KR20110057166A - Ｃｃｒ２에 대한 항체 - Google Patents

Ｃｃｒ２에 대한 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20110057166A
KR20110057166A KR1020117006355A KR20117006355A KR20110057166A KR 20110057166 A KR20110057166 A KR 20110057166A KR 1020117006355 A KR1020117006355 A KR 1020117006355A KR 20117006355 A KR20117006355 A KR 20117006355A KR 20110057166 A KR20110057166 A KR 20110057166A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
amino acid
ccr2
antibody
acid sequence
Prior art date
Application number
KR1020117006355A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101772706B1 (ko
Inventor
로날드 피 글래듀
브래들리 티 켈러
신지 오가와
아르빈드 라즈팔
라우리 에이 틸라스카
셸리 심스 벨로우스키
래리 엘 그린
메이나 리앙
Original Assignee
화이자 인크.
암젠 프레몬트 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 화이자 인크., 암젠 프레몬트 인코포레이티드 filed Critical 화이자 인크.
Publication of KR20110057166A publication Critical patent/KR20110057166A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101772706B1 publication Critical patent/KR101772706B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

본 발명은 CCR2, 특히 인간 CCR2에 특이적으로 결합하고, CCR2를 억제하도록 기능할 수 있는 인간 항체 및 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항체를 제공한다. 항CCR2 항체는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 인간 항CCR2 항체 및 이의 항원 결합 부분을 제공한다. 본 발명은 인간 항CCR2 항체로부터 유도된 단리된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 및 이 면역글로불린을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 인간 항CCR2 항체 또는 항원 결합 부분의 제조 방법, 이 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하는 조성물, 항체 및 항원 결합 부분의 사용 방법 및 진단 및 치료를 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 분자를 코딩하는 핵산 분자를 이용하는 유전자 요법 방법을 제공한다.

Description

ＣＣＲ２에 대한 항체{ANTIBODIES TO CCR2}
관련 특허 및 특허 출원에 대한 상호 참조
본원은 2008년 8월 18일자에 출원된 미국 가출원 제61/189,357호의 이점을 주장하고, 이것은 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함된다.
공동 연구 계약
본 개시내용 및 본원의 특허청구범위는, 청구된 발명의 대상이 이루어진 때 또는 그 전에 발효되는, 화이자 인코포레이티드(Pfizer Inc.)와 압지닉스 인코포레이티드(Abgenix Inc.) 간의 공동 연구 계약의 범위 내에 이루어진 활동의 결과로서 이루어진 것이다.
염증 부위로의 백혈구 침윤은 케모카인으로 공지된 8~10 kD의 단백질에 의해 조절되는 것으로 생각된다. 상기 케모카인은, 이의 N 말단 시스테인 잔기의 간격에 따라, CC, CXC, XC 및 CX3C로 지칭되는 4개의 군으로 분류된다. 케모카인은 백혈구에, 예컨대 주화성 촉발, 탈과립, 지질 매개체 합성 및 인테그린 활성화와 같은 일련의 전염증성 효과를 매개할 수 있다(Oppenheim, J. J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller, M. D. and Krangel, M. S., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992)).
CCL2로도 공지된, 1종의 케모카인인, 단핵구 주화성 단백질 1(MCP-1: Monocyte Chemotactic Protein-1)은 단핵구, 림프구 및 수지상 세포에 작용하여, 주화성, 과립 방출, 호흡 폭발 및 사이토카인 방출을 유도한다. 연구에 의하면 MCP-1이 류마티스성 관절염, 죽상동맥경화증, 육아종성 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 비만/당뇨병, 신경병증성 통증, 암 및 다발성 경화증과 같은 질환의 병리학에 관여한다는 것을 제시한다(Koch, J. Clin. Invest. 90:772-79 (1992); Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol. 97:451-457 (1994); Schwartz et al., Am. J. Cardiol. 71(6):9B-14B (1993); Schimmer et al., J. Immunol. 160:1466-1471 (1998); Flory et al., Lab. Invest. 69:396-404 (1993); Gong et al., J. Exp. Med. 186:131-137 (1997); Salcedo et al. Blood 96(1) 34-40 (2000); Bracke et al., Inflammation & Allergy - Drug Targets 6: 75-79 (2007); Chung Current Drug Targets - Inflammation & Allergy 4: 619-625 (2005)).
CCR2는 MCP-1 및 CCL8(MCP-2), CCL7(MCP-3) 및 CCL13(MCP-4)을 비롯한 다른 케모카인에 결합하는 7개의 막관통 도메인 G-단백질이 결합된 주화성 수용체이다(Charo, I. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2752-2756 (1994); Myers, S. J., et al., J. Biol. Chem. 270:5786-5792 (1995); Gong et al., J. Biol Chem 272:11682-11685 (1997); Garcia-Zepeda et al., J. Immunol. 157:5613-5626 (1996)). CCR2는 CMKBR2 및 CKR2로도 공지되어 있다. C 말단이 다른 CCR2의 2종의 대안적으로 스플라이싱된 형태인 CCR2A 및 CCR2B가 클로닝된다(Wong et al (1997) J. Biol. Chem. 272:1038-1045). 신호 전달 연구에서, CCR2A 및 CCR2B 둘 다 효능제 의존 칼슘 동원 및 아데닐릴 시클라아제 억제를 매개한다. CCR2는 단핵구, T 세포 및 수지상 세포 상에 발현되고, 내피 세포, 단핵구 및 활막 섬유아세포에 의해 분비되는 케모카인과 상호작용한다.
CCR2의 생물학적 역할은 CCR2 넛아웃(knockout) 마우스의 사용을 통해 조사된다(Boring et al., J Clin Invest. 100(10):2552-61 (1997); Boring et al., Nature 394(6696):894-7 (1998); De Paolo et al., J Immunol. 171(7):3560-7 (2003); Gaupp et al., Am J Pathol. 162(1):139-50(2003)). CCR2-/- 마우스는 지연형 과민증 반응 및 Th1형 사이토카인의 생성 둘 다에 상당한 결함을 갖고, 일반적으로 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE: experimental autoimmune encephalomyelitis)에 덜 감수성이다. 면역 반응을 조절하는 것 이외에, CCR2는 HIV에 대한 보조 수용체이다(Connor et al., J. Exp. Med. 185:621-628 (1997); Frade et al., J Clin Invest. 100(3):497-502(1997)).
바람직하지 않은 면역 반응에서 MCP-1 및 이의 수용체 CCR2의 관여로 인해, CCR2 길항제는 유망한 치료제일 수 있다. 그러나, CCR2 길항제가 거의 기재되어 있지 않다(문헌[Ogilvie et al., Blood 97(7):1920-4 (2001)] 참조). 따라서, CCR2에 결합하고 이의 리간드에 의한 매개되는 CCR2 신호 전달을 차단하는 신규한 및 개선된 조성물이 필요하다.
본 발명은 CCR2, 특히 인간 CCR2에 특이적으로 결합하고, CCR2 길항제로서 작용할 수 있는, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 및 상기 항체 또는 이의 일부분을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 CCR2의 N 말단 부분 또는 제3 루프 이외의 에피토프에서 CCR2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 상기 항체는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합할 수 있다.
본 발명은 (ⅰ) 상기 항CCR2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄, 이의 가변 도메인 또는 이의 항원 결합 부분, 또는 이들을 코딩하는 핵산 분자; 및 (ⅱ) 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 치료 제제 또는 진단 제제와 같은 다른 성분을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 진단 및 치료 방법을 제공한다. 유사하게, 본 발명은 염증성 및 비염증성 질환을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 항CCR2 항체 및 이의 일부분을 제공한다.
본 발명은 핵산 분자를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 재조합으로 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생산하는 단리된 세포주를 제공한다.
도 1a, 도 1b 및 도 1c는 FACS 분석에 의해 평가되는 세포에 대한 CCR2 항체의 결합을 보여주는 그래프이다. 도 1a는 FACS 분석에 의해 평가되는 KLH 대조군 항체와 비교하여 인간 전체 혈액 단핵구에 대한 AF-488(ALEXA FLUOR® 488, Invitrogen) 접합된 CCR2 항체 4.40 A68G S230P의 결합을 보여주는 그래프이다. 도 1b는 FACS 분석에 의해 평가되는 인간 CCR2를 발현하는 300-19 세포에 대한 AF-488 접합된 CCR2 항체 4.40 A68G S230P의 결합을 보여주는 그래프이다. 도 1c는 항인간 PE에 의해 검출되는 CCR2 형질감염된 300-19 세포에 대한 여러 농도의 4.40 A68G S230P 항체의 결합을 보여주는 그래프이다.
도 2는 포화 결합 분석에서 CCR2 형질감염된 300-19 세포에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 용량 관련 결합을 보여주는 것이다.
도 3은 CCR1/CCR5 리간드 MIP-1a에 반응하지 않고 CCR2 리간드 MCP-1에 반응하여 THP-1 세포의 주화성을 억제하는 4.40 A68G S230P 항체의 능력을 보여주는 것이다.
도 4는 MCP-1에 반응하여 1차 인간 단핵구의 주화성을 억제하는 4.40 A68G S230P 항체의 능력을 보여주는 것이다.
도 5는 CCR1/CCR2 키메라의 발현에 대한 레트로바이러스 벡터의 플라스미드 지도를 보여주는 것이다.
도 6a 및 도 6b는 CCR2의 세포외 제1 및 제2 루프 및 CCR1의 N 말단 및 제3 루프만으로 이루어지는 키메라 수용체를 발현하는 300-19 세포에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 결합을 보여주는 것이다. 도 6c는 FACS 분석에 의해 측정되는 키메라 수용체 형질감염된 300-19 세포에 대한 4.40 A68G S230P의 포화 결합 분석을 보여주는 것이다.
도 7은 (A) 300-19 대조군 세포; (B) 전장 CCR2를 발현하는 형질감염된 300-19 세포; (C) 플래그 태그된(M1) MRRR 키메라[CCR1(R)의 수용체 발현 및 루프 구역을 보장하도록 플래그 태그된 CCR2(M)의 N 말단]를 발현하는 형질감염된 300-19 세포; (D) 플래그 태그된(M1) RRRM 키메라[CCR2(M)의 수용체 발현 및 제3 루프를 보장하도록 플래그 태그된 CCR1(R)의 N 말단 및 제1 및 제2 루프]를 발현하는 형질감염된 300-19 세포; 및 (E) 플래그 태그된(M1) RMMR 키메라[CCR2(M)의 수용체 발현 및 제1 및 제2 루프를 보장하도록 플래그 태그된 CCR1(R)의 N 말단 및 제3 루프]를 발현하는 형질감염된 300-19 세포에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 포화 결합 분석(3시간 포화 곡선)을 보여주는 것이다.
도 8은 캡쳐 ELISA에서 평가되는 CCR2의 루프 2 펩티드 구역 또는 루프 3 펩티드 구역 중 어느 하나에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 결합을 보여주는 것이다.
도 9는 AF-488 접합된 4.40.3 A68G S230P 항체(A 패널) 또는 항CCR5 항체(B 패널) 중 어느 하나에 의한 재조합 CCR5를 발현하는 300-19 세포의 FACS 면역염색을 나타내는 2개의 그래프를 보여주는 것이다.
도 10은 CCR2 형질감염된 300-19 세포에서 칼슘 동원에 의해 평가되는 4.40 A68G S230P 항체에 의한 MCP-1 유도 활성의 억제를 보여주는 것이다.
도 11은 4.40 A68G S230P 항체에 의한 CCR2 형질감염된 300-19 세포의 MCP-3 유도 주화성 억제를 보여주는 것이다.
도 12는 4.40 A68G S230P 항체에 의한 전체 혈액에서 MCP-1에 반응하여 인간 단핵구 액틴 중합의 억제를 보여주는 것이다.
도 13은 4.40 A68G S230P 항체에 의한 전체 혈액에서 MCP-1에 반응하여 암컷 사이노몰거스 원숭이에서 단핵구 액틴 중합의 억제를 보여주는 것이다.
도 14는 4.40 A68G S230P 항체에 의한 hHSC 세포주, LI90에서 콜라겐 1 mRNA 합성의 용량 의존 억제를 보여주는 것이다.
도 15는 4.40 A68G S230P 항체에 의한 10 nM MCP-1에서 인간 전체 혈액에서 pERK 인산화의 용량 의존 억제를 보여주는 것이다.
도 16은 단일 ConA 주사 24시간 후 4.40 A68G S230P 항체에 의한 인간 CCR2 넛-인(knock-in) 마우스에서 혈장 알라닌 트랜스아미나제(ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 활성의 감소를 보여주는 것이다.
도 17a 내지 도 17d는 각각의 4.22.3, 4.40.2, 4.39.3 및 4.9.2 항체 중쇄 및 경쇄 가변 구역(4.22.3, 4.40.2, 4.39.3 및 4.9.2 항체에 대해서만 미스매치가 관찰됨)과 비교하여 중쇄 및 경쇄 가변 구역의 생식선 아미노산 서열의 정렬을 보여주는 것이다. CDR을 밑줄쳤고 미스매치 공백(들)을 파운드 부호(#)로 나타냈다.
정의 및 일반적 기법
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 추가로, 상황에 의해 달리 필요하지 않은 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 본원에서 언급되는 모든 공보 및 다른 참조문헌은 참조문헌으로 그 전문이 포함된다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 단백질 및 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용되는 명명법 및 이것들의 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 흔히 사용되는 것이다. 상충하는 경우에, 정의를 비롯한 본 명세서의 내용이 규제한다.
당해 분야에 널리 공지된 종래 방법에 따라 및 달리 기재되지 않은 한 본 명세서 전체에서 인용되고 기재된 다양한 일반적이고, 보다 구체적인 참조문헌에 기재된 바대로 방법 및 기법을 일반적으로 수행한다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992); and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조하고, 이들 모두 본원에 참조문헌으로 포함된다. 당해 분야에서 흔히 수행되거나 본원에 기재된 바대로, 제조업자의 설명서에 따라 효소 반응 및 정제 기법을 수행한다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 명명법 및 이것들의 실험실 절차 및 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 흔히 사용되는 것이다. 화학 합성, 화학 분석, 약학 제제, 제형 및 전달, 및 환자 치료에 대해 표준 기법을 사용한다.
다음의 용어는, 달리 기재되지 않은 한, 다음의 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:
"폴리펩티드"란 용어는 천연 또는 인공 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩티드 유사체를 포함한다. 폴리펩티드는 단량체 또는 중합체일 수 있다.
"단리된 단백질", "단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 항체"란 용어는 이의 기원 또는 유도원에 의해 (1) 이의 본래 상태에서 수반하는 자연적으로 관련된 성분과 관련되지 않거나, (2) 동일한 종 유래의 다른 단백질이 제거되거나, (3) 상이한 종 유래의 세포에 의해 발현되거나, (4) 자연에서 존재하지 않는 단백질, 폴리펩티드 또는 항체이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나 자연적으로 기원하는 세포와 다른 세포 시스템에서 합성되는 폴리펩티드는 이의 자연적으로 관련된 성분으로부터 "단리"된다. 단백질에 또한 당해 분야에 널리 공지된 단백질 정제 기법을 이용하여 단리에 의해 자연적으로 관련된 성분이 실질적으로 제거될 수 있다.
단리된 항체의 예로는 CCR2 또는 이의 일부분을 이용하여 친화도 정제된 항CCR2 항체, 하이브리도마 또는 다른 세포주에 의해 시험관내 합성되는 항CCR2 항체 및 형질전환 마우스로부터 유도되는 인간 항CCR2 항체를 들 수 있다.
단백질 또는 폴리펩티드는, 샘플의 적어도 약 60% 내지 75%가 폴리펩티드의 단일 종을 나타낼 때, "실질적으로 순수하거나", "실질적으로 동종성이거나", "실질적으로 정제된다". 폴리펩티드 또는 단백질은 단량체 또는 다량체일 수 있다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 단백질은 통상적으로 단백질 샘플의 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% W/W, 보다 통상적으로 약 95%를 포함하고, 99% 이상 순수할 수 있다. 당해 분야에 널리 공지된 수많은 수단에 의해, 예컨대 단백질 샘플의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 이후 당해 분야에 널리 공지된 염색제에 의한 겔 염색시 단일 폴리펩티드 밴드의 가시화에 의해 단백질 순도 또는 동종성을 나타낼 수 있다. 특정한 목적을 위해, HPLC를 사용하여 또는 정제 분야에 널리 공지된 다른 수단에 의해 더 높은 해상도가 제공될 수 있다.
본원에서 사용되는 "항체 유사체"란 용어는 아미노산 서열의 일부분과 실질적인 동일성을 갖고 다음의 특성 중 하나 이상을 갖는 분절을 포함하는 항체를 의미한다: (1) 적합한 결합 조건 하에 CCR2에 대한 특이적 결합, (2) CCR2의 하나 이상의 생물학적 활성을 억제하는 능력. 통상적으로, 항체 유사체는 본래의 서열에 대하여 보존적 아미노산 치환(또는 삽입 또는 결실)을 포함한다. 유사체는 통상적으로 적어도 20개 또는 25개의 아미노산 길이, 적어도 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 150개 또는 200개의 아미노산 길이 또는 그 이상이고, 대개 항체의 전장 중쇄 또는 경쇄만큼 길 수 있다. 몇몇 경우는 생식선 아미노산 서열로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 치환을 갖는 항체 유사체를 포함한다.
몇몇 경우에, 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 대한 아미노산 치환은 (1) 단백질 가수분해에 대한 감수성을 줄이고, (2) 산화에 대한 감수성을 줄이고, (3) 단백질 착체 형성에 대한 결합 친화도를 변경하고, (4) 글리코실화 부위를 부가 또는 제거하고, (5) 이 유사체의 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여 또는 변경하지만, 여전히 CCR2에 대한 특이적 결합을 보유하는 것이다. 유사체는 통상적으로 존재하는 펩티드 서열 이외의 서열의 다양한 무테인을 포함할 수 있다. 분자간 접촉 형성 도메인(들) 밖의 폴리펩티드의 일부분에서 통상적으로 존재하는 서열에서, 예를 들면 단일 또는 다수의 아미노산 치환, 예컨대 보존적 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변경하지 않아야 하고; 예를 들면, 대체 아미노산은 모 서열에 나타나는 면역글로불린 결합 도메인을 구성하는 역평행 β 시트를 변경해서는 안 되거나, 모 서열을 규명하는 다른 유형의 2차 구조를 방해해서는 안 된다. 일반적으로, 글리신 및 프롤린을 역평행 β 시트에서 사용해서는 안 된다. 분야에서 인정된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991); Thornton et al., Nature 354:105 (1991), 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 기재되어 있다.
"항체"가 본원에서 언급될 때, 이것은 일반적으로 이의 항원 결합 부분도 사용할 수 있다는 것을 의미한다. 항원 결합 부분은 특이적 결합에 대해 비손상 항체와 경쟁한다. 일반적으로, 문헌[Fundamental Innunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., second ed. Raven Press, N.Y. (1989)](모든 목적을 위해 이의 전문이 참조문헌으로 포함됨)을 참조한다. 항원 결합 부분을 재조합 DNA 기법에 의해 또는 비손상 항체의 효소 또는 화학 분해에 의해 제조할 수 있다. 몇몇 경우에, 항원 결합 부분으로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 구역(CDR) 단편, 단일쇄 항체(예를 들면, scFv), 키메라 항체, 2항체 및 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩티드를 들 수 있다.
N 말단으로부터 C 말단으로, 항체의 성숙 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 구역을 포함한다. 본원에서의 각각의 도메인에 대한 아미노산의 정렬은 문헌[Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)); Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.
본원에서 사용되는, 숫자에 의해 나타낸 항체는 동일한 숫자의 하이브리도마로부터 얻은 단일클론 항체와 동일하다. 예를 들면, 단일클론 항체 4.40은 하이브리도마 4.40 또는 이의 서브클론으로부터 얻은 것과 동일한 항체이다. 순차적인 서브클론을 예를 들면 4.40.1, 4.40.2 및 4.40.3이라 지칭하고, 실질적으로 동일한 서열 및 기능을 갖는다.
본원에서 사용되는 Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 항체 단편을 의미하고; Fv 단편은 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지고; dAb 단편(Ward et al., Nature 341:544-546 (1989))은 VH 도메인으로 이루어진다.
몇몇 경우에, 항체는 VL 및 VH 도메인이 쌍을 이뤄 단일 폴리펩티드 쇄로서 제조되게 하는 합성 링커를 통해 1가 분자를 형성하는 단일쇄 항체(예를 들면, scFv)이다(예를 들면, 문헌[Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988)] 참조). 몇몇 경우에, 항체는 2항체, 즉 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되지만, 동일한 쇄 상에 2개의 도메인 사이에 짝을 이루게 하기에 너무 짧은 링커를 사용하여, 도메인이 또 다른 쇄의 상보성 도메인과 짝을 이루도록 하고 2개의 항원 결합 부위를 생성하는 2가 항체이다.(예를 들면, 문헌[Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993); Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994)] 참조). 몇몇 경우에, 본원에서의 항체 유래의 하나 이상의 CDR은 공유로 또는 비공유로 분자에 혼입되어 이것을 CCR2에 특이적으로 결합하는 면역접합체로 만들 수 있다. 이런 경우에, CDR(들)은 더 큰 폴리펩티드 쇄의 일부분으로서 혼입되거나, 또 다른 폴리펩티드 쇄로 공유 연결되거나, 비공유로 혼입될 수 있다. 하나 이상의 결합 부위를 갖는 경우에, 결합 부위는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본원에서 사용되는 "인간 항체"란 용어는 가변 및 불변 도메인 서열이 인간 서열인 임의의 항체를 의미한다. 상기 용어는 인간 유전자로부터 유도된 서열을 갖지만, 예를 들면 가능한 면역원성을 감소시키고, 친화도를 증가시키고, 원치않는 폴딩을 야기할 수 있는 시스테인을 제거하기 위해 변경되는 항체를 포함한다. 상기 용어는, 인간 세포에 특징적이지 않은 글리코실화를 부여할 수 있는, 비인간 세포에서 재조합으로 제조되는 항체를 포함한다. 이 항체는 본원에 기재된 바대로 다양한 방식으로 제조될 수 있다.
본원에서 사용되는 "키메라 항체"란 용어는 2개 이상의 상이한 항체 유래의 구역을 포함하는 항체를 의미한다. 일 경우에, 키메라 항체의 하나 이상의 CDR은 인간 항CCR2 항체로부터 유도된다. 또 다른 경우에, CDR 모두는 인간 항CCR2 항체로부터 유도된다. 또 다른 경우에, 하나 이상의 인간 항CCR2 항체 유래의 CDR은 키메라 항체에서 합해진다. 예를 들면, 키메라 항체는 제1 인간 항CCR2 항체의 경쇄 유래의 CDR1, 제2 인간 항CCR2 항체의 경쇄 유래의 CDR2 및 제3 인간 항CCR2 항체의 경쇄 유래의 CDR3을 포함할 수 있고, 중쇄 유래의 CDR은 하나 이상의 다른 항CCR2 항체로부터 유도될 수 있다. 추가로, 프레임워크(framework) 구역은 하나 이상의 CDR이 하나 이상의 상이한 인간 항체로부터 취해지는 항CCR2 항체 중 하나로부터 유도될 수 있다.
몇몇 경우에, 키메라 항체는 인간화 항CCR2 항체이다. 인간화 항CCR2 항체는 하나 이상의 프레임워크 구역의 아미노산 서열 및/또는 하나 이상의 인간 항CCR2 항체의 불변 구역의 적어도 일부분 및 비인간 항CCR2 항체로부터 유도된 CDR 유래의 아미노산 서열을 포함한다.
이 명세서의 교시내용에 따라 당업자가 항체 또는 면역글로불린 분자의 단편 또는 유사체를 용이하게 제조할 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노산 및 카복시 말단은 기능성 도메인의 경계 근처에서 발생한다.
본원에서 사용되는 "표면 플라즈몬 공명"이란 용어는, 예를 들면 BIACORE™ 시스템(Pharmacia Biosensor AB(스웨덴 웁살라 및 미국 뉴저지주 피스카타웨이))을 사용하여 바이오센서 매트릭스 내에서 단백질 농도 변화 검출에 의한 실시간 생특이적 상호작용의 분석이 가능한 광학 현상을 의미한다. 추가 설명을 위해, 문헌[Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995); Johnsson B. et al., Anal. Biochem. 198:268-277 (1991)]을 참조한다.
"KD"란 용어는 특정한 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미한다. 항체는 해리 상수가 1 mM 이하, 100 nM 이하, 또는 10　nM 이하일 때 항원에 특이적으로 결합하는 것이라 일컬어진다. 몇몇 경우에, KD는 1 pM 내지 500 pM이다. 다른 경우에, KD는 500 pM 내지 1 μM, 1 μM 내지 100 nM, 또는 100 mM 내지 10 nM이다.
"에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있거나, 그렇지 않으면 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 이루어지고, 일반적으로 특정한 3차원 구조 특성 및 특정한 전하 특성을 갖는다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태적(conformational)"일 수 있다. 선형 에피토프에서, 단백질과 상호작용 분자(예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용 지점은 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형으로 발생한다. 입체형태적 에피토프에서, 상호작용 지점은 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기에 걸쳐 발생한다. 일단 항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예를 들면 본 명세서에 기재된 기법을 이용하여 그 에피토프에 항체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 발견 과정 동안, 항체 생산 및 규명은 바람직한 에피토프에 대한 정보를 설명할 수 있다. 이 정보로부터, 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 성취하기 위한 접근법은 CCR2에 대한 결합에 대해 서로 경쟁 또는 상호 경쟁하는 항체를 확인하기 위해 경쟁 및 상호 경쟁 연구를 수행하는 것이고, 예를 들면 항체는 항원에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 이의 상호 경쟁에 기초한 "결합" 항체에 대한 고속 탐색 과정은 국제 특허 출원 제WO03/48731호에 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 20개의 종래 아미노산 및 이의 약어는 종래 사용법을 따른다. 문헌[Immunology - A Synthesis (second Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))), 본원에 참조문헌으로 포함됨]을 참조한다.
본원에서 언급되는 "폴리뉴클레오티드"란 용어는 적어도 길이 10개의 염기의 뉴클레오티드의 중합체 형태로, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 뉴클레오티드의 어느 하나의 형태의 변형된 형태를 의미한다. 이 용어는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다.
본원에서 사용되는 "단리된 폴리뉴클레오티드"란 용어는 이의 기원에 의해 "단리된 폴리뉴클레오티드"가 (1) "단리된 폴리뉴클레오티드"가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 관련되지 않거나, (2) 이것이 자연에서 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되거나, (3) 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발견되지 않는, 게놈, cDNA 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 몇몇 조합을 의미한다.
본원에서 사용되는 "천연 뉴클레오티드"란 용어는 데옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 "변형된 뉴클레오티드"란 용어는 변형된 또는 치환된 당 군 등을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 언급되는 "올리고뉴클레오티드 연결"이란 용어는 올리고뉴클레오티드 연결, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트, 포스포로아미데이트 등을 포함한다. 예를 들면, 문헌[LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp.　87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); 미국 특허 제5,151,510호; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), 이의 개시내용은 본원에 참조문헌으로 포함됨]를 참조한다. 올리고뉴클레오티드는 원하는 경우 검출을 위해 라벨을 포함할 수 있다.
"작동적으로 연결된" 서열은 관심 있는 유전자에 인접한 발현 조절 서열 및 관심 있는 조절 유전자에 횡단하여 또는 근처에서 작용하는 발현 조절 서열 둘 다를 포함한다. 본원에서 사용되는 "발현 조절 서열"이란 용어는 발현 및 결찰된 서열을 코딩하는 과정을 수행하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 강화자 서열; 효과적인 RNA 처리 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질막 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증강시키는 서열(즉, Kozak 공통 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 및, 원하는 경우, 단백질 분비를 증강시키는 서열을 포함한다. 이 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르다. 원핵생물에서 이 조절 서열은 일반적으로 프로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함하고, 진핵생물에서 이 조절 서열은 일반적으로 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. "조절 서열"이란 용어는, 최소한도에서, 발현 및 처리에 존재가 필수적인 모든 성분을 포함하는 것으로 의도되고, 또한 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들면 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 "벡터"란 용어는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 몇몇 경우에, 벡터는 플라스미드, 즉 추가의 DNA 분절이 결찰될 수 있는 DNA의 원형 이중 가닥 조각이다. 몇몇 경우에, 벡터는 추가의 DNA 분절이 바이러스 게놈으로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 몇몇 경우에, 벡터는 이것이 도입되는 숙주 세포에서 자율 증식할 수 있다(예를 들면, 복제의 박테리아 기원을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 경우에, 벡터(예를 들면, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포로의 도입시 숙주 세포 게놈으로 통합될 수 있고, 따라서 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 몇몇 벡터는 이것이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 칭한다.
본원에서 사용되는 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 재조합 발현 벡터가 도입되는 세포를 의미한다. "재조합 숙주 세포" 및 "숙주 세포"는 특정한 피험체 세포뿐만 아니라, 이 세포의 자손을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 몇몇 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향 중 어느 하나로 인해 후손 세대에서 발생하므로, 이 자손은, 사실, 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 "숙주 세포"란 용어의 범위 내에 여전히 포함된다.
뉴클레오티드 서열과 관련하여 "서열 동일성(%)"이란 용어는 최대 관련성에 대해 정렬될 때 동일한 2개의 서열의 잔기를 의미한다. 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하기 위해 이용할 수 있는 당해 분야에 공지된 수많은 상이한 알고리즘이 존재한다. Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group(GCG)(미국 위스콘신주 매디슨)에서의 프로그램인 FASTA, Gap 또는 Bestfit를 이용하여, 예를 들면 폴리뉴클레오티드 서열을 비교할 수 있다. 예를 들면, 프로그램 FASTA2 및 FASTA3을 포함하는 FASTA는 질의 서열과 검색 서열 사이의 최고의 중첩 구역의 정렬 및 서열 동일성(%)을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); 본원에 참조문헌으로 포함됨). 달리 기재되지 않은 한, 특정한 프로그램 또는 알고리즘을 위한 디폴트 매개변수를 이용한다. 이의 디폴트 매개변수(6의 글자 크기 및 매트릭스를 분류하기 위한 NOPAM 인자)와 함께 FASTA를 이용하여 또는 GCG Version 6.1[본원에 참조문헌으로 포함됨]에서 제공되는 이의 디폴트 매개변수와 함께 Gap을 이용하여, 예를 들면 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성(%)을 결정할 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 대한 언급은 달리 기재되지 않은 한 이의 보체를 포함한다. 따라서, 특정한 서열을 갖는 핵산에 대한 언급은 이의 상보성 서열과 함께 이의 상보성 가닥을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 용어 "서열 동일성(%)" 및 "서열 상동성(%)"는 상호교환되어 사용된다.
