KR20110082172A - Ｉｌ-1ｒ1에 대한 결합 성분 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인터류킨 1 수용체 1 (IL-1R1)에 대해서 특이적인 결합 성분, 특히 항체 분자에 관한 것이다. 예를 들어, IL-1R1에 대한 결합에 관해서 IL-1 및 IL-1Ra와 경쟁하며, Kinexa™에 의해서 측정하는 경우에 10 pM 이하의 K_D로 IL-1R1에 결합하는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분에 관한 것이다. 결합 성분은 특히, 류마티스성 관절염, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)을 포함하는 IL-1R1에 의해서 매개된 장애를 치료하는데 유용하다.

Description

ＩＬ-1Ｒ1에 대한 결합 성분{BINDING MEMBERS AGAINST IL-1R1}

본 발명은 인터류킨 1 수용체-1 (IL-1R1)에 대한 결합 성분 (binding members), 특히 항체 분자에 관한 것이다. 결합 성분은 류마티스성 관절염, 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)을 포함하는, IL-1R1에 의해서 매개된 장애의 치료에 유용하다. 본 발명은 또한, 이러한 결합 성분을 제조하는 방법, 본 발명의 결합 성분을 사용하여 IL-1R1에 의해서 매개된 장애를 치료하는 방법, 및 IL-1R1에 의해서 매개된 장애를 치료하는 의약을 제조하는데 있어서의 본 발명의 결합 성분의 용도에 관한 것이다.

인터류킨 1 (IL-1)은 면역-매개된 질환 및 감염 중의 염증성 반응에서 주된 역할을 하는 다기능성 사이토킨이다. IL-1은 박테리아 생성물, 사이토킨 또는 면역 컴플렉스에 의한 자극에 따라 다양한 세포 타입으로부터 생산된다. IL-1은 프로스타글란딘, 산화질소, 사이토킨, 케모킨, 메탈로프로테이나제 및 부착 분자와 같은 염증성 매개물질의 생산을 촉진하는 다양한 세포 타입에 대해 오토크린 (autocrine) 및 파라크린 (paracrine) 활성을 나타낸다. IL-1 생물학적 활성을 차단하는 것은 과도한 생산 또는 조절되지 않는 IL-1 활성에 의해서 야기된 조직 손상을 예방하거나, 예를 들어, COPD의 악화 중에 병원체에 대한 비정상적인 반응을 정상화시키는데 유익할 것이다.

사이토킨의 IL-1 집단은 일반적으로 11 개의 개개 성분, IL-1알파 (IL-1α), IL-1베타 (IL-1β), 인터류킨-18 (IL-18), 인터류킨 1 길항제 (IL-1Ra), IL1F5-10 및 인터류킨-33 (IL-33)으로 구성된다. 이들 중의 4 개, 즉 IL-1α, IL-1β, IL-18 및 IL-1Ra (IL-1 수용체 길항제)가 가장 완전하게 특정화되고, 다양한 질병의 병리학적 과정과 연관되었으며, IL-1α, IL-1β, 및 IL-1Ra는 단독으로 명백하게 막 IL-1R1과 상호작용하는 것으로 나타났다 (1, 2, 3). IL-1α 및 IL-1β는 별개의 유전자의 생성물이다. 이들 단백질은 아미노산 레벨에서 연관되며, IL-1α와 IL-1β는 22% 상동성을 공유하며, IL-1α와 IL-1Ra는 18% 상동성을 공유한다. IL-1β는 IL-1Ra와 26% 상동성을 공유한다. IL-1α, IL-1β 및 IL-1Ra 성분에 대한 유전자는 인간 염색체 2q14 내의 유사한 부분 상에 위치한다 (4, 5).

IL-1α 및 IL-1β는 둘 다 31-kDa 전구체 펩타이드로 합성되며, 이것은 분할되어 17-kDa 성숙 IL-1α 및 Il-1β를 생성한다. IL-1β는 상피세포 및 대식세포를 포함하는 다양한 세포 타입에 의해서 생산된다. 이것은 시스테인 프로테아제 카스파제-1 (IL-1 전환효소 (ICE) (6))에 의한 분할 후에 세포로부터 방출된다. IL-1α는 칼파인 프로테아제에 의해서 분할되며, 원형질막 상에 남아있을 수 있으며, 여기에서 이것은 세포 대 세포 접촉을 통해서 세포를 활성화시키는 것으로 보인다 (7). 프로-IL-1α는 그의 아미노 말단에 핵 국재화 서열을 함유하며, 이것은 다양한 세포성 경로의 활성화를 유도할 수 있다 (8).

IL-1Ra는 IL-1 시스템의 천연적으로 존재하는 억제제이다. 이것은 선택적 mRNA 스플리싱 (splicing) 및 선택적 해독 개시로부터 유도된 4 개의 상이한 이소형태로 생산된다. IL-1Ra의 분비된 17 kDa 이소형태는 이제 sIL-1Ra로 불리는 22-25 Kda의 가변적으로 글리코실화된 종으로 발현된다 (9, 10). 18 kDa 세포내 이소형태는 icIL-1Ra1로 불린다 (11). 이소형태 icIL-1Ra2는 icIL-1Ra1 및 sIL-1Ra 제1 엑손 사이에 위치하는 엑손으로부터 선택적 전사 스플리스에 의해서 생산된다 (12). 세 번째 16 kDa 세포내 이소형태 icIL-1Ra3도 또한 확인되었다 (13). Kineret® (아나킨라 (anakinra))는 가용성 인간 인터류킨-1 수용체 길항제 (IL-1Ra)의 재조합 비글리코실화된 형태이다. Kineret®는 그의 아미노 말단에 단일 메티오닌 잔기의 부가가 있다는 점에서 천연 인간 IL-1Ra와는 상이하다. Kineret®는 153 개의 아미노산으로 구성되며, 17.3 킬로달톤의 분자량을 갖는다. Kineret®는 중등도 내지 중증의 활동성 류마티스성 관절염의 치료에 대해 승인되었다.

IL-1α 및 Il-1β는 IL-1 수용체 집단에 속하는 경막 수용체 (transmembrane receptor)인 IL-1R1 (RefSeq NM_00877)에 결합함으로써 그들의 생물학적 효과를 나타낸다. IL-1 수용체 집단에는 일반적으로 10 개의 성분이 있으며 (14); IL-1 수용체 1 (IL-1R1 (80 kDa), IL-1RII (68 kDa) 및 IL-1 수용체 부속 (accessory) 단백질 (IL-1RacP)는 IL-1α 및 β의 신호전달과 관련이 있다. IL-1R1 및 IL1RacP는 세포막 내에서 IL-1α 또는 Il-1β의 결합에 대해 신호전달할 수 있는 고친화성 수용체를 형성하도록 컴플렉스를 형성한다. IL-1Ra는 IL-1R1를 결합시키지만 IL-1RAcP와 상호작용하지 않는다. IL-1α, Il-1β 및 IL-1Ra는 또한, 세포내 신호전달 도메인을 갖지 않는 IL-RII를 결합시킨다.

이들 수용체 중의 3 가지는 모두 막결합되거나 가용성인 단백질로 발현될 수 있다. IL-1R 타입 I (IL-1R1), IL-1RII 및 IL-1R 부속 단백질 (IL-1RAcP)은 3 개의 Ig-유사 도메인을 함유하는 그들의 세포외 부분을 갖는 면역글로불린 (Ig) 유전자 슈퍼패밀리 (superfamily)에 속한다. IL-1R1 및 IL-1RacP는 톨-유사 수용체 (Toll-Like receptor; TLR) 슈퍼패밀리와 관련된 세포질 영역 (톨-유사 IL-1R (TIR) 영역)을 갖는다. IL-1R1은 리간드 결합하고 IL-1RAcP와 컴플렉스를 형성하면 시그날 형질도입이 그의 213 아미노산 잔기의 세포질 꼬리를 통해서 개시되기 때문에 신호전달 수용체로 불린다 (15). 현재의 문헌들은 IL-1RII이 단지 세포 표면에서, 또는 가용성 형태로서 세포외적으로 '디코이 수용체 (decoy receptor)'로 작용한다고 시사한다 (16).

IL-1β에 결합된 IL-1R1의 세포외 부분의 결정 구조는 2.5 Å 분해능으로 분해되었다 (17). 2 개의 N-말단 Ig 도메인은 디설파이드 링커로 인하여 고정되는 것으로 보이며, 제3 도메인은 더 유연성을 나타낸다. IL-1R1은 2 개의 상당한 접촉 면적을 가지고 IL-12β 주위를 둘러싸는 것으로 보인다. 이들 중의 하나는 도메인 1 과 2 사이의 홈 (groove) 내에 있는 한편, 두 번째 접촉 면적은 제3 도메인 상에 위치하는 더 작은 면적이다. 흥미롭게도, IL-1Ra는 또한 IL-1R1의 도메인 1과 2 사이의 홈 부분에 결합하는 것으로 보이지만, IL-1Ra와 IL-1R1의 세 번째 Ig 도메인 사이에는 어떠한 접촉도 있는 것으로 나타내지 않는다 (18).

일단 IL-1이 IL-1R1 쇄에 결합하면, IL-1RAcP가 리간드-수용체 쌍에 동원되고, 고친화성 수용체 컴플렉스를 형성하며, 이것은 시그날 형질도입의 개시를 야기한다.

IL-1-IL-1R1과의 IL-1RAcP 상호작용의 모델은 돌연변이유발 및 항체 시험을 기초로 하여 제안되었다 (19, 20 및 21). IL-1RAcP는 IL-1과 IL-1R1 사이의 계면과 상호작용하는 것으로 나타난다. 이들 시험은 또한, AcP가 IL-1Ra-IL-1R1 쌍과 상호작용할 수 없으며, 더 이완된 구조를 형성하는 것을 입증하였다. Greenfeder 등 (22)은 IL-1Ra와 결합된 L-1R1이 IL-1RAcP를 동원하지 못하며, 따라서 시그날을 보내지 못한다는 것을 나타내었다. ILRa는 IL-1β 또는 IL-1α에 대한 IL-1R1 상의 결합 부위를 점유하고, 또한 IL-1RAcP와의 신호전달 컴플렉스를 형성하지 못함으로써 작용한다.

IL-1R 패밀리의 추가의 성분은 타입 II IL-1R (IL-1RII)이다. 이 수용체는 세포외 부분에서 IL-1R1과 고도로 상동성이며, IL-1α 및 IL-1β를 결합시킬 수 있다. 그러나, 현재의 증거는 IL-1RII가 세포질내 영역의 결여로 인하여 신호전달을 개시하지 않는다는 것을 시사한다. 이 수용체는 세포 표면으로부터 분할되고, 막 형태와 함께 디코이 수용체로서 작용함으로써 IL-1 활성의 억제제로서 작용할 수 있다 (16). IL-1RII는 IL-1β에 대해서 더 큰 친화성 및 IL-1Ra에 대해서는 더 낮은 친화성을 가지며, 이것은 IL-1RII가 IL-1Ra의 억제활성을 차단하지 않는다는 것을 의미한다 (23). IL-1RII에 대한 리간드 결합은 IL-1RAcP의 동원을 야기하지만, 이 컴플렉스는 비-신호전달을 유지한다 (24). IL-1RAcP는 이 방식으로 IL-1RII에 의해서 제거되며, IL-1R1에 대한 IL-1RAcP 결합을 방지하기 때문에, 이것은 또한 이 기전에 의해서 IL-1 작용을 차단할 수 있고, 이것은 "공-수용체 경쟁 (co-receptor competition)"으로 불린다 (24). 그러나, 높은 레벨의 IL-1RII를 발현하는 세포는 IL-1β에 대해서 비반응성이 되는 것으로 나타났지만, 현재 IL-1RII가 또 다른 신호전달 쇄를 동원할 수 있다는 것이 오류임은 명확하게 입증하지 못하였다 (25).

IL-1이 IL-1R1에 결합하는 경우에 형성되는 고친화성 컴플렉스는 IL-1RAcP의 동원을 유도하고, 수용체 신호전달을 개시시킨다. IL-1R1 및 IL-1RacP는 톨-유사 수용체 (TLR) 슈퍼패밀리와 관련된 세포질 영역 (톨-유사 IL-1R (TIR) 도메인)을 갖는다.

시그날 형질도입 중에, 어댑터 분자 MyD88의 TIR 도메인은 IL-1RAcP의 TIR 도메인과 상호작용하며, IRAK-4 및 IRAK-1을 함유하는 수용체 컴플렉스의 동원을 야기한다. 인산화된 IRAK는 다시 수용체 컴플렉스로 TRAF6을 동원하는 것으로 제안되었다. 그 후, IRAK는 TRAF6을 막 결합된 컴플렉스 II를 형성하도록 자극하기 전에 막에 전결합된 TAK1, TAB1, 및 TAB2로 보낸다. 컴플렉스 II의 형성은 미지의 키나제에 의한 막 상에서의 TAK1 및 TAB2의 인산화를 유도하고, 이어서 IRAK로부터 TRAF6-TAK1-TAB1-TAB2 (컴플렉스 III)의 해리 및 그 결과로 컴플렉스 III의 사이토졸로의 전좌를 유도한다. 컴플렉스 III의 형성 및 추가의 사이토졸 인자와 그의 상호작용은 TAK1의 활성화를 유도한다. 인산화된 IRAK는 막 상에 남고, 결국은 유비퀴틴화되고 분해된다. TAK-1의 활성화는 IKK의 활성화, IkB 단백질의 분해를 유도하여 NF-kB 활성화를 야기하고, 이것은 핵 내에서 전사를 활성화시킨다. TAK-1은 또한 p38, JNK 및 ERK1/2의 활성화를 통해서 AP1을 포함하는 전사인자의 활성을 조절하는 미토겐 활성화된 단백질 키나제 경로 (MAPK)의 활성화에 역할을 하는 것으로 나타났다 (26). 신호전달 형질도입은 이들 다수의 경로 아래쪽에서 증폭되기 때문에, 리간드에 의한 세포당 수용체 점유 백분율은 IL-1R 발현 세포에서 생리학적 반응을 개시시키기 위해서 낮은 것만이 필요하다 (아마도 세포당 10 개의 수용체 정도로 낮은 점유).

IL-1은 다수의 염증성 질환에서 중요한 역할을 갖는 주된 염증성 사이토킨이다. 유전자 및 단백질 레벨에서 IL-1의 발현은 다양한 질환에서 검사되었다. IL-1의 증가된 레벨은 타입 2 당뇨병 (27, 28, 29), HIV-1 고형 종양, 백혈병, 알츠하이머병, 허혈성 질환 (30) 및 아테롬성 경화증 (31), 천식, COPD 및 OA에서 보고되었다 (32). IL-1은 다양한 시험관내 및 생체내 시험에 의해서 다수의 생물학적 효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 그의 다면발현성 작용은 프로스타노이드, 산화질소, 사이토킨, 케모킨, 프로테아제 및 부착 분자를 포함하는 다양한 염증성 매개물질의 유전자 발현, 및 사이토킨 수용체 발현에 있어서의 그의 주된 역할과 연관된다 (32). 이들 염증성 매개물질의 과도한 생산 또는 발현은 질병 병리학 및 조직 리모델링 및 파괴와 연관된다. 따라서, IL-1은 류마티스성 관절염, 골관절염 (OA), 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 타입 2 당뇨병, 허혈성 질환 및 아테롬성경화증과 같은 다수의 통상적인 염증성 장애에 대한 중요한 치료학적 표적을 나타낸다.

본 발명은 완전한 인간 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 포함하는, IL-1R1에 결합하고, IL-1α 및/또는 IL-1β의 생물학적 활성을 억제하는 결합 성분을 제공한다.

IL-1R1에 대해 유도된 결합 성분은 이하의 국제특허출원에 기술되어 있다: WO 2004/022718, WO 2005/023872, WO 2007/063311, WO 2007/063308 및 WO 2006/059108.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 IL-1R1에 대한 결합에 대해서 IL-1Ra와 경쟁하는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분, 예를 들어, 항체를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 IL-1R1에 대한 결합에 대해서 IL-1 및 IL-1Ra와 경쟁하며, Kinexa™에 의해서 측정되는 경우에 10 pM 이하의 KD로 IL-1R1를 결합시키는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분을 제공한다. 하나의 구체예에서, IL-1은 IL-1α에 관한 것이며, 또 다른 구체예에서 IL-1은 IL-1β에 관한 것이다. 또 다른 구체예에서, IL-1은 IL-1α 및 IL-1β 둘 다에 관한 것이다.

IL-1 및 IL1Ra 결합을 차단하는 항체가 특히 효과적인 것으로 믿어진다. IL-1의 부재 하에서, IL-1R1은 약 11 시간의 t_1/2로 내재화하지만, IL-1의 존재 하에서 수용체는 더 빠른 내재화를 겪어서 t_1/2은 약 1.5 시간이다 (33, 34). 이에 반해서, IL-1Ra는 IL-1R1을 결합시키지만, 수용체의 증가된 내재화를 유도하지 않는다 (35). IL-1R1이 내재화되는 경우에, 이것은 막 표면으로 쉽게 다시 재순환되지 않으며 (33), 따라서 IL-1 단독인 경우와 유사한 에피토프에 대한 항체 결합은 쉽게 내재화될 수 있고, 결과적으로 엔도솜 경로 내로 운반될 수 있으며, 이 수용체-매개된 청소 기전을 통해서 더 큰 비율의 청소를 겪을 수 있는 것 같다. IL-1ra와 더욱 유사한 에피토프에 대한 항체는 수용체 내재화의 비율을 증가시키는데 덜 민감할 수 있고, 수용체 매개된 기전을 통해서 증가된 청소를 겪지 않을 수 있으며, 따라서 아마도 더욱 인간 IgG에 전형적인 순환 청소율 및 반감기를 가질 것이다. 국제특허출원 제WO 2004/022718호는 IL-1R1에 대한 IL-1 및 IL-1Ra 결합 둘 다를 차단하는 항체의 부류를 기술하였지만, 이 부류는 Il-1R의 제3 도메인에 결합하고, Il-1β 결합을 방지하는 기술된 항체의 바람직한 부류보다 훨씬 덜 강력하였다. 이와는 대조적으로, 본 발명의 항체는 IL-1R1에 대한 Il-1 및 Il-1Ra 결합을 차단하고, 높은 친화성으로 Il-1R1을 결합시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 30 pM IL-1β의 존재 하에서 전체 인간 혈액 내에서의 IL-1β 유도된 IL-6 생산의 억제에 관해, 적어도 6 개의 상이한 공여체로부터 평균을 구한 것으로서, 1 nM 미만의 평균 IC₅₀을 갖는, IL-1R1에 대해 특이적인 분리된 결합 성분이 제공된다. 추가의 구체예에서, 평균 IC₅₀은 적어도 10, 15 또는 20 개의 상이한 공여체로부터 평균을 구하였다. 추가의 구체예에서, 평균 IC₅₀은 800 pM 미만, 700 pM 미만, 600 pM 미만, 500 pM 미만, 400 pM 미만, 300 pM 미만, 300 pM 미만, 200 pM 미만, 100 pM 미만, 또는 50 pM 미만이다.

본 발명의 결합 성분은 IL-1R1에 결합하며, 높은 효력으로 IL-1R1을 중화시킨다. 중화는 IL-1R1의 생물학적 활성을 억제하는 것을 의미한다. 본 발명의 결합 성분은 IL-1R1의 하나 이상의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있으며, 전형적으로 본 발명의 결합 성분은 IL-1R1에 대한 IL1α 및IL1β 결합을 억제한다.

본 발명의 결합 성분은 또한, 천연적으로 인간 이외의 종에 존재하는 IL-1R1 오르토로그 (orthologs)를 의미하는 비-인간 IL-1R1에 결합하여 이것을 중화시킬 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 통상적으로 다른 단백질보다 IL-1R1에 대해서 특이적이며, 따라서 IL-1R1을 선택적으로 결합시킨다. 이러한 선택성은 예를 들어, 표준 경쟁시험에서 결정되거나 입증될 수 있다.

본 발명의 결합 성분에 의한 IL-1R1의 중화를 측정하는데 적합한 시험방법에는 예를 들어, 리간드 수용체 생화학 시험방법 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR) (예를 들어, BIACORE™)이 포함된다.

인간 IL-1R1에 대한 IL-1R1 결합 성분의 결합 역학 및 친화성 (평형 해리상수 K_D로 표현됨)은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명 (BIACORE™)을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 결합 성분은 통상적으로 약 1 nM 미만의 인간 IL-1R1에 대한 친화성 (K_D)을 가지며, 일부의 구체예에서는 약 100 pM 미만의 K_D를 가지며, 다른 구체예에서는 50 pM 미만의 K_D를 가지고, 다른 구체예에서는 25 pM 미만의 K_D를 가지며, 다른 구체예에서는 10 pM 미만의 K_D를 가지고, 다른 구체예에서는 5 pM 미만의 K_D를 가지며, 다른 구체예에서는 3 pM 미만의 K_D를 가지고, 다른 구체예에서는 1 pM 미만의 K_D를 갖는다.

항체의 그의 항원에 대한 결합 친화성의 측정을 위해서는 다수의 방법이 이용될 수 있으며, 이러한 방법 중의 하나는 KinExA™이다. 역학적 배제시험 (Kinetic Exclusion Assay; KinExA™)은 평형 해리상수, 및 항원/항체 상호작용에 대한 결합 및 해리 속도상수를 측정할 수 있는 일반적 목적의 면역시험 플랫폼 (기본적으로 유동 분광형광계)이다. KinExA™는 평형이 수득된 후에 수행되기 때문에, 이것은 상호작용의 오프율 (off-rate)이 매우 느릴 수 있는 고친화성 상호작용의 K_D를 측정하기 위해서 사용하는데 유리한 기술이다. KinExA™의 사용은 항체 및 항원의 친화성이 표면 플라즈몬 공명 분석에 의해서 정확하게 예측될 수 있는 것보다 더 큰 경우에 특히 적절하다. KinExA™ 방법은 문헌 [Drake et al (2004) Analytical Biochemistry 328, 35-43]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 KinExA™ 방법을 사용하여 측정된 것으로서, 300 pM 이하의 K_D로 IL-1R에 대해서 특이적이다. 대신으로, K_D는 200 pM 또는 그 미만, 100 pM 또는 그 미만, 50 pM 또는 그 미만, 20 pM 또는 그 미만, 10 pM 또는 그 미만, 5 pM 또는 그 미만, 3 pM 또는 그 미만, 1 pM 또는 그 미만이다.

생물학적 활성의 억제는 부분적이거나 전체적일 수 있다. 결합 성분은 CYNOM-K1 세포에서의 IL-1β 유도된 IL-8 방출 또는 HeLa 세포에서의 IL-1α 및 IL-1β 유도된 IL-8 방출과 같은 IL-1R1 생물학적 활성을, 결합 성분의 부재 하에서의 최대 가능한 활성의 50% 또는 80%를 유도하는 IL-1α 또는 β의 농도의 활성의 100%만큼, 또는 대신으로 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 억제할 수 있다.

결합 성분의 중화 효력은 다른 식으로 나타내지 않는 한, 통상적으로 nM 단위의 IC₅₀ 값으로 표현된다. 기능적 시험에서, IC₅₀은 생물학적 반응을 그의 최대치의 50%만큼 감소시키는 결합 성분의 농도이다. 리간드 결합시험에서, IC₅₀은 수용체 결합을 최대 특이적 결합 레벨의 50%만큼 감소시키는 농도이다. IC₅₀은 결합 성분 농도의 로그의 함수로서 최대 생물학적 반응의 %를 도시하고, 데이터에 시그모이드 함수 (sigmoidal function)를 적용하여 IC₅₀ 값을 생성시키는 Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA)과 같은 소프트웨어 프로그램을 사용하여 계산할 수 있다. 효력은 숙련된 전문가에게 공지되고/되거나 본 발명에 기술되거나 언급된 하나 이상의 시험방법을 사용하여 결정되거나 측정될 수 있다. 결합 성분의 중화 효력은 기하평균 (Geomean)으로 표현될 수 있다.

본 발명에 기술된 시험방법에서 결합 성분에 의한 IL-1R1 활성의 중화는 결합 성분이 IL-1R1에 결합하여 그를 중화시킨다는 것을 나타낸다. IL-1R1에 대한 결합 성분의 결합을 결정하는데 사용될 수 있는 다른 방법에는 ELISA, 웨스턴 블럿팅 (Western blotting), 면역침강, 친화성 크로마토그래피 및 생화학적 시험방법이 포함된다.

본 발명의 결합 성분은 다른 종의 IL-1R1에 대해서보다 인간 IL-1R1에 대해서 유사하거나 더 강력한 친화성을 가질 수 있다. 인간 IL-1R1에 대한 결합 성분의 친화성은 시노몰구스 (cynomolgus) 원숭이 IL-1R1에 대한 것과 유사하거나, 예를 들어, 5 또는 10-배일 수 있다. 대신으로, 결합 성분은 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-1R1에 대해서 유사한 결합 친화성을 가질 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 골격 (framework) 내에 하나 이상의 CDRs, 예를 들어, 'CDRs의 세트'를 포함하는 IL-1R1 결합 모티프를 포함한다. CDRs의 세트는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDRs를 포함한다. 하나의 구체예에서, CDRs의 세트는 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDRs, 예를 들어, 표 2에서의 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDRs와 임의로 조합된 표 2에서의 HCDR3을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, CDRs의 세트는 HCDR1, HCDR2, LCDR1 및 LCDR2로부터 선택된 하나 이상의 CDRs, 예를 들어, 표 2에서의 HCDR1, HCDR2, LCDR1 및 LCDR2로부터 선택된 하나 이상의 CDRs와 임의로 조합된 표 2에서의 HCDR3 및 LCDR3을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, CDRs의 세트는 표 2에서의 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다. 표 2에서의 동일한 항체로부터 하나 이상의 CDRs를 선택하는 것이 바람직하지만, CDRs는 표 2에 열거된 하나 이상의 항체로부터 선택될 수도 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 성분, 예를 들어, 항체는 예를 들어, 표 1a 및 1b에 기술된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDRs를 포함하는 IL-1R1 결합 모티프를 포함하며, 여기에서 상기 결합 성분은 Il-1R1을 특이적으로 결합시킨다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 결합 성분, 예를 들어, 항체는 예를 들어, 표 1a 및 1b에 기술된 바와 같은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로부터 선택된 하나 이상의 CDRs를 포함하는 IL-1R1 결합 모티프를 포함하며, 여기에서 상기 결합 성분은 Il-1R1을 특이적으로 결합시키고, IL-1R1에 대한 결합에 관해서 IL-1β 및 IL-1Ra와 경쟁하며, Kinexa™에 의해서 측정하는 경우에 10 pM 이하의 K_D로 Il-1R1을 결합시킨다.

본 발명에 기술된 바와 같이, 모항체 분자는 표 1a에 나타낸 바와 같은 CDR 서열의 세트를 갖는 것으로 분리되었다 (참조: 항체 1). 최적화의 과정을 통해서, 본 발명자들은 모 CDR 서열로부터 유도된 CDR 서열을 가지며, 표 1에 나타낸 위치에서 변형을 갖는 2-3으로 번호가 매겨진 항체 클론의 패널을 생성시켰다. 따라서, 예를 들어, 항체 2는 모 HCDR1, HCDR2, LCDR1 및 LCDR2를 가지며, 카바트 (Kabat) 잔기 100E가 T로 대체되고, 카바트 잔기 100F가 V로 대체되고, 카바트 잔기 100G가 D로 대체되고, 카바트 잔기 100H가 A로 대체되고, 카바트 잔기 100I가 A로 대체되고, 카바트 잔기 101이 V로 대체되고, 카바트 잔기 102가 D로 대체된 모 HCDR3 서열을 갖는다는 것을 표 1a로부터 알 수 있다.

본 발명에 기술된 바와 같이, 제2 모항체 분자는 표 1b에 나타낸 바와 같이 CDR 서열의 세트를 갖는 것으로 분리되었다 (참조: 항체 4). 최적화의 과정을 통해서, 본 발명자들은 모 CDR 서열로부터 유도된 CDR 서열을 가지며, 표 1b에 나타낸 위치에서 변형을 갖는 5-10으로 번호가 매겨진 항체 클론의 패널을 생성시켰다. 따라서, 예를 들어, 항체 5는 모 HCDR1, HCDR2, LCDR1 및 LCDR2를 가지며, 카바트 잔기 100A가 A로 대체되고, 카바트 잔기 100B가 P로 대체되고, 카바트 잔기 100C가 P로 대체되고, 카바트 잔기 100D가 P로 대체되고, 카바트 잔기 100E가 L로 대체되고, 카바트 잔기 100F가 G로 대체되고, 카바트 잔기 100I가 G로 대체된 모 HCDR3 서열을 갖는다는 것을 표 1b로부터 알 수 있다. 또한, 표 1b로부터 항체 6은 모 HCDR1, HCDR2, LCDR1 및 LCDR2를 가지며, 카바트 잔기 100A가 E로 대체되고, 카바트 잔기 100B가 Q로 대체되고, 카바트 잔기 100C가 Y로 대체되고, 카바트 잔기 100D가 G로 대체되고, 카바트 잔기 100E가 V로 대체되고, 카바트 잔기 100F가 V로 대체되고, 카바트 잔기 100J가 결실되고, 카바트 잔기 101은 F로 대체되고, 카바트 잔기 102는 V로 대체된 모 HCDR3 서열을 갖는다는 것을 알 수 있다.

본 발명에는 표 1a에 나타낸 바와 같은 CDRs의 모 세트를 포함하는 결합 성분 (항체 1)이 기술되며, 여기에서 HCDR1은 SEQ ID NO: 93 (카바트 잔기 31-35)이고, HCDR2는 SEQ ID NO: 94 (카바트 잔기 50-65)이며, HCDR3은 SEQ ID NO: 95 (카바트 잔기 95-102)이고, LCDR1은 SEQ ID NO: 98 (카바트 잔기 24-34)이며, LCDR2는 SEQ ID NO: 99 (카바트 잔기 50-56)이고, LCDR3은 SEQ ID NO: 100 (카바트 잔기 89-97)이다. 본 발명에 따른 결합 성분은 또한, 표 1a에 나타낸 바와 같은 모 결합 성분 (항체 1)일 수도 있으며, 여기에서 CDRs 중의 하나 이상은 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 일부의 구체예에서, 결합 성분은 항체 1의 모 서열에 비해서 1 내지 12 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDRs의 세트를 포함한다. 또 다른 구체예에서는, 항체 1에 비해서 1 내지 10 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는, 항체 1의 모 서열에 비해서 1 내지 5 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는 항체 1에 비해서 1 내지 3 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다.

특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며; 여기에서 HCDR3은 임의로 1 내지 7 개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 SEQ ID NO: 95의 아미노산 서열을 갖고; LCDR3은 임의로 1 내지 5 개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 SEQ ID NO: 100의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 구체예에서, HCDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 93을 가질 수 있으며; HCDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 94를 가질 수 있고; LCDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 98을 가질 수 있으며; LCDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 99를 가질 수 있다. 대신으로, HCDR1, HCDR2, LCDR1, 및 LCDR2는 또한 총체적으로, 모 서열 (항체 1)에 비해서 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입, 예를 들어, 1 내지 10 개의 치환을 가질 수 있다.

본 발명에는 표 1b에 나타낸 바와 같은 CDRs의 모 세트를 포함하는 결합 성분 (항체 4)이 기술되어 있으며, 여기에서 HCDR1은 SEQ ID NO: 103 (카바트 잔기 31-35)이며, HCDR2는 SEQ ID NO: 104 (카바트 잔기 50-65)이고, HCDR3은 SEQ ID NO: 105 (카바트 잔기 95-102)이며, LCDR1은 SEQ ID NO: 108 (카바트 잔기 24-34)이고, LCDR2는 SEQ ID NO: 109 (카바트 잔기 50-56)이며, LCDR3은 SEQ ID NO: 110 (카바트 잔기 89-97)이다. 본 발명에 따른 결합 성분은 또한, 표 1b에 나타낸 바와 같은 모 결합 성분일 수 있으며, 여기에서 CDRs 중의 하나 이상은 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 일부의 구체예에서, 결합 성분은 항체 4의 모 서열에 비해서 1 내지 15 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDRs의 세트를 포함한다. 또 다른 구체예에서는 항체 4에 비해서 1 내지 10 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는 항체 4의 모 서열에 비해서 1 내지 5 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는 항체 4에 비해서 1 내지 3 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다.

특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며; 여기에서 HCDR3은 임의로 1 내지 9 개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 SEQ ID NO: 105의 아미노산 서열을 가지며; LCDR3은 임의로 1 내지 6 개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 SEQ ID NO: 110의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 구체예에서, HCDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 103을 가질 수 있으며; HCDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 104를 가질 수 있고; LCDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 108을 가질 수 있으며; LCDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 109를 가질 수 있다. 대신으로, HCDR1, HCDR2, LCDR1, 및 LCDR2는 또한 총체적으로 모 서열 (항체 4)에 비해서 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입, 예를 들어, 1 내지 10 개의 치환을 가질 수 있다.

본 발명에는 표 1b에 나타낸 바와 같은 CDRs의 항체 6 세트를 포함하는 결합 성분이 기술되어 있으며, 여기에서 HCDR1은 SEQ ID NO: 63 (카바트 잔기 31-35)이며, HCDR2는 SEQ ID NO: 64 (카바트 잔기 50-65)이고, HCDR3은 SEQ ID NO: 65 (카바트 잔기 95-102)이며, LCDR1은 SEQ ID NO: 68 (카바트 잔기 24-34)이고, LCDR2는 SEQ ID NO: 69 (카바트 잔기 50-56)이며, LCDR3은 SEQ ID NO: 70 (카바트 잔기 89-97)이다. 본 발명에 따른 결합 성분은 또한, 표 1b에 나타낸 바와 같은 항체 6 결합 성분일 수도 있으며, 여기에서 CDRs 중의 하나 이상은 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 일부의 구체예에서, 결합 성분은 항체 6의 서열에 비해서 1 내지 17 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 CDRs의 세트를 포함한다. 또 다른 구체예에서는 항체 6에 비해서 1 내지 10 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는 항체 6의 서열에 비해서 1 내지 5 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는 항체 6에 비해서 1 내지 3 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는 항체 6에 비해서 1 내지 2 개의 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 또 다른 구체예에서는 항체 6에 비해서 1 개의 부가, 치환, 결실 또는 삽입을 갖는다.

특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3을 포함하며; 여기에서 HCDR3은 임의로 1 내지 11 개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 SEQ ID NO: 65의 아미노산 서열을 가지며; LCDR3은 임의로 1 내지 6 개의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 SEQ ID NO: 70의 아미노산 서열을 갖는다. 이러한 구체예에서, HCDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 63을 가질 수 있으며; HCDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 64를 가질 수 있고; LCDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 68을 가질 수 있으며; LCDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 69를 가질 수 있다. 대신으로, HCDR1, HCDR2, LCDR1, 및 LCDR2는 또한 총체적으로 항체 6의 서열에 비해서 하나 이상의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입, 예를 들어, 1 내지 10 개의 치환을 가질 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 본 발명에 기술된 바와 같은 CDRs 중의 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 성분은 SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1; SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; SEQ ID NOS: 95, 5 또는 125로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3; SEQ ID NO: 98의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; SEQ ID NO: 99의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 SEQ ID NOS: 100, 10 또는 130으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 본 발명에 기술된 바와 같은 CDRs 중의 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 성분은 SEQ ID NO: 103의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1; SEQ ID NO: 104의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; SEQ ID NOS: 105, 15, 65, 25, 35, 75, 45, 115, 55 또는 85로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3; SEQ ID NO: 108의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; SEQ ID NO: 109의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 SEQ ID NOS: 110, 20, 70, 30, 40, 80, 50, 120, 60 또는 90으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 본 발명에 기술된 바와 같은 CDRs 중의 하나 또는 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 성분은 SEQ ID NO: 93의 아미노산 서열을 갖는 HCDR1; SEQ ID NO: 94의 아미노산 서열을 갖는 HCDR2; SEQ ID NOS: 95, 5, 125, 105, 15, 65, 25, 35, 75, 45, 115, 55 또는 85로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 HCDR3; SEQ ID NO: 98 또는 108의 아미노산 서열을 갖는 LCDR1; SEQ ID NO: 99 또는 109의 아미노산 서열을 갖는 LCDR2; 및 SEQ ID NOS: 100, 10, 130, 110, 20, 70, 30, 40, 80, 50, 120, 60 또는 90으로 구성된 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 LCDR3을 포함할 수 있다.

특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분 또는 VH 도메인은 다음의 치환 또는 결실 중의 하나 이상을 갖는 항체 1 HCDR3 (SEQ ID NO:95)을 포함한다:

T에 의해서 대체된 카바트 잔기 100E;

V 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 100F;

D에 의해서 대체된 카바트 잔기 100G;

A 또는 P에 의해서 대체된 카바트 잔기 100H;

A 또는 P에 의해서 대체된 카바트 잔기 100I;

V 또는 G에 의해서 대체된 카바트 잔기 101;

D 또는 V에 의해서 대체된 카바트 잔기 102.

특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분 또는 VH 도메인은 다음의 치환 또는 결실 중의 하나 이상을 갖는 항체 4 HCDR3 (SEQ ID NO:105)을 포함한다:

A 또는 E에 의해서 대체된 카바트 잔기 100A;

P, Q 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 100B;

P, Y, S 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 100C;

P, G 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 100D;

L 또는 V에 의해서 대체된 카바트 잔기 100E;

G, V 또는 P에 의해서 대체된 카바트 잔기 100F;

V에 의해서 대체된 카바트 잔기 100G;

Y에 의해서 대체된 카바트 잔기 100H;

G 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 100I;

A에 의해서 대체되거나 결실된 카바트 잔기 100J;

F에 의해서 대체된 카바트 잔기 101;

V에 의해서 대체된 카바트 잔기 102.

