KR101269124B1 - Method for Proliferating Stem Cells Using Activating c-MET/HGF Signaling - Google Patents

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Abstract

본 발명은 줄기세포 증식방법 및 c-MET/HGF 신호 전달 체계를 활성화시키는 유전자로 형질전환된 증식능이 우수한 줄기세포에 관한 것으로, 구체적으로는 줄기세포를 c-MET 유전자로 형질전환시키고 HGF(hepatocyte growth factor) 리간드 단백질을 처리하여 c-MET/HGF 신호 전달 체계를 활성화시킴으로써 줄기세포의 증식능을 현저히 높이는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 c-MET/HGF 신호체계의 활성화를 통해, 증식능이 우수한 줄기세포를 대량으로 수득할 수 있다. 특히, 종래 기내 배양이 어려웠던 신경 줄기세포의 대량 증식이 가능하므로 뇌신경질환 치료용 세포치료제의 제조에 더욱 유용하다.
The present invention relates to a stem cell proliferation method and a stem cell excellent in proliferative capacity transformed with a gene activating the c-MET / HGF signal transmission system, specifically transforming stem cells with c-MET gene and HGF (hepatocyte) growth factor) relates to a method of significantly increasing the proliferative capacity of stem cells by treating ligand proteins to activate c-MET / HGF signaling.
According to the present invention, through the activation of the c-MET / HGF signaling system, it is possible to obtain a large amount of stem cells with excellent proliferative capacity. In particular, since it is possible to mass-proliferate neural stem cells, which has been difficult in conventional in-flight culture, it is more useful for the preparation of cell therapy for the treatment of brain neurological diseases.

Description

c-MET/HGF 신호 활성을 이용한 줄기세포의 증식 방법{Method for Proliferating Stem Cells Using Activating c-MET/HGF Signaling}Method for Proliferating Stem Cells Using Activating c-MET / HGF Signaling}

본 발명은 c-MET/HGF 신호를 활성화시키는 방법을 이용한 줄기세포 증식방법 및 이를 이용한 증식능이 우수한 줄기세포에 관한 것으로, 구체적으로는 줄기세포를 c-MET 유전자로 형질전환시키고 HGF 리간드 단백질을 처리하여 c-MET/HGF 신호전달 체계를 활성화시킴으로써 줄기세포의 증식능을 현저히 높이는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a stem cell proliferation method using a method of activating the c-MET / HGF signal and a stem cell having excellent proliferative capacity using the same, specifically transforming stem cells with c-MET gene and processing HGF ligand protein By activating the c-MET / HGF signaling system relates to a method of significantly increasing the proliferation of stem cells.

21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.Biotechnology in the 21st century is the ultimate goal of human welfare, and it presents the possibility of a new solution to food, environment and health problems. Recently, the use of stem cells has emerged as a new field of intractable disease treatment. Until now, organ transplantation and gene therapy have been suggested for the treatment of human intractable diseases, but there has been little practical application due to lack of immunity, lack of supply or lack of knowledge on vector development or disease genes.

이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다. 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상 등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다.As interest in stem cell research increased, pluripotent stem cells with the ability to form all organs through proliferation and differentiation were found to be capable of fundamentally solving long-term damage as well as treating most diseases. Stem cells are cells that have the ability of self-replication and differentiate into two or more cells. Totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells can be classified as a multipotent stem cell. Many scientists have suggested the possibility of applying stem cells to almost all organ regeneration of the human body, as well as treatment of Parkinson's disease, which was incurable disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury.

특히, 신경 줄기세포는 자기복제능력 및 중추신경계를 구성하는 신경세포, 성상세포(astrocyte), 핍지세포(oligodendrocyte) 등의 세가지 구성세포로 분화하는 다분화능력을 가지고 있어, 이러한 신경줄기세포를 이용한 줄기세포의 증식과 분화기전 및 신경계 발달에 관한 기초연구뿐만 아니라, 한번 손상되면 재생되지 않는다고 알려져 있는 신경계질환에서 신경줄기세포의 생물학적 특성을 이용하여 새로운 세포 및 유전자 치료의 가능성에 대한 관심이 증대하고 있다.In particular, neural stem cells have the ability to differentiate into three constitutive cells such as self-replicating ability and neuronal cells, constituent cells (astrocyte), oligodendrocyte constituting the central nervous system, stems using these neural stem cells In addition to basic research on cell proliferation, differentiation mechanisms and nervous system development, there is increasing interest in the possibility of new cell and gene therapy using the biological properties of neural stem cells in neurological diseases known to not regenerate once damaged.

이러한 줄기세포들은 그 배양에 있어서, 특정한 세포적 미세환경(microenvironment) 또는 적소(niche)를 필요로 한다는 것이 줄기세포 생물학의 정설이다. 신경 줄기세포를 선택적으로 배양하는 배양기술도 뉴로스페어(neurosphere) 형성법, 저밀도 배양법, 고밀도 배양법 등이 보고되었으나, 현재까지 비분화 상태의 대규모 배양에서 세포들을 확장하는 것은 어려운 것으로 알려져 있다. 문헌에 ES 세포들로부터 신경줄기세포의 동질적인 집단을 유도하는 것에 관한 보고는 없고, 신경아교세포-한정적(glialrestricted)이 되기 전에 일시적으로 확장될 수 있는 신경상피 전구 세포(neuroepithelial precursor cells)를 유도하는 것에 관한 보고만 있다(예를 들면, Brustle et al., Science 1999). The theory of stem cell biology is that these stem cells require a specific cellular microenvironment or niche in their culture. Neurosphere stem cell culture (neurosphere formation method, low density culture method, high density culture method, etc.) has been reported as a culture technology for selectively culturing neural stem cells, but it is known that it is difficult to expand the cells in large-scale culture of non-differentiated state. The literature does not report on inducing homogenous populations of neural stem cells from ES cells, and on inducing neuroepithelial precursor cells that can be expanded temporarily before becoming glialrestricted. Only reports (eg, Brustle et al., Science 1999).

여러 연구자들이 줄기세포의 대량배양을 시도하고 있지만, 특히 인간 성체 신경줄기세포는 기내배양 자체가 매우 어려우며, 또 그 증식능력 또한 제한 되어있어 연구의 답보가 거듭되고 있는 실정이다. Several researchers have attempted mass culture of stem cells, but in particular, adult neural stem cells are very difficult to carry out in-flight culture, and their proliferative capacity is also limited.

이에, 본 발명자들은 인간 성체 신경줄기세포의 제한된 증식능의 문제를 극복하기 위해 본 발명자는 일차 배양된 성체 신경신경줄기세포에 c-MET 유전자를 도입하고 HGF 리간드 단백질을 처리하여 c-MET/HGF 신호체계를 활성화시킴으로써, 이의 성체 신경줄기세포의 증식능에 미치는 영향을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
In order to overcome the problem of limited proliferation of human adult neural stem cells, the present inventors introduced c-MET gene into primary cultured adult neural stem cells and treated the HGF ligand protein to prepare c-MET / HGF signaling system. By activating, the effect on the proliferative capacity of the adult neural stem cells was confirmed, and the present invention was completed.

본 발명의 목적은 c-MET 유전자가 도입되어 있고, HGF(hepatocyte growth factor)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있거나, HGF로 처리되어, c-MET/HGF 신호 전달 체계가 활성화되어 있는 줄기세포 및 이의 증식방법을 제공하는데 있다.An object of the present invention is a stem cell having a c-MET gene is introduced, a gene encoding a hepatocyte growth factor (HGF) is introduced, or treated with HGF, the c-MET / HGF signaling system is activated and its It is to provide a proliferation method.

본 발명의 또 다른 목적은 c-MET 유전자가 도입된 신경줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 뇌 신경질환 치료용 세포치료제를 제공하는데 있다.
Still another object of the present invention is to provide a cell therapy agent for treating brain neurological disease, which contains neural stem cells into which the c-MET gene is introduced as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 c-MET 유전자가 도입되어 있고, HGF(hepatocyte growth factor)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있거나, HGF로 처리되어, c-MET/HGF 신호 전달 체계가 활성화되어 있는, 증식능이 우수한 줄기세포 및 c-MET/HGF 신호체계를 활성화되어 있는 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 증식방법을 제공한다. In order to achieve the above object, the present invention is a c-MET gene is introduced, a gene encoding a hepatocyte growth factor (HGF) is introduced, or treated with HGF, the c-MET / HGF signaling system is activated There is provided a stem cell proliferation method comprising the step of culturing stem cells that have excellent proliferative capacity and activated c-MET / HGF signaling system.

본 발명은 또한 c-MET/HGF 신호체계가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 뇌신경질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.
The present invention also provides a cell therapeutic agent for the treatment of cerebral neurological diseases, comprising as an active ingredient neural stem cells or neural crest stem cells in which the c-MET / HGF signaling system is activated.

본 발명에 따르면 c-MET/HGF 신호체계의 활성화를 통해, 증식능이 우수한 줄기세포를 대량으로 수득할 수 있다. 특히, 종래 기내 배양이 어려웠던 신경 줄기세포의 대량 증식이 가능하므로 뇌신경질환 치료용 세포치료제의 제조에 더욱 유용하다.
According to the present invention, through the activation of the c-MET / HGF signaling system, it is possible to obtain a large amount of stem cells with excellent proliferative capacity. In particular, since it is possible to mass-proliferate neural stem cells, which has been difficult in conventional in-flight culture, it is more useful for the preparation of cell therapy for the treatment of brain neurological diseases.