용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적인 서열 유사성"은, 핵산 또는 이의 단편을 언급할 때, 또 다른 핵산(또는 이의 상보성 가닥)과 적절한 뉴클레오티드 삽입 또는 결실로 최적으로 정렬될 때, 상기 기재된 FASTA, BLAST 또는 Gap와 같은 서열 동일성의 임의의 널리 공지된 알고리즘에 의해 측정할 때, 뉴클레오티드 염기의 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 존재한다는 것을 의미한다,.
폴리펩티드에 적용될 때, "실질적인 동일성"이란 용어는 2개의 펩티드 서열이 프로그램에 의해 제공되는 디폴트 갭 중량을 이용하여, 예컨대 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해 최적으로 정렬될 때, 적어도 70%, 75% 또는 80%의 서열 동일성, 적어도 90% 또는 95%의 서열 동일성, 적어도 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유한다는 것을 의미한다. 몇몇 경우에, 동일하지 않은 잔기 부분은 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 기를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능 특성을 실질적으로 변경시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 서로 보존적 치환에 의해 상이한 경우, 치환의 보존적 성질에 대해 보정하기 위해 서열 동일성(%)을 상향 조정할 수 있다. 이러한 조정을 만드는 수단은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994)]을 참조한다. 유사한 화학 특성을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산의 기의 예로 (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신; (2) 지방족-하이드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르트산 및 글루탐산; 및 (7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌을 포함한다. 보존적 아미노산 치환 기는 발린-류신-이소류신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린, 글루타메이트-아스파르테이트 및 아스파라긴-글루타민이다.
대안적으로, 보존적 대체는 문헌[Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 개시된 PAM250 대수값 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다. "적당히 보존적인" 대체는 PAM250 대수값 매트릭스에서 음이 아닌 값을 갖는 임의의 변화이다.
서열 분석 소프트웨어를 이용하여 폴리펩티드에 대한 서열 동일성을 통상적으로 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 비롯한 다양한 치환, 결실 및 다른 변형으로 배정되는 유사성의 측정을 이용하여 서열을 일치시킨다. 예를 들면, GCG는 밀접하게 연관된 폴리펩티드, 예컨대 유기체의 상이한 종 기원의 상동성 폴리펩티드 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 무테인 사이의 서열 상동성 또는 서열 동일성을 측정하기 위해 프로그램에 의해 구체화된 디폴트 매개변수와 함께 이용할 수 있는 프로그램, 예컨대 "Gap" 및 "Bestfit"를 들 수 있다. 예를 들면, GCG Version 6.1(미국 위스콘신주 위스콘신 대학)을 참조한다. 디폴트 또는 추천되는 매개변수를 이용하는 FASTA를 이용하여 폴리펩티드 서열을 또한 비교할 수 있고, GCG Version 6.1을 참조한다. FASTA(예를 들면, FASTA2 및 FASTA3)는 질의 서열과 검색 서열 사이의 최고의 중첩 구역의 정렬 및 서열 동일성(%)을 제공한다(Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). 서열을 상이한 유기체 기원의 수많은 서열을 포함하는 데이타베이스와 비교할 때 또 다른 바람직한 알고리즘은 프로그램에 의해 제공되는 디폴트 매개변수를 이용하는 컴퓨터 프로그램 BLAST, 특히 blastp 또는 tblastn이다. 예를 들면, 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)]을 참조한다.
CCR2는 7개의 막관통 도메인 단백질이고, 따라서 이것은 6개의 루프를 갖는다. 세포외 N 말단으로부터 셀 때 루프 1, 루프 3 및 루프 5는 세포내 루프인 반면, 루프 2, 루프 4 및 루프 6은 세포외 루프이다. CCR2의 제1, 제2 및 제3 세포외 루프는 각각 루프 2, 루프 4 및 루프 6을 의미한다.
이 명세서 및 특허청구범위에 걸쳐, "포함한다"란 어구 또는 변형어, 예컨대 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수군의 포함을 암시하는 것으로 해석되지만, 임의의 다른 정수 또는 정수군의 배제를 암시하는 것으로는 해석되지 않는다.
인간 항CCR2 항체 및 이의 규명
몇몇 경우에, 본 발명은 인간 항CCR2 항체를 제공한다. 몇몇 경우에, 형질전환 동물이 인간 항체를 생산하도록 게놈이 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 비인간 형질전환 동물, 예를 들면 설치류를 면역화하여 인간 항CCR2 항체를 제조한다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체 및 항원 결합 부분은 (ⅰ) CCR2의 제1 또는 제2 세포외 루프 또는 둘 다에 결합하거나; (ⅱ) CCR2의 N 말단 끝 또는 제3 세포외 루프 또는 둘 다에 결합하지 않거나; (ⅲ) (ⅰ) 및 (ⅱ) 둘 다 하는 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또 다른 경우에, 본 발명은 서열 번호 128 또는 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합하는 인간 항CCR2 항체를 제공한다. 또 다른 경우에, 인간 항CCR2 항체는 서열 번호 128 또는 서열 번호 129와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체 및 항원 결합 부분은 CCR2의 제3 세포외 루프에 결합하는 항체 또는 항원 결합 부분을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
VH, VK, Vλ 유전자는 서열 상동성에 기초하여 패밀리로 분류된다. 2개의 VH, VK, Vλ 유전자는 80% 초과의 위치에서 동일한 뉴클레오티드 서열을 공유하는 경우 동일한 패밀리에 속한다. 항CCR2 항체는 인간 카파 경쇄(VK) 또는 인간 람다 경쇄(Vλ) 또는 이들로부터 유도되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 람다 경쇄를 포함하는 몇몇 경우에, 경쇄 가변 도메인(VL)은 인간 Vλ1, Vλ2, Vλ3, Vλ4, Vλ5, Vλ6, Vλ7, Vλ8, Vλ9 또는 Vλ10 패밀리 유전자(Williams S.C. et al. J. Mol. Bio. 264:220-232 (1996))를 이용한다.
카파 경쇄를 포함하는 몇몇 경우에, 경쇄 가변 도메인(VL)은 인간 VKⅠ, VKⅡ, VKⅢ, VKⅣ, VKⅤ 또는 VKⅥ 패밀리 유전자(Cox J. P. L., et al., Eur. J. Immunol 24:827-836 (1994)), 바람직하게는 VKⅠ, VKⅡ, VKⅣ 또는 VKⅥ 패밀리 유전자, 바람직하게는 VKⅠ 또는 VKⅥ 패밀리 유전자를 이용한다. 몇몇 경우에, 경쇄 생식선 서열은 A1, A10, A11, A14, A17, A18, A19, A2, A20, A23, A26, A27, A3, A30, A5, A7, B2, B3, L1, L10, L11, L12, L14, L15, L16, L18, L19, L2, L20, L22, L23, L24, L25, L4/18a, L5, L6, L8, L9, O1, O11, O12, O14, O18, O2, O4 및 O8을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 인간 VK 서열로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 이 경쇄 인간 생식선 유전자는 V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-2, V1-20, V1-22, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V2-1, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, V2-6, V2-7, V2-8, V3-2, V3-3, V3-4, V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, V5-1, V5-2, V5-4 및 V5-6으로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 경쇄는 인간 VKⅠ O12, VKⅡ A1, VKⅣ B3 또는 VKⅥ A26 생식선 유전자를 이용한다.
항CCR2 항체는 인간 VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6 또는 VH7 패밀리 유전자를 이용하는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함할 수 있다. 특정한 예에서, 이 중쇄 인간 생식선 유전자는 VH1-18, VH1-2, VH1-24, VH1-3, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH1-8, VH2-26, VH2-5, VH2-70, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-7, VH3-72, VH3-73, VH3-74, VH3-9, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-4, VH4-59, VH4-61, VH5-51, VH6-1 및 VH7-81로부터 선택된다. 몇몇 경우에, 중쇄는 인간 VHⅠ 1-46 또는 VH Ⅲ 3-30 유전자를 이용한다.
특정한 경우에, 경쇄 가변 구역 및/또는 중쇄 가변 구역은 프레임워크 구역 또는 프레임워크 구역의 적어도 일부분을 포함한다(예를 들면, 2개 또는 3개의 부분구역, 예컨대 FR2 및 FR3을 포함한다). 몇몇 경우에, 적어도 FRL1, FRL2, FRL3 또는 FRL4는 완전 인간이다. 다른 예에서, 적어도 FRH1, FRH2, FRH3 또는 FRH4는 완전 인간이다. 몇몇 경우에, 적어도 FRL1, FRL2, FRL3 또는 FRL4는 생식선 서열(예를 들면, 인간 생식선)이거나, (본원에 기재된 기지의 인간 Ig 서열의 공급원에서 용이하게 구입 가능한) 특정한 프레임워크에 대해 인간 공통 서열을 포함한다. 다른 예에서, 적어도 FRH1, FRH2, FRH3 또는 FRH4는 생식선 서열(예를 들면, 인간 생식선)이거나, 특정한 프레임워크에 대해 인간 공통 서열을 포함한다.
몇몇 경우에, CCR2 항체의 VL은 인간 유전자의 생식선 아미노산 서열에 비해 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체의 VL은 생식선 아미노산 서열에 비해 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 경우에, 하나 이상의 이 치환, 결실 및/또는 삽입은 경쇄의 CDR에서 일어난다. 몇몇 경우에, 생식선에 대한 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 항체 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P의 임의의 하나 이상의 VL에서 생식선에 대한 치환, 결실 및/또는 삽입으로서 하나 이상의 동일한 위치에서 일어난다. 예를 들면, 항CCR2 항체의 VL은 항체 4.40의 VL에서 발견되는 생식선과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 아미노산 변경은 하나 이상의 동일한 위치에서 일어나지만, 생식선에 대한 상이한 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 몇몇 경우에, 치환은 기준 항체에서 아미노산에 대한 이 위치(들)에서의 보존적 아미노산 치환을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 이 항체 중 하나에서 특정 위치가 생식선에 대해 치환되고 글루타메이트인 경우, 그 위치에서 아스파르테이트를 치환할 수 있다. 유사하게, 생식선과 비교하여 아미노산 치환이 세린인 경우, 그 위치에서 세린에 대해 트레오닌을 보존적으로 치환될 수 있다.
몇몇 경우에, 인간 항CCR2 항체의 경쇄는 항체 4.40(서열 번호 101); 4.9(서열 번호 29); 4.22(서열 번호 65); 4.39(서열 번호 194); 또는 4.40 A68G S230P(서열 번호 113)의 가변 도메인(VL) 아미노산 서열; 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, 경쇄는 각각 항체 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P의 경쇄의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3으로부터 독립적으로 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3, 또는 각각 4개 미만 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 CDR을 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체의 경쇄는 각각 단일클론 항체 4.40(서열 번호 100); 4.9(서열 번호 28); 4.22(서열 번호 64); 4.39(서열 번호 193); 또는 4.40 A68G S230P(서열 번호 112)의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 구역으로부터 독립적으로 선택되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함한다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체의 경쇄는 4.40(서열 번호 101); 4.9(서열 번호 29); 4.22(서열 번호 65); 4.39(서열 번호 194); 또는 4.40 A68G S230P(서열 번호 113)로부터 선택되는 항체의 VL 구역의 아미노산 서열을 포함하는 항체의 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3; 또는 각각 4개 미만 또는 3개 미만의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 CDR을 포함한다. 서열 식별자를 표 8에서 몇몇 항체의 CDR에 대해 기재하였다.
중쇄와 관련하여, 몇몇 경우에, 가변 도메인(VH)은 인간 VH 3-30 또는 VH 1-46 유전자 서열을 이용한다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체의 VH 서열은 생식선 아미노산 서열에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입(부가)을 포함한다. 몇몇 경우에, 중쇄의 가변 도메인은 생식선 아미노산 서열로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개 또는 17개의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 몇몇 경우에, 치환은 생식선 아미노산 서열과 비교하여 비보존적 치환이다. 몇몇 경우에, 중쇄의 CDR에서 치환, 결실 및/또는 삽입이 발생한다. 몇몇 경우에, 항체 4.40, 4.22, 4.39 또는 4.9의 임의의 하나 이상의 VH에서 생식선으로부터의 돌연변이로서 하나 이상의 동일한 위치에서 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 발생한다. 다른 경우에, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입은 하나 이상의 동일한 위치에서 발생하지만, 기준 항체에서보다 상이한 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함한다. 몇몇 경우에, 항체는 서열 번호 202 또는 서열 번호 203의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함한다.
몇몇 경우에, 중쇄는 항체 4.40(서열 번호 83); 4.22(서열 번호 47); 4.9(서열 번호 11); 4.39(서열 번호 176)의 VH 아미노산 서열; 또는 1개, 2개, 3개, 4개, 6개, 8개 또는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 VH 아미노산 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, 중쇄는 CDR1의 시작부터 상기 항체 중 임의의 하나의 CDR3의 말단까지의 아미노산 서열을 포함한다.
몇몇 경우에, 중쇄는 항체 4.40, 4.22, 4.39 또는 4.9의 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 또는 각각 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하, 3개 이하의 보존적 아미노산 치환 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 CDR을 포함한다.
몇몇 경우에, 중쇄 CDR은 항체 4.40, 4.22, 4.39 또는 4.9의 CDR로부터 독립적으로 선택된다. 또 다른 경우에, 중쇄는 4.40(서열 번호 83); 4.22(서열 번호 47); 4.39(서열 번호 176) 또는 4.9(서열 번호 11)로부터 선택되는 2개 이상의 VH 구역으로부터 독립적으로 선택되는 CDR을 포함한다. 또 다른 경우에, 항체는 상기 개시된 경쇄 및 상기 개시된 중쇄를 포함한다. 추가의 경우에, 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR은 동일한 항체 기원이다.
이루어질 수 있는 아미노산 치환의 하나의 유형은 또 다른 잔기, 예컨대 제한함이 없이, 알라닌 또는 세린에 화학적으로 반응성일 수 있는 항체에서의 하나 이상의 시스테인을 변경하는 것이다. 일 경우에, 비변인 시스테인의 치환이 존재한다. 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 구역에서 또는 항체의 불변 도메인에서 치환이 이루어질 수 있다. 몇몇 경우에, 시스테인은 변인이다.
이루어질 수 있는 또 다른 유형의 아미노산 치환은 항체에서 임의의 잠재적 단백질 가수분해 부위를 변경하는 것이다. 이 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 구역에서 또는 항체의 불변 도메인에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질 가수분해 부위의 제거는 항체 제품에서의 임의의 이질성의 위험을 감소시키고, 따라서 이의 동종성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 유형의 아미노산 치환은 하나의 잔기 또는 잔기 둘 다를 변경하여 잠재적 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 몇몇 경우에, 아미노산 치환을 이용하여 글리코실화 부위를 삽입 또는 제거한다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체의 중쇄의 C 말단 리신을 단백질 가수분해로 또는 유전적으로 제거할 수 있다. 다양한 경우에, 항CCR2 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로 신호 서열을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 하이브리도마에 의해 항체를 제조한다.
표 1은 전장을 코딩하는 핵산의 서열 식별자(서열 번호) 및 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 함유 부분 및 예시적인 항체의 상응하는 유추 아미노산 서열을 기재한 것이다.
[표 1]
Figure pct00001
또한, 본 발명은 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 상기 기재된 인간 항CCR2 항체의 몇몇의 중쇄 및/또는 경쇄 변이체를 제공한다. 변이체를 지정하기 위해, 제1 철자는 자연적으로 존재하는 항체 쇄의 아미노산에 대한 1단어 기호이고, 숫자는 아미노산의 위치(여기서, 1번 위치는 N 말단 아미노산임)를 나타내고, 제2 철자는 변이체 아미노산에 대한 1단어 기호이다. 몇몇 경우에, 본 발명은 중쇄 변이체를 제공한다. 하나의 이러한 중쇄 변이체는 반단량체의 형성을 줄이는 돌연변이를 안정화시키는 힌지 구역이다(Angal, S. et al. Molecular Immunology 30:105-108 (1993)). 4.40 항체 중쇄 변이체의 돌연변이를 안정화시키는 하나의 이러한 힌지는 서열 번호 82의 230번 위치에서 세린에 대해 프롤린 치환을 갖는다. S230P 변이체를 코딩하는 DNA 서열은 서열 번호 115의 688번 위치에서 시작하는 CCA 코돈을 갖는다.
또한, 본 발명은 단일클론 항체 4.40의 변이체 경쇄를 제공한다. A68G는 68번 잔기가 글리신 잔기인 서열 번호 113으로 표시되는 4.40 경쇄 변이체이다. DNA 서열에서, A68G 4.40 변이체는 252번 위치에서 시작하는 코돈이 GGG인 서열 번호 109에 의해 코딩된다.
다른 경우에, 아미노산 변이체의 조합을 포함하는 항체를 제조할 수 있다. 변이체의 조합의 예는 4.40 항체와 관련하여 경쇄 치환 A68G 및 중쇄 치환 S230P를 포함하는 항CCR2 항체 4.40 A68G S230P이다. 4.40의 변이체 중쇄 및 변이체 경쇄의 추가의 조합을 포함한다.
일 경우에, 항CCR2 항체는 4.40, 4.22, 4.39, 4.40 A68G S230P 또는 4.9이다. 훨씬 추가의 경우에, 상기 기재된 인간 항CCR2 항체 중 어느 하나의 가변 도메인 아미노산 서열에 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과 또는 99% 초과의 서열 동일성을 갖는 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 항체를 포함한다.
항CCR2 항체의 클래스 및 서브클래스
항CCR2 항체의 클래스 및 서브클래스를 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다. 일반적으로, 항체의 특정한 클래스 및 서브클래스에 특이적인 항체를 사용하여 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정할 수 있다. 이 항체는 상업적으로 구입 가능하다. ELISA 또는 웨스턴 블롯 및 다른 기법에 의해 클래스 및 서브클래스를 결정할 수 있다. 대안적으로, 아미노산 서열을 면역글로불린의 다양한 클래스의 기지의 아미노산 서열과 비교하여 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 도메인의 전부 또는 일부를 서열분석하고, 항체의 클래스 및 서브클래스를 결정함으로써 클래스 및 서브클래스를 결정할 수 있다.
몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 단일클론 항체이다. 항CCR2 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD 분자일 수 있다. 일 경우에, 항CCR2 항체는, 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스에 속하는 IgG이다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 IgG4이다. 훨씬 또 다른 경우에, 항체는 IgG4 동종동질이형체이다(Ellison J. and Hood L., PNAS 79:1984-1988 (1982); & Brusco A. et al., Eur J. Immunogenticsl 25:349-355 (1998)).
CCR2에 대한 항CCR2 항체의 결합 친화도
몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 높은 친화도로 CCR2에 결합한다.
몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 CCR2의 제1 세포외 루프에, CCR2의 제2 세포외 루프에 또는 제1 및 제2 세포외 루프 둘 다에 의해 형성되는 에피토프에 높은 친화도로 결합한다.
관련 경우에, 항CCR2 항체는 서열 번호 128 또는 서열 번호 129에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드에 결합한다.
몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 CCR2의 제3 세포외 루프 또는 CCR2의 N 말단 도메인에 결합하지 않는다.
또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 서열 번호 127 또는 서열 번호 130에 기재된 서열로 이루어지는 펩티드에 결합하지 않는다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 약 2×10-7 M 이하, 약 2×10-8 M 이하, 약 2×10-9 M 이하, 약 1×10-9 M 이하, 약 9×10-10 M 이하, 약 8×10-10 M 이하, 약 7×10-10 M 이하, 약 6×10-10 M 이하, 5×10-10 M 이하, 약 4×10-10 M 이하, 약 3×10-10 M 이하 또는 약 2×10-10 M 이하의 KD로 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합한다. 몇몇 경우에, 항체는 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P로부터 선택되는 항체로서 실질적으로 동일한 KD로 CCR2, 또는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합한다. 훨씬 또 다른 경우에, 항체는 서열 번호 83, 서열 번호 11, 서열 번호 176 또는 서열 번호 47에서 발견되는 VH 구역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체로서 실질적으로 동일한 KD로 CCR2, 또는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합한다. 훨씬 또 다른 경우에, 항체는 서열 번호 101, 서열 번호 113, 서열 번호 29, 서열 번호 194 또는 서열 번호 65에서 발견되는 VL 구역의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인의 CDR을 포함하거나, 서열 번호 83, 서열 번호 11, 서열 번호 176 또는 서열 번호 47에서 발견되는 VH 구역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인의 CDR을 포함하는 항체로서 실질적으로 동일한 KD로 CCR2에 결합한다.
몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 해리 속도 상수(koff)가 낮을 수 있다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 1.0×10-3 s-1 이하, 5.0×10-4 s-1 이하 또는 2×10-4 s-1 이하의 koff로 CCR2에, 보다 바람직하게는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합한다. 몇몇 경우에, koff는 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 및 4.40 A68G S230P로부터 선택되는 항체를 비롯하여 본원에 기재된 항체와 실질적으로 동일할 수 있다. 몇몇 경우에, 항체는 4.40, 4.9 및 4.40 A68G S230P로부터 선택되는 항체로부터 중쇄의 CDR 또는 경쇄의 CDR을 포함하는 항체로서 실질적으로 동일한 koff로 CCR2, 또는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합할 수 있다. 몇몇 경우에, 항체는 (ⅰ) 서열 번호 83 또는 서열 번호 11에서 발견되는 VH 구역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인, (ⅱ) 서열 번호 101, 서열 번호 113, 서열 번호 29에서 발견되는 VL 구역의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인, 또는 (ⅲ) (ⅰ) 및 (ⅱ) 둘 다를 포함하는 항체로서 실질적으로 동일한 koff로 CCR2, 또는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합할 수 있다. 훨씬 또 다른 경우에, 항체는 서열 번호 101, 서열 번호 113 또는 서열 번호 29에서 발견되는 VL 구역의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인의 CDR; 및 서열 번호 83 또는 서열 번호 11에서 발견되는 VH 구역의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인의 CDR을 포함하는 항체로서 실질적으로 동일한 koff로 CCR2, 또는 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합할 수 있다.
당해 분야에서 공지된 방법에 의해 CCR2에 대한 항CCR2 항체의 결합 친화도 및 해리 속도를 결정할 수 있다. ELISA, RIA, 유세포 측정법, 표면 플라즈몬 공명, 예컨대 BIACORE™에 의해 결합 친화도를 측정할 수 있다. 표면 플라즈몬 공명에 의해 해리 속도를 측정할 수 있다. 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 항체가 항CCR2 항체와 실질적으로 동일한 KD를 갖는지를 결정할 수 있다. 실시예 5는 항CCR2 단일클론 항체의 결정 친화도 상수에 대한 방법을 예시한 것이다.
항CCR2 항체에 의해 인식되는 CCR2 에피토프의 동정
본 발명은 CCR2에 결합하고 (a) 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 및 4.40 A68G S230P로부터 선택되는 항체; (b) 서열 번호 83, 서열 번호 11, 서열 번호 176 또는 서열 번호 47에서 발견되는 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, (c) 서열 번호 101, 서열 번호 113, 서열 번호 29, 서열 번호 194 또는 서열 번호 65에서 발견되는 가변 도메인의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체, 또는 (d) (b)에 정의된 중쇄 가변 도메인 및 (c)에 정의된 경쇄 가변 도메인 둘 다를 포함하는 항체로서 동일한 에피토프와 경쟁 또는 상호 경쟁하고/하거나 이에 결합할 수 있는 인간 항CCR2 단일클론 항체를 제공한다. 2개의 항체가 CCR2에 대한 결합에 대해 서로 호혜적으로 경쟁하는 경우, 이것은 상호 경쟁한다고 일컬어진다.
항체가 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 본원에서 제공되는 항CCR2 항체와의 결합에 대해 동일한 에피토프에 결합하거나, 경쟁하거나, 상호 경쟁하는지를 결정할 수 있다. 일 경우에, 본원에서 제공되는 항CCR2 항체가 포화 조건 하에 CCR2에 결합하게 하고 이후 CCR2에 결합하는 시험 항체의 능력을 측정한다. 시험 항체가 항CCR2 항체가 제공되는 동시에 CCR2에 결합하는 경우, 시험 항체는 항CCR2 항체로서 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 시험 항체가 동시에 CCR2에 결합할 수 없는 경우, 시험 항체는 동일한 에피토프, 중첩 에피토프 또는 본원에서 제공되는 인간 항CCR2 항체에 의해 결합된 에피토프에 밀접히 근접한 에피토프에 결합한다. 시험 항체가 기준 항체와 상호 경쟁하는지를 결정하기 위해, 항체를 역전시켜, 즉 시험 항체가 CCR2에 결합하게 하고 이후 CCR2에 결합하는 본원에서 제공되는 항CCR2 항체의 능력을 측정하여 실험을 수행한다. ELISA, RIA, BIACORE™ 또는 유세포 측정법(FACS)을 이용하여 이 실험을 수행할 수 있다.
항CCR2 항체에 의한 CCR2 활성의 억제
몇몇 경우에, 본 발명은 CCR2 매개 신호 전달을 억제하는 항CCR2 항체를 제공한다. 다른 경우에, 본 발명은 CCR2을 통한 MCP-1, MCP-2, MCP-3 및/또는 MCP-4 매개 신호 전달을 억제하는 항CCR2 항체를 제공한다. 다른 경우에, 본 발명은 CCR2에 대한 MCP-1 MCP-2, MCP-3 및/또는 MCP-4의 결합을 억제하는 항CCR2 항체를 제공한다. 일 경우에, CCR2는 인간 CCR2이다. 몇몇 경우에, CCR2는 인간 CCR2A, CCR2B 또는 둘 다이다. 훨씬 또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 인간 항체이다.
리간드 결합 분석, 예컨대 ELISA, RIA 또는 관련 분석 및 세포 기반 분석, 예컨대 CCR2를 발현하는 세포의 주화성 분석에서 항CCR2 항체의 IC50을 측정할 수 있다. 다양한 경우에, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 ELISA 분석에 의해 측정될 때 5 ㎍/ml 이하, 1 ㎍/ml 이하, 0.5 ㎍/ml 이하 또는 0.20 ㎍/ml 이하의 IC50으로 MCP-1과 CCR2 사이의 리간드 결합을 억제한다.
또 다른 경우에, 본 발명은 MCP-1(CCL2), MCP-2, MCP-3 및/또는 MCP-4와 같은 CCR2 리간드의 존재 하에 CCR2의 활성화를 감소시키는 항CCR2 항체를 제공한다. 일 경우에, 항CCR2 항체는 CCR2 리간드 유도된 (ⅰ) G-단백질 활성화, (ⅱ) 아데닐레이트 시클라아제 활성화, (ⅲ) 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 활성화, (iv) 시토졸 칼슘 동원, (v) ERK 인산화, (vi) 주화성 또는 (vii) 액틴 중합을 억제할 수 있다. 항CCR2 항체는 방사선 표지된 GTP에 의해 표지된 세포에서 G-단백질의 GTP/GDP 비를 결정하여, GTPgS 통합을 측정하여, 칼슘 발색단을 이용한 시토졸 칼슘 유입을 측정하여 또는 세포에서 MAPK의 인산화 상태를 측정하여 MCP-1의 존재 하에 CCR2의 활성화를 예방, 억제 또는 감소시킬 수 있다. CCR2 활성화 및/또는 CCR2에 대한 MCP-1 결합을 검출하는 분석은, 예를 들면 문헌[Gabrilin et al., Biochem Biophys Res Commun. 327(2):533-40 (2005); Jimenez-Sainz et al., Mol Pharmacol. 64(3):773-82 (2003)]에 기재되어 있다.
일 경우에, 주화성 분석을 이용하여 CCR2 활성화의 수치를 결정할 수 있다. 몇몇 경우에, 주화성 분석을 이용하여 측정된 IC50은 5 ㎍/ml 이하, 1 ㎍/ml 이하, 0.5 ㎍/ml 이하 또는 0.20 ㎍/ml 이하이다. 실시예 10은 칼슘 동원을 모니터링하여 항CCR2 항체에 의한 CCR2의 억제를 측정하는 분석의 하나의 유형을 예시한 것이다.
또 다른 양태에서, 세포를 항체와 접촉시켜 항체와 항온처리 후 세포 표면 CCR2 발현을 하향 조절할 수 있다. 몇몇 경우에, 항온처리는 짧은 시간(예를 들면, 4시간) 또는 긴 시간(예를 들면, 24시간)일 수 있다. 웨스턴 블롯팅, ELISA 또는 FACS 분석을 이용하여 세포 표면 CCR2 발현의 하향 조절을 측정할 수 있다. 특정한 경우에, 세포를 항체와 접촉시켜 웨스턴 블롯팅 또는 ELISA에 의해 측정되는 세포 표면 CCR2 발현을 적어도 6%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30% 또는 적어도 50% 감소시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체는 MCP-1 유도된 pERK 인산화를 감소시킨다. 웨스턴 블롯팅, ELISA 또는 FACS 분석을 이용하여 MCP-1 유도된 pERK 인산화의 하향 조절을 측정할 수 있다. 특정한 경우에, 항체는 FACS 분석에 의해 측정되는 MCP-1 유도된 pERK 인산화를 적어도 6%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30% 또는 적어도 50% 감소시킨다.
항CCR2 항체에 의한 생체내 주화성 억제
몇몇 경우에 따르면, 본 발명은 생체내 면역 세포의 주화성을 억제하는 항CCR2 항체를 제공한다. 주화성이 억제되는 면역 세포로는 말초 혈액 단핵 세포, THP 세포, 단핵구, 기억 T 림프구, 수지상 세포, 호산구, 자연 살해 세포 및 입양으로 전이된 CCR2+ 세포를 들 수 있다. 일 경우에, 항CCR2 항체는 하나 이상의 MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4에 반응하여 면역 세포 주화성을 억제한다. 일 경우에, 케모카인은 MCP-1이다. 훨씬 또 다른 경우에, 케모카인은 MCP-3이다. 항CCR2 항체는 염증 또는 손상 부위에 주화성을 억제할 수 있다.
몇몇 경우에 따르면, 본 발명은 또한 섬유아세포 유사 활막세포(FLS: fibroblast-like synoviocyte)(문헌[Garcia-Vicuna et al., Arthritis Rheum. 50(12):3866-77 (2004)] 참조), 성인 신경 줄기 세포(문헌[Widera et al., Eur J Cell Biol. 83(8):381-7 (2004)] 참조) 및 인간 태아 성상세포(문헌[Andjelkovic et al., J Neurosci Res. 70(2):219-31 (2002)] 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 비면역 세포의 주화성을 억제하는 항CCR2 항체를 제공한다.
일 경우에, 항체는 비치료 동물에서 세포의 주화성과 비교하여 세포 주화성을 억제한다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 주화성을 적어도 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 억제한다. 일 경우에, 동물이 항체에 의한 치료를 시작한 지 적어도 1시간 후 주화성 억제를 측정한다. 또 다른 경우에, 동물이 항체에 의한 치료를 시작한 지 적어도 7 일 후 주화성 억제를 측정한다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 주화성을 적어도 10% 내지 100% 억제한다.