일부의 구체예에서, 결합 성분 또는 그의 VL 도메인은 다음의 치환 중의 하나 이상을 갖는 항체 1 LCDR3 (SEQ ID NO: 100)을 포함할 수 있다:

H 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 94;

A에 의해서 대체된 카바트 잔기 95;

E 또는 R에 의해서 대체된 카바트 잔기 95A;

Q 또는 V에 의해서 대체된 카바트 잔기 95B;

H 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 97.

일부의 구체예에서, 결합 성분 또는 그의 VL 도메인은 다음의 치환 중의 하나 이상을 갖는 항체 4 LCDR3 (SEQ ID NO: 110)을 포함할 수 있다:

A, V, D, H, L 또는 R에 의해서 대체된 카바트 잔기 94;

G, R 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 95;

G, L, A, V 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 95A;

H, R, A 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 95B;

H, P 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 96;

H, V 또는 Q에 의해서 대체된 카바트 잔기 97.

특정의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분 또는 VH 도메인은 다음의 치환 또는 결실 중의 하나 이상을 갖는 항체 6 HCDR3 (SEQ ID NO:65)을 포함한다:

G 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 100A;

S, P 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 100B;

D, P, S 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 100C;

Y, P 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 100D;

T 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 100E;

T, G 또는 P에 의해서 대체된 카바트 잔기 100F;

V에 의해서 대체된 카바트 잔기 100G;

Y에 의해서 대체된 카바트 잔기 100H;

G 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 100I;

항체 6에서 결실된 카바트 잔기 100J는 A 또는 F로서 복귀된다;

D에 의해서 대체된 카바트 잔기 101;

I에 의해서 대체된 카바트 잔기 102.

일부의 구체예에서, 결합 성분 또는 그의 VL 도메인은 다음의 치환 중의 하나 이상을 갖는 항체 6 LCDR3 (SEQ ID NO: 70)을 포함할 수 있다:

S, A, D, H, L 또는 R에 의해서 대체된 카바트 잔기 94;

L, G 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 95;

S, G, A, V 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 95A;

G, R, A 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 95B;

S, P 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 96;

L, H 또는 Q에 의해서 대체된 카바트 잔기 97.

하나의 구체예에서, 본 발명은 HCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3을 가지며, HCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 4를 가지고, HCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 5를 가지며, LCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 8을 가지고, LCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 9를 가지며, LCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 10을 갖는 CDRs의 세트를 포함하는 결합 성분이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 HCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 63을 가지고, HCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 64를 가지며, HCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 65를 가지고, LCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 68을 가지며, LCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 69를 가지고, LCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 70을 갖는 CDRs의 세트를 포함하는 결합 성분이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 HCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 23을 가지고, HCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 24를 가지며, HCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 25를 가지고, LCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 28을 가지며, LCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 29를 가지고, LCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 20을 갖는 CDRs의 세트를 포함하는 결합 성분이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 HCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 113을 가지고, HCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 114를 가지며, HCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 115를 가지고, LCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 118을 가지며, LCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 119를 가지고, LCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 120을 갖는 CDRs의 세트를 포함하는 결합 성분이다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 HCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 53을 가지고, HCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 54를 가지며, HCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 55를 가지고, LCDR1이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 58을 가지며, LCDR2가 아미노산 서열 SEQ ID NO: 59를 가지고, LCDR3이 아미노산 서열 SEQ ID NO: 60을 갖는 CDRs의 세트를 포함하는 결합 성분이다.

본 발명의 결합 성분은 IL-1R1에 대한 결합에 관해서 본 발명에 기술된 어떤 결합 성분과도 경쟁하거나 교차-경쟁하는 것일 수 있으며, 이들은 둘 다 IL-1R1을 결합시키며, VH 및/또는 VL 도메인, CDR, 예를 들어, HCDR3, 및/또는 본 발명에 기술된 CDRs의 세트와 같은 결합 성분, 예를 들어, 표 2에 기술된 항체를 포함한다. 결합 성분들 사이의 경쟁은 시험관내에서, 예를 들어, ELISA를 사용하고/하거나 동일한 에피토프 또는 중복성 에피토프에 결합하는 결합 성분을 확인할 수 있도록, 하나 이상의 다른 비태깅된 결합 성분의 존재 하에서 검출될 수 있는 하나의 결합 성분에 특정의 리포터 분자를 태깅함으로써 쉽게 시험할 수 있다. 이러한 방법은 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에게 쉽게 공지되어 있으며, 본 발명에 더 상세히 기술된다. 따라서, 본 발명의 추가의 관점은 인간 IL-1R1에 대한 결합에 관해서 VH 및/또는 VL 도메인 또는 CDR, 예를 들어, HCDR3 또는 항체 1 내지 10 중의 어떤 것의 CDRs의 세트를 포함하는 항체 분자와 경쟁하거나 교차-경쟁하는, IL-1R1에 대해 특이적인 결합 성분을 제공한다. 하나의 구체예에서, 본 발명의 결합 성분은 표 2의 항체 1 및/또는 항체 3과 경쟁하거나 교차-경쟁한다.

본 발명의 또 다른 구체예는 IL-1R1의 특정한 부분, 예를 들어, 에피토프에 결합하는 결합 성분을 제공한다. 구체적으로, 동일한 에피토프 또는 그의 일부분이 표 2에 열거된 항체 중의 어느 하나에 의해서 결합된다.

본 발명의 또 다른 구체예는 IL-1R1의 다음 서열 중의 하나 이상 내에 포함된 에피토프에 결합하는 분리된 결합 성분을 제공한다:

(i) N123-V134;

(ⅱ) L140-K157; 및/또는

(ⅲ) K178-R180.

본 발명의 또 다른 구체예는 IL-1R1의 다음 서열 내에 포함된 불연속적 에피토프에 결합하는, 청구항 16에 따른 IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분을 제공한다:

(i) N123-V134;

(ⅱ) L140-K157; 및

(ⅲ) K178-R180.

추가의 관점에서, 본 발명은 인간 IL-1R1에 대한 결합에 관해서 항체 항원 결합 부위와 경쟁하거나 교차-경쟁하는 인간 항체 항원 결합 부위를 포함하는 결합 성분을 제공하며, 여기에서 항체 항원 결합-부위는 VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성되고, VH 및 VL 도메인은 모 (항체 1 또는 항체 4)의, 또는 표 2에 열거된 항체 2 내지 3 또는 5 내지 10 중의 어떤 것의 CDRs의 세트를 포함한다.

어떤 적합한 방법이라도 결합 성분에 의해서 결합된 잔기의 서열을 결정하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, PEPSCAN-기본 효소 결합된 면역시험 (ELISA)과 같은 펩타이드 결합 스캔이 사용될 수 있다. PEPSCAN 시스템에 의해서 제공된 종류와 같은 펩타이드 결합 스캔에서는, 항원으로부터 유도된 짧은 중복성 펩타이드가 결합 성분에 대한 결합에 관해서 체계적으로 스크리닝된다. 펩타이드는 지지체 표면에 공유적으로 커플링되어 펩타이드의 어레이를 형성할 수 있다. 펩타이드는 선형이거나 속박된 배좌로 존재할 수 있다. 속박된 배좌는 펩타이드 서열의 각 말단에서 말단 Cys 잔기를 갖는 펩타이드를 사용하여 생산될 수 있다. Cys 잔기는 펩타이드가 루프형 배좌로 유지되도록 지지체 표면에 직접 또는 간접적으로 공유적으로 커플링될 수 있다. 따라서, 이 방법에서 사용된 펩타이드는 항원의 단편에 상응하는 펩타이드 서열의 각 말단에 부가된 Cys 잔기를 가질 수 있다. 이중 루프형 펩타이드가 사용될 수도 있으며, 여기에서 Cys 잔기는 추가로 펩타이드 서열의 중간에 또는 중간 부근에 위치한다. Cys 잔기는 펩타이드가 하나의 루프가 중앙 Cys 잔기의 양쪽에 있는 이중-루프형 배좌를 형성하도록 지지체 표면에 직접 또는 간접적으로 공유적으로 커플링될 수 있다. 펩타이드는 합성적으로 생성될 수 있으며, 따라서 Cys 잔기는 IL-1R1 서열에 천연적으로 존재하지 않음에도 불구하고 원하는 위치에서 조작될 수 있다. 임의로, 선형 및 속박된 펩타이드는 둘 다 펩타이드 결합시험에서 스크리닝될 수 있다. 펩타이드 결합 스캔은 결합 성분이 결합하는 펩타이드의 세트를 확인하고 (예를 들어, ELISA를 사용) (여기에서, 펩타이드는 IL-1R1의 단편에 상응하는 아미노산 서열을 갖는다 (예를 들어, IL-1R1의 약 5, 10 또는 15 개의 인접한 잔기의 펩타이드)), 결합 성분에 의해서 결합된 잔기의 족적 (footprint) (여기에서, 족적은 중복성 펩타이드에 대해서 공통적인 잔기를 포함한다)을 결정하기 위해서 펩타이드를 정렬하는 것을 수반할 수 있다.

대신으로, 또는 추가로, 펩타이드 결합 스캔 방법은 적어도 소정의 시그날:잡음 비로 결합 성분이 결합하는 펩타이드를 확인하는 것을 수반할 수 있다. 결합을 결정하는데 적합한 펩타이드 결합 스캔 방법의 상세한 내용은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 본 기술분야에서 잘 알려져 있고, 항체에 의해서 결합된 잔기를 결정하고/하거나 펩타이드 결합 스캔 결과를 확인하기 위하여 사용될 수 있는 다른 방법에는 부위 지시된 돌연변이유발, 수소 중수소 교환, 질량 분광분석, NMR, 및 X-선 결정학이 포함된다.

본 발명의 결합 성분은 항체 분자 또는 그의 결합 단편, 바람직하게는 인간 항체 분자 또는 인간화된 항체 분자 또는 그의 결합 단편일 수 있다. 항체는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 수득될 수 있는, 특히 인간, 쥐, 키메릭 또는 인간화된 기원의 모노클로날 항체일 수 있다.

비록 이하에 나타내는 바와 같이 CDRs가 비-항체 스캐폴드 (scaffolds)에 의해서 운반될 수 있지만, 본 발명의 CDR 또는 CDRs의 세트를 운반하는 구조는 일반적으로 항체 중쇄 또는 경쇄 서열 또는 그의 상당한 부분일 수 있으며, 여기에서 CDR 또는 CDRs의 세트는 재배열된 면역글로불린 유전자에 의해서 코드화된 천연적으로 존재하는 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR 또는 CDRs의 세트에 상응하는 위치에 위치한다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 문헌 [Kabat, et al., 1987 (36)] 및 어떤 인터넷 탐색 엔진을 사용하여 "카바트 Kabat)"로 찾을 수 있는 그의 업데이트를 참고로 하여 결정될 수 있다.

본 발명의 항체는 통상적으로 항체 VH 및/또는 VL 도메인을 포함한다. 본 발명의 VH 도메인은 HCDRs의 세트를 포함하며, VL 도메인은 LCDRs의 세트를 포함한다. 항체 분자는 VH CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VH 도메인 및 골격을 포함할 수 있다. 이것은 대신으로, 또는 또한 VL CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 VL 도메인 및 골격을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 VH 도메인의 예는 SEQ ID NO: 22이며, 본 발명의 항체 VL 도메인의 예는 SEQ ID NO: 27이다.

본 발명은 표 2에서의 항체 중의 어떤 것의 HCDR1 및/또는 HCDR2 및/또는 HCDR3 및/또는 표 2에서의 항체 중의 어떤 것의 LCDR1 및/또는 LCDR2 및/또는 LCDR3을 포함하는 결합 성분을 제공한다. 결합 성분은 VH CDRs의 세트를 포함할 수 있으며, 임의로 이것은 또한 VL CDRs의 세트를 포함할 수도 있고, VL CDRs는 VH CDRs와 동일하거나 상이한 항체로부터 유래할 수 있다.

이하에 더 거론되는 바와 같이 VH 또는 VL 도메인 단독으로도 항원을 결합시키기 위해서 사용될 수 있지만, 전형적으로 VH 도메인은 VL 도메인과 짝을 이루어 항체 항원 결합-부위를 제공한다. 예를 들어, 항체 1 VH 도메인 (참조: 표 2)은 항체 1 VL 도메인과 짝을 이루어 항체 1 VH 및 VL 도메인 둘 다를 포함하는 항체 항원 결합-부위가 형성될 수 있다. 유사한 구체예가 본 발명에 기술된 다른 VH 및 VL 도메인에 대해서 제공된다. 다른 구체예에서, 항체 1 VH는 항체 1 이외의 다른 VL 도메인과 짝을 이룬다. 경쇄 난잡성 (promiscuity)은 본 기술분야에서 잘 정립되어 있다. 역시, 유사한 구체예는 본 발명에 의해서 본 발명에 기술된 다른 VH 및 VL 도메인에 대해서 제공된다. 따라서, 표 2에서의 항체 중의 어떤 것의 VH는 표 2에서의 동일하거나 어떤 다른 항체의 VL과 짝을 이룰 수 있다.

본 발명의 추가의 관점은 표 2에 나타낸 항체 중의 어떤 것의 VH 도메인과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하거나, 표 1a 또는 1b에 나타낸 HCDRs의 세트 (예를 들어, HCDR1, HCDR2, 및/또는 HCDR3)를 포함하는 항체 분자이다. 항체 분자는 또한 임의로, 항체 1 내지 28 중의 어떤 것의 VL 도메인과, 또는 표 1a 또는 1b에 나타낸 LCDRs의 세트 (예를 들어, LCDR1, LCDR2, 및/또는 LCDR3)와 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 2 개의 아미노산 서열의 동일성 %를 계산하기 위해서 사용될 수 있는 알고리듬 (algorithms)은 예를 들어, BLAST (37), FASTA (38), 또는 디폴트 (default) 파라메터를 사용하는 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리듬을 포함한다.

본 발명의 결합 성분은 항체 불변 부분 또는 그의 일부분, 예를 들어, 인간 항체 불변 부분 또는 그의 일부분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인은 인간 Cκ 또는 Cλ 쇄를 포함하는 항체 경쇄 불변 도메인에 그의 C-말단 종단에서 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인을 기초로 하는 결합 성분은 항체 이소타입, 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 이소타입 서브-클래스 중의 어떤 것, 특히 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 유도된 면역글로불린 중쇄의 모두 또는 일부 (예를 들어, CH1 도메인)에 대해 그의 C-말단 종단에서 부착될 수 있다. IgG1이 그의 제조의 용이성 및 안정성, 예를 들어, 반감기로 인하여 유리하다. 결합 성분 기능 및/또는 특성을 변조시키는, 예를 들어, 가변 부분을 안정화시키는 어떤 합성적 또는 다른 불변 부분이 본 발명에서 또한 유용할 수 있다.

더구나, 본 발명에 따르면 본 발명에 기술된 아미노산 서열, 특히 인간 중쇄 불변 부분의 아미노산 서열은 서열을 원하는 알로타입 (allotype), 예를 들어, 백인 집단에서 발견되는 알로타입에 순응하도록 변형시키는 것이 바람직할 수 있다.

결합 성분은 항체 골격 내에 하나 이상의 CDRs, 예를 들어, CDRs의 세트를 갖는 항체 분자, 또는 그의 결합 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체의 하나 이상의 CDRs 또는 CDRs의 세트를 골격 (예를 들어, 인간 골격) 내로 이식하여 항체 분자를 제공할 수 있다. 골격 부분은 인간 배선 (germline) 유전자 서열의 것일 수 있거나, 비-배선화될 수 있다. 따라서, 골격은 배선화될 수 있으며, 여기에서 골격 내의 하나 이상의 잔기는 가장 유사한 인간 배선 골격에서의 상응하는 위치에서의 잔기와 부합하도록 변화된다. 따라서, 본 발명의 결합 성분은 인간 배선 골격, 예를 들어, 인간 배선 IgG VH 골격 내에 HCDRs의 세트를 포함하는 VH 도메인을 갖는 분리된 인간 항체 분자일 수 있다. 결합 성분은 또한, 예를 들어, 인간 배선 IgG VL 골격 내에 LCDRs의 세트를 포함하는 VL 도메인을 갖는다.

VH 및/또는 VL 골격 잔기는 본 발명에서 거론되고 예시된 바와 같이, 예를 들어, 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 변형될 수 있다. 본 발명에 따른 VH 또는 VL 도메인, 또는 이러한 VL 도메인을 포함하는 결합 성분은 바람직하게는 표 2의 항체의 VH 및/또는 VL 도메인 서열을 가지며, 본 발명의 HCDR3을 포함한다.

비-배선화된 항체 분자는 배선화된 항체 분자와 비교하여 동일한 CDRs을 갖지만 골격은 상이하다. 배선화된 항체는 이들 항체에 대해서 본 발명에 나타낸 VH 및 VL 도메인 서열의 골격 부분을 배선화함으로써 생산될 수 있다.

하나 이상의 골격 부분 및/또는 하나 이상의 CDRs에서 변경이 이루어질 수 있다. 변경은 통상적으로 기능의 상실을 야기하지 않으며, 따라서 이렇게 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 성분은 IL-1R1을 결합시키고/시키거나 중화시키는 능력을 유지하여야 한다. 이것은 예를 들어, 본 발명에 기술된 시험방법에서 측정되는 것으로서, 변경이 이루어지지 않는 결합 성분과 동일한 정량적 결합 및/또는 중화 능력을 보유할 수 있다. 이렇게 변경된 아미노산 서열을 포함하는 결합 성분은 IL-1R1을 결합시키고/시키거나 중화시키는 개선된 능력을 가질 수 있다.

변경은 하나 이상의 아미노산 잔기(들)를 천연적으로 존재하지 않거나 비-표준 아미노산으로 대체시키거나, 하나 이상의 아미노산 잔기를 천연적으로 존재하지 않거나 비-표준 형태로 변형시키거나, 하나 이상의 천연적으로 존재하지 않거나 비-표준 아미노산을 서열 내에 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 서열에서 변경의 수 및 위치의 예는 본 발명의 다른 곳에 기술된다. 천연적으로 존재하는 아미노산은 그들의 표준 단일-문자 코드에 의해서 G, A, V, L, I, M, P, F, W, S, T, N, Q, Y, C, K, R, H, D, E로 확인된 20 개의 "표준" L-아미노산을 포함한다. 비-표준 아미노산은 폴리펩타이드 골격 내로 혼입될 수 있거나, 기존의 아미노산 잔기의 변형으로 유래할 수 있는 어떤 다른 잔기를 포함한다. 비-표준 아미노산은 천연적으로 존재하거나 천연적으로 존재하지 않을 수 있다. 4-하이드록시프롤린, 5-하이드록시리신, 3-메틸히스티딘, N-아세틸세린 등과 같은 몇 개의 천연적으로 존재하는 비-표준 아미노산은 본 기술분야에서 공지되어 있다 (40). 그들의 N-알파 위치에서 유도체화된 이들 아미노산 잔기는 단지 아미노산 서열의 N-말단에 위치할 수 있다. 통상적으로, 본 발명에서 아미노산은 L-아미노산이지만, 이것은 D-아미노산일 수도 있다. 따라서, 변경은 L-아미노산을 D-아미노산으로 변형시키거나, L-아미노산을 D-아미노산으로 대체시키는 것을 포함할 수 있다. 아미노산의 메틸화, 아세틸화 및/또는 인산화된 형태도 또한 공지되어 있으며, 본 발명에서 아미노산은 이러한 변형의 대상이 될 수 있다.

본 발명의 항체 영역 및 결합 성분의 아미노산 서열은 상술한 비-천연 또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다. 비-천연 아미노산 (예를 들어, D-아미노산)은 합성 중에, 또는 아미노산 서열의 합성 후에 "원래의" 표준 아미노산을 변형 또는 대체시킴으로써 아미노산 서열 내로 혼입될 수 있다.

비-천연 및/또는 천연적으로 존재하지 않는 아미노산의 사용은 구조적 및 기능적 다양성을 증가시키며, 따라서 본 발명의 결합 성분에서 바람직한 IL-1R1 결합 및 중화 특성을 달성하는 잠재력을 증가시킬 수 있다. 추가로, D-아미노산 및 유사체는 동물, 예를 들어, 인간에게 투여한 후에 L-아미노산을 갖는 폴리펩타이드의 생체내 분해로 인하여, 표준 L-아미노산에 비해서 더 우수한 약력학적 프로필을 갖는 것으로 나타났다.

본 발명의 CDR-유도된 서열을 운반하는 신규의 VH 또는 VL 부분은 전체 가변 도메인 내에 돌연변이를 생성시키는 하나 이상의 선택된 VH 및/또는 VL 유전자의 랜덤 돌연변이유발을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 기술은 오류-경향 (error-prone) PCR을 사용한 문헌 [Gram et al. (41)]에 기술된다. 일부의 구체예에서는, 하나 또는 2 개의 아미노산 치환이 전체 가변 도메인 또는 CDRs의 세트 내에 만들어진다.

사용될 수 있는 또 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 부분에 대한 돌연변이유발을 지시하는 것이다. 이러한 기술은 문헌 [Barbas et al. (42) 및 Schier et al. (43)]에 기술되어 있다.

상술한 기술은 모두 그 자체로서 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 숙련된 전문가는 본 기술분야에서의 일상적인 방법을 사용하여 본 발명의 결합 성분을 제공하기 위해서 이러한 기술을 사용할 수 있을 것이다.

본 발명의 추가의 관점은 본 발명에 설명된 VH 도메인의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실, 치환 또는 삽입을 제공하고, 임의로 이렇게 제공된 VH 도메인을 하나 이상의 VL 도메인과 조합하고, VH 도메인 또는 VH/VL 조합 또는 조합들을 시험하여, 임의로 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들어, IL-1R1 활성을 중화시키는 능력을 갖는, IL-1R1에 대한 결합 성분 또는 항체 항원 결합-부위를 확인하는 것을 포함하여, IL-1R1에 대한 항체 항원 결합-부위를 수득하는 방법을 제공한다. 상기의 VL 도메인은 실질적으로 본 발명에 설명된 바와 같은 아미노산 서열을 가질 수 있다. 본 발명에 기술된 VL 도메인의 하나 이상의 서열 변이체가 하나 이상의 VH 도메인과 조합되는 유사한 방법이 사용될 수 있다.

그의 서열이 본 발명에 구체적으로 기술된 VH 및 VL 도메인 중의 어떤 것의 가변 도메인 아미노산 서열 변이체는 언급된 바와 같이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 개개의 변이체는 하나 이상의 아미노산 서열 변경 (아미노산 잔기의 부가, 결실, 치환 및/또는 삽입)을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 변이체는 약 20 개 미만, 15 개 미만, 10 개 미만 또는 5 개 미만의 이러한 변경을 갖는다.

상기 언급한 바와 같이, 실질적으로 본 발명에 설명된 바와 같은 CDR 아미노산 서열은 인간 항체 가변 도메인 또는 그의 상당한 부분 내의 CDR로서 운반될 수 있다. 실질적으로 본 발명에 설명된 바와 같은 HCDR3 서열은 본 발명의 구체예를 나타내며, 이들의 각각은 임의로 본 발명의 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3과 함께, 인간 중쇄 가변 도메인 또는 그의 상당한 부분 내에서 HCDR3으로 운반될 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 또한, 항체 항원 결합-부위를 포함하는 항체의 단편을 포함한다. 항체의 단편은 재조합 DNA 기술에 의해서, 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 분할에 의해서 생산된다. 항체 항원 결합-부위를 포함하는 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd 및 디설파이드 안정화된 가변 부분 (dsFv)과 같은 분자를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들어, Fab₂, Fab₃, 디아바디 (diabodies), 트리아바디 (triabodies), 테트라바디 (tetrabodies) 및 미니바디 (minibodies)를 포함하는, 하나 이상의 항체 항원 결합-부위를 포함하는 다양한 다른 항체 분자가 조작되었다. 항체 분자 및 그들의 구성 방법은 문헌 [Holliger & Hudson (44)]에 기술되어 있다.

전체 항체의 단편은 결합 항원의 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, 불변 경쇄 도메인 (CL) 및 불변 중쇄 도메인 1 (CH1)으로 구성된 Fab 단편; (ⅱ) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (ⅲ) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (iv) VH 또는 VL 도메인으로 구성된 dAb 단편 (45, 46, 47); (v) 분리된 CDR 부분; (vi) 2 개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vⅱ) VH 도메인 및 VL 도메인이, 2 개의 영역이 회합하여 항원 결합 부위를 형성하도록 허용하는 펩타이드 링커에 의해서 연결된 단일쇄 Fv 분자 (scFv) (48, 49); (vⅲ) 이중특이성 단일쇄 Fv 다이머 (예를 들어, WO 1993/011161에 기술된 바와 같음); 및 (ix) 유전자 융합에 의해서 구성된 다가 또는 다중특이성 단편인 "디아바디" (예를 들어, WO94/13804 및 (50)에 기술된 바와 같음)이다. Fv, scFv 또는 디아바디 분자는 VH 및 VL 도메인을 연결하는 디설파이드 브릿지를 혼입시킴으로써 안정화될 수 있다 (51). CH3 도메인에 접합된 scFv를 포함하는 미니바디도 또한 만들어질 수 있다 (52). 결합 단편의 다른 예는 항체 힌지 (hinge) 부분으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함한, 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단의 몇 개의 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과는 상이한 Fab', 및 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 제공하는 Fab' 단편인 Fab'-SH이다.

본 발명의 항체 단편은 모항체 분자 (항체 1 또는 4) 또는 항체 분자 2, 3, 5 내지 10 중의 어떤 것으로부터 출발하여 효소, 예를 들어, 펩신 또는 파파인에 의한 분해 및/또는 화학적 환원에 의한 디설파이드 브릿지의 분할과 같은 방법에 의해서 수득될 수 있다. 또 다른 방식으로, 본 발명에 포함된 항체 단편은 마찬가지로 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 유전자 재조합의 기술에 의해서, 또는 추가로 예를 들어, 회사 Applied Biosystems Inc. (Foster City, California, USA)에 의해서 공급되는 것과 같은 자동 펩타이드 합성기를 이용한 펩타이드 합성에 의해서, 또는 핵산 합성 및 발현에 의해서 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 기능적 항체 단편은 화학적 변형에 의해서, 예를 들어, PEG화에 의해서, 또는 리포좀 내에 혼입시킴으로써 그의 반감기가 증가되는 모든 기능적 단편을 포함한다.

dAb (영역 항체)는 항체의 작은 모노머성 항체 결합 단편, 즉 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변 부분이다 (47). VH dAbs는 카멜리드 (camelids) (예를 들어, 낙타, 라마)에 천연적으로 존재하며, 카멜리드를 표적 항원으로 면역시키고, 항원-특이적 B 세포를 분리하고, 개개 B 세포로부터 dAb를 직접 클로닝함으로써 생산될 수 있다. dAbs는 또한 세포 배양에서 생산될 수도 있다. 이들의 작은 크기, 우수한 용해성 및 온도 안정성은 이들이 특히 생리학적으로 유용하고, 선택 및 친화성 성숙에 적합하도록 한다. 카멜리드 VH dAbs는 "나노바디 (nanobodies™)"라는 명칭으로 치료학적 용도를 위해서 개발되고 있다. 본 발명의 결합 성분은 실질적으로 본 발명에 설명된 바와 같은 VH 또는 VL 도메인, 또는 실질적으로 본 발명에 설명된 바와 같은 CDRs의 세트를 포함하는 VH 또는 VL 도메인을 포함하는 dAb일 수 있다.

본 발명의 항체는 이중특이성 항체를 포함한다. 이중특이성 또는 이중기능성 항체는 2 개의 상이한 가변 부분이 동일한 분자 내에서 조합된 모노클로날 항체의 제2 세대를 형성한다 (53). 이들의 사용은 진단적 분야에서, 및 새로운 효과기 기능을 동원하거나 종양 세포의 표면에 대해 몇 개의 분자를 표적화하는 그들의 능력으로 인하여 치료 분야에서 모두 입증되었다. 이중특이성 항체가 사용되는 경우에, 이들은 다양한 방법 (51)으로 제조될 수 있는, 예를 들어, 화학적으로 제조되거나 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상적인 이중특이성 항체일 수 있거나, 상기 언급된 이중특이성 항체 단편 중의 어떤 것이라도 될 수 있다. 이들 항체는 화학적 방법 (55, 56) 또는 체세포적 (somatic) 방법 (57, 58)에 의해서 수득될 수 있지만, 마찬가지로 선택적으로는 강제로 헤테로다이머화되도록 하고, 따라서 원하는 항체의 정제과정을 촉진시키는 유전자 조작기술 (59)에 의해서도 수득될 수 있다. 이중특이성 항체의 예로는 상이한 특이성을 갖는 2 개의 항체의 결합 도메인이 사용되고, 짧은 유연성 펩타이드를 통해서 직접 연결될 수 있는 BiTE™ 기술의 항체가 포함된다. 이것은 짧은 단일 폴리펩타이드 쇄 상에서 2 개의 항체를 조합한다. 디아바디 및 scFv는 단지 가변 도메인만을 사용하여 Fc 부분이 없이 구성되어 잠재적으로 항-이디오타입 반응의 효과를 감소시킬 수 있다.

이중특이성 항체는 전체 IgG로서, 이중특이성 Fab'2로서, Fab'PEG로서, 디아바디로서, 또는 추가로 이중특이성 scFv로서 구성될 수 있다. 추가로, 2 개의 이중특이성 항체는 본 기술분야에서 공지된 일상적인 방법을 사용하여 연결되어 4가 항체를 형성할 수 있다.

이중특이성 전체 항체와는 대조적으로, 이중특이성 디아바디가 또한 특히 유용할 수 있는데, 이는 이들이 이. 콜라이 (E. coli) 내에서 쉽게 구성되고 발현될 수 있기 때문이다. 적절한 결합 특이성의 디아바디 (및 항체 단편과 같은 다수의 다른 폴리펩타이드)는 라이브러리로부터의 파지 디스플레이 (phage display) (WO 1994/13804)를 사용하여 쉽게 선택될 수 있다. 항체의 하나의 팔이 예를 들어, IL-1R1에 대해 지시된 특이성을 가지고 일정하게 유지된다면, 다른 팔이 변화된 라이브러리가 만들어질 수 있고, 적절한 특이성의 항체가 선택될 수 있다. 이중특이성 전체 항체는 문헌 [Ridgeway et al. (60)]에 기술되거나, WO 1996/27011, WO 1998/50431 및 WO 2006/028936에 기술된 바와 같은 대체 조작방법에 의해서 만들어질 수 있다.

대신으로, 본 발명의 결합 성분은 통상적으로 하나 이상의 CDRs, 예를 들어, 이하에 더 언급되는 바와 같은 비-항체 단백질 스캐폴드 내의 CDRs의 세트에 의해서 제공된 비-항체 분자 내의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다.

항원 결합 부위는 피브로넥틴 또는 사이토크롬 B 등과 같은 비-항체 단백질 스캐폴드 상에 CDRs를 정렬시킴으로써 (61, 62, 63), 또는 단백질 스캐폴드 내에서 루프의 아미노산 잔기를 램덤화하거나 돌연변이시켜 원하는 표적에 대한 결합 특이성을 부여함으로써 제공될 수 있다. 단백질 내의 신규한 결합 부위를 조작하기 위한 스캐폴드는 문헌 [Nygren et al. (63)]에서 상세하게 검토되었다. 항체 모방체 (mimics)를 위한 단백질 스캐폴드는 본 발명에 온전히 참고로 포함된 WO200034784에 기술되어 있으며, 여기에서 발명자들은 적어도 하나의 램덤화된 루프를 갖는 피브로넥틴 타입 III 영역을 포함하는 단백질 (항체 모방체)을 기술하였다. 하나 이상의 CDRs, 예를 들어, HCDRs의 세트를 이식하는데 적합한 스캐폴드는 면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리의 어떤 영역 성분에 의해서라도 제공될 수 있다. 스캐폴드는 인간 또는 비-인간 단백질일 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드의 이점은 이것이 적어도 일부의 항체 분자보다 더 작고/작거나 제조하기가 더 쉬운 스캐폴드 분자 내에 항원 결합 부위를 제공할 수 있다는 점이다. 결합 성분의 작은 크기는 세포에 들어가거나, 조직 내로 깊게 침투하거나 다른 구조 내의 표적에 도달하거나, 표적 항원의 단백질 공동 내에 결합하는 능력과 같은 유용한 생리학적 특성을 부여할 수 있다. 비-항체 단백질 스캐폴드 내의 항원 결합 부위의 사용은 문헌 [Wess, 2004 (64)]에서 검토되었다. 대표적인 것은 안정한 중추 (backbone) 및 하나 이상의 가변성 루프를 갖는 단백질이며, 여기에서 루프 또는 루프들의 아미노산 서열은 특이적으로 또는 무작위적으로 돌연변이되어 표적 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 발생시킨다. 이러한 단백질은 스타필로코커스 아루레우스 (S. aureus)로부터의 단백질 A의 IgG 결합 도메인, 트랜스페린, 테트라넥틴, 피브로넥틴 (예를 들어, 제10 피브로넥틴 타입 III 영역), 리포칼린뿐만 아니라 감마-결정성 및 그 밖의 다른 Affilin™ 스캐폴드 (Scil 단백질)를 포함한다. 다른 접근방법의 예로는 분자내 디설파이드 결합을 갖는 작은 단백질인 사이클로타이드 (cyclotides)를 기본으로 하는 합성 "마이크로바디 (Microbodies)", 마이크로단백질 (Versabodies™, Amunix Inc, Mountain View, California, USA) 및 안키린 반복 단백질 (ankyrin repeat proteins) (DARPins, Molecular Partners AG, Zurich-Schlieren, Switzerland)이 포함된다. 이러한 단백질은 또한 예를 들어, 면역-도메인 (immuno-domains) (예를 들어, 미국 특허공개 제2003/082630 및 2003/157561호 참조)과 같은 작은 조작된 단백질 영역을 포함한다. 면역-도메인은 항체의 적어도 하나의 상보성 결정 부분 (CDR)을 함유한다.

본 발명에 따른 결합 성분은 예를 들어, 접힌 영역과 같은 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 형성하거나, 항원에 결합하는 능력 이외에 또 다른 기능적 특징을 분자에게 부여하는 다른 아미노산을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 성분은 검출가능한 라벨을 가질 수 있거나, 독소 또는 표적화 부위 또는 효소에 (예를 들어, 펩티딜 결합 또는 링커를 통해서) 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 결합 성분은 촉매적 부위 (예를 들어, 효소 영역 내에)뿐만 아니라 항원 결합 부위를 포함할 수 있으며, 여기에서 항원 결합 부위는 항원에 결합함으로써 촉매적 부위를 항원에 대해 표적화한다. 촉매적 부위는 예를 들어, 분할에 의해서 항원의 생물학적 기능을 억제할 수 있다.

본 발명은 또한, 결합 성분, 예를 들어, 변형된 Fc 부분을 갖는 항체의 생물학적 효과 기능을 변화시키도록, 즉 증가, 감소 또는 제거하도록 변형된 결합 성분을 포함한다. 일부의 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체는 보체를 고정시키고, 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 참여하는 그들의 능력을 증진시키도록 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 결합 성분 또는 항체는 효과기 세포를 활성화시키고, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에 참여하는 그들의 능력을 증진시키도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체는 효과기 세포를 활성화시키고, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에 참여하는 그들의 능력을 증진시키도록, 및 보체를 고정시키고, 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 참여하는 그들의 능력을 증진시키도록 모두 변형될 수 있다.

일부의 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체는 보체를 고정시키고, 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 참여하는 그들의 능력을 감소시키도록 변형될 수 있다. 다른 구체예에서, 결합 성분 또는 항체는 효과기 세포를 활성화시키고, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에 참여하는 그들의 능력을 감소시키도록 변형될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체는 효과기 세포를 활성화시키고, 항체 의존성 세포독성 (ADCC)에 참여하는 그들의 능력을 감소시키도록, 및 보체를 고정시키고, 보체 의존성 세포독성 (CDC)에 참여하는 그들의 능력을 감소시키도록 모두 변형될 수 있다.

특정의 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체, 및 본 발명의 조성물의 반감기는 적어도 약 4 내지 7일이다. 특정의 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체, 및 본 발명의 조성물의 평균 반감기는 적어도 약 2 내지 5일, 3 내지 6일, 4 내지 7일, 5 내지 8일, 6 내지 9일, 7 내지 10일, 8 내지 11일, 8 내지 12, 9 내지 13, 10 내지 14, 11 내지 15, 12 내지 16, 13 내지 17, 14 내지 18, 15 내지 19, 또는 16 내지 20일이다. 다른 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체, 및 본 발명의 조성물의 평균 반감기는 적어도 약 17 내지 21일, 18 내지 22일, 19 내지 23일, 20 내지 24일, 21 내지 25일, 22 내지 26일, 23 내지 27일, 24 내지 28일, 25 내지 29일, 또는 26 내지 30일이다. 또한 추가의 구체예에서, 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체, 및 본 발명의 조성물의 반감기는 약 50일까지일 수 있다. 특정의 구체예에서, 항체 및 본 발명의 조성물의 반감기는 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서 연장될 수 있다. 이러한 연장은 다시 항체 조성물의 양 및/또는 투약 빈도를 감소시킬 수 있다. 개선된 생체내 반감기를 갖는 항체 및 이들을 제조하는 방법은 미국 특허 제6,277,375호; 및 국제공보 제 WO 1998/23289 및 WO 1997/3461호에 기술되어 있다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 용기를 포함하는 제품을 제공한다. 용기는 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체를 함유하는 조성물, 및 조성물이 IL-1R1과 연관된 장애를 치료하기 위해서 사용될 수 있는 것을 나타내는 포장 삽입지 또는 라벨을 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 기술된 바와 같은 결합 성분 또는 항체를 함유하는 조성물, 및 조성물을 치료가 필요한 대상체에게 투여하는 설명서를 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 변이체 Fc 부분, 즉 천연적으로 존재하지 않는 Fc 부분, 예를 들어, 하나 이상의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함하는 Fc 부분을 포함하는 단백질의 제제를 제공한다. 또한, 본 발명의 변이체 Fc 부분은 아미노산 결실, 부가 및/또는 변형을 포함하는 Fc 부분이다.

