgtcgct gccatcctcg ctggtcccac ccgtgaccgc 2160 agcccagttc ctgacgcccc cctcgcagca cagctactcc tcgcctgtgg acaacacccc 2220 cagccaccag ctacaggtgc ctgagcaccc cttcctcacc ccgtcccctg agtcccctga 2280 ccagtggtcc agctcgtccc cgcattccaa cgtctccgac tggtccgagg gcgtctccag 2340 ccctcccacc agcatgcagt cccagatcgc ccgcattccg gaggccttca agtaa 2395 <210> 2 <211> 795 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Arg Arg Gln His Gly Gln Leu Trp Phe Pro Glu Gly Phe Lys Val Ser   1 5 10 15 Glu Ala Ser Lys Lys Lys Arg Arg Glu Pro Leu Gly Glu Asp Ser Val              20 25 30 Gly Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ala Ser Asp Gly Ala Leu Met Asp Asp          35 40 45 Asn Gln Asn Glu Trp Gly Asp Glu Asp Leu Glu Thr Lys Lys Phe Arg      50 55 60 Phe Glu Glu Pro Val Val Leu Pro Asp Leu Asp Asp Gln Thr Asp His  65 70 75 80 Arg Gln Trp Thr Gln Gln His Leu Asp Ala Ala Asp Leu Arg Met Ser                  85 90 95 Ala Met Ala Pro Thr Pro Pro Gln Gly Glu Val Asp Ala Asp Cys Met             100 105 110 Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Phe Thr Pro Leu Met Ile Ala         115 120 125 Ser Cys Ser Gly Gly Gly Leu Glu Thr Gly Asn Ser Glu Glu Glu Glu     130 135 140 Asp Ala Pro Ala Val Ile Ser Asp Phe Ile Tyr Gln Gly Ala Ser Leu 145 150 155 160 His Asn Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Thr Ala Leu His Leu Ala Ala                 165 170 175 Arg Tyr Ser Arg Ser Asp Ala Ala Lys Arg Leu Leu Glu Ala Ser Ala             180 185 190 Asp Ala Asn Ile Gln Asp Asn Met Gly Arg Thr Pro Leu His Ala Ala         195 200 205 Val Ser Ala Asp Ala Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg     210 215 220 Ala Thr Asp Leu Asp Ala Arg Met His Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile 225 230 235 240 Leu Ala Ala Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Leu Glu Asp Leu Ile Asn                 245 250 255 Ser His Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp Leu Gly Lys Ser Ala Leu             260 265 270 His Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Asp Ala Ala Val Val Leu Leu         275 280 285 Lys Asn Gly Ala Asn Lys Asp Met Gln Asn Asn Arg Glu Glu Thr Pro     290 295 300 Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Thr Ala Lys Val Leu 305 310 315 320 Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg Leu                 325 330 335 Pro Arg Asp Ile Ala Gln Glu Arg Met His His Asp Ile Val Arg Leu             340 345 350 Leu Asp Glu Tyr Asn Leu Val Arg Ser Pro Gln Leu His Gly Ala Pro         355 360 365 Leu Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ser Pro Pro Leu Cys Ser Pro Asn Gly     370 375 380 Tyr Leu Gly Ser Leu Lys Pro Gly Val Gln Gly Lys Lys Val Arg Lys 385 390 395 400 Pro Ser Ser Lys Gly Leu Ala Cys Gly Ser Lys Glu Ala Lys Asp Leu                 405 410 415 Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ser Gln Asp Gly Lys Gly Cys Leu Leu Asp             420 425 430 Ser Ser Gly Met Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Gly         435 440 445 Tyr Leu Ser Asp Val Ala Ser Pro Pro Leu Leu Pro Ser Pro Phe Gln     450 455 460 Gln Ser Pro Ser Val Pro Leu Asn His Leu Pro Gly Met Pro Asp Thr 465 470 475 480 His Leu Gly Ile Gly His Leu Asn Val Ala Ala Lys Pro Glu Met Ala                 485 490 495 Ala Leu Gly Gly Gly Gly Arg Leu Ala Phe Glu Thr Gly Pro Pro Arg             500 505 510 Leu Ser His Leu Pro Val Ala Ser Gly Thr Ser Thr Val Leu Gly Ser         515 520 525 Ser Ser Gly Gly Ala Leu Asn Phe Thr Val Gly Gly Ser Thr Ser Leu     530 535 540 Asn Gly Gln Cys Glu Trp Leu Ser Arg Leu Gln Ser Gly Met Val Pro 545 550 555 560 Asn Gln Tyr Asn Pro Leu Arg Gly Ser Val Ala Pro Gly Pro Leu Ser                 565 570 575 Thr Gln Ala Pro Ser Leu Gln His Gly Met Val Gly Pro Leu His Ser             580 585 590 Ser Leu Ala Ala Ser Ala Leu Ser Gln Met Met Ser Tyr Gln Gly Leu         595 600 605 Pro Ser Thr Arg Leu Ala Thr Gln Pro His Leu Val Gln Thr Gln Gln     610 615 620 Val Gln Pro Gln Asn Leu Gln Met Gln Gln Gln Asn Leu Gln Pro Ala 625 630 635 640 Asn Ile Gln Gln Gln Gln Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Pro Gln                 645 650 655 Pro His Leu Gly Val Ser Ser Ala Ala Ser Gly His Leu Gly Arg Ser             660 665 670 Phe Leu Ser Gly Glu Pro Ser Gln Ala Asp Val Gln Pro Leu Gly Pro         675 680 685 Ser Ser Leu Ala Val His Thr Ile Leu Pro Gln Glu Ser Pro Ala Leu     690 695 700 Pro Thr Ser Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Pro Val Thr Ala Ala Gln 705 710 715 720 Phe Leu Thr Pro Pro Ser Gln His Ser Tyr Ser Ser Pro Val Asp Asn                 725 730 735 Thr Pro Ser His Gln Leu Gln Val Pro Glu His Pro Phe Leu Thr Pro             740 745 750 Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Asn         755 760 765 Val Ser Asp Trp Ser Glu Gly Val Ser Ser Pro Pro Thr Ser Met Gln     770 775 780 Ser Gln Ile Ala Arg Ile Pro Glu Ala Phe Lys 785 790 795 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NICD sense primer <400> 3 caccatgcgg cggcagcatg gccag 25 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NICD anti-sense primer <400> 4 ttacttgaag gcctccggaa tg 22

Claims (17)

노치 (Notch) 신호 활성화 유전자가 도입되어 있는 재조합 줄기세포.