종 및 분자 선택도
또 다른 양태에서, 항CCR2 항체는 종 및 분자 선택도 둘 다를 나타낸다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 인간 및 사이노몰거스 CCR2에 결합한다. 항CCR2 항체는 비인간 영장류 종의 추가의 CCR2에 결합할 수 있다. 몇몇 경우에, 항CCR2 항체는 마우스 또는 랫트 CCR2에 결합하지 않는다. 명세서의 교시내용에 따라, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 항CCR2 항체에 대한 종 선택도를 결정할 수 있다. 예를 들면, 웨스턴 블롯, 유세포 측정법, ELISA, 면역침강 또는 RIA를 이용하여 종 선택도를 결정할 수 있다. 일 경우에, 유세포 측정법을 이용하여 종 선택도를 결정할 수 있다. 또 다른 경우에, 그 종 유래의 세포를 이용하여 MCP-1 기능 반응을 억제하는 항체의 능력을 평가하여 종 특이성을 결정할 수 있다. 이것은 주화성, 액틴 중합, 칼슘 동원 등을 들 수 있다.
또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 서열 번호 131에 기재된 아미노산 서열(인간 CCR5)로 이루어지는 폴리펩티드에 대해 서열 번호 126에 기재된 아미노산 서열(인간 CCR2B)로 이루어지는 폴리펩티드에 대한 선택도를 갖는다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배 또는 적어도 100배의 CCR5에 대해 CCR2에 대한 선택도를 갖는다. 또 다른 경우에, 인간 항CCR2 항체는 서열 번호 126와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 25배, 적어도 50배 또는 적어도 100배의 서열 번호 131에 기재된 아미노산 서열(인간 CCR5)로 이루어지는 폴리펩티드에 대해 서열 번호 125에 기재된 아미노산 서열(인간 CCR2A)로 이루어지는 폴리펩티드에 대한 선택도를 가질 수 있다. 또 다른 경우에, 인간 항CCR2 항체는 서열 번호 125와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
명세세의 교시내용에 따라 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 CCR2에 대한 항CCR2 항체의 선택도를 결정할 수 있다. 예를 들면, 웨스턴 블롯, 유세포 측정법, ELISA, 면역침강 또는 RIA 및/또는 기능 분석, 예컨대 주화성, 칼슘 동원 또는 액틴 중합을 이용하여 선택도를 결정할 수 있다.
항체를 생산하는 방법 및 세포주를 생산하는 항체
면역화
몇몇 경우에, 게놈 내에 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비인간 형질전환 동물을 CCR2 항원에 의해 면역화하여 인간 항체를 제조한다. 일 경우에, 비인간 동물은 XENOMOUSE™ 동물이다.(Amgen Fremont, Inc.(이전 Abgenix, Inc.)(미국 캘리포니아주 프레몬트)).
XENOMOUSE™ 마우스는 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 큰 단편을 포함하고 마우스 항체 생성이 결핍된 조작된 마우스 균주이다. 예를 들면, 문헌[Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994)] 및 미국 특허 제5,916,771호, 제5,939,598호, 제5,985,615호, 제5,998,209호, 제6,075,181호, 제6,091,001호, 제6,114,598호, 제6,130,364호, 제6,162,963호 및 제6,150,584호를 참조한다. 또한 WO 제91/10741호, WO 제94/02602호, WO 제96/34096호, WO 제96/33735호, WO 제98/16654호, WO 제98/24893호, WO 제98/50433호, WO 제99/45031호, WO 제99/53049호, WO 제00/09560호 및 WO 제00/037504호를 참조한다.`
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비인간 형질전환 동물을 CCR2 항원에 의해 면역화하여 비인간 비마우스 동물로부터 항CCR2 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 상기 인용된 문헌에 기재된 방법을 이용하여 이 동물을 생성할 수 있다. 이 문헌에 개시된 방법을 미국 특허 제5,994,619호(본원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 바대로 변경할 수 있다. 미국 특허 제5,994,619호에는 돼지 및 소로부터 유도되는 새로 배양된 내부 세포괴(CICM: cultured inner cell mass) 세포 및 세포주, 및 이성 DNA가 삽입된 형질전환 CICM 세포를 생성하는 방법이 기재되어 있다. 클로닝된 형질전환 배아, 태아 및 자손을 생성하기 위해 CICM 형질전환 세포를 사용할 수 있다. 제5,994,619호 특허에는 또한 이성 DNA를 이의 자손에게 전달할 수 있는 형질전환 동물을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 바람직한 경우에, 비인간 동물은 포유동물, 특히 랫트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다.
XENOMOUSE™ 마우스는 완전 인간 항체의 성인 유사 인간 레퍼토리를 생성하고 항원 특이적 인간 항체를 생산한다. 몇몇 경우에, XENOMOUSE™ 마우스는 인간 중쇄 유전자좌 및 카파 경쇄 유전자좌의 생식선 배치 단편의 도입을 통해 인간 항체 V 유전자 레퍼토리의 대략 80%를 포함한다. 다른 경우에, XENOMOUSE™ 마우스는 추가로 인간 람다 경쇄 유전자좌의 대략 전부를 포함한다. 문헌[Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)] 및 WO 제98/24893호를 참조하고, 이의 개시내용은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
또 다른 경우에, 변형된 배아 줄기(ES) 세포로부터 직접적으로 유전적으로 변형된 마우스의 즉시 생성을 위해 VELOCIMOUSE™ 기술(Regeneron Pharmaceuticals(미국 뉴욕주 테리타운))을 이용하여 항체를 생성한다(Poueymirou W.T., et al., Nature Biotechnology 25:91-99 (2007)).
몇몇 경우에, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 비인간 동물은 인간 면역글로불린 "미니유전자좌"를 갖는 동물이다. 미니유전자좌 접근법에서, Ig 유전자좌 기원의 개별 유전자의 삽입을 통해 외인성 Ig 유전자좌를 모방한다. 따라서, 동물에 대한 삽입에 대한 작제물로 하나 이상의 VH 유전자, 하나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 JH 유전자, 뮤 불변 도메인 및 제2 불변 도메인(바람직하게는 감마 불변 도메인)을 형성한다. 이 접근법은 특히 미국 특허 제5,545,807호, 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,661,016호, 제5,770,429호, 제5,789,650호, 제5,814,318호, 제5,591,669호, 제5,612,205호, 제5,721,367호, 제5,789,215호 및 제5,643,763호에 기재되어 있고, 이들은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간화 항CCR2 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 경우에, 항체 생성을 허용하는 조건 하에 본원에 기재된 바대로 CCR2 항원에 의해 비인간 동물을 면역화한다. 동물로부터 항체 생산 세포를 단리하고, 관심 있는 항CCR2 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산을 단리한다. 당업자에게 공지된 기법을 이용하여 그리고 하기 추가로 기재된 바대로 비인간 서열의 양을 감소시키기 위해, 즉 항체를 인간화하여 인간에서 면역 반응을 감소시키기 위해 후속적으로 이 핵산을 조작한다.
몇몇 경우에, CCR2 항원은 단리된 및/또는 정제된 CCR2이다. 일 경우에, CCR2 항원은 인간 CCR2이다. 몇몇 경우에, CCR2 항원은 CCR2의 단편이다. 몇몇 경우에, CCR2 단편은 CCR2의 세포외 루프, N 말단 도메인 또는 C 말단 끝이다. 몇몇 경우에, CCR2 단편은 CCR2의 제1 또는 제2 세포외 루프를 포함한다. 다른 경우에, CCR2 단편은 서열 번호 128 또는 서열 번호 129에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
다른 경우에, CCR2 단편은 CCR2의 제3 세포외 루프 또는 N 말단 도메인을 포함하지 않는다.
다른 경우에, CCR2 단편은 서열 번호 127 또는 서열 번호 130에 기재된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 몇몇 경우에, CCR2 단편은 CCR2의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 다른 경우에, CCR2 항원은 이의 표면 상에 CCR2 또는 이의 면역성 단편을 발현 또는 과발현하는 세포이다. 몇몇 경우에, CCR2 항원은 CCR2 융합 단백질이다. 몇몇 경우에, CCR2는 합성 펩티드 면역원이다.
당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 동물을 면역화할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990]을 참조한다. 비인간 동물, 예컨대 마우스, 랫트, 양, 염소, 돼지, 소 및 말을 면역화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 Harlow 및 Lane 문헌 및 미국 특허 제5,994,619호를 참조한다. 일 경우에, 면역 반응을 자극하는 항원보강제와 함께 CCR2 항원을 투여한다. 항원보강제의 예로는 완전 또는 불완전 프로이드 항원보강제, RIBI(무라밀 디펩티드) 또는 ISCOM(면역자극 복합체)를 들 수 있다. 이 항원보강제는 국지적 침착물에서 이것을 봉쇄하여 폴리펩티드가 신속히 확산되는 것을 예방할 수 있거나, 면역계의 대식세포 및 다른 성분에 대해 화학주성인 인자를 분비하도록 숙주를 자극하는 물질을 포함할 수 있다. 폴리펩티드를 투여하는 경우, 면역화 스케줄은 수주에 걸쳐 이어지는 폴리펩티드의 2종 이상의 투여를 포함한다. 실시예 1은 XENOMOUSE™ 마우스에서 항CCR2 단일클론 항체를 생성하는 방법을 예시한 것이다.
항체 생산 및 항체 생산 세포주
CCR2 항원에 의해 동물을 면역화한 후, 이 동물로부터 항체 및/또는 항체 생산 세포를 얻을 수 있다. 몇몇 경우에, 동물을 채혈 또는 희생시켜 이 동물로부터 항CCR2 항체 함유 혈청을 얻는다. 이 동물로부터 얻은 그대로 혈청을 사용할 수 있거나, 혈청으로부터 면역글로불린 단편을 얻을 수 있거나, 혈청으로부터 항CCR2 항체를 정제할 수 있다.
몇몇 경우에, 면역화된 동물로부터 단리된 세포로부터 항체 생산 불멸화 세포주를 제조한다. 면역화한 후, 동물을 희생시키고, 당해 분야에서 공지된 임의의 수단에 의해 말초 혈액, 림프절 및/또는 비장 B 세포를 불멸화한다. 세포를 불멸화하는 방법으로는 이것을 암유전자로 형질감염시키는 것, 이것을 암유전자 바이러스로 감염시키는 것 및 이것을 불멸화 세포를 위해 선택된 조건 하에 배양하는 것, 이것을 발암성 또는 변이 화합물로 처리하는 것, 이것을 불멸화 세포, 예를 들면 골수종 세포와 융합시키는 것 및 종양 억제인자 유전자를 불활화시키는 것을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 상기 Harlow 및 Lane 문헌을 참조한다. 골수종 세포에 의한 융합을 이용하는 경우, 골수종 세포는 바람직하게는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다(비분비형 세포주). CCR2, 이의 일부분 또는 CCR2를 발현하는 세포를 사용하여 불멸화 세포를 스크리닝한다. 일 경우에, CCR2 부분은 (ⅰ) CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프를 포함하거나; (ⅱ) 서열 번호 128 및/또는 서열 번호 129에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나; (ⅲ) CCR2의 제3 세포외 루프 및/또는 N 말단 도메인을 포함하지 않거나; (iv) 서열 번호 127 및/또는 서열 번호 130에 기재된 아미노산 서열을 포함하지 않거나; (v) 이들의 조합이다. 일 경우에, 효소 결합 면역측정법(ELISA) 또는 방사선면역측정법을 이용하여 초기 스크리닝을 수행한다. ELISA 스크리닝의 예는 WO 제00/37504호에 제공되어 있고, 이것은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
항CCR2 항체 생산 세포, 예를 들면 하이브리도마를 선택하고, 클로닝하고, 하기 추가로 기재된 바대로 탄탄한 성장, 높은 항체 생산 및 바람직한 항체 특성을 비롯한 바림직한 특성에 대해 추가로 스크리닝한다. 생체내 동계 동물에서, 면역계가 부족한 동물에서, 예를 들면 누드 마우스에서 또는 시험관내 세포 배양에서 하이브리도마를 확장시킬 수 있다. 하이브리도마를 선택하고 클로닝하고 확장하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
일 양태에서, 면역화된 동물은 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 비인간 동물이고, 비장 B 세포를 비인간 동물과 동일한 종 기원의 골수종 세포주에 융합시킨다. 예시적인 경우에, 면역화된 동물은 XENOMOUSE™ 마우스이고, 골수종 세포주는 비분비형 마우스 골수종이다. 일 경우에, 골수종 세포주는 P3-X63-Ag8.653(American Type Culture Collection)이다. 예를 들면, 실시예 1을 참조한다.
CCR2의 제1 또는 제2 세포외 루프의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드에 결합하는 세포에 의해 항체가 제조되는지를 시험하여 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프와 관련되는 항체를 확인하는 불멸화 항체 생산 세포의 스크리닝을 성취할 수 있다. 대안적으로 또는 조합으로, CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프의 서열을 갖지만 또 다른 케모카인 수용체의 서열을 주로 갖는 키메라 케모카인 수용체에 대한 결합에 대해 세포에 의해 제조된 항체를 시험할 수 있다. 항CCR2 항체의 에피토프를 맵핑하기 위한 키메라의 용도를 예시한 것인 실시예 8을 참조한다. 상보성 경우에, CCR2의 서열을 주로 갖지만, CCR2의 야생형 제1 및/또는 제2 세포외 루프가 부족한, 예를 들면 또 다른 사이토카인 수용체로부터 제1 및/또는 제2 세포외 루프를 갖거나, 이 세포외 루프 중 하나 또는 둘 다에서 돌연변이를 포함하는 키메라 케모카인 수용체에 대한 결합에 대해 CCR2에 결합하는 것으로 공지된 세포에 의해 제조된 항체를 시험할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인간 항CCR2 항체를 생성하는 (하이브리도마를 포함하는) 세포 및 세포주를 제공한다. 일 경우에, 세포, 세포주 또는 하이브리도마에 의해 제조된 인간 항CCR2 항체는 CCR2의 길항제이다. 훨씬 또 다른 경우에, 인간 항CCR2 항체는 (ⅰ) CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합하거나; (ⅱ) 서열 번호 128 및/또는 서열 번호 129에 기재된 아미노산 서열에 결합하거나; (ⅲ) CCR2의 제3 세포외 루프 및/또는 N 말단 도메인에 결합하지 않거나; (iv) 서열 번호 127 및/또는 서열 번호 130에 기재된 아미노산 서열에 결합하지 않거나; (v) 이들의 조합이다. 또 다른 경우에, 세포, 세포주 또는 하이브리도마에 의해 제조된 인간 항CCR2 항체는 높은 친화도로 제3 세포외 루프에 결합하지 않거나, 높은 친화도로 CCR2의 N 말단 도메인에 결합하지 않거나, 높은 친화도로 어디에도 결합하지 않는다.
훨씬 또 다른 양태에서, 형질전환 동물을 CCR2, 1차 세포, 예를 들면 비장 또는 말초 혈액 세포에 의해 면역화하고, 면역화된 형질전환 동물로부터 단리하고 원하는 항원에 특이적인 항체를 생성하는 개별 세포를 확인한다. 예를 들면, 각각의 개별 세포로부터 폴리아데닐레이트화 mRNA를 단리하고, 가변 구역 서열을 어닐링하는 센스 프라이머, 예를 들면 인간 중쇄 및 경쇄 가변 구역 유전자의 FR1 구역의 대부분 또는 모두를 인식하는 축퇴성 프라이머 및 가변 또는 결합(J) 구역 서열을 어닐링하는 안티센스 프라이머를 이용하여 역전사 중합효소 쇄 반응(RT-PCR)을 수행한다. 이후, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 cDNA를 클로닝하고 각각의 면역글로불린 불변 구역, 예컨대 중쇄 및 κ 또는 λ 불변 도메인을 갖는 키메라 항체로서 임의의 적합한 숙주 세포, 예를 들면 골수종 세포에서 발현시킨다. 문헌[Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996), 본원에 참조문헌으로 포함됨]을 참조한다. 이후, 항CCR2 항체를 확인하고 본원에 기재된 바대로 단리할 수 있다.
또 다른 양태에서, 파아지 디스플레이 기법을 이용하여 CCR2에 대해 다양한 친화도를 갖는 항체의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리를 제공할 수 있다. DNA의 공급원으로서 직접 1차 B 세포를 이용할 수 있다. 예를 들면, 비장으로부터 유도된 B 세포로부터 얻은 cDNA 혼합물을 사용하여 발현 라이브러리, 예를 들면 이. 콜라이로 형질감염된 파아지 디스플레이 라이브러리를 제조할 수 있다. CCR2에 대한 면역반응성에 대해 생성된 세포를 시험한다. 이 라이브러리로부터 높은 친화도 인간 항체를 확인하는 기법은 문헌[Griffiths et al., EMBO J. 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp. 692-698; Griffiths et al., ibid, 12:725-734, 참조문헌으로 포함됨]에 기재되어 있다. 궁극적으로, 항원에 대해 원하는 양의 결합 친화도를 생성하는 라이브러리로부터 얻은 클론을 확인하고 이 결합을 책임지는 생성물을 코딩하는 DNA를 표준 재조합 발현에 대해 조작한다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 또한 이전에 조작된 뉴클레오티드 서열을 사용하여 작제하고 유사한 방식으로 스크리닝한다. 일반적으로, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA를 독립적으로 공급하거나 연결하여 파아지 라이브러리에서의 생성에 대해 Fv 유사체를 형성한다.
이후, CCR2 및 적절한 클론으로부터 회수된 유전 물질에 대해 최고 친화도를 갖는 항체에 대해 파아지 라이브러리를 스크리닝한다. 추가의 스크리닝 횟수는 단리된 원래 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다.
핵산, 벡터, 숙주 세포 및 항체를 제조하는 재조합 방법
핵산
본 발명은 또한 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 몇몇 경우에, 상이한 핵산 분자는 항CCR2 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다. 다른 경우에, 동일한 핵산 분자는 항CCR2 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄를 코딩한다. 일 경우에, 핵산은 CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩한다.
몇몇 경우에, 경쇄(VL)의 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자는 인간 Vκ1, Vκ2, Vκ3, Vκ4, Vκ5 또는 Vκ6 유전자 패밀리 분절 및 생식선으로부터 돌연변이를 갖거나 또는 갖지 않는 Jκ1, Jκ2, Jκ4 또는 Jκ5 유전자 분절을 포함한다.
몇몇 경우에, 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 생식선 아미노산 서열(들)로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 치환을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 경우에, 핵산 분자는 생식선 VK 및 JK 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 보존적 아미노산 치환 및/또는 1개, 2개 또는 3개의 비보존적 치환을 포함하는 VL 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. CDR, 프레임워크 구역 또는 불변 도메인에서 치환될 수 있다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 항체 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P 중 하나의 VL에서 발견되는 변형에 동일한 생식선 서열과 비교하여 하나 이상의 변이체를 포함하는 VL 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 경우에, 핵산은 본원에서 제공되는 CCR2 항체에서 생식선으로부터의 돌연변이와 동일한 위치의 하나 이상에서 돌연변이를 포함하지만, 제공된 항체에서의 치환과 비교하여 상이한 치환, 몇몇 경우에 보존적 치환을 포함하는 VL 아미노산 서열을 코딩한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 항체 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P 중 하나의 VL에서 발견되는 생식선 서열과 비교하여 적어도 3개의 아미노산 치환을 코딩한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 단일클론 항체 4.40(서열 번호 101), 4.9(서열 번호 29), 4.22(서열 번호 65), 4.39(서열 번호 194) 또는 4.40 A68G S230P(서열 번호 113)의 VL 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 또는 일부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, 핵산은 상기 기재된 항체 중 하나의 경쇄 CDR을 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 경우에, 상기 일부분은 CDR1-CDR3을 포함하는 인접 부분이다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 항체 4.40, 4.9, 4.22. 4.39 또는 4.40 A68G S230P의 VL 구역 중 임의의 하나의 VL 아미노산 서열 또는 서열 번호 101, 서열 번호 113, 서열 번호 29, 서열 번호 194 또는 서열 번호 65 중 임의의 하나의 VL 구역의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VL 아미노산 서열을 코딩한다. 핵산 분자는 서열 번호 101, 서열 번호 113, 서열 번호 29 또는 서열 번호 65에서 발견되는 VL 구역을 코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 경우에, 핵산은 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P로부터 선택되는 항체의 전장 경쇄 또는 서열 번호 100, 서열 번호 112, 서열 번호 64, 서열 번호 193 또는 서열 번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 또는 돌연변이를 포함하는 상기 경쇄 서열, 예컨대 본원에 개시된 것을 코딩한다.
훨씬 또 다른 경우에, 핵산 분자는 인간 3-30 또는 1-46 VH 유전자 서열 또는 이로부터 유도된 서열을 포함하는 중쇄(VH)의 가변 도메인을 코딩한다. 다양한 경우에, 핵산 분자는 인간 3-30 VH 유전자 서열, 인간 D1-7 유전자 서열 및 인간 JH3B 유전자 서열; 인간 1-46 VH 유전자 서열, 인간 D1-7 유전자 서열 및 인간 JH3B 유전자 서열; 또는 인간 유전자로부터 유도된 서열을 이용한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 인간 V, D 또는 J 유전자의 생식선 아미노산 서열과 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개 또는 18개의 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 경우에, 상기 돌연변이는 VH 구역에 존재한다. 몇몇 경우에, 상기 돌연변이는 CDR에 존재한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 단일클론 항체 4.40, 4.22, 4.39 또는 4.9의 VH에서 발견되는 아미노산 돌연변이에 동일한 생식선 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 코딩한다. 몇몇 경우에, 핵산은 상기 기재된 단일클론 항체 중 하나에서 발견되는 적어도 3개의 아미노산 돌연변이와 동일한 생식선 서열과 비교하여 적어도 3개의 아미노산 돌연변이를 코딩한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 4.40(서열 번호 83), 4.22(서열 번호 47), 4.39(서열 번호 176) 또는 4.9(서열 번호 11)로부터 선택되는 단일클론 항체의 VH 아미노산 서열의 적어도 일부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 이의 변이체, 또는 보존적 아미노산 돌연변이 및/또는 전체 3개 이하의 비보존적 아미노산 치환을 갖는 상기 서열을 포함한다. 다양한 경우에, 서열은 신호 서열을 갖거나 또는 갖지 않는 하나 이상의 CDR, CDR3 구역, 모든 3개의 CDR, CDR1-CDR3을 비롯한 인접 부분 또는 전체 VH 구역을 코딩한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 서열 번호 82, 서열 번호 46, 서열 번호 10, 서열 번호 175 또는 서열 번호 116 중 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 신호 서열을 갖는 상기 서열을 포함한다. 몇몇 바람직한 경우에, 핵산 분자는 서열 번호 73 또는 서열 번호 115의 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부분 또는 신호 서열을 갖는 상기 서열을 포함한다. 몇몇 경우에, 상기 일부분은 (신호 서열을 갖거나 또는 갖지 않는) VH 구역, CDR3 구역, 모든 3개의 CDR 또는 CDR1-CDR3을 비롯한 인접 구역을 코딩한다.
몇몇 경우에, 핵산 분자는 항체 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P의 VH 구역 중 임의의 하나의 VH 아미노산 서열 또는 서열 번호 83, 서열 번호 47, 서열 번호 176 또는 서열 번호 11 중 임의의 하나의 VH 구역의 아미노산 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 VH 아미노산 서열을 코딩한다. 본 발명은 또한 4.40(서열 번호 83), 4.22(서열 번호 47), 4.39(서열 번호 176) 또는 4.9(서열 번호 11)의 아미노산 서열 또는 이의 VH 구역을 코딩하거나, 서열 번호 74, 서열 번호 38, 서열 번호 167, 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 이의 VH 구역을 코딩하는 핵산을 포함한다.
또 다른 경우에, 핵산은 4.40, 4.22, 4.9, 4.39 또는 4.40 A68G S230P로부터 선택되는 항체의 전장 중쇄, 또는 신호 서열 존재 또는 부재 하에 서열 번호 10, 서열 번호 46, 서열 번호 82, 서열 번호 175 또는 서열 번호 116의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 또는 돌연변이를 포함하는 중쇄, 예컨대 본원에 기재된 변이체 중 하나를 코딩한다. 추가로, 핵산은 서열 번호 1, 서열 번호 37, 서열 번호 73, 서열 번호 166 또는 서열 번호 115의 뉴클레오티드 서열, 또는 돌연변이를 포함하는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자, 예컨대 본원에 기재된 변이체 중 하나를 포함할 수 있다.
이 항체를 생성하는 임의의 공급원으로부터 항CCR2 항체의 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 일부분을 코딩하는 핵산 분자를 단리할 수 있다. 다양한 경우에, CCR2에 의해 면역화된 동물로부터 단리된 B 세포로부터 또는 항CCR2 항체를 발현하는 이 B 세포로부터 유도된 불멸화 세포로부터 핵산 분자를 단리한다. 항체를 코딩하는 mRNA를 단리하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sambrook et al]을 참조한다. mRNA를 사용하여 중합효소 쇄 반응(PCR) 또는 항체 유전자의 cDNA 클로닝에서 사용하기 위한 cDNA를 생성할 수 있다. 일 경우에, 융합 파트너 중 하나로서 비인간 형질전환 동물 기원의 인간 면역글로불린 생성 세포를 갖는 하이브리도마로부터 핵산 분자를 단리한다. 다른 경우에, XENOMOUSE™ 동물로부터 인간 면역글로불린 생성 세포를 단리한다. 또 다른 경우에, 인간 면역글로불린 생성 세포는 본원에 기재된 바대로 비인간 비마우스 형질전환 동물 기원이다. 또 다른 경우에, 비인간의 비형질전환 동물로부터 핵산을 단리한다. 예를 들면, 인간화 항체에 대해 비인간의 비형질전환 동물로부터 단리된 핵산 분자를 사용할 수 있다.
몇몇 경우에, 항CCR2 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산은 임의의 공급원으로부터 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임 연결된 VH 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 유사하게, 항CCR2 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자는 임의의 공급원으로부터 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 인-프레임 연결된 VL 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 중쇄(VH) 및/또는 경쇄(VL)의 가변 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 전장 항체 유전자로 "전환시킨다". 일 경우에, 각각 중쇄 불변(CH) 또는 경쇄 불변(CL) 도메인을 이미 코딩하는 발현 벡터로 삽입하여 VH 또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 전장 항체 유전자로 전환시켜, VH 분절은 벡터 내에 CH 분절(들)에 작동적으로 연결되고/되거나 VL 분절은 벡터 내에 CL 분절에 작동적으로 연결된다. 또 다른 경우에, VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 표준 분자 생물학적 기법을 이용하여 CH 및/또는 CL 도메인을 코딩하는 핵산 분자에 연결, 예를 들면 결찰하여 VH 및/또는 VL 도메인을 코딩하는 핵산 분자를 전장 항체 유전자로 전환시킨다. 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 불변 도메인 유전자의 뉴클레오티드 서열은 당해 분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991]을 참조한다. 이후, 전장 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를, 이것이 도입되고 항CCR2 항체가 단리된 세포로부터 발현시킬 수 있다.
핵산 분자를 사용하여 재조합으로 항CCR2 항체를 발현시킬 수 있다. 핵산 분자를 또한 사용하여 하기 추가로 기재된 바대로 키메라 항체, 2중 특이적 항체, 단일 쇄 항체, 면역접합체, 2항체, 돌연변이된 항체 및 항체 유도체를 생성할 수 있다. 핵산 분자가 비인간 비형질전환 동물로부터 유도되는 경우, 또한 본원에 기재된 바대로 항체 인간화에 대해 핵산 분자를 사용할 수 있다.
몇몇 경우에, 본 발명은 불변 구역 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 생식선 인간 불변 구역 서열과 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 전장 중쇄 또는 전장 경쇄를 코딩하는 핵산을 제공한다. 예를 들면, 글리코실화 부위를 추가 또는 제거하여 또는 항체의 안정성 또는 반감기를 개선하는 치환을 코딩하여 핵산은 항체의 특성을 개선하는 아미노산 치환을 코딩할 수 있다. 핵산은 또한 제한 효소 부위를 추가 또는 제거하기 위해, 예를 들면 특정한 발현 벡터로 핵산이 클로닝되는 것을 수월하게 하기 위해 "침묵" 돌연변이를 포함할 수 있다.
벡터
본 발명은 항CCR2 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 단백질, 변형된 항체, 항체 단편 및 이의 프로브를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
몇몇 경우에, 본원에 기재된 바대로 얻은 부분 또는 전체 길이 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 DNA가 발현 벡터로 삽입되어 유전자가 필수적인 발현 조절 서열, 예컨대 전사 및 번역 조절 서열에 작동적으로 연결되는 항CCR2 항체 또는 항원 결합 부분을 발현시킨다. 발현 벡터로는 플라스미드, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV), 식물 바이러스, 예컨대 컬리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 코스미드, YAC, EBV 유도된 에피솜 등을 들 수 있다. 몇몇 경우에, 항체 유전자를 벡터에 결찰하여 벡터 내에 전사 및 번역 조절 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 이의 의도된 기능을 제공한다. 사용되는 발현 숙주 세포와 경쟁하도록 발현 벡터 및 발현 조절 서열을 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자를 별개의 벡터 또는 동일한 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 항체 유전자를 표준 방법(예를 들면, 항체 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 부위의 결찰, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 블런트 말단 결찰)에 의해 발현 벡터에 삽입한다.
편리한 벡터는 적절한 제한 부위가 조작되는 기능상 완전한 인간 CH 또는 CL 면역글로불린 서열을 코딩하여 임의의 VH 또는 VL 서열이 본원에 기재된 바대로 삽입 및 발현될 수 있는 것이다. 이러한 벡터에서, 스플라이싱은 보통 삽입된 J 구역에서의 스플라이스 도너 부위와 인간 C 도메인 앞의 스플라이스 억셉터 부위 사이에 발생하고, 또한 인간 CH 엑손 내에 발생하는 스플라이스 구역에서 발생한다. 폴리아데닐화 및 전사 종결은 코딩 구역 하류에서 본래의 염색체 부위에서 발생한다. 재조합 발현 벡터는 또한 숙주 세포로부터 항체 쇄의 분비를 수월하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자를 벡터로 코딩하여 신호 펩티드가 면역글로불린 쇄의 아미노 말단에 인-프레임 연결시킬 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비면역글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
항체 쇄 유전자 이외에, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 조절하는 조절 서열을 운반한다. 당업자는 조절 서열의 선택을 비롯하여 발현 벡터의 설계가 형질전환시키고자 하는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수치 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해하고 있다. 포유동물 숙주 세포 발현에 바람직한 조절 서열은 포유동물 세포에서 높은 수치의 단백질 발현을 지시하는 바이러스 성분, 예컨대 레트로바이러스 LTR, 시토메갈로바이러스(CMV)(예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 유인원 바이러스 40(SV40)(예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스(예를 들면, 아데노바이러스 주요 후발 프로모터(AdMLP))로부터 유도된 프로모터 및/또는 인핸서, 폴리오마 및 강력한 포유동물 프로모터, 예컨대 본래의 면역글로불린 및 액틴 프로모터를 포함한다. 바이러스 조절 성분 및 이의 서열의 추가 설명을 위해, 예를 들면 미국 특허 제5,168,062호, 미국 특허 제4,510,245호 및 미국 특허 제4,968,615호를 참조한다. 프로모터 및 벡터, 및 식물의 형질전환의 설명을 비롯하여 식물에서 항체를 발현시키는 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제6,517,529호를 참조하고, 이것은 본원에 참조문헌으로 포함된다. 박테리아 세포 또는 진균 세포, 예를 들면 효모 세포에서 폴리펩티드를 발현시키는 방법은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체 쇄 유전자 및 조절 서열 이외에, 재조합 발현 벡터는 추가 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들면, 복제 기원) 및 선택 가능한 마커 유전자를 운반할 수 있다. 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포의 선택을 수월하게 한다(예를 들면, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호를 참조하고, 이들은 본원에 참조문헌으로 포함된다). 예를 들면, 통상적으로 선택 가능한 마커 유전자는 벡터가 도입되는 숙주 세포 상에 약물, 예컨대 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트에 내성을 부여한다. 바람직한 선택 가능한 마커 유전자로는 (메토트렉세이트 선택/증폭을 갖는 dhfr-숙주 세포에서의 사용을 위한) 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자, (G418 선택을 위한) 네오 유전자 및 글루타메이트 신시타제(GS) 유전자를 들 수 있다.