Fc 부분을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 Fc 부분의 FcRn에 대한 결합 친화성을 증가시킴으로써 증가시킬 수 있다. 하나의 구체예에서, Fc 변이체 단백질은 비교할 수 있는 분자에 비해서 증진된 혈청 반감기를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 239, 330 및 332로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 239D, 330L 및 332E로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 임의로, Fc 부분은 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252, 254, 및 256으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 추가의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 239D, 330L 및 332E로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산, 및 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252Y, 254T 및 256E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234, 235 및 331로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 추가의 특정한 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235F, 및 331S의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 본 발명의 Fc 변이체는 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235Y, 및 331S의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산 잔기를 포함한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235E 및 331S로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 또 다른 특정한 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235E 및 331S로 구성된 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다. 임의로, Fc 부분은 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252, 254, 및 256으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 추가의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산; 및 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252Y, 254T 및 256E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 239, 330 및 332로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 239D, 330L 및 332E로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 임의로, Fc 부분은 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252, 254, 및 256으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 추가의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 239D, 330L 및 332E로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산, 및 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252Y, 254T 및 256E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234, 235 및 331로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다. 임의로, Fc 부분은 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252, 254, 및 256으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 추가의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 본 발명은 Fc 부분이 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 234F, 235F, 235Y, 및 331S로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산; 및 카바트에서 설명된 바와 같은 EU 인덱스에 의해서 매겨진 번호로 252Y, 254T 및 256E로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 적어도 하나의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산을 포함하는 Fc 변이체 단백질 제제를 제공한다.

천연적으로 존재하지 않는 Fc 부분을 생성시키는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 아미노산 치환 및/또는 결실은 부위-지시된 돌연변이유발 [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)], PCR 돌연변이유발 [Higuchi, in "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, pp. 177-183 (1990)], 및 카세트 (cassette) 돌연변이유발 [Wells et al., Gene 34:315-323 (1985)]를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 돌연변이유발 방법에 의해서 생성될 수 있다. 바람직하게는, 부위-지시된 돌연변이유발은 중복-연장 (overlap-extension) PCR 방법 [Higuchi, in "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press, New York, pp. 61-70 (1989)]에 의해서 수행된다. 중복-연장 PCR [Higuchi, ibid.]의 기술은 또한, 어떤 바람직한 돌연변이(들)를 표적 서열 (출발 DNA) 내에 도입시키기 위해서 사용될 수도 있다. 예를 들어, 중복-연장 방법에서 PCR의 제1 라운드는 표적 서열을 외측 프라이머 (outside primer) (프라이머 1) 및 내부 돌연변이유발 프라이머 (프라이머 3)로, 및 별도로 제2 외측 프라이머 (프라이머 4) 및 내부 프라이머 (프라이머 2)로 증폭시켜 2 개의 PCR 절편 (절편 A 및 B)을 수득하는 것을 포함한다. 내부 돌연변이유발 프라이머 (프라이머 3)는 원하는 돌연변이(들)를 명시하는 표적 서열에 대한 미스매치 (mismatches)를 함유하도록 디자인된다. PCR의 제2 라운드에서는, PCR의 제1 라운드의 생성물 (절편 A 및 B)을 2 개의 외측 프라이머 (프라이머 1 및 4)를 사용하는 PCR에 의해서 증폭시킨다. 생성된 전체-길이 PCR 절편 (절편 C)을 제한효소로 분해시키고, 생성된 제한 단편을 적절한 벡터 내로 클로닝한다. 돌연변이유발의 제1 단계로는, 출발 DNA (예를 들어, Fc 융합 단백질, 항체, 또는 간단하게는 Fc 부분을 코드화함)를 돌연변이유발 벡터 내로 작동가능하게 클로닝시킨다. 프라이머는 원하는 아미노산 치환을 반영하도록 디자인된다. 변이체 Fc 부분을 생성시키는데 유용한 다른 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [예를 들어, 미국 특허 제5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 6,821,505; 6,277,375호; 미국 특허공개 제2004/0002587호 및 PCT 공개 제WO 94/29351; WO 99/58572; WO 00/42072; WO 02/060919; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 06/23403호 참조].

본 발명의 일부의 구체예에서, 본 발명에서 제공된 항체의 글리코실화 패턴은 ADCC 및 CDC 효과기 기능을 증진시키도록 변형된다 [참조: Shields RL et al., (2002) JBC. 277:26733; Shinkawa T et al., (2003) JBC. 278:3466, 및 Okazaki A et al., (2004) J. Mol. Biol., 336: 1239]. 일부의 구체예에서, Fc 변이체 단백질은 하나 이상의 조작된 당형태 (glycoforms), 즉 Fc 부분을 포함하는 분자에 공유적으로 부착된 탄수화물 조성물을 포함한다. 조작된 당형태는 효과기 기능을 증진시키거나 감소시키는 것을 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다양한 목적에 유용할 수 있다. 조작된 당형태는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 어떤 방법에 의해서라도, 예를 들어, 조작되거나 변이체 발현 스트레인을 사용함으로써, 하나 이상의 효소, 예를 들어, DI N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTI11)와의 공동-발현에 의해서, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주 내에서 Fc 부분을 포함하는 분자를 발현시킴으로써, 또는 Fc 부분을 포함하는 분자를 발현시킨 후에 탄수화물(들)을 변형시킴으로써 생성될 수 있다. 조작된 당형태를 생성시키는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 문헌 [Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 특허출원 제10/277,370호; 미국 특허출원 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1]에 기술된 것; Potillegent™ 기술 (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ 글리코실화 조작기술 (Glycart Biotechnology AG, Zurich, Switzerland) [참조: 예를 들어, WO 00/061739; EA01229125; US 20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49]을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

또한, Fc 부분의 글리코실화는 효과기 기능을 증가시키거나 감소시키도록 변형될 수 있다는 것이 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; 미국 특허 제6,602,684호; 미국 특허출원 제10/277,370호; 미국 특허출원 제10/113,929호; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent™ 기술 (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb™ 글리코실화 조작기술 (Glycart Biotechnology AG, Zurich, Switzerland)]. 따라서, 하나의 구체예에서 본 발명의 항체의 Fc 부분은 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화는 저하된 효과기 기능을 야기한다. 또 다른 구체예에서, 아미노산 잔기의 변경된 글리코실화는 증가된 효과기 기능을 야기한다. 특정의 구체예에서, Fc 부분은 감소된 푸코실화를 갖는다. 또 다른 구체예에서, Fc 부분은 비푸코실화된다 [참조: 예를 들어, 미국 특허출원공개 제2005/0226867호]. 또 다른 구체예에서, Fc 부분은 적어도 하나의 갈락토즈 부위가 α 2,6 연결에 의해서 각각의 말단 시알산 부위에 연결되는 경우와 같이 시알릴화된다 [참조: 예를 들어, 국제특허출원공개 제WO2009079382호].

결합 성분은 IL-1R1에 의해서 매개된 장애, 특히 류마티스성 관절염, 골관절염 (OA), 천식 및 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD)과 같은 염증성 장애를 치료 및/또는 예방하는데 유용하다. 결합 성분은 또한, HIV-1, 고체 종양, 백혈병, 알츠하이머병 및 허혈성 질환과 같은 IL-1R1에 의해서 매개된 장애를 치료 및/또는 예방하는데 유용하다.

본 발명의 추가의 관점은 본 발명의 결합 성분을 함유하는 조성물, 및 치료에 의해서 인간 또는 동물 신체를 치료하는 방법을 포함한 IL-1R1을 억제하고/하거나 중화시키는 방법에서의 이들의 용도를 제공한다.

예를 들어, 본 발명에 따른 결합 성분은 인간 또는 동물 신체에서 (예를 들어, 인간 환자에게서), 또는 시험관내에서 생물학적 반응, 질병, 장애 또는 상태를 치료 및/또는 예방하는 방법에서 사용되거나, 이들을 진단하는 방법에서 사용될 수 있다.

치료 및/또는 예방하는 방법은 상기 환자에게 IL-1R1을 측정가능하게 중화시키는데 충분한 양으로 본 발명의 결합 성분을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 치료할 수 있는 상태에는 COPD 및 천식과 같이 IL-1R1이 역할을 하는 모든 것이 포함된다.

본 발명의 결합 성분은 인간 또는 동물 대상체, 특히 인간에게서의 진단 또는 치료의 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 성분은 인간 또는 동물 대상체, 특히 인간에게서의 진단 또는 치료의 방법에서 사용하는 의약의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명은 추가로, 인간 또는 동물 대상체, 특히 인간에게서의 진단 또는 치료를 위한 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 치료는 IL-1R1에 의해서 매개된 생물학적 효과를 특징으로 하는 장애, 특히 류마티스성 관절염, 골관절염 (OA), 천식 및 COPD와 같은 염증성 장애를 포함한다.

따라서, 본 발명은 포유동물에게 본 발명의 결합 성분을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 류마티스성 관절염, 골관절염, 천식 및 COPD와 같은 염증성 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 류마티스성 관절염, 골관절염, 천식 및 COPD와 같은 염증성 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 류마티스성 관절염, 골관절염, 천식 및 COPD와 같은 염증성 장애의 치료를 위한 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 하나의 구체예에서, 포유동물은 인간이고, 또 다른 구체예에서 포유동물은 비-인간 동물이다. 하나의 구체예에서, 결합 성분은 IL-1R1을 중화시키는데 충분한 양의 본 발명의 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인이다.

따라서, 본 발명은 포유동물에게 본 발명의 결합 성분을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 폐 내로의 호중구 동원 및 화학주성을 억제하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 폐 내로의 호중구 동원 및 화학주성을 억제하기 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 폐 내로의 호중구 동원 및 화학주성을 억제하기 위한 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 하나의 구체예에서, 포유동물은 인간이고, 또 다른 구체예에서 포유동물은 비-인간 동물이다. 하나의 구체예에서, 결합 성분은 IL-1R1을 중화시키는데 충분한 양의 본 발명의 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인이다.

따라서, 본 발명은 포유동물에게 본 발명의 결합 성분을 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에게서 HIV, 고체 종양, 백혈병, 알츠하이머병, 타입 II 당뇨병, 허혈성 질환 및 아테롬성경화증으로부터 선택된 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 HIV, 고체 종양, 백혈병, 알츠하이머병, 타입 II 당뇨병, 허혈성 질환 및 아테롬성경화증으로부터 선택된 장애의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 HIV, 고체 종양, 백혈병, 알츠하이머병, 타입 II 당뇨병, 허혈성 질환 및 아테롬성경화증으로부터 선택된 장애의 치료를 위한 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 하나의 구체예에서, 포유동물은 인간이고, 또 다른 구체예에서 포유동물은 비-인간 동물이다. 하나의 구체예에서, 결합 성분은 IL-1R1을 중화시키는데 충분한 양의 본 발명의 항체, VH 도메인, 또는 VL 도메인이다.

시험 세포를 시험관내에서 본 발명의 결합 성분과 접촉시키는 경우에는, 대조 세포(들)가 또한 양성 대조 (예를 들어, 결합 성분을 함유하지 않는 반응) 및/또는 음성 대조 (예를 들어, IL-1R1 및/또는 항원을 함유하지 않는 반응)를 위해서 사용될 수 있다.

세포가 생체내에서, 예를 들어, IL-1α- 및/또는 IL-1β-매개된 생물학적 반응을 나타내는 포유동물에게 본 발명의 결합 성분을 투여함으로써 결합 성분에 의해서 접촉되는 경우에, 본 발명의 결합 성분은 IL-1R1을 중화시키는데 충분한 양으로 투여된다.

더 나가서, 본 발명은 본 발명의 항체, VH 도메인 또는 VL 도메인과 같은 결합 성분을 투여하는 것을 포함하여, 인간과 같은 포유동물에게서 IL-1R1-매개된 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 IL-1R1-매개된 활성을 감소시키기 위한 의약을 제조하는데 있어서의 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 포유동물에게서 IL-1R1-매개된 활성을 감소시키기 위한 본 발명의 결합 성분의 용도를 제공한다. 하나의 구체예에서, 포유동물은 인간이고, 또 다른 구체예에서, 포유동물은 비-인간 동물이다. 하나의 구체예에서, 결합 성분은 IL-1R1을 중화시키고, IL-1R1-매개된 활성을 감소시키는데 충분한 양의 본 발명의 항체, VH 도메인 또는 VL 도메인이다.

본 발명의 결합 성분이 사용될 수 있는 질환 또는 장애에는 다음이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다:

1. 기도: 다음을 포함하는 기도의 폐쇄성 질환: 간헐적일 뿐만 아니라 지속적인 모든 중증도의 기관지, 알레르기성, 내인성, 외인성, 운동-유도성, 약물-유도성 (아스피린 및 NSAID-유도성) 및 먼지-유도성 천식을 포함하는 천식, 및 기도 과민반응의 다른 원인; 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD); 감염성 및 호산구성 기관지염을 포함하는 기관지염; 폐기종; 기관지확장증; 낭포성 섬유증; 유육종증; 농부폐 및 관련된 질환; 과민성 폐렴; 잠재성 섬유성 폐포염, 특발성 간질성 폐렴, 항신생물 요법 및 폐결핵 및 아스퍼질로스증 (aspergillosis) 및 그 밖의 다른 진균성 감염을 포함한 만성 감염 합병성 섬유증을 포함하는 폐 섬유증; 폐 이식의 합병증; 폐 맥관구조의 맥관성 및 혈전성 장애, 및 폐고혈압; 기도의 염증성 및 분비성 상태와 연관된 만성 기침, 및 의원성 기침의 치료를 포함한 진해활성; 약물성 비염 및 혈관운동성 비염을 포함한 급성 및 만성 비염; 신경성 비염 (고초열)을 포함한 다년성 및 계절성 알레르기 비염; 비 폴립증; 감기를 포함하는 급성 바이러스성 감염, 및 호흡기 합포체 바이러스, 인플루엔자, 코로나바이러스 (SARS 포함), 아데노바이러스 및 ARDS 및 ALI에 기인한 감염;

2. 뼈 및 관절: 예를 들어, 선천성 골관절 이형성증에 대해서 일차성뿐만 아니라 이차성인, 골관절염/골관절증과 연관되거나 이들을 포함하는 관절성피진; 경부 및 요부 척추염, 및 허리 및 목 통증; 류마티스성 관절염 및 스틸병 (Still's disease); 강직성 척추염, 건선성 관절염, 반응성 관절염 및 미분화 척추관절증을 포함하는 혈청음성 척추관절증; 패혈성 관절염 및 포트병 (Potts' disease) 및 폰세트 증후군 (Poncet's syndrome)을 포함한 결핵과 같은 그 밖의 다른 감염-관련된 관절증 및 골 장애; 요산염 통풍, 칼슘 피로포스페이트 축적 질환 및 칼슘 아파타이트 관련된 건, 활액낭 및 활액 염증을 포함하는 급성 및 만성 결정-유도된 활막염; 베체트병 (Behcet's disease); 원발성 및 이차성 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome); 전신성 경화증 및 제한된 경피증; 전신성 홍반성 루푸스, 혼합된 결합조직 질환, 및 미분화된 결합조직 질환; 피부근염 및 다발성근염을 포함한 염증성 근육병; 류마티스성 다발근육통; 모든 관절 분포의 특발성 염증성 관절성피진 및 연관된 증후군을 포함하는 연소성 관절염, 및 류마티스열 및 그의 전신성 합병증; 거대세포 동맥염, 다가야스 (Takayasu) 동맥염, 처그-스트라우스 (Churg-Strauss) 증후군, 결절성 다발동맥염, 현미경적 다발동맥염, 및 바이러스 감염, 과민성 반응, 한랭글로불린 및 파라단백질과 연관된 맥관염 (vasculitides); 하리 통증; 가족성 지중해열 (Familial Mediterranean fever), 머클-웰스 (Muckle-Wells) 증후군, 및 가족성 동면성열 (Familial Hibernian Fever), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 기구치병 (Kikuchi disease); 약물-유도된 관절통, 건염 (tendonititides), 및 근육병;

3. 상해, 예를 들어, 스포츠 상해, 또는 질병에 기인한 근골격 장애의 통증 및 결합조직 리모델링: 관절성피진 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 골관절염, 통풍 또는 결정성 관절병증), 그 밖의 다른 관절 질환 (예를 들어, 추간판 퇴행 또는 측두하악관절 퇴행), 골 리모델링 질환 (예를 들어, 골다공증, 파제트병 (Paget's disease) 또는 골괴사), 다발연골염, 경피증, 혼합된 결합조직 장애, 척추관절증 또는 치주질환 (예를 들어, 치주염);

4. 피부: 건선, 유건선, 아토피 피부염, 접촉 피부염 또는 그 밖의 다른 습진성 피부병, 및 지연된-타입의 과민반응; 식물성- 및 광선피부염; 지루성 피부염, 포진성 피부염, 편평태선, 경화 위축성 태선, 괴저성 농피증, 피부 유육종증, 원판상 홍반성 루푸스, 천포창, 유천포창, 수포성 표피박리증, 균상 식육종, 담마진, 혈관 부종, 맥관염, 중독성 홍반, 피부 호산구증다증, 원형 탈모증, 남성형 탈모, 스위트 증후군 (Sweet's syndrome), 웨버-크리스찬 (Weber-Christian) 증후군, 다형 홍반; 감염성뿐만 아니라 비감염성의 봉와직염; 지방층염; 피부 림프종, 비-흑색종 피부암 및 그 밖의 다른 이형성성 병변; 고정 약진을 포함한 약물-유도된 장애;

5. 눈: 안검염; 다년성 및 춘계 알레르기성 결막염을 포함하는 결막염; 홍채염; 전 및 후 포도막염; 맥락막염; 망막에 영향을 미치는 자가면역, 퇴행성 또는 염증성 장애; 교감성 안염을 포함하는 안염; 유육종증; 바이러스, 진균 및 박테리아를 포함하는 감염;

6. 위장관: 설염, 치은염, 치주염; 역류성을 포함하는 식도염; 호산성 위장염, 비만세포증, 크론병 (Crohn's disease), 대장염, 예를 들어, 궤양성 대장염, 불확정성 (indeterminant) 대장염, 직장염, 현미경적 대장염, 항문 소양증; 셀리악병 (Coeliac disease), 자극성 장 증후군, 자극성 장 질환, 비-염증성 설사 및 장으로부터 먼 곳에서의 효과 (예를 들어, 편두통, 비염 또는 습진)를 가질 수 있는 음식-관련된 알레르기;

7. 복부: 자가면역, 알콜성 및 바이러스성을 포함하는 간염; 간의 섬우증 및 경화증; 담낭염; 급성뿐만 아니라 만성인 췌장염;

8. 비뇨생식기: 간질성 및 사구체신염을 포함하는 신장염; 신증후군; 급성 및 만성 (간질성) 방광염 및 훈너 궤양 (Hunner's ulcer)을 포함하는 방광염; 급성 및 만성 요도염, 전립선염, 부고환염, 난소염 및 난관염; 외음-질염; 페이로니병 (Peyronie's disease); 발기부전 (남성 및 여성 둘 다);

9. 동종이식 거부반응: 예를 들어, 신장, 심장, 간, 폐, 골수, 피부 또는 각막의 이식 후, 또는 수혈 후의 급성 및 만성 거부반응; 또는 급성 및 만성 이식편대숙주 질환;

10. CNS: 알츠하이머병, 및 CJD 및 nvCJD를 포함하는 그 밖의 다른 치매성 장애; 아밀로이드증; 다발성 경화증 및 그 밖의 다른 탈수초성 증후군; 대뇌 아테롬성경화증 및 맥관염; 측두 동맥염; 중증 근무력증; 내장 통증, 두통, 편두통, 삼차 신경통, 비정형 안면통, 관절 및 골통, 암 및 종양 침습으로 인한 통증, 당뇨병성, 대상포진-후 및 HIV-연관된 신경병증을 포함하는 신경병성 통증 증후군을 포함하는 급성 및 만성 통증 (중추성 기원이든 말초성 기원이든 급성, 간헐성 또는 지속성); 열대 경련성 대부전마비, 신경유육종증; 악성, 감염성 또는 자가면역 과정의 중추 및 말초 신경계 합병증;

11. 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 그레이브스병 (Graves' disease), 애디슨병 (Addison's disease), 당뇨병, 특발성 혈소판감소성 자반병, 호산구성 근막염, 고-IgE 증후군, 항인지질 증후군을 포함하는 기타 자가면역 및 알레르기성 장애 (다른 알레르기 요법과 함께하는 것 포함); 예정일-전 출산;

12. 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS), 나병, 세자리 (Sezary) 증후군 및 부신생물 증후군을 포함하는 염증성 또는 면역학적 성분을 갖는 기타 장애;

13. 심혈관: 관상 및 말초 순환에 영향을 미치는 아테롬성경화증; 심막염; 심근염, 심근 유육종증을 포함하는 염증성 및 자가면역 심근증; 허혈성 재관류 손상; 심내막염, 판막염, 및 감염성 (예를 들어, 매독성)을 포함하는 대동맥염; 맥관염; 정맥염 및 심부 정맥 혈전증 및 정맥류성 정맥의 합병증을 포함하는 혈전증을 포함한 근위 및 말초 정맥의 장애; 및

14. 종양학: 전이성 질환 및 종양 재발의 예방 및 치료를 포함한 전립선, 유방, 폐, 난소, 췌장, 장 및 대장, 피부 및 뇌 종양을 포함하는 통상적인 암, 및 골수 (백혈병 포함) 및 호지킨 (Hodgkin) 및 비-호지킨 림프종과 같은 림프증식 시스템에 영향을 미치는 악성종양, 및 부종양성 증후군의 치료.

따라서 IL-1R1의 결합 및 중화에 관하여 본 발명에 제시된 데이터는 본 발명의 결합 성분이 장애의 중증도를 감소시키는 것을 포함하여 이러한 장애를 치료 또는 예방하기 위해서 사용될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 필요한 환자에게 본 발명의 하나 이상의 결합 성분의 유효량을 단독으로, 또는 본 기술분야에서 공지되거나 본 발명에 기술된 또 다른 적절한 의약과의 병용 치료학적 레지멘으로 투여하여 상기 자애 중의 어떤 것의 적어도 하나의 증상의 중증도를 감소시키는 것을 포함하여, 본 발명에 언급된 장애 중의 어떤 것의 적어도 하나의 증상의 중증도를 치료하거나 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 결합 성분은 적절한 동물에게서, 및 질병의 동물 모델에게서, 특히 원숭이에게서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 결합 성분은 IL-1R1, 예를 들어, IL-1R1 생산, 발현 및/또는 활성, 특히 비정상적인 생산, 발현 또는 활성을 수반하는 질환 또는 장애의 치료 시에 치료학적 약제로서 유용하다. 치료의 방법은 필요한 환자에게 본 발명의 결합 성분의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서는 이에 의해 IL-1R1의 생산, 발현 및/또는 활성이 감소된다. 치료의 방법은 (i) 증가된 IL-1R1 또는 IL-1 레벨 또는 그의 활성을 나타내는 환자를, 예를 들어, 상술한 진단방법을 사용하여 확인하고, (ⅱ) 환자에게 본 발명의 결합 성분의 유효량을 투여하여 IL-1R1의 생산, 발현 및/또는 활성이 감소되도록 하는 것을 포함할 수 있다. 치료의 대체 방법은 (i) IL-1R1-매개된 활성의 명백한 증가는 없지만 본 발명의 결합 성분의 투여가 유익한 것으로 믿어지는 환자를 확인하고, (ⅱ) 환자에게 본 발명의 결합 성분의 유효량을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 유효량은 질병 또는 장애를 반드시 치유시키지는 않지만 치료할 특정의 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 중증도를 감소시키거나 약화시키도록 IL-1R1의 증가된 생산, 발현 및/또는 활성을 감소시키는 양이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 하나 이상의 결합 성분의 유효량과 접촉시키거나 투여함으로써 IL-1R1의 적어도 하나의 효과에 길항하도록 하는 것을 포함하여 IL-1R1의 적어도 하나의 효과에 길항하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 의해서 길항될 수 있는 IL-1R1의 효과는 IL-1α 및/또는 IL-1β에 의해서 매개된 생물학적 반응, 및 이들 결합반응의 결과로 야기하는 모든 하류 효과를 포함한다.

따라서, 본 발명의 추가의 관점은 본 발명에서 검토된 바와 같은 IL-1R1과 연관되거나 IL-1R1에 의해서 매개된 장애를 치료하는 의약의 제조를 위한 본 발명의 항체, VH 도메인 또는 VL 도메인과 같은 분리된 결합 성분의 용도를 제공한다. 의약 또는 약제학적 조성물의 이러한 용도 및 이들을 제조하는 방법은 결합 성분을 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제제화하는 것을 포함한다.

약제학적으로 허용되는 부형제는 이차 반응을 유발하지 않고 약제학적 조성물 내로 도입되며, 예를 들어, 활성 화합물(들)의 투여를 용이하게 하거나, 그의 수명 및/또는 체내에서의 그의 효능을 증가시키거나, 용액 중에서의 그의 용해도를 증가시키거나, 아니면 그의 보존을 개선시키도록 하는 화합물 또는 화합물의 조합물일 수 있다. 이들 약제학적으로 허용되는 부형제는 잘 알려져 있으며, 선택된 활성 화합물(들)의 성질 및 투여 모드의 함수로서 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 조정될 수 있을 것이다.

본 발명의 결합 성분은 통상적으로, 결합 성분 이외에도 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르며, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분 이외에도 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정화제, 또는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려진 그 밖의 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 비-독성이어야 하며, 활성 성분의 효능을 저해하지 않아야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 이하에 검토되는 바와 같이 경구, 흡입, 기관내, 국소, 방광내, 또는 주사에 의한 것일 수 있는 투여의 경로에 따라 좌우될 수 있다.

예를 들어, 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어, "nanobodies™") 등과 같은 경구 투여용 약제학적 조성물이 본 발명에서 또한 예상된다. 이러한 경구용 제제는 정제, 캅셀제, 분말, 액체 또는 반-고체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 보조제와 같은 고체 담체를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리식염수 용액, 덱스트로즈 또는 그 밖의 다른 사카라이드 용액, 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.

정맥내 주사, 또는 고통 부위에서의 주사를 위해서, 활성 성분은 발열성 물질이 없고, 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 본 기술분야에서 관련된 기술을 갖는 전문가는 예를 들어, 염화나트륨 주사, 링거 (Ringer) 주사, 락테이트화 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있을 것이다. 포스페이트, 시트레이트 및 그 밖의 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르빈산 및 메티오닌과 같은 항산화제; 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥사놀, 3'-펜타놀 및 m-크레졸과 같은 보존제; 저분자량 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코즈, 만노즈 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 디사카라이드 및 그 밖의 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당류; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온; 금속 컴플렉스 (예를 들어, Zn-단백질 컴플렉스); 및/또는 트윈 (TWEEN™), 플루로닉스 (PLURONICS™) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함하는 보존제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 그 밖의 다른 첨가제가 필요에 따라서 사용될 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 분자의 물리화학적 특성 및 송달의 경로에 따라 액체, 반고체 또는 고체 형태로 제제화될 수 있다. 제제화는 부형제, 또는 부형제의 조합, 예를 들어, 당류, 아미노산 및 계면활성제를 포함할 수 있다. 액체 제제는 광범한 항체 농도 및 pH를 포함할 수 있다. 고체 제제는 동결건조, 스프레이 건조 또는, 예를 들어, 초임계 유체 기술에 의한 건조에 의해서 생산될 수 있다. 항-IL-1R1의 제제는 의도된 송달의 경로에 따라 좌우될 수 있다: 예를 들어, 폐 송달을 위한 제제는 흡입시에 심부 폐 내로의 침투를 보장하는 물리적 특성을 갖는 입자로 구성될 수 있으며; 국소 제제 (예를 들어, 반흔, 예를 들어, 피부 반흔의 치료를 위함)는 약물이 작용 부위에 체류하는 시간을 연장시키는 점도 변형제를 포함할 수 있다. 결합 성분은 이식물, 경피 패치제 및 마이크로캅셀화된 송달 시스템을 포함한 조절 방출 제제와 같이 빠른 방출로부터 결합 성분을 보호할 수 있는 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생물분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 다수의 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있다 (65).

항-IL-1R1 치료는 경구적으로 (예를 들어, 단일 도메인 항체 분자 (예를 들어, "나노바디™")와 같음), 주사에 의해서 (예를 들어, 피하, 관절내, 정맥내, 복강내, 동맥내 또는 근육내로), 기관내 흡입에 의해서, 방광내 경로로 (방관 내로 점적주입 (instillation)), 또는 국소적으로 (예를 들어, 안내, 비내, 직장, 창상내, 또는 피부 상에) 제공될 수 있다. 치료는 특히 결합 성분의 감소하는 용량에 의한 펄스 주입 (pulse infusion)으로 투여될 수 있다. 투여의 경로는 치료의 물리화학적 특징에 의해서, 질병에 대한 특별한 고려에 의해서, 또는 효능을 최적화하거나 부작용을 최소화하는 필요성에 의해서 결정될 수 있다. 투여의 하나의 특별한 경로는 정맥내이다. 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 또 다른 경로는 피하이다. 항-IL-1R1 치료는 임상에서 사용하는 것으로 제한되지 않을 것으로 생각된다. 따라서, 무침 장치 (needle-free device)를 사용한 피하 주사가 또한 유리하다.

정맥내 제제의 예는 다음을 포함한다:

25 mM 히스티딘,

120 mM 염화나트륨

pH 6.0.

IL-1R1에 대한 결합 성분 또는 IL-1R1에 대한 결합 성분을 포함하는 조성물은 추가의 의약적 성분과 함께 병용요법의 일부분으로서 사용될 수 있다. 병용치료, 특히 항-IL-1R1 결합 성분과 하나 이상의 약물의 병용을 사용하여 상당한 상승적 효과를 제공할 수 있다. IL-1R1에 대한 결합 성분은 본 발명에 열거된 상태 중의 하나 이상을 치료하기 위해서 또 다른 치료학적 약제 또는 약제들과 동시에 또는 순차적으로, 또는 조합된 제제로 투여될 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 기도의 폐쇄성 질환, 천식 및 알레르기성 장애와 같은 IL-1R1 매개된 질환, 또는 IL-1R1 매개된 효과를 수반하는 다른 장애에 대해 이용할 수 있는 다른 치료와 함께 조합하여 제제화되고/되거나 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 결합 성분은 단독 치료법으로서, 또는 다음 약제 중의 하나 이상과 함께 또는 이들을 부가하여 제공될 수 있다:

- 알파-, 베타- 및/또는 감마-인터페론과 같은 사이토킨 또는 사이토킨 기능의 아고니스트 또는 길항제 (예를 들어, SOSC 시스템의 변조물질과 같이 사이토킨 신호전달 경로에 작용하는 약제); 인슐린-양 성장인자 타입 I (IGF-1), 그의 수용체 및 연관된 결합 단백질; 인터류킨 (IL), 예를 들어, IL-2 내지 -33 중의 하나 이상, 및/또는 아나킨라 (anankinra)와 같은 인터류킨 길항제 또는 억제제; 인터류킨 집단 구성원의 수용체의 억제제 또는 이러한 수용체의 특정 서브유니트의 억제제, 항-TNF 모노클로날 항체 (예를 들어, 인플릭시마브, 아달리무마브 및/또는 CDP-870) 및/또는 TNF 수용체 길항제, 예를 들어, 면역글로불린 분자 (예를 들어, 에타너셉트)와 같은 종양괴사인자 알파 (TNF-α) 억제제 및/또는 펜톡시필린과 같은 저분자량 약제;

- B 세포의 변조물질, 예를 들어, B-림프구 (예를 들어, CD20 (리툭시마브) 또는 MRA-aILl6R) 또는 T-림프구 (예를 들어, CTLA4-Ig, HuMax Il-15 또는 아바타셉트)를 표적화한 모노클로날 항체;

- 파골 활성을 억제하는 변조물질, 예를 들어, RANKL에 대한 항체;

- CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 및 CCR11 (C-C 집단의 경우); CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 및 CXCR5 및 CXCR6 (C-X-C 집단의 경우), 및 C-X₃-C 집단에 대한 CX₃CR1의 길항제와 같은 케모킨 또는 케모킨 수용체 기능의 변조물질;

- 매트릭스 메탈로프로테아제 (MMPs)의 억제제, 즉 하나 이상의 스트로멜리신, 콜라게나제, 및 젤라티나제뿐만 아니라 아그리카나제, 특히 콜라게나제-1 (MMP-1), 콜라게나제-2 (MMP-8), 콜라게나제-3 (MMP-13), 스트로멜리신-1 (MMP-3), 스트로멜리신-2 (MMP-10) 및/또는 스트로멜리신-3 (MMP-11) 및/또는 MMP-9 및/또는 MMP-12, 예를 들어, 독시사이클린과 같은 약제;

- 류코트리엔 생합성 억제제, 5-리폭시게나제 (5-LO) 억제제 또는 5-리폭시게나제 활성화 단백질 (FLAP) 길항제, 예를 들어, 질루톤; ABT-761; 펜루톤; 테폭살린; 애보트-79175; 애보트-85761; N-(5-치환된)-티오펜-2-알킬설폰아미드; 2,6-디-tert-부틸페놀하이드라존; 제네카 (Zeneca) ZD-2138과 같은 메톡시테트라하이드로피란; 화합물 SB-210661; L-739,010과 같은 피리디닐-치환된 2-시아노나프탈렌 화합물; L-746,530과 같은 2-시아노퀴놀린 화합물; MK-591, MK-886 및/또는 BAY x 1005와 같은 인돌 및/또는 퀴놀린 화합물;

- L-651,392와 같은, 페노티아진-3-1s로 구성된 그룹으로부터 선택된 류코트리엔 (LT) B4, LTC4, LTD4, 및 LTE4에 대한 수용체 길항제; CGS-25019c와 같은 아미디노 화합물; 온타졸라스트와 같은 벤즈옥살아민; BIIL 284/260과 같은 벤젠카복스이미드아미드; 및 자피르루카스트, 애브루카스트, 몬테루카스트, 프란루카스트, 베르루카스트 (MK-679), RG-12525, Ro-245913, 이라루카스트 (CGP 45715A) 및 BAY x 7195와 같은 화합물;

- 메틸크산타닌과 같은 포스포디에스테라제 (PDE) 억제제, 예를 들어, 테오필린 및/또는 아미노필린; 및/또는 선택적 PDE 동위효소 억제제, 예를 들어, PDE4 억제제 및/또는 이소형태 PDE4D의 억제제 및/또는 PDE5의 억제제;

- 세티리진, 로라타딘, 데스로라타딘, 펙소페나딘, 아크리바스틴, 터페나딘, 아스테미졸, 아젤라스틴, 레보카바스틴, 클로르페니라민, 프로메타진, 사이클리진, 및/또는 미졸라스틴 (일반적으로 경구, 국소 또는 비경구적으로 적용됨)과 같은 히스타민 타입 1 수용체 길항제;

- 양자 펌프 억제제 (예를 들어, 오메프라졸) 또는 위보호성 히스타민 타입 2 수용체 길항제;

- 히스타민 타입 4 수용체의 길항제;

- 프로필헥세드린, 페닐에프린, 페닐프로판올아민, 에페드린, 슈도에페드린, 나파졸린 하이드로클로라이드, 옥시메타졸린 하이드로클로라이드, 테트라하이드로졸린 하이드로클로라이드, 자일로메타졸린 하이드로클로라이드, 트라마졸린 하이드로클로라이드 및 에틸노르에피네프린 하이드로클로라이드와 같은 알파-1/알파-2 아드레날린 수용체 아고니스트 혈관수축 교감신경흥분제;

- 항콜린제, 예를 들어, 아트로핀, 히오신, 글리코피롤레이트, 이프라트로피움 브로마이드, 티오트로피움 브로마이드, 옥시트로피움 브로마이드, 피렌제핀 및 텔렌제핀과 같은 무스카린 수용체 (M1, M2, 및 M3) 길항제;

- 이소프레날린, 살부타몰, 포르모테롤, 살메테롤, 터부탈린, 오르시프레날린, 비톨테롤 메실레이트 및/또는 피르부테롤, 예를 들어, 그의 키랄 에난티오머와 같은 베타-아드레날린 수용체 아고니스트 (베타 수용체 서브타입 1-4를 포함);

- 크로몬, 예를 들어, 나트륨 크로모글리케이트 및/또는 네도크로밀 나트륨;

- 플루니솔리드, 트리암시놀론 아세토나이드, 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소나이드, 플루티카손 프로피오네이트, 시클레소니드 및/또는 모메타손 푸로에이트와 같은 글루코코르티코이드;

- PPAR과 같이 핵 호르몬 수용체를 변조시키는 약제;