도 1A는 인간 측두엽 뇌조직 및 해마 뇌조직의 일차배양을 통해 확보한 성체 신경줄기세포의 계대별 사진[P0: 기내 배양 시작 시점의 세포 ; P18: 계대 배양 18회차의 세포] 이고, 도 1B는 기내 계대배양을 통해 증식시킨 성체 신경줄기세포 수를 누적하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 인간 성체 신경줄기세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법 (innumolcytochemistry)을 통해 검증한 결과를 나타낸 것이다[A:Nestin+/CD133+/GFAP+/Olig2-/Tuj-1- ; B: Sox2+/Sox9+/Vimentin+/Sox10-]
도 3은 인간 성체 신경줄기세포의 분화능을 검증하기 위해 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역세포화학법 (immunocytochemistry) 통해 검증한 결과를 나타낸 것으로, 기내 배양을 통해 확보한 성체 신경줄기세포가 전 계대에 걸쳐 분화능을 유지하고 있음을 검증한 결과로, 3회 계대 배양을 거친 초기단계의 세포 (Early paggasge) 및 18회 계대 배양을 거친 후기 단계의 세포 (Late passage) 모두 신경세포로의 분화한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 신경줄기세포에 c-MET 유전자의 도입을 위해 제작한 렌티바이러스 (lentivirus) 벡터의 구조 (A)와 c-MET 유전자가 도입된 신경줄기세포에 대한 면역세포화학법 (innumolcytochemistry)을 수행한 결과(B는 신경줄기세포 특이적인 마커 ; C는 아스트로사이트 마커와 올리고덴드로사이트 특이적인 마커)이다.
도 5는 c-MET 유전자가 도입된 신경줄기세포의 증식능을 CCK 분석법을 통해 검증한 결과(A)와 계대배양하여 증식된 총 세포의 숫자를 누적하여 나타낸 그래프(B)이다.
1A is a passage-specific photograph of adult neural stem cells obtained through primary culture of human temporal lobe brain tissue and hippocampal brain tissue [P0: cells at the start of in-flight culture; P18: Cell 18 of passage culture], FIG. 1B is a graph showing the cumulative number of adult neural stem cells grown through in-flight passage.
Figure 2 shows the results of verifying the expression of human adult neural stem cell-specific marker protein through the immunocytochemistry (innumolcytochemistry) [A: Nestin + / CD133 + / GFAP + / Olig2- / Tuj-1; B: Sox2 + / Sox9 + / Vimentin + / Sox10-]
Figure 3 shows the results of verifying the expression of the lower neuronal cell specific marker protein through immunocytochemistry (immunocytochemistry) in order to verify the differentiation capacity of human adult neural stem cells, adult neural stem cells secured through in-flight culture passage As a result of verifying that the differentiation capacity was maintained throughout, the early stage cells (Early paggasge) and the late stage cells (Late passage) after 18 passages were differentiated into neurons. It is shown.
Figure 4 shows the results of the immunocytochemistry (innumolcytochemistry) of the structure (A) of the lentivirus vector prepared for the introduction of c-MET gene into neural stem cells and the neural stem cells into which the c-MET gene is introduced (B is a neural stem cell specific marker; C is an astrosite marker and an oligodendrosite specific marker).
Figure 5 is a graph showing the cumulative total number of cells proliferated by passage (A) and the results of verifying the proliferative capacity of the neural stem cells introduced c-MET gene through CCK analysis (B).

본 발명은 일 관점에서 c-MET/HGF 신호 전달 체계가 활성화된 줄기세포 및 상기 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 증식방법에 관한 것이다. The present invention relates to a stem cell in which the c-MET / HGF signal transduction system is activated, and a method of proliferating a stem cell comprising culturing the stem cell.

본 발명에 있어서, c-MET/HGF 신호전달 체계를 활성화시키는 방법은 하기 2가지 방법을 사용할 수 있다.In the present invention, the method of activating the c-MET / HGF signaling system may use the following two methods.

첫째, c-MET/HGF 신호전달 체계를 활성화시키는 유전자 및 HGF 유전자를 줄기세포에 도입시켜 c-MET/HGF 신호전달 체계를 활성화시키는 방법이 있으며, 둘째로, c-MET/HGF 신호전달 체계를 활성화시키는 유전자가 도입된 줄기세포에 HGF 리간드를 처리하여 c-MET/HGF 신호전달 체계를 활성화시키는 방법이 있다.First, there is a method of activating the c-MET / HGF signaling system and the HGF gene to activate the c-MET / HGF signaling system by introducing into the stem cells, second, the c-MET / HGF signaling system There is a method of activating the c-MET / HGF signaling system by treating the HGF ligand to the stem cells into which the activating gene is introduced.

'줄기세포 (stem cell)'란 조직을 구성하는 각 세포로 분화 (differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하여 일컫는 말이며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화가 진행된다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산 (self-renewal)할 수 있어 증식 (proliferation; expansion)하는 특성이 있으며, 또한 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되는데 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다른 세포로도 분화될 수 있어 분화에 유연성 (plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다. 이러한 줄기세포는 그들의 발생기원에 따라 배아 줄기세포와 성체 줄기세포로 나눌 수 있는데, 본 발명에서는 생물학적, 윤리적, 그리고 법적인 문제가 많아 임상적용에 제한이 많은 배아 줄기세포가 아닌, 성체 줄기세포를 사용하는 것이 바람직하다. 'Stem cell' refers to the undifferentiated cells of the stage before the differentiation (differentiation) to each cell constituting the tissue, and is differentiated to a specific cell by a specific differentiation stimulus (environment). Stem cells, unlike differentiated cells that have ceased cell division, are capable of self-renewal by cell division and thus proliferation (expansion). It is characterized by having plasticity in differentiation because it can be differentiated into other cells by different environment or differentiation stimulus. These stem cells can be divided into embryonic stem cells and adult stem cells according to their origin, but in the present invention, adult stem cells are used instead of embryonic stem cells, which have many biological, ethical and legal problems, and thus have many limitations in clinical applications. It is desirable to.

상기 "성체 줄기세포 (adult stem cell)"는 성장한 신체조직으로부터 추출해낸 줄기세포로서, 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포다. 성체 줄기세포는 증식이 어렵고 쉽게 분화되는 경향이 강한 대신에 인체에 내재된 조직 특이적 전구세포로 분화할 수 있다. 성체 줄기세포는 분화하여 다양한 특성을 가지는 세포가 될 수 있고, 심장, 췌장, 신경 조직, 근육, 연골 등과 같은 광범위하게 위치한 조직 및 기관에 대한 대체 세포를 생성할 수 있는 능력을 가지고 있다.The "adult stem cells" are stem cells extracted from grown body tissues, which are primitive cells just before being differentiated into cells of specific organs. Adult stem cells are difficult to proliferate and have a strong tendency to differentiate, but instead can differentiate into tissue-specific progenitor cells inherent in the human body. Adult stem cells can be differentiated to become cells having various properties, and have the ability to generate replacement cells for a wide range of tissues and organs such as the heart, pancreas, nerve tissue, muscle, cartilage, and the like.

상기와 같은 성체 줄기세포는 인간, 영장류, 설치류, 및 조류로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 포유류, 특히, 마우스, 랫트 및 인간으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간의 골수, 지방, 제대혈, 혈액, 간장, 피부, 위장관, 태반, 자궁, 뇌, 췌장, 간, 눈 및 태아 조직 등 대부분의 조직으로부터 성체 줄기세포를 수득할 수 있다. Such adult stem cells may be derived from humans, primates, rodents, and birds. Preferably, they may be derived from mammals, in particular mice, rats and humans. For example, adult stem cells can be obtained from most tissues such as human bone marrow, fat, umbilical cord blood, blood, liver, skin, gastrointestinal tract, placenta, uterus, brain, pancreas, liver, eyes and fetal tissue.

인간의 다양한 조직으로부터 성체 줄기세포를 분리하는 방법은 각 조직에 적절한, 당업계에 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 수득한 특정 조직을, 트립신 용액 및/또는 콜라게나아제 등을 처리하여 단일 세포체로 분리한 후, bFGF, EGF등의 성장인자 (growth factor)를 적합한 양으로 첨가한 적합한 배지에서 배양한 다음, FACS 등으로 분리하거나 성장속도에 따라 성체 줄기세포를 분리하는 방법 등을 사용할 수 있다. As a method for separating adult stem cells from various tissues of humans, methods conventional in the art, which are appropriate for each tissue, can be used. For example, the obtained specific tissues are separated into single cell bodies by treatment with trypsin solution and / or collagenase and the like, and then cultured in a suitable medium in which growth factors such as bFGF and EGF are added in an appropriate amount. Then, it can be separated by FACS or the like, or a method of separating adult stem cells according to the growth rate.

본 발명의 가장 바람직한 예로는 성체 신경줄기세포 (Neural stem cells) 또는 신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells;. NCSCs)를 들 수 있다. Most preferred examples of the invention include neural stem cells or neural crest stem cells (NCSCs).

"신경줄기세포 (Neural stem cells)"는 20-30회 이상 세포 분열을 수행할 수 있고, 뉴런 및 신경아교세포를 생성할 수 있는 분화능 (potency)을 유지하는 세포를 의미한다. 바람직하게는, 상기 세포들은 40회 이상, 보다 바람직하게는 50회 이상, 가장 바람직하게는 무제한적인 세포 분열을 수행할 수 있다. 상기 신경줄기세포는 다분화능 (multipotent)으로 정의되고, 즉, 다수의 신경세포 유형들(예를 들면, 뉴런/신경아교세포)로 분화할 수 있다. 신경줄기세포는 중추신경계 (Central nervous system: CNS)와 말초신경계 (peripheral nervous system: PNS)의 조직을 일차 배양하여 확보할 수 있으며, 이 세포는 특정 분화 조건에서 glial lineage와 neural lineage 등으로 분화하게 된다(Sally Temple et al. 2001). "신경 능선 줄기세포 (neural crest stem cells;. NCSCs)"는 초기 배 발생 과정 중 한시적으로 나타나는 줄기세포로서, 마찬가지로 다분화능 줄기세포이다."Neural stem cells" refers to cells that can perform cell division more than 20-30 times and maintain potency capable of producing neurons and glial cells. Preferably, the cells are capable of performing at least 40, more preferably at least 50, most preferably unlimited cell division. The neural stem cells are defined as multipotent, that is, they can differentiate into multiple neuronal cell types (eg neurons / glia). Neural stem cells can be secured by primary culture of the central nervous system (CNS) and the peripheral nervous system (PNS), which can differentiate into glial lineage and neural lineage under specific differentiation conditions. (Sally Temple et al. 2001). "Nural crest stem cells (NCSCs)" are stem cells that appear temporarily during early embryonic development and are likewise multipotent stem cells.