비하이브리도마 숙주 세포 및 단백질을 재조합으로 생산하는 방법
적합한 포유동물, 식물, 박테리아, 곤충 또는 효모 숙주 세포의 형질감염에 항CCR2 항체를 코딩하는 핵산 분자 및 이 핵산 분자를 포함하는 벡터를 사용할 수 있다. 숙주 세포로 폴리뉴클레오티드를 도입시키는 임의의 공지된 방법에 의해 형질전환시킬 수 있다. 포유동물 세포로 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 덱스트란 매개 형질감염, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 매개 형질감염, 원형질체 융합, 전기영동, 리포솜에서 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화 및 핵으로의 DNA의 직접 미량주사를 들 수 있다. 또한, 핵산 분자를 바이러스 벡터에 의해 포유동물 세포로 도입할 수 있다. 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,399,216호, 제4,912,040호, 제4,740,461호 및 제4,959,455호를 참조하고, 이들은 본원에 참조문헌으로 포함된다. 예를 들면, 아그로박테리움 매개 형질전환, 주입 형질전환, 직접 주사, 전기영동 및 바이러스 형질전환을 비롯한 식물 세포를 형질전환시키는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 박테리아, 곤충 세포 및 효모 세포를 형질전환시키는 방법은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
발현을 위해 숙주로서 이용 가능한 포유동물 세포주는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC; American Type Culture Collection)으로부터 구입 가능한 많은 불멸화 세포주를 들 수 있다. 이것은 특히 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, NSO 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 아기 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들면, Hep G2), A549 세포 및 수많은 다른 세포주를 들 수 있다. 세포주가 높은 발현 수치를 갖는지의 결정을 통해 특히 바람직한 세포주를 선택한다. 사용할 수 있는 다른 세포주는 곤충 세포주, 예컨대 Sf9 또는 Sf21 세포이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포로 도입할 때, 숙주 세포에서 항체를 발현시키거나, 숙주 세포가 배양되는 배양 배지로 항체를 분비시키기에 충분한 시간 기간 동안 숙주 세포를 배양하여 항체를 제조한다. 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 배양 배지로부터 항체를 회수할 수 있다. 식물 숙주 세포로는, 예를 들면 니코티아나, 애기장대, 좀개구리밥, 옥수수, 밀, 감자 등을 들 수 있다. 박테리아 숙주 세포는 이. 콜라이 및 스트렙토마이세스 종을 들 수 있다. 효모 숙주 세포로는 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 및 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 들 수 있다.
추가로, 수많은 공지된 기법을 이용하여 생성 세포주로부터 항체의 발현을 증진시킬 수 있다. 예를 들면, 글루타민 신시타제 유전자 발현 시스템(GS 시스템)은 일정한 조건 하에 발현을 증진시키는 통상적인 접근법이다. GS 시스템은 유럽 특허 제216 846호, 제256 055호, 제323 997호 및 제338 841호와 관련하여 전체로 또는 부분적으로 논의되고 있다.
상이한 세포주에 의해 또는 형질전환 동물에서 발현되는 항체는 서로 상이한 글리코실화를 가질 것이다. 그러나, 본원에 제공되는 핵산 분자에 의해 코딩되거나, 본원에서 제공되는 아미노산 서열을 포함하는 모든 항체는 항체의 글리코실화와 무관하게 본 개시내용의 일부이다.
형질전환 동물 및 식물
또한, 관심 있는 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열에 형질전환인 포유동물 또는 식물의 생성 및 이로부터 회수 가능한 형태의 항체의 생성을 통해 형질전환으로 항CCR2 항체를 제조할 수 있다. 포유동물에서의 형질전환 생성과 관련하여, 항CCR2 항체를 제조하고, 염소, 소 또는 다른 포유동물의 젖으로부터 회수할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,827,690호, 제5,756,687호, 제5,750,172호 및 제5,741,957호를 참조하고, 이들은 본원에 참조문헌으로 포함된다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비인간 형질전환 동물을 본원에 기재된 바대로 CCR2 또는 이의 면역성 부분에 의해 면역화한다. 식물에서 항체를 제조하는 방법은, 예를 들면 미국 특허 제6,046,037호 및 제5,959,177호에 기재되어 있고, 이들은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
몇몇 경우에, 항CCR2 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 표준 형질전환 기법에 의해 동물 또는 식물로 도입하여 비인간 형질전환 동물 또는 식물을 제조한다. 상기 Hogan 문헌 및 미국 특허 제6,417,429호를 참조한다. 형질전환 동물을 제조하기 위해 사용되는 형질전환 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포 또는 수정란일 수 있다. 형질전환 비인간 유기체는 키메라, 비키메라 이형접합체 및 비키메라 동형접합체일 수 있다. 예를 들면, 문헌[Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual second ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)]을 참조하고, 이들은 모든 본원에 참조문헌으로 포함된다. 몇몇 경우에, 형질전환 비인간 동물은 관심 있는 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 작제물을 표적화하여 표적화된 분열 및 대체를 갖는다. 일 경우에, 형질전환 동물은 CCR2에 특이적으로 결합하고, 바람직하게는 (ⅰ) CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합하거나; (ⅱ) CCR2의 N 말단 끝 또는 제3 세포외 루프 또는 둘 다에 결합하지 않거나; 또는 (ⅲ) 둘 다인 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 발현시킨다. 일 경우에, 형질전환 동물은 인간 CCR2에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 발현시킨다. 몇몇 경우에, 형질전환 동물은 변형된 항체, 예컨대 단일쇄 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 임의의 형질전환 동물에서 항CCR2 항체를 제조할 수 있다. 일 경우에, 비인간 동물은 마우스, 랫트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다. 비인간 형질전환 동물은 혈액, 젖, 뇨, 타액, 눈물, 점액 및 다른 체액에서 상기 코딩된 폴리펩티드를 발현시킨다.
파아지 디스플레이 라이브러리
본 발명은 파아지 상에 인간 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, CCR2 또는 이의 일부분을 갖는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, CCR2에 결합하는 파아지를 단리시키는 단계 및 파아지로부터 항체를 얻는 단계를 포함하는 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생성하는 방법을 제공한다. 예의 방식으로, 파아지 디스플레이 기법에서 사용하기 위한 항체의 라이브러리를 제조하기 위한 방법은 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 CCR2 또는 이의 항원 부분에 의해 면역화하여 면역 반응을 생성하는 단계, 면역화된 동물로부터 항체 생산 세포를 추출하는 단계; 추출된 세포로부터 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 RNA를 단리시키는 단계, RNA를 역전사시켜 cDNA를 생성하는 단계, 프라이머를 이용하여 cDNA를 증폭시키는 단계 및 파아지 디스플레이 벡터로 cDNA를 삽입하여 항체를 파아지 상에 발현시키는 단계를 포함한다. 이러한 방식으로 재조합 항CCR2 항체를 얻을 수 있다.
재조합 조합 항체 라이브러리를 스크리닝하여 재조합 항CCR2 인간 항체를 단리시킬 수 있다. 라이브러리는 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 생성되는 scFv 파아지 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 이 라이브러리를 제조하고 스크리닝하는 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다. 파아지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 키트는 상업적으로 구입 가능하다(예를 들면, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 27-9400-01호; 및 Stratagene SurfZAP™ 파아지 디스플레이 키트, 카탈로그 240612호). 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 데 있어서 이용할 수 있는 다른 방법 및 시약이 또한 존재한다(예를 들면, 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공보 WO 제92/18619호, WO 제91/17271호, WO 제92/20791호, WO 제92/15679호, WO 제93/01288호, WO 제92/01047호, WO 제92/09690호; 문헌[Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)]을 참조하고, 이들은 모두 본원에 참조문헌으로 포함된다).
일 경우에, 원하는 특성을 갖는 인간 항CCR2 항체를 단리하고 생성하기 위해, 본원에 기재된 인간 항CCR2 항체를 처음에 사용하여 PCT 공보 WO 제93/06213호(본원에 참조문헌으로 포함됨)에 기재된 에피토프 각인 방법을 이용하여 CCR2에 대해 유사한 결합 활성을 갖는 인간 중쇄 및 경쇄 서열을 선택한다. 이 방법에서 사용되는 항체 라이브러리는 PCT 공보 WO 제92/01047호, 문헌[McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993), 모두 본원에 참조문헌으로 포함됨]에 기재된 바대로 제조되고 스크리닝되는 scFv 라이브러리일 수 있다. 항원으로서 인간 CCR2를 사용하여 scFv 항체 라이브러리를 스크리닝할 수 있다.
일단 초기 인간 VL 및 VH 도메인이 선택되면, "믹스 앤 매치(mix and match)" 실험을 수행하고, 여기서 CCR2 결합에 대해 초기 선택되는 VL 및 VH 분절의 여러 쌍을 스크리닝하여 VL/VH 쌍 조합을 선택한다. 또한, 항체의 품질을 추가로 개선하기 위해, 자연 면역 반응 동안 항체의 친화도 성숙을 담당하는 생체내 체세포 돌연변이 과정과 유사한 공정으로 바람직하게는 VH 및/또는 VL의 CDR3 구역 내에서 바람직한 VL/VH 쌍(들)의 VL 및 VH 분절을 무작위로 돌연변이시킬 수 있다. 각각 VH CDR3 또는 VL CDR3에 상보적인 PCR 프라이머를 이용하여 VH 및 VL 도메인을 증폭시켜 이 시험관내 친화도 성숙을 수행할 수 있고, 이 프라이머는 몇몇 위치에서 4개의 뉴클레오티드 염기의 임의의 혼합물에 의해 "방해"되어, 얻어진 PCR 산물이 임의의 돌연변이가 VH 및/또는 VL CDR3 구역에 도입되는 VH 및 VL 분절을 코딩된다. CCR2에 대한 결합에 대해 이 임의 돌연변이된 VH 및 VL 분절을 재스크리닝할 수 있다.
재조합 면역글로불린 디스플레이 라이브러리로부터 항CCR2 항체의 스크리닝 및 단리 이후, 선택된 항체를 코딩하는 핵산을 (예를 들면, 파아지 게놈으로부터의) 디스플레이 팩키지로 회수하고 표준 재조합 DNA 기법에 의해 다른 발현 벡터로 서브클로닝할 수 있다. 원하는 경우, 핵산을 추가로 조작하여 본원에 기재된 바대로 다른 항체 형태를 생성할 수 있다. 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리된 재조합 인간 항체를 발현시키기 위해, 항체를 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터로 클로닝하고 본원에 기재된 바대로 포유동물 숙주 세포로 도입한다.
클래스 스위칭
또 다른 양태는 항CCR2 항체의 클래스 또는 서브클래스를 또 다른 클래스 또는 서브클래스로 전환하는 방법을 제공한다. 몇몇 경우에, CL 또는 CH를 코딩하는 서열을 포함하지 않는 VL 또는 VH를 코딩하는 핵산 분자를 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 단리시킨다. 이후, 핵산 분자를 원하는 면역글로불린 클래스 또는 서브클래스로부터 CL 또는 CH를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결시킨다. 본원에 기재된 바대로 CL 또는 CH 쇄를 포함하는 벡터 또는 핵산 분자를 사용하여 이를 성취할 수 있다. 예를 들면, 원래 IgM이었던 항CCR2 항체를 IgG로 클래스 스위칭할 수 있다. 또한, 클래스 스위칭을 이용하여 하나의 IgG 서브클래스를 또 다른 IgG 서브클래스로, 예를 들면 IgG1 또는 IgG2로부터 IgG4로 전환시킬 수 있다. 원하는 이소타입을 포함하는 항체를 생성하는 또 다른 방법은 항CCR2 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 및 항CCR2 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산을 단리시키는 단계, VH 구역을 코딩하는 서열을 단리시키는 단계, VH 서열을 원하는 이소타입의 중쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열에 결찰시키는 단계, 세포에서 경쇄 유전자 및 중쇄 작제물을 발현시키는 단계 및 원하는 이소타입을 갖는 항CCR2 항체를 수집하는 단계를 포함한다.
탈면역화된 항체
또 다른 양태에서, 항체를 탈면역화하여, 예를 들면 PCT 공보 WO 제98/52976호 및 WO 제00/34317호(본원에 참조문헌으로 포함된다)에 기재된 기법을 이용하여 이의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
돌연변이된 항체
또 다른 양태에서, 핵산 분자, 벡터 및 숙주 세포를 사용하여 돌연변이된 항CCR2 항체를 제조할 수 있다. 항체를 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이시켜, 예를 들면 항체의 결합 특성을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, CCR2에 대해 항체의 KD를 증가 또는 감소시키기 위해, koff를 증가 또는 감소시키기 위해 또는 항체의 결합 특이성을 변경시키기 위해 CDR 중 하나 이상을 돌연변이시킬 수 있다. 부위 지정 돌연변이에서의 기법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 Sambrook 등 및 Ausubel 등의 문헌을 참조한다. 또 다른 경우에, 단일클론 항체 4.40, 4.9, 4.22, 4.39 또는 4.40 A68G S230P에서 생식선과 비교하여 변화된 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 하나 이상의 돌연변이가 일어날 수 있다. 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 구역, 또는 불변 도메인에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 일 경우에, 가변 도메인에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 몇몇 경우에, 서열 번호 11, 서열 번호 47, 서열 번호 83, 서열 번호 176, 서열 번호 29, 서열 번호 65, 서열 번호 101, 서열 번호 194 또는 서열 번호 113으로부터 선택되는 아미노산 서열 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 구역에서 생식선과 비교하여 변화된 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 하나 이상의 돌연변이가 일어날 수 있다.
또 다른 양태에서, 프레임워크 구역이 돌연변이되어, 얻어진 프레임워크 구역(들)이 상응하는 생식선 유전자의 아미노산 서열을 갖는다. 항CCR2 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 구역 또는 불변 도메인에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 예를 들면, PCT 공보 WO 제00/09560호를 참조하고, 이것은 본원에 참조문헌으로 포함된다. 항체의 면역원성을 변경 또는 감소시키기 위해, 또 다른 분자에 대한 공유 또는 비공유 결합을 위한 부위를 제공하기 위해, 하나 이상의 글리코실화 부위를 추가 또는 제거하기 위해 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체 의존 세포 매개 세포독성(ADCC)과 같은 특성을 변경시키기 위해 프레임워크 구역 또는 불변 도메인에서의 돌연변이가 또한 일어날 있다. 단일 항체는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 구역 중 임의의 하나 이상에서 또는 불변 도메인에서 돌연변이를 가질 수 있다.
몇몇 경우에, 돌연변이 이전의 항CCR2 항체와 비교하여 돌연변이된 항CCR2 항체의 VH 또는 VL 도메인 중 어느 하나에서 1개 내지 8개의 아미노산 돌연변이(이들 사이의 임의의 숫자를 포함)가 존재한다. 상기 중 어느 하나에서, 하나 이상의 CDR에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 추가로, 임의의 돌연변이는 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 몇몇 경우에, 불변 도메인에서 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 변경이 존재한다.
변형된 항체
또 다른 양태에서, 또 다른 폴리펩티드에 연결된 항CCR2 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체 또는 면역접합체를 제조할 수 있다. 일 경우에, 항CCR2 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 훨씬 또 다른 경우에, 항CCR2 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 연결되고, 항CCR2 항체의 VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 방식으로 제1 폴리펩티드와 회합하는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 훨씬 또 다른 경우에, VH 도메인을 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리시켜 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있다(단일 쇄 항체 하에 아래 참조). 이후, VH-링커-VL 항체가 관심 있는 폴리펩티드에 연결된다. 폴리펩티드를 CCR2 발현 세포 또는 조직에 지시하는 데 융합 항체가 유용하다. 폴리펩티드는 치료제, 예컨대 독소, 케모카인 또는 다른 조절 단백질일 수 있거나, 진단제, 예컨대 용이하게 가시화될 수 있는 효소, 예컨대 겨자무과산화효소일 수 있다. 또한, 2개(또는 2개 이상)의 단일쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체를 생성할 수 있다. 단일 폴리펩티드 쇄 상에 2가 또는 다가 항체를 생성하기를 원하는 경우 또는 2중 특이적 항체를 생성하기를 원하는 경우 이는 유용하다.
단일 쇄 항체(scFv)를 생성하기 위해, VH 및 VL을 코딩하는 DNA 단편이 가요성 링커를 코딩하는, 예를 들면 아미노산 서열(Gly4-Ser)3을 코딩하는 또 다른 단편에 작동적으로 연결되어, VL 및 VH 도메인이 가요성 링커에 의해 연결되면서 VH 및 VL 서열이 인접 단일쇄 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]을 참조한다. 단일 쇄 항체는, 오직 단일 VH 및 VL이 사용되는 경우 1가일 수 있거나, 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우 2가일 수 있거나, 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우 다가일 수 있다. CCR2 및 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 2중 특이적 또는 다가 항체를 생성시킬 수 있다.
또 다른 양태에서, 핵산 분자를 코딩하는 항CCR2 항체를 사용하여 다른 변형된 항체를 제조할 수 있다. 명세서의 교시내용에 따라 표준 분자 생물학적 기법을 이용하여, 예를 들면 "카파 바디"(Ill et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "미니바디"(Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "2항체"(Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)) 또는 "Janusin"(Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992))를 제조할 수 있다.
하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 결합을 비롯한 각종 방법에 의해 2중 특이적 항체 또는 항원 결합 단편을 제조할 수 있다. 예를 들면, 문헌[Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992)]을 참조한다. 또한, 2중 특이적 항체를 "2항체" 또는 "야누신(Janusin)"으로서 형성할 수 있다. 몇몇 경우에, 2중 특이적 항체는 CCR2의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 몇몇 경우에, 2중 특이적 항체는 단일클론 항체 4.40, 4.9 또는 4.40 A68G S230P로부터의 제1 중쇄 및 제1 경쇄 및 추가의 항체 중쇄 및 경쇄를 갖는다. 몇몇 경우에, 추가의 경쇄 및 중쇄는 또한 상기 확인된 단일클론 항체 중 하나로부터 유래하지만, 제1 중쇄 및 경쇄와 상이하다.
몇몇 경우에, 본원에서 제공되는 인간 항CCR2 단일클론 항체로부터의 가변 도메인 또는 CDR 중 하나 이상을 이용하여 본원에 기재된 변형된 항체를 제조한다.
유도된 및 표지된 항체
항CCR2 항체 또는 항원 결합 부분을 또 다른 분자(예를 들면, 또 다른 펩티드 또는 단백질)에 유도체화 또는 연결시킬 수 있다. 일반적으로, CCR2 결합이 유도체화 또는 표지에 의해 부정적으로 영향을 받지 않도록 항체 또는 이의 일부를 유도체화한다. 따라서, 항체 및 항체 일부는 본원에 기재된 인간 항CCR2 항체의 비손상 형태 및 변형 형태 둘 다를 포함하도록 의도된다. 예를 들면, 항체 또는 항체 일부는 (화학 커플링, 유전 융합, 비공유 회합 또는 그외에 의해) 하나 이상의 다른 분자 집합체, 예컨대 또 다른 항체(예를 들면, 2중 특이적 항체 또는 2중 항체), 검출 제제, 세포독성 제제, 약학 제제 및/또는 또 다른 분자에 의한 항체 또는 항체 일부의 회합을 중재할 수 있는 단백질 또는 펩티드(예컨대, 스트렙타비딘 코어 구역 또는 폴리히스티딘 태크)에 기능적으로 연결될 수 있다.
(예를 들면, 2중 특이적 항체를 생성하기 위해 동일한 유형 또는 상이한 유형의) 2개 이상의 항체를 가교결합시켜 유도체화 항체의 하나의 유형을 제조한다. 적합한 크로스링커는 적절한 스페이서에 의해 분리된 2개의 명확히 반응성인 기를 갖는 이종이중기능인 것(예를 들면, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙신이미드 에스테르) 또는 동종이중기능인 것(예를 들면, 디숙신이미딜 수버레이트)을 들 수 있다. 이 링커는 Pierce Chemical Company(미국 일리노이주 록포드)로부터 구입 가능하다.
유도체화 항체의 또 다른 유형은 표지된 항체이다. 항체 또는 항원 결합 부분이 유도체화될 수 있는 유용한 검출 제제로는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 란탄계 형광체 등을 비롯한 형광성 화합물을 들 수 있다. 예컨대, 겨자무과산화효소, β-갈락토시다아제, 루시퍼라제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제 등과 같은 검출에 유용한 효소에 의해 항체를 또한 표지할 수 있다. 항체를 검출 가능한 효소로 표지할 때, 식별할 수 있는 반응 생성물을 생성하는 효소를 사용하는 추가의 시약을 첨가하여 이것을 검출한다. 예를 들면, 겨자무과산화효소 물질이 존재할 때, 과산화수소 및 디아미노벤지딘을 첨가하여 검출 가능한 착색된 반응 생성물이 생성된다. 항체를 또한 바이오틴에 의해 표지할 수 있고, 아비딘 또는 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출할 수 있다. 2차 리포터에 의해 인식된 선결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들면, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그)에 의해 항체를 또한 표지할 수 있다. 몇몇 경우에, 잠재적 입체 장애를 감소시키는 다양한 길이의 스페이서 암에 의해 표지를 부착한다.
방사선 표지된 아미노산에 의해 항CCR2 항체를 또한 표지할 수 있다. 진단학적 및 치료학적 목적 둘 다를 위해 방사선 표지를 사용할 수 있다. 예를 들면, X선 또는 다른 진단학적 기법에 의해 CCR2 발현 종양을 검출하기 위해 방사선 표지를 사용할 수 있다. 추가로, 암성 세포 또는 종양을 위한 독소로서 방사선 표지를 치료학적으로 사용할 수 있다. 폴리펩티드를 위한 표지의 예로는 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I 및 131I의 방사선 동위원소 또는 방사선 핵종을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메틸 또는 에틸 기, 또는 탄수화물 기와 같은 화학 기에 의해 항CCR2 항체를 또한 유도체화할 수 있다. 이 기는 항체의 생물학적 특징을 개선하기에, 예를 들면 혈청 반감기를 증가시키기에 또는 조직 결합을 증가시키기에 유용하다.
몇몇 경우에, 영상화시 검출 가능한 상자성, 방사성 또는 형광성 이온 또는 부분에 의해 항CCR2 항체를 표지할 수 있다.
몇몇 경우에, 상자성 이온은 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 바나듐(Ⅱ), 터븀(Ⅲ), 디스프로슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ) 또는 에르븀(Ⅲ)이다. 다른 경우에, 방사성 이온은 요오드123, 테크네튬99, 인듐111, 레늄188, 레늄186, 구리67, 요오드131, 이트륨90, 요오드125, 아스타틴211 및 갈륨67이다. 다른 경우에, 항CCR2 항체를 X선 조영제, 예컨대 란타늄(Ⅲ), 금(Ⅲ) 납(Ⅱ) 및 비스무트(Ⅲ)로 표지한다.
약학 조성물 및 키트
본 발명은 길항제 특성을 갖는 인간 항CCR2 항체을 포함하는 조성물을 제공한다. 이 조성물은 CCR2가 역할을 하는 간 섬유증, 신장 섬유증, 폐 섬유증, 건선; 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 이식편 거부 반응, 죽상동맥경화증, 비만, HIV 감염, 신경병증성 통증, 허혈, 협착증 및 재협착증 관련 염증, 암, 패혈증, 경피증 및 당뇨병을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 병증을 치료하는 데 유용하다. 몇몇 경우에, C형 간염 바이러스(HCV), B형 간염 바이러스(HBV), 비알콜 지방 간염(NASH) 및 /또는 알콜 유발 지방 간염(ASH)에 의해 매개되는 간 섬유증의 치료이다. 몇몇 경우에, 피험체는 조직, 예컨대 염증성 반응의 부위인 조직에 백혈구 침윤을 감소시킬 필요가 있다. 몇몇 경우에, 치료의 피험체는 인간이다. 다른 경우에, 피험체는 수의학 피험체이다. 염증 감소 또는 백혈구 침윤 감소를 필요로 하는 조직의 예로 뇌, 척수 및 말초 신경 조직, 심장, 혈관, 식도, 위, 소장, 대장, 대장, 전립선, 췌장, 요로, 난소, 유방, 자궁, 고환, 음경, 뼈, 근육, 갑상선, 부신, 뇌하수체, 지방 조직, 골수, 혈액, 흉선, 비장, 림프절, 피부, 눈, 귀 또는 코를 비롯한 연결 조직, 연골, 간, 폐, 신장, 신경 조직을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 일 경우에, 조직은 점막 표면을 갖는 조직이다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용되는 담체"는 생리적으로 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 의미한다. 약학적으로 허용되는 담체의 몇몇 예는, 단순히 실례의 방식으로, 물, 식염수, 인산염 완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합이다. 많은 경우에, 조성물 내 등장화제, 예를 들면 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 약학적으로 허용되는 물질의 추가 예는 습윤제 또는 항체의 반감기 또는 효과를 증강시키는 소량의 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제이다.
조성물은 액체, 반고체 및 고체 제형, 예컨대 액체 용액(예를 들면, 주사용 및 점적용 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포솜 및 좌제와 같은 각종 제형일 수 있다. 제형은 의도하는 투여 방식 및 치료학적 용도에 의존한다. 통상적인 조성물은 주사용 또는 점적용 용액, 예컨대 인간의 수동 면역화에 사용되는 것과 유사한 조성물의 형태이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내)이다. 일 경우에, 항체를 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여한다. 훨씬 또 다른 경우에, 항체를 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여한다.
치료학적 조성물은 통상적으로 제조 및 저장 조건 하에 무균이고 안정해야 한다. 조성물을 용액, 마이크로에멀션, 분산액, 리포솜 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙화된 구조로서 제제화할 수 있다. 적절한 용매 중의 필요한 양의 항CCR2 항체를 필요한 만큼 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 혼입한 후 무균 여과시켜 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 염기성 분산액 매질 및 상기 기재된 것과 다른 필요한 성분을 포함하는 무균 비히클에 혼입하여 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에, 제조의 바람직한 방법은 이의 이미 무균 여과된 용액으로부터 활성 성분 + 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성시키는 동결 건조 및 진공 건조이다. 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 용액의 적절한 유동성을 유지시킬 수 있다. 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 조성물에 포함시켜 주사용 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
당해 분야에서 공지된 각종 방법에 의해 항체를 투여할 수 있지만, 많은 치료학적 용도의 경우, 바람직한 투여 경로/방식은 피하, 근육내 또는 정맥내 주입이다. 당업자가 이해하는 바대로, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 다른 투여 방식으로는 복강내, 기관지내, 경점막, 척수내, 활막내, 대동맥내, 비강내, 눈, 귀, 국소 및 협측,및 종양내를 들 수 있다.
몇몇 경우에, 이식, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제제와 같은 신속한 방출에 대해 항체를 보호하는 담체에 의해 항체 조성물의 활성 화합물을 제조할 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리언하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생체 분해성, 생체 적합성 중합체를 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하기 위한 많은 방법이 특허 허여되거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)]을 참조한다.