- 본 발명의 결합 성분과 동일하거나 상이한 에피토프에 결합하는 항-IL-1R1과 같은, 면역글로불린 (Ig) 또는 Ig 제제 또는 Ig 기능을 변조시키는 길항제 또는 항체;

- 그 밖의 다른 전신적 또는 국소적으로-적용된 소염제, 예를 들어, 탈리도마이드 또는 그의 유도체, 레티노이드, 디트라놀 및/또는 칼시포트리올;

- 설파살라진, 메살라진, 발살라지드 및 올살라진과 같은 아미노살리실레이트와 설파피리딘의 조합; 및 티오퓨린과 같은 면역조절제; 및 부데소나이드와 같은 코르티코스테로이드;

- 항균제, 예를 들어, 페니실린 유도체, 테트라사이클린, 마크로라이드, 베타-락탐, 플루오로퀴놀론, 메트로니다졸 및/또는 흡입된 아미노글리코사이드; 및/또는 항바이러스제, 예를 들어, 아사이클로비르, 팜시클로비르, 발라시클로비르, 간시클로비르, 시도포비르; 아만타딘, 리만타딘, 리바비린, 자나마비르 및/또는 오셀타마비르; 인디나비르, 넬피나비르, 리토나비르 및/또는 사퀴나비르와 같은 프로테아제 억제제; 디다노신, 라미부딘, 스타부딘, 잘시타빈, 지도부딘과 같은 뉴클레오사이드 역전사효소 억제제; 네비라핀, 에파비렌즈와 같은 비-뉴클레오사이드 역전사효소 억제제;

- 다음과 같은 심혈관 약제:

1) HMG-CoA 환원효소 억제제 (예를 들어, 스타틴); PPARa 아고니스트 (피브레이트, 예를 들어, 젬피브로질); 담즙산 격리제 (콜레스티라민); 콜레스테롤 흡수 억제제 (식물 스타놀, 합성 억제제); 담즙산 흡수 억제제 (IBATi) 및 니코틴산 및 유사체 (나이아신 및 서방출 제제)와 같은 항이상지혈증제 (anti-dyslipidaemia agents);

2) β 차단제 (예를 들어, 아테놀롤, 인데랄); ACE 억제제 (예를 들어, 리시노프릴); 칼슘 길항제 (예를 들어, 니페디핀); 안지오텐신 수용체 길항제 (예를 들어, 칸데사르탄), 길항제 및 이뇨제 (예를 들어, 푸로세마이드, 벤즈티아자이드)와 같은 항고혈압제;

3) 항혈전제, 섬유소용해의 활성화제 및 항혈소판제; 트롬빈 길항제; 인자 Xa 억제제; 인자 VIIa 억제제); 항혈소판제 (예를 들어, 아스피린, 클로피도그렐); 항응고제 (헤파린 및 저분자량 유사체, 히루딘) 및 와파린과 같은 지혈 변조물질;

4) 글루카곤의 작용에 길항하는 약제; 및

5) 비-스테로이드성 소염 약물 (예를 들어, 아스피린) 및 스테로이드성 소염제 (예를 들어, 코르티손)와 같은 소염제;

6) 펜톡시필린과 같은 혈액 세포 형태학의 변조물질;

- 다음과 같은 당뇨병 치료제:

1) 인슐린 및 인슐린 유사체;

2) 설포닐우레아 (예를 들어, 글리벤클라미드, 글리피지드), 식사 (prandial) 글루코즈 조절제 (예를 들어, 레파글리니드, 네이트글리니드)를 포함하는 인슐린 분비촉진물질;

3) 인크레틴 작용을 개선하는 약제 (예를 들어, 디펩티딜 펩티다제 IV 억제제, 예를 들어, 삭사글립틴, 시타글립틴, 빌다글립틴 또는 알로글립틴, 및 GLP-1 아고니스트);

4) PPAR감마 아고니스트 (예를 들어, 피오글리타존 및 로시글리타존), 및 조합된 PPAR알파 및 감마 활성을 갖는 약제를 포함하는 인슐린 증감제;

5) 간 글루코즈 평형을 변조시키는 약제 (예를 들어, 메트포르민, 프럭토즈 1, 6 비스포스파타제 억제제, 글리코겐 포스포릴라제 억제제, 글리코겐 신타제 키나제 억제제);

6) 장으로부터 글루코즈의 흡수를 감소시키도록 디자인된 약제 (예를 들어, 아카르보즈);

7) 신장에 의한 글루코즈의 재흡수를 방지하는 약제 (SGLT 억제제);

8) 장기간의 고혈당증의 합병증을 치료하도록 디자인된 약제 (예를 들어, 알도즈 환원효소 억제제);

- 노르아드레날린/세로토닌 비-선택적 재흡수 억제제와 같은 항비만제;

- CNS 약제, 예를 들어, 항우울제 (예를 들어, 세르트랄린), 항-파킨슨증후군 약물 (예를 들어, 데프레닐, L-도파, 로피니롤, 프라미펙솔; 셀레긴 및 사라길린과 같은 MAOB 억제제; 타스마르와 같은 comP 억제제; A-2 억제제, 도파민 재흡수 억제제, NMDA 길항제, 니코틴 아고니스트, 도파민 아고니스트 및/또는 신경원성 산화질소 신타제의 억제제) 및 도네제필, 리바스티그민, 타크린, COX-2 억제제, 프로펜토필린 또는 메트리포네이트와 같은 항-알츠하이머 약물;

- 급성 및 만성 통증의 치료용 약제, 예를 들어, 중추적으로 또는 말단적으로 작용하는 진통제, 예를 들어, 아편양제제 유사체 또는 유도체, 카바마제핀, 페니토인, 나트륨 발프로에이트, 아미트리프틸린 또는 다른 항우울제, 파라세타몰, 또는 비-스테로이드성 소염제;

- 리그노카인 또는 그의 유사체와 같은 비경구적으로 또는 국소적으로 적용된 (흡입 포함) 국소 마취제;

- 항골다공증제, 예를 들어, 랄록시펜과 같은 호르몬성 약제, 또는 알렌드로네이트와 같은 비포스포네이트;

- (i) 트립타제 억제제; (ⅱ) 혈소판 활성화 인자 (PAF) 길항제; (ⅲ) 인터류킨 전환효소 (ICE) 억제제; (iv) IMPDH 억제제; (v) VLA-4 길항제를 포함하는 부착 분자 억제제; (vi) 카텝신; (vⅱ) 키나제 억제제, 예를 들어, 티로신 키나제 (예를 들어, Btk, Itk, Jak3 MAP, 억제제의 예로는 제피티니브, 이마티니브 메실레이트가 포함될 수 있다), 세린/트레오닌 키나제 (예를 들어, MAP 키나제, 예를 들어, p38, JNK, 단백질 키나제 A, B 및 C 및 IKK의 억제제), 또는 세포 주기 조절에 포함되는 키나제 (예를 들어, 사이클린 의존성 키나제)의 억제제; (vⅲ) 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제 억제제; (ix) 키닌-B.sub1.- 및/또는 B.sub2.-수용체 길항제; (x) 항통풍제, 예를 들어, 콜히친; (xi) 크산틴 옥시다제 억제제, 예를 들어, 알로퓨리놀; (xⅱ) 요산요유인제 (uricosuric agent), 예를 들어, 프로베네시드, 설핀피라존, 및/또는 벤즈브로마론; (xⅲ) 성장 호르몬 분비촉진물질; (xiv) 변형 성장인자 (TGFβ); (xv) 혈소판-유도된 성장인자 (PDGF); (xvi) 섬유아세포 성장인자, 예를 들어, 염기성 섬유아세포 성장인자 (bFGF); (xvⅱ) 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF); (xvⅲ) 캅사이신 크림; (xix) NKP-608C, SB-233412 (탈네탄트) 및/또는 D-4418과 같은 타키티닌 NK.sub1. 및/또는 NK.sub3. 수용체 길항제; (xx) 엘라스타제 억제제, 예를 들어, UT-77 및/또는 ZD-0892; (xxi) TNF-알파 전환효소 억제제 (TACE); (xxⅱ) 유도된 산화질소 신타제 (iNOS) 억제제 또는 (xxⅲ) TH2 세포 상에서 발현된 화학주성인자 수용체-동종성 분자 (예를 들어, CRTH2 길항제); (xxiv) P38의 억제제, (xxv) 톨-유사 수용체 (TLR)의 기능을 변조시키는 약제, 및 (xxvi) P2X7과 같은 퓨린성 수용체의 활성을 변조시키는 약제; (xxvⅱ) NFkB, API, 및/또는 STATS와 같은 전사인자 활성화의 억제제.

본 발명에 따른 결합 성분은 또한 단독 치료법으로서, 또는 통상적인 수술 또는 방사선요법 또는 암 화학요법과 함께 또는 이들을 부가하여 제공될 수도 있다. 이러한 암 화학요법은 다음의 항암제의 카테고리 중의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(i) 알킬화제 (예를 들어, 시스-플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜파란, 클로람부실, 부설판, 테모졸라미드 및 니트로소우레아); 항대사산물 (예를 들어, 젬시타빈 및 항엽산제, 예를 들어, 5-플루오로우라실 및 테가푸르와 같은 플루오로피리미딘, 랄티트렉시드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노사이드, 및 하이드록시우레아); 항종양 항생제 (예를 들어, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 미토마이신-C, 닥티노마이신 및 미트라마이신과 같은 안트라사이클린); 항유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈과 같은 빈카 알카로이드, 및 탁솔 및 탁소테레와 같은 탁소이드 및 폴로키나제 억제제); 및 토포이소머라제 억제제 (예를 들어, 에토포사이드 및 테니포사이드와 같은 에피포도필로톡신, 암사크린, 토포테칸 및 캄프토테신)와 같은, 의약적 종양학에서 사용되는 기타 항증식성/항신생물성 약물 및 이들의 조합;

(ⅱ) 항에스트로겐제 (예를 들어, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜 및 요오독시펜), 항안드로겐제 (예를 들어, 비칼루타미드, 플루타미드, 닐루타미드 및 사이프로테론 아세테이트), LHRH 길항제 또는 LHRH 아고니스트 (예를 들어, 고세렐린, 류프로렐린 및 부세렐린), 황체호르몬 (예를 들어, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제 (예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스테인), 및 피나스테라이드와 같은 5α-리덕타제의 억제제와 같은 세포증식억제제;

(ⅲ) 항침습제 [예를 들어, 4-(6-클로로-2,3-메틸렌디옥시아닐리노)-7-[2-(4-메틸피페라진-1-일)에톡시]-5-테트라하이드로피란-4-일옥시퀴나졸린 (AZD0530; 국제특허출원 제WO　01/94341호), N-(2-클로로-6-메틸페닐)-2-{6-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]-2-메틸피리미딘-4-일아미노}티아졸-5-카복스아미드 (다사니티브, BMS-354825; J. Med. Chem., 2004, 47, 6658-6661) 및 보수티니브 (SKI-606)와 같은 c-Src 키나제 집단 억제제, 및 마리마스타트와 같은 메탈로프로테이나제 억제제, 유로키나제 플라스미노겐 활성화제 수용체 기능의 억제제 또는 헤파라나제에 대한 항체];

(iv) 성장인자 기능의 억제제: 예를 들어, 이러한 억제제에는 성장인자 항체 및 성장인자 수용체 항체 (예를 들어, 항-erbB2 항체 트라스투주마브 [Herceptin™], 항-EGFR 항체 파니투무마브, 항-erbB1 항체 세툭시마브 [Erbitux, C225] 및 문헌 [Stern et al. Critical reviews in oncology/haematology, 2005, Vol. 54, pp11-29]에 기술된 모든 성장인자 또는 성장인자 수용체 항체)가 포함되며; 이러한 억제제는 또한 티로신 키나제 억제제, 예를 들어, 표피성장인자 집단의 억제제 (예를 들어, N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린-4-아민 (제피티니브, ZD1839), N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스(2-메톡시에톡시)퀴나졸린-4-아민 (에를로티니브, OSI-774) 및 6-아크릴아미도-N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-(3-모르폴리노프로폭시)-퀴나졸린-4-아민 (CI 1033)과 같은 EGFR 집단 티로신 키나제 억제제, 라파티니브와 같은 erbB2 티로신 키나제 억제제); 간세포 성장인자 집단의 억제제; 인슐린 성장인자 집단의 억제제; 이마니티브 및/또는 닐로티니브 (AMN107)와 같은 혈소판-유도된 성장인자 집단의 억제제; 세린/트레오닌 키나제의 억제제 (예를 들어, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제와 같은 Ras/Raf 신호전달 억제제, 예를 들어, 소라페니브 (BAY 43-9006), 티피파르니브 (R115777) 및 로나파르니브 (SCH66336)), MEK 및/또는 AKT 키나제를 통한 세포 신호전달의 억제제, c-키트 억제제, abl 키나제 억제제, PI3 키나제 억제제, Plt3 키나제 억제제, CSF-1R 키나제 억제제, IGF 수용체 (인슐린-양 성장인자) 키나제 억제제; 오로라 키나제 억제제 (예를 들어, AZD1152, PH739358, VX-680, MLN8054, R763, MP235, MP529, VX-528 AND AX39459), 및 CDK2 및/또는 CDK4 억제제와 같은 사이클린 의존성 키나제 억제제를 포함한다;

(v) 혈관내피성장인자의 효과를 억제하는 약제 [예를 들어, 항-혈관내피세포 성장인자 항체 베바시주마브 (Avastin™), 및 예를 들어, 반데타니브 (ZD6474), 바탈라니브 (PTK787), 수니티니브 (SU11248), 악시티니브 (AG-013736), 파조파니브 (GW 786034) 및 4-(4-플루오로-2-메틸인돌-5-일옥시)-6-메톡시-7-(3-피롤리딘-1-일프로폭시)퀴나졸린 (AZD2171; WO 00/47212 내의 실시예 240)과 같은 VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 국제특허출원 제WO97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 및 WO 98/13354호에 기술된 것과 같은 화합물, 및 다른 기전에 의해서 작용하는 화합물 (예를 들어, 리노마이드, 인테그린 αvβ3 기능의 억제제 및 안지오스타틴)]와 같은 항혈관형성제;

(vi) 콤브레타스타틴 (Combretastatin) A4 및 국제특허출원 제WO 99/02166, WO 00/40529, WO　00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213에 기술된 화합물과 같은 혈관 손상제;

(vⅱ) 엔도텔린 수용체 길항제, 예를 들어, 지보텐탄 (ZD4054) 또는 아트라센탄;

(vⅲ) 안티센스 치료법, 예를 들어, ISIS 2503, 항-ras 안티센스와 같이 상기 열거된 표적에 대해 지시되는 것;

(ix) 예를 들어, 비정상적인 p53 또는 비정상적인 BRCA1 또는 BRCA2와 같은 비정상적인 유전자를 대체하는 방법, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 박테리아성 니트로리덕타제 효소를 사용하는 것과 같은 GDEPT (유전자-지시된 효소 프로-드럭 치료) 방법, 및 다중-약물 저항성 유전자 치료법과 같이 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자 내성을 증가시키는 방법을 포함하는 유전자 치료방법; 및

(x) 예를 들어, 인터류킨 2, 인터류킨 4 또는 과립구-대식세포 콜로니 자극인자와 같은 사이토킨에 의한 형질감염과 같은 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 생체외 및 생체내 방법, T-세포 에너지를 감소시키는 방법, 사이토킨-형질감염된 수상돌기세포와 같은 형질감염된 면역세포를 사용하는 방법, 사이토킨-형질감염된 종양 세포주를 사용하는 방법 및 항-이디오타입 항체를 사용하는 방법을 포함하는 면역요법 방법.

억제제는 특이적일 수 있거나, 혼합된 억제제, 예를 들어, 상기 언급된 분자 (예를 들어, 수용체) 또는 분자 클래스 중의 하나 이상을 표적화한 억제제일 수 있다.

결합 성분은 또한, 티로신 키나제 억제제와 같은 화학요법제와 공동으로 공동-투여에 의해서, 또는 면역컨쥬게이트의 형태로 사용될 수 있다. 상기 항체의 단편은 또한, 재조합 기전 또는 생화학적 커플링한 다음에 상술한 항체의 특이성을 IL-1R1이 연관된 활성에 수반된 다른 분자를 인식할 수 있는 다른 항체의 특이성과 결합시킴으로써 수득된 이중특이성 항체로 사용될 수 있다.

염증성 질환, 예를 들어, 류마티스성 관절염, 골관절염, 천식, 알레르기성 비염, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 또는 건선의 치료를 위해서, 본 발명의 결합 성분은 피록시캄, 디클로페낙, 나프록센, 플루르비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜과 같은 프로피온산, 메페남산과 같은 페나메이트, 인도메타신, 술린닥, 아자프로파존, 페닐부타존과 같은 피라졸론, 아스피린과 같은 살리실레이트와 같은 국소적으로뿐만 아니라 전신적으로 적용되는 비-선택적 사이클로옥시게나제 (COX)-1/COX-2 억제제를 포함하는 비-스테로이드성 소염제 (이하에서는 NSAIDs); 선택적 COX-2 억제제 (예를 들어, 멜록시캄, 셀레콕시브, 로페콕시브, 발데콕시브, 루마로콕시브, 파레콕시브 및 에토리콕시브); 사이클로옥시게나제 억제성 산화질소 공여체 (CINODs); 글루코코르티코이드 (국소, 경구, 근육내, 정맥내 또는 관절내 경로에 의해서 투여); 메토트렉세이트, 레플루노마이드; 하이드록시클로로퀸, d-페니실라민, 아루라노핀 또는 다른 비경구 또는 경구용 금 제제; 진통제; 디아세레인; 히알우론산 유도체와 같은 관절내 치료; 및 글루코사민과 같은 영양 보충물과 같은 하나 이상의 약제와 조합될 수 있다.

본 발명의 결합 성분 및 상기 추가의 의약적 성분 중의 하나 이상은 의약의 제조에 사용될 수 있다. 의약은 개체에게 별도로 또는 조합 투여하기 위한 것일 수 있으며, 따라서 결합 성분 및 추가의 성분을 조합된 제제로서, 또는 별도의 제제로 포함할 수 있다. 별도의 제제는 별도, 및 순차적 또는 동시 투여가 용이하도록 사용될 수 있으며, 상이한 경로로, 예를 들어, 경구 및 비경구 투여에 의한 성분들의 투여를 허용한다.

본 발명에 따르면, 제공된 조성물은 포유동물에게 투여될 수 있다. 투여는 통상적으로 "치료학적 유효량"으로 되며, 이것은 환자에게 효과를 나타내기에 충분한 것이다. 이러한 효과는 적어도 하나의 증상을 적어도 개선시킬 수 있는 것이다. 투여되는 실제량, 및 투여의 속도 및 시간-과정은 치료될 상태의 성질 및 중증도, 치료될 특정의 포유동물, 개개 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 조성물의 송달 부위, 결합 성분의 타입, 투여의 방법, 투여의 스케줄, 및 의약적 전문가에게 공지된 다른 인자들에 따라 좌우될 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약량 등의 결정은 일반 개업의 및 다른 의료 의사의 책임 하에 있으며, 증상의 중증도 및/또는 치료될 질병의 진행에 따라 좌우될 수 있다. 항체의 적절한 용량은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다 (66, 67). 투여될 의약의 타입에 대해 적절한 것으로 본 발명에, 또는 문헌 [Physician's Desk Reference (2003)]에 나타낸 항체의 적절한 투약량이 사용될 수 있다. 본 발명의 결합 성분의 치료학적 유효량 또는 적합한 용량은 그의 시험관내 활성과 동물 모델에서의 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 마우스 및 다른 시험 동물에서의 유효량을 인간에 대해 추정하는 방법은 공지되어 있다. 정확한 용량은 항체가 진단, 예방 또는 치료를 위한 것인지 여부, 치료되는 면적의 크기 및 위치, 항체의 정확한 성질 (예를 들어, 전체 항체, 단편 또는 디아바디) 및 항체에 부착된 모든 검출가능한 라벨 또는 다른 분자의 성질을 포함한 다수의 인자에 따라 좌우될 것이다. 대표적인 항체 용량은 전신 적용의 경우에 100 ㎍ 내지 1 g, 및 국소 적용의 경우에 1 ㎍ 내지 1 ㎎의 범위일 수 있다. 초기의 더 큰 부하 용량에 이어서 하나 이상의 더 적은 용량이 투여될 수 있다. 전형적으로, 항체는 전체 항체, 예를 들어, IgG1 이소타입, IgG2 이소타입, IgG3 이소타입 또는 IgG4 이소타입일 수 있다. 이것은 성인 환자의 단일 치료를 위한 용량이며, 소아 및 유아에 대해서는 비례적으로 조정될 수 있고, 다른 항체 형태에 대해서는 또한 분자량에 비례하여 조정될 수 있다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 주 2회, 1 주일 또는 1 개월 간격으로 반복될 수 있다. 치료는 피하 투여의 경우에는 매 2 내지 4 주마다, 및 정맥내 투여의 경우에는 매 4 내지 8 주마다 이루어질 수 있다. 치료는 주기적일 수 있으며, 투여 사이의 기간은 약 2 주일 또는 그 이상, 예를 들어, 약 3 주일 또는 그 이상, 약 4 주일 또는 그 이상, 또는 약 1 개월에 1 회일 수 있다. 치료는 수술하기 전 및/또는 후에 제공될 수 있고/있거나, 수술 치료의 해부학적 부위에서 직접 투여되거나 적용될 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 또한, 기도의 폐쇄성 질환 또는 IL-1R1을 수반하는 염증성 장애를 갖는 샘플 환자에게서와 같이 IL-1R1의 존재 또는 양을 검출하기 위한 것과 같은 진단적 유용성을 갖는다. 이러한 진단적 유용성은 본 발명의 결합 성분을 표지하는 것을 수반할 수 있다.

본 발명의 결합 성분은 검출가능하거나 기능성인 라벨로 표지될 수 있다. 따라서, 결합 성분 또는 항체 분자는 검출가능하고/하거나 정량할 수 있는 시그날을 수득하도록 면역컨쥬게이트의 형태로 존재할 수 있다. 면역컨쥬게이트는 검출가능하거나 기능적인 라벨과 컨쥬게이트된 본 발명의 항체 분자를 포함할 수 있다. 라벨은 형광물질, 방사성라벨, 효소, 화학발광물질 또는 광증감제를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 시그날을 생산하거나 시그날을 생산하도록 유도될 수 있는 모든 분자일 수 있다. 따라서, 결합 성분은 형광 또는 발광, 방사능, 효소 활성 또는 흡광도를 측정함으로써 검출하고/하거나 측정될 수 있다.

적합한 라벨에는 제한적이 아닌 설명적으로 다음의 물질이 포함된다:

- 알칼리성 포스파타제, 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제 ("G6PDH"), 알파-D-갈락토시다제, 글루코즈 옥시다제, 글루코즈 아밀라제, 카보닉 안하이드라제, 아세틸콜린에스테라제, 리소자임, 말레이트 데하이드로게나제 및 퍼옥시다제, 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 같은 효소;

- 염료;

- 플루오레세인 및 그의 유도체, 형광색소, 로다민 화합물 및 유도체, GFP ("녹색 형광 단백질 (Green Fluorescent Protein)"의 경우의 GFP), 단실, 움벨리페론, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드, 및 플루오레스카민과 같은 형광성 라벨 또는 형광물질; 란타니드 크립테이트 및 킬레이트, 예를 들어, 유로피움 (Europium) 등 (Perkin Elmer and Cis Biointernational)과 같은 형광단;

- 이소루미놀, 루미놀 및 디옥세탄과 같은 화학발광성 라벨 또는 화학발광물질;

- 루시퍼라제 및 루시페린과 같은 생물-발광성 라벨;

- 증감제;

- 조효소;

- 효소 기질;

- 브롬77, 탄소14, 코발트57, 불소8, 갈륨67, 갈륨68, 수소3 (삼중수소), 인듐111, 인듐113m, 요오드123m, 요오드125, 요오드126, 요오드131, 요오드133, 수은107, 수은203, 인32, 레늄99m, 레늄101, 레늄105, 루테늄95, 루테늄97, 루테늄103, 루테늄105, 스칸듐47, 셀레늄75, 황35, 테크네튬99, 테크네튬99m, 텔루륨121m, 텔루륨122m, 텔루륨125m, 툴륨165, 툴륨167, 툴륨168, 이트륨199 및 본 발명에 언급된 그 밖의 다른 방사성라벨을 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 방사성라벨;

- 염료, 촉매 또는 다른 검출가능한 그룹으로 더 표지될 수 있는 라텍스 또는 탄소 입자와 같은 입자; 급속 졸; 미소결정; 리포좀; 세포 등;

- 비오틴, 디옥시게닌 또는 5-브로모데옥시유리딘과 같은 분자;

- 예를 들어, 슈도모나스 (Pseudomonas) 외독소 (PE 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체), 디프테리아 (Diptheria) 독소 또는 그의 세포독성 단편 또는 돌연변이체, 보툴리눔 (botulinum) 독소 A, B, C, D, E 또는 F, 리신 또는 그의 세포독성 단편, 예를 들어, 리신 A, 애브린 또는 그의 세포독성 단편, 사포린 또는 그의 세포독성 단편, 포크위드 (pokeweed) 항바이러스성 독소 또는 그의 세포독성 단편 및 비리오딘 (bryodin) 1 또는 그의 세포독성 단편으로 구성된 그룹으로부터 선택된 독소 부위와 같은 독소 부위.

적합한 효소 및 조효소는 각각 본 발명에 온전히 참고로 포함된 US 4,275,149 (Litman, et al.) 및 US 4318980 (Boguslaski, et al.)에 기술되어 있다. 적합한 형광물질 및 화학발광물질은 본 발명에 온전히 참고로 포함된 US 4275149 (Litman, et al.)에 기술되어 있다. 라벨은 특정한 동계의 검출가능한 부위, 예를 들어, 표지된 아비딘 또는 스트렙타비딘에 대한 결합을 통해서 검출될 수 있는 비오틴과 같은 화학적 부위를 추가로 포함한다. 검출가능한 라벨은 본 기술분야에서 공지된 통상적인 화학을 사용하여 본 발명의 항체에 부착될 수 있다.

면역컨쥬게이트 또는 이들의 기능적 단편은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다. 이들은 직접, 또는 스페이서 그룹 또는 연결그룹, 예를 들어, 글루타르알데히드와 같은 폴리알데히드, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 디에틸렌-트리아민펜타아세트산 (DPTA)을 거쳐서, 치료학적 컨쥬게이트에 대해서 상기 언급된 것과 같은 커플링제의 존재 하에서 효소 또는 형광성 라벨에 커플링될 수 있다. 형광 타입의 라벨을 함유하는 컨쥬게이트는 이소티오시아네이트와의 반응에 의해서 제조될 수 있다.

치료학적 방사성동위원소를 항체에 직접 또는 상기 언급된 EDTA, DTPA와 같은 킬레이트화제를 거쳐서 커플링시키는 기존의 기술에 숙련된 전문가에게 공지된 방법은 진단에 사용될 수 있는 방사성원소에 대해서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 클로라민 T 방법 (68)에 의해 나트륨125로, 또는 그렇지 않으면, Crockford 등의 기술 [본 발명에 온전히 참고로 포함된 US 4424200]에 의해서 또는 Hnatowich (본 발명에 온전히 참고로 포함된 US 4,479,930)에 의해서 기술된 바와 같이 DTPA를 통해서 부착된 테크네튬99m으로 표지하는 것을 수행할 수 있다.

라벨은 다수의 방법에 의해 외부 수단에 의해서, 예를 들어, 시각적 검사, 전자기적 방사선, 열 및 화학적 시약에 의해서 검출할 수 있는 시그날을 생산할 수 있다. 라벨은 또한, 본 발명의 항체에 결합하는 또 다른 결합 성분에, 또는 지지체에 결합될 수도 있다.

라벨은 직접 시그날을 생산할 수 있으며, 따라서 시그날을 생산하는데 추가의 성분이 필요하지 않다. 다수의 유기 분자, 예를 들어, 형광물질은 자외선 및 가시광선을 흡수할 수 있으며, 여기에서 광흡수는 에너지를 이들 분자에 전이시켜, 이들을 여기된 에너지 상태로 상승시킨다. 그 후에, 이렇게 흡수된 에너지는 제2 파장에서 빛을 방출함으로써 소산된다. 이러한 제2 파장 방출은 또한 에너지를 표지된 수용기 분자에 전이시킬 수 있으며, 생성된 에너지는 빛의 방출, 예를 들어, 형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer; FRET)에 의해서 수용기 분자로부터 소산된다. 직접 시그날을 생산하는 다른 라벨에는 방사성 동위원소 및 염료가 포함된다.

대신으로, 라벨은 시그날을 생산하기 위해서 다른 성분을 필요로 할 수 있으며, 따라서 시그날 생성 시스템은 측정가능한 시그날을 생산하는데 필요한 모든 성분을 포함할 수 있으며, 이것은 기질, 조효소, 증진제, 추가의 효소, 효소적 생성물과 반응하는 물질, 촉매, 활성화제, 보조인자, 억제제, 스캐빈저, 금속 이온, 및 시그날 생성 물질의 결합에 필요한 특정의 결합 물질을 포함할 수 있다. 적합한 시그날 생성 시스템에 대한 상세한 검토는 본 발명에 온전히 참고로 포함된 US 5,185,243 (Ullman, et al.)에서 발견될 수 있다.

본 발명은 본 발명에 제공된 바와 같은 결합 성분의 IL-1R1에 대한 결합을 야기하거나 허용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 언급된 바와 같이, 이러한 결합은 생체내에서, 예를 들어, 결합 성분을 투여하거나 핵산을 인간 또는 동물 (예를 들어, 포유동물)에 대해서 코드화함으로써 일어날 수 있거나, 이것은 시험관내에서, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블럿팅 (Western blotting), 면역세포화학, 면역침강, 친화성 크로마토그래피, 및 생화학적 또는 세포-기본 시험방법에서 일어날 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 결합 성분과 IL-1R1 사이의 컴플렉스는 특히, 효소 결합된 면역시험, 방사성시험, 면역침강, 형광면역시험, 화학발광시험, 면역블럿 시험, 측방 유동 시험 (lateral flow assay), 응집시험 및 미립자-기본 시험에 의해서 검출될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 결합 성분을 예를 들어, 바이오센서 (biosensor) 시스템에서 사용함으로써 항원의 레벨을 직접 측정하는 것을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 (i) 결합 성분을 IL-1R1에 노출시키고, (ⅱ) 상기 결합 성분의 IL-1R1에 대한 결합을 검출하는 것을 포함하여, IL-1R1에 대한 결합을 검출 및/또는 측정하는 방법을 포함하며, 여기에서 결합은 본 발명에 기술된 어떤 방법 또는 검출가능한 라벨을 사용하여서라도 검출된다. 이것 및 본 발명에 기술된 어떤 다른 결합 검출방법이라도 예를 들어, 검출가능한 라벨을 시각적으로 관찰함으로써 본 발명을 수행하는 전문가에 의해서 직접 판단될 수 있다. 대신으로, 이 방법 또는 본 발명에 기술된 어떤 다른 결합 검출방법은 이 방법의 결과 또는 결과의 어떤 다른 시각적 또는 물리적 표시를 함유하는 오토래디오그래프 (autoradiograph), 사진, 컴퓨터 출력물, 유동세포분석 보고서, 그래프, 챠트, 시험관 또는 용기 또는 웰의 형태로 보고서를 제공할 수 있다.

IL-1R1에 대한 결합 성분의 결합의 양이 결정될 수 있다. 정량화는 진단적 관심의 대상일 수 있는 시험 샘플 내의 항원의 양과 관련될 수 있다. IL-1R1 결합에 대한 스크리닝 및/또는 그의 정량화는 예를 들어, 본 발명에 언급된 질병 또는 장애 및/또는 비정상적인 IL-1R1 생산, 발현 및/또는 활성을 수반하는 어떤 다른 질병 또는 장애에 대해서 환자를 스크리닝하는데 유용할 수 있다.

본 발명의 진단방법은 (i) 대상체로부터 조직 또는 유체 샘플을 수득하고, (ⅱ) 상기 조직 또는 유체 샘플을 본 발명의 하나 이상의 결합 성분에 노출시키고; (ⅲ) 결합된 IL-1R1을 대조 샘플과 비교함으로써 검출하는 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 대조군과 비교하여 IL-1R1 결합의 양의 증가는 IL-1R1 생산, 발현 또는 활성의 비정상적인 레벨을 나타낼 수 있다. 시험할 조직 또는 유체 샘플에는 혈액, 혈청, 뇨, 생검 물질, 종양, 또는 비정상적인 IL-1R1 레벨을 함유하는 것으로 의심되는 모든 조직이 포함될 수 있다. 비정상적인 IL-1R1 레벨 또는 활성에 대해서 양성으로 시험되는 대상체는 본 발명에서 이하에 기술되는 치료방법으로부터 효과를 볼 수 있다.

본 발명의 진단방법은 결합 성분과 IL-1R1의 컴플렉스를 고정화된 항원을 통해서 포착하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항원은 관심이 있는 샘플 내의 항원-특이적 IL-1R1을 포착하는 측방 스트립 시험 (lateral strip assay) 상에서 고정화될 수 있다.

본 기술분야에서 숙련된 전문가는 본 발명에 기술된 방법을 고려하여, 이들의 선택성 및 일반적인 지식에 따라 항원에 대한 결합 성분의 결합을 결정하는 적합한 모드를 선택할 수 있다.

샘플 내의 결합 성분의 반응성은 어떤 적절한 수단에 의해서라도 결정될 수 있다. 방사성면역시험 (RIA)이 하나의 가능성이다. 방사성 표지된 항원을 비표지된 항원 (시험 샘플)과 혼합시키고, 결합 성분에 결합하도록 한다. 결합된 항원을 비결합된 항원으로부터 물리적으로 분리시키고, 결합 성분에 결합된 방사성 항원의 양을 결정한다. 시험 샘플 내에 항원이 많을수록 더 적은 방사성 항원이 결합 성분에 결합할 것이다. 경쟁적 결합시험이 또한, 리포터 분자에 연결된 항원 또는 유사체를 사용하여 비-방사성 항원과 함께 사용될 수 있다. 리포터 분자는 스펙트럼적으로 분리된 흡수 또는 방출 특징을 갖는 형광색소, 인광체 또는 레이저 염료일 수 있다. 적합한 형광색소에는 플루오레세인, 로다민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red), 및 란타니드 킬레이트 또는 크립테이트가 포함된다. 적합한 색원성 염료에는 디아미노벤지딘이 포함된다.

그 밖의 다른 리포터에는 착색되거나 자기성이거나 상자성인 라텍스 비드와 같은 콜로이드성 입자 또는 미립체 물질, 및 시각적으로 관찰되거나, 전자적으로 검출되거나 다른 식으로 기록되는 검출가능한 시그날을 직접 또는 간접적으로 야기할 수 있는 생물학적 또는 화학적 활성제가 포함된다. 이들 분자는 예를 들어, 색상을 나타내거나 변화시키거나, 전기적 특성의 변화를 야기하는 반응을 촉진시키는 효소일 수 있다. 이들은 에너지 상태 사이의 전자 전이가 특징적인 스펙트럼 흡수 또는 방출을 야기하도록 분자적으로 흥분할 수 있다. 이들은 바이오센서와 함께 사용된 화학적 실체를 포함할 수 있다. 비오틴/아비딘 또는 비오틴/스트렙타비딘 및 알칼리성 포스파타제 검출 시스템이 이용될 수 있다.

각각의 결합 성분-리포터 컨쥬게이트에 의해서 생성된 시그날을 사용하여 샘플 (정상 및 시험) 내의 해당하는 결합 성분 결합의 정량가능한 절대적 또는 상대적 데이터를 도출할 수 있다.