Recombinant stem cells into which Notch signal activating genes are introduced.
제1항에 있어서, 상기 노치 신호 활성화 유전자는 NICD (Notch intracellular domain) 유전자인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
The stem cell of claim 1, wherein the Notch signal activating gene is a Notch intracellular domain (NICD) gene.
제2항에 있어서, 상기 NICD (Notch intracellular domain) 유전자는 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 줄기세포.
According to claim 2, wherein the Notch intracellular domain (NICD) gene is a stem cell, characterized in that consisting of a sequence comprising the nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포 (neural stem cells) 또는 신경능선줄기세포 (neural crest stem cells)인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
The stem cell of claim 1, wherein the stem cells are neural stem cells or neural crest stem cells.
제4항에 있어서, 상기 신경줄기세포 (neural stem cells) 또는 신경능선줄기세포 (neural crest stem cells)는 인간 성체 뇌조직 유래인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
The stem cell of claim 4, wherein the neural stem cells or neural crest stem cells are derived from human adult brain tissue.
제5항에 있어서, 상기 뇌조직은 측두엽 조직 또는 해마조직인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
The stem cell of claim 5, wherein the brain tissue is temporal lobe tissue or hippocampal tissue.
제1항에 있어서, 상기 도입은 바이러스 벡터를 매개로 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
The stem cell of claim 1, wherein the introduction is performed through a viral vector.
제7항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 허피스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스 및 렌티 바이러스로 구성된 군에서 선택되는 하나의 바이러스인 것을 특징으로 하는 줄기세포.
8. The stem cell of claim 7, wherein the virus is one virus selected from the group consisting of retrovirus, adenovirus, herpes virus, Epstein-Barr virus and lenti virus.
제7항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 도 4의 (A) 개열 지도를 가지는 것을 특징으로 하는 줄기세포.
8. The stem cell of claim 7, wherein the viral vector has a cleavage map of FIG. 4 (A).
NICD (Notch intracellular domain) 유전자가 도입되어 있고, 노치 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포.
A neural stem cell or a neural crest stem cell in which a Notch intracellular domain (NICD) gene is introduced and a Notch signal is activated.
제10항의 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 유효성분으로 함유하는 뇌신경질환 치료용 세포 치료제.
Cell therapy for the treatment of cerebral neurological diseases, comprising the neural stem cells or neural crest stem cells of claim 10 as an active ingredient.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 증식방법.
5. A method of proliferating stem cells comprising culturing the stem cells of claim 1.
제12항에 있어서, 상기 노치 신호 활성화 유전자는 NICD (Notch intracellular domain)인 것을 특징으로 하는 증식방법.
The method of claim 12, wherein the Notch signal activating gene is a Notch intracellular domain (NICD).
제12항에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포(neural stem cells) 또는 신경능선줄기세포 (neural crest stem cells)인 것을 특징으로 하는 증식방법.
The method of claim 12, wherein the stem cells are neural stem cells or neural crest stem cells.
제12항에 있어서, 상기 노치 신호 활성화 유전자 도입은 일차 배양된 줄기세포에서 수행되는 것을 특징으로 하는 증식방법.
The method of claim 12, wherein the notch signal activating gene is introduced in primary cultured stem cells.
제12항에 있어서, 상기 배양은 FBS, B27 supplement, N2 supplement, bFGF 및 EGF를 함유하는 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 증식방법.
The method according to claim 12, wherein the culturing is performed in a medium containing FBS, B27 supplement, N2 supplement, bFGF, and EGF.
제12항에 있어서, 상기 배양은 3대 계대 배양 이상으로 수행되는 것을 특징으로 하는 증식방법.The method according to claim 12, wherein the culturing is carried out in three subcultures.
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