다양한 출처로부터 신경줄기세포를 수득하는 것이 가능하다. 예를 들어 인간 성체 뇌조직으로부터 수득할 수 있는데, 상기 뇌는 대뇌, 간뇌, 중뇌, 소뇌, 연수, 뇌교 및 척수로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 바람직하게는 대뇌로부터 유래한 것, 구체적 예로는 측두엽 조직 또는 해마 조직일 수 있다. 인간의 신경줄기세포는 상업적으로 판매되는 것을 구입하여 사용할 수도 있고, 바람직하게는 인간 성체의 뇌조직으로부터 얻은 세포를 신경줄기세포 성장인자가 첨가된 배지에서 배양하여 제조할 수 있다(실시예 1).It is possible to obtain neural stem cells from various sources. For example, it can be obtained from human adult brain tissue, the brain may be any one selected from the group consisting of cerebral, hepatic brain, midbrain, cerebellum, soft water, pontoon and spinal cord, preferably derived from the cerebrum, Specific examples may be temporal lobe tissue or hippocampal tissue. Human neural stem cells may be purchased and used commercially, preferably cells obtained from adult human brain tissue may be prepared by culturing in a medium to which the neural stem cell growth factor is added (Example 1).

특히, 상기 성체 신경줄기세포는 기내 배양 자체가 매우 어려우며 그 증식능력 또한 제한되어 있어 기존의 배양 방법으로는 미분화 상태의 신경줄기세포를 대량으로 증식하는 것이 곤란했다. In particular, the adult neural stem cells are difficult to culture in-flight itself and its proliferative capacity is also limited, making it difficult to multiply large amounts of undifferentiated neural stem cells by conventional culture methods.

신경줄기세포들의 대칭적 분열을 촉진하는 방법을 개시하고 있는 WO 2005/121318에서는 EGF 패밀리의 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성 및 FGF 수용체 하류의 신호전달 경로의 활성을 이용하고 있으나, 이와 달리, 본 발명에서는 줄기세포를 c-MET/HGF 신호전달을 활성화시킴으로써 줄기세포, 특히 신경줄기세포의 증식능을 개선하여, 대량으로 수득할 수 있게 함으로써 상기 문제점을 해결하고 있다.WO 2005/121318, which discloses a method for promoting symmetrical division of neural stem cells, utilizes the activity of signaling pathways downstream of the EGF family of receptors and the activity of signaling pathways downstream of FGF receptors. In order to solve the above problems by activating c-MET / HGF signaling of stem cells to improve the proliferative capacity of stem cells, in particular neural stem cells, it can be obtained in large quantities.

분산 인자(scatter factor(SF))로도 알려져 있는, 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)(HGF)는 중간엽 세포에 의해 우세하게 생성되는 다기능성 이종이량체 단백질이며, Met 티로신 키나제 수용체를 발현시키는 세포의 이펙터(effector)이다. 인간 Met 수용체는 또한 "c-MET"로도 알려져 있다. HGF는 그의 동족 수용체에 결합하는 경우에 다수의 세포 활성을 매개한다. HGF- Met 신호전달 경로는 간 재생, 창상 치유, 신경 재생, 혈관신생 및 종양발생에서 소정의 역할을 수행한다Hepatocyte growth factor (HGF), also known as scatter factor (SF), is a multifunctional heterodimeric protein that is predominantly produced by mesenchymal cells and expresses Met tyrosine kinase receptors. Effector of. Human Met receptors are also known as "c-MET". HGF mediates many cellular activities when bound to its cognate receptors. HGF-Met signaling pathway plays a role in liver regeneration, wound healing, nerve regeneration, angiogenesis and tumorigenesis

Met에 대한 HGF 결합은 다양한 세포 타입에서 세포 성장, 분화 및 이동에 이르게 하는 복잡한 세트의 세포내 경로의 활성화를 가져오는 세포내 키나제 영역의 인산화를 유도한다. c-MET/HGF 신호전달 경로는 예를 들어, 세포 성장 자극(예를 들어 세포 증식, 세포 생존, 세포 이동, 형태발생) 및 혈관신생을 포함하는, 여러 생물학적 및 생리적 기능에 연루되어 있다. HGF binding to Met induces phosphorylation of intracellular kinase regions leading to the activation of a complex set of intracellular pathways leading to cell growth, differentiation and migration in various cell types. The c-MET / HGF signaling pathway is involved in several biological and physiological functions, including, for example, cell growth stimulation (eg, cell proliferation, cell survival, cell migration, morphogenesis) and angiogenesis.

c-MET/HGF 신호 활성화에 사용되는 유전자로는 c-MET 유전자를 사용할 수 있다. 상기 c-MET를 암호화하는 핵산은, 당업계에 공지된 c-MET를 암호화하는 염기서열을 가지는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. c-MET gene may be used as a gene used for c-MET / HGF signal activation. The nucleic acid encoding the c-MET can be used without limitation so long as it has a base sequence encoding c-MET known in the art.

바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 DNA 서열을 포함하는 c-MET를 암호화하는 서열을 가질 수 있으며, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 상기 c-MET의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다. Preferably, it may have a sequence encoding c-MET comprising a DNA sequence represented by SEQ ID NO: 1, may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto. That is, it may have a base sequence encoding the functional equivalent of the c-MET.

상기 기능적 동등물이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%, 바람직하게는 80%,보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 c-MET과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다.예를 들면, 70%,71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. c-MET와 '동등한 생리활성'이란, c-MET 수용체 단백질이 HGF 리간드 단백질과 상호 작용하여 c-MET/HGF 신호전달 체계를 활성화하는 활성을 의미한다. 또한 상기 c-MET을 암호화하는 핵산은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다.The functional equivalent means having at least 50%, preferably 80%, more preferably 90% or more of sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO. 2 as a result of the addition, substitution or deletion of amino acids. Polypeptides that exhibit physiological activity substantially equivalent to c-MET of e.g. 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , Polypeptides having sequence homology of 97%, 98%, 99%, 100%. 'Equivalent physiological activity' with c-MET refers to an activity in which c-MET receptor protein interacts with HGF ligand protein to activate c-MET / HGF signaling system. In addition, the nucleic acid encoding the c-MET may be prepared by genetic recombination methods known in the art.

본 발명에서, c-MET을 암호화하는 핵산은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 발현 벡터 내에 삽입될 수 있다. '발현 조절 서열 (expression control sequence)'이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 개시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 그리고 '발현 벡터'라 함은 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다.In the present invention, nucleic acids encoding c-MET can be operably linked to expression control sequences and inserted into expression vectors. An 'expression control sequence' refers to a DNA sequence that controls the expression of a nucleic acid sequence operably linked in a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for initiating transcription, any operator sequence for regulating transcription and sequences regulating termination of transcription and translation. And "expression vector" refers to a plasmid, viral vector or other media known in the art that can be inserted nucleic acid encoding a structural gene, and can express the nucleic acid in a host cell. Preferably it may be a viral vector.

상기 바이러스 벡터로는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스 바이러스 벡터, 엡스타인-바 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 등이 있다. 본 발명의 일 구체예에서는 렌티 바이러스 벡터를 사용하였다. The viral vectors include, but are not limited to, retrovirus vectors, adenovirus vectors, herpes virus vectors, abipox virus vectors, Epstein-Barr virus vectors, lentivirus vectors, and the like. In one embodiment of the invention a lentiviral vector was used.

본 발명의 재조합 발현벡터를 이용한 렌티 바이러스를 제조하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사, 형질도입 (transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 전기침공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 줄기세포 내로 도입할 수 있다.The method for producing a lentivirus using the recombinant expression vector of the present invention may use a method known in the art. Expression vectors comprising nucleic acids according to the invention are methods known in the art, such as, but not limited to, transient transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation Methods, liposome-mediated transfection, DEAE Dextran-mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation Can be introduced into stem cells by gene guns and other known methods for introducing nucleic acids into cells.

본 발명의 일 구체예에서, c-MET/HGF 신호를 활성화시키는 유전자로 형질전환된 신경줄기세포는 예를 들어, 이하와 같은 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다. In one embodiment of the present invention, the neural stem cells transformed with the gene activating the c-MET / HGF signal may be prepared by a method comprising the following steps, for example.

(a) c-MET을 암호화하는 핵산을 함유한 DNA 구조물을 포함하는 재조합 바이러스 벡터를 제조하는 단계;(a) preparing a recombinant viral vector comprising a DNA construct containing a nucleic acid encoding c-MET;

(b) 상기 재조합 바이러스 벡터를 바이러스 생산 세포주에 형질감염시켜 c-MET 발현 재조합 바이러스를 제조하는 단계; 및(b) transfecting said recombinant viral vector with a virus producing cell line to produce a c-MET expressing recombinant virus; And

(c) 상기 c-MET 발현 재조합 바이러스로 신경줄기세포를 감염시키는 단계.(c) infecting neural stem cells with the c-MET expressing recombinant virus.