본 발명의 어떤 관점 또는 구체예에 따른 결합 성분을 포함하는 키트가 또한 본 발명의 관점으로서 제공된다. 키트에서, 결합 성분은, 예를 들어, 이하에 더 기술되는 바와 같이, 샘플 내에서의 그의 반응성이 결정될 수 있도록 표지될 수 있다. 추가로, 결합 성분은 고체 지지체에 부착되거나 부착되지 않을 수 있다. 키트의 성분은 일반적으로 무균성이며, 밀봉된 바이알 또는 다른 용기 내에 존재한다. 키트는 결합 성분이 유용한 진단적 분석 또는 다른 방법에서 사용될 수 있다. 키트는 방법, 예를 들어, 본 발명에 따른 방법에서 성분들을 사용하는데 대한설명서를 함유할 수 있다. 이러한 방법을 수행하는데 도움을 주거나 방법을 수행할 수 있도록 하는 보조물질이 본 발명의 키트 내에 포함될 수 있다. 보조물질에는 제1 결합 성분에 결합하고, 검출가능한 라벨 (예를 들어, 형광성 라벨, 방사성 동위원소 또는 효소)에 컨쥬게이트되는 제2의 상이한 결합 성분이 포함된다. 항체-기본 키트는 또한, 면역침강을 수행하기 위한 비드를 포함할 수도 있다. 키트의 각각의 성분은 일반적으로 그 자신에 적합한 용기 내에 존재한다. 따라서, 이들 키트는 일반적으로 각각의 결합 성분에 대해서 적합한 별개의 용기들을 포함한다. 추가로, 키트는 시험 및 방법을 수행하고 시험을 수행함으로써 제공된 데이터를 해석하고 분석하는 설명서를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 경쟁시험에서 항원 레벨을 측정하기 위한 상기한 바와 같은 결합 성분의 용도, 즉 경쟁시험에서 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 결합 성분을 이용함으로써 샘플 내의 항원의 레벨을 측정하는 방법을 제공한다. 이것은 비결합된 항원으로부터 결합된 것의 물리적 분리를 필요로 하지 않을 수 있다. 물리적 또는 광학적 변화가 결합 상에서 나타나도록 결합 성분에 대해 리포터 분자를 연결시키는 것이 하나의 실행가능한 것이다. 리포터 분자는 정량할 수 있는 검출가능한 시그날을 직접 또는 간접적으로 생성할 수 있다. 리포터 분자의 연결은 직접 또는 간접적이거나, 예를 들어, 펩타이드 결합을 통해서 공유적이거나, 비-공유적일 수 있다. 펩타이드 결합을 통한 연결은 항체 및 리포터 분자를 코드화한 유전자 융합물의 재조합체 발현의 결과일 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 (i) IL-1R1을 지지체에 고정시키고, (ⅱ) 상기 고정화된 IL-1R1을 동시에 또는 단계적 방식으로, 본 발명에 따른 적어도 하나의 태깅되거나 표지된 결합 성분, 및 하나 이상의 태깅되지 않거나 비표지된 시험 결합성 화합물과 접촉시키고, (ⅲ) 태깅된 결합 성분으로부터 결합된 태그의 양의 감소를 관찰함으로써 새로운 IL-1R1 결합성 화합물을 확인하는 것을 포함하여, IL-1R1 결합 화합물을 확인하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 다중웰 (multiwell) 또는 어레이 (array) 형식을 사용하여 고처리량 방식으로 수행될 수 있다. 이러한 시험은 또한 용액 상에서 수행될 수도 있다 [참조: 예를 들어, 본 발명에 온전히 참고로 포함된 U.S. 5,814,468]. 상술한 바와 같이, 결합의 검출은 예를 들어, 검출가능한 라벨, 또는 그의 존재 하에서의 감소를 시각적으로 관찰함으로써 방법을 수행한 전문가에 의해서 직접 해석될 수 있다. 대신으로, 본 발명의 결합 방법은 이 방법의 결과 또는 결과의 어떤 다른 시각적 또는 물리적 표시를 함유하는 오토래디오그래프, 사진, 컴퓨터 출력물, 유동세포분석 보고서, 그래프, 챠트, 시험관 또는 용기 또는 웰의 형태로 보고서를 제공할 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명의 결합 성분을 코드화한 분리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및/또는 RNA를 포함할 수 있다. 하나의 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 CDR 또는 CDRs의 세트 또는 VH 도메인 또는 VL 도메인 또는 항체 항원 결합-부위 또는 항체 분자, 예를 들어, scFv 또는 IgG1에 대해서 코드화한 핵산을 제공한다.

추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 결합 성분, 본 발명에 따른 VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 코드화한 서열을 포함하는 분리된 핵산을 제공한다. 예를 들어, SEQ ID NOS: 92, 2, 122, 102, 12, 62, 22, 32, 72, 42, 112, 52, 및 82는 본 발명의 예시적인 VH 도메인을 코드화하며, SEQ ID NOS: 97, 7, 127, 107, 17, 67, 27, 37, 77, 47, 117, 57, 및 87은 본 발명의 예시적인 VL 도메인을 코드화한다.

본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태인 구성체를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 하나 이상의 구성체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하며, 상기 코드화 구성체로부터의 발현을 포함하여 코드화된 생성물을 생산하는 방법을 제공한다. 발현은 적절한 조건 하에서 구성체를 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산에 이어서, VH 또는 VL 도메인 또는 결합 성분은 어떤 적합한 기술을 사용하여서라도 분리 및/또는 정제한 다음에 필요에 따라서 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있으며, 전체적으로 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 본 발명에 설명된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열에 대한 언급은 명시된 서열을 갖는 DNA 분자를 포함하며, 문맥이 다른 식으로 필요로 하지 않는 한, U가 T에 대해서 치환된 명시된 서열을 갖는 RNA 분자를 포함한다.

또한 추가의 관점은 코드화 핵산으로부터의 발현을 야기하는 것을 포함하여, 항체 또는 VH 가변 도메인을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 항체 VH 가변 도메인의 생산을 위한 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

VL 가변 도메인, 및 VH 및/또는 VL 도메인을 포함하는 항체와 같은 결합 성분을 생산하는 유사한 방법이 본 발명의 추가의 관점으로 제공된다.

생산방법은 생성물을 분리 및/또는 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 생산방법은 생성물을 약제학적으로 허용되는 부형제와 같은 적어도 하나의 추가의 성분을 포함하는 조성물로 제제화하는 것을 포함할 수 있다.

다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현시키는 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포에는 박테리아, 포유동물 세포, 식물 세포, 사상 진균, 효모 및 바큘로바이러스 시스템 및 유전자이식 식물 및 동물이 포함된다. 원핵세포 내에서 항체 및 항체 단편의 발현은 본 기술분야에서 잘 확립되어 있다. 검토를 위해서는 예를 들어, 문헌 [Pluckthun (69)]을 참고로 한다. 통상적인 박테리아 숙주는 이. 콜라이 (E. coli)이다.

배양물 중의 진핵세포 내에서의 발현은 또한 결합 성분의 생산을 위한 옵션으로서 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 이용될 수 있다 (70, 71, 72). 이종 폴리펩타이드의 발현을 위해서 본 기술분야에서 이용할 수 있는 포유동물 세포주에는 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary; CHO) 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 (baby hamster) 신장 세포, NS0 마우스 흑색종 세포, YB2/0 랫트 골수종 세포, 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 망막 세포 및 그 밖의 다수가 포함된다.

적절하게는 프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 그 밖의 다른 서열을 포함하는 적절한 조절서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택되거나 구성될 수 있다. 벡터는 적절하게는 플라스미드, 예를 들어, 파지미드 (phagemid), 또는 바이러스성, 예를 들어, '파지'일 수 있다 (73). 예를 들어, 핵산 구성체의 제조, 돌연변이유발, 서열결정, DNA의 세포 내로의 도입 및 유전자 발현, 및 단백질의 분석에 있어서 핵산을 조작하는 다수의 공지된 기술 및 프로토콜은 문헌 [Ausubel et al. (74)]에 상세히 기술되어 있다.

본 발명의 추가의 관점은 본 발명에 기술된 바와 같은 핵산을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 이러한 숙주 세포는 시험관내에 존재할 수 있으며, 배양물 내에 존재할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 생체내에 존재할 수 있다. 숙주 세포의 생체내 존재는 "인트라바디 (intrabodies)" 또는 세포내 항체로서의 본 발명의 결합 성분의 세포내 발현을 허용할 수 있다. 인트라바디는 유전자 요법을 위해서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 핵산을 상기 결합 성분, VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 생산을 초래하는 조건 하에서 발현시키고, 결합 성분을 분리 또는 정제함으로써 이것을 회수하는 것을 포함하여, 본 발명의 결합 성분, VH 도메인 및/또는 VL 도메인을 제조하는 방법을 포함한다.

또한 추가의 관점은 본 발명의 핵산을 숙주 세포 내로 도입시키는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 도입은 어떤 이용가능한 기술이라도 이용할 수 있다. 진핵세포의 경우에, 적합한 기술에는 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개된 형질감염, 및 레트로바이러스 또는 그 밖의 다른 바이러스, 예를 들어, 백시니아, 또는 곤충 세포의 경우에는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입이 포함될 수 있다. 핵산을 숙주 세포, 특히 진핵세포 내에 도입시키는 것은 바이러스 또는 플라스미드 기본 시스템을 사용할 수 있다. 플라스미드 시스템은 에피좀적으로 유지될 수 있거나, 숙주 세포 내로, 또는 인공 염색체 내로 통합될 수 있다. 통합은 단일 또는 다수의 유전자좌에서의 하나 이상의 카피의 랜덤 또는 표적화된 통합에 의한 것일 수 있다. 박테리아 세포의 경우에, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.

도입에 이어서 예를 들어, 숙주 세포를 유전자의 발현을 위한 조건 하에서 배양함으로써, 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용할 수 있다. 발현된 생성물의 정제는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법에 의해서 달성될 수 있다.

본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체) 내로 통합될 수 있다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 봉입시킴으로써 촉진될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 결합 성분 또는 폴리펩타이드를 발현시키기 위해서 발현 시스템 내에서 상기 언급한 바와 같은 구성체를 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

일반적으로, 특히 쥐 기원의 모노클로날 항체 또는 이들의 기능적 단편의 제조를 위해서는 특히 매뉴얼 ["Antibodies"] (75)에 기술된 기술, 또는 문헌 [Kohler and Milstein (12)]에 기술된 하이브리도마로부터의 제조 기술을 참고로 할 수 있다.

모노클로날 항체는 예를 들어, IL-1R1 또는 상기 모노클로날 항체에 의해서 인식되는 에피토프를 함유하는 그의 단편 중의 하나에 대해서 면역화된 동물로부터 수득된 세포로부터 수득될 수 있다. 이들을 포함하는 적합한 단편 및 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 사용하여 동물을 면역시켜 IL-1R1에 대한 항체를 생성시킬 수 있다. 상기 IL-1R1, 또는 그의 단편 중의 하나는 특히, IL-1R1 또는 그의 단편에 대해 코드화한 cDNA 서열 내에 함유된 핵산 서열로 출발하는 유전자 재조합에 의해서, IL-1R1 및/또는 그의 단편의 펩타이드 서열 내에 포함된 아미노산의 서열로부터 출발하는 펩타이드 합성에 의해서 통상적인 작업방법에 따라 생산될 수 있다.

모노클로날 항체는 예를 들어, 상기 모노클로날 항체에 의해서 인식된 에피토프를 함유하는 IL-1R1 또는 그의 단편 중의 하나가 이미 고정화되어 있는 친화성 칼럼 상에서 정제될 수 있다. 더욱 특히, 모노클로날 항체는 단백질 A 및/또는 G 상에서의 크로마토그래피에 의해서 정제될 수 있으며, 이어서 잔류하는 단백질 오염물질뿐만 아니라 DNA 및 리포폴리사카라이드 (LPS)를 제거하는 목적의 이온-교환 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않고, 이어서 다이머 또는 다른 멀티머 (multimers)의 존재에 기인한 잠재적인 응집체를 제거하기 위한 세파로즈 (Sepharose™) 겔 상에서의 배제 크로마토그래피를 수행하거나 수행하지 않을 수 있다. 하나의 구체예에서, 이들 기술의 전체는 동시에 또는 연속적으로 사용될 수 있다.

표적 항원을 결합시키는 다른 항체 또는 키메릭 분자를 생산하기 위해서 모노클로날 및 그 밖의 다른 항체를 취하고, 재조합 DNA 기술의 기술을 사용할 수 있다. 이러한 기술은 항체의 면역글로불린 가변 부분 또는 CDRs를 상이한 면역글로불린의 불변 부분, 또는 불변 부분과 함께 골격 부분에 도입시키는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, EP-A-184187, GB　2188638A 또는 EP-A-239400, 및 대량의 후속 문헌을 참고로 한다. 항체를 생산하는 하이브리도마 또는 다른 세포는 생산된 항체의 결합 특이성을 변화시킬 수 있거나 없는 유전자 돌연변이 또는 다른 변화가 일어날 수 있다.

항체 조작의 기술분야에서 이용할 수 있는 추가의 기술은 인간 및 인간화된 항체를 분리하는 것이 가능하도록 한다. 예를 들어, 인간 하이브리도마는 문헌 [Kontermann & Dubel (77)]에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 결합 성분을 생성시키기 위한 또 다른 정립된기술인 파지 디스플레이 (phage display)는 문헌 [Kontermann & Dubel (77)] 및 WO92/01047 (이하에서 더 검토함), 및 미국 특허 US　5,969,108, US 5,565,332, US 5,733,743, US 5,858,657, US 5,871,907, US 5,872,215, US　5,885,793, US 5,962,255, US 6,140,471, US 6,172,197, US 6,225,447, US 6,291,650, US　6,492,160 및 US 6,521,404와 같은 다수의 문헌에 상세히 기술되어 있다.

마우스 면역 시스템의 다른 성분들은 온전히 유지시키면서 마우스 항체 유전자를 불활성화시키고, 기능적으로 인간 항체 유전자로 대체시킨 유전자이식 마우스가 인간 항체를 분리시키기 위해서 사용될 수 있다 (78). 인간화된 항체는 예를 들어, WO91/09967, US 5,585,089, EP592106, US 5,565,332 및 WO93/17105에 기술된 것과 같은 본 기술분야에서 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 추가로, WO2004/006955는 비-인간 항체의 가변 부분의 CDR 서열에 대한 표준 CDR 구조 타입을 인간 항체 서열의 라이브러리, 예를 들어, 배선 항체 유전자 절편으로부터의 상응하는 CDRs에 대한 표준 CDR 구조 타입과 비교함으로써 인간 항체 유전자로부터 가변 부분 골격 서열을 선택하는 것을 기초로 하는, 항체의 인간화 방법을 기술하고 있다. 비-인간 CDRs와 유사한 표준 CDR 구조 타입을 갖는 인간 항체 가변 부분은 인간 골격 서열을 선택하는 인간 항체 서열 구성원의 서브세트를 형성한다. 서브세트 구성원은 인간과 비-인간 CDR 서열 사이의 아미노산 유사성에 의해서 더 등급이 매겨질 수 있다. WO2004/006955의 방법에서, 상위 등급의 인간 서열은 선택된 서브세트 구성원 인간 골격을 사용하여 인간 CDR 서열을 비-인간 CDR 등가물로 기능적으로 대체시킴으로써 비-인간 및 인간 항체 사이의 골격 서열을 비교할 필요가 없이 고친화성 및 저면역원성을 갖는 인간화된 항체를 제공하는 키메릭 항체를 구성하기 위한 골격 서열을 제공하기 위해서 선택된다. 이 방법에 따라 제조된 키메릭 항체도 또한 기술된다.

합성 항체 분자는 예를 들어, 문헌 [Knappik et al. (79) 또는 Krebs et al. (80)]에 기술된 바와 같이, 적합한 발현 벡터 내에서 합성 및 조립된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 생성된 유전자로부터의 발현에 의해서 생성될 수 있다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 따른 결합 성분은 IL-1R1의 생물학적 활성을 변조시키고, 중화시킬 수 있다. 본 발명에 기술된 바와 같이, 본 발명의 IL-1R1 결합 성분은 중화 효력에 대해서 최적화될 수 있다. 일반적으로, 효력 최적화는 선택된 결합 성분 (통상적으로 항체의 가변 도메인 서열)의 서열을 돌연변이시켜 결합 성분의 라이브러리를 생성시킨 다음에, 효력에 대해서 시험하는 것을 포함하며, 더 강력한 결합 성분이 선택된다. 따라서, 선택된 "효력-최적화된" 결합 성분은 라이브러리가 생성된 결합 성분보다 더 큰 효력을 갖는 경향이 있다. 그럼에도 불구하고, 고효력 결합 성분은 또한 최적화 없이 수득될 수도 있으며, 예를 들어, 고효력 결합 성분은 초기 스크린, 예를 들어, 생화학적 중화시험으로부터 직접 수득될 수 있다. "효력 최적화된" 결합 성분은 특별한 활성 또는 하류 기능의 중화의 최적화된 효력을 갖는 결합 성분을 나타낸다. 시험방법 및 효력은 본 발명의 다른 부분에서 더 상세하게 기술된다. 본 발명은 효력-최적화 및 비-최적화 결합 성분 둘 다뿐만 아니라 선택된 결합 성분으로부터 효력을 최적화하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 숙련된 전문가가 고효력을 갖는 결합 성분을 생성하도록 한다.

비록 효력 최적화를 사용하여 소정의 결합 성분으로부터 고효력 결합 성분을 생성시킬 수 있지만, 고효력 결합 성분은 효력 최적화가 없이도 수득될 수 있다는 것을 또한 주목하여야 한다.

추가의 관점에서, 본 발명은 항원에 결합할 수 있는 하나 이상의 결합 성분을 수득하는 방법, 본 발명에 따른 결합 성분의 라이브러리와 상기 항원을 접촉시키고, 상기 항원을 결합시킬 수 있는 라이브러리의 하나 이상의 결합 성분을 선택하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

라이브러리는 입자 또는 분자 컴플렉스, 예를 들어, 효모, 박테리아 또는 박테리오파지 (예를 들어, T7) 입자와 같은 복제가능한 유전자 패키지, 바이러스, 세포 또는 공유적, 리보좀성 또는 그 밖의 다른 시험관내 디스플레이 시스템상에서 디스플레이될 수 있으며, 각각의 입자 또는 분자 컴플렉스는 그 위에서 디스플레이된 항체 VH 가변 도메인, 및 임의로 또한, 존재하는 경우에는 디스플레이된 VL 도메인을 코드화한 핵산을 함유한다. 파지 디스플레이는 각각 본 발명에 온전히 참고로 포함된 WO 92/01047 및, 예를 들어, 미국 특허 US 5,969,108, US 5,565,332, US 5,733,743, US 5,858,657, US 5,871,907, US 5,872,215, US 5,885,793, US 5,962,255, US 6,140,471, US 6,172,197, US 6,225,447, US 6,291,650, US 6,492,160 및 US 6,521,404에 기술되어 있다.

항원을 결합시킬 수 있고, 박테리오파지 또는 다른 라이브러리 입자 또는 분자 컴플렉스 상에서 디스플레이된 결합 성분의 선택 후에, 핵산은 선택된 결합 성분을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 컴플렉스로부터 채취될 수 있다. 이러한 핵산은 상기의 선택된 결합 성분을 디스플레이하는 박테리오파지 또는 다른 입자 또는 분자 컴플렉스로부터 채취된 핵산의 서열을 갖는 핵산으로부터의 발현에 의해서 결합 성분 또는 항체 VH 또는 VL 가변 도메인의 후속 생산 시에 사용될 수 있다.

상기의 선택된 결합 성분의 항체 VH 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 항체 VH 가변 도메인은 이러한 VH 도메인을 포함하는 결합 성분일 수 있는 것으로서 분리된 형태로 제공될 수 있다.

IL-1R1을 결합시키는 능력은 IL-1R1에 대한 결합에 관해서 예를 들어, 모항체 분자 (항체 1 또는 4) 또는 항체 분자 2, 3, 5 내지 10 (예를 들어, scFv 형식 및/또는 IgG 형식, 예를 들어, IgG1으로)와 경쟁하는 능력을 더 시험할 수 있다. IL-1R1을 중화시키는 능력은 본 발명은 다른 부분에서 더 거론되는 같이 시험할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 성분은 모항체 (항체 1 또는 4) 또는 다른 항체 분자, 예를 들어, scFv, 또는 항체 2, 3, 5 내지 10 중의 하나, 예를 들어, IgG1의 친화성으로, 또는 더 우수한 친화성으로 결합할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 성분은 모항체 (항체 1 또는 4) 또는 다른 항체 분자, 항체 2, 3, 5 내지 10 중의 하나, 예를 들어, scFv, 또는 IgG1의 효력으로, 또는 더 우수한 효력으로 IL-1R1의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다.

상이한 결합 성분의 결합 친화성 및 중화 효력은 적절한 조건 하에서 비교될 수 있다.

본 발명에 설명된 아미노산 서열을 갖는 것을 포함하며, IL-1R1에 대한 결합 성분에서 사용될 수 있는 본 발명의 VH 및 VL 도메인의 변이체 및 CDRs는 서열 변경 또는 돌연변이의 방법 및 바람직한 특징을 갖는 항원 결합 성분에 대해 스크리닝을 이용함으로써 수득될 수 있다. 바람직한 특징의 예는 다음을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다:

● 항원에 대해서 특이적인 공지의 항체에 비해서 항원에 대해 증가된 결합 친화성

● 활성이 공지된 경우에는, 항원에 대해서 특이적인 공지의 항체에 비해서 항원 활성의 증가된 중화

● 특정의 몰 비에서 항원에 대해 공지의 항체 또는 리간드와의 명시된 경쟁적 능력

● 컴플렉스를 면역침전시키는 능력

● 명시된 에피토프에 결합하는 능력

○ 선형 에피토프, 예를 들어, 본 발명에 기술된 바와 같이 펩타이드 결합 스캔을 사용하여, 예를 들어, 선형 및/또는 속박된 배좌에서 스크리닝된 펩타이드를 사용하여 확인된 펩타이드 서열

○ 비-연속적 잔기에 의해서 형성된 배좌 (conformational) 에피토프

● IL-1R1, 또는 하류 분자의 새로운 생물학적 활성을 변조시키는 능력

이러한 방법도 또한 본 발명에서 제공된다.

본 발명에 기술된 항체 분자의 변이체는 본 발명에서 생산 및 사용될 수 있다. 구조/특성-활성 관계에 다변량 데이터 분석 기술을 적용함에 있어서의 계산 화학의 리드 (lead)에 따라 (81), 항체의 정량적 활성-특성 관계는 통계적 회귀, 패턴 인식 및 분류와 같은 잘 알려진 수학적 기술을 사용하여 유도될 수 있다 (82, 83, 84, 85, 86, 87). 항체의 특성은 항체 서열, 기능적 및 삼차원적 구조의 경험적 및 이론적 모델 (예를 들어, 가능한 접촉 잔기의 분석 또는 계산된 물리화학적 특성)로부터 유도될 수 있으며, 이들 특성은 단독으로, 및 조합하여 고려될 수 있다.

VH 도메인 및 VL 도메인으로 구성된 항체 항원 결합-부위는 전형적으로는, 폴리펩타이드의 6 개의 루프, 즉 경쇄 가변 도메인 (VL)으로부터의 3 개 및 중쇄 가변 도메인 (VH)으로부터의 3 개에 의해서 형성된다. 공지된 원자 구조의 항체의 분석은 항체 결합 부위의 서열 및 삼차원적 구조 사이의 관계를 설명하였다 (88, 89). 이들 관계는 VH 도메인 내의 세 번째 부분 (루프)을 제외하고는, 결합 부위 루프가 작은 수의 주쇄 배좌 중의 하나를 갖는다는 것을 나타낸다: 표준 구조. 특정한 루프에서 형성된 표준 구조는 그의 크기, 및 루프 및 골격 부분 모두에서 주요 부위에서의 특정 잔기의 존재에 의해서 결정되는 것으로 나타났다 (88, 89).

이러한 서열-구조 관계의 연구는 공지된 서열, 및 미지의 삼차원적 구조의 항체 내에서 그의 CDR 루프의 삼차원적 구조를 유지시키고, 따라서 결합 특이성을 유지시키는데 중요한 이들 잔기를 예견하기 위해서 사용될 수 있다. 이들 예견은 리드 (lead) 최적화 실험으로부터의 산물에 대한 예견의 비교에 의해서 뒷받침될 수 있다. 구조적 접근방법에서, 모델은 WAM (91)과 같은 어떤 자유롭게 이용할 수 있거나 상업적인 패키지를 사용하여서라도 항체 분자를 생성할 수 있다 (90). 그 후, Insight II (Accelrys, Inc, San Diego, USA.) 또는 Deep View (92)와 같은 단백질 가시화 및 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 CDR 내의 각 위치에서 가능한 치환을 평가할 수 있다. 그 후, 이 정보를 사용하여 활성에 대해서 최소 또는 유익한 효과를 가질 것 같은 치환을 만들 수 있다.

CDRs, 항체 VH 또는 VL 도메인 및 결합 성분의 아미노산 서열 내에 치환을 만드는데 필요한 기술은 일반적으로 본 기술분야에서 이용할 수 있다. 변이체 서열은 활성에 대해서 최소 또는 유익한 효과를 갖는 것으로 예상될 수 있거나 예상될 없는 치환에 의해서 만들어질 수 있으며, IL-1R1을 결합시키고/시키거나 중화시키는 능력에 대해서 및/또는 어떤 다른 바람직한 특성에 대해서 시험할 수 있다.

본 발명에서 사용된 가변 도메인은 어떤 배선 또는 재배열된 인간 가변 도메인으로부터 수득 또는 유도될 수 있거나, 공지된 인간 가변 도메인의 공통 (consensus) 또는 실제 서열을 기초로 하는 합성 가변 도메인일 수 있다. 가변 도메인은 비-인간 항체로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 CDR 서열 (예를 들어, HCDR3)은 재조합 DNA 기술을 사용하여 CDR (예를 들어, HCDR3)이 결여된 가변 도메인의 레퍼토리 (repertoire) 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, Marks 등 (93)은 항체 가변 도메인의 레퍼토리를 생산하는 방법을 기술하였으며, 여기에서는 항체 가변 도메인 구역의 5' 말단으로 유도되거나 그에 근접한 공통 프라이머를 인간 VH 유전자의 세 번째 골격 부분에 대한 공통 프라이머와 함께 사용하여 CDR2가 결여된 VH 가변 도메인의 레퍼토리를 제공한다. Marks 등은 더 나아가 이 레퍼토리를 어떻게 특정한 항체의 CDR2와 조합할 수 있는지를 기술하였다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR2-유도된 서열은 CDR2이 결여된 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리와 셔플 (shuffle)될 수 있으며, 셔플된 완전한 VH 또는 VL 도메인은 동계 VL 또는 VH 도메인과 조합하여 본 발명의 결합 성분을 제공한다. 그 후, 레퍼토리는 적합한 결합 성분이 선택될 수 있도록, 본 발명에 온전히 참고로 포함된 WO92/01047, 또는 Kay, Winter & McCafferty (94)를 포함하는 이후의 대량의 문헌 중의 어떤 것에서의 파지 디스플레이 시스템과 같은 적합한 숙주 시스템 내에서 디스플레이될 수 있다. 레퍼토리는 10⁴ 개의 개개 구성원 이상, 예를 들어, 적어도 10⁵, 적어도 10⁶, 적어도 10⁷, 적어도 10⁸, 적어도 10⁹ 또는 적어도 10¹⁰ 개의 구성원 또는 그 이상으로부터의 어떤 것으로부터나 구성될 수 있다. 다른 적합한 숙주 시스템에는 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, T7 디스플레이, 바이러스 디스플레이, 세포 디스플레이, 리보좀 디스플레이 및 공유적 디스플레이가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.

IL-1R1 항원에 대한 결합 성분을 제조하는 방법이 제공되며, 이 방법은

(a) 대체될 CDR2를 포함하거나, CDR2 코드화 부분을 결여하는 VH 도메인을 코드화한 핵산의 출발 레퍼토리를 제공하고;

(b) 상기 레퍼토리를 실질적으로 VH CDR2에 대해서 본 발명에 설명된 바와 같은 아미노산 서열을 코드화한 공여체 핵산과 조합하여 상기 공여체 핵산 서열이 레퍼토리 내의 CDR2 부분에 삽입되도록 하여 VH 도메인을 코드화한 핵산의 생성물 레퍼토리를 제공하고;

(c) 상기 생성물 레퍼토리의 핵산을 발현시키고;

(d) IL-1R1에 대한 결합 성분을 선택하고;

(e) 상기 결합 성분 또는 그를 코드화한 핵산을 회수하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 VH 또는 VL CDR3을 대체될 CDR3을 포함하거나, CDR3 코드화 부분을 결여하는 VH 또는 VL 도메인을 코드화한 핵산의 레퍼토리와 조합하는 유사한 방법이 이용될 수도 있다.

유사하게, 하나 이상, 또는 3 개 모두의 CDRs를 VH 또는 VL 도메인의 레퍼토리 내에 이식할 수 있으며, 그 다음에 이들은 IL-1R1에 대한 결합 성분 또는 결합 성분들에 대해서 스크리닝할 수 있다.

유사하게, 본 발명에 기술된 다른 VH 및 VL 도메인, CDRs의 세트 및 HCDRs의 세트 및/또는 LCDRs의 세트가 사용될 수 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 실질적 부분은 그들의 개입성 골격 부분과 함께 적어도 3 개의 CDR 부분을 포함할 수 있다. 이 부분은 또한 적어도 약 50%의 첫 번째 및 네 번째 골격 부분 중의 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있으며, 50%는 첫 번째 골격 부분의 C-말단 50% 및 네 번째 골격 부분의 N-말단 50%이다. 가변 도메인의 실질적 부분의 N-말단 또는 C-말단 종단에서의 추가의 잔기는 천연적으로 존재하는 가변 도메인 부분과 통상적으로 결합되지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술에 의해서 제조된 본 발명의 결합 성분의 구성은 클로닝 또는 다른 조작 단계를 촉진하도록 도입된 링커에 의해서 코드화된 N-　또는 C-말단 잔기의 도입을 야기할 수 있다. 다른 조작 단계에는 본 발명의 가변 도메인을, 본 발명의 다른 부분에서 더 상세히 거론되는 바와 같은 항체 불변 부분, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 디아바디의 생산 시에) 또는 검출가능한/기능적 라벨을 포함하는 추가의 단백질 서열에 접합시키기 위한 링커의 도입을 포함한다.

본 발명의 일부의 관점에서, 결합 성분은 VH 및 VL 도메인의 쌍을 포함하지만, VH 또는 VL 도메인을 기초로 하는 단일 결합 도메인은 본 발명의 추가의 관점을 형성한다. 단일 면역글로불린 도메인, 특히 VH 도메인은 특이적 방식으로 표적 항원을 결합시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, dAbs의 검토를 참고로 한다.

단일 결합 도메인 중의 어느 하나의 경우에, 이들 영역은 IL-1R1을 결합시킬 수 있는 2-영역 결합 성분을 형성할 수 있는 상보적 영역에 대해서 스크리닝하기 위해서 사용될 수 있다. 이것은 본 발명에 온전히 참고로 포함된 WO92/01047에 기술된 바와 같은 소위 계층적 이중 조합적 접근방법 (hierarchial dual combinatorial approach)을 사용한 파지 디스플레이 스크리닝 방법에 의해서 달성될 수 있으며, 여기에서는 H 또는 L 쇄 클론을 함유하는 각각의 콜로니를 사용하여 다른 쇄 (L 또는 H)를 코드화한 클론의 완전한 라이브러리를 감염시키고, 생성된 2-쇄 결합 성분을 이하의 문헌에 기술된 것과 같은 파지 디스플레이 기술에 따라 선택한다. 이 기술은 또한 문헌 [Marks et al, ibid.]에 기술되어 있다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 20 개의 표준 "아미노산" 및 이들의 약어는 통상적인 관례에 따른다. 본 발명에 온전히 참고로 포함된 문헌 [Immunology - A Synthesis (2^nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)]을 참고로 한다. 20 개의 통상적인 아미노산, α-,α-이치환된 아미노산과 같은 비천연 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산 및 그 밖의 다른 비정규적인 아미노산의 입체이성체 (예를 들어, D-아미노산)가 또한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대해서 적합한 성분일 수 있다. 비정규적인 아미노산의 예로는 다음이 포함된다: 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸리신, ε-N-아세틸리신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, σ-N-메틸아르기닌 및 기타 유사한 아미노산 및 이미노산 (예를 들어, 4-하이드록시프롤린). 본 발명에서 사용된 폴리펩타이드 표시법에서, 표준 관계 및 협약에 따라 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 우측 방향은 카복시-말단 방향이다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "알로타입"은 항체 유전자의 대립유전자 형태에 의해서 명시되는 항원성 결정인자에 관하여 사용된다. 알로타입은 상이한 개체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노산 서열에서 약간의 차이를 나타내며, 서브클래스의 대립유전자들 사이에서의 서열 차이이고, 이에 의해서 항혈청은 단지 대립유전자 차이만을 인식한다. 가장 중요한 타입은 Gm (중쇄) 및 Km (경쇄)이다. Gm 다형성은 인간 IgGI, lgG2 및 lgG3 분자의 마커에 대한 G1m, G2m, 및 G3m 알로타입으로 불리는 알로타입 항원 결정인자를 코드화한 대립유전자를 갖는 IGHG1, IGHG2 및 IGHG3 유전자에 의해서 결정된다. 현재, 18 Gm 알로타입이 알려져 있다: G1m (1, 2, 3, 17) 또는 G1m (a, x, f, z), G2m (23) 또는 G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g, 1, c5, u, v, g5) [Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-21 1, 이들은 둘 다 온전히 참고로 포함된다].

인간 면역글로불린의 대립유전자 형태는 잘 특정화되어있다 [WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J lmmunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; E. van Loghem, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-51, 이들은 모두 온전히 참고로 포함된다]. 추가로, 다른 다형성이 특정화되었다 [Kim et al., 2001, J. MoI. Evol. 54:1-9, 온전히 참고로 포함된다].

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 올리고클로날, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메릭 항체, CDR-이식 항체, 다중-특이성 항체, 이중-특이성 항체, 촉매적 항체, 키메릭 항체, 인간화된 항체, 완전한 인간 항체 또는 항-이디오타입 항체, 및 단독으로 또는 공지된 기술에 의해서 제공된 다른 아미노산 서열과 함께 가용성 또는 결합된 형태뿐만 아니라 그의 단편, 변이체 또는 유도체로 표지될 수 있는 항체를 나타낸다. 항체는 어떤 종으로부터라도 유래할 수 있다. 용어 항체는 또한, 본 발명의 항체의 결합 단편을 포함하며; 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, 단일 스트랜드 항체 (svFC), 다이머성 가변 부분 (디아바디), 트리아바디, 테트라바디, 미니바디 및 디설파이드 안정화된 가변 부분 (dsFv)이 포함된다.

항체는 전형적으로 폴리펩타이드 쇄의 2 개의 동일한 쌍을 포함하는 테트라머 형태를 가지며, 여기에서 각각의 쌍은 하나의 "경"쇄 및 하나의 "중"쇄를 갖는다. 각각의 경/중쇄 쌍의 가변 부분은 항체 결합 부위를 형성한다. 항체는 천연적이거나 부분적이거나 완전하게 합성에 의해서 생산된 항체를 나타낸다. 여기에서, 본 발명은 천연적인 형태의 항체에 관련된 것이 아니며, 즉 이들은 이들의 천연적 환경에 존재하지 않지만, 천연 공급원으로부터의 정제에 의해서 분리 또는 수득되거나, 그렇지 않으면 유전자 재조합에 의해서, 또는 비천연 아미노산에 의한 변형을 포함한 화학적 합성에 의해서 수득된 것으로 이해되어야 한다.

"이중특이성" 또는 "이중기능성" 항체 이외의 항체는 그의 결합 부위 각각이 동일한 것으로 이해된다. 과량의 항체가 수용체에 결합한 리간드의 양을 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80%만큼, 더욱 통상적으로 약 85% 이상 (시험관내 경쟁적 결합시험에서 측정) 감소시키는 경우에, 항체는 실질적으로 수용체에 대한 리간드의 결합을 억제한다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "항원 결합 부위"는 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고, 그에 대해서 상보적인 분자의 부분이다. 항체 분자에서 이것은 항체 항원 결합-부위로 불리며, 표적 항원의 전부 또는 일부에 결합하고, 그에 대해서 상보적인 항체의 부분을 포함한다. 항원이 큰 경우에, 결합 성분은 단지 항원의 특정한 부분 (이 부분은 에피토프라 칭한다)에만 결합할 수 있다. 항체 항원 결합-부위는 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해서 제공될 수 있다. 항체의 항원 결합-부위는 일반적으로 상보성 결정부분 (CDRs)이라 불리는 6 개의 표면 폴리펩타이드 루프에 의해서 형성된 항원 결합-계면을 갖는 가변 중 (VH) 및 가변 경 (VL) 면역글로불린 도메인에 의해서 형성된다.. 여기에는 골격 부분 (FRs)과 함께 각각의 VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각각의 VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) 내에 3 개의 CDRs가 존재한다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "결합 성분"은 항원의 항원성 결정인자의 특징에 대해 상보적인 내부 표면 형상 및 전하 분포로 삼차원적 결합 공간을 갖는 폴리펩타이드 쇄의 접힘으로부터 형성된 적어도 하나의 항원 결합 부위로 이루어진 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 그룹을 나타낸다. 하나의 구체예에서, 결합 성분은 단지 하나의 표적 부위에 대해서 특이적이다. 다른 구체예에서, 결합 성분은 하나보다 많은 표적 부위에 대해서 특이적이다. 하나의 구체예에서, 결합 성분은 항체, 예를 들어, 모노클로날 항체이다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "키메릭 항체"는 또 다른 폴리펩타이드 (예를 들어, 또 다른 종으로부터 유도되거나, 또 다른 항체 부류 또는 서브클래스에 속함)에 융합된 항체 항원 결합-부위 또는 등가 부위를 포함하는 분자를 나타낸다. 키메릭 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023, 및 대량의 후속 문헌에 기술되어 있다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 '경쟁한다'는 결합 성분이 IL-1R1에 대한 결합에 관해서 항체 1 내지 10 중의 어느 하나와 경쟁하는 것을 나타내며, 즉 경쟁은 단일방향성이다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 '교차 경쟁한다'는 결합 성분이 결합 성분이 IL-1R1에 대한 결합에 관해서 항체 1 내지 10 중의 어느 하나와 경쟁하거나, 그 반대로 되는 것을 나타내며, 즉 경쟁은 양방향성이다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 '상보적 결정부분 (CDR)'은 문헌 [Kabat et al. 1991 (95), 및 후속판]에 정의된 바와 같이, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변성 부분을 나타내고자 하는 것이다. 항체는 전형적으로 3 개의 중쇄 CDRs 및 3 개의 경쇄 CDRs를 함유한다. 용어 CDR 또는 CDRs는 본 발명에서 경우에 따라, 항원 또는 이것이 인식하는 에피토프에 대한 항체의 친화성에 의해 결합을 책임지는 아미노산 잔기의 대부분을 함유하는, 이들 부분 중의 하나 또는 이들 부분 중의 몇 개 또는 전부까지도 나타낸다.