추가의 활성 화합물을 또한 조성물에 혼입할 수 있다. 몇몇 경우에, 억제제 항CCR2 항체를 하나 이상의 추가의 치료학적, 진단학적 또는 예방학적 제제와 함께 공동 제제화 및/또는 병용 투여한다. 치료제로는 상이한 미세 특이성을 갖는 항CCR2 항체, 다른 표적에 결합하는 항체, 광감제, 안드로겐, 에스트로겐, 비스테로이드성 항염증제, 항고혈압제, 진통제, 항우울제, 항생제, 항암제, 마취제, 진토제, 항감염제, 피임약, 항당뇨병제, 스테로이드제, 항알레르기제, 화학치료제, 편두통 치료제, 금연용 제제, 항바이러스제, 면역억제제, 혈전용해제, 콜레스테롤 저하제 및 항비만제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
치료제는 또한 CCR2를 억제하는 펩티드 유사체, MCP-1, MCP-2, MCP-3 또는 MCP-4에 결합하고 CCR2에 대한 이의 결합을 방지하는 항체 또는 다른 분자 및 CCR2 발현을 억제하는 제제를 포함한다. 일 경우에, CCR2 발현을 억제하는 추가의 제제는 헤어핀 RNA 또는 siRNA과 같은 CCR2 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 안티센스 핵산을 포함한다. RNA 간섭에 의해 유전자 기능을 억제할 수 있는 서열 특이적 핵산은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 조합 요법은 적은 용량의 억제제 항CCR2 항체, 및 병용 투여되는 제제를 필요로 할 수 있고, 따라서 다양한 단일요법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 회피한다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 항미생물제이다. 항미생물제로는 항생제(예를 들면, 항박테리아제), 항바이러스제, 항진균제 및 항원충제를 들 수 있다. 항미생물제의 예로 설폰아미드, 트리메토프림-설파메톡사졸, 퀴놀론, 페니실린 및 세팔로스포린을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 케모카인 길항제, CCR2 길항제, MCP-1 길항제 또는 CCR5 길항제이다. CCR2 길항제 또는 MCP-1 길항제로는 MCP-1과 관련된 항체(미국 특허 제7,202,343호, 제US2005/0025768호, 제US2006/0039913호, 제US2006/0246069호 및 제US2004/004/0047860호); 테트라하이드로피라닐 사이클로펜틸 벤질아미드 화합물(제US2006/0116421호); 헤테로아릴피페리딘 화합물(제US2005/0250781호); 피페리디닐 사이클로펜틸 아릴 벤질아미드 화합물(제US2006/0173013호); 사이클릭 아민 화합물(미국 특허 제6,140,349호 및 미국 특허 제6,476,054호); 사이클로펜틸 화합물(제US2002/0049222호 및 미국 특허 제6,545,023호); 테트라하이드로피라닐 사이클로펜틸 테트라하이드로피리도피페리딘화합물(제US2004/0167156호, 미국 특허 제6,812,234호 및 미국 특허 제7,230,008호); 아미노사이클로펜틸 축합 헤테로트리사이클릭아미드 화합물(제US2007/0004714호); 피페리디닐-알파-아미노아미드 화합물(제US2005/0250814호); 치환된 피라졸 화합물(제WO06/88813호); 테트라하이드로피라닐 사이클로펜틸 헤테로사이클릭 아미드 화합물(제US2006/0178363호); 7원 및 8원 헤테로사이클릭 사이클로펜틸 벤질아미드 화합물(제US2006/0183731호); 벤즈옥사지닐-아미도사이클로펜틸-헤테로사이클릭 화합물(제US2006/0069088호); 3-아미노사이클로펜탄카르복사미드 화합물(제US2007/0149532호); 질소 함유 헤테로사이클릭 화합물(제US2007/0155713호); 트리아졸릴 페닐 벤젠설폰아미드 화합물(제WO08/10934호); 치환된 피롤리딘 유도체(제US2004/0186140호); 치환된 벤즈아미드 및 치환된 페닐카바메이트 유도체(미국 특허 제7,087,604호); 치환된 사이클로알킬아민 화합물(제US2005/0054626호); 치환된 비사이클로알킬아민 화합물(제US2005/0227960호); 피롤리디논 및 피롤리딘-티온 화합물(제US2003/0149081호, 미국 특허 제6,727,275호 및 미국 특허 제6,936,633호); 머캅토이미다졸 화합물(제US2007/0244138호); 치환된 디피페리딘 화합물(제US2007/0197590호); 페닐아미노 치환된 4차 염 화합물(제US2006/0293379호); 비사이클릭 및 브릿지된 질소 헤테로사이클(제US2006/0074121호); 3-아미노사이클로펜탄카르복사미드 화합물(제US2006/0020133호); 3-(4-헤테로아릴사이클로헥실아미노)사이클로펜탄카르복사미드 화합물(제US2005/0267146호); 트리아졸로 화합물(미국 특허 제6,492,364호); 헤테로아릴 설폰아미드 화합물(제US2006/0173019호); 아릴 설폰아미드(미국 특허 제6,939,885호); 비스-아릴 설폰아미드(미국 특허 제7,227,035호 및 제US2004/0167113호); 치환된 벤즈아미드 화합물(미국 특허 제6,821,964호); 치환된 디아제팜 화합물(제US2007/0249589호); 트리아자스피로[5.5]운데칸 유도체(제US2005/267114호); 치환된 피페리딘카르복사미드 화합물(제US2003/0114443호 및 제US6,562,978호); 벤자제핀 유도체(제US2004/0235822호 및 미국 특허 제7,262,185호)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
선택되는 경우에, CCR2 항체와 함께 공동 제제화되거나 병용 투여되는 케모카인 길항제는 화학적으로 4,4-디플루오로-N-{(1S)-3-[엑소-3-(3-이소프로필-5-메틸-4H-1,2,4-트리아졸-4-일)-8-아자비사이클로[3.2.1]옥트-8-일]-1-페닐프로필}사이클로헥산카르복사미드로 공지된 SELZENTRY™(마라비록)이다:
Figure pct00002
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 CB-1 수용체 길항제이다. 본원에서 사용되는 "CB-1 수용체"란 용어는 G-단백질 결합된 1형 카나비노이드 수용체를 의미한다. "길항제"란 용어는 완전 길항제 및 부분 길항제 둘 다 및 역효능제를 포함한다. CB-1 수용체 길항제는 CB-1 수용체에 선택적일 수 있다. "선택적인 CB-1 수용체"는 카나비노이드-2 수용체(CB-2)을 길항하는 활성이 없거나 거의 없는 화합물을 의미한다. CB-1 길항제는 CB-2 수용체와 비교하여 CB-1 수용체에 대해 적어도 약 10배 선택적일 수 있다. 예를 들면, CB-1 수용체를 길항하는 억제제 농도(IC50)는 CB-2 수용체를 길항하는 것보다 약 10배 낮다. 적합한 CB-1 수용체 길항제로는 미국 특허 제5,462,960호; 제5,596,106호; 제5,624,941호; 제5,747,524호; 제6,017,919호; 제6,028,084호; 제6,432,984호; 제6,476,060호; 제6,479,479호; 제6,518,264호; 및 제6,566,356호; 미국 특허 공보 제2003/0114495호; 제2004/0077650호; 제2004/0092520호; 제2004/0122074호; 제2004/0157838호; 제2004/0157839호; 제2004/0214837호; 제2004/0214838호; 제2004/0214855호; 제2004/0214856호; 제2004/0058820호: 제2004/0235926호; 제2004/0259887호; 제2005/0080087호; 제2005/0026983호 및 제2005/0101592호; PCT 특허 공보 제WO 03/075660호; 제WO 02/076949호; 제WO 01/029007호; 제WO 04/048317호; 제WO 04/058145호; 제WO 04/029204호; 제WO 04/012671호; 제WO 03/087037호; 제WO 03/086288호; 제WO 03/082191호; 제WO 03/082190호; 제WO 03/063781호; 제WO 04/012671호; 제WO 04/013120호; 제WO 05/020988호; 제WO 05/039550호; 제WO 05/044785호; 제WO 05/044822호; 및 제WO 05/049615호: 2004년 12월 6일자에 출원된 PCT 특허 출원 제PCT/IB2004/004050호; 2004년 12월 6일자에 출원된 제PCT/IB2004/004017호; 2004년 12월 6일자에 출원된 제PCT/IB2004/004023호; 및 2004년 12월 6일자에 출원된 제PCT/IB2004/004019호; 및 2003년 11월 21일자에 출원된 미국 가출원 제60/523937호; 2003년 12월 16일자에 출원된 제60/529908호; 2003년 12월 16일자에 제60/529909호; 2003년 12월 16일자에 출원된 제60/529910호; 2003년 12월 16일자에 출원된 제60/530012호; 및 2004년 4월 21일자에 출원된 제60/564648호에 개시된 화합물을 들 수 있다. 상기 특허 및 특허 출원 모두는 본원에 참조문헌으로 포함된다. 상기 방법에서 사용하기에 바람직한 CB-1 수용체 길항제로는 Sanofi-Synthelabo로부터 구입 가능하거나 미국 특허 제5,624,941호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 리모나반트(또한 상품명 Acomplia™ 하에 공지된 SR141716A); Tocris™(미국 미주리주 엘리스빌)로부터 구입 가능한 N-(피페리딘-1-일)-1-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-요오도페닐)-4-메틸-1H-피라졸-3-카르복사미드(AM251); 미국 특허 제6,645,985호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 [5-(4-브로모페닐)-1-(2,4-디클로로-페닐)-4-에틸-N-(1-피페리디닐)-1H-피라졸-3-카르복사미드](SR147778); PCT 특허 공보 제WO 03/075660호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 N-(피페리딘-1-일)-4,5-디페닐-1-메틸이미다졸-2-카르복사미드, N-(피페리딘-1-일)-4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-클로로페닐)-1-메틸이미다졸-2-카르복사미드, N-(피페리딘-1-일)-4,5-디-(4-메틸페닐)-1-메틸이미다졸-2-카르복사미드, N-사이클로헥실-4,5-디-(4-메틸페닐)-1-메틸이미다졸-2-카르복사미드, N-(사이클로헥실)-4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-클로로페닐)-1-메틸이미다졸-2-카르복사미드 및 N-(페닐)-4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-클로로페닐)-1-메틸이미다졸-2-카르복사미드; 미국 특허 공보 제2004/0092520호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 1-[9-(4-클로로-페닐)-8-(2-클로로-페닐)-9H-푸린-6-일]-4-에틸아미노-피페리딘-4-카르복실산의 하이드로클로라이드, 메실레이트 및 베실레이트 염; 미국 특허 공보 제2004/0157839호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 1-[7-(2-클로로-페닐)-8-(4-클로로-페닐)-2-메틸-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일]-3-에틸아미노-아제티딘-3-카르복실산 아미드 및 1-[7-(2-클로로-페닐)-8-(4-클로로-페닐)-2-메틸-피라졸로[1,5-a][1,3,5]트리아진-4-일]-3-메틸아미노-아제티딘-3-카르복실산 아미드; 미국 특허 공보 제2004/0214855호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 3-(4-클로로-페닐)-2-(2-클로로-페닐)-6-(2,2-디플루오로-프로필)-2,4,5,6-테트라하이드로-피라졸로[3,4-c]피리딘-7-온, 2-(2-클로로-페닐)-3-(4-에틸-페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-4,5-디하이드로-2H-피롤로[3,4-c]피라졸-6-온 및 2-(2-클로로-페닐)-3-(4-이소프로필-페닐)-5-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-4,5-디하이드로-2H-피롤로[3,4-c]피라졸-6-온; 미국 특허 공보 제2005/0101592호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 3-(4-클로로-페닐)-2-(2-클로로-페닐)-7-(2,2-디플루오로-프로필)-6,7-디하이드로-2H,5H-4-옥사-1,2,7-트리아자-아줄렌-8-온; 미국 특허 공보 제2004/0214838호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 2-(2-클로로-페닐)-6-(2,2,2-트리플루오로-에틸)-3-(4-트리플루오로메틸-페닐)-2,6-디하이드로-피라졸로[4,3-d]피리미딘-7-온; PCT 특허 공보 제WO 02/076949호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 (S)-4-클로로-N-{[3-(4-클로로-페닐)-4-페닐-4,5-디하이드로-피라졸-1-일]-메틸아미노-메틸렌}-벤젠설폰아미드(SLV-319) 및 (S)-N-{[3-(4-클로로-페닐)-4-페닐-4,5-디하이드로-피라졸-1-일]-메틸아미노-메틸렌}-4-트리플루오로메틸-벤젠설폰아미드(SLV-326); 미국 특허 제6,432,984호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 N-피페리디노-5-(4-브로모페닐)-1-(2,4-디클로로페닐)-4-에틸피라졸-3-카르복사미드; 미국 특허 제6,518,264호에 기재한 바대로 제조할 수 있는 1-[비스-(4-클로로-페닐)-메틸]-3-[(3,5-디플루오로-페닐)-메탄설포닐-메틸렌]-아제티딘; PCT 특허 공보 제WO 04/048317호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 2-(5-(트리플루오로메틸)피리딘-2-일옥시)-N-(4-(4-클로로페닐)-3-(3-시아노페닐)부탄-2-일)-2-메틸프로판아미드; 미국 특허 제5,747,524호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 4-{[6-메톡시-2-(4-메톡시페닐)-1-벤조푸란-3-일]카보닐}벤조니트릴(LY-320135); 제WO 04/013120호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 1-[2-(2,4-디클로로페닐)-2-(4-플루오로페닐)-벤조[1,3]디옥솔-5-설포닐]-피페리딘; 및 제WO 04/012671호에 기재된 바대로 제조할 수 있는 [3-아미노-5-(4-클로로페닐)-6-(2,4-디클로로페닐)-푸로[2,3-b]피리딘-2-일]-페닐-메타논을 들 수 있다
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 혈관 생성 유도 인자이다. 혈관 생성 유도 인자로는 염기성 섬유아세포 성장 인자, 산성 섬유아세포 성장 인자, 혈관 내피 성장 인자, 엔지오제닌, 종양 증식 인자 α 및 β 종양 괴사 인자, 안지오포이에틴, 혈소판 유도 성장 인자, 태반 성장 인자, 간세포 성장 인자 및 프로리페린을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 혈전용해제이다. 혈전용해제로는 유로키나아제 플라스미노겐 활성제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, α2-플라스민 억제제의 억제제 및 플라스미노겐 활성제 억제제-1의 억제제, 안지오텐신 전환 효소(ACE) 억제제, 스피로놀락톤, 조직 플라스미노겐 활성제(tPA), 인터류킨 1알파-전환 효소의 억제제, 안티트롬빈 III 등을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 항비만제이다. 항비만제로는 apo-B/MTP 억제제, 11β-하이드록시 스테로이드 디하이드로게나제-1 억제제, 펩티드 YY3 -36 또는 이의 유사체, MCR-4 효능제, CCK-A 효능제, 모노아민 재흡수 억제제, 교감신경흥분제, β3 아드레날린 수용체 효능제, 도파민 효능제, 멜라닌 세포 자극 호르몬 수용체 유사체, 5-HT2c 수용체 효능제, 멜라닌 농축 호르몬 길항제, 렙틴, 렙틴 유사체, 렙틴 수용체 효능제, 갈라닌 길항제, 리파제 억제제, 봄베신 효능제, 뉴로펩티드-Y 수용체 길항제, 갑상선 호르몬 유사 제제, 디하이드로에피안드로스테론 또는 이의 유사체, 글루코코르티코이드 수용체 길항제, 오렉신 수용체 길항제, 글루카곤양 펩티드-1 수용체 효능제, 섬모 향신경성 인자, 인간 아구티 관련 단백질 길항제, 그렐린 수용체 길항제, 히스타민 3 수용체 길항제 또는 역효능제 및 뉴로메딘 U 수용체 효능제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 혈관 손상의 부위에 호중구 및/또는 단핵 세포의 동원 및/또는 접착을 억제하는 제제이다. 이러한 치료제는, 예를 들면 세포 접착, 주화성 및/또는 호밍(homing)이 매개되는 세포 표면 분자의 활성(예를 들면, 결합 활성, 신호 전달 활성)을 억제할 수 있다. 예를 들면, 세포 접착 분자의 길항제(예를 들면, 인테그린(예를 들면, β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8 인테그린), 설렉틴(예를 들면, E-설렉틴, P-설렉틴, L-설렉틴), 카드헤린(예를 들면, E-, P-, N-카드헤린) 및 면역글로불린 슈퍼패밀리 접착 분자(예를 들면, LFA-2, LFA-3, CD44)) 및 사이토카인 수용체의 길항제(예를 들면, 케모카인 수용체 기능의 길항제)는 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화하고/하거나 병용 투여할 수 있다. 또한, 세포 접착 분자 또는 사이토카인 또는 케모카인의 리간드에 결합하고 호중구 및/또는 단핵 세포 상에 발현되는 수용체에 대한 리간드의 결합을 억제하는 제제를 또한 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화하고/하거나 병용 투여할 수 있다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 심장 치료제이다. 심장 질환을 치료하도록 의도되는 치료제의 예로는 성장 인자, 혈관 생성 유도 제제, 칼슘 채널 차단제, 항고혈압제, 수축력 촉진제, 항죽종형성제, 항응혈제, β-차단제, 항부정맥제, 강심 배당체, 항염증제, 항생제, 항바이러스제, 항진균제 및 원생동물 감염을 억제하는 제제 및 항종양제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 칼슘 채널 차단제이다. 칼슘 채널 차단제로는 디하이드로피리딘, 예컨대 니페디핀, 니카르디핀, 니모디핀 등; 벤조티아제핀, 예컨대 딜리타젬; 페닐알킬아민, 예컨대 베라파밀; 디아릴아미노프로필아민 에테르, 예컨대 베프리딜; 및 벤즈이미돌-치환된 테트랄린, 예컨대 미베프라딜을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 항고혈압제이다. 항고혈압제로는 이뇨제, 예를 들면 티아자이드, 예컨대 하이드로클로로티아자이드, 푸로세마이드, 스피로놀락톤, 트리암테렌 및 아밀로라이드; 항아드레날린제, 예를 들면 클로니딘, 구아나벤즈, 구안파신, 메틸도파, 트리메타판, 레세르핀, 구아네티딘, 구아나드렐, 펜톨아민, 페녹시벤즈아민, 프라조신, 테라조신, 독사조신, 프로파놀롤, 메토프롤롤, 나돌롤, 아테놀롤, 티몰로로, 베타솔롤, 카르테올롤, 핀돌롤, 아세부톨롤, 라베탈롤; 혈관확장제, 예를 들면 히드랄리진, 미녹시딜, 디아족사이드, 니트로프루지트; 및 안지오텐신 전환 효소 억제제, 예를 들면 캅토프릴, 베나제프릴, 에날라프릴, 에날라프릴라트, 포시노프릴, 리시노프릴, 퀴나프릴, 라미프릴; 안지오텐신 수용체 길항제, 예컨대 로사르탄; 및 칼슘 채널 길항제, 예를 들면 니페디핀, 암로디핀, 펠로디핀 XL, 이사디핀, 니카르디핀, 벤조티아제핀(예를 들면, 딜티아젬) 및 페닐알킬아민(예를 들면, 베라파밀)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 항응혈제이다. 항응혈제로는 헤파린, 와파린, 히루딘, 벼룩 항응혈제 펩티드, 저분자량 헤파린, 예컨대 에녹사파린, 달테파린 및 아르데파린, 티클로피딘, 다나파로이드, 아르가트로반, 압시시맙 및 티로피반을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 항부정맥제이다. 항부정맥제로는 나트륨 채널 차단제(예를 들면, 리도카인, 프로카인아미드, 엔카이니드, 플레카니드, 등), 베타 아드레날린 차단제(예를 들면, 프로프라놀롤), 활동 전위 기간의 연장제(예를 들면, 아미오다론) 및 칼슘 채널 차단제(예를 들면, 베르파밀, 딜티아젬, 염화니켈 등)를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 심장 억제제(예를 들면, 리도카인), 심장 자극제(예를 들면, 이소프로테레놀, 도파민, 노르에피네프린 등) 및 다발성 심장 제제의 조합(예를 들면, 심방 세동을 치료하기 위한 디곡신/퀴니딘)의 전달이 또한 관심 있다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는 울혈성 심부전을 치료하는 제제이다. 울혈성 심부전을 치료하는 제제의 예로는 강심 배당체, 수축력 촉진제, 세포외 루프 이뇨제, 티아자이드 이뇨제, 칼륨 이온 보존형 이뇨제, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 안지오텐신 수용체 길항제, 니트로 혈관확장제, 포스포디에스테라제 억제제, 직접 혈관확장제, α1-아드레날린 수용체 길항제, 칼슘 채널 차단제 및 교감신경흥분제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 구체적인 경우에, 억제제 항CCR2 항체와 함께 공동 제제화되고/되거나 병용 투여되는 치료제(들)는, 예컨대 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린 및 페닐에프린을 비롯한 심근증을 치료하는 데 적합한 제제이다.
본 발명은 또한 일정량의 항체를 일정량의 항바이러스제와 조합하여 포함하는 포유동물에서 바이러스 감염, 특히 HIV 감염을 억제하기 위한 조성물로서, 일정량의 항CCR2 항체와 일정량의 항바이러스제가 함께 바이러스 복제, 새로운 세포의 바이러스 감염 또는 바이러스 부하를 억제하는 데 효과적인 조성물을 제공한다. 뉴클레오시드 유사체(예를 들면, AZT, 3TC 및 ddl), 프로테아제 억제제 및 케모카인 수용체 길항제를 비롯한 많은 항바이러스제가 현재 당해 분야에서 공지되어 있고, 바이러스 감염이 아니라 HIV 감염을 억제할 수 있다.
또 다른 양태에서, 항CCR2 항체 또는 이의 단편을 염증성 질환, 예컨대 관절염, 죽상동맥경화증 또는 다발성 경화증을 앓는 환자에게 다른 치료제, 예컨대 항염증성 약물 또는 분자와 함께 병용 투여할 수 있다. 일 양태에서, 본 발명은 항염증제와 병용되는 화합물의 치료학적 유효량을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 염증성 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 항염증제로는 임의의 공지된 비스테로이드성 항염증제, 예컨대 살리실산 유도체(아스피린), 파라-아미노페놀 유도체(아세트아미노펜), 인돌 및 인덴 아세트산(인도메탄신), 헤테로아릴 아세트산(케토롤락), 아릴프로피온산(이부프로펜), 안트라닐산(메페남산), 에놀산(옥시캄) 및 알카논(나부메톤) 및 이의 상대적 글루코코르티코이드(대사) 및 무기질 코르티코이드(전해질 조절) 활성과 관련되는 코르티코스테로이드 및 생물학적 활성 합성 유사체를 포함하는 임의의 공지된 스테로이드성 항염증제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또 다른 경우에, 비스테로이드성 항염증성 약물, 예컨대 아스피린(Bayer, Bufferin), 이부프로펜(Motrin, Advil), 나프록센 나트륨(Aleve), 케토프로펜(Orudis KT), 인도메탄신(Indocin), 에토돌락(Lodine), 디클로페낙 나트륨(Voltaren), 로펙콕시브(Vioxx), 셀레콕시브(Celebrex), 나부메톤(Relafen)과 병용하여 또는 스테로이드, 예컨대 프레드니손, 프레드니솔론, 엑사메타손, 베클로메타손, 부데소나이드, 플루티카손 또는 트리암시놀론과 병용하여 항CCR2 항체를 투여한다.
또한, 염증의 치료에 사용되는 다른 약물로는 길항제, 예컨대 모든 히스타민 및 브래디키닌 수용체 길항제, 류코트리엔 및 프로스타글란딘 수용체 길항제 및 혈소판 활성 인자 수용체 길항제를 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 훨씬 또 다른 경우에, 방사선 요법, 화학 요법, 광역학 요법, 수술 또는 다른 면역요법 치료, 즉 면역계를 치료하는 요법과 함께 항체 또는 병용 요법을 투여한다. 훨씬 또 다른 경우에, 또 다른 항체와 함께 항체를 투여한다. 예를 들면, 염증을 억제하는 것으로 공지된 항체 또는 다른 제제, 예를 들면 알파-4 인테그린(제2004/0009169호) 또는 IL-8 수용체(제US2004/0037830호)를 억제하는 항체 또는 제제와 함께 항CCR2 항체를 투여할 수 있다. 항CCR2 항체와 함께 병용 투여할 수 있는 추가의 항체는 미국 특허 제6,6965,50호; 제6,406,865호; 제6,352,832호; 및 제6,084,075호에 기재되어 있고, 이들의 내용은 본원에 참조문헌으로 포함된다.
상기 조성물은 항체 또는 항원 결합 부분의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"은 원하는 치료학적 결과를 성취하기에 필요한 용량에서 및 시간 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 항체 또는 항체 일부분의 치료학적 유효량은 객체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자 및 객체에서 원하는 반응을 얻기 위한 항체 또는 항체 일부분의 능력에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효량은 또한 항체 또는 항체 일부분의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 치료학적으로 유리한 효과가 큰 것이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 성취하기에 필요한 용량에서 및 시간 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 통상적으로, 예방학적 용량이 질환 상태 이전에 또는 조기에 피험체에서 사용되므로, 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적을 수 있다.
용량 요법을 조정하여 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스를 투여할 수 있고, 몇몇 분리 용량을 시간에 따라 투여할 수 있거나, 치료학적 상황의 긴급 사태에 의해 표시되는 바대로 용량을 비례하여 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여 용이성 및 용량 균일성을 위해 단위 제형으로 비경구 조성물을 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 단위 제형은 치료하고자 하는 포유동물 피험체에 대한 단일 용량으로서 적합한 물리적인 별개 단위를 의미하고, 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 회합된 원하는 치료학적 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 선결정된 분량을 포함한다. 단위 제형에 대한 설명서는 (a) 항CCR2 항체 또는 이의 일부분의 독특한 특징 및 성취하고자 하는 특정한 치료학적 또는 예방학적 효과 및 (b) 객체에서 과민증 치료를 위한 이러한 항체를 배합하는 데 있어 당해 분야에 고유한 제한에 의해 설명되고, 직접적으로 이에 따라 달라진다.
항체 또는 항체 일부분의 치료학적 또는 예방학적 유효량을 위한 비제한적인 범위의 예는 0.025 내지 50 ㎎/kg, 0.1 내지 50 ㎎/kg, 0.1 내지 25, 0.1 내지 10 또는 0.1 내지 3 ㎎/kg이다. 일 경우에, pH 범위가 약 5.0 내지 약 6.5이고, 약 1 ㎎/ml 내지 약 200 ㎎/ml의 항체, 약 1 밀리몰 내지 약 100 밀리몰의 히스티딘 완충액, 약 0.01 ㎎/ml 내지 약 10 ㎎/ml의 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 약 100 밀리몰 내지 약 400 밀리몰의 비환원 당(트레할로스 또는 수크로스로부터 선택되지만 이들로 제한되지는 않음), 약 0.01 밀리몰 내지 약 1.0 밀리몰의 이나트륨 EDTA 2수화물을 포함하고, 킬레이트화제 이외에 약학적으로 허용되는 항산화제를 임의로 포함하는 무균 수용액으로서 항체를 제제 중에 투여할 수 있다. 적합한 항산화제로는 메티오닌, 나트륨 티오설페이트, 카탈라아제 및 백금을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, 조성물은 메티오닌을 1 mM 내지 약 100 mM 범위, 특히 약 27 mM인 농도로 포함할 수 있다. 몇몇 경우에, 제제는 20 mM 나트륨 시트레이트(pH 5.5), 140 mM NaCl 및 0.2 ㎎/ml 폴리소르베이트 80의 완충액 중에 5 ㎎/ml의 항체를 포함한다. 용량 값은 경감시키고자 하는 병증의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있는 것을 유의한다. 임의의 특정 피험체에 대해, 시간에 따라 객체 필요 및 조성물을 투여하거나 그 투여를 감시하는 사람의 전문적 판단에 따라 특정한 용량 요법을 조정해야 하는 것으로 추가로 이해되고, 본원에 기재된 용량 범위는 단지 예시적이고 청구된 조성물의 범위 또는 실행을 제한하지 않는 것으로 의도된다.
또 다른 양태는 항CCR2 또는 항원 결합 부분, 또는 이 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는, 항체 또는 조성물 이외에, 진단제 또는 치료제를 포함할 수 있다. 키트는 진단학적 또는 치료학적 방법에서 사용하기 위한 지시 및 팩키징 물질, 예컨대 아이스, 드라이 아이스, STYROFOAM™, 발포체(foam), 플라스틱, 셀로판, 수축성 랩, 버블 랩, 판지 및 전분 땅콩(이들로 제한되지는 않음)을 포함할 수 있다. 일 경우에, 키트는 항체 또는 항체를 포함하는 조성물 및 본원에 기재된 방법에서 사용할 수 있는 진단제를 포함한다. 훨씬 또 다른 경우에, 키트는 항체 또는 항체를 포함하는 조성물 및 본원에 기재된 방법에서 사용할 수 있는 하나 이상의 치료제를 포함한다.
본 발명은 일정량의 항체를 일정량의 화학치료제와 조합하여 포함하는 포유동물에서 암을 억제하기 위한 조성물 및 키트로서, 일정량의 화합물, 염, 용매화물 또는 프로드럭 및 일정량의 화학치료제가 함께 비정상 세포 성장을 억제하는 데 효과적인 조성물 및 키트를 제공한다. 많은 화학치료제가 현재 당해 분야에서 공지되어 있다. 몇몇 경우에, 화학치료제는 유사분열 억제제, 알킬화제, 대사길항물질, 인터칼레이트성 항생제, 케모카인 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포아이소머라제 억제제, 생물학적 반응 조절물질, 항호르몬, 예를 들면 항안드로겐 및 항혈관신생제로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
진단학적 사용 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 진단 방법을 제공한다. 시험관내 또는 생체내 생물학적 샘플에서 CCR2를 검출하기 위해 항CCR2 항체를 사용할 수 있다. 일 경우에, 본 발명은 항체를 피험체에게 주사하는 단계, 위치 확인에 의해 피험체에서 항체가 결합된 CCR2 발현을 결정하는 단계, 피험체에서의 발현을 정상 기준 피험체 또는 표준 피험체에서의 발현과 비교하는 단계 및 세포의 존재 또는 위치를 진단하는 단계를 포함하는, CCR2 발현 세포의 존재 또는 위치의 진단을 필요로 하는 피험체에서 CCR2 발현 세포의 존재 또는 위치를 진단하는 방법을 제공한다. 염증에 대한 및/또는 면역 세포, 예컨대 단핵구의 조직으로의 침윤에 대한 마커로서 항CCR2 항체를 또한 사용할 수 있다.
ELISA, RIA, 유세포 측정법, 조직 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 면역침강을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 종래 면역분석에서 항CCR2 항체를 사용할 수 있다. 인간으로부터 CCR2를 검출하기 위해 항CCR2 항체를 사용할 수 있다. 또 다른 경우에, 사이노몰거스 원숭이 또는 레서스 원숭이로부터 CCR2를 검출하기 위해 항CCR2 항체를 사용할 수 있다. 또 다른 경우에, 설치류, 예컨대 마우스 및 랫트로부터 CCR2를 검출 검출하기 위해 항CCR2 항체를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 생물학적 샘플을 항CCR2 항체와 접촉시키는 단계 및 결합 항체를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플에서 CCR2를 검출하는 방법을 제공한다. 일 경우에, 검출 가능한 표지에 의해 항CCR2 항체를 직접 표지한다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체(제1 항체)를 표지할 수 없고, 항CCR2 항체에 결합할 수 있는 제2 항체 또는 다른 분자를 표지할 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 바대로, 제1 항체의 특정한 종 및 클래스에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체를 선택한다. 예를 들면, 항CCR2 항체가 인간 IgG인 경우, 제2 항체는 항인간-IgG이다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자로는 단백질 A 및 단백질 G를 들 수 있지만, 이들로 제한되는 않고, 둘 다 예를 들면 Pierce Chemical Co.로부터 상업적으로 구입 가능하다.
항체 또는 2차 항체에 적합한 표지가 상기 개시되어 있고, 다양한 효소, 보결분자단, 형광성 물질, 발광성 물질 및 방사성 물질을 들 수 있다. 적합한 효소의 예로는 겨자무과산화효소, 알칼리 포스파타제, β-갈락토시다아제 또는 아세틸콜린에스테라제를 들 수 있고, 적합한 보결분자단 복합체의 예로는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴을 들 수 있고, 적합한 형광성 물질의 예로는 엄벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 들 수 있고, 발광성 물질의 예로는 루미놀을 들 수 있고, 적합한 방사성 물질의 예로는 125I, 131I, 35S 또는 3H를 들 수 있다.
다른 경우에, 검출 가능한 물질에 의해 표지된 CCR2 표준품 및 표지할 수 없는 항CCR2 항체를 사용하여 경쟁 면역분석에 의해 생물학적 샘플에서 CCR2를 평가할 수 있다. 이러한 분석에서, 생물학적 샘플, 표지된 CCR2 표준품 및 항CCR2 항체를 합하고 표지할 수 없는 항체에 결합하는 표지된 CCR2 표준품의 양을 측정한다. 생물학적 샘플에서 CCR2의 양은 항CCR2 항체에 결합하는 표지된 CCR2 표준품의 양에 역비례한다.