상기 바이러스 생산 세포주는 사용한 바이러스 벡터에 해당하는 바이러스를 생산하는 세포주를 사용할 수 있으며, 예컨대 렌티 바이러스 벡터를 사용한 경우에는 렌티 바이러스 생산세포주인 293FT 세포를 사용할 수 있다. 이후, c-MET를 발현하는 재조합 렌티 바이러스 벡터를 인간의 신경줄기세포에 감염시킨다. 본 발명에서는 특히, 일차 배양된 줄기세포에 c-MET 유전자를 도입하는 것이 바람직하다.The virus producing cell line may be a cell line producing a virus corresponding to the used viral vector. For example, when a lentivirus vector is used, 293FT cells which are lentiviral producing cell lines may be used. Then, a recombinant lentiviral vector expressing c-MET is infected with human neural stem cells. In the present invention, in particular, it is preferable to introduce the c-MET gene into the primary cultured stem cells.

렌티 바이러스를 인간의 신경줄기세포에 감염시키기 위해서는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 신경줄기세포를 성장인자 함유 배지에 플레이팅하고, 폴리브렌(polybrene)을 처리한 후 적정 MOI(multiplicity of infection)에 해당하는 바이러스성 입자를 배지에 첨가하여 세포를 감염시킨다. 감염 후 기존 바이러스 포함 배지를 새로운 신경줄기세포 배양배지로 교체하여 배양하는 방법에 의해 수행될 수 있다.In order to infect the lentiviral virus to human neural stem cells, a method known in the art, for example, but not limited to, neural stem cells are plated in a growth factor-containing medium, and treated with polybrene, followed by appropriate MOI. Viral particles corresponding to (multiplicity of infection) are added to the medium to infect the cells. After infection, the virus-containing medium may be replaced with a new neural stem cell culture medium, followed by culturing.

다음으로, 상기 c-MET 유전자로 형질전환된 줄기세포에 HGF(hepatocyte growth factor) 리간드 단백질을 처리한다.Next, HGF (hepatocyte growth factor) ligand protein is treated to the stem cells transformed with the c-MET gene.

성숙한 HGF는 2개의 폴리펩티드 쇄인 α-쇄 및 β-쇄를 함유한다. 공개된 연구 결과는 HGF의 c-MET 수용체 결합 도메인을 함유하는 것이 α-쇄임을 시사한다. HGF는 다수의 상이한 아미노산 서열을 갖는 것으로 보고되어 있으며 이의 명칭도 HGF, TCF, SCF 등이 사용되고 있다. 본 발명에서는 이들을 HGF라고 총칭 한다.Mature HGF contains two polypeptide chains, α-chain and β-chain. The published findings suggest that it is the α-chain that contains the c-MET receptor binding domain of HGF. HGFs have been reported to have a number of different amino acid sequences and their names are HGF, TCF, SCF and the like. In the present invention, these are collectively referred to as HGF.

이러한 HGF 리간드 단백질은 수용액 제제로 조제하여 세포주에 처리하거나 벡터에 삽입하여 세포주에 형질전환시키는 방법으로 처리할 수 있다. 본 발명에서 HGF는 종래 알려져있는 HGF를 발현하는 아미노산 서열, 또는 이를 코딩하는 염기서열이라면 제한없이 사용될 수 있다. Such HGF ligand protein may be prepared by an aqueous solution preparation and treated in a cell line or inserted into a vector and transformed into a cell line. In the present invention, HGF can be used without limitation so long as it is an amino acid sequence expressing HGF, or a base sequence encoding the same.

본 발명에서, c-MET/HGF 신호 전달 체계가 활성화된 줄기세포는 상기 HGF 리간드 단백질을 수용액 제제로 조제하여 c-MET 유전자로 형질전환된 줄기세포에 처리하여 배양하거나, c-MET 유전자 및 HGF를 코딩하는 유전자로 동시에 형질전환된 줄기세포를 배양하여 얻었을 수 있다. In the present invention, the stem cells in which the c-MET / HGF signaling system is activated are cultured by treating the stem cells transformed with the c-MET gene by preparing the HGF ligand protein with an aqueous solution preparation, or the c-MET gene and HGF. It may have been obtained by culturing stem cells transformed at the same time with the gene encoding the.

c-MET 유전자가 도입된 줄기세포에 HGF 리간드 단백질 처리 및 배양에 사용할 수 있는 배지는, 당업계에서 줄기세포의 종류에 따라 공지되어 있는 적절한 배지를 사용할 수 있고, 아스코르브산, 표피성장인자(EGF), 인슐린, 항생제 및 FBS(Fetal bovine serum) 등을 첨가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 신경줄기세포인 경우에는 성장인자 함유 NBE 배지, 보다 구체적으로 B27TM supplement, N2TM supplement, bFGF 및 EGF 등을 함유하는 배지를 사용할 수 있다. As a medium that can be used for HGF ligand protein treatment and culture in stem cells into which the c-MET gene has been introduced, appropriate media known in the art according to the type of stem cells can be used, and ascorbic acid and epidermal growth factor (EGF) can be used. ), Insulin, antibiotics and Fetal bovine serum (FBS) can be added and used. For example, in the case of neural stem cells, a growth factor-containing NBE medium, more specifically, a medium containing a B27 supplement, an N2 supplement, bFGF, and EGF may be used.

상기와 같이, 줄기세포를 c-MET 유전자 및 HGF를 코딩하는 유전자로 형질전환시켜 배양하거나, c-MET 유전자로 형질전환시켜 HGF 리간드 단백질 처리하여 배양하면, 형질전환하지 않은 줄기세포와 비교하여 세포 증식이 매우 활발히 이루어진다. 그리고, 계대 배양을 진행함에 따라 줄기세포수의 누적 증가율 또한 현저하게 차이가 나타난다. 이 때, 3대 계대 이상 배양하는 것이 바람직하다.As described above, when the stem cells are transformed with the c-MET gene and the HGF-encoding gene, or cultured by transforming the c-MET gene with the HGF ligand protein, the cells are compared with the non-transformed stem cells. Multiplication is very active. In addition, the cumulative increase rate of the stem cell number also appears significantly as the passage passage. At this time, it is preferable to culture at least three generations.

즉, 본 발명의 줄기세포 증식 방법에서는 c-MET 유전자를 줄기세포에 도입시켜 c-MET 수용체 단백질과 HGF 리간드 단백질간의 상호 작용을 이용하여 c-MET/HGF 신호 전달체계를 활성화시킴으로써, 줄기세포가 미분화 상태로 대량으로 증식하도록 한다. That is, in the stem cell proliferation method of the present invention, the c-MET gene is introduced into the stem cells to activate the c-MET / HGF signal transduction system using the interaction between the c-MET receptor protein and the HGF ligand protein. Proliferate in large quantities in an undifferentiated state.

이와 같은 본 발명의 증식능이 우수한 줄기세포의 가장 바람직한 예는 c-MET 유전자가 도입되어 있고 c-MET/HGF 신호 전달체계가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포로서, 이하와 같은 특성을 가진다. The most preferable example of the stem cells excellent in the proliferative capacity of the present invention is a neural stem cell or a neural crest stem cell in which the c-MET gene is introduced and the c-MET / HGF signaling system is activated, has the following characteristics: .

(i) 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin, CD133 및 을 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP를 발현함.(i) Nestin, CD133, known as neural stem cell specific marker protein, express GFAP, an astrosite specific marker.

(ii) 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 Olig2, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질은 발현하지 않음.(ii) does not express Olig2, an oligodendrosite specific marker, and Tuj-I protein, a neuron specific marker.

(iii) 신경원세포, 희소돌기아교세포 및 성상세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나로 분화할 수 있는 능력을 가짐.(iii) has the ability to differentiate into any one selected from the group consisting of neuronal cells, oligodendrocytes and astrocytic cells.

(iv) c-MET를 과발현함.(iv) overexpresses c-MET.

(iv) c-MET/HGF 신호 전달체계가 활성화되어 있음.
(iv) c-MET / HGF signaling is activated.

본 발명의 일 실시예에서는, c-MET 유전자가 도입된 신경줄기세포를 HGF 리간드 단백질로 처리하여, c-MET/HGF 신호 전달체계를 활성화시킨 줄기세포를 배양한 결과, 야생형 세포주에 비하여 세포증식이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(실시예 4-3 참조).In one embodiment of the present invention, by treating the neural stem cells introduced with the c-MET gene with HGF ligand protein, and cultured stem cells activating the c-MET / HGF signaling system, cell proliferation compared to wild-type cell line It was confirmed that the increase was significant (see Example 4-3).

본 발명은 또 다른 관점에서, c-MET/HGF 신호 전달체계가 활성화되어 있는 줄기세포를 유효성분으로 함유하는, 세포 치료제에 관한 것이다. In another aspect, the present invention relates to a cell therapeutic agent containing stem cells in which the c-MET / HGF signal transduction system is activated as an active ingredient.

특히, c-MET/HGF 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 함유하는 뇌신경질환 치료용 세포 치료제로 사용할 수 있다. In particular, it can be used as a cell therapy for the treatment of cerebral neurological diseases containing neural stem cells or neural crest stem cells in which c-MET / HGF signal is activated.

특히, c-MET/HGF 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세포를 함유하는 뇌신경질환 치료용 세포 치료제로 사용할 수 있다. 상기 뇌신경질환으로는 대표적으로 신경퇴행성 질환이 있다. 신경퇴행성 질환 또는 질병은 뉴런 소실 또는 기능장애와 관련된 질환 또는 의학적 상태이다. In particular, it can be used as a cell therapy for the treatment of cerebral neurological diseases containing neural stem cells or neural crest stem cells in which c-MET / HGF signal is activated. The neurological diseases are typically neurodegenerative diseases. Neurodegenerative diseases or conditions are diseases or medical conditions associated with neuronal loss or dysfunction.