6 개의 짧은 CDR 서열 중에서, 중쇄의 세 번째 CDR (HCDR3)은 더 큰 크기의 가변성 (본질적으로, 이것을 유발하는 유전자의 배열 기전에 기인하는 더 큰 다양성)을 갖는다. 이것은 공지된 가장 큰 크기가 26이지만, 2 개의 아미노산 정도로 짧을 수 있다. CDR 길이는 또한 특정한 기본 골격에 의해서 제공될 수 있는 길이에 따라서 다를 수 있다. 기능적으로, HCDR3는 항체의 특이성의 결정에 부분적으로 역할을 할 수 있다 (문헌 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 참조).

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "에피토프"는 결합 성분에 대한 특이적 결합을 할 수 있는 모든 단백질 결정인자, 예를 들어, 면역글로불린 또는 T-세포 수용체를 포함한다. 에피토프 결정인자는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며, 항상 그렇지는 않지만, 특정한 삼차원 구조적 특징뿐만 아니라 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 항체는 해리상수가 ≤1 μM, 바람직하게는 ≤100 nM, 가장 바람직하게는 ≤10 nM인 경우에 항원을 특이적으로 결합시킨다고 한다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "골격"은 IL-1R1를 결합시키는 배치로 하나 이상의 CDRs를 유지시킬 수 있는 원자의 모든 조합, 예를 들어, 아미노산을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "Fv"는 항원-인식 및 항원 결합 부위 둘 다를 보유하는 항체의 최소 단편을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "Fab"는 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 CH1 도메인을 포함하는 항체의 단편을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "huIL"은 인간 인터류킨을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "IL-1R1"은 인터류킨 1 수용체 1을 의미한다. IL-1R1의 아미노산 서열은 공공연히 이용할 수 있다 (RefSeq NM_00877). 일부의 구체예에서, IL-1R1은 인간 또는 시노몰구스 원숭이 IL-1R1일 수 있다. 본 발명의 다른 부분에서 기술된 바와 같이, IL-1R1은 재조합체일 수 있고/있거나, 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "기하평균" (기하학적 평균으로 또한 알려짐)은 기본 10 수로 다시 전환된, 데이터 세트의 대수값의 평균을 나타낸다. 이것은 적어도 2 회의 측정, 예를 들어, 적어도 2, 바람직하게는 적어도 5, 더욱 바람직하게는 적어도 10 회의 반복실험을 필요로 한다. 본 기술분야에서 숙련된 전문가는 반복실험의 수가 더 클수록 더 확고한 기하평균이 될 것임을 이해할 것이다. 반복실험 횟수의 선택은 본 기술분야에서 숙련된 전문가의 판단에 따를 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "분리된"은 본 발명의 결합 성분, 또는 이러한 결합 성분을 코드화한 핵산이 일반적으로 본 발명에 따라 존재하는 상태를 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따른 결합 성분, VH 및/또는 VL 도메인, 및 코드화 핵산 분자 및 벡터는, 예를 들어, 그들의 천연 환경으로부터, 실질적으로 순수하거나 균일한 형태로, 또는 핵산의 경우에는, 필요한 기능을 갖는 폴리펩타이드를 코드화한 서열 이외의 다른 기원의 핵산 또는 유전자가 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않게 분리 및/또는 정제하여 제공될 수 있다. 분리된 성분 및 분리된 핵산은 그들의 천연 환경, 또는 제조가 시험관내 또는 생체내에서 실시된 재조합 DNA 기술에 의한 것인 경우에 이들이 제조된 환경 (예를 들어, 세포 배양)에서 이들과 함께 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산과 같은 천연적으로 이들과 함께 회합되는 물질을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않을 것이다. 성분 및 핵산은 희석제 또는 보조제와 함께 제제화될 수 있으며, 여전히 실제적인 목적에 따라 분리될 수 있다 - 예를 들어, 성분은 면역시험에서 사용하기 위해서 미량역가 플레이트를 코팅하기 위해서 사용된다면, 통상적으로 젤라틴 또는 다른 담체와 혼합될 수 있거나, 진단 또는 치료에 사용되는 경우에는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다. 결합 성분은 천연적으로, 또는 이종 진핵세포 (예를 들어, CHO 또는 NS0 (ECACC 85110503) 세포)의 시스템에 의해서 글리코실화될 수 있거나, 이들은 (예를 들어, 원핵세포에서의 발현에 의해서 생산되는 경우에) 비글리코실화될 수 있다.

항-IL-1R1 항체 분자를 포함하는 분균질 제제도 또한 본 발명의 일부분을 형성한다. 예를 들어, 이러한 제제는 다양한 정도의 글리코실화를 갖고/갖거나 피로글루탐산 잔기를 형성하는 N-말단 글루탐산의 폐환과 같은 유도체화된 아미노산을 갖는, 전체-길이 중쇄 및 C-말단 리신이 없는 중쇄와 항체의 혼합물일 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "모노클로날 항체"는 동일한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 실질적으로 균일한 집단으로부터의 항체를 나타낸다. 용어 "mAb"는 모노클로날 항체를 나타낸다.

본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "실질적으로 설명한 바와 같은"은 본 발명에 기술된 결합 성분의 VH 또는 VL 도메인의 상응하는 CDRs의 특징이 그의 서열이 본 발명에 설명되어 있는 명시된 부분과 동일하거나 매우 유사한 것을 나타낸다. 본 발명에서 기술된 것으로서, 하나 이상의 가변 도메인의 명시된 부분(들)에 관한 문구 "매우 유사한"은 1 내지 약 6 개, 예를 들어, 1 내지 3 개, 또는 1 또는 2 개, 또는 3 또는 4 개를 포함하는 1 내지 5 개의 아미노산 치환이 CDR 및/또는 VH 또는 VL 도메인 내에서 만들어질 수 있는 것으로 고려된다.

여기에서 "및/또는"은 본 발명에서 사용되는 경우에, 두 가지 명시된 특징 또는 성분 각각이 다른 것이 있거나 없이 구체적으로 설명된 것으로 채택되어야 하는 것임을 지적하는 것이 편리하다. 예를 들어, "A 및/또는 B"는 각각이 본 발명에 개별적으로 설명된 것처럼 (i) A, (ⅱ) B 및 (ⅲ) A와 B의 각각의 구체적인 설명으로 채택되어야 한다.

표 및 도면의 간단한 설명
표 1a는 항체 1-3 각각의 중쇄 및 경쇄 CDRs의 아미노산 서열의 리스트이다.
표 1b는 항체 4-10 각각의 중쇄 및 경쇄 CDRs의 아미노산 서열의 리스트이다.
표 2는 첨부된 서열 목록에서 나타낸 바와 같은 본 발명의 예시적인 결합 성분의 서열을 나타내며, 여기에서 SEQ ID 번호는 표 3에 나타낸 것에 상응한다.
표 3은 HTRF® 인간 수용체-리간드 IL1β 결합시험에서의 리드 scFv 효력의 예를 나타낸다.
표 4는 인간 IL-1β 유도된 IL-8 방출시험에서 리드 IgG1 효력의 예를 나타낸다.
표 5는 HeLa 세포에서의 IL-α- 또는 IL-1β-유도된 IL-8 방출의 억제에 대해서 최적화된 IgG1 및 GL IgG2 효력을 나타낸다.
표 6은 인간 IL-1R 결합 최적화 IgG 시험 (DELFIA®)에서의 IL-1R 집단 구성원 및 상이한 IL-1R 종의 효능을 나타낸다.
표 7은 수용체-리간드 (IL1Ra) HTRF® 결합시험에서 최적화된 IgG에 의한 억제를 나타낸다.
표 8은 내인성 시노몰구스 IL-1R을 발현하는 CYNOM-K1 세포로부터의 IL-1β 유도된 IL-8 방출의 최적화된 IgG에 의한 억제를 나타낸다.
표 9는 인간 전혈에서 IL-1β 유도된 IL-6 생산의 억제에 대한 IC₅₀ 값을 나타낸다.
표 10은 가용성 인간 IL-1R1 및 가용성 시노몰구스 IL-1R1에 대한 항-IL-1R1 FAb에 관한 친화성 측정의 결과를 나타낸다.
표 11은 가용성 인간 IL-1R1에 대한 항체 6 및 AMG108 결합에 관한 친화성 측정의 결과를 나타낸다.
표 12는 항체에 대한 인간 IL-1R1 결합에 대해서 경쟁하는 키메릭 IL-1R1 분자의 IC₅₀ (nM로)을나타낸다.
도 1은 시노몰구스 원숭이 IL-1R1 세포외 도메인 cDNA의 서열 [SEQ ID NO: 131]을 나타낸다.
도 2는 시노몰구스 원숭이 IL-1R1 세포외 도메인 아미노산 서열 [SEQ ID NO: 132]의 서열을 나타낸다.
도 3은 인간 IL1R1Fc cDNA 뉴클레오타이드 서열 [SEQ ID NO: 133]을 나타낸다.
도 4는 인간 IL1R1Fc 단백질 서열 [SEQ ID NO: 134]을 나타낸다.
도 5는 시노몰구스 원숭이 IL1R1Fc cDNA 뉴클레오타이드 서열 [SEQ ID NO: 135]을 나타낸다.
도 6은 시노몰구스 원숭이 IL1R1Fc 단백질 서열 [SEQ ID NO: 136]을 나타낸다.
도 7은 인간 IL-1R1 세포외 서열 [SEQ ID NO: 137]을 나타낸다.
도 8은 인간 IL-1R1 cDNA 서열 [SEQ ID NO: 138]을 나타낸다.
도 9는 Cyno IL-1R1 세포외 서열 (잔기 1 내지 337) [SEQ ID NO: 139]을 나타낸다.
도 10은 Cyno cDNA 세포외 IL-1R1 서열 [SEQ ID NO: 140]을 나타낸다.
도 11은 성숙한 인간 HIS-FLAG IL-1ra의 서열 [SEQ ID NO: 141]을 나타낸다.
도 12는 성숙한 인간 HIS-FLAG IL-1β의 서열 [SEQ ID NO: 142]을 나타낸다.
도 13은 항체 6 IgG2에 관하여 인간 전혈에서의 IL-1β 유도된 IL-6 생산의 억제를 나타낸다 (실시예 2.7). x 축은 항체 6의 농도 (Log molar)를나타내고, Y 축은 IL6 생산의 억제 백분율이다.
도 14는 Vh3_DP-47_(3-23) 집단의 리보좀 디스플레이 구성 및 검색에서 Glu를 Gln으로 전환시키는 SDCAT-CG 프라이머를 나타낸다.

실시예

섬유상 파지 M13을 기초로 하는 파지미드 (phagemid) 벡터 내로 클로닝된 순수한 인간 단일쇄 Fv (scFv) 파지 디스플레이 라이브러리가 선택을 위해서 사용되었다 (104, 105).

항-IL-1R1 특이적 scFv 항체는 재조합 인간 IL-1R1 상에서의 일련의 선택 사이클을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리된다.

선택된 scFv 항체는 인간 IL-1R1에 대한 결합에 관하여, 및/또는 효력에 관하여 최적화되며, IgG 항체로서 리포맷 (reformat)된다.

서열

본 발명의 예시적인 결합 성분의 서열은 첨부된 서열 목록에 나타내었으며, 여기에서 SEQ ID NOS는 이하의 표 2에 나타낸 것에 상응하고, 여기에서:

i) 항체 번호 다음에 GL이 이어지는 경우에, 예를 들어, 11GL인 경우에, 이것은 잔기 중의 하나 이상이 배선 배치로 다시 돌연변이된 항체를 나타내며, 일반적으로 GL이 사용되는 경우에 인지할 수 있는 활성의 상실이 없이 배선으로 다시 돌연변이될 수 있는 모든 비-배선 잔기는 배선화되었다. 본 명세서에서 항체 1 내지 10 중의 어느 하나 또는 모두가 언급되는 경우에, 이것은 또한 표 2에 열거된 모든 배선화된 변이체도 포함하는 것으로 알아야 한다.

또한, CDRs는 표 1a 및 1b에 나타낸다.

[표 1a]

[표 1b]

[표 2]

본 발명은 이제 이하의 비-제한적 실시예에 의해서 예시된다.

실시예 1: 항체 리드 분리

1.1. 선택

섬유상 파지 M13을 기초로 하는 파지미드 벡터 내로 클로닝된 큰 단일쇄 Fv (scFv) 인간 항체 라이브러리가 선택을 위해서 사용되었다 (106, 107). 항-IL-1R 특이적 scFv 항체는 본질적으로 전술한 바와 같이 비오티닐화된 재조합 인간 IL-1R-Fc 상에서의 일련의 선택 사이클을 사용하여 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리되었다 (108). 간략하면, scFv-파지 입자를 용액 중에서 100 nM 재조합 비오티닐화된 인간 IL-1R-Fc 융합 단백질 (재료 및 방법에 기술된 바와 같고, 사내에서 비오티닐화된 huIL-1R1-Fc 융합 단백질)과 함께 배양하였다. 그 후, 항원에 결합된 ScFv-파지를 제조자의 추천에 따라 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드 (Dynabeads® M-280) 상에 포착시켰다. 그 후, 선택된 scFv-파지 입자를 전술한 바와 같이 (109) 구제하고, 선택 과정을 제2 라운드 동안 반복하였다.

선택의 제2 라운드로부터의 개별적인 클론의 대표적인 수를 96-웰 플레이트 내에서 성장시켰다. ScFvs를 박테리아 세포질 내에서 발현시키고, 재료 및 방법에 기술된 인간 수용체-리간드 (IL-1β) 결합 HTRF 시험에서 그들의 억제 활성에 대해서 스크리닝하였다. 조 세포질성 추출물로서 이 시험에서 상당한 억제효과를 나타낸 ScFv를 DNA 서열결정에 적용하였다 (106, 109). 독특한 scFvs를 다시 박테리아 내에서 발현시키고, 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제하고 (110), IC₅₀ 값은 동일한 리간드-수용체 결합시험에서 정제된 scFvs의 희석 시리즈를 시험함으로써 결정되었다.

1.2. 수용체-리간드 (IL-1β) 결합시험에서 scFv에 의한 억제

선택 산물을 수용체-리간드 결합 HTRF® (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) 시험 형식에서 인간 히스티딘 태깅된 (HIS) IL1RFc 융합 단백질 (사내용)에 대한 HIS FLAG 태깅된 인간 IL1 베타 (사내에서 이. 콜라이 발현됨; HIS FLAG IL-1 베타) 결합의 억제에 관해서 스크리닝하였다.

상세한 시험방법, 및 재료 발현방법은 재료 및 방법 항목에 제시된다.

결합시험으로부터 수득된 리드 scFv 효력의 예는 표 3에 나타낸다.

[표 3]

IC = 불완전한 억제 곡선; IC50 값은 추정된다.

데이터는 몇 가지의 독립적인 실험의 대표적인 단일 실험으로부터 제공된다.

1.3. scFv의 IgG1으로의 재포맷팅

수용체-리간드 HTRF 결합시험에서 억제성인 것으로 확인된 클론은 V_H 및 VL 도메인을 각각 전체 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하는 벡터 내에 서브-클로닝함으로써 scFv로부터 IgG₁ 형식으로 전환되었다. VH 도메인을 인간 중쇄 불변 도메인 및 조절 요소를 함유하는 벡터 (pEU15.1) 내에 클로닝하여 포유동물 세포에서 전체 IgG 중쇄를 발현시켰다. 마찬가지로, VL 도메인을 인간 경쇄 (람다) 불변 도메인 및 조절 요소의 발현을 위한 벡터 (pEU4.4) 내에 클로닝하여 포유동물세포에서 전체 IgG 경쇄를 발현시켰다. 중쇄 및 경쇄의 발현을 위한 벡터는 문헌 (111)에서 최초로 기술된 것을 기초로 하였다. 본 발명자들의 벡터는 OriP 요소를 도입시킴으로써 간단하게 조작되었다. IgGs를 수득하기 위해서, 중쇄 및 경쇄 IgG 발현 벡터를 EBNA-HEK293 포유동물 세포 내로 형질감염시켰다. IgGs를 발현시키고, 배지 내로 분비시켰다. 수확물을 모아서 여과한 후에 정제하고, 그 다음에 IgG는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 배양 상등액을 세라믹 단백질 A의 적절한 크기의 칼럼 (BioSepra) 상에 부하시키고, 50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 250 mM NaCl로 세척하였다. 결합된 IgG를 0.1 M 나트륨 시트레이트 (pH 3.0)를 사용하여 칼럼으로부터 용출시키고, 트리스-HCl (pH 9.0)을 첨가함으로써 중화시켰다. 용출된 물질을 Nap10 칼럼 (Amersham, #17-0854-02)을 사용하여 PBS로 완충제 교환하고, IgG의 농도는 IgG의 아미노산 서열을 기초로 한 흡광계수를 사용하여 분광광도적으로 결정하였다 (112). 정제된 IgG는 SEC-HPLC를 사용하고, SDS-PAGE에 의해서 응집 및 분해에 대해서 분석하였다.

1.4. 모 KENB026 및 KENB061의 배선화

생물학적 시험에서 억제성인 모항체 항체 1 및 항체 4의 V_H 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 VBASE 데이터베이스 (113) 내의 공지된 인간 배선 서열로 정렬하였으며, 가장 근접한 배선은 서열 유사성에 의해서 확인되었다. 변하지 않은 채로 남는 베르니에르 (Vernier) 잔기 (114)를 고려함이 없이, VH 및 VL 도메인의 골격에서의 변화는 적절한 돌연변이유발 프라이머와 함께 표준 부위 지시된 돌연변이유발 기술을 사용하여 가장 근접한 배선 서열로 복귀시켜 인간 항체와 동일하게 매치시켰다. 이들 돌연변이유발 과정은 모항체에 대해 IgG1 벡터에서 수행하였다.

1.5. IgG2로서 리드 항체의 배선화

모항체 4 (IgG1 형식으로)가 리드 항체를 배선화하기 위한 돌연변이유발을 위한 주형으로 사용되었다. 리드 항체의 개개 VH 및 VL CDR3 서열을 적절한 프라이머와 함께 표준 부위 지시된 돌연변이유발 기술을 사용하여 IgG1 벡터 내의 배선화된 모항체에 도입시켜 배선화된 리드 항체를 생산하였다.

IgG1의 IgG2로의 전환은 표준 클로닝 절차를 사용하여 수행되었다. IgG1 VH 리드 플라스미드를 분리시키고, 배선화된 VH를 IgG2 VH 벡터 내로의 클로닝을 위해서 분리하였다.

배선 정보

¹ 이것은 프라이머 SDCATCG (참조: 리보좀 디스플레이 라이브러리 구성 및 검색을 위한 프라이머 및 Vh3_DP-47_(3-23) 골격 서열 정렬 - 도 14)를 사용하는 경우의 GAA (Glu)로부터 CAA (Gln)로의 염기 변화 때문이다. 이 잔기 (비록 베르니에르이지만)는 인공적으로 도입되었기 때문에, 배선 과정 중에서 다시 글루탐산 (Glu)으로 복귀되었다. 항체 6은 또한 SDCATCG를 사용하여 증폭되었지만, 위치 1은 IgG1 전환과정 중에 Glu로 정정되었다.

² 이 결실은 리보좀 디스플레이 전환 및 선택 과정 중에 나타난 것으로 보인다. 리보좀 디스플레이는 PCR-기본이며, 오류 경향 폴리머라제를 사용하는 방법이다.

1.6. HeLa 세포로부터의 IL-1-유도된 IL-8 방출의 억제

IL-1R 억제제의 생물활성을 결정하기 위해서, 수용체-리간드 결합시험에서 억제성인 scFvs의 패널을 IgG로 전환시키고, 이들의 활성을 HeLa 인간 세포 시험에서 IL-1β- 및 IL-1α-유도된 IL-8 방출의 용량-의존적 억제를 측정함으로써 평가하였다. 시험방법에 대한 상세한 내용은 재료 및 방법 항목을 참고로 한다.

이 시험에서, 항-IL-1R IgGs의 패널의 억제 활성은 인간 IL-1β 또는 IL-1α의 EC₅₀ 농도 (시험에서 1/2 최대 반응을 제공하는 IL-1의 농도로 정의됨; 이 경우에는 약 2 pM)에 대한 반응으로 결정되었다. IL-1-유도된 반응의 상당한 억제를 나타내는 항체를 리드 분리 패널 내로 취하였으며, 예는 표 4에 나타낸다. 항체 1 및 항체 4의 배선화된 IgG₁ 변이체도 또한 이 시험에서 활성인 것으로 나타났다.

[표 4]

IC₅₀s은 2 내지 5 회의 독립적인 실험으로부터의 기하학적 평균을 나타낸다.

실시예 2: 항체 최적화

2.1. 친화성 성숙

항체 4 및 항체 1은 친화성-기본 파지 및 리보좀 디스플레이 선택을 사용하여 최적화되었다.

리드 클론으로부터 유도된 큰 scFv-파지 라이브러리는 기술된 바와 같이 (115) 가변 중쇄 (V_H) 및 경쇄 (V_L) 상보성 결정 부분 3 (CDR3)의 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발에 의해서 생성되었다. 라이브러리는 인간 IL-1R-Fc에 대해서 고친화성을 갖는 변이체를 선택하기 위해서 친화성-기본 파지 디스플레이 선택에 적용하였다. 결과적으로, 이들은 인간 IL-1β 결합 IL-1R1에 대해서 개선된 억제 활성을 나타내는 것으로 예상되었다. 선택은 본질적으로 전술한 바와 같이 수행되었다 (108). 간략하면, scFv-파지 입자를 용액 중에서 재조합 비오티닐화된 인간 IL-1R-Fc와 함께 배양하였다. 그 후, 항원에 결합된 ScFv-파지를 제조자의 추천에 따라 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드 (Dynabeads® M-280) 상에 포착시켰다. 그 후, 선택된 scFv-파지 입자를 전술한 바와 같이 (109) 구제하고, 선택 과정을 감소하는 농도의 비오티닐화된 인간 IL-1R-1 (3 라운드에 걸쳐서 50 nM 내지 0.05 nM)의 존재 하에서 반복하였다.

조 scFv-함유 세포질 추출물을 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 선택 산물로부터의 대표적인 수의 개개 클론으로 제조하였으며, 인간 히스티딘 태깅된 (HIS) IL1RFc 융합 단백질 (사내용)에 대한 HIS FLAG 태깅된 인간 IL1 베타 (사내에서 이. 콜라이 발현됨; HIS FLAG IL-1 베타) 결합의 억제에 관해서 수용체-리간드 결합 HTRF® (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) 시험 형식에서 스크리닝하였다. 그들의 각각의 모항체와 비교할 때 상당히 개선된 억제효과를 나타낸 스크리닝 히트 (hits), 즉 scFv 변이체를 DNA 서열결정에 적용하였으며, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 라이브러리 산물로부터의 독특한 변이체는 추가의 특정화를 위해서 정제된 scFv로서 생산되었다. 그 후, 일부의 scFv를 선택하고, IgG1로 전환시키고, 다시 추가의 효력 증가를 실현시키기 위한 노력으로 다시 시험하였다.

인간 IL-1R1에 대한 인간 IL-1β의 결합을 억제하는 능력을 갖는 큰 수의 scFv 변이체를 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 선택 산물을 재조합하여, 클론이 무작위적으로 쌍을 이룬 개별적으로 랜덤화된 VH 및 VL 서열을 함유하는 파지 디스플레이 형식으로 단일 라이브러리를 형성시켰다. 그 후, 파지 선택을 감소하는 농도의 비오티닐화된 인간 IL-1R-Fc (추가의 3 라운드에 걸쳐서 0.1 nM 내지 5 pM)의 존재 하에서 전술한 바와 같이 계속하였다.

대신으로, 리보좀 디스플레이 방법을 사용하여 선택 산물을 재조합시켰다. 리보좀 디스플레이를 위해서, 인간 IL-1R1에 대한 인간 IL-1β의 결합을 억제하는 능력을 갖는 큰 수의 scFv 변이체를 포함하는 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 선택 산물을 재조합시켜 폴리머라제 연쇄반응 (PCR)에 의해 단일라이브러리를 형성시키고, 본질적으로 문헌 (116)에 기술된 바와 같이 리보좀 디스플레이 형식에 적응시켰다. 리보좀 디스플레이 친화성-기본 선택은 재조합된 라이브러리에 대해서 수행되었으며, 선택 과정은 감소하는 농도의 비오티닐화된-인간 IL-1RI (3 라운드에 걸쳐서 1 nM 내지 5 pM)의 존재 하에서 반복하였다. 그 후, 리보좀 디스플레이 산물은 본질적으로 문헌 (117)에 기술된 바와 같이, 추가의 특정화를 위해서 파지 디스플레이 벡터 내에 클로닝하였다.

조 scFv-함유 세포질 추출물은 파지 디스플레이 및 리보좀 디스플레이 산물로부터의 대표적인 수의 개개 클론으로 제조하였으며, 인간 IL-1R1 수용체에 대한 인간 바이오-인간 (bio-human) Il-1β의 결합을 억제하는 그들의 능력에 대해서 스크리닝하였다. 그들의 각각의 모항체와 비교할 때 상당히 개선된 억제 효과를 나타내고, 생성된 전재조합 (prerecombination)을 유도하는 스크리닝 히트, 즉 scFv 변이체를 DNA 서열결정에 적용하였으며, 추가의 특정화를 위해서 독특한 재조합된 변이체를 정제된 scFv로 생산하였다.

이 시험에서 가장 활성인 scFv를 실시예 1.3 및 1.5에 기술된 바와 같이 비-배선 IgG₁ 및/또는 배선화된 IgG₂로 전환시키고, 수용체-리간드 IL-1Ra HTRF, 및 HeLa IL-1-베타 및 -알파 유도된 IL-8 방출시험에서, 경쟁적 ELISA 형식으로 특이성에 대해서 시험하였다. 항체는 또한 시노몰구스 IL-1R1에 대한 교차-반응성에 대해서도 시험하였다.

2.3. HeLa 세포로부터의 IL-1β- 및 IL-1α-유도된 IL-8 방출의 최적화된 IgGs에 의한 억제

IgG에 대한 리드 최적화 및 재포맷팅에 따른 클론의 생물활성에 있어서의 개선은 재료 및 방법 항목에 기술된 바와 같이, EC₈₀ 농도 (두 경우에 모두 5 pM)에서 huIL-1-베타 및 huIL-1 알파 (R&D Systems)를 사용한 HeLa IL-8 방출시험에서 평가하였다. 결과는 표 5에 나타낸다.

[표 5]

IC₅₀은 지시된 수의 실험의 기하학적 평균을 나타낸다.

이어서, 모항체에 비해 증가된 효력을 갖는 클론의 서브세트를 CYNOM-K1 세포를 사용하는 시노몰구스 IL-1R 시험을 포함한 추가의 시험에서 분석하였다 (이하의 항목 및 재료 및 방법에서의 시험 설명에 기술됨). 최적화된 항체를 IL-1Ra (Kineret®; Amgen, 의약품 아울렛 (pharmacy outlet)에서 상업적으로 제공됨), 및 US 2004/071702 (2004년 4월 15일에 공개됨)로부터의　AMG108 서열과 비교하였다.

2.4. DELFIA® 에피토프 경쟁시험에서 최적화된 항체의 선택성 및 종 교차 반응성

IL-1R 집단 구성원에 대한 리드 항체의 선택성 및 종 교차 반응성은 DELFIA® 에피토프 경쟁시험을 사용하여 입증하였다.

시험은 각각의 최적화된 항-IL1R 항체를 결합시키는 비오티닐화된 인간 HIS-IL1RFc (사내에서 발현되고, 사내에서 비오티닐화됨)의 억제를 측정하였다.

비-비오티닐화된 정제된 인간 재조합체 IL1sRII (R&D Systems), 인간 재조합체 IL-1R6/IL1 R rp2/Fc (R&D Systems), 인간 재조합체 IL18R 알파/IL-1 R5/Fc (R&D systems) 및 재조합체 인간 IL-1 R4 (ST2)/Fc (R&D systems)의 적정을 각각의 시험방법에서 시험하여, 시험방법에서 IC₅₀ 값에 의해 측정된 바와 같이 각각의 구조적으로 관련된 집단 구성원에 대한 효력을 입증하였다.

인간 HIS-IL1RFc (사내용), 시노몰구스 HIS-IL1RFc (사내용) 및 랫트 IL-1RFc (사내용)를 포함하는 IL-1R 종의 적정을 각각의 시험방법에서 시험하여 최적화된 항체의 종 교차-반응성을 입증하였다.

실시예 결과는 표 6에 요약하였다. 결과는 리드 최적화된 항체가 인간 IL-1R, 및 또한 유사하게, 결합된 시노몰구스 IL-1R에 대해서 선택적이었으며, 구조적으로 관련된 단백질을 인식하지 않았음을 나타낸다. 랫트 IL-1R-Fc는 최적화된 항체 중의 어느 것에 의해서도 인식되지 않았다.

[표 6]

IC₅₀ 값은 3 개의 독립적인 실험의 기하학적 평균을 나타낸다.

NI : huIL-1RFc의 억제가 관찰되지 않았다.

2.5. 수용체-리간드 (IL-1Ra) 결합시험에서 최적화된 IgG에 의한 억제

IL-1R1에 대한 IL-1Ra를 억제하는 리드 항체의 능력을 재료 및 방법 항목에 기술된 바와 같이, 인간 히스티딘 태깅된 (HIS) IL1RFc 융합 단백질 (사내용)에 대한 HIS FLAG 태깅된 인간 IL1Ra (사내에서 이. 콜라이 발현됨; HIS FLAG IL-1RA) 결합의 억제에 관한 수용체-리간드 결합 HTRF® (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) 시험 형식에서 평가하였다.

이것은 유익한 에피토프가 수득되었는지 여부를 결정하기 위한 것이었으며, 여기에서 항체는 IL-1-베타 및 IL-1-알파 이외에도 IL-1R1에 대한 IL-1Ra에 관하여 결합에 대하여 경쟁하였다. 생체내에서, 이것은 수용체 결합된 IL-1Ra를 유리시킬 수 있으며, 이렇게 함으로써 이것이 유익한 것으로 믿어지는 또 다른 수용체에 결합하도록 허용한다. IL-1Ra는 다른 식으로는 IgGs에 빈약하게 접근할 수 있는 조직에 접근할 수 있으며, 이것은 또한 IgGs보다 더 빨리 순환계로부터 먼 조직을 침투할 수 있다. AMG108 [Amgen (US2004/0097712A1) 및 Hoffmann-La Roche AG (WO 2005/023872)]에 대한 특허에서는, 이들 선행기술 항체가 IL-1R1에 대한 IL-1Ra 결합과 직접적으로 경쟁하지 않는다는 것을 밝혔다. Amgen의 특허 (US2004/0097712A1)에서는, IL-1과 경쟁하지만 IL-1Ra와는 경쟁하지 않는 항체는 IL-1 및 IL-1ra와 경쟁하지 않는 것에 대한 IL-1-매개된 효과의 억제를 나타내도록 디자인된 시험에서 탁월한 효력을 나타내었으며, 따라서 탁월한 에피토프를 나타내었다고 거론하였다. 본 발명자들은 놀랍게도, IL-1ra뿐만 아니라 IL-1을 억제하는 항체는 US2004/0097712A1에 기술된, 그렇지 않았던 항체에 대한 IL-1 활성의 억제시험에서 유사하게 강력할 수 있음을 보고하였다.

실시예 결과는 이하의 표 7에 나타내었으며, 이것은 선행기술 항체는 IL-1R1에 대한 IL-1Ra 결합과 완전히 경쟁할 수 없었지만, 본 발명의 리드 항체는 나타낸 바와 같은 IC₅₀으로 이 상호작용을 완전히 억제하였음을 뒷받침한다.

[표 7]

IC₅₀ 값은 3 개의 독립적인 실험의 기하학적 평균을 나타낸다.

NI : huIL-1RFc의 억제가 관찰되지 않았다.

GL : 배선화됨

2.6. CYNOM-K1 세포로부터의 huIL-1β-유도된 IL-8 방출의 최적화된 IgG에 의한 억제

리드 항체가 내인성으로 발현된 시노몰구스 IL-1R1을 통한 IL-1β 신호전달의 활성을 억제하는데 있어서 효과적이었는지 여부를 입증하기 위해서, CYNOM-K1 세포로부터의 huIL-1β-유도된 IL-8 방출을 억제하는 리드 IgG의 능력을 측정하였다. 리드 항체는 IL-1Ra와 동등한 활성으로 시노몰구스 IL-1R1을 통해서 작용하는 IL-1β를 분명하고 완전하게 억제하였으며, 그 반면에 AMG108 IgG는 이 상호작용을 억제하지 않았다. 인간 IL-8에 대한 상업적으로 이용할 수 있는 ELISA는 세포 상등액에서 시노몰구스 IL-8을 검출하는 것으로 또한 나타났으며, CYNOM-K1 세포 상에서의 IL-1-유도된 효과를 결정하기 위해서 사용되었다.

[표 8]

IC₅₀s는 2 개의 독립적인 실험 각각으로부터의 IC₅₀s이다.

NI = IL-1 베타 유도된 IL-8 방출의 억제가 관찰되지 않음.

2.7. 인간 전혈에서 IL-1β 유도된 IL-6 생산의 억제

전혈은 정상적인 지원자 (6 명의 공여체)로부터 나트륨 헤파린 모노베트 (monovette) 용기 내로 수집하였다. 전혈 (80 ㎕s)을 시험 완충액 (PBS 중의 1% BSA) 중의 10 ㎕s의 항-IL-1RI 모노클로날 Ab 항체 6GL IgG2를 함유하는 96 웰 플레이트의 웰 내로 분취하였다. IL-1β를 30 분 후에 첨가하여 30 pM (EC₅₀)의 최종 농도를 제공하였다. 상등액을 18 시간 후에 수확하고, 상등액 내의 IL-6 레벨을 ELISA (R&D Systems IL-6 ELISA)를 사용하여 측정하였다. 항-IL-1RI 항체는 도 13에 나타낸 바와 같이 IL-1 활성을 차단하였다. 인간 전혈에서 IL-1 유도된 IL-6 생산의 억제에 관한 IC50 값의 범위는 표 9에 나타낸다. 6 명의 공여체에 대한 평균 IC₅₀은 229 pM이었다.

[표 9]

동등한 데이터는 상이한 Fc 형식을 갖는 항체 6인 항체　6 IgG1TM (3중 돌연변이체, 234F, 235E 및 331S)에 관해서 실시예 4에 제공된다.

시험 재료 및 방법

수용체-리간드 (IL1 베타) 결합 HTRF® 시험

선택 산물은 인간 히스티딘 태깅된 (HIS) IL1RFc 융합 단백질 (이하에 기술되는 바와 같이 사내에서 HEK EBNA 발현됨)에 대한 HIS FLAG 태깅된 인간 IL1 베타 (사내에서, 이. 콜라이 발현됨; HIS FLAG IL-1 베타) 결합의 억제에 관한 수용체-리간드 결합 HTRF® (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence, Cis-Bio, Bedford, MA, USA) 시험 형식에서 스크리닝하였다. HTRF® 시험의 더 상세한 내용은 문헌 [Mathis (1995) Clinical Chemistry 41(9), 1391-1397]에서 볼 수 있다.

리드 분리 중의 산물은 200 mM HEPES 완충액 pH 7.4, 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 슈크로즈 중에서 제조된 비희석된 조 scFv 함유 세포질 추출물로서 스크리닝되었다. 5 ㎕의 조 scFv 샘플을 384 웰 저용량 시험 플레이트 (Costar 3676)에 첨가하였다. 그 후, 이어서 2 nM 인간 HIS IL1RFc를 20 ㎕의 용적까지 첨가하였다. 그 후, 시험 플레이트를 밀봉하고, 암소에서 실온으로 1 시간 동안 배양하였다.

시험 플레이트의 전-배양 후에, 5 ㎕의 4 nM HIS FLAG IL1 베타를 첨가하였다. 이어서 XL665 (CIS Bio international 61FG2XLB)로 표지된 5 ㎕의 20 nM 항-FLAG IgG 및 크립테이트 (CIS Bio International 61HFCKLB)로 표지된 5 ㎕의 3.2 nM 항-인간 Fc IgG를 첨가하였다. 모든 희석은 0.4 M 불화칼륨 및 0.1% BSA를 함유하는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) (시험 완충액) 중에서 수행하였다.

시험 플레이트를 암소에서 실온으로 3 시간 동안 배양한 후에, 엔비전 (EnVision) 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 사용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 시간 분해 형광 (time resolved fluorescence)을 판독하였다.

데이터는 각각의 샘플에 대한 델타 (Delta) F 값 % 및 특이적 결합 %를 각각 수학식 1 및 수학식 2에 따라 계산함으로써 분석하였다.

수용체-리간드 시험은 또한 FLAG IL1 베타의 대체 공급원 (Alexis, ALX-522-056)을 사용하여 다음과 같이 수행하였다. 200 mM HEPES 완충액 pH 7.4, 0.5 mM EDTA 및 0.5 M 슈크로즈 중에서 제조된 5 ㎕의 조 scFv 함유 세포질 추출물을 384 웰 저용량 시험 플레이트 (Costar 3676)에 첨가하였다. 그 후, 이어서 8 nM 인간 HIS IL1RFc를 20 ㎕의 용적까지 첨가하였다. 그 후, 시험 플레이트를 밀봉하고, 암소에서 실온으로 1 시간 동안 배양하였다.