수많은 목적을 위해 상기 개시된 면역분석을 이용할 수 있다. 예를 들면, 배양된 세포에서 CCR2를 검출하기 위해 항CCR2 항체를 사용할 수 있다. 일 경우에, 다양한 화합물에 의해 치료된 세포의 표면 상에 CCR2의 양을 결정하기 위해 항CCR2 항체를 사용한다. CCR2 단백질 수치를 조절하는 화합물을 확인하기 위해 상기 방법을 이용할 수 있다. 상기 방법에 따르면, 세포의 하나의 샘플을 일정 시간 기간 동안 시험 화합물로 처리하고, 또 다른 샘플을 처리하지 않고 둔다. 전체 CCR2 발현을 측정하고자 하는 경우, 세포를 용리시키고, 본원에 기재된 면역분석 중 하나를 이용하여 전체 CCR2 발현을 측정한다. 시험 화합물의 효과를 측정하기 위해 치료 세포 대 비치료 세포에서의 전체 CCR2 발현을 비교한다.
전체 CCR2 발현을 측정하기 위한 바람직한 면역분석은 유세포 측정법 또는 면역조직화학이다. 세포 표면 CCR2 발현을 측정하고자 하는 경우, 세포를 용리시키지 않고, 본원에 기재된 면역분석 중 하나를 이용하여 CCR2의 세포 표면 수치를 측정한다. CCR2의 세포 표면 수치를 결정하기 위한 바람직한 면역분석은 세포 표면 단백질을 검출 가능한 표지, 예컨대 바이오틴 또는 125I에 의해 표지하는 단계, CCR2를 항CCR2 항체에 의해 면역침강시키는 단계 및 표지된 CCR2를 검출하는 단계를 포함한다.
CCR2의 편재, 예를 들면 세포 표면 수치를 결정하기 위한 또 다른 면역분석은 면역조직화학의 사용에 의한다. CCR2의 세포 표면 수치를 검출하는 면역분석은 적절한 형광단, 예컨대 플루오레세인 또는 피코에리트린에 의해 표지된 항CCR2 항체의 결합 및 유세포 측정법을 이용한 1차 항체의 검출을 포함한다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체는 표지할 수 없고, 항CCR2 항체에 결합할 수 있는 제2 항체 또는 다른 분자를 표지한다. ELISA, RIA, 유세포 측정법, 웨스턴 블롯, 면역조직화학, 내재성 막 단백질의 세포 표면 표지 및 면역침강과 같은 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 상기 Harlow 및 Lane 문헌을 참조한다. 또한, CCR2의 활성화 또는 억제에 대해 수많은 화합물을 시험하기 위해 고속 탐색 스크리닝을 위해 면역분석의 규모를 증가시킬 수 있다.
조직에서 또는 조직으로부터 유도된 세포에서 CCR2의 수치를 측정하기 위해 항CCR2 항체를 또한 사용할 수 있다. 몇몇 경우에, 조직은 질환을 갖는 조직이다. 몇몇 경우에, 조직은 생체검사 조직이다. 상기 방법의 몇몇 경우에, 환자로부터 조직 또는 이의 생체검사 조직을 절제한다. 이후, 상기 기재된 방법에 의해, 예를 들면 전체 CCR2 발현, CCR2의 세포 표면 수치 또는 CCR2의 편재를 결정하기 위해 면역분석에서 조직 또는 생체검사 조직을 이용한다. 조직이 높은 수치의 CCR2를 발현하는지를 결정하기 위해 상기 방법을 이용할 수 있고, 이것은 조직이 항CCR2 항체에 의한 치료에 표적임을 나타낼 수 있다.
CCR2를 발현하는 조직 및 장기를 확인하기 위해 항체를 또한 생체내 사용할 수 있다. 몇몇 경우에, CCR2 발현 세포를 확인하기 위해 항CCR2 항체를 사용한다.
상기 방법은 이러한 진단 시험을 필요로 하는 환자에게 검출 가능하게 표지된 항CCR2 항체 또는 이를 포함하는 조성물을 투여하는 단계 및 환자를 영상화 분석하여 CCR2 발현 조직의 위치를 결정하는 단계를 포함한다. 영상화 분석은 의학 분야에 널리 공지되어 있고, X선 분석, 자기 공명 영상(MRI) 또는 컴퓨터 단층 촬영(CT)을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 생체내 영상화에 적합한 임의의 제제, 예를 들면 조영제, 예컨대 바륨(X선 분석에 사용할 수 있음) 또는 자기 조영제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트(MRI 또는 CT에 사용할 수 있음)에 의해 항체를 표지할 수 있다. 다른 표지 물질로는 방사선 동위원소, 예컨대 99Tc를 들 수 있지만, 이것으로 제한되지는 않는다. 또 다른 경우에, 항CCR2 항체를 표지할 수 없고, 검출 가능하고 항CCR2 항체에 결합할 수 있는 제2 항체 또는 다른 분자를 투여하여 이를 영상화할 수 있다. 또 다른 경우에, 관심 있는 조직이 CCR2를 발현하는지를 결정하기 위해 환자로부터 생체검사 조직을 얻는다.
몇몇 경우에, 검출 가능하게 표지된 항CCR2는 형광단을 포함한다. 몇몇 경우에, 형광단은 근적외선 형광성 염료, 디니트로페닐, 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민, 로다민 유도체, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플루오레사민, TEXAS RED™, RHODAMINE GREEN™, OREGON GREEN™, CASCADE BLUE™, 피코에리트린, CY3™, CY5™, CY2™, CY7™, 쿠마린, 적외선 40, MR 200, IRD 40, ALEXA FLUOR™, 테트라메틸로다민, PACIFIC BLUE™, SYBR™ 및 BODIPY™으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 또 다른 경우에, 형광단으로는 방출 최대를 괄호 안의 ㎚로 나타낸 CY2™ (506), GFP(Red Shifted) (507), YO-PRO®-1 (509), YOYO®-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FLUORX® (519), ALEXA® (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), OREGON GREEN® 500 (522), OREGON GREEN® 488 (524), RIBOGREEN® (525), RHODAMINE GREEN® (527), Rhodamine 123 (529), MAGNESIUM GREEN® (531), CALCIUM GREEN® (533), TO-PRO®-1 (533), TOTO®-1 (533), JOE (548), BODIPY® 530/550 (550), Dil (565), BODIPY® (568), BODIPY® 558/568 (568), BODIPY® 564/570 (570), CY3® (570), ALEXA® 546 (570), TRITC (572), MAGNESIUM ORANGE® (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), CALCIUM ORANGE® (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine RED® (590), CY3.5® (596), ROX (608), CALCIUM CRIMSON™ (615), ALEXA® 594 (615), TEXAS RED™ (615), Nile Red (628), YO-PRO®-3 (631), YOYO®-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO®-3 (660), TOTO®-3 (660), DiD DilC(5) (665), CY5™ (670), Thiadicarbocyanine (671) 및 Cy5.5™ (694)의 화합물 중 하나를 들 수 있다.
치료학적 사용 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 항CCR2 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하여 CCR2 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 임의의 유형의 항체를 치료학적으로 사용할 수 있다. 다양한 경우에, 항CCR2 항체는 인간 키메라 또는 인간화 항체이다. 몇몇 경우에, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합한다. 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 바람직하게는 CCR2의 제3 세포외 루프 또는 N 말단 도메인에 결합하지 않는다.
훨씬 또 다른 경우에, CCR2는 인간이고, 환자는 인간 환자이다. 대안적으로, 환자는 항CCR2 항체가 교차 반응하는 CCR2를 발현하는 포유동물일 수 있다. 항체가 수의학 목적을 위해 또는 인간 질환의 동물 모델로서 교차 반응하는 CCR2를 발현하는 비인간 포유동물에게 항체를 투여할 수 있다. 이 동물 모델은 항체의 치료학적 효율을 평가하는 데 유용할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 항CCR2 항체의 치료학적 유효량을 피험체에게 투여하여 피험체에서 CCR2 매개 질환을 치료하는, 치료를 보조하는, 예방하는 또는 예방을 보조하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 "CCR2 매개 질환"이란 용어는 질환을 앓는 피험체에서 높은 수치의 CCR2 발현 또는 활성이 질환의 병태생리학 또는 질환의 악화에 기여하는 인자에 책임있는 것으로 보이거나, 이에 책임있는 것으로 의심되는 질환 및 다른 질환을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들면, 질환을 앓는 피험체의 이환된 세포 또는 조직에서 세포 표면 상의 CCR2의 수치 증가에 의해, 또는 질환의 병리학에 기여하는 또는 질환의 악화에 기여하는 세포 유형에서, 예컨대 호산구, 단핵구 또는 림프구에서 CCR2 매개 활성의 증가에 의해, 또는 염증 부위에서 CCR2 리간드, 예컨대 MCP-1의 수치의 증가에 의해 이 질환을 확신할 수 있다. 예를 들면, 항CCR2 항체를 사용하여 CCR2 발현 증가를 검출할 수 있다. G-단백질의 활성화의 증가, F-액틴 중합 또는 CCR2 발현 세포의 주화성, 예컨대 MCP-1 또는 다른 CCR2 리간드에 반응하는 주화성의 증가에 의해 CCR2 활성 증가를 검출할 수 있다.
일 양태에서, CCR2 매개 질환은 섬유증을 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 "섬유증"이란 용어는 조직 손상에 반응하는 섬유증 물질(예를 들면, 세포외 매트릭스)의 과도한 침착 및 대사를 특징으로 하는 병리학적 상태를 의미한다. 많은 경우에, 섬유증은 섬유아세포 또는 성상 세포 활성화 및 증식 및 콜라겐 축척을 발생시키는 만성 또는 과도한 조직 영향으로 인해 잘못된 정상 치유 과정(즉, 상처 치유)을 나타낸다. 섬유증으로는 혈관 질환, 예컨대 심장 질환, 뇌 질환 및 말초 혈관 질환, 및 모든 주요 조직 및 장기 시스템, 예컨대 눈, 피부, 신장, 폐, 소화관 및 간과 관련된 섬유증식성 질환을 들 수 있다(Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004); Bataller, R and Brenner, D., J. Clin. Invest. 115:209-218 (2005)). 다른 공급원으로는 화학치료학적 약물, 방사선 유발 섬유증 및 손상 및 화상이 있다. 섬유증이 광범위한 병리학 군을 포괄하면서, 이 증상의 대부분의 경우, 섬유증 조직 축척을 발생시키는 일반적인 메커니즘은 공통의 많은 요소를 갖는 것으로 생각된다. 종종, 상기 병증은 염증성 세포의 유입에 반응하여 개시되고, 조직(예를 들면, 성상, 근섬유아세포 또는 쿠퍼 세포) 내에 침윤 세포(예를 들면, 대식세포, T 세포)와 휴지기 세포 사이의 후속적인 사이토카인 신호 전달 경로에 의해 영구화된다. 예를 들면, MCP-1은 폐의 몇몇 질환에서 중요한 역할을 하는 것으로 보이고(Rose CE Jr, Sung SS, Fu SM. Microcirculation 10:273-288 (2003)), 폐 섬유증 발병으로부터 CCR2 결핍 마우스를 보호하고(Moore BB, et al. Protection from Pulmonary Fibrosis in the Absence of CCR2 Signaling. J. Immunol. 167: 4368-4377 (2001)), 이것은 폐에서 이 수용체의 중요한 역할을 제시한다. 유사하게, 혈관주위세포는 경피증 발명에 관계되는 중요한 섬유화 세포 유형이고, PDGF 수용체 티로신 키나아제 억제제(RTKI)는 혈관주위세포의 증식을 느리게 하고 이 점진적인 질환을 앓는 환자에서 피부 병소를 억제하는 것으로 보인다. 신장에서, 백혈구 침윤은 만성 신장 질환에서 신세뇨관 간질성 염증 및 섬유증을 매개하는 데 중요한 역할을 한다. Vielhauer 및 그 동료는 폐쇄성 신병증의 마우스 모델에서, 대식세포 및 CD3+ 림프구를 축적하는 데 있어서 CCR2 및 CCR5의 발현은 조직 손상의 부위에서 점진적인 섬유증과 상관된다는 것을 입증하였다(Vielhauer V, et al. J. Am. Soc. Nephrol. 12:1173-1187 (2001)).
본원에서 사용되는 "섬유증"이란 용어는 또한 "섬유아세포 축척 및 콜라겐 침착"과 동의어로 사용한다. 섬유아세포는 신체 전체에서 연결 조직에 분산된 연결 조직 세포이다. 섬유아세포는 Ⅰ형 및/또는 Ⅲ형 콜라겐을 포함하는 비경질 세포외 매트릭스를 분비한다. 조직에 대한 손상에 반응하여, 근처 섬유아세포 또는 성상 세포는 상처로 이동하고, 증식하고, 다량의 콜라겐성 세포외 매트릭스를 생성한다. 콜라겐은 세포외 매트릭스 및 연결 조직, 연골 및 뼈의 주요 성분인 글리신 및 프롤린이 풍부한 섬유성 단백질이다. 콜라겐 분자는 로프형 나선으로 서로 권취된 α 쇄라 불리는 3중 가닥 나선 구조이다. 콜라겐은 몇몇 형태 또는 유형으로 존재하고, 이들 중, 가장 흔한 Ⅰ형은 피부, 힘줄 및 뼈에서 발견되고, Ⅲ형은 피부, 혈관 및 내부 장기에서 발견된다. 섬유증의 예로는 섬유증과 관련된 폐 질환, 예를 들면 특발성 폐 섬유증, 방사선 유발 섬유증, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 경피증, 블레오마이신 유발 폐 섬유증, 만성 천식, 규폐증, 석면 유발 폐 섬유증, 급성 폐 손상 및 급성 호흡 곤란(예를 들면, 박테리아 폐렴 유발, 외상 유발, 바이러스 폐렴 유발, 호흡기 유발, 비폐 패혈증 유발 및 흡인 유발); 손상/섬유증과 관련된 만성 신증(신장 섬유증), 예를 들면 루푸스, 당뇨병, 경피증, 사구체 신염, 국소성 분절성 사구체 경화증, IgA 신병증, 고혈압, 동종 이식편, 루푸스 및 알포트 증후군; 소화관 섬유증, 예를 들면 경피증 및 방사선 유발 소화관 섬유증; 간 섬유증, 예를 들면 간경변증, 알콜 유발 간 섬유증, 비알콜성 지방 간염(NASH), 담도 손상, 원발성 담즙성 간경변증, 감염 또는 바이러스 유발 간 섬유증(예를 들면, 만성 HCV 감염) 및 자가면역 감염; 두경부 섬유증, 예를 들면 방사선 유발 두경부 섬유증; 각막 반흔, 예를 들면 LASIX™, 각막 이식 및 섬유주절제술; 비후성 반흔 및 켈로이드, 예를 들면 화상 유발 및 수술; 및 다른 섬유증 질환, 예를 들면 유육종증, 경피증, 척수 손상/섬유증, 골수섬유증, 혈관 재협착증, 죽상동맥경화증, 웨게너 육아종증, 혼합 연결 조직 질환 및 페이로니씨병을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
일 양태에서, CCR2 매개 질환은 병리학적 염증을 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 "병리학적 염증"이란 용어는 천식, 죽상동맥경화증, AIDS 치매, 당뇨병, 염증성 장 질환, 류마티스성 관절염, 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 다발성 경화증(특히 추가 탈수초를 억제하는 다발성 경화증), 종양, 종양 전이, 신염, 아토피성 피부염, 건선, 심근 허혈 및 만성 전립선염, 비만, 대사 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 부적절한 및/또는 만성 염증 관련 질환을 의미한다. 이 염증은 침윤 백혈구를 비롯하여 염증성 세포의 고조된 반응을 특징으로 한다. 시간이 경과하면서, 이 병리학적 염증은 대개 부적절한 염증 구역에서 조직을 손상시킨다. 따라서, 본 발명은 CCR2에 결합하여 이를 억제하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 치료학적 유효량을 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 병리학적 염증을 앓는 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.
MCP-1, MCP-2, MCP-3 및 MCP-4를 비롯한 케모카인의 결합에 의한 CCR2의 활성화가 원인임을 보여주는 질환을 치료하는 데 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 또한 사용할 수 있다.
호흡기 알레르기성 질환, 예컨대 천식, 알레르기성 비염, 과민증 폐 질환, 과민성 폐렴, 간질성 폐 질환(ILD)(예를 들면, 특발성 폐 섬유증, 또는 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 강직성 척추염, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 다발성 근염 또는 피부 근염과 관련된 ILD), 만성 폐쇄성 폐 질환, 아나필락시스 또는 과민증 반응, (예를 들면, 페니실린, 세팔로스포린에 대한) 약물 알레르기, 벌독 알레르기, 염증성 장 질환, 예컨대 크론씨병 및 궤양성 대장염, 척추관절증, 경피증, 건선 및 염증성 피부병, 예컨대 피부염, 습진, 아토피성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 두드러기, 혈관염(예를 들면, 괴사성, 피부 및 과민증 혈관염)을 비롯한 염증성 또는 알레르기성 질환 및 병태를 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 항원 결합 단편)을 사용할 수 있다.
자가면역 질환을 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 항원 결합 단편)을 사용할 수 있다. 자가면역 질환의 예로는 에디슨병, 용혈성 빈혈, 항인지질항체 증후군, 류마티스성 관절염, 피부염, 알레르기성 뇌척수염, 사구체 신염, 굿패스쳐 증후군, 그레이브스병, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 신경염, 안염, 수포성 유사천포창, 천포창, 다발성 내분비장애, 자반, 라이터 질환, 강직 인간 증후군(Stiff-Man Syndrome), 자가면역 갑상선염, 전신성 홍반성 루푸스, 자가면역 폐 염증, 갈랑 발레 증후군, 인슐린 의존 당뇨병 및 자가면역 염증성 눈 질환을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 경우에, 길항제 항CCR2 항체에 의해 치료되는 자가면역 질환은 류마티스성 관절염(RA)이다. TH1 질환인 RA는 유병률이 백인에서 약 1%인 흔한 인간 자가면역 질환으로(Harris, B. J. et al., 1997, In Textbook of Rheumatology 898-932), 현재 250만명의 미국인에게 영향을 미치고 있다. RA는 인공 연골을 점진적으로 파괴하는 윤활 관절의 만성 염증 및 활성화 T 세포, 대식세포 및 혈장 세포에 의한 침윤을 특징으로 한다. 이것은 관절 질환 중 가장 흔한 형태이다.
훨씬 또 다른 양태에서, 길항제 항CCR2 항체에 의해 치료되는 자가면역 질환은 다발성 경화증(MS)이다. 또한 TH1 질환인 MS는 북아메리카에서 350,000(0.1%)명의 객체에 영향을 미치고 전세계적으로 110만명의 객체에 영향을 미치는 가장 흔한 중추 신경계(CNS) 탈수초 질환이다. 일반적으로, MS는 항원(Ag) 제시 세포(APC) 상에 발현되는 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 관련하여 특정한 미엘린 폴리펩티드를 인식하는 단핵구 및 전염증성 CD4 T(Th1) 세포에 의해 부분적으로 매개되는 자가면역 질환인 것으로 생각된다.
랑게르한스 췌장섬에서 β 세포의 자가면역 파괴를 특징으로 하는 질환인 인간 Ⅰ형 또는 인슐린 의존 당뇨병(IDDM)을 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 항원 결합 단편)을 사용할 수 있다. β 세포의 고갈은 혈중 글루코스 수치를 조절할 수 없게 만든다. 인간에서, 긴 증상발현전 기간은 당뇨병 발병에 선행한다. 이 기간 동안, 췌장 β 세포 기능은 점진적으로 소실된다. 질환 발병은 인슐린, 글루탐산 데카르복실라아제 및 티로신 포스파타제 IA2(IA2)에 대한 자가항체의 존재가 원인임을 보여준다.
신경병증성 통증을 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 항원 결합 단편)을 또한 사용할 수 있다. CCR2가 결핍된 마우스는 신경병증성 통증을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Abbadie et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(13): 7947-52 (2003)). 본원에서 사용되는 "신경병증성 통증"이란 용어는 신경에 대한 손상으로부터 생기는 통증을 의미한다. 신경병증성 통증은 작은 피부 신경, 또는 근육 또는 연결 조직에서의 작은 신경을 포함하는 급성 조직 손상에 의해 야기되는 통증인 침해성 통증과 구별된다. 침해성 메커니즘을 포함하는 통증은 보통 기간상 조직 치유 기간으로 제한되고, 일반적으로 문헌[Myers, Regional Anesthesia 20:173-184 (1995)]에 기재된 바대로 구입 가능한 진통제 또는 오피오이드에 의해 경감된다. 신경병증성 통증은 통상적으로 오래 지속되거나 만성이고, 대개 초기 급성 조직 손상 이후 수일 또는 수달 발병한다. 신경병증성 통증은 통상적으로 고통스럽지 않은 자극에 고통스런 반응을 나타내는 이질통 및 지속성 자발 통증을 포함할 수 있다. 신경병증성 통증은 또한 보통 하찮은, 예컨대 핀으로 찌르는 고통스런 자극에 강조된 반응을 나타내는 통각과민을 특징으로 할 수 있다.
길항제 항CCR2 항체는 말초 신경, 배근 신경절, 척수, 뇌간, 시상 또는 피질의 질환으로부터 생기는 신경병증성 통증을 경감시키는 데 유용하다. 상기 방법은 통증의 병인과 무관하게 신경병증성 통증을 경감시키는 데 유용하다. 예를 들면, 말초 신경 질환, 예컨대 신경종; 신경 압박; 신경 압좌, 신경 신전 또는 불완전 신경 절단; 단발 신경병증 또는 다발 신경병증으로부터 생기는 신경병증성 통증을 경감시키기 위해 상기 방법을 사용할 수 있다. 배근 신경절 압박; 척수의 염증; 척수의 좌상, 종양 또는 반측절단; 뇌간, 시상 또는 피질의 종양; 또는 뇌간, 시상 또는 피질에 대한 외상과 같은 질환으로부터 생기는 신경병증성 통증을 경감시키기 위해 상기 방법을 사용할 수 있다.
죽상동맥경화증을 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 기능성 단편)을 또한 사용할 수 있다. 죽상동맥경화판은 수십년 동안 발병하고, 염증성 세포 침윤, 평활근 세포 증식, 세포외 매트릭스의 축척, 섬유성 모자 형성 및 혈관신생을 수반한다(Bayes-Genis et al. Circ. Res. 86:125-130 (2000)). 주화성은 죽상동맥경화증의 초기 발병과 관련된다. 세포 집단은 혈관벽의 내부 부분으로 이동하고, 신내막이 생기게 하여, 죽상동맥경화판을 형성시킨다. 예를 들면, 단핵구 주화성은 손상된 동맥관에서 죽상동맥경화증의 발병에서 초기 나타나는 단핵구 주화성인자 단백질 1(MCP-1)에 의해 유발된다(Furukawa et al. Circ. Res. 84:306-314 (1999); Han et al. J. Lipid Res. 40:1053 (1999)). CCR2 +/+ 마우스가 아니라 CCR2 -/- 마우스로부터 ApoE3-Leiden 마우스(식이 유도 죽상동맥경화증에 걸리기 쉬운 마우스 균주)로 골수 이식하여 죽종형성을 감소시키고, 이것은 CCR2를 통한 MCP-1 신호 전달이 죽상동맥경화증에 기여한다는 것을 제시한다(Guo et al. (2003) Arterioscler Thromb Vasc Biol.;23(3):447-53). 따라서, 죽상동맥경화증의 발병률을 감소시키거나, 이를 치료하거나, 이의 치료를 보조하기 위해 CCR2 길항제 항체, 특히 CCR2의 제1 및/또는 제2 세포외 루프에 결합하는 길항제 항체를 피험체에게 투여할 수 있다.
비만을 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 항원 결합 단편)을 또한 사용할 수 있다. 비만에서, 지방 조직은 수많은 단핵구를 포함하는 것으로 입증되었다. 이 단핵구는 대사 증후군이라 흔히 불리는 비만과 흔히 관련되는 다양한 후유증 발병 또는 지방 침착에 기여할 수 있다. 대사 증후군은 당뇨병 발병과 같은 이러한 변형을 포함한다.
맥관구조, 특히 동맥, 예를 들면 관상 동맥의 협착증 또는 재협착증, 예컨대 혈관 중재로부터 생기는 협착증 또는 재협착증(예를 들면, 수술, 치료학적 또는 기계적 중재) 및 신내막 과형성을 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 항원 결합 단편)을 또한 사용할 수 있다. 예를 들면, 통상적으로 혈관의 내강 개열이 좁아지게 하는 재협착증은 인공 혈관 절차, 혈관성형술(예를 들면, 벌룬에 의해 수행되는 혈관성형술), 죽상반절제술, 레이저 또는 다른 적합한 방법(예를 들면, 경피적 관상동맥 풍선성형술(PTCA)), 스텐트 설치(예를 들면, 기계적 또는 생물학적 혈관내 스텐트 설치), 혈관 우회 절차 또는 이들의 조합에 의해 및 협착 또는 폐쇄 혈관을 치료하기 위해 이용되는 다른 절차(이들로 제한되지는 않음)에 의해 생기는 혈관 손상으로부터 생길 수 있다.
동종이식편 거부 또는 이식편 대 숙주 질환 및 장기 이식 관련 동맥경화증을 비롯한 (예를 들면, 이식시) 이식편 거부를 치료하기 위해 길항제 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들면, 4.40 및/또는 4.9 또는 이의 항원 결합 단편)을 또한 사용할 수 있다.
HIV 감염에 대한 치료제로서 CCR2의 길항제인 항체 및 이의 항원 결합 단편을 사용할 수 있다. HIV-1 및 HIV-2는 인간에서 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 기병성 인자이다. AIDS는 부분적으로 HIV 감염 객체에서 CD4+ T 림프구의 결핍으로부터 생긴다. HIV-1은 주로 T 림프구, 단핵구/대식세포, 수지상 세포를 감염시키고, 중추 신경계에서는, 소교세포를 감염시킨다. 이 세포는 모두 HIV-1 및 HIV-2에 대한 수용체로서 작용하는 CD4 당단백질을 발현시킨다. 표적 세포로의 HIV의 효과적인 진입은 바이러스 외부 엔벨로프 당단백질, gp120의 아미노 말단 CD4 도메인으로의 결합에 따라 달라진다.
또한, CCR2는 HIV-1에 대한 보조 수용체로서 작용하는 것으로 보인다(Frade et al. (1997) J Clin Invest.;100(3):497-502). 바이러스 결합 후, HIV-1 엔벨로프 당단백질은 진입 과정을 완료하기 위해 바이러스 및 숙주 세포막의 융합을 매개한다. 감염된 세포 표면 상에 발현된 HIV-1 엔벨로프 당단백질에 의해 지시되는 막 융합은 세포--세포 융합을 발생시켜 융합 세포를 발생시킨다.
노화성 황반 변성(AMD), 포도막염 및 각막 감염을 비롯한 각종 안과 병증의 치료를 위한 치료제로서 CCR2의 길항제인 항체 및 이의 항원 결합 단편을 사용할 수 있다.
노화성 황반 변성( AMD )
CCR2는 노화성 황반 변성 환자에서 및 혈관양 선조, 고도 근시, 눈 히스토플라스마종 환자에서 관찰되는 맥락막 신혈관 형성(CNV)의 발병에서 대식세포의 동원에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Tsutsumi, C. et al. Journal of Leukocyte Biology 74:25-32, 2003).
포도막염
CCR2의 단일 뉴클레오티드 다형과 이의 리간드(MCP-1) 사이의 회합은 급성 특발성 전부 포도막염(Yeo, TK, et al. Cytokine 35:29-35 2006) 및 특발성 면역 매개 후구역 포도막염(Ahad, MA, et al. Mol Vis 13:388-396 2007)을 앓는 환자에서 입증되었다.
각막 감염(박테리아)
CCL2는 각막 감염 동안 다형핵호중구(PMN) 동원의 조절에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Xue, M. L, et al. Immunology and Cell Biology 85:525-531 2007). PMN이 박테리아를 제거하고 각막에서 상처 치유를 촉진하는 데 필수적이므로, 이 세포가 지속되면 만성 염증성 질환이 발생할 수 있다.
만성 림프성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 악성 골수종, 호지킨병, 및 전립선, 방광, 유방, 자궁경부, 대장, 폐, 간의 암종 또는 위 고체 종양 및 암을 비롯한 각종 고체 종양 및 암의 치료를 위한 치료제로서 CCR2의 길항제인 항체 및 이의 항원 결합 단편을 사용할 수 있다.
전립선암
MCP-1은 전립선암 성장 및 침입에 대한 주변 분비 및 자가 분비 인자로서 작용하는 것으로 보이고(Lu, Y. et al. The Prostate 66:1311-1318, 2006) 및 CCR2 발현은 전립선암 진행과 상관되는 것으로 보인다(Lu, Y. et al. Journal of cellular biochemistry 101:676-685, 2007). 중화 항MCP-1 항체의 전신성 전달은 마우스에서 전립선암 종양 퇴행을 유도하는 것으로 보인다(Loberg, R. D., Cancer Res 67:9417-9424 2007).
유방암
종양 관련 대식세포는 종양 면역 감시 및 개발에서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고, 림프구의 활성화 및 동원은 MCP-1을 비롯한 케모카인에 의해 조절된다. 유방암에서 CCR2 다형에 대해 상당한 회합이 입증되었다(Zafiropoulos, A., N. et al. Journal of medical genetics 41:e59 2009). CCL2/CCR2 경로는 또한 종양 퇴행, 혈관신생 및 신생 혈관 형성을 촉진하는 골수성 억제인자 세포의 유방암, 난소암 및 위암을 비롯한 암에 대해 중심적인 역할을 하는 것으로 보인다(Huang, B., et al. Cancer letters 252:86-92, 2007).
흑색종
MCP-1 기능의 차단은 또한 마우스에서 종양 관련 대식세포의 동원을 억제하고 종양 혈관신생 및 악성 흑색종의 성장을 예방하는 것으로 보인다(Koga, M. et al. Biochemical and biophysical research communications 365:279-284, 2008).
간암
CCR2의 차단은 간 종양 형성 동안 신혈관화를 촉진하는 기질 금속단백분해효소 2의 주요 공급원인 간 성상 세포의 수송을 감소시키는 것으로 보인다(Yang, X. et al. International journal of cancer 118:335-345, 2006).
자궁경부암
CCR2는 편평 상피내 병소로부터 자궁경부 종양 형성의 발병에서 종양 혈관신생을 발생시키는 대식세포 동원에서 중요한 역할을 하는 것으로 보인다(Coelho, A., et al. Gynecologic oncology 96:760-764, 2005; .Coelho, A., et al. Gynecologic and obstetric investigation 64:208-212, 2007).
난소암
CCL2/CCR2 경로는 또한 종양 퇴행, 혈관신생 및 신생 혈관 형성을 촉진하는 골수성 억제인자 세포의 유방암, 난소암 및 위암을 비롯한 암에 대한 동원에서 중심적인 역할을 하는 것으로 보인다(Huang, B., et al. Cancer letters 252:86-92, 2007).