신경퇴행성 질환 또는 질병의 예로는 신경퇴행성 질환, 중추신경계 손상 또는 기능장애가 포함된다. 신경퇴행성 질환으로는, 예를 들면, 알츠하이머병 또는 기타 치매, 다발성 경화증 (MS), 정신분열증, 시력 감퇴, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 말초신경 장애, 헌팅톤병, 근위축성 측삭 경화증, 및 파킨슨병이 포함된다. CNS 손상으로는, 예를 들면, 뇌졸중과 같은 뇌혈관 사고 (예를 들면, 출혈성 뇌졸중, 국소 허혈성 뇌졸중, 또는 전뇌 허혈성 뇌졸중), 안허혈, 및 경막 정맥동 혈전증; 외상성 뇌 또는 척수 손상 (예를 들면, 뇌 또는 척수 수술 또는 신체 사고에 의해 야기된 손상); 뇌진탕; 약물(예를 들면, 화학치료제, 기분전환용 약물, 및 신경이완제)에 의해 야기된 손상; 관상동맥 우회로 이식 (CABG) 수술; 및 분만시 허혈이 포함된다. CNS 기능장애로는, 예를 들면, 우울증, 간질, 신경증 및 정신병이 포함된다Examples of neurodegenerative diseases or disorders include neurodegenerative diseases, central nervous system damage or dysfunction. Neurodegenerative diseases include, for example, Alzheimer's disease or other dementia, multiple sclerosis (MS), schizophrenia, decreased vision, glaucoma, diabetic retinopathy, peripheral neuropathy, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and Parkinson's disease. Included. CNS injuries include, for example, cerebrovascular accidents such as stroke (eg, hemorrhagic stroke, local ischemic stroke, or whole cerebral ischemic stroke), eye ischemia, and dural venous sinus thrombosis; Traumatic brain or spinal cord injury (eg, damage caused by brain or spinal cord surgery or physical accidents); Concussion; Damage caused by drugs (eg, chemotherapeutic agents, recreational drugs, and neuroleptics); Coronary artery bypass graft (CABG) surgery; And ischemia at delivery. CNS dysfunctions include, for example, depression, epilepsy, neurosis and psychosis

상기에서 '치료 (treatment)'는 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 악화되지 않는 질환의 유지, 질환진행의 지연, 질환 상태의 개선 또는 완화 (palliation),(일부 또는 완전한) 완화 (remission)를 포함한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교하여 원하지 않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다.The term 'treatment' refers to alleviation of symptoms, reduction in the extent of disease, maintenance of a disease that does not worsen, delay in the progression of the disease, improvement or palliation of the disease state, or (partial or complete) reduction. Include. Treatment can also mean increased survival compared to the expected survival if untreated. Treatment includes simultaneously prophylactic measures in addition to therapeutic means. Cases in need of treatment include those already with the disease and cases in which the disease should be prevented. Alleviation of a disease is when the clinical manifestations of the undesired disease are delayed or the progress of the disease is delayed or prolonged compared to the untreated situation.

본 발명에 따른 줄기세포는 원하는 조직 부위로 직접 이식하거나 이동하는 방식으로 투여되어, 기능적으로 결핍된 부위를 재구성하거나 재생한다. 예를 들어, c-MET/HGF 신호가 활성화되어 있는 신경줄기세포 또는 신경능선줄기세를 인간의 신경줄기세포를 중추신경계의 유조직 또는 수막강내 부위로직접 이식한다. 이식은 단세포 현탁액 또는 ㎕ 당 1×105~1.5×105세포 밀도의 작은 집합체를 이용하여 수행할 수 있다. 세포치료제의 통상적인 투여량은 104~1010 cells/body, 바람직하게는 106~108 cells/body, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.Stem cells according to the invention are administered in a manner that is directly transplanted or migrated to a desired tissue site, to reconstruct or regenerate a functionally deficient site. For example, neural stem cells or neural crest stem cells in which c-MET / HGF signal is activated are directly transplanted into human tissues or into the intramedullary region of the central nervous system. Transplantation can be performed using single cell suspensions or small aggregates of 1 × 10 5 -1.5 × 10 5 cell density per μl. Typical dosages of cell therapy products may be administered 10 4 to 10 10 cells / body, preferably 10 6 to 10 8 cells / body, one or several times.

그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.However, it should be understood that the actual dosage of the active ingredient should be determined in light of several relevant factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease, and therefore the dosage may be determined in any way. Also, the scope of the present invention is not limited.

본 발명에 따른 줄기세포는 인간 내로의 투여를 위해 약학적 조성물의 형태로 공급될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기 '약학적으로 허용되는'이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등 당업계에 공지된 것이라면 제한없이 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조될 수 있다. 예컨대, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 의약 제형의 일반적인 원리에 대해서는 공지의 문헌을 참고할 수 있다.Stem cells according to the invention can be supplied in the form of a pharmaceutical composition for administration into a human. The pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier. The term 'pharmaceutically acceptable' refers to a cell or human being exposed to the composition, which is not toxic. The carrier can be used without limitation so long as it is known in the art such as buffers, preservatives, analgesics, solubilizers, isotonic agents, stabilizers, bases, excipients, lubricants, preservatives and the like. The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared according to techniques commonly used in the form of various formulations. For example, injectables can be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple dose inclusions. For a general principle of the pharmaceutical formulation of the pharmaceutical composition according to the present invention, reference may be made to known documents.

아울러, 본 발명은 c-MET/HGF 신호체계가 활성화되어 있는 줄기세포, 특히 신경줄기세포를 이를 필요로 하는 개체에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 종양의 치료 방법을 제공한다. 본 발명에서 '유효한 양'이라 함은 본 발명의 줄기세포가 투여 대상인 개체 내에서 치료하는 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체(subject)'란 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물을 의미한다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다. 본 발명의 줄기세포는 상기 기재한 효과 중에서 원하는 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다.In addition, the present invention provides a method for the treatment of a tumor comprising administering to the individual in need thereof stem cells, in particular neural stem cells, in which the c-MET / HGF signaling system is activated. In the present invention, the term "effective amount" refers to an amount showing the effect of treating the stem cells of the present invention in the subject to be administered, and the term "subject" refers to an animal including a mammal, particularly a human. . The subject may be a patient in need of treatment. Stem cells of the present invention may be administered until the desired effect is derived from the effects described above, and may be administered by various routes according to methods known in the art.

또한, 본 발명은 세포 치료제를 제조하기 위한 c-MET 유전자로 형질전환되어 있고, c-MET/HGF 신호체계가 활성화되어 있는 줄기세포 특히, 신경줄기세포의 용도를 제공한다. 본 발명의 줄기세포 및 이의 효과에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.
The present invention also provides the use of stem cells, particularly neural stem cells, which have been transformed with the c-MET gene for the preparation of cell therapeutics and whose c-MET / HGF signaling system is activated. Stem cells of the present invention and their effects are as described above.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these examples are for illustrative purposes only and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these examples.

실시예 1 : 인간 신경줄기세포의 획득
Example 1 Acquisition of Human Neural Stem Cells

1-1: 인간 신경줄기세포의 분리 및 배양1-1: Isolation and Culture of Human Neural Stem Cells

간질 환자의 외과적 수술을 통해(삼성 서울병원 신경외과) 측두엽(Surgical Operation of Epilepsy Patients (Samsung Seoul Hospital Neurosurgery) temporaltemporal lobelobe ) 및 해마() And hippocampus ( hippocampushippocampus ) 조직을 수득하였다. ) Tissue was obtained.

각 조직을 수술 후 3 시간 이내에 Each tissue within 3 hours after surgery PBSPBS in 수세한Flush 후 수술용 가위 또는 면도칼 등을 사용해 기계적으로 분쇄하고, 37 ℃ 하에서 Collagenase(0.4 ㎎/㎖,  And then mechanically pulverized using surgical scissors or a razor, and Collagenase (0.4 mg / ml, GibcoGibco ) 와 ) Wow DNaseIDNaseI (0.01-1 ㎎/㎖, (0.01-1 mg / ml, RocheRoche ) 또는 Papain(10 ) Or Papain (10 unitunit /㎖, Sigma), D-L-/ Ml, Sigma), D-L- CysteinCystein (400 (400 ngng /Of mlml , , SigmaSigma )과 )and DNaseIDNaseI (0.01-1 ㎎/㎖, (0.01-1 mg / ml, RocheRoche )를 혼합하여 제조한 Manufactured by mixing 효소액에In the enzyme solution 1 시간 이내로 처리하였다. 이후 혈청 피펫을 사용해 단세포 수준으로 해리시킨 후 나일론 메쉬( Treatment was done within 1 hour. Then use a serum pipette to dissociate to single cell level and then use nylon mesh ( nylonnylon meshmesh )를 통과시켜 단일 세포들을 확보하였다.), Single cells were obtained.

상기 단일 세포현탁액을 The single cell suspension 퍼콜Percol ( ( PercollPercoll , , SigmaSigma ) 농도 A) concentration 구배gradient 원심분리하여 적혈구 및 죽은 세포들을 제거하였다. 최종 수득한 세포들을  Centrifugation removes red blood cells and dead cells. Finally obtained cells FBSFBS , B27 supplement(Gibco), , B27 supplement (Gibco), N2N2 supplementsupplement (( GibcoGibco ), ), bFGFbFGF (R&D), (R & D), EGFEGF (R&D)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 Neurobasal-A (Gibco) culture containing (R & D) or DMEMDMEM :F12(: F12 ( GibcoGibco )배양액에 To culture 현탁한Suspended 후, Poly-L-Ornithine(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여, 일차 배양된 신경줄기세포를 수득하였다. Thereafter, the cells were cultured in a cell culture vessel pretreated with Poly-L-Ornithine (Sigma) to obtain primary cultured neural stem cells.