시험 플레이트를 전-배양한 후에, 5 ㎕의 80 nM FLAG IL1 베타 (Alexis ALX-522-056)를 첨가하였다. 이어서 XL665 (CIS Bio international 61FG2XLB)로 표지된 5 ㎕의 40 nM 항-FLAG IgG 및 크립테이트 (CIS BIO International 61HFCKLB)로 표지된 5 ㎕의 3.2 nM 항-인간 Fc IgG를 첨가하였다. 모든 희석은 0.4 M 불화칼륨 및 0.1% BSA를 함유하는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) (시험 완충액) 중에서 수행하였다.

시험 플레이트를 암소에서 실온으로 3 시간 동안 배양한 후에, 엔비전 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 사용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 시간 분해 형광을 판독하였다.

데이터는 각각의 샘플에 대한 델타 F 값 % 및 특이적 결합 %를 각각 수학식 1 및 수학식 2에 따라 계산함으로써 분석하였다.

[수학식 1]

이어서, 델타 F 값 %를 사용하여 수학식 2에 기술된 바와 같이 특이적 결합 %를 계산하였다.

[수학식 2]

스크리닝으로부터 확인된 양성 크론으로부터 정제된 scFv를 인간 HIS IL1RFc에 대한 인간 HIS FLAG 태깅된 IL1 베타의 결합의 억제에 관한 상기의 수용체-리간드 HTRF® 시험 중의 어느 하나에서 시험하였다. 숙련된 전문가는 IgG 또는 그 밖의 다른 억제제 형식을 시험하도록 이들 시험방법을 변형시킬 수 있었다. scFv 농도의 적정은 시험방법에서 IC₅₀ 값에 의해서 측정된 바와 같은 클론 효력을 입증하기 위해서 사용되었다. 모든 희석은 시험 완충액 중에서 수행하였다. 5 ㎕의 정제된 scFv 샘플의 적정액을 384 웰 저용량 시험 플레이트 (Costar 3676)에 첨가하였다. 그 후, 이어서 2 nM 인간 HIS IL1RFc (사내용 HIS IL1 베타를 사용한 경우) 또는 8 nM HIS IL1RFc (Alexis 공급원 IL1 베타를 사용한 경우)를 20 ㎕의 용적까지 첨가하였다. 그 후, 시험 플레이트를 밀봉하고, 암소에서 실온으로 1 시간 동안 배양하였다. 후속 첨가단계는 정확히 조 scFv 함유 세포질 추출물에 대해 기술한 바와 같이 수행하였다.

시험 플레이트를 암소에서 실온으로 3 시간 동안 배양한 후에, 엔비전 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 사용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 시간 분해 형광을 판독하였다.

데이터는 각각의 샘플에 대한 델타 F 값 %를 계산함으로써 분석하였다. 델타 F 및 특이적 결합은 각각 수학식 1 및 수학식 2에 따라 결정하였다. IC₅₀ 값은 4-파라메터 보급 방정식 (logistic equation) (수학식 3)을 사용한 곡선 맞춤 (curve fitting)에 의해서 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

[수학식 3]

Y=하단 + (상단-하단)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))

X는 농도의 대수이다. Y는 특이적 결합이다.

Y는 하단에서 시작하여 시그모이드 형상으로 상단쪽으로 간다.

기준 마우스 항-인간 IL1R1 mAb (Fitzgerald 10-I73) 및 IL-1 수용체 길항제 아나킨라 (Kineret®; AMGEN commercial pharmacy)가 양성 대조군으로서 모든 정제된 scFv 적정 시험에 포함되었다.

리드 최적화를 위해서, 조 scFv를 시험 완충액 중에서 희석하였다. 5 ㎕의 희석된 조 scFv 샘플을 384 웰 저용량 시험 플레이트 (Costar 3676)에 첨가하였다. 그 후, 이어서 2 nM 인간 HIS IL1RFc를 20 ㎕의 용적까지 첨가하였다. 그 후, 시험 플레이트를 밀봉하고, 암소에서 실온으로 1 시간 동안 교반하였다.

시험 플레이트의 전-배양 후에, 5 ㎕의 40 nM HIS FLAG IL1 베타 (사내에서 이. 콜라이 발현됨)를 첨가하였다. 이어서 XL665 (CIS Bio international 61FG2XLB)로 표지된 5 ㎕의 40 nM 항-FLAG IgG 및 크립테이트 (CIS BIO International 61HFCKLB)로 표지된 5 ㎕의 3.2 nM 항-인간 Fc IgG를 첨가하였다. 모든 희석은 0.4 M 불화칼륨 및 0.1% BSA를 함유하는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS) (시험 완충액) 중에서 수행하였다.

시험 플레이트를 암소에서 실온으로 3 시간 동안 배양한 후에, 엔비전 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 사용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 시간 분해 형광을 판독하였다.

리드 분리에 관해서는, 델타 F 및 특이적 결합을 각각 수학식 1 및 수학식 2에 기술된 바와 같이 계산하였다.

수용체-리간드 (IL1 수용체 길항제) 결합 HTRF® 시험

스크리닝으로부터 확인된 양성 클론으로부터의 정제된 scFv를 수용체-리간드 IL1 수용체 길항제 (IL1ra) 결합 HTRF® 시험에서 시험하였다. IgG도 또한, 이 시험 형식에서 시험하였다.

억제제의 적정은 시험방법에서 IC₅₀ 값에 의해서 측정되는 바와 같이 클론 효력을 입증하기 위해서 사용되었다. 모든 희석은 상기 리간드 결합시험에 관한 시험 완충액 중에서 수행되었다. 5 ㎕의 억제제의 적정액을 384 웰 저용량 시험 플레이트 (Costar 3676)에 첨가하였다. 그 후, 이어서 0.4 nM 크립테이트 표지된 HIS IL1RFc를 첨가하였다. 그 후, 시험 플레이트를 밀봉하고, 암소에서 실온에서 1 시간 동안 배양하였다.

전-배양 후에, 5 ㎕의 0.6 nM FLAG HIS IL1ra (사내에서 이. 콜라이 발현됨)를 첨가하였다. 즉시 이어서 XL665 (CIS BIO 61FG2XLB)로 표지된 5 ㎕의 40 nM 항-FLAG IgG를 첨가하였다.

시험 플레이트를 암소에서 실온으로 3 시간 동안 배양한 후에, 엔비전 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 사용하여 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 파장에서 시간 분해 형광을 판독하였다.

데이터는 델타 F % 및 특이적 결합 %를 각각 수학식 1 및 수학식 2에 따라 계산함으로써 분석하였다. IC₅₀ 값은 4-파라메터 보급 방정식 (수학식 3)을 사용한 곡선 맞춤에 의해서 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

경쟁 결합시험에서 항체의 선택성 및 종 교차 반응성

정제된 IgG를 PBS 중의 96-웰 맥시솝 (Maxisorp) 미량역가 플레이트 (Nunc) 상에, 비오티닐화된 인간 HIS IL1RFc가 해당하는 특정한 IgG에 대해 대략적으로 추정된 그의 K_D로 첨가하는 경우에 상당한 시그날을 제공하는 농도로 흡착시켰다. 과량의 IgG를 PBS-트윈 (0.1% v/v)으로 세척하여 버리고, 웰을 PBS 중의 탈지 분유 (3% w/v)로 1 시간 동안 차단하였다. 다음의 경쟁인자 각각의 계열 희석액을 비오티닐화된 인간 IL1RFc와 각각의 IgG 사이의 상호작용의 K_D 값의 약 400-배의 농도에서 출발하여 3% 탈지 분유 중에서 제조하였다: 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis) HIS IL1RFc (이하에 기술하는 바와 같이 사내에서 HEK EBNA 발현됨), 랫트 HIS IL1RFc (사내에서 HEK EBNA 발현됨), 재조합 인간 IL1 sRI (R&D systems 269-1R/CF), 인간 IL-1 R6/IL-1 R rp2/Fc (R&D systems 872-RP), 재조합 인간 IL-18 R 알파 (IL-1 R5)/Fc (R&D systems 816-LR), 재조합 인간 IL-1 R4 (ST2)/Fc (R&D systems 523-ST). 비-비오티닐화된 인간 HIS IL1RFc가 양성 대조군으로 포함되었다. 25 ㎕의 이 계열 희석액을 차단된 IgG 시험 플레이트에 첨가하였다.

25 ㎕의 1.4 nM 비오티닐화된 인간 HIS IL1RFc를 시험 플레이트에 첨가하였다. 그 후, 플레이트를 밀봉하고, 2 시간 동안 실온에서 배양하였다. 미결합된 항원을 PBS-트윈 (0.1% v/v)으로 세척하여 제거하는 한편, 나머지 비오티닐화된 인간 IL1RFc는 스트렙타비딘-유로퓸3+ 컨쥬게이트 (DELFIA® 검출, PerkinElmer)에 의해서 검출하였다. 시간-분해 형광은 엔비전 플레이트 판독기 (Perkin Elmer) 상에서 620 ㎚로 측정하였다. 형광 데이터는 유로퓸 계수로서 도시하였다. IC₅₀ 값은 4-파라메터 보급 방정식 (수학식 3)을 사용한 곡선 맞춤에 의해서 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

재조합 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-1R1 Fc 융합 단백질의 생성

인간 IL-1R1 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-336 NP_000868)의 서열은 코드화한 cDNA는 인간 IL-1R1 cDNA 서열 (RefSeq NM_00877)을 기초로 한 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 인간 간 cDNA로부터 증폭되었다. 시노몰구스 원숭이 (Macaca fascicularis) IL-1R1 세포외 도메인 서열 (아미노산 잔기 1-336)을 코드화한 cDNA는 인간 PCR 증폭을 위해서 사용된 것과 동일한 프라이머를 사용하여 시노몰구스 원숭이 간 cDNA로부터 증폭되었다. 시노몰구스 원숭이 서열은 표준 디-데옥시 형광성 종결인자 서열을 사용한 PCR 생성물의 분석에 의해서 결정되었다. 생성된 DNA 서열은 도 1에 나타내었으며, 예측된 아미노산 서열은 도 2에 나타내었다. 생성된 cDNAs는 제조자의 설명에 따라 pENTR/D-TOPO (Invitrogen) 내로 서브-클로닝하였다.

그 후, IL-IR1 세포외 도메인을 코드화한 cDNA 단편을 LR Gateway® 반응 (Invitrogen)을 사용하여 포유동물 발현 벡터 pDEST12.2 (Invitrogen)에 전이시켰다. pDEST12.2 벡터는 관심이 있는 삽입된 유전자를 갖는 골격 내에 인간 IgG₁ Fc 코드화 부분을 함유하도록 하고, 또한 EBNA-1 유전자 생성물을 발현하는 세포주 (예를 들어, HEK293-EBNA 세포) 내로 형질감염시키면 에피좀성 플라스미드 복제를 허용하는 pCEP4 벡터 (Invitrogen)로부터의 oriP 복제 기원을 삽입시킴으로써 변형되었다. 인간 IL-1R1Fc에 대해 생성된 뉴클레오타이드 및 예측된 아미노산 서열은 도 3 및 도 4에 나타내었으며, 시노몰구스 원숭이 IL-1R1Fc에 대해서는 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.

단백질은 단백질 G 크로마토그래피에 이어서 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 조건화된 배지로부터 정제되었다.

재조합 인간 및 시노몰구스 랫트 IL-1R-Fc 융합 단백질의 생성

랫트 IL-1R-Fc는 상술한 바와 같은 재조합 인간 및 시노몰구스 원숭이 IL-1R1 Fc 융합 단백질의 생성과 유사한 방법에 의해서 제조되었다.

HeLa IL-1α- 및 IL-1β-유도된 IL-8 방출시험

HeLa 세포 (European Collection of Cell Cultures, ECACC 카탈로그 번호 93021013, MEM + 10% 태자 소 혈청 + 1% 비-필수 아미노산 중에 유지된 인간 니그로이드 경부 유상피세포양 암세포주 (human negroid cervix epitheloid carcinoma cell line; Cancer Res 1952;12:264; Proc Soc Exp Biol Med 1954;87:480); 세포는 일상적인 배양을 위해서 100% 콘플루언시 (confluency)로부터 1:4 내지 1:12로 분할되었다)를 100 ㎕ (용적/웰) 배양 배지 (10% (v/v) 열 불활성화된 태자 소 혈청 (Invitrogen), 1% (v/v) 비-필수 아미노산 (Invitrogen)을 함유하는 둘베코 변형 이글배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium; Invitrogen) 중에서 1.5×10⁴ 세포/웰로 96-웰 편평-바닥 조직배양 시험 플레이트 (Costar) 내에 접종한 다음에, 37℃ 및 5% CO₂ 하의 가습된 대기 중에서 밤새 (16-18 h) 배양하였다.

정제된 scFv/IgG의 적정액을 배양 배지 중에서 제조하고, 50 ㎕/웰의 이 희석 계열을 밤새 배양 배지를 제거하지 않고 HeLa 세포에 첨가하고, HeLa 세포와 함께 37℃에서 30-60 분 동안 전-배양하였다. 이어서 50 ㎕/웰의 ILα/IL-1β를 첨가하고, 37℃ 및 5% CO₂ 하의 가습된 대기 중에서 4-5 h 동안 배양하였다. 사용된 리간드의 농도는 시험한 scFv/IgG의 효력에 따라서 EC₅₀ 또는 그 이상이었으며, 여기에서 EC₅₀은 이 시험에서 리간드에 대한 최대 반응의 절반을 제공하는 리간드의 농도이다 (수학식 3과 유사한 방식으로 계산됨).

기준 마우스 항-인간 IL1R1 mAb (Fitzgerald 10-I73) 및 IL-1 수용체 길항제 아나킨라 (Kineret®; 의약품 아울렛으로부터 상업적으로 제공됨)가 적정시험에서 양성 대조군으로 포함되었다.

상등액 (조건화된 배양 배지)을 수확하고, IL-8 분석시까지 (통상적으로 1 주일 미만) -20℃에서 저장하였다.

상등액 내의 IL-8 레벨은 인간 IL-8 듀오세트 (Duoset) ELISA 키트 (R & D Systems)를 사용하여 결정되었다. IL-8 포착 항체 (PBS 중에서 희석된 4 ㎍/㎖, 50 ㎕/웰)를 4℃에서 밤새 96 웰 저자가-형광성, 고단백질 결합 플레이트 (FluoroNunc Maxisorb 플레이트)에 흡착시켰다. 과량의 IgG는 PBS-트윈으로 세척함으로써 제거하고, 웰을 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 실온에서 1 시간 동안 차단하고, 그 후에 플레이트를 전술한 바와 같이 세척하였다. 웰당 80 ㎕의 PBS 중의 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 첨가하였다. 그 후, 20 ㎕/웰의 조건화된 배양 배지를 첨가하여 조건화된 배양 배지의 1:5 희석을 제공하였다. IL-8 표준품 (1000 pg/㎖로부터, 1:2 희석)을 또한 ELISA 대조군으로서 ELISA 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양하였다.

배양 후에, 플레이트를 앞에서와 같이 세척하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 그 후, 비오티닐화된 IL-8 검출 Ab (시약 희석제 (0.1% BSA/PBS) 중의 20 ng/㎖; 50 ㎕/웰)를 플레이트에 첨가하고, RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 미결합된 검출 항체를 PBS-트윈 (0.1% v/v)으로 세척하여 제거하는 한편, 나머지 비오티닐화된 항체는 스트렙타비딘-유로퓸3+ 컨쥬게이트 (DELFIA® 검출, PerkinElmer)에 의해서 검출하였다. 시간-분해 형광은 빅터 (Victor) 플레이트 판독기 (PerkinElmer) 상에서 615 ㎚로 측정하였다. 형광 데이터는 유로퓸 계수로 도시하였다.

억제제 데이터는 수학식 4에 의해 억제제 대조군의 부재 하 (최대 대조군) 및 무-IL-1 대조군 (배지 대조군)에서의 IL-1 자극으로부터 유로퓸 계수를 사용하여 최대 IL-8 방출의 백분율로 표준화되었다.

[수학식 4]

IC₅₀ 값은 4-파라메터 보급 방정식 (수학식 3)을 사용한 곡선 맞춤에 의해서 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

CYNOMK1 IL-1β-유도된 IL-8 방출시험

CYNOM-K1 세포 (시노몰구스-유래 섬유아세포 세포주; European Collection of Cell Cultures, ECACC ref no 90071809; 공급자의 설명에 따라 유지됨)를 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 수확하고, 100 ㎕ (용적/웰) 배양 배지 (20% (v/v) 비-열 불활성화된 태자 소 혈청 (Invitrogen), 1% (v/v) 비-필수 아미노산 (Invitrogen)을 함유하는 최소 필수 배지 (Minimum Essential medium MEM; Invitrogen) 중에서 8×10³ 세포/웰로 96-웰 편평-바닥 조직배양 시험 플레이트 (Costar) 내에 접종한 다음에, 37℃ 및 5% CO₂ 하의 가습된 대기 중에서 밤새 (16-18 시간) 배양하였다.

정제된 scFv/IgG의 적정액을 배양 배지 중에서 제조하고, 50 ㎕/웰의 이 희석 계열을 밤새 배양 배지를 제거하지 않고 CYNOM-K1 세포에 첨가하고, CYNOM-K1 세포와 함께 37℃에서 30-60 분 동안 전-배양하였다. 이어서 50 ㎕/웰의 ILα/IL-1β를 첨가하고, 37℃ 및 5% CO₂ 하의 가습된 대기 중에서 4-5 시간 동안 배양하였다. 사용된 리간드의 농도는 이 시험에서 리간드에 대한 최대 반응의 80%를 제공하는 리간드의 농도이다 (수학식 3과 유사한 방식으로 계산됨).

IL-1 수용체 길항제 아나킨라 (Kineret®; 의약품 아울렛으로부터 상업적으로 제공됨)가 적정시험에서 양성 대조군으로 포함되었다.

상등액 (조건화된 배양 배지)을 수확하고, IL-8 분석시까지 (통상적으로 1 주일 미만) -20℃에서 저장하였다.

상등액 내의 IL-8 레벨은 인간 IL-8 듀오세트 ELISA 키트 (R & D Systems)를 사용하여 결정되었다. IL-8 포착 항체 (PBS 중에서 희석된 4 ㎍/㎖, 50 ㎕/웰)를 4℃에서 밤새 96 웰 저자가-형광성, 고단백질 결합 플레이트 (FluoroNunc Maxisorb 플레이트)에 흡착시켰다. 과량의 IgG는 PBS-트윈으로 세척함으로써 제거하고, 웰을 PBS 중의 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 실온에서 1 시간 동안 차단하고, 그 후에 플레이트를 전술한 바와 같이 세척하였다. 웰당 80 ㎕의 PBS 중의 0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)을 첨가하였다. 그 후, 20 ㎕/웰의 조건화된 배양 배지를 첨가하여 조건화된 배양 배지의 1:5 희석을 제공하였다. IL-8 표준품 (1000 pg/㎖로부터, 1:2 희석)을 또한 ELISA 대조군으로서 ELISA 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 RT에서 2 시간 동안 배양하였다.

배양 후에, 플레이트를 앞에서와 같이 세척하여 미결합된 단백질을 제거하였다. 그 후, 비오티닐화된 IL-8 검출 Ab (시약 희석제 (0.1% BSA/PBS) 중의 20 ng/㎖; 50 ㎕/웰)를 플레이트에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 미결합된 검출 항체를 PBS-트윈 (0.1% v/v)으로 세척하여 제거하는 한편, 나머지 비오티닐화된 항체는 스트렙타비딘-유로퓸3+ 컨쥬게이트 (DELFIA® 검출, PerkinElmer)에 의해서 검출하였다. 시간-분해 형광은 빅터 플레이트 판독기 (PerkinElmer) 상에서 615 ㎚로 측정하였다. 형광 데이터는 유로퓸 계수로 도시하였다.

억제제 데이터는 수학식 4에 의해 억제제 대조군의 부재 하 (최대 대조군) 및 무-IL-1 대조군 (배지 대조군)에서의 IL-1 자극으로부터 유로퓸 계수를 사용하여 최대 IL-8 방출의 백분율로 표준화되었다.

[수학식 4]

IC₅₀ 값은 4-파라메터 보급 방정식 (수학식 3)을 사용한 곡선 맞춤에 의해서 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 결정하였다.

인간 IL-1R1 세포외 도메인의 클로닝

서열 RefSeqNM 00877이 인간 IL-1R1에 대한 기준 서열로서 사용되었다. 세포외 도메인 (잔기 1-336)은 주형으로서 인간 간 cDA를 사용하여 PCR에 의해서 증폭되었다. 사용된 프라이머는 NC268 (5'-CACCATGAAAGTGTTACTCAGAC) 및 NC269 (5'-CTTCTGGAAATTAGTGACTGG)였다. 증폭된 PCR 생성물을 제조자의 설명을 사용하여 pENTR-D-TOPO (Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 몇 개의 클론을 수득하고, 서열결정하였다. 클론 4는 기준 서열과 동일하였으며, 후속 사용을 위해서 유지시켰다.

인간 다형성 A124G는 인간 pENTR-D-topo IL-1R1 클론 4 내의 해당 GCA 코돈의 GGA로의 표준 부위 지시된 돌연변이유발을 사용하여 생성되었다.

cyno IL-1R1 세포외 도메인의 클로닝

IL-1R1을 코드화한 시노몰구스 cDNA는 EMBL 데이터베이스 (EMBL AY497008)에서 이용할 수 있었다. 이 서열은 인간 서열에 대해서 고도로 상동성이었지만, 이것은 인간 IL-1R1과 비교할 때 코드화 서열의 첫 번째 5' 27bp가 결여되었다. 시노몰구스 원숭이 IL-1R1의 가용성 세포외 도메인 (잔기 1-336)을 코드화한 cDNA는 주형으로서 시노몰구스 간 cDNA를 사용하여 PCR에 의해서 증폭시켰다. 사용된 프라이머는 인간 IL-1R1 5'-프라이머인 상기한 바와 같은 NC268, 및 역방향 프라이머인 NC270 (5'-CTTCTGGAATTTAGTGACTGG)이었다. 증폭된 PCR 생성물은 pENTR-D-TOPO (Invitrogen) 내로 클로닝되었다.

몇 개의 클론을 서열결정하였으며, 여기에는 사용된 해독된 기준 서열 (EMBL AY497008)로부터의 변화가 있었다.

변화는 다음과 같다:

1. S17F : 모든 클론에서 공개된 서열 TTT 내의 TCT (시그날 서열)

2. V66I: 모든 클론에서 공개된 서열 ATA 내의 GTA

3. H173N: 공개된 서열에서 및 클론 5에서의 CAC, 다른 모든 클론에서의 AAC

공개된 서열과 비교한 이들 서열 변화의 타당성을 검사하기 위해서, 세포외 도메인을 코드화한 증폭된 cDNA는 표준 디-데옥시 형광성 종결인자 서열결정을 사용하여 직접 서열결정하였다. S17F 변화가 증폭된 PCR 생성물 내에 존재하였으며, 공개된 서열로부터의 진성 변화인 것으로 보인다. V66I 변화가 또한 증폭된 PCR 생성물 내에 존재하였으며, 공개된 서열로부터의 진성 변화인 것으로 보인다. H173N 변화는, CAC 및 AAC 코돈 둘 다가 동일한 강도로 동일한 위치에 존재하였기 때문에 진성 다형성인 것으로 보인다. PCR 생성물의 직접적인 서열결정은 추가의 다형성 E300K를 나타내었다. 이 경우에, 서열결정 반응은 명백하게 동등한 양의 GAA 및 AAA 코돈을 나타내었다.

랫트 IL-1R1 세포외 도메인의 클로닝

IL-1R1을 코드화한 랫트 cDNA의 서열은 EMBL 데이터베이스 (EMBL ID RNIL1R)로부터 수득하였으며, 기준 서열로 사용되었다. 세포외 도메인 (잔기 1-336)은 주형으로서 랫트 간 cDNA를 사용하여 PCR에 의해서 증폭되었다. 사용된 프라이머는 NC288 (5'-CACCATGCTGCCGAGGCTTG) 및 NC289 (5'-ATTCTTGAAGTCAGGAACTGGGT)였다. 증폭된 PCR 생성물은 제조자의 설명을 사용하여 pENTR-D-TOPO (Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 몇 개의 클론을 수득하고, 서열결정하였다. 클론 1은 기준 서열과 동일하였으며, 후속 사용을 위해서 유지시켰다.

인간 HIS FLAG IL-1Ra의 클로닝, 발현 및 정제

인간 IL-1Ra의 서열은 RefSeq 데이터베이스 (NM_173842)로부터 수득하였으며, 기준 서열로 사용되었다. 인간 IL-1Ra의 성숙 서열 (잔기 26-177)을 코드화한 cDNA는 인간 폐 cDNA로부터 PCR에 의해서 증폭되었다. 사용된 프라이머는 IL1RaF (5'-CCTCATATGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTCGACCCTCTGGGAGAAA) 및 IL1RaR (5'-ATATCTCGAGCTACTCGTCCTCCTGGAAG)이었다. 프라이머 IL1RaF의 디자인은 담배 식각 모자이크 바이러스 (Tobacco Etch Mosaic Virus) 프로테아제 (TEV) 분할 부위가 성숙 IL-1Ra의 N-말단 아르기닌 잔기에 바로 인접하도록 하였다. 증폭된 PCR 생성물은 제조자의 설명을 사용하여 pCR4blunt-topo (Invitrogen) 내로 클로닝하였다.

몇 개의 클론을 수득하고, 그들의 서열을 생성시켰다. 기준 서열과 비교하여 정확한 코드화 서열을 갖는 클론이 추가의 조작을 위해서 선택되었다. 삽입 DNA는 이어서 N-말단 (HIS)₆-FLAG 태그를 갖는 골격 내의 NdeI 부위를 사용하여 pT7 이. 콜라이 발현 벡터 내로 서브-클로닝하였다.

가용성 HIS-FLAG 태깅된 단백질을 발현시키기 위해서, 발현 플라스미드를 화학적으로 적절한 BL21 (DE3) 스타 (star) 세포 (Invitrogen) 내로 형질전환시켰다. 발현 플라스미드를 함유하는 세포를 37℃에서 라이소제니 육즙 (Lysogeny Broth) (10 g/ℓ의 트립톤, 5 g/ℓ의 효모 추출물, 5 g/ℓ의 NaCl을 함유하는 LB) 중에서 0.5의 OD600까지 배양하였다. 그 후에, IPTG를 1 M 원액으로부터 50 μM의 최종 농도까지 첨가하였다. 세포를 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 세포를 6,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리함으로써 수확하였으며, 펠릿을 -80℃에서 저장하였다. 세포를 해동시키고, 50 mM 트리스, pH 8.0, 10% 글리세롤, 0.3 M NaCl, 10 mM 이미다졸 (완충액 A) + 컴플리트 (Complete) 프로테아제 억제제 (Roche) 내에 재현탁시켰다. 세포를 Heatsystems-Ultrasonics Inc. 소니케이터 (sonicator)를 사용하여 얼음 상에서 3×30 초 동안 초음파처리함으로써 용해시켰다. 용해물을 100,000 g 및 4℃에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 Ni-NTA 슈퍼플로우 (Superflow) (Qiagen)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 결합된 물질을 0.3 M 이미다졸을 함유하는 완충액 A로 용출시켰다. IL-1Ra를 함유하는 분획을 모아서 Hiprep 26/10 탈염 칼럼 (GE Healthcare)을 사용하여 PBS 내로 완충액 교환하였다. 샘플의 순도는 SDS-겔 전기영동을 사용하여 시험하였다. 단백질은 겔 여과 크로마토그래피에 의해서 분석하였으며, 모노머성인 것으로 확인되었다.

LPS는 폴리믹신 B 아가로즈 (Sigma Prod. No. P1411)를 사용하여 5 ㎖ (14 ㎎)의 정제된 IL-1Ra로부터 제거하였다. 시그마 폴리믹신 아가로즈를 무-LPS PBS (Sigma D8537)로 3 회 세척하고, 비어있는 바이오래드 폴리프레프 (BioRad Polyprep) 칼럼에 적용하고, 비드가 중력 하에서 침강하도록 하였다. 1 ㎖의 충전된 비드를 10 ㎖의 무-LPS PBS로 세척하였다. IL-1ra 샘플을 칼럼에 적용하고, 중력 하에서 수지를 통해서 통과하도록 하였다. 샘플을 추가의 1 ㎖ 폴리믹신 칼럼을 통해서 통과시켰다. 폴리믹신 처리 전 및 후의 IL-1Ra 샘플 내의 LPS 레벨을 파이로크롬 (Pyrochrome) LAL 시험 (Associates of Cape Cod Inc. C0180)을 사용하여 결정하였다.

무-LPS 단백질의 분자 질량은 Q-ToF 질량 분석법을 사용한 온전한 질량 분석법을 사용하여 측정하였다. 측정된 질량은 N-말단 Met가 없는 His-Flag-Tev-IL-1ra의 계산된 질량 (20325.67 Da)의 1 Da 이내였다.

인간 HIS FLAG-IL-1β의 클로닝, 발현 및 정제

인간 IL-1β의 서열은 RefSeq 데이터베이스 (NM_000576)로부터 수득하였으며, 기준 서열로 사용되었다. 인간 IL-1β의 성숙 서열 (잔기 117-269)을 코드화한 cDNA는 인간 폐 cDNA로부터 PCR에 의해서 증폭되었다. 사용된 프라이머는 IL1bF (5'-CCTCATATGGAAAACCTGTACTTCCAGTCTGCACCTGTACGATCACTG) 및 IL1bR (5'-ATATCTCGAGTTAGGAAGACACAAATTGCATGG)이었다. 프라이머 IL1bF의 디자인은 담배 식각 모자이크 바이러스 프로테아제 (TEV) 분할 부위가 성숙 IL-1β의 N-말단 알라닌 잔기에 바로 인접하도록 하였다. 증폭된 PCR 생성물은 제조자의 설명을 사용하여 pCR4blunt-topo (Invitrogen) 내로 클로닝하였다.

몇 개의 클론을 수득하고, 그들의 서열을 생성시켰다. 기준 서열과 비교하여 정확한 코드화 서열을 갖는 클론이 추가의 조작을 위해서 선택되었다. 삽입 DNA는 이어서 N-말단 (HIS)₆-FLAG 태그를 갖는 골격 내의 NdeI 부위를 사용하여 pT7 이. 콜라이 발현 벡터 내로 서브-클로닝하였다.

가용성 HIS-FLAG 태깅된 IL-1β 단백질을 발현시키기 위해서, 발현 플라스미드를 화학적으로 적절한 BL21 (DE3) 스타 세포 (Invitrogen) 내로 형질전환시켰다. 발현 플라스미드를 함유하는 세포를 37℃에서 LB 중에서 0.5의 OD600까지 배양하였다. 그 후에, IPTG를 1 M 원액으로부터 50 μM의 최종 농도까지 첨가하였다. 세포를 37℃에서 추가로 3 시간 동안 배양하였다. 세포를 6,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리함으로써 수확하였으며, 펠릿을 -80℃에서 저장하였다. 세포를 해동시키고, 50 mM 트리스, pH 8.0, 10% 글리세롤, 0.3 M NaCl, 10 mM 이미다졸 (완충액 A) + 컴플리트 (Complete™) 프로테아제 억제제 (Roche) 내에 재현탁시켰다. 세포를 Heatsystems-Ultrasonics Inc. 소니케이터를 사용하여 얼음 상에서 3×30 초 동안 초음파처리함으로써 용해시켰다. 용해물을 100,000 g 및 4℃에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 Ni-NTA 슈퍼플로우 (Qiagen)를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 적용하였다. 결합된 물질을 0.3 M 이미다졸을 함유하는 완충액 A로 용출시켰다. IL-1β를 함유하는 분획을 모아서 Hiprep 26/10 탈염 칼럼 (GE Healthcare)을 사용하여 PBS 내로 완충액 교환하였다. 샘플의 순도는 SDS-겔 전기영동을 사용하여 시험하였다. 단백질은 겔 여과 크로마토그래피에 의해서 분석하였으며, 모노머성인 것으로 확인되었다.

LPS는 폴리믹신 B 아가로즈 (Sigma Prod. No. P1411)를 사용하여 본질적으로 상술한 것과 동일한 방식으로 정제된 IL-1β로부터 제거하였다.

무-LPS IL-1β 단백질의 분자 질량은 Q-ToF 질량 분석법을 사용한 온전한 질량 분석법을 사용하여 측정하였다. 측정된 질량은 N-말단 Met가 없는 His-Flag-Tev-IL-1β의 계산된 질량 (20576.10 Da)의 1 Da 이내였다.

실시예 3: 항체 6 및 AMG108의 친화성 측정

본 발명의 IL-1R1에 대한 항체의 친화성은 모두 KinExA™ 기술을 사용하는2 가지 방식으로 측정되었다 (118). KinExA™ (Kinetic Exclusion Assay)는 피코몰 범위 이하의 것을 포함하는 고친화성 상호작용을 정확하게 정량하기 위해서 사용될 수 있는 유동 분광형광측정 기본 기술이다 (119).

우선, 모노머화된 FAb를 sIL-1R1-Fc (가용성 sIL-1R1-Fc)와 평형에 도달하도록 하거나, IgG가 sIL-1R1 (비-태깅됨)과 평형에 도달하도록 하였다. 그 후, 상호작용 분자의 이들 평형화된 용액을 KinExA™. 3200 기술을 사용하여 분석하였다. 간략하면, 각각의 평형화된 샘플에 대해서 KinExA™. 3200 기구를 sIL-1R1 컨쥬게이트된 마이크로-비드의 새로운 칼럼으로 자동 충전하였다. 항체 (또는 FAb 단편), 항원, 및 Ab/항원 (또는 FAb/항원) 컴플렉스를 함유하는 샘플 (둘베코 PBS, 1 ㎎ ㎖^-1 소 혈청 알부민, 0.02% (w/v) 나트륨 아지드 중의)을 칼럼을 통해서 빠르게 (0.25 ㎖/분) 유동시켜 샘플과 항원-비드의 접촉 시간을 극도로 짧게 유지시켰다. 이러한 빠른 접촉 시간은, 고친화성 (느리게 해리하는) 상호작용의 경우에 컴플렉스의 해리가 이렇게 짧은 접촉 시간 중에는 무시할 수 있음을 보장하였다. 유리 항체는 IL-1R1-비드에 결합하였다. 그 후, Cy5™ (시아닌) 형광 표지된 이차 항체, 마우스 항-인간 IgG (중쇄 및 경쇄 특이적)를 칼럼을 통해서 통과시켰다. 표지된 이차 항체는 칼럼에 결합된 항체에 결합하였다. 완충액 세척으로 과량의 라벨을 제거하여 원래의 샘플 내의 유리 수용체의 양에 정비례하는 형광 시그날을 비드 칼럼 상에 남긴다. 항체 및 sIL-1R1의 다양한 농도 범위의 적정액을 제조하고, 이들 각각의 조건 후의 자유 항체를 측정함으로써, 수용체에 대한 항체에 관한 K_D를 추정하였다 (제공된 KinExA™. Pro 소프트웨어 내의 1:1 가역적 이분자성 상호작용 모델을 사용한 최소 자승 맞춤). 비아코어 (BIAcore) 기술 (표면 플라즈몬 공명)을 사용한 친화성 추정치를 비교할 수 있지만, 극도로 느린 해리 속도는 KinExA™. 평가가 K_D 값 <10 pM에서 친화성의 더 신뢰할 수 있는 치수를 제공한다는 것을 의미한다.

가용성 인간 IL-1R1 및 가용성 시노몰구스 IL-1R1에 대한 항-IL-1R1 FAb에 과한 친화성 측정의 결과는 이하의 표 10에 제시된다. 결과는, 이 항체가 동등하게 높은 친화성으로 인간 및 시노몰구스 IL-1R1에 결합하였으며, IL-1-알파, -베타 및 IL-1 수용체 길항제 (IL-1ra)와의 경쟁이 모두 가능한 에피토프 상에서도 불구하고 수용체의 친화성은 매우 높은 것을 나타낸다. 인간 sIL-1R1에 대한 친화성은 AMG108 IgG2에 대한 IgG1TM 형식으로서의 예시 항체에 관해 비교하였다. AMG108 IgG2는 시노몰구스 IL-1R1-Fc에 결합하지 않으며, AMG108인 IgG2는 모노머성의 안정한 균질의 FAb 단편을 쉽게 형성하지 않는다. 따라서, 전체 IgGs 사이의 비교만이 가능하였다. 표 11에서의 결과는, 인간 sIL-1R1에 대한 친화성이 예시 항체와 AMG108 사이에서 비교할 수 있었음을 나타낸다. 이전의 공개자료 (국제특허출원 제 WO 2004/022718호)에는 IL-1ra와 경쟁한 항체가 기술되어 있지만, 이들 (확인된 항체의 이차 클래스로 지정됨)은 더 낮은 친화성 및 효력을 가졌다. 이와는 대조적으로, 여기에서 본 발명자들은 IL-1ra에 대해서 경쟁하는 항체는 IL-1R1에 대해서 여전히 매우 높은 친화성을 갖는 것을 입증한다. 항체 6에 대한 FAb 및 IgG1TM에 관한 결과는 유사하였다.