항체를 1회 또는 수회 투여할 수 있다. 1일 4회 내지 6개월마다 1회 또는 그 이상 항체를 투여할 수 있다. 투여는 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일 1회, 3일 1회, 1주 1회, 2주 1회, 1달 1회, 2달 2회, 3달 1회 및 6달 1회와 같은 스케줄에 의할 수 있다. 항체를 또한 미니펌프를 통해 연속적으로 투여할 수 있다. 항체를 점막, 협측, 비강내, 흡입, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내 또는 국소 경로를 통해 투여할 수 있다. 항체를 국소로 또는 전신으로 투여할 수 있다.
1회, 2회 이상 또는 적어도 병증이 치료되거나, 완화시거나, 치유할 때까지의 기간 동안 항체를 투여할 수 있다. 항체를 본원에 기재된 바대로 약학 조성물의 일부로서 일반적으로 투여할 수 있다. 항체의 용량은 일반적으로 0.1~100 ㎎/kg, 0.5~50 ㎎/kg, 1~20 ㎎/kg 또는 1~10 ㎎/kg 범위일 수 있다. 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 항체의 혈청 농도를 측정할 수 있다.
하기 실시예는 오직 예시를 위한 것이고, 임의의 방식으로 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1
항 CCR2 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
인간 IgG2 및 IgG4 항체를 생산하는 8주 내지 10주령 XENOMOUSE™ 마우스를 이의 뒤의 족척에서 CCR2B(Genbank MN000648, 서열 번호 204)(TITERMAX™ Gold Adjuvant(Sigma, 카탈로그 T2684호, 롯트 K1599호)에서 107 개의 세포/투여량/마우스; 50/50 부피 준비)로 형질감염된 300-19 세포에 의해 면역화시켰다. 마우스는 3주 내지 8주 기간 동안 Aluminium Phosphate Gel Adjuvant(카탈로그 1452-250호, 뱃치 8937호, HCI Biosector(5 ㎕/마우스/부스트)) 및 qCpG(IMMUNEASY™ Mouse Adjuvant)(카탈로그 303101호; 롯트 11551249호; Qiagen(15 ㎕/마우스/부스트)) 중의 5회 내지 9회의 추가 주사를 받았다. 주입 4일 전에, 마우스는 PBS 중의 최종 주사를 받았다. 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 및 림프절 림프구를 수집하고 비분비형 골수종 P3-X63-Ag8.653 세포주와 융합하였다. 융합된 세포를 상기 기재된 바대로 HAT 선택 처리하였다(Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)). 모두 CCR2 특이적 인간 항체를 분비하는 일련의 하이브리도마를 회수하였다. FACS 분석에 의해 평가되는 바대로 CCR2에 대한 결합에 대해 수많은 항체를 확인하였다. 추가 연구를 위해 하이브리도마를 선택하고, 이들 중 몇몇을 표 6에 기재하였다.
표 2에 기재된 하이브리도마를 부다페스트 조약에 따른 조항 하에 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC)(미국 20110-2209 버지니아주 머내서스 유니버시티 블러바드 10801)에 기탁하였다. 하이브리도마에 다음의 수탁 번호가 부여되었다:
[표 2]
Figure pct00003
실시예 2
항 CCR2 항체의 서열 분석
생산된 항체의 구조를 분석하기 위해, 항CCR2 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 얻은 단편을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 핵산을 클로닝하였다. CCR2 항체의 경쇄 및 경쇄를 클로닝하고 4.40.2 항체에 대해 예시된 바대로 서열을 다음과 같이 확인하였다: RNEASY™ MINI KIT(Qiagen)를 이용하여 Poly(A)+ mRNA를 단리시키고, 올리고(dT) 프라이밍을 이용하여 ADVANTAGE RT-for-PCR kit(BD Biosciences)에 의해 cDNA를 mRNA로부터 합성시켰다. 표 3에 기재된 프라이머를 이용하여 클론 4.40.2에 대해 올리고(dT) 프라이밍된 cDNA를 증폭시켰다. 다음의 사이클에 따라 PFUULTRA HIGH-FIDELITY Polymerase(Stratagene) 및 PTC-200 DNA Engine(MJ Research)을 이용하여 증폭하였다: 95℃에서 2분; 25X(95℃에서 20초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초); 72℃에서 10분. PCR 엠플리콘을 중쇄 및 경쇄 발현 벡터로 클로닝하였다. 이후, 벡터를 표준 프로토콜을 이용하여 MAX EFFICIENCY DH5α 화학적 경쟁 세포(Invitrogen)로 형질전환시켰다. 클론은 Grills 16th BDTv3.1/dGTP 화학(Applied Biosystems Inc) 및 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc)를 이용하여 확인된 서열이었다. 뉴클레오티드 서열 및 항체의 예상된 아미노산 서열로부터, 각각의 항체 쇄에 대해 유전자 이용을 확인하였다. MACVECTOR™ 및 GENEWORKS™ 소프트웨어 프로그램(Oxford Molecular Group(미국 캘리포니아주 캠프벨)을 이용하여 "V 염기 서열 디렉토리"(MRC Centre for Protein Engineering(영국 캠브리지); Tomlinson, et al., J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995))로 정렬시켰다.
[표 3] 4.40.2를 증폭하도록 설계된 가변 도메인 프라이머(5'→3')
Figure pct00004
표 4는 선택되는 하이브리도마 항체 클론의 유전자 이용을 기재한 것이다.
[표 4] 중쇄 및 경쇄 유전자 이용
Figure pct00005
IgG4 마우스에서 하이브리도마 클론이 생성되었고, 서열이 일단 얻어지면, 가변 도메인을 비교를 위해 IgG1, IgG2 및 IgG4 포맷 발현 벡터로 클로닝하였다.
실시예 3
항CCR2 항체의 돌연변이
경쇄 가변 구역에서 생식선 서열로의 회귀
CCR2 4.40.2의 경쇄에서 68번 위치에서의 알라닌 잔기를 다음과 같이 부위 지정 돌연변이에 의해 생식선 잔기인 글리신으로 회귀시켰다. 표 5에서의 프라이머를 이용하여 68번 아미노산 잔기에 대한 코돈에서의 점 돌연변이를 변경시켰다. 96℃에서 2분; 16X(96℃에서 50초, 68℃에서 10초); 68℃에서 10분의 사이클로의 변형을 포함하는 표준 프로토콜에 의해 QUIKCHANGE™ Ⅱ 부위 지정 돌연변이 키트(Stratagene)를 이용하여 부위 지정 돌연변이를 수행하였다. 돌연변이된 벡터를 XL1-Blue supercompetent 세포로 형질전환시켰다. 돌연변이가 성공적인지 확인하기 위해, Grills 16th BDTv3.1/dGTP 화학(Applied Biosystems Inc.) 및 3730xl DNA Analyzer(Applied Biosystems Inc.)를 이용하여 클론을 서열 분석하였다.
[표 5] 돌연변이 프라이머(5'→3')
Figure pct00006
얻어진 항체를 경쇄 가변 구역의 68번 위치에서 글리신을 갖는 4.40 A68G(서열 번호 112)로 지칭하였다.
힌지 -안정화 돌연변이를 갖는 IgG4 중쇄 불변 구역의 생성
pCON-G4(pro)(Lonza(스위스 바젤)) 유도된 IgG4 발현 벡터로부터 IgG4 중쇄 불변 구역을 단리시키고, 이 벡터는 IgG4 L309 알로타입과 관련하여(Brusco A. et al., Eur J. Immunogenticsl 25:349-355 (1998)) 230번 아미노산(Angal, S. et al. Molecular Innunology 30:105-108 (1993))에서 생식선으로부터 힌지 구역 안정화 돌연변이(세린에서 프롤린)를 갖는다.
침묵 돌연변이(Lys, AAG→AAA)를 PCR 돌연변이에 의해 pCON-G4(pro) 벡터의 G4 CH1 엑손의 11번째 뉴클레오티드 잔기로 도입하여, Apal 인지 부위를 제거하여 다음의 증폭 프라이머를 이용하여 서브클로닝을 촉진하였다:
Figure pct00007
(대문자 염기는 하이브리드화(CH1의 11번 잔기의 돌연변이는 볼드체이다); 소문자 염기는 하이브리드화하지 않음)
Figure pct00008
(대문자 염기는 하이브리드화. 소문자에서 Xbal 부위를 갖는 염기는 하이브리드화하지 않음)
다음과 같은 열 사이클에 의해 Expand Hi-Fi 중합효소(Roche) 및 PTC-200 DNA ENGINE™(MJ Research)을 이용하여 증폭을 성취하였다: 95℃에서 3분; 22X(95℃에서 20초, 58℃에서 30초, 72℃에서 2분 10초); 72℃에서 10분.
다음의 프라이머를 이용하여 발현 벡터로 가변 구역을 서브클로닝하기 위한 효소의 사용을 촉진하기 위해 또 다른 침묵 돌연변이(Thr, ACC→ACA)를 pCON-G4(pro) 벡터의 G4 CH1 엑손의 209번 뉴클레오티드 잔기에서 PCR 돌연변이에 의해 도입하여 BstEII 부위를 제거하였다:
Figure pct00009
Figure pct00010
다음과 같은 열 사이클에 의해 QUIKCHANGE™ 부위 지정 돌연변이 키트(Stratagene) 및 PTC-200 DNA Engine(MJ Research)을 이용하여 증폭을 성취하였다: 96℃에서 1분; 14X(96℃에서 50초, 68℃에서 15분 48초); 72℃에서 10분.
이후, 힌지 구역 돌연변이 및 2개의 침묵 돌연변이를 포함하는, S230P라 불리는, 얻어진 IgG4 불변 구역을 Apal/Xbal 단편으로서 DHFR 항체 발현 벡터의 Apal/Xbal 부위로 서브클로닝하였다. 이후, 4.40.2 항체의 중쇄 가변 구역을 전장 중쇄 작제물을 생성시키는 G4 S230P 불변 구역을 포함하는 발현 벡터로 클로닝하였다. 경쇄 가변 구역 A68G 생식선 치환 및 중쇄 힌지 구역 S230P 치환을 갖는 4.40 유도된 항체를 서열 번호 112의 경쇄 아미노산 서열 및 서열 번호 116의 중쇄 아미노산 서열을 갖는 4.40 A68G S230P라 칭하였다.
발현 벡터에 의해 형질감염된 세포로부터 얻은 상청액을 수집하고 표준 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하여 재조합 면역글로불린을 단리시켰다. 이후, 이 단백질을 SDS-PAGE, 광 산란 및 분광측정법에 의해 규명하였다.
실시예 4
시험관내 결합
도 1은 전체 혈액에서의 인간 단핵구(도 1a)에 대한, CCR2 형질감염된 300-19 세포(도 1b)에 대한 AF-488 접합된 항체 4.40 A68G S230P의 시험관내 결합, 및 항인간 PE에 의해 검출되는 CCR2 형질감염된 300-19 세포에 대한 여러 농도의 4.40 A68G S230P 항체의 결합을 보여주는 것이다(도 1c). 간단히 말하면, 2% 열 비활성화 소 태아 혈청 및 0.002% 아지드화나트륨을 포함하는 둘베코 인산염 완충 식염수를 사용하여 시험 항체에 의해 100 ㎕의 부피 중 100만개의 세포를 염색하였다. 15분 후, 2차 검출 항체를 첨가하였다. 30분 후, 세포를 완충액 중에 세척하고, 500 ㎕ 중에 재현탁시키고 FACS CALIBUR 상에서 염색에 대해 평가하였다. 튜브당 전체 10,000건의 사건을 평가하였다. 염색의 규모에 대한 표시자로서 각각의 농도의 항체에 대해 평균 채널 형광성 강도를 평가하였다.
실시예 5
항 CCR2 단일클론 항체의 친화도 상수( K D )의 결정
CCR2에 대한 항체의 KD를 평가하기 위해, CCR2를 발현하는 300-19 세포에 대한 항체 결합을 3시간 분석에서 FACS에 의해 평가하였다. 간단히 말하면, 2% 열 비활성화 소 태아 혈청, 0.002% 아지드화나트륨 및 0.005 ㎎/ml 사이토칼라신-B(Sigma 6762)을 포함하는 둘베코 인산염 완충 식염수의 완충액을 사용하여, 100 ㎕의 부피 중 100만개의 세포를 시험 항체에 의해 염색시켰다. 15분 후, 2차 검출 항체, R-피코에리트린 접합된 Affini-pure F(ab') 단편 당나귀 항인간 IgG H+L(Jackson 709-116-149)를 첨가하였다. 튜브를 실온에서 3시간 동안 약하게 진탕시켰다. 완충액 중에 2회 세척 후, 세포를 완충액 500 ㎕ 중에 재현탁시키고, FACS CALIBUR™ 상에서 평가하였다. 튜브당 전체 10,000건의 사건을 평가하였다. 염색의 규모에 대한 표시자로서 각각의 농도의 항체에 대해 평균 채널 형광성 강도를 평가하였다. 이 결합 연구는 4.40 A68G S230P 항체가 0.085 ㎍/mL의 KD로 형질감염된 세포 상에서 인간 CCR2에 결합한다(0.58 nM)는 것을 보여준다(도 2). CCR2의 제1 및 제2 세포외 루프를 갖는 CCR2/CCR5 키메라 수용체를 발현하는 세포 상에서 포화 결합을 평가할 때(실시예 7 참조), 유사한 농도 곡선 및 KD(KD = 0.023 ㎍/mL(0.16 nM))를 도 6c에 도시된 바대로 얻었다.
실시예 6
MCP-1 유도 주화성 억제
CCR2 리간드인 MCP-1(CCL2)에 반응하여 THP-1 단핵구(ATCC 번호 TIB 202)의 주화성을 억제하는 능력에 대해 인간 항CCR2 항체를 평가하였다. 이미 기재된 바대로(문헌[Gladue RP et al., J Biol Chem 278:40473-40480 (2003)] 참조), NeuroProbe, Inc.(미국 메릴랜드주 게이더스버그)로부터 구입한 96웰 주화성 챔버에서 주화성을 수행하였다. 간단히 말하면, CCL2를 0.1% BSA를 포함하는 RPMI 1640 배지(Roswell Park Memorial Institute) 중에 희석한 후, 챔버의 바닥 웰에 첨가하였다. 5 ㎛ 구멍을 갖는 필터(뉴로프로브)를 챔버의 상부 웰과 하부 웰 사이에 배치하였다. 이후, THP-1 세포를 다양한 농도의 시험 항체의 존재 또는 부재 하에 탑 챔버(8×105)에 첨가하였다. 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 37℃에서 3시간 동안 기구를 항온처리하였다. 항온처리 기간 후, 상부 챔버로부터 이동하지 않은 세포를 제거하고 필터 상부를 닦았다. 이후, 2 mM 냉 EDTA를 상부 웰에 첨가하고, 주화성 챔버를 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 이후, EDTA를 제거하고 96웰 미량적정 플레이트를 800xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 이후, 필터를 제거하고, 배양 배지를 버리고, 0.2% FDA를 플레이트에 첨가하였다. 이후, 황색이 될 때까지 37℃에서 1.5시간 동안 플레이트를 항온처리하였다. 490 ㎚에서 미량적정 플레이트 리더 상에서 색상 강도를 판독하여 이동한 세포의 수를 정량하였다. 표 6에 도시된 바대로, 여러 정도로 THP1 주화성을 억제한 몇몇 항체를 확인하였다.
[표 6] MCP-1 유도 THP-1 주화성 억제
Figure pct00011
유사하게, 항체 4.40 A68G S230P는 도 3에 도시된 바대로 CCR1/CCR5 리간드 MIP-1이 아닌 MCP-1(IC50 = 0.148 ㎍/ml)에 반응하여 THP-1 단핵구의 주화성을 억제하였다.
1차 단핵구 주화성
ACCUSPIN HISTOPAQUE 1077 튜브(Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스) 상에 헤파린화된 인간 전체 혈액을 층으로 만들고 스핀 다운하였다. 단핵 세포 부분을 수집하고, PBS에 의해 3회 세척하고, 적혈구 세포(RBC)를 물에 의해 용리시키고, 세포를 0.1% BSA(Sigma) 및 10 mM HEPES(Gibco)를 갖는 RPMI(Gibco; 미국 뉴욕주 그랜드 아일) 중에 4×106/ml로 재현탁시켰다. 항체 희석액 또는 KLH 대조군을 0.25 nM MCP-1(Peprotech; 미국 뉴저지주 로키 힐)에 첨가하고 30 ㎕를 48웰 Boyden 챔버(뉴로프로브; 미국 메릴랜드주 게이더스버그)의 바닥에 배치하고; 음성 대조군은 배지만 있었다. 5 ㎛ PVP 비함유 필터(뉴로프로브)를 이 위에 배치하고 챔버를 밀봉하였다. 실온에서 30분 동안 항체 희석액 또는 KLH 대조군에 의해 단리된 단핵 세포를 항온처리하였다. 이후, 50 ㎕를 상부 웰에 첨가하였다. 5% CO2 습윤 인큐베이터 내에서 37℃에서 90분 동안 챔버를 항온처리하였다. 항온처리 후, 세포를 상부 웰 밖으로 흡입시키고, 필터 상부를 닦고, 공기 건조시키고, DIFF-QUIK™(Dade-Behring; 미국 델라웨어주 뉴어크)에 의해 염색하고, 6 필드 내에 이동한 세포의 수를 계수하였다. 항체 4.40 A68G S230P에 의해 MCP-1에 반응하는 1차 단리된 인간 단핵구의 주화성 억제를 도 4에 도시하였다.
또한, 4.40 항체에 의해 예시된 바대로, THP-1 세포의 억제가 CCR1/CCR5 리간드 MIP-1a에 관찰되지 않았다(도 3).
실시예 7
CCR2 / CCR1 키메라 작제
에피토프를 맵핑하기 위해 CCR2 키메라에 대한 결합에 대해 MCP-1 유도 주화성을 억제하는 항체를 시험하였다. (제1, 제2 및/또는 제3) 세포외 루프로 이루어지는 여러 수용체 키메라를 발현하는 300-19 세포에 대한 항체의 결합 및 CCR1의 일부분에 의한 CCR2의 N 말단 치환(M = CCR2, R = CCR1)을 평가하여 이를 수행하였다.
키메라 수용체 MRRR 의 작제
Stratagene로부터 얻은 QUIKCHANGE® 부위 지정 돌연변이 키트 및 다음의 돌연변이 프라이머를 이용하여 MRRR 키메라 수용체(CCR2(M)의 N 말단, CCR1(R)의 제1, 제2 및 제3 세포외 루프)를 작제하여 야생형 인간 CCR1에서 제1 ApaL 제한 효소 부위를 돌연변이시키고, 다음의 프라이머를 이용하여 발현 벡터 pcDNA3(Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼즈배드)를 거쳐 BamHI 부위로 클로닝하였다:
Figure pct00012
Figure pct00013
pCMV-1 유도된 발현 벡터(Pharmacia; 미국 뉴저지주 피스카타웨이)로 클로닝된 FLAG 태그된 MMRR 키메라(CCR2의 N 말단 및 제1 세포외 루프, CCR1의 제2 및 제3 세포외 루프)를 포함하는 키메라 수용체는 J. David Gladstone Institutes의 Israel Charo에 의해 제공되었다. (저자에 의해 "2211"이라 불리는) MMRR 키메라의 작제는 Monteclaro F. S. 등이 기재하였다(Methods in Enzymology 228:70-84 (1997)). 키메라에서 제1 ApaL 부위를 다음의 돌연변이 프라이머를 이용하여 BamH1 부위로 돌연변이시켰다:
Figure pct00014
Figure pct00015
각각의 얻어진 돌연변이된 클론을 NdeI 및 BamHI에 의해 절단하였다. CCR1/pcDNA3 BamHI 돌연변이체로부터 얻은 벡터를 포함하는 단편 및 돌연변이된 MMRR/pCMV1 플라스미드로부터 오직 CCR2 N 말단을 포함하는 632개의 염기쌍 NdeI/BamHI 단편을 겔 단리시키고 함께 결찰시켜 MRRR/pcDNA3 키메라를 생성시켰다.
다음의 돌연변이 프라이머를 이용하여 MRRR 키메라에서의 BamHI 부위를 ApaL 부위로 다시 돌연변이시켰다:
Figure pct00016
Figure pct00017
벡터의 FLAG 태그 구역에 상동성인 센스 프라이머 66C(서열 번호 138) 및 CCR1의 3' 말단에 상동성이고 HindIII 부위를 포함하는 안티센스 프라이머 66D(서열 번호 139)를 사용하여 완전 MRRR 단편을 PCR 증폭시켰다.
Figure pct00018
Figure pct00019
이후, 이 단편을 pMIG(Van Parijs, L. et al., Immunity 11:281-188 (1999)) 유도된 레트로바이러스 작제물의 PflMI 및 HindIII 부위로 서브클로닝하고(도 5), FLAG 태그, 이어서 Sal1 부위에 선행하는 삽입된 유전자(마우스/인간 키메라)를 대체하고, 내부 리보솜 진입 부위 증진 녹색 형광성 단백질 부위(IRESEGFP)를 제거하였다.
키메라 수용체 RRRM 및 RMMR 의 작제
2단계 PCR 방법을 이용하여 RRRM(CCR1의 N 말단, 제1 및 제2 세포외 루프 및 제3 세포외 루프 CCR2) 및 RMMR(CCR1의 N 말단 및 제3 세포외 루프 및 CCR2의 제2 및 제3 세포외 루프) 키메라 수용체를 제조하였다.
RRRM 키메라의 경우, 다음의 프라이머를 이용하여 인간 야생형 CCR2의 제3 루프를 처음에 PCR 증폭시켰다:
Figure pct00020
Figure pct00021
야생형 인간 CCR2를 주형으로서 레트로바이러스 유도 발현 벡터 pMIG로 클로닝하였다. 다음의 프라이머를 이용하여 제2 세포외 루프를 통한 N 말단 구역을 PCR 증폭시키고, 야생형 CCR1를 주형으로서 발현 벡터 pcDNA3으로 클로닝하였다.:
Figure pct00022
Figure pct00023
이 단편을 겔 정제하고, 합하고, 5' 및 3' 말단 프라이머: 89C(서열 번호 142) 및 81B(서열 번호 141)를 이용하여 함께 PCR 증폭시켰다. 생성된 단편을 레트로바이러스 벡터의 SalI/HindII 부위, N 말단 FLAG 태그를 포함하고 IRESEGFP가 제거된 pMIG로 결찰시켰다.
키메라 수용체 RMMR 의 작제
주형으로서 발현 벡터 pcDNA3으로 클로닝된 야생형 CCR1 및 야생형 CCR1/pcDNA3 플라스미드에서 인서트의 벡터의 3' 구역에 하이브리드화하는 다음의 프라이머를 이용하여 세포질막 꼬리를 통한 CCR1 제3 세포외 루프를 PCR 증폭시켰다:
Figure pct00024
Figure pct00025
주형으로서 J. David Gladstone Institutes의 Israel Charo로부터 얻은 FLAG 태그된 RMMM/pcDNA3 플라스미드를 사용하여 CCR1의 N 말단 및 CCR2의 제1 및 제2 세포외 루프를 포함하는 구역을 포함하는 제2 단편을 PCR 증폭시켰다. (저자에 의해 "2211"이라 불리는) MMRR 키메라의 작제는 Monteclaro F. S. 등이 기재하였다(Methods in Enzymology 228:70-84 (1997)). 이용된 프라이머는 FLAG 태그에 하이브리드화되는 센스 프라이머 66C(서열 번호 138) 및 안티센스 키메라 프라이머 85B이다:
Figure pct00026
이 2개의 단편을 겔 정제하고, 합하고, 5' 및 3' 말단 프라이머: 66C(서열 번호 138) 및 78D(서열 번호 144)를 사용하여 함께 PCR 증폭시켰다. 이 최종 단편을 PflMI 및 HindIII에 의해 분해하고 N 말단 FLAG 태그를 포함하고 IRESEGFP가 제거된 pMIG 레트로바이러스 벡터로 결찰하였다.
키메라 발현
각각의 키메라 작제물로부터 레트로바이러스를 제조하고, 300-19 세포를 형질유도하기 위해 사용하였다. 항FLAG 에피토프 항체 M1을 사용하여 FACS 분석에 의해 발현을 결정하였다(Sigma(미국 미주리주 세인트 루이스), 카탈로그 F3040).
실시예 8
에피토프 맵핑
FACS 분석을 이용하여 CCR2/CCR1 키메라 수용체에 대한 항체의 결합을 평가하였다. 모든 수용체를 FLAG를 갖는 N 말단에서 태그하고 또한 항FLAG 항체 M1로 염색하여 수용체 발현을 확인하였다. 도 6a 및 도 6b는 4.40의 염색(도 6b)과 비교하여 M1 항체에 의한 N 말단 상의 FLAG의 FACS 염색(도 6a)을 도시한 것이다. 도 6c는 RMMR 키메라 형질감염된 300-19 세포 상의 4.40 A68G S230P 항체의 포화 결합 곡선을 도시한 것이다. CCR2에 의해 형질감염되지 않은 300-19 세포에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 포화 결합은 10 ㎍/mL 이하의 농도에서 결합을 보이지 않지만(도 7a), 완전 인간 CCR2에 의해 형질감염된 300-19 세포는 0.01 ㎍/mL 이상의 농도에서 용량 의존 결합을 나타낸다(도 7b)는 것을 보여준다. 또한, CCR1의 제3 루프 구역과 함께 CCR2의 N 말단(MRRR)(도 7C) 또는 CCR1의 N 말단 및 제1 및 제2 루프 구역과 함께 CCR2의 제3 세포외 루프(RRRM)만을 발현하는 키메라 수용체에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 포화 결합은 10 ㎍/mL 이하의 농도에서 어떠한 유의적인 결합을 나타내지 못했다(도 7d). 반대로, CCR1의 N 말단 및 제3 루프 구역 및 CCR2의 제1 및 제2 루프 구역(RMMR)을 발현하는 키메라 수용체에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 포화 결합은 0.001 ㎍/mL 초과의 농도에서 유의적인 용량 의존 결합을 나타냈다(도 7e). M1 항체에 의한 N 말단 상의 FLAG의 염색을 평가하여 모든 수용체 형질감염체 상의 수용체 발현을 확인하였다(Sigma F3040호).
[표 7] 에피토프 맵핑
Figure pct00027
펩티드 ELISA
또한, 펩티드 ELISA를 이용하여 CCR2의 제1 및/또는 제2 루프에 대한 에피토프 결합을 또한 평가하였다. Reacti-Bind NEUTRAVIDIN™ Coated, High Binding Capacity ELISA 플레이트(Pierce; 미국 일리노이주 락포드)를 PBS/0.05% Tween20으로 3회 세척한 후, 바이오티닐화 CCR2 루프 2(서열 번호 129) 또는 루프 3(서열 번호 130) 펩티드(AnaSpec; 미국 캘리포니아주 산 호세) 6 ㎍/ml의 100 ㎕/웰에 의해 코팅하였다. 플레이트를 1시간 동안 항온처리한 후, 3회 세척하였다. 이후, PBS/0.1% BSA/0.05% Tween20 중에 희석된, CCR2 길항제 항체 4.40.3 A68G S230P 또는 다른 1차 항체를 연속 희석으로 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 항온처리하고, 다른 대조군도 그렇게 하였다. 플레이트를 3회 세척하고 100 ㎕/웰 HRP-Mouse anti-Human IgG4 2차 항체(Zymed; 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코)를 1:5000 희석으로 모든 웰에 첨가하고, 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 3회 세척하고, TMB 기질을 모든 웰에 첨가하고, 약 30분 동안 항온처리하였다. 색상 반응을 2M H2SO4에 의해 중지시키고, 450 nM에서 플레이트 리더 상에서 흡광도 판독을 측정하였다(도 8). 항체 4.9 및 4.40를 포함하는 항체는 수용체의 제2 세포외 루프 펩티드에 결합하고 제3 루프에 결합하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 9
결합 선택도
인간 CCR2에 대한 4.40 A68G S230P 항체의 선택도를 도 9에 도시된 바대로 밀접하게 연관된 케모카인 수용체, CCR5에 대한 결합의 부재에 의해 및 CCR5/CCR1 리간드 MIP-1a에 의해 유도된 주화성 억제의 부재에 의해 확인하였다(도 3). 항CCR5 항체(Pharmingen, 카탈로그 555992호)는 CCR5를 발현하는 세포에 결합하였지만(도 9b), CCR2 항체 4.40.3 A68G S230P는 이 동일한 세포에 결합을 나타내지 않았다(도 9a). 이 연구 동안, CCR5를 발현하도록 조작된 300.19 세포를 CCR2 선택적 항체, 4.40 A68G S230P 또는 CCR5 선택적 항체 중 어느 하나로 30분 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 FACS 완충액(PBS 중의 0.02% 아지드화나트륨, 2% 열 비활성화 소 태아 혈청) 중에 세척하고 표준 방법을 이용하여 유세포 분석기를 사용하여 세포 표면 발현에 대해 분석하였다.
실시예 10
칼슘 동원
항체 4.40이 CCR2 상에 기능적 길항제로서 작용하고 어떠한 유의적인 효능제 특성을 보유하지 않는지를 결정하기 위해, CCR2 형질감염된 300-19 세포의 칼슘 동원에 대한 4.40.3의 효과를 이전에 기재된 바대로 시험하였다(Gladue RP et al., J Biol Chem 278:40473-40480 (2003)). 인간 CCR2 형질감염된 300-19 세포를 스핀 다운하고 10 mM Hepes(Gibco) 및 4.0 mM CaCl2(Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스))를 함유하는 PTI 완충액(HBSS(Gibco, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에 의해 2×106개의 세포/ml로 재현탁시켰다. 세포를 ml(최종 2 μM)당 indo-1 AM(Molecular Probes; Eugene(미국 오리건주)) 2 ㎕로 로딩하고, 37℃에서 25분 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 PTI 완충액으로 2회 세척하고 1×107/ml로 현탁시켰다. 여러 농도의 항체 또는 적절한 대조군을 세포에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 1 mm 스퀘어 큐벳(Sarstedt; 독일)에, 예열된 PTI 완충액 1.8 ml를 세포 현탁액 200 ㎕와 함께 첨가하였다. 세포를 여기시키고, Photon Technology Corporation International(PTI; 미국 뉴저지주 라우렌스빌)로부터 얻은 장비를 사용하여 형광을 측정하였다. 기계를 중지시키고, 100 nM MCP-1(Peprotech; 미국 뉴저지주 로키 힐) 20 ㎕를 첨가하였다. 반응 후, 다음의 시약을 이 순서로 첨가하여 전체 칼슘을 방출시키고 킬레이트시켰다: 18% Triton X-100 20 ㎕; 3M Tris(pH 8.5) 20 ㎕; 0.5M EGTA(pH 8.5) 20 ㎕(모두 Sigma로부터 구입). 항체 4.40는 용량 반응 방식으로 칼슘 동원을 유도하는 MCP-1의 능력을 억제하였다(도 10). 4.40 A68G S230P 항체에 의해 유사한 결과를 얻었다.