1-2 : 1-2: 계대배양Subculture

실시예 1-1에서 수득한 신경 줄기세포에 대하여 약 10 일 마다 계대배양을 실시하였다. 계대배양은 다음과 같은 방법으로 실시하였다.The neuronal stem cells obtained in Example 1-1 were passaged about every 10 days. Subculture was carried out in the following manner.

세포 배양 플레이트에서 배지를 모두 제거하고, 세포에 0.05% 트립신/EDTA(T/E, Gibco) 2 ㎖를 처리하고, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 1 분간 반응시켰다.이후, 트립신의 작용을 중단시키기 위하여 FBS가 1% 함유된 배양액 2.5 ㎖를 첨가하여 잘 혼합하였다. 세포 현탁액을 15 ㎖ 코니컬 튜브(cornical tube, Falcon)에 옮겼다. 원심분리를 하여 상층액을 제거하였다. 세포를 Neurobasal-A(Gibco) 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액 1 ㎖로 재부유 시킨 다음 세포수를 측정한 후, 약 1×105~ 5×105개의 세포를 포함하고 있는 세포 현탁액을 기존의 배지가 50% 포함되어 있는 새로운 세포 배양 플레이트에 옮기고, 50 ng/㎖ bFGF, 50 ng/㎖ EGF를 첨가한 후, 계속하여 5% CO2 배양기에서 배양하였다.Remove all medium from the cell culture plate, treat cells with 2 ml of 0.05% trypsin / EDTA (T / E, Gibco) and react for 1 minute at 37 ° C., 5% CO 2 incubator. To stop, 2.5 ml of the culture solution containing 1% of FBS was added and mixed well. The cell suspension was transferred to a 15 ml cornical tube (Falcon). The supernatant was removed by centrifugation. The cells were resuspended in 1 ml of Neurobasal-A (Gibco) or DMEM: F12 (Gibco) culture, the cell number was measured, and a cell suspension containing about 1 × 10 5 to 5 × 10 5 cells was prepared. The cells were transferred to a new cell culture plate containing 50% of medium, 50 ng / ml bFGF, 50 ng / ml EGF were added, and then cultured in a 5% CO 2 incubator.

도 1A는 분리한 인간 측두엽 및 해마 뇌조직의 성체 신경줄기세포의 계대별 사진을 나타내었다.FIG. 1A shows passage images of adult neural stem cells of isolated human temporal and hippocampal brain tissues.

신경줄기세포의 계대 배양을 수행하며 증식하는 세포의 개수를 누적하여 분석한 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이 기울기가 일정한 세포의 성장곡선을 확인하였다.
As a result of accumulating the number of proliferating cells while performing passage culture of neural stem cells, as shown in FIG. 1B, the growth curve of the cells having a constant slope was confirmed.

1-3 : 인간 신경줄기세포의 특성 분석1-3: Characterization of human neural stem cells

상기에서 수득한 신경줄기세포를 4% 파라포름알데히드 (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) 또는 아세톤/메탄올 고정액을 사용하여 고정시킨 후, 0.05% Triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 15 분간 permiablization을 진행하고 5% normal horse serum/1% normal goat serum(Vector lab.)으로 상온에서 1 시간 동안 조직을 blocking하였다.The neural stem cells obtained above were fixed using 4% paraformaldehyde (Paraformaldehyde, PFA, Sigma) or acetone / methanol fixative, followed by 15 minutes permiablization with PBS containing 0.05% Triton X-100 (Sigma). The tissues were blocked with 5% normal horse serum / 1% normal goat serum (Vector lab.) For 1 hour at room temperature.

이후, 0.01% triton X-100(Sigma)을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 anti-CD133(Abcam),anti-musashi (Chemicon),anti-nestin(Abcam or Millipore), anti-Sox2(R&D), anti-Sox9(Abcam), anti-Sox10(Abcam), anti-Vimentin(Millipore), anti-GFAP(Sigma or Abcam), anti-Olig2(Millipore), anti-O4(Chemicon), anti-Tuj-I(Millipore) 각각의 항체를 조합하여 처리한 후 4℃에서 overnight로 반응을 시켰다. After washing several times with PBS containing 0.01% triton X-100 (Sigma), anti-CD133 (Abcam), anti-musashi (Chemicon), anti-nestin (Abcam or Millipore), anti-Sox2 (R & D) , anti-Sox9 (Abcam), anti-Sox10 (Abcam), anti-Vimentin (Millipore), anti-GFAP (Sigma or Abcam), anti-Olig2 (Millipore), anti-O4 (Chemicon), anti-Tuj-I (Millipore) Each antibody was treated in combination and then reacted overnight at 4 ° C.

그리고, 0.01% triton X-100을 포함하는 PBS로 수차례 수세한 후 상온에서 1시간 동안 처리한 1차 항체에 대응되는 anti-mouse-488(BD), anti-mouse-594(BD), anti-rabbit-488(BD), anti-rabbit-594(BD), anti-rat-488(BD), anti-rat-594(BD) 2차 항체를 처리한 후 마지막으로 DAPI(Sigma)를 사용하여 핵 염색을 시행하였고, 최종 형광 발현은 형광현미경(Axiovert, Zeiss)하에서 검증하였다.After washing several times with PBS containing 0.01% triton X-100, anti-mouse-488 (BD), anti-mouse-594 (BD), and anti-mouse corresponding to the primary antibody treated at room temperature for 1 hour. -rabbit-488 (BD), anti-rabbit-594 (BD), anti-rat-488 (BD), anti-rat-594 (BD) secondary antibody and then DAPI (Sigma) Nuclear staining was performed and final fluorescence expression was verified under fluorescence microscopy (Axiovert, Zeiss).

그 결과, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Nestin, CD133 및 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP의 발현이 확인되었고, 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 Olig2, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질은 발현되지 않음을 확인하였으며(도 2A), Sox2, Sox9, 및 Vimentin은 강하게 발현하였다(도 2B). 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 신경 줄기세포의 특성 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
As a result, expression of Nestin, CD133 and astrolase-specific marker GFAP, which are known as neural stem cell specific marker proteins, was confirmed, and oligodendrosite-specific marker Olig2 and neuron-specific marker Tuj-I protein were not expressed. (FIG. 2A), Sox2, Sox9, and Vimentin were strongly expressed (FIG. 2B). Through this, it was confirmed that the characteristics of neural stem cells were maintained throughout the passage.

1-4 : 인간 신경줄기세포의 1-4: of human neural stem cells 분화능Ability to distinguish 검증 Verification

상기에서 획득한 성체 신경줄기세포가 하위 신경세포로의 분화능력을 가지며, 계대 배양기간 중 분화능이 유지되는 것을 확인하기 위하여, FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후 Poly-L-Ornithine(Sigma) 및 Laminin(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여 부착시켰다. 이후 10%FBS를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액이나 Nerve growth factor(R&D), IBMX, dcAMP를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액에 1-2주일간 배양하여 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포를 대상으로 실시예 1-3에 기재된 방식으로 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역염색화학법을 이용해 분석하였고 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 분화능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
Neurobasal-A including FBS, B27 supplement (Gibco) and N2 supplement (Gibco) in order to confirm that the adult neural stem cells obtained above have differentiation capacity to lower neurons and maintain differentiation capacity during subculture. The cells were suspended in (Gibco) culture medium or DMEM: F12 (Gibco) culture medium, and then cultured and attached to cell culture containers pretreated with Poly-L-Ornithine (Sigma) and Laminin (Sigma). Then incubate for 1-2 weeks in Neurobasal-A (Gibco) medium containing 10% FBS or DMEM: F12 (Gibco) medium or Neurobasal-A (Gibco) medium containing Nerve growth factor (R & D), IBMX, dcAMP Differentiation was induced. The expression of sub-neuronal cell specific marker proteins in these differentiated cells was analyzed by immunostaining chemistry in the manner described in Examples 1-3, and it was confirmed that the differentiation capacity was maintained throughout the passage. 3).

실시예 2 : c- MET 발현 재조합 렌티바이러스 제작
Example 2: c- MET expressing recombinant lentivirus produced

2-1 : 재조합 바이러스 벡터 제조2-1: Recombinant Virus Vector Preparation

먼저, 서열번호 1의 c-MET 유전자는 신경 줄기세포로부터 RT-PCR로 증폭하였다. 실시예 1의 신경 줄기세포로부터 total RNA는 Rneasy kit(Qiagen)를 사용하여 추출하였고, 이후 역 전사효소인 Superscript III(Invitrogen)를 처리하여 cDNA를 합성하고 PCR 증폭의 주형으로 사용하였으며, EmGFP(Invitrogen) 유전자는 pLenti6.3/V5-GW/EmGFP(Invitrogen) 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머는 두 유전자 모두 lentivirus 벡터에서의 아미노산 발현을 개시하기 위해 CACC 서열을 포함하고 있다. 구체적으로 서열은 아래와 같다:First, the c-MET gene of SEQ ID NO: 1 was amplified by RT-PCR from neural stem cells. Total RNA was extracted from the neural stem cells of Example 1 using Rneasy kit (Qiagen), and then treated with reverse transcriptase Superscript III (Invitrogen) to synthesize cDNA and to use as a template for PCR amplification, EmGFP (Invitrogen). ) Gene was amplified by PCR from pLenti6.3 / V5-GW / EmGFP (Invitrogen) vector. Both primers contain a CACC sequence for initiating amino acid expression in lentivirus vectors. Specifically, the sequence is as follows:

Forward primer: CACCGGTACCATGAAGGCCCCCGCTGTGC (서열번호 3)Forward primer: CACCGGTACCATGAAGGCCCCCGCTGTGC (SEQ ID NO: 3)

Reverse primer: GCGGCCGCCTATGATGTCTCCCAGAAGGAGG (서열번호 4)Reverse primer: GCGGCCGCCTATGATGTCTCCCAGAAGGAGG (SEQ ID NO: 4)

PCR 반응은 94 ℃에서 5 분간 초기 변성; 94 ℃에서 1 분간 변성, 60 ℃에서 30 초간 어닐링(annealing) 및 72 ℃에서 3 분간 신장(extension)의 15 사이클; 및 72 ℃에서 10 분간 최종 신장으로 수행되었다. 증폭된 PCR 산물을 pENTR-D-TOPO (Invitrogen) 벡터에 클로닝하였다. PCR reactions were initially denatured at 94 ° C. for 5 minutes; 15 cycles of denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 60 ° C. for 30 seconds and extension at 72 ° C. for 3 minutes; And final elongation at 72 ° C. for 10 minutes. The amplified PCR product was cloned into pENTR-D-TOPO (Invitrogen) vector.