[표 10]

[표 11]

방법:

FAb 모노머화

항체 6 IgG1TM (삼중 변이체, 234F, 235E 및 331S)을 활성화된 파파인을 사용하여 용액 중에서 분해시켰다. 파파인 (SIGMA) (6.2 mgs)은 620 ㎖의 둘베코 PBS (D-PBS)에 용해시키고, 62 ㎖의 D-PBS 중의 100 mM L-Cys에 이어서 D-PBS 중의 10 ㎖의 1 M NaHCO₃와 함께 배양함으로써 활성화시켰다. 그 후, 용액을 D-PBS 평형화된 세파덱스 (Sephadex) G25 (PD-10) 칼럼 상에서 탈염하고, 2.75-3.85 ㎖ 분획을 수집하였다. 이것은 원치않는 잔류 L-Cys 및 억제성 저분자량 파파인 자가분해 생성물을 제거하였다. 250 ㎕의 항체 6 IgG1TM (9.32 ㎎㎖^-1)을 25 ㎕의 D-PBS 중의 NaHCO₃ (pH를 8-8.5로 상승시킴) 및 50 ㎕의 L-Cys 활성화된 파파인 PD-10 용출액 (상술한 바와 같음)과 혼합시키고, 반응액을 RT에서 배양하였다. 반응 진행에 이어서 50 ㎕의 샘플을 0.5 ㎖ 분^-1로 D-PBS에 의해서 평형화된 슈퍼덱스 (Superdex) 75 크기 배제 크로마토그래피 칼럼 상에 주입하였다. 나머지 분해물 모두를 0.43 g (습윤 중량) 단백질 G 세파로즈 4 패스트 플로우 (Fast Flow)에 첨가하였다. 모노머성 FAb 단편에 해당하는 피크를 수집하고, 아미콘 울트라 (Amicon Ultra) 4 10,000 MWCO 원심분리 농축기 (Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 105 ㎕로 농축시켰다. 그 후, 이것을 슈퍼덱스 75 칼럼 상에 재주입하고, FAb 분획에 해당하는 피크를 수집하였다. 최종 슈퍼덱스 75 정제단계로부터의 21.0-21.8 분 분획을 순수한 항체 6 FAb의 공급원으로 사용하였다. FAb를 4℃에서 3일 저장한 후에 슈퍼덱스 75 칼럼 상에서 재분석하였으며, <0.4% 멀티머가 측정되었고, 이것은 모노머성 FAb 제제가 친화성 분석에 대해서 충분하게 안정하였음을 입증한다. 모노머성 FAb의 순도는 또한 환원성 및 비-환원성 SDS-PAGE 및 환원성 및 비-환원성 MALDI-TOF 질량 분석적 분석을 사용하여 확인되었다.

KinExA™. 분석

인간 (SEQ ID NO: 134; 완전히 환원된 모노머로서 65,036.92 Da의 예상된 펩타이드 서열 기본 질량; -Fc 다이머로서 133,039.8 Da; 모노머 농도로서 11,071 nM) 또는 시노몰구스 원숭이 (SEQ ID NO: 136; 완전히 환원된 것으로서 65213.14 Da의 예상된 펩타이드 서열 기본 질량, 스위스 프로트 (Swiss Prot), -Fc 다이머로서 130,392.3 Da, 모노머 농도로서 7,974 nM) IL-1R-Fcs가 항체 6 FAb와의 친화성 측정 (인간 및 cyno IL-1Rs와의 친화성의 직접 비교)을 위한 항원으로서 사용되었다. 인간 s IL-1R1 (R&D Systems, 49,503 Da의 예상된 펩타이드 서열 기본 질량)이 IgGs로서 AMG108 및 항체 6의 친화성을 측정하기 위한 (AMG108 및 항체 6 IgGs의 친화성의 직접 비교를 위한) 실험에서 항원으로 사용되었다.

긴 평형화 시간으로 인하여, KinExA™. 실험에서 사용된 모든 완충액은 0.2 ㎛ 필터 멸균되었다. 칼럼 (FAb 및 IgG 기본 측정 둘 다에 대해서 공통)에 대해서 인간 IL-1R1 (R&D Systems)이 사용되었고, 50 분 동안 일정하게 교반하면서 실온에서 3 ㎖의 50 mM 탄산나트륨 pH=8.4 중의 100 mgs (비드 ㎎ 당 1 ㎍ IL-1R1)의 아즈락톤 울트라링크 바이오서포트 (UltraLink Biosupport) 비드 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)에 공유적으로 결합되었다. 세정 및 차단은 1 M 트리스 pH 8.7 중의 10 ㎎㎖^-1 BSA에 의해서 달성되었다 (1 ㎖의 단일 세정, 이어서 비드의 원심분리, 및 이차 원심분리 후에 RT에서 1.5 시간 동안 25 r.p.m. 교반하면서 2 ㎖ 세정). 침강된 비드를 최종적으로 1 회 또는 그 이상 2 ㎖의 신선한 BSA 완충액에 옮기고, 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 마지막으로, 이 비드 현탁액을 60 ㎖ D-PBS + 0.02% 나트륨 아지드에 첨가하고, 기구 비드 취급 시스템상에 연결시켰다. 마우스 항-인간 IgG (H+L) Cy5 컨쥬게이트는 15 ㎎㎖^-1 BSA 및 0.05% Na 아지드에 의해 0.01 M Na 포스페이트, 0.25 M NaCl (pH 7.6) 중에서 1.4 ㎎㎖^-1로 구성되었다. 이것은 필요할 때까지 4℃에서 유지시켰다. FAbs 및 IgGs를 50 nM 또는 250 pM 또는 100 pM 또는 10 pM으로 희석하였다. FcRs를 25 or 5 nM로부터 0.1525 pM까지의 희석 계열 (둘베코 PBS, 1 ㎎ ㎖^-1 소 혈청 알부민, 0.02% (w/v) 나트륨 아지드 중의)로 항체 6 FAb 또는 항체 6 Ab/AMG108Ab를 혼입시킨 2-배 희석 계열로 희석하였다. 컴플렉스를 12-16일 동안 18℃ (실온)에서 평형에 도달하도록 한 다음에, 시그날 시험 후에 칼럼을 통해서 유동시켰다. 결합된 자유 항체는 50 ㎕의 Cy5 표지된 이차 항체를 사용하여 검출되었다. 데이터 처리 및 분석은 KinExA™. Pro (v 2.0.0.17) 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

실시예 4: 전혈 시험

항체를 전혈 시험에서의 효력에 관하여 분석하였으며, 여기에서 IL-1베타 (GIBCO, 동결건조됨, 담체 없음) 배양은 IL-6의 방출을 제공한다. 간략하면, 항체를 1% BSA를 함유하는 PBS 중에서 15 ㎍/㎖로 희석한 다음에, PBS/1% BSA 중에서 1:3 희석액으로 연속 적정하였다. 10 ㎕의 각각의 농도의 항체, 또는 PBS/1% BSA 대조군을 80 ㎕의 인간 전혈과 실온에서 30 분 동안 배양하였다. PBS/1% BSA 중의 10 ㎕ IL-1베타, 또는 PBS/BSA만을 첨가하여 30 pM의 최종 농도를 제공하고, 가습된 5% CO₂ 배양기 내의 37℃에서 22±2 시간 동안 배양하였다. 100 ㎕의 PBS를 웰에 첨가하고, 300 g에서 10 분 동안 회전시킨 후에 상등액을 제거하고, 상업적으로 이용할 수 있는 huIL-6 ELISA 키트 (R&D Systems Duoset, 설명에 따름)를 사용하여 IL-6에 대해서 분석하였다.

이 시험에서 항체 6 IgG1TM의 효력은 311 pM (83 pM-1.2 nM) (평균 IC₅₀; 95%CI)이었다.

실시예 5: 키메릭 인간/마우스 IL-1R1 세포외 도메인을 사용한 항체 6 상호작용의 에피토프 지도작성 (Mapping)

5.1. 전체 도메인 스왑 (swap) 키메릭 IL-1R1 분자의 생성

항체 6은 인간 IL-1R1은 결합시키지만, 마우스 IL-1R1은 결합시키지 않는다. 이 특성을 사용하여, 에피토프 지도작성을 위해서 키메릭 IL-1R1 분자를 생성시켰다. 전체 영역-스왑 키메라는 인간 IL-1R1 엑토영역 (ectodomain)의 도메인 1 (D1) (M1-Y122), 영역 2 (D2) (N123-V227) 또는 영역 3 (D3) (I228-K336)을 상응하는 마우스 IL-1R1 서열로 대체시킴으로써 생성시켰다. 서브-영역 (sub-domain) 스왑 키메라는 인간 IL-1R1로부터의 IL1β (120) 및 IL1ra (121)와 상호작용하는 것으로 공지된 부분을 마우스 IL-1R1로부터의 상응하는 부분으로 대체시킴으로써 생성시켰다. HTRF (homogeneous time resolved fluorescence) 경쟁시험을 사용하여 항체에 대한 키메라 결합을 결정하였다. 이 시험에서, Eu³⁺ 크립테이트로 표지된 항체는 비오틴으로 표지된 인간 IL-1R1과 상호작용하였다. 상호작용은 Eu³⁺ 크립테이트와 XL^ent! 표지된 스트렙타비딘 사이의 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시그날에 의해서 검출되었다.

5.1.1. 재료 및 방법 - 키메라의 클로닝, 발현 및 정제

인간 IL-1R1 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-336 NP_000868) 및 마우스 IL-1R1 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-338 NP_032388)의 키메라를 코드화한 cDNA 분자를 프라이머 연장 PCR 클로닝에 의해서 합성하고, pDONR221 (Invitrogen Cat. No.12536-017) 내로 클로닝하였다. 그 후, IL-1R1 세포외 도메인 키메라에 대해 코드화한 cDNA 단편을 제조자의 설명 (Invitrogen Cat. No.12538-120)에 따라 LR 게이트웨이 클로나제 (Gateway Clonase) II 효소를 사용하여 포유동물 발현 벡터 pDEST12.2 (Invitrogen)에 전이시켰다. pDEST12.2 벡터는 관심이 있는 삽입된 유전자를 갖는 골격 내에 인간 IgG₁ Fc 단편 및 6xhis 태그 (SEQ ID NO: 134)를 함유하도록 하고, 또한 EBNA-1 유전자 생성물을 발현하는 세포주 (예를 들어, EBNA-1 유전자로 형질감염된 CHO 세포 [CHO-EBNA]) 내로 형질감염시키면 에피좀성 플라스미드 복제를 허용하는 pCEP4 벡터 (Invitrogen cat. no. V044-50)로부터의 oriP 복제 기원을 삽입시킴으로써 변형되었다. CHO-EBNA 유전자로부터 상등액 내에 발현된 단백질을 단백질 G 친화성 크로마토그래피 (HiTrap Protein G HP column (GE Healthcare Cat. No. 17-0404-03))에 이어서 크기 배제 크로마토그래피 (슈퍼덱스 200 칼럼 (GE Healthcare Cat. No.17-1069-01))를 사용하여 정제하였다.

인간 IL-1R1 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-336 NP_000868), 벡터 코드화된 서열, 인간 IgG1 Fc 태그 및 6xhis 태그의 서열은 SEQ ID NO: 134에 기술된다. 마우스 IL-1R1 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-338 NP_032388)의 서열, 벡터 코드화된 서열.

5.1.2. IL-1R1 키메라에 대한 항체의 결합

항체는 제조자의 설명 (CisBio International Cat No. 62EUSPEA)에 따라 Eu³⁺ 크립테이드 표지 키트로 크립테이트에 의해서 크립테이트 표지하였으며, IL-1R1/Fc (SEQ ID NO: 134, 재료 및 방법 참조)는 제조자의 설명에 따라 EZ 링크 설포-NHS-비오틴 (Perbio Cat No. 21335)으로 비오틴 표지하였다. 시험 조건은 384 웰 천정 (shallow well) 코스타 플레이트 (3676) 내에서 20 ㎕의 총 용적으로 1×D-PBS, 0.1% BSA, 0.4 M 불화칼륨 중의 0.25 nM 크립테이트 표지된 항체, 0.3 nM 비오틴 표지된 IL-1R1/Fc, 2.5 nM 스트렙타비딘 XL^ent! (CisBio International Cat. No. 611SAXLB)였다. 시험에 시험 단백질의 희석 계열 (최대 100 nM로부터 0.0017 nM까지)을 첨가하고, 시험액을 실온에서 3 시간 동안 배양하였다. FRET 시그날은 320 ㎚ 여기 필터 및 620 ㎚ 및 665 ㎚ 방출 필터를 사용하는 퍼킨엘머 엔비전 (PerkinElmer EnVision) 플레이트 판독기를 사용하여 검출하였다. 결과는 665/620 비로부터 특이적 결합 (경쟁자 항원이 없는 경우의 시그날)의 백분율로서 계산하였다. 결과는 시그모이드 용량 반응 모델을 사용하여 프리즘 (Prism) (GraphPad Software)에 의해서 분석하였다.

5.2. 결과

키메릭 분자의 항체 결합은 HTRF (Homogeneous Time Resolved Fluorescence) 경쟁시험에서 시험하였다. 인간 IL-1R1과 동일한 파라토프에서 항체를 결합시킨 분자는 결합 상호작용을 억제하여 시그날의 감소를 유도하였다. 억제곡선으로부터 인간 IL-1R1, 마우스 IL-1R1 및 키메릭 분자에 대한 IC₅₀ 값을 계산하였다 (표 12). 분자가 결합을 완전히 억제하지 않았다면, 최고 농도에서 나타난 억제 백분율을 계산하였다. 천연 인간 IL-1R1과 유사한 IC₅₀ 값을 제공하는 키메라는 여전히 에피토프를 함유하였다. 항체에 대한 IL-1R1 결합을 완전히 억제하지 않았거나, 증가된 IC₅₀ 값을 나타낸 키메라는 완전한 에피토프를 함유하지 않았다. 이들 데이터는 항체 에피토프의 위치결정 (localisation)을 가능하게 하였다.

[표 12]

키메릭 인간/마우스 IL-1R1 키메라의 결합은 항체에 의해서 결합된 인간 IL-1R1 에피토프의 위치결정을 가능하게 하였다. 인간 D2 IL1R1을 대체시킨 IL1R1의 마우스 D2 도메인을 함유하는 모든 키메라 (MoIL-1R1; MoD1-D2 HuD3 IL1R1; MoD2 HuD1 HuD3 IL1R1; MoD2-D3 HuD1)는 인간 IL1R1을 완전히 억제하지 못한 반면에 D2 인간 IL1R1을 함유하는 것 (HuIL-1R1; MoD3 HuD1-D2)은 인간 IL-1R1과 경쟁할 수 있었기 때문에 (표 12), 전체 도메인 스왑 키메라는 에피토프를 인간 IL-1R1의 D2 (잔기 N123-V227)로 위치결정하였다.

인간 IL-1R1은 7 개의 베타 스트랜드 및 4 개의 루프 부분을 함유하고, 결정 구조 내에서 IL1β에 매우 근접한 3 개의 도메인에 걸쳐서 퍼져있다 (123). 또한, 인간 IL1R1은 결정 구조 내에서 IL1ra에 매우 근접하여 존재하는 3 개의 베타 스트랜드 및 7 개의 루프 부분을 함유한다 [Schreuder et al., Nature 386:194-200, 1997]. 베타 스트랜드 또는 루프 스왑 키메라는 베타 스트랜드 a2 (잔기 N123-V134)를 포함하는 도메인 2 내의 주성분 및 루프 b2-c2 (잔기 L140-K157) [Vigers et al ., Nature 386:190-194, 1997] 및 루프 d2-e2 (잔기 K178-R180) [Schreuder et al., Nature 386:194-200, 1997] 내의 미량 성분으로의 인간 IL-1R1 에피토프의 위치결정을 가능하게 하였다. 인간 베타 스트랜드 a2가 없는 키메라는 항체에 대한 인간 IL1R1 결합보다 26 배 더 큰 IC₅₀을 제공하였으며, 루프 b2-c2 또는 d2-e2가 없는 키메라는 인간 IL-1R1보다 >3 배 더 큰 IC₅₀을 제공하였다 (표 x). 도메인 스왑 데이터와 일치하여, 베타 스트랜드 a2, 루프 b2-c2 및 d2-e2는 도메인 2에 위치한다 [Vigers et al ., Nature 386:190-194, 1997].

이들 데이터로부터, 항체는 인간 IL-1R1; N123-V134, L140-K157 및 K178-R180의 3 개의 부분에서의 33 개 아미노산의 불연속적 에피토프 내에서 아미노산을 결합시킨다.

생물학적 기탁물

이. 콜라이 (E. coli) TOP10 내의 생물학적 기탁물은 부다페스트 협약 (Budapest Treaty) 하에 다음에서 기탁되었다:

NCIMB Limited

Ferguson Building,

Craibstone Estate,

Bucksburn,

Aberdeen,

AB21 9YA.

Scotland

UK

상기 기탁물은 본 발명의 또 다른 구체예를 나타낸다.

참고문헌

상기 어디에서든 인용된 것을 포함한 본 명세서의 어디에서든 인용된 모든 문헌 본 발명에 온전히, 그리고 모든 목적으로 참고로 포함된다.

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Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Ser Ser Thr Asn Trp Gly Tyr Thr Val Asp Ala 100 105 110 Ala Val Asp Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Tyr Ala Met Ser 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Gly Ala Ser Ser Thr Asn Trp Gly Tyr Thr Val Asp Ala Ala Val 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgttctg gcagcagctc caacatcgga agtaattatg tattctggta ccagcagttc 120 ccaggtacgg ccccccaact cctcgtcaaa tggaataatc agcggccctc aggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tggactccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgca gcatgggatg accacctgga acagctccac 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccgtccta 330 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Gln Leu Leu 35 40 45 Val Lys Trp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp His Leu 85 90 95 Glu Gln Leu His Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 8 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Phe 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Trp Asn Asn Gln Arg Pro Ser 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT 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caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaccgtacg tctccaccat 300 gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 67 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asp Thr His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val Ile Ala Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Val 85 90 95 Arg Leu His His Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 68 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Gly Asp Thr His Arg Pro Ser 5 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Gln Ser Tyr Asp Thr Val Arg Leu His His Val 5 10 <210> 71 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120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaacccttg 300 tactactatg atgaatcact agctctacct gtgtatgatg ctgatatctg gggccggggg 360 acactggtca ccgtctcctc a 381 <210> 82 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Leu Tyr Tyr Tyr Asp Glu Ser Leu Ala Leu Pro Val Tyr 100 105 110 Asp Ala Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Homo 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acggccgtgt attactgtgc aagagatggc 300 gcgagtagta ccaattgggg atacaactac tacggtatgg acgtctgggg gcgggggacc 360 acggtcaccg tctcctca 378 <210> 92 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Ser Ser Thr Asn Trp Gly Tyr Asn Tyr Tyr Gly 100 105 110 Met Asp Val Trp Gly Arg Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 93 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ser Tyr Ala Met Ser 5 <210> 94 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 5 10 15 Gly <210> 95 <211> 17 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tatggtgaca cccatcggcc ctcaggggtc 180 cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggtcat cgctgggctc 240 caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaccctact tctcgcacca 300 caattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333 <210> 117 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly 20 25 30 Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Asp Thr His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Val Ile Ala Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Leu 85 90 95 Leu Leu Ala Pro Gln Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 118 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His 5 10 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Gly Asp Thr His Arg Pro Ser 5 <210> 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catctgcaaa tgaaattgat 120 gttcgtccct gtcctcttaa cccaaatgaa cacaaaggca ctataacttg gtataaagat 180 gacagcaaga cacctgtatc tacagaacaa gcctccagga ttcatcaaca caaagagaaa 240 ctttggtttg ttcctgctaa ggtggaggat tcaggacatt actattgcgt ggtaagaaat 300 tcatcttact gcctcagaat taaaataagt gcaaaatttg tggagaatga gcctaactta 360 tgttataatg cacaagccat atttaagcag aaactacccg ttgcaggaga cggaggactt 420 gtgtgccctt atatggagtt ttttaaaaat gaaaataatg agttacctaa attacagtgg 480 tataaggatt gcaaacctct acttcttgac aatatacact ttagtggagt caaagatagg 540 ctcatcgtga tgaatgtggc tgaaaagcat agagggaact atacttgtca tgcatcctac 600 acatacttgg gcaagcaata tcctattacc cgggtaatag aatttattac tctagaggaa 660 aacaaaccca caaggcctgt gattgtgagc ccagctaatg agacaatgga agtagacttg 720 ggatcccaga tacaattgat ctgtaatgtc accggccagt tgagtgacat tgcttactgg 780 aagtggaatg ggtcagtaat tgatgaagat gacccagtgc taggggaaga ctattacagt 840 gtggaaaatc ctgcaaacaa aagaaggagt accctcatca cagtgcttaa tatatcggaa 900 attgaaagta gattttataa acatccattt acctgttttg ccaagaatac 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atgaacgtga agaaaaaata attttagtgt catctgcaaa tgaaattgat 120 gttcgtccct gtcctcttaa cccaaatgaa tacaaaggca ctataacatg gtataaaaat 180 gacagcaaga cacctatatc tacagaacaa gcctccagga ttcatcagca caaaaagaaa 240 ctttggtttg ttcctgctaa ggtagaagat tcaggacatt actactgtgt ggtaagaaat 300 tcatcttact gcctcagaat taaaataact gcaaaatttg tggagaatga gcctaacttg 360 tgttataatg cagaagccat atttaagcag agactacccg ttgcaggaga tggaggactt 420 gtgtgccctt atatggagtt ttttaaagac gaaaataatg agttacctaa attactgtgg 480 tataaggatt gcaaacctct acttcttgac aatataaact ttagtggagt caaagatagg 540 ctcatcgtga tgaatgtggc tgaaaagcat agagggaact atacttgtca tgcatcctac 600 acatacttgg gcaagcaata tcctattacc cgggtaatag aatttattac tctagaggaa 660 aacaaaccca caaggcctgt gattgtgagc ccagctaatg agacaataga agtagacttg 720 ggatcccaga tacaattgat ctgtaatgtc actggccagt tgagtgatac tgcctactgg 780 aagtggaatg ggtccttcat tgatgaagat gacccagtgc taggggaaga ctattacagt 840 gtggaaaatc ctgcaaacaa aagaaggagt accctcatca cagtgcttaa tatatcagaa 900 actgaaagta gattttataa acatccattt acctgtttag ccaggaatac acatggtatg 960 gatgcagcat atgtccagtt aatatatcca gtcactaaat tccagaagaa gggtgggcgc 1020 gccgacccag ctttcttgta caaagtggtg ggggccgccc ccaaatcttg tgacaaaact 1080 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 1140 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 1200 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1260 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1320 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1380 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1440 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1500 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1560 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1620 ttcttcctct atagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1680 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1740 tctccgggta aacatcatca 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Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 Ser Leu Glu Ala Asp Lys Cys Lys Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu 20 25 30 Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro 35 40 45 Asn Glu His Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asp Asp Ser Lys Thr 50 55 60 Pro Val Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Glu Lys 65 70 75 80 Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Ser Ala Lys 100 105 110 Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Gln Ala Ile Phe 115 120 125 Lys Gln Lys Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr 130 135 140 Met Glu Phe Phe Lys Asn Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Gln Trp 145 150 155 160 Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile His Phe Ser Gly 165 170 175 Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly 180 185 190 Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro 195 200 205 Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr 210 215 220 Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu 225 230 235 240 Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro 260 265 270 Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg 275 280 285 Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg 290 295 300 Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile 305 310 315 320 Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Phe Gln Lys 325 330 335 <210> 138 <211> 1012 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 caccatgaaa gtgttactca gacttatttg tttcatagct ctactgattt cttctctgga 60 ggctgataaa tgcaaggaac gtgaagaaaa aataatttta gtgtcatctg caaatgaaat 120 tgatgttcgt ccctgtcctc ttaacccaaa tgaacacaaa ggcactataa cttggtataa 180 agatgacagc aagacacctg tatctacaga acaagcctcc aggattcatc aacacaaaga 240 gaaactttgg tttgttcctg ctaaggtgga ggattcagga cattactatt gcgtggtaag 300 aaattcatct tactgcctca gaattaaaat aagtgcaaaa tttgtggaga atgagcctaa 360 cttatgttat aatgcacaag ccatatttaa gcagaaacta cccgttgcag gagacggagg 420 acttgtgtgc ccttatatgg agttttttaa aaatgaaaat aatgagttac ctaaattaca 480 gtggtataag gattgcaaac ctctacttct tgacaatata cactttagtg gagtcaaaga 540 taggctcatc gtgatgaatg tggctgaaaa gcatagaggg aactatactt gtcatgcatc 600 ctacacatac ttgggcaagc aatatcctat tacccgggta atagaattta ttactctaga 660 ggaaaacaaa cccacaaggc ctgtgattgt gagcccagct aatgagacaa tggaagtaga 720 cttgggatcc cagatacaat tgatctgtaa tgtcaccggc cagttgagtg acattgctta 780 ctggaagtgg aatgggtcag taattgatga agatgaccca gtgctagggg aagactatta 840 cagtgtggaa aatcctgcaa acaaaagaag gagtaccctc atcacagtgc ttaatatatc 900 ggaaattgaa agtagatttt ataaacatcc atttacctgt tttgccaaga atacacatgg 960 tatagatgca gcatatatcc agttaatata tccagtcact aatttccaga ag 1012 <210> 139 <211> 336 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 139 Met Lys Val Leu Leu Arg Leu Ile Cys Phe Ile Ala Leu Leu Ile Ser 1 5 10 15 Phe Leu Glu Ala Asp Lys Cys Asn Glu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Leu 20 25 30 Val Ser Ser Ala Asn Glu Ile Asp Val Arg Pro Cys Pro Leu Asn Pro 35 40 45 Asn Glu Tyr Lys Gly Thr Ile Thr Trp Tyr Lys Asn Asp Ser Lys Thr 50 55 60 Pro Ile Ser Thr Glu Gln Ala Ser Arg Ile His Gln His Lys Lys Lys 65 70 75 80 Leu Trp Phe Val Pro Ala Lys Val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Val Arg Asn Ser Ser Tyr Cys Leu Arg Ile Lys Ile Thr Ala Lys 100 105 110 Phe Val Glu Asn Glu Pro Asn Leu Cys Tyr Asn Ala Glu Ala Ile Phe 115 120 125 Lys Gln Arg Leu Pro Val Ala Gly Asp Gly Gly Leu Val Cys Pro Tyr 130 135 140 Met Glu Phe Phe Lys Asp Glu Asn Asn Glu Leu Pro Lys Leu Leu Trp 145 150 155 160 Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn Ile Asn Phe Ser Gly 165 170 175 Val Lys Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly 180 185 190 Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro 195 200 205 Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr 210 215 220 Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Ile Glu Val Asp Leu 225 230 235 240 Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp 245 250 255 Thr Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Phe Ile Asp Glu Asp Asp Pro 260 265 270 Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg 275 280 285 Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Thr Glu Ser Arg 290 295 300 Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Leu Ala Arg Asn Thr His Gly Met 305 310 315 320 Asp Ala Ala Tyr Val Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Lys Phe Gln Lys 325 330 335 <210> 140 <211> 1012 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 140 caccatgaaa gtgttactcc gacttatttg tttcattgct ctactgattt cttttctgga 60 ggctgataaa tgcaatgaac gtgaagaaaa aataatttta gtgtcatctg caaatgaaat 120 tgatgttcgt ccctgtcctc ttaacccaaa tgaatacaaa ggcactataa catggtataa 180 aaatgacagc aagacaccta tatctacaga acaagcctcc aggattcatc agcacaaaaa 240 gaaactttgg tttgttcctg ctaaggtaga agattcagga cattactact gtgtggtaag 300 aaattcatct tactgcctca gaattaaaat aactgcaaaa tttgtggaga atgagcctaa 360 cttgtgttat aatgcagaag ccatatttaa gcagagacta cccgttgcag gagatggagg 420 acttgtgtgc ccttatatgg agttttttaa agacgaaaat aatgagttac ctaaattact 480 gtggtataag gattgcaaac ctctacttct tgacaatata aactttagtg gagtcaaaga 540 taggctcatc gtgatgaatg tggctgaaaa gcatagaggg aactatactt gtcatgcatc 600 ctacacatac ttgggcaagc aatatcctat tacccgggta atagaattta ttactctaga 660 ggaaaacaaa cccacaaggc ctgtgattgt gagcccagct aatgagacaa tagaagtaga 720 cttgggatcc cagatacaat tgatctgtaa tgtcactggc cagttgagtg atactgccta 780 ctggaagtgg aatgggtcct tcattgatga agatgaccca gtgctagggg aagactatta 840 cagtgtggaa aatcctgcaa acaaaagaag gagtaccctc atcacagtgc ttaatatatc 900 agaaactgaa agtagatttt ataaacatcc atttacctgt ttagccagga atacacatgg 960 tatggatgca gcatatgtcc agttaatata tccagtcact aaattccaga ag 1012 <210> 141 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Met Gly Ser Ser His His His His His His Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 1 5 10 15 Asp Lys His Met Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Arg Pro Ser Gly Arg 20 25 30 Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys 35 40 45 Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly 50 55 60 Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro 65 70 75 80 His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile 100 105 110 Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile 115 120 125 Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro 130 135 140 Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu 145 150 155 160 Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln 165 170 175 Glu Asp Glu <210> 142 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 142 Met Gly Ser Ser His His His His His His Asp Tyr Lys Asp Asp Asp 1 5 10 15 Asp Lys His Met Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Ala Pro Val Arg Ser 20 25 30 Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser 35 40 45 Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu 50 55 60 Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn 65 70 75 80 Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu 85 90 95 Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val 100 105 110 Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe 115 120 125 Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe 130 135 140 Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe 145 150 155 160 Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln 165 170 175 Phe Val Ser Ser 180 <210> 143 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 143 agaccacaac ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg agatatatcc 60 atggcccagg tgcagc 76 <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 144 caccatgaaa gtgttactca gac 23 <210> 145 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 145 cttctggaaa ttagtgactg g 21 <210> 146 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 146 cttctggaat ttagtgactg g 21 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 147 caccatgctg ccgaggcttg 20 <210> 148 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 148 attcttgaag tcaggaactg ggt 23 <210> 149 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 149 cctcatatgg aaaacctgta cttccagtct cgaccctctg ggagaaa 47 <210> 150 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 150 atatctcgag ctactcgtcc tcctggaag 29 <210> 151 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 151 cctcatatgg aaaacctgta cttccagtct gcacctgtac gatcactg 48 <210> 152 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 152 atatctcgag ttaggaagac acaaattgca tgg 33

Claims (25)

1. IL-1R1에 대한 결합에 관해서 IL-1 및 IL-1Ra와 경쟁하며, Kinexa™에 의해서 측정하는 경우에 10 pM 이하의 K_D로 IL-1R1에 결합하는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분.
2. 30 pM IL-1β의 존재 하에 인간 전혈 내에서 IL-1β 유도된 IL-6 생산의 억제에 관해 적어도 6 개의 상이한 공여체로부터 평균하여 1 nM 미만의 평균 IC₅₀을 갖는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분.
3. 청구항 2에 있어서, 평균 IC₅₀이 500 pM 미만인, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분.
4. CDRs의 세트인 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기에서 CDRs의 세트는 CDRs의 기준 세트에 비해서 12개 이하의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지며, 여기에서
   HCDR1은 SEQ. ID. NO: 93의 아미노산 서열을 가지고;
   HCDR2는 SEQ. ID. NO: 94의 아미노산 서열을 가지며;
   HCDR3은 SEQ. ID. NO: 95의 아미노산 서열을 가지고;
   LCDR1은 SEQ. ID. NO: 98의 아미노산 서열을 가지며;
   LCDR2는 SEQ. ID. NO: 99의 아미노산 서열을 가지고;
   LCDR3은 SEQ. ID. NO: 100의 아미노산 서열을 갖는,
   IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분.
5. CDRs의 세트인 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기에서 CDRs의 세트는 CDRs의 기준 세트에 비해서 15개 이하의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지며, 여기에서
   HCDR1은 SEQ. ID. NO: 103의 아미노산 서열을 가지고;
   HCDR2는 SEQ. ID. NO: 104의 아미노산 서열을 가지며;
   HCDR3은 SEQ. ID. NO: 105의 아미노산 서열을 가지고;
   LCDR1은 SEQ. ID. NO: 108의 아미노산 서열을 가지며;
   LCDR2는 SEQ. ID. NO: 109의 아미노산 서열을 가지고;
   LCDR3은 SEQ. ID. NO: 110의 아미노산 서열을 갖는,
   IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분.
6. CDRs의 세트인 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 여기에서 CDRs의 세트는 CDRs의 기준 세트에 비해서 17개 이하의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지며, 여기에서
   HCDR1은 SEQ. ID. NO: 63의 아미노산 서열을 가지고;
   HCDR2는 SEQ. ID. NO: 64의 아미노산 서열을 가지며;
   HCDR3은 SEQ. ID. NO: 65의 아미노산 서열을 가지고;
   LCDR1은 SEQ. ID. NO: 68의 아미노산 서열을 가지며;
   LCDR2는 SEQ. ID. NO: 69의 아미노산 서열을 가지고;
   LCDR3은 SEQ. ID. NO: 70의 아미노산 서열을 갖는,
   IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분.
7. 청구항 6에 있어서, CDRs의 세트가 CDRs의 기준 세트에 비해서 10개 이하의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 분리된 결합 성분.
8. 청구항 6에 있어서, CDRs의 세트가 CDRs의 기준 세트에 비해서 5개 이하의 아미노산 부가, 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는 분리된 결합 성분.
9. 다음의 치환 또는 결실 중의 하나 이상을 갖는 항체 1 HCDR3 (SEQ ID NO: 95)을 포함하는 분리된 결합 성분 또는 VH 도메인:
   T에 의해서 대체된 카바트 잔기 100E;
   V 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 100F;
   D에 의해서 대체된 카바트 잔기 100G;
   A 또는 P에 의해서 대체된 카바트 잔기 100H;
   A 또는 P에 의해서 대체된 카바트 잔기 100I;
   V 또는 G에 의해서 대체된 카바트 잔기 101; 및
   D 또는 V에 의해서 대체된 카바트 잔기 102.
10. 다음의 치환 또는 결실 중의 하나 이상을 갖는 항체 4 HCDR3 (SEQ ID NO: 105)을 포함하는 분리된 결합 성분 또는 VH 도메인:
    A 또는 E에 의해서 대체된 카바트 잔기 100A;
    P, Q 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 100B;
    P, Y, S 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 100C;
    P, G 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 100D;
    L 또는 V에 의해서 대체된 카바트 잔기 100E;
    G, V 또는 P에 의해서 대체된 카바트 잔기 100F;
    V에 의해서 대체된 카바트 잔기 100G;
    Y에 의해서 대체된 카바트 잔기 100H;
    G 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 100I;
    A에 의해서 대체되거나 결실된 카바트 잔기 100J;
    F에 의해서 대체된 카바트 잔기 101;
    V에 의해서 대체된 카바트 잔기 102.
11. 다음의 치환 중의 하나 이상을 갖는 항체 1 LCDR3 (SEQ ID NO 100)을 포함하는 분리된 결합 성분 또는 VH 도메인:
    H 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 94;
    A에 의해서 대체된 카바트 잔기 95;
    E 또는 R에 의해서 대체된 카바트 잔기 95A;
    Q 또는 V에 의해서 대체된 카바트 잔기 95B;
    H 또는 L에 의해서 대체된 카바트 잔기 97.
12. 다음의 치환 중의 하나 이상을 갖는 항체 4 LCDR3 (SEQ ID NO 110)을 포함하는 분리된 결합 성분 또는 VH 도메인:
    A, V, D, H, L 또는 R에 의해서 대체된 카바트 잔기 94;
    G, R 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 95;
    G, L, A, V 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 95A;
    H, R, A 또는 D에 의해서 대체된 카바트 잔기 95B;
    H, P 또는 A에 의해서 대체된 카바트 잔기 96; 및
    H, V 또는 Q에 의해서 대체된 카바트 잔기 97.
13. 청구항 9에 따른 HCDR3 및 청구항 11에 따른 LCDR3을 포함하는 분리된 결합 성분.
14. 청구항 10에 따른 HCDR3 및 청구항 12에 따른 LCDR3을 포함하는 분리된 결합 성분.
15. IL-1R1에 대한 결합에 관해서 청구항 1 내지 14 중의 어느 하나에 따른 분리된 결합 성분 또는 항체와 경쟁하거나 교차-경쟁하는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분.
16. IL-1R1의 다음의 서열 중의 하나 이상 내에 포함된 에피토프를 결합시키는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분:
    (i) N123-V134;
    (ⅱ) L140-K157; 및/또는
    (ⅲ) K178-R180.
17. 청구항 16에 있어서, IL-1R1의 다음의 서열 내에 포함된 불연속적 에피토프를 결합시키는, IL-1R1에 대해서 특이적인 분리된 결합 성분:
    (i) N123-V134;
    (ⅱ) L140-K157; 및
    (ⅲ) K178-R180.
18. 청구항 1 내지 17 중의 어느 하나에 있어서, 결합 성분이 모노클로날 항체인 분리된 결합 성분.
19. 청구항 1 내지 18 중의 어느 하나에 따른 분리된 결합 성분을 코드화한 분리된 핵산 분자.
20. 청구항 19에 따른 핵산 분자에 의해서 형질전환된 숙주 세포.
21. 청구항 20에 따른 숙주 세포를 청구항 1 내지 18 중의 어느 하나에 따른 항체 또는 결합 성분의 생산을 위한 조건 하에서 배양하는 것을 포함하는, 청구항 1 내지 18 중의 어느 하나에 따른 항체 또는 분리된 결합 성분을 생산하는 방법.
22. 청구항 1 내지 18 중의 어느 하나에 따른 결합 성분 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
23. 청구항 22에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 조성물.
24. IL-1R1와 연관된 장애를 치료하기 위한 청구항 22의 조성물의 용도.
25. 청구항 24에 있어서, 장애가 류마티스성 관절염, 골관절염, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, HIV, 고체 종양, 백혈병, 알츠하이머병, 타입 II 당뇨병, 허혈성 질환 및 아테롬성경화증 중의 하나 이상인 용도.

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