그리고, 신경줄기세포에서의 안정적인 도입 유전자의 발현을 위해 인간 ubiquitin C (UbC) 유전자의 프로모터 부분을 pLenti6/UbC/V5-DEST(Invitrogen) 벡터로부터 PCR로 증폭하였다. 이 때 사용한 프라이머는 용이한 클로닝을 위해 ClaI 및 SpeI 제한효소 서열을 포함하고 있다. 상기에서 증폭된 UbC 유전자 프로모터 부분을 pGEM-T easy(Promega) 벡터에 클로닝하였고, 이후 ClaI 및 SpeI 제한효소를 처리를 통해 유전자 단편을 확보하였으며, 동일한 제한 효소를 사용하여 pLenti7.3/V5-DEST(Invitrogen) 벡터의 CMV 프로모터 부위를 제거하여 벡터의 단편을 확보하였다. 이후 상기의 유전자 단편과 벡터 단편을 Ligase(promega) 처리를 통해 UbC 프로모터가 삽입된 발현 벡터를 확립하였다.In addition, the promoter portion of the human ubiquitin C (UbC) gene was amplified by PCR from the pLenti6 / UbC / V5-DEST (Invitrogen) vector to express stable transgenes in neural stem cells. The primers used at this time contain the ClaI and SpeI restriction enzyme sequences for easy cloning. The amplified UbC gene promoter portion was cloned into the pGEM-T easy (Promega) vector, and then a gene fragment was obtained by treating with ClaI and SpeI restriction enzymes, and pLenti7.3 / V5-DEST using the same restriction enzyme. The fragment of the vector was obtained by removing the CMV promoter region of the (Invitrogen) vector. Thereafter, the gene fragment and the vector fragment were treated with Ligase (promega) to establish an expression vector into which the UbC promoter was inserted.

Reporter 유전자의 삽입을 위해 상기의 벡터에 KpnI 제한효소를 처리해 벡터의 절편을 확보하였고, 동일한 제한 효소의 처리를 통해 pSuper-retro (Oligoengine) 벡터에서 항생제 발현 프로모터 및 유전자 단편을 확보하였다. 이후 상기의 유전자 단편과 벡터 단편을 Ligase(promega) 처리를 통해 UbC 프로모터가 삽입된 발현 벡터를 확립하였다. 확립된 발현 벡터에 LR clonase(Invitrogen)를 이용 c-MET 및 EmGFP 유전자를 전달하여 최종 발현벡터를 확립하였다.For insertion of the reporter gene, the vector was treated with KpnI restriction enzyme to obtain a fragment of the vector. Through the same restriction enzyme treatment, an antibiotic expression promoter and gene fragment were obtained from the pSuper-retro (Oligoengine) vector. Thereafter, the gene fragment and the vector fragment were treated with Ligase (promega) to establish an expression vector into which the UbC promoter was inserted. Final expression vectors were established by delivering c-MET and EmGFP genes using LR clonase (Invitrogen) to the established expression vectors.

상기 방법으로 제조한 c-MET의 렌티 바이러스 벡터와 EmGFP의 렌티 바이러스 벡터구조를 도 4A에 도시하였다.
The lentivirus vector of c-MET and the lentivirus vector of EmGFP prepared by the above method are shown in FIG. 4A.

2-2 : c-2-2: c- METMET 발현 재조합  Expression recombination 렌티바이러스Lentivirus 제조 Produce

(1) 렌티 바이러스(Lentivirus)의 생산 (1) Production of lentiviruses

Virus packaging 세포주로는 293FT (Invitrogen) 세포주를 사용하였다. 상기293FT 세포주에 실시예 2-1에서 제작한 NICD 과발현 벡터 및 virus packaging 관련 벡터 3종을 (pLP-1, pLP-2, pLP/VSVG) (Invitrogen) Lipofectamine reagent (Invitrogen)를 이용해 co-transfection 하여 virus 생산을 유도하였다.
Virus packaging cell line was used 293FT (Invitrogen) cell line. The 393FT cell line was co-transfected with three NICD overexpression vectors and virus packaging-related vectors (pLP-1, pLP-2, pLP / VSVG) (Invitrogen) using Lipofectamine reagent (Invitrogen). Induced virus production.

(2) Lentivirus particle의 수거 (2) Collection of Lentivirus particles

상기에서 확보한 virus 생산 세포주의 세포 배양액을 co-transfection 후 72 시간까지 수거하였다. Virus가 생산되어 나오는 배양액을 새로운 배양 배지로 12 시간 간격으로 교체하며 상층 배양액을 6 회 수거하였다. 이 기간 중 수거한 virus는 4 ℃에서 보관하였다.
Cell cultures of the virus-producing cell lines obtained above were harvested up to 72 hours after co-transfection. The culture medium from which the virus was produced was replaced with fresh culture medium every 12 hours, and the supernatant culture was collected 6 times. Viruses collected during this period were stored at 4 ° C.

(3) Lentivirus particle의 적정 (titration) (3) titration of Lentivirus particles

상기에서 수거한 virus를 포함하는 상층 배양액을 0.22 ㎛ syringe filter를 통과시켜 세포 부유물을 제거하였다. 24-well plate에 1x104 cells/ml의 세포농도로 배양된 293FT 세포에 6 ㎍/㎖ 농도의 polybrene (Sigma)을 처리하고, 준비한 virus를 10x, 1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625x의 농도로 순차적으로 희석하여 감염시켰다. The cell suspension was removed by passing the supernatant culture solution containing the virus collected above through a 0.22 μm syringe filter. 293FT cells incubated in a 24-well plate at a cell concentration of 1x10 4 cells / ml were treated with 6 μg / ml polybrene (Sigma), and the prepared virus was 10x, 1x, 0.5x, 0.25x, 0.125x, 0.0625. Infection was carried out by serial dilution to a concentration of x.

그 다음, FACS (FACS Calibur., BD) 분석을 통해 EGFP 발현 세포의 계수 또는 puromycin 항생제 선발을 통해 virus particle의 수와 세포의 수가 1:1이 되는 농도를 선택하였다. 이때의 농도를 기준으로 각 virus particle의 개수를 일량화 시켰다.
Next, the concentration of the virus particles and the number of cells were selected to be 1: 1 by counting EGFP-expressing cells or selecting puromycin antibiotics by FACS (FACS Calibur., BD) analysis. Based on the concentration at this time, the number of each virus particle was equalized.

실시예Example 3:  3: c-c- METMET 발현 재조합  Expression recombination 렌티바이러스에Lentivirus 의한 신경줄기세포의 감염 및 감염 세포주 선발 Infection of neural stem cells and selection of infected cell lines

Poly-L-Ornithine으로 전 처리한 24-well plate에 1x104 cells/㎖의 세포농도로 배양된 신경줄기세포에 6 ㎍/㎖ 농도의 polybrene (Sigma)을 처리하였다. 그 후, 실시예 2에서 준비한 c-MET 발현 재조합 렌티 바이러스를 1x103 Transducing unit (TU)으로 희석하여 감염시켰다.A 24-well plate pre-treated with Poly-L-Ornithine was treated with 6b / ml polybrene (Sigma) in neural stem cells incubated at a cell concentration of 1x10 4 cells / ml. Thereafter, c-MET expressing recombinant lenti virus prepared in Example 2 was infected by dilution with 1 × 10 3 Transducing unit (TU).

감염 시작 3 시간 후 기존 바이러스 포함 배지를 새로운 신경줄기세포 배양배지로 교체한 후 12 시간 배양을 진행하였다. 배양 후 Puromycin (Sigma) 항생제를 1 ug/ml의 농도로 첨가하여 5 일간 항생제 선발을 진행하였다.
Three hours after the start of infection, the culture medium containing the virus was replaced with a new neural stem cell culture medium, and then cultured for 12 hours. After incubation, antibiotics were selected for 5 days by adding Puromycin (Sigma) antibiotics at a concentration of 1 ug / ml.

실시예Example 4: 4: C-C- METMET 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인 Characterization of Neural Stem Cells Introduced by Genes

4-1 : c-4-1: c- METMET 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인 Characterization of Neural Stem Cells Introduced by Genes

실시예 2에서 선발된 c-MET 발현 재조합 렌티 바이러스로 감염된 신경줄기세포주에 대하여, 실시예 1, 2와 같은 방법으로 C-MET 유전자가 도입된 신경줄기세포의 특성 확인을 확인하였다. About the neural stem cell line infected with the c-MET expressing recombinant lenti virus selected in Example 2, it was confirmed the characteristics of the neural stem cells into which the C-MET gene was introduced in the same manner as in Examples 1 and 2.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 신경줄기세포 특이적 마커 단백질로 알려진 Musashi, Nestin, Sox2, CD133의 강하게 발현 (도 4B)되는 것을 확인할 수 있었다.  As a result, as shown in Figure 4, it was confirmed that the strong expression of Musashi, Nestin, Sox2, CD133 known as neural stem cell specific marker protein (Fig. 4B).

4-2 : c-4-2: c- METMET 유전자가 도입된 신경줄기세포의  Of neural stem cells 분화능Ability to distinguish 검증 Verification

상기에서 획득한 c-MET 과발현 성체 신경줄기세포가 하위 신경세포로의 분화능력을 가지며, 계대 배양기간 중 분화능이 유지됨을 확인하기 위하여, FBS, B27 supplement(Gibco), N2 supplement(Gibco)를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco)배양액에 현탁한 후 Poly-L-Ornithine(Sigma) 및 Laminin(Sigma)으로 전 처리한 세포배양용기에 배양하여 부착시켰다. 이후 10%FBS를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액 또는 DMEM:F12(Gibco) 배양액이나 Nerve growth factor(R&D), IBMX, dcAMP를 포함하는 Neurobasal-A(Gibco) 배양액에 1-2주일간 배양하여 분화를 유도하였다. 이들 분화된 세포를 대상으로 실시예 1-3에 기재된 방식으로 하위 신경세포 특이적 마커 단백질의 발현을 면역염색화학법을 이용해 분석하였고 이를 통해 전 계대배양에 걸쳐 분화능을 유지하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4C; 아스트로사이트 특이적 마커인 GFAP, 올리고덴드로사이트 특이적 마커인 O4, 뉴런 특이적 마커인 Tuj-I 단백질)
In order to confirm that the obtained c-MET overexpressing adult neural stem cells have differentiation capacity to lower neurons and maintain differentiation capacity during subculture, FBS, B27 supplement (Gibco) and N2 supplement (Gibco) are included. The cells were suspended in Neurobasal-A (Gibco) culture or DMEM: F12 (Gibco) culture, and then cultured in cell culture vessels pretreated with Poly-L-Ornithine (Sigma) and Laminin (Sigma). Then incubate for 1-2 weeks in Neurobasal-A (Gibco) medium containing 10% FBS or DMEM: F12 (Gibco) medium or Neurobasal-A (Gibco) medium containing Nerve growth factor (R & D), IBMX, dcAMP Differentiation was induced. The expression of sub-neuronal cell specific marker proteins in these differentiated cells was analyzed by immunostaining chemistry in the manner described in Examples 1-3, and it was confirmed that the differentiation capacity was maintained throughout the passage. Fig. 4C; Astrosite-specific marker GFAP, oligodendrosite-specific marker O4, neuron-specific marker Tuj-I protein)

4-3 : c-4-3: c- METMET 유전자가 도입된 신경줄기세포의  Of neural stem cells 증식능Proliferative ability 검증 Verification

실시예 5에서 선발된 c-MET 발현 재조합 렌티 바이러스 또는 EmGFP 발현 재조합 렌티 바이러스로 감염된 신경줄기세포에 대하여, 각 세포군별로 HGF를 세포배양 배지에 10 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도 범위로 첨가한 후 Poly-L-Ornithine으로 전 처리된 24-well plate에 5x103 cells/ml의 세포농도로 37 ℃ 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 이 때, 세포 증식능을 측정하기 위하여 배지에 CCK-8 (Dojindo) 시약을 동량 처리하였다. 세포 배양 2-4 시간 후, 배지의 상층액을 96-well plate에 옮긴 후 micro well plate reader 기기를 이용하여 460 ㎚의 파장 영역에서 흡광도를 측정하였다.For neural stem cells infected with c-MET expressing recombinant lenti virus or EmGFP expressing recombinant lenti virus selected in Example 5, HGF was added to the cell culture medium in each cell group at a concentration range of 10 to 1,000 μg / ml, followed by Poly-L In a 24-well plate pretreated with -Ornithine, the cells were incubated at 37 ° C in a 5% CO 2 cell incubator at a cell concentration of 5x10 3 cells / ml. At this time, the same amount of CCK-8 (Dojindo) reagent was treated in the medium in order to measure the cell proliferation ability. After 2-4 hours of cell culture, the supernatant of the medium was transferred to a 96-well plate, and then absorbance was measured in a wavelength region of 460 nm using a micro well plate reader.

그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이, wild type 및 EmGFP 발현 세포주에 비해 c-MET 발현 세포주에서 세포 증식이 현저하게 증가 되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in Figure 5A, it was confirmed that the cell proliferation is significantly increased in the c-MET expressing cell line compared to the wild type and EmGFP expressing cell line.

이 후, 계대 배양을 진행하면서 신경줄기세포의 증식 정도를 관찰하였다. 증식되는 세포의 개수를 계수한 결과, 도 5-B에 나타난 바와 같이, 세포수 누적 증가율 또한, c-MET 발현 세포주에서 대조군과 비교하여, 확연히 증가되는 것을 확인할 수 있었다.Subsequently, passage of culture was observed to observe the extent of neural stem cell proliferation. As a result of counting the number of cells to proliferate, as shown in FIG. 5-B, the cumulative increase rate of the cell number was also significantly increased in comparison with the control group in the c-MET expressing cell line.

이러한 결과를 통해, c-MET/HGF 신호 전달체계의 활성화는 성체 신경줄기세포의 증식능을 획기적으로 향상시키는 것을 확인할 수 있었다. 이는 성체 신경줄기세포의 대량증식을 통한 세포치료로의 응용 가능성을 시사한다. Through these results, it was confirmed that the activation of the c-MET / HGF signaling system dramatically improved the proliferative capacity of adult neural stem cells. This suggests the possibility of application to cell therapy through mass proliferation of adult neural stem cells.

또한, 상기 실시예에서는 c-Met/HGF 신호전달체계 활성화 줄기세포를 c-Met 유전자가 도입된 줄기세포에 HGF 리간드를 처리하여 제조하였으나, c-Met 유전자와 HGF 유전자를 동시에 도입시켜, HGF를 세포 내에서 발현시켜, c-Met/HGF 신호전달체계 활성화 줄기세포를 제조할 수 있다는 것은 당업장에게 자명하며, HGF 유전자의 도입은 c-MET 유전자의 도입방법과 유사하게, 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 허피스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 렌티 바이러스 등을 벡터로 이용하여 도입시킬 수 있다.
In addition, in the above embodiment, c-Met / HGF signaling system activated stem cells were prepared by treating HGF ligands to stem cells into which the c-Met gene was introduced, but simultaneously introducing c-Met gene and HGF gene to HGF It is apparent to those skilled in the art that the cells can be expressed in cells to prepare c-Met / HGF signaling system-activated stem cells. The introduction of HGF gene is similar to the method of introducing c-MET gene, retrovirus, adenovirus. , Herpes virus, Epstein-Barr virus, lenti virus and the like can be introduced as a vector.

이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having thus described the present invention in detail, it will be apparent to those skilled in the art that this specific description is only a preferred embodiment and that the scope of the present invention is not limited thereby . It is therefore intended that the scope of the invention be defined by the claims appended hereto and their equivalents.

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Claims (10)

다음과 같은 특징을 가지는 c-MET/HGF 신호 전달 체계가 활성화되어 세포 증식능이 증가된 신경줄기세포(neural stem cells):
(a) c-MET 유전자가 도입되어 과발현되어 있음; 및
(b) (i) HGF(hepatocyte growth factor)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있음; 또는
(ii) HGF로 처리됨.
Neural stem cells, which increase cell proliferation by activating the c-MET / HGF signal transduction system with the following characteristics:
(a) the c-MET gene has been introduced and overexpressed; And
(b) (i) a gene encoding hepatocyte growth factor (HGF) is introduced; or
(ii) treated with HGF.
제1항에 있어서, 상기 c-MET 유전자는 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cells).
The neural stem cells of claim 1, wherein the c-MET gene consists of a nucleic acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
삭제delete 제1항에 있어서, 상기 신경줄기세포(neural stem cells)는 인간 성체 뇌 조직 유래인 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cells).
The neural stem cells of claim 1, wherein the neural stem cells are derived from human adult brain tissue.
제4항에 있어서, 상기 뇌 조직은 측두엽 조직 또는 해마 조직인 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cells).
The neural stem cells of claim 4, wherein the brain tissue is temporal lobe tissue or hippocampal tissue.
제1항에 있어서, 상기 유전자 도입은 바이러스 벡터를 매개로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cells).
The neural stem cell of claim 1, wherein the gene is introduced through a viral vector.
제6항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 허피스 바이러스, 엡스타인-바 바이러스 및 렌티바이러스로 구성된 군에서 선택되는 하나의 바이러스인 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cells).
The neural stem cell of claim 6, wherein the virus is one virus selected from the group consisting of retrovirus, adenovirus, herpes virus, Epstein-Barr virus, and lentivirus.
제6항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 도 4의 (A) 개열 지도를 가지는 것을 특징으로 하는 신경줄기세포(neural stem cells).
The neural stem cells of claim 6, wherein the viral vector has a cleavage map of FIG. 4.
제1항, 제2항 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 신경줄기세포(neural stem cells)의 증식방법.

9. A method of propagating neural stem cells, the method comprising culturing the stem cells of any one of claims 1, 2 and 4-8.

삭제delete
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WO2020117017A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-11 서울대학교산학협력단 Anti-c-met agonist antibody and use thereof
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015002474A1 (en) * 2013-07-03 2015-01-08 서울대학교병원 Method for increasing stem-cell stemness in human cells
KR101627151B1 (en) * 2015-04-07 2016-06-07 가톨릭관동대학교산학협력단 controlled the expression and the production of growth factors of human adipose tissue derived mesenchymal stem cells by miRNA21 transfection

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020117017A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-11 서울대학교산학협력단 Anti-c-met agonist antibody and use thereof
WO2020117019A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-11 서울대학교산학협력단 Anti-c-met agonist antibody and use thereof
KR20200069822A (en) * 2018-12-07 2020-06-17 서울대학교산학협력단 Anti c-Met agonist antibody and uses thereof
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