실시예 11
CCL2 및 CCL7에 대한 주화성 억제
4.40 A68G S230P 항체에 의한 주화성 억제가 MCP-1에 특이적인지 또는 이것이 또한 다른 CCR2 리간드에 적용되는지를 결정하기 위해, MCP-1(CCL2)에 대한 THP-1 세포의 주화성을 도 3에 도시된 바대로 CCL3(MIP-1a)에 대한 것과 비교하였다. 또 다른 CCR2 리간드에 대한 CCR2 형질감염된 300-19 세포의 이동 이외에, 항체 4.40 A68G S230P의 존재 하의 CCL7(MCP-3)을 또한 실시예 6에 기재된 바대로 유사한 주화성 분석을 이용하여 평가하였다. 4.40 A68G S230P 항체가 둘 다 공지된 CCR2 리간드인 CCL2(도 3) 및 CCL7(도 11)에 대한 주화성을 억제하였지만, 도 3은 CCR1/CCR5 리간드인 CCL3(MIP-1a)에 대해 주화성을 차단하지 않는 것을 나타냈다.
실시예 12
단핵구에서의 액틴 중합
인간 전체 혈액 액틴 중합
단일클론 항체 4.40 A68G S230P를 또한 도 12에 도시된 바대로 인간 전체 혈액 중에 액틴 중합을 억제하는 이의 능력에 대해 시험하였다. 혈액을 EDTA 진공 채혈관(VWR; 미국 마이애미주 보스톤)에서 수집한 후, 실온에서 30분 동안 항체 또는 KLH 대조군의 희석액에 의해 항온처리하였다. 완충액 대조군 또는 100 nM MCP-1(Peprotech; 미국 뉴저지주 로키 힐) 10 ㎕를 48웰 Corning 플레이트(VWR)에 첨가하였다. 이후, 혈액 100 ㎕를 온화하게 혼합하면서 첨가하고, 0.8 ml의 중지/용리 시약(10%의 FACS 용리액(Becton Dickinson; 미국 캘리포니아주 산 호세), 20%의 16% 파라포름알데하이드(Electron Microscopy Science; 미국 필라델피아주 포트 워싱턴) 및 70%의 H2O)에 의해 반응이 중지된 후 40초 동안 항온처리하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 항온처리하고, 스핀 다운하고, 세포를 96웰 환저 폴리프로필렌 플레이트로 옮기고, PBS로 2회 세척하였다. 웰당 PBS 100 ㎕를 첨가하였다. 이후, 염색 시약 50 ㎕(10X HBSS 중의 10%의 5 ㎎/ml 리소포스포티딜콜린(Sigma), 80%의 16% 파라포름알데하이드 및 10%의 6.6 μM NBD 팔라시딘(Molecular Probes; Eugene(미국 오리건주)))를 첨가하였다. 세포를 암소에서 실온에서 1시간 동안 염색시켰다. 항온처리한 후, 세포를 2% 소 태아 혈청(Hyclone, 미국 유타주 로간)을 포함하는 PBS로 2회 세척하고, 형광을 단핵구에서 게이트된 FACSCAN(Becton Dickinson) 상에서 정량하였다. 도 12에 도시된 바대로, 항체 4.40 A68G S230P는 0.168 ㎍/ml의 IC50로 액틴 중합을 억제하였다.
사이노몰거스 원숭이 전체 혈액 액틴 중합
혈액을 EDTA 진공 채혈관(VWR; 미국 마이애미주 보스톤)에서 수집한 후, 실온에서 30분 동안 항체 또는 이소타입 대조군의 희석액으로 항온처리하였다. 이 시간 동안, 100 nM MCP-1(Peprotech; 미국 뉴저지주 로키 힐; 최종 농도 10 nM) 또는 완충액 대조군(Ca+2 또는 Mg+2가 없는 HBSS(Gibco; 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 및 0.2% BSA(Sigma; 미국 미주리주 세인트 루이스)) 10 ㎕를 48웰 Corning 플레이트(VWR)에 첨가하였다. 이후, 혈액 100 ㎕를 온화하게 혼합하면서 첨가하고, 40초 동안 항온처리하였다. 0.8 ml의 중지/용리 시약(10%의 FACS 용리액(Becton Dickinson; 미국 캘리포니아주 산 호세), 20%의 16% 파라포름알데하이드(Electron Microscopy Science; 미국 필라델피아주 포트 워싱턴) 및 70%의 H2O)에 의해 반응을 중지시켰다. 플레이트를 10분 동안 항온처리하고, 스핀 다운하고, PBS로 2회 세척하였다. 이후, 세포를 염색 시약(10X HBSS 중의 10%의 5 ㎎/ml 리소포스포티딜콜린(Sigma), 80%의 16% 파라포름알데하이드 및 10%의 6.6 μM NBD 팔라시딘(Molecular Probes; Eugene(미국 오리건주)))에 의해 암소에서 실온에서 1시간 동안 염색시켰다. 항온처리한 후, 세포를 2% 소 태아 혈청(Hyclone, 미국 유타주 로간)을 포함하는 PBS로 2회 세척하고, 형광을 활성화 단핵구에서 게이트된 FACSCAN(Becton Dickinson) 상에서 정량하였다. 도 13에 도시된 바대로, 항체 4.40 A68G S230P는 0.49 ㎍/ml의 IC50로 사이노몰거스 원숭이에서 전체 혈액 액틴 중합을 억제하였다.
실시예 13
콜라겐 I mRNA 정량 분석
37℃에서 5% CO2 습윤 인큐베이터에서 10% 탈활성화 FBS, 100 U/ml 페니실린/100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 2 mM L-Gln(Invitrogen)이 보충된 DME 배지를 포함하는 플라스크에서 인간 간 성상 세포주, LI-90(JCRB Cellbank, 일본)를 배양하였다. 96웰 조직 배양 플레이트에서 3일 동안 20,000개의 세포/웰로 세포를 배양하고, 1000 nM의 MCP-1(PeproTech) 및 다양한 농도의 4.40 A68G S230P로 37℃에서 48시간 동안 처리하였다. 배양 배지를 제고하고, QUANTIGENE™ Expression Kit(Panomics)가 보충된 용리 완충액 100 ㎕를 첨가하여 세포를 용리시켰다. 제조업자의 지시에 따라 분지된 DNA 분석을 수행하였다. 간단히 말하면, 전체 RNA의 샘플을 하이브리드화 완충액 및 50 fmol/㎕의 Col1A1/GAPDH 프로브 세트를 포함하는 96웰 미량적정 플레이트 상에 로딩하였다. 포획된 mRNA를 46℃에서 60분 동안 항온처리하여 알칼리 포스파타제 분자가 포함된 분지된 DNA 분자로 하이브리드화하였다. 46℃에서 30분 동안 화학발광 기질과 함께 추가로 항온처리한 후, 발광을 발광측정기(ARVOsx, Perkin Elmer; 미국 메사추세츠주)에 의해 정량하였다. GAPDH에 대한 Col1A1의 발광의 비율을 계산하고, Prism 4.0 소프트웨어에 의해 데이터를 분석하여 IC50 값(GraphPad)을 결정하였다. 도 14에 도시된 바대로, 4.40 A68G S230P는 0.89 ㎍/mL의 IC50 값(6.2 nM)으로 MCP-1에 유도된 LI90 세포에서 콜라겐 IAI mRNA 합성을 억제하였다.
실시예 14
pERK 인산화
건강한 지원자로부터 인간 전체 혈액을 새로 단리하였다. FACS 분석은 MCP-1의 첨가 6분 후 CD14+ 단핵구에서 세포외 신호 조절 키나아제(pERK)의 높은 수치의 인산화를 나타냈다. 4.40 A68G S230P는 용량 의존 방식으로 전체 혈액에서 MCP-1 유도된 pERK 인산화를 억제하였다(도 15). MCP-1에 의한 생체외 자극 이후 단핵구에서의 pERK 인산화를 메커니즘 생체 마커로서 이용하여, PK/PD 및 번역 약리학을 수월하게 할 수 있었다. 이 전체 혈액 분석에서 4.40 A68G S230P 항체에 대해 얻은 IC50 및 IC90 값은 각각 0.44 ㎍/mL(2.9 nM) 및 0.89 ㎍/ml(6.1 nM)이었다.
실시예 15
쥐과 급성 간염 모델
간염의 급성 마우스 ConA 모델을 이용하여 4.40 A68G S230P 항체의 효율을 또한 검사하였다. 이 실험의 경우, 4.40 A68G S230P 항체가 설치류 CCR2를 인식하지 않기 때문에 마우스 CCR2가 인간 CCR2로 대체된 형질전환 마우스를 사용하였다. 동물에게 식염수 중의 0.1, 0.3 또는 1.0 ㎎/kg로 mAb를 단일 복강내 주사하였다. IgG4 이소타입 대조군 항체를 개별 군에게 투여하였다. 30분 후, 동물에게 발열원 비함유 식염수 중의 15 ㎎/kg ConA를 i.v. 꼬리 정맥 주사(0.1 mL)하였다. 대조군에게 ConA가 없는 식염수를 주었다. 24시간 후, 혈액 샘플을 얻고, 혈장 간 효소를 분석하였다. 도 16에 도시된 바대로, ALT 및 AST는 25,000 U/L에 가까운 값으로 항체 대조군에서 현저히 상승하였다. 반대로, 0.5 및 1.0 ㎎/kg의 4.40 A68G S230P로 치료된 마우스는 대략 각각 50% 및 80%로 이의 혈장 간 효소의 유의적인 감소를 나타냈다.
실시예 17
동물 질환 모델에서 치료학적 효과
염증
염증의 생체내 포유동물 모델을 이용하여 4.40 및 4.9 항체를 비롯한 인간 항CCR2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 치료학적 효과를 시험하였다. 적합한 동물, 예컨대 래빗, 마우스, 랫트, 기니아 피그 또는 레서스 마카크에 포유동물 CCR2, 예컨대 4.40 항체와 반응성인 케모카인, 예컨대 MCP-1 및 항체 또는 이의 단편을 피내 주사하여 백혈구 침윤을 모니터링하였다(예를 들면, 문헌[Van Damme, J. et al., J. Exp. Med. 176:59-65 (1992); Zachariae, C. O. C. et al., J. Exp. Med. 171:2177-2182 (1990); Jose, P. J. et al., J. Exp. Med. 179: 881-887 (1994)] 참조). 백혈구(예를 들면, 호산구 및 과립구)의 침윤에 대해 피부 생검 조직을 조직학으로 평가하였다. 길항제 항CCR2 항체가 대조군 동물과 비교하여 백혈구의 침윤을 감소시키는 것으로 예상되었다.
다발성 경화증
다발성 경화증의 생체내 포유동물 모델을 이용하여 4.40 및 4.9 항체를 비롯한 항체 또는 이의 단편의 치료학적 효과를 시험하였다. 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증(MS)에 대한 동물 모델로서 작용하는 중추 신경계(CNS)의 T 세포 매개 염증성 질환이다(문헌[Steinman L, Neuron 24:511-514 (1999)] 참조). 뇌염 유발 물질 MOG35 -55 펩티드에 의한 면역화(p.i.) 0일 및 7일 후에, 미코박테리움 튜베쿨로시스(tuberculosis), H37Ra(Difco) 70 ㎍을 포함하는 불완전 프로이드 항원보강제(IFA; Difco, 미국 미시간주 디트로이트) 중에 유화된 총 600 ㎍의 뇌염 유발 물질 MOG35 -55에 의한 피하(s.c.) 주사(2개소, 배근 옆구리)에 의해 활성 EAE에 대해 C57/J129 및/또는 C57BL/6 마우스를 민감화시켰다. p.i. 0일 및 2일에, 각각의 마우스는 또한 꼬리 정맥을 통해 정맥내로(i.v.) 백일해 독소(PTX; List Biological Laboratories, 미국 캘리포니아주 캡프벨) 500 ng을 투여받았다. 몇몇 동물은 또한 항CCR2 길항제 항체, 예컨대 4.40 항체의 상승 용량을 받았다. 임상 증상에 대해 동물을 매일 평가하고 다음의 스케일에 따라 평가하였다: 0등급, 비정상 아님; 1등급, 약한 꼬리; 2등급, 축 처진 꼬리 및 뒷다리가 허약; 3등급, 뒷다리 부분마비; 4등급, 사지마비; 및 5등급, 반사 또는 사망.
또한, 눈 신경, 대뇌, 소뇌 및 척수로부터 얻은 글루타르알데하이드/오스뮴 고정 조직 샘플에서 광 현미경 연구를 수행하였다. 조직 샘플을 탈수시키고, 1 ㎛ 시험편이 절단되고 톨루이딘 블루에 의해 염색된 에폭시 수지 중에 포매시켰다. 염증, 탈수초, 월러 변성(WD; Wallerian degeneration) 및 재수초화를 이미 기재된 바대로 0 내지 5의 스케일로 평점 매겼다(Cannella et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:10100-10105 (1998)). 항CCR2 길항제 항체에 의해 치료된 마우스는 대조군 동물에 비해 임상 비정상, 염증, 탈수초 및 WD의 증상의 감소를 나타내는 것으로 기대되었다. 추가로, 이러한 감소는 용량 의존 방식으로 일어나는 것으로 기대되었다.
신경병증성 통증
신경병증성 통증의 생체내 포유동물 모델을 이용하여 4.40 및 4.9 항체를 비롯한 항체 또는 이의 단편의 치료학적 효과를 시험하였다. C57BL 마우스를 2개 군으로 나눴다. 실험군에 꼬리 정맥 주사를 통해 항CCR2 길항제 항체, 예컨대 4.40 항체를 매일 투여하지만, 제2 군에는 항체를 투여하지 않았다. 다음의 분석으로 치료 개시 후 시간 간격으로 2개 군을 시험하였다:
운동 기능( Rota - rod ) . 초기에, 마우스를 10 rpm의 속도로 3분 동안 운동 기능에 대해 훈련시켰다. 시험을 위해, 속도를 60분 동안 10 rpm으로 설정하고, 후속적으로 600 rpm으로 상승시켰다. 마우스가 상승 시작 후 감소하는 데 걸리는 시간을 기록하였다.
핫 플레이트 . 마우스를 2분 동안 온도가 45℃로 설정된 핫 플레이트 장치에 길들였다. 후속적으로, 마우스를 핫 플레이트에 배치하고 온도를 순차적으로 52.5℃ 및 55.5℃(컷오프를 30초로 설정)로 각각 변화시킨 후, 58.5℃(컷오프를 20초로 설정)로 변화시켰다. 마우스가 자신의 발을 핥거나 점프하는 시간을 기록하였다.
포르말린 시험 . 시험 전 4일 동안, 마우스를 시험 플랫폼에서 매일 2시간 동안 순응시켰다. 연구 일자에, 마우스를 시험 플랫폼에 1시간 동안 배치하고, 후속적으로 왼쪽 발의 발바닥 면에서 2% 포르말린 10 ㎕를 투여하였다. 마우스가 주입된 발을 핥거나 들어올리는 데 걸리는 시간을 50분 동안 5분 간격으로 2분 기간에 걸쳐 기록하였다.
열 및 기계 자극 . 방사성 열 자극에 대한 발 움추림 잠복기를 측정하여 열 민감성을 평가하였다(Hargreaves et al., Pain 32:77-88 (1988)). 업 및 다운 패러다임을 이용하여 보정된 본 프레이 필라멘트(von Frey filament)에 의해 기계 민감성을 결정하였다(Chaplan et al., J. Neurosci. Methods 53, 55-63 (1994)).
신경 손상 . 케타민(50 ㎎/kg, i.m.)과 메데토미딘(1 ㎎/kg, i.m.)의 혼합물로 마우스를 마취시켰다. 좌골 신경에 평행인 관골 바로 아래를 절개하였다. 신경을 노출시키고 임의의 접착 조직을 신경으로부터 제거하였다. 좌골 신경의 직경의 ⅓ 내지 ½ 주위에 6-0 실크 봉합사로 단단히 결찰시켰다. 근육을 봉합사로 봉하고 상처를 운드 클립(wound clip)으로 봉하였다. 신경 손상 15일 전 및 후에 기계 자극에 대한 마우스의 반응을 시험하였다.
항CCR2 길항제 항체에 의해 치료된 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 신경병증성 통증의 증상 감소를 나타내는 것으로 예상되었다.
[표 8] CDR 서열 분석(서열 번호)
Figure pct00028
미국 표준 균주 보존 기관(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-6979 20050916 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-6980 20050916 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-6981 20050916 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-7341 20060131 미국 표준 균주 보존 기관(ATCC: American Type Culture Collection) PTA-7342 20060131
SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Inc <120> CCR2 antibodies <130> PC032985 <160> 203 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt caaacatatg atggaagaaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa aacgttgtat 240 ctgcaaatga acagactgag agctgaggac acggctgtgt attattgtgc gagagatcag 300 gcgtactgga agtactttga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1350 <210> 2 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agttatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt caaacatatg atggaagaaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa aacgttgtat 240 ctgcaaatga acagactgag agctgaggac acggctgtgt attattgtgc gagagatcag 300 gcgtactgga agtactttga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 agttatggca tgcac 15 <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gttcaaacat atgatggaag aaataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gatcaggcgt actggaagta ctttgatgct tttgatatc 39 <210> 6 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt 90 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg ca 42 <210> 8 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgattcacca tctccagaga caattccaag aaaacgttgt atctgcaaat gaacagactg 60 agagctgagg acacggctgt gtattattgt gcgaga 96 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tggggccaag ggacaatggt caccgtctct tca 33 <210> 10 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Gln Thr Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gln Ala Tyr Trp Lys Tyr Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 11 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Gln Thr Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gln Ala Tyr Trp Lys Tyr Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 13 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Gln Thr Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Gln Ala Tyr Trp Lys Tyr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 15 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 16 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Arg Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 19 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctacat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacaatt ccccgtgcag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa gaacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 20 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctacat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacaatt ccccgtgcag ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 cgggcaagtc agagcattag cagctattta aat 33 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gctgcatcca gtttgcaaag t 21 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 caacagagtt acaattcccc gtgcagt 27 <210> 24 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctacat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgc 69 <210> 25 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct aagctcctga tctat 45 <210> 26 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 ggggtcccat caaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 60 agtctgcaac ctgaagattt tgcaacttac tactgt 96 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa 30 <210> 28 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Ser Pro Cys 85 90 95 Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Lys Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asn Ser Pro Cys 85 90 95 Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Gln Ser Tyr Asn Ser Pro Cys Ser 1 5 <210> 33 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 35 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 37 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactggat acgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaatg atcaacccta gtggtggtag cacaacctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccttg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggacctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagagaga 300 tggtataagt ggaacttcga tgtttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1350 <210> 38 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tgcactggat acgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaatg atcaacccta gtggtggtag cacaacctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccttg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggacctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtat attactgtgc gagagagaga 300 tggtataagt ggaacttcga tgtttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 agctactata tgcac 15 <210> 40 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 atgatcaacc ctagtggtgg tagcacaacc tacgcacaga agttccaggg c 51 <210> 41 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 gagagatggt ataagtggaa cttcgatgtt tttgatatc 39 <210> 42 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc 90 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 tggatacgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg ga 42 <210> 44 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 44 agagtcacct tgaccaggga cacgtccacg agcacagtct acatggacct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt atattactgt gcgaga 96 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 tggggccaag ggacaatggt caccgtctct tca 33 <210> 46 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Trp Tyr Lys Trp Asn Phe Asp Val Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 47 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Trp Tyr Lys Trp Asn Phe Asp Val Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Ser Tyr Tyr Met His 1 5 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Met Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Glu Arg Trp Tyr Lys Trp Asn Phe Asp Val Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 51 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 52 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 53 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Arg Val Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Asp 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 54 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagccccgta tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 cttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taactgggac 180 gctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttgggttt tattacactg gccgatcgat caccgtcggc 300 caagggacac gactggagat taaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648 <210> 56 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtca aagccccgta tacagtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120 cttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taactgggac 180 gctggggtcc cagacagatt cagcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttgggttt tattacactg gccgatcgat caccgtcggc 300 caagggacac gactggagat taaa 324 <210> 57 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 57 aggtctagtc aaagccccgt atacagtgat ggaaacacct acttgaat 48 <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 aaggtttcta actgggacgc t 21 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 actggccgat cgatcacc 18 <210> 60 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 60 gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60 atctcctgc 69 <210> 61 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 61 tggcttcagc agaggccagg ccaatctcca aggcgcctaa tttat 45 <210> 62 <211> 93 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 62 ggggtcccag acagattcag cggcagtggg tcaggcactg atttcacact gaaaatcagc 60 agggtggagg ctgaggatgt tgggttttat tac 93 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 63 gtcggccaag ggacacgact ggagattaaa 30 <210> 64 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Pro Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ala Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Thr Gly Arg Ser 85 90 95 Ile Thr Val Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 65 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Pro Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ala Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr Thr Gly Arg Ser 85 90 95 Ile Thr Val Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 66 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Arg Ser Ser Gln Ser Pro Val Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 15 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Lys Val Ser Asn Trp Asp Ala 1 5 <210> 68 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Thr Gly Arg Ser Ile Thr 1 5 <210> 69 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys 20 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Phe Tyr Tyr 20 25 30 <210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Val Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 73 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 73 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atattatatg atggaaagaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcag 300 gcgtactgga cctactttga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1350 <210> 74 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 74 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atattatatg atggaaagaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcag 300 gcgtactgga cctactttga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttca 366 <210> 75 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 75 agctatggca tgcac 15 <210> 76 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 76 gttatattat atgatggaaa gaataaatac tatgcagact ccgtgaaggg c 51 <210> 77 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 77 gatcaggcgt actggaccta ctttgatgct tttgatatc 39 <210> 78 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 78 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact caccttcagt 90 <210> 79 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 79 tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg ca 42 <210> 80 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 80 cgattcacca tctccagaga caattccaag aacacgctgt atctgcaaat gaacagcctg 60 agagctgagg acacggctgt gtattactgt gcgaga 96 <210> 81 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 81 tggggccaag ggacaatggt caccgtctct tca 33 <210> 82 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Leu Tyr Asp Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gln Ala Tyr Trp Thr Tyr Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 83 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Leu Tyr Asp Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gln Ala Tyr Trp Thr Tyr Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ser Tyr Gly Met His 1 5 <210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Val Ile Leu Tyr Asp Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 86 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Asp Gln Ala Tyr Trp Thr Tyr Phe Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 87 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 88 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 89 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 90 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 91 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 91 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtca gagcattggt agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120 gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgcgacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg caacgtatta ctgtcatcag agtagtagtt taccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 92 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 92 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtca gagcattggt agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120 gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgcgacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg caacgtatta ctgtcatcag agtagtagtt taccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 93 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 93 cgggccagtc agagcattgg tagtagctta cac 33 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 tatgcttccc agtccttctc a 21 <210> 95 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 catcagagta gtagtttacc gctcact 27 <210> 96 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgc 69 <210> 97 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 tggtaccagc agaaaccaga tcagtctcca aagctcctca tcaag 45 <210> 98 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgcgacag atttcaccct caccatcaat 60 agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat tactgt 96 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 ttcggcggag ggaccaaggt ggagatcaaa 30 <210> 100 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 100 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 101 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 102 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 103 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 104 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr 1 5 <210> 105 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 105 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 106 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 106 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Lys 1 5 10 15 <210> 107 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 108 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 109 <211> 645 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtca gagcattggt agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120 gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg caacgtatta ctgtcatcag agtagtagtt taccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645 <210> 110 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 gaaattgtgc tgactcagtc tccagacttt cagtctgtga ctccaaagga gaaagtcacc 60 atcacctgcc gggccagtca gagcattggt agtagcttac actggtacca gcagaaacca 120 gatcagtctc caaagctcct catcaagtat gcttcccagt ccttctcagg ggtcccctcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcaccctca ccatcaatag cctggaagct 240 gaagatgctg caacgtatta ctgtcatcag agtagtagtt taccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 111 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 ggggtcccct cgaggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcaccct caccatcaat 60 agcctggaag ctgaagatgc tgcaacgtat tactgt 96 <210> 112 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 113 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 114 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 115 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atattatatg atggaaagaa taaatactat 180 gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcag 300 gcgtactgga cctactttga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcttcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccacca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1350 <210> 116 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Leu Tyr Asp Gly Lys Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gln Ala Tyr Trp Thr Tyr Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 117 <211> 389 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 117 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser Asp Tyr 20 25 30 Lys Asp Asp Asp Asp Val Asp Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr 35 40 45 Asp Thr Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys 50 55 60 Val Asn Glu Arg Ala Phe Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val Leu Ile 85 90 95 Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr Leu Leu 100 105 110 Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro Leu Trp 115 120 125 Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met Cys Lys 130 135 140 Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe 145 150 155 160 Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val 165 170 175 Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr Ser Val 180 185 190 Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile Ile Phe 195 200 205 Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro Tyr Phe 210 215 220 Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile Leu Gly 225 230 235 240 Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu 245 250 255 Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val 260 265 270 Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Thr Pro 275 280 285 Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Asp Phe Leu Phe Thr 290 295 300 His Glu Cys Glu Gln Ser Arg His Leu Asp Leu Ala Val Gln Val Thr 305 310 315 320 Glu Val Ile Ala Tyr Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala 325 330 335 Phe Val Gly Glu Arg Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe His Arg 340 345 350 Arg Val Ala Val His Leu Val Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp 355 360 365 Arg Leu Glu Arg Val Ser Ser Thr Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu 370 375 380 Leu Ser Ala Gly Phe 385 <210> 118 <211> 1167 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 atggacagca aaggttcgtc gcagaaaggg tcccgcctgc tcctgctgct ggtggtgtca 60 aatctactct tgtgccaggg tgtggtctcc gattacaaag atgatgatga tgtcgacgaa 120 actccaaaca ccacagagga ctatgacacg accacagagt ttgactatgg ggatgcaact 180 ccgtgccaga aggtgaacga gagggccttt ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg 240 ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc 300 aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctt 360 tttcttatta ctctcccatt gtgggctcac tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat 420 gcaatgtgca aattattcac agggctgtat cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc 480 atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa 540 gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt 600 gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt 660 ggcccttatt ttccacgagg atggaataat ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg 720 ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt 780 cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt 840 gtttactttc tcttctggac tccctataac attgtcattc tcctgaacac cttccaagac 900 ttcctgttca cccatgagtg tgagcagagc agacatttgg acctggctgt gcaagtgacg 960 gaggtgatcg cctacacgca ctgctgtgtc aacccagtga tctacgcctt cgttggtgag 1020 aggttccgga agtacctgcg gcagttgttc cacaggcgtg tggctgtgca cctggttaaa 1080 tggctcccct tcctctccgt ggacaggctg gagagggtca gctccacatc tccctccaca 1140 ggggagcatg aactctctgc tgggttc 1167 <210> 119 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 119 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser Asp Tyr 20 25 30 Lys Asp Asp Asp Asp Val Asp Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr 35 40 45 Asp Thr Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys 50 55 60 Val Asn Glu Arg Ala Phe Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Val Phe Val Ile Gly Leu Val Gly Asn Ile Leu Val Val Leu Val 85 90 95 Leu Val Gln Tyr Lys Arg Leu Lys Asn Met Thr Ser Ile Tyr Leu Leu 100 105 110 Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Phe Thr Leu Pro Phe Trp 115 120 125 Ile Asp Tyr Lys Leu Lys Asp Asp Trp Val Phe Gly Asp Ala Met Cys 130 135 140 Lys Ile Leu Ser Gly Phe Tyr Tyr Thr Gly Leu Tyr Ser Glu Ile Phe 145 150 155 160 Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala 165 170 175 Val Phe Ala Leu Arg Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser 180 185 190 Ile Ile Ile Trp Ala Leu Ala Ile Leu Ala Ser Met Pro Gly Leu Tyr 195 200 205 Phe Ser Lys Thr Gln Trp Glu Phe Thr His His Thr Cys Ser Leu His 210 215 220 Phe Pro His Glu Ser Leu Arg Glu Trp Lys Leu Phe Gln Ala Leu Lys 225 230 235 240 Leu Asn Leu Phe Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Val Met Ile Ile Cys 245 250 255 Tyr Thr Gly Ile Ile Lys Ile Leu Leu Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys 260 265 270 Ser Lys Ala Val Arg Leu Ile Phe Val Ile Met Ile Ile Phe Phe Leu 275 280 285 Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Leu Ile Ser Val Phe Gln Glu 290 295 300 Phe Phe Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala 305 310 315 320 Thr Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro 325 330 335 Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Val 340 345 350 Phe Phe Arg Lys His Ile Thr Lys Arg Phe Cys Lys Gln Cys Pro Val 355 360 365 Phe Tyr Arg Glu Thr Val Asp Gly Val Thr Ser Thr Asn Thr Pro Ser 370 375 380 Thr Gly Glu Gln Glu Val Ser Ala Gly Leu 385 390 <210> 120 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 atggacagca aaggttcgtc gcagaaaggg tcccgcctgc tcctgctgct ggtggtgtca 60 aatctactct tgtgccaggg tgtggtctcc gattacaaag atgatgatga tgtcgacgaa 120 actccaaaca ccacagagga ctatgacacg accacagagt ttgactatgg ggatgcaact 180 ccgtgccaga aggtgaacga gagggccttt ggggcccaac tgctgccccc tctgtactcc 240 ttggtatttg tcattggcct ggttggaaac atcctggtgg tcctggtcct tgtgcaatac 300 aagaggctaa aaaacatgac cagcatctac ctcctgaacc tggccatttc tgacctgctc 360 ttcctgttca cgcttccctt ctggatcgac tacaagttga aggatgactg ggtttttggt 420 gatgccatgt gtaagatcct ctctgggttt tattacacag gcttgtacag cgagatcttt 480 ttcatcatcc tgctgacgat tgacaggtac ctggccatcg tccacgccgt gtttgccttg 540 cgggcacgga ccgtcacttt tggtgtcatc accagcatca tcatttgggc cctggccatc 600 ttggcttcca tgccaggctt atacttttcc aagacccaat gggaattcac tcaccacacc 660 tgcagccttc actttcctca cgaaagccta cgagagtgga agctgtttca ggctctgaaa 720 ctgaacctct ttgggctggt attgcctttg ttggtcatga tcatctgcta cacagggatt 780 ataaagattc tgctaagacg accaaatgag aagaaatcca aagctgtccg tttgattttt 840 gtcatcatga tcatcttttt tctcttttgg accccctaca atttgactat acttatttct 900 gttttccagg aattcttcgg cctgagtaac tgtgaaagca ccagtcaact ggaccaagcc 960 acgcaggtga cagagactct tgggatgact cactgctgca tcaatcccat catctatgcc 1020 ttcgttgggg agaagttcag aaggtatctc tcggtgttct tccgaaagca catcaccaag 1080 cgcttctgca aacaatgtcc agttttctac agggagacag tggatggagt gacttcaaca 1140 aacacgcctt ccactgggga gcaggaagtc tcggctggtt ta 1182 <210> 121 <211> 390 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 121 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser Asp Tyr 20 25 30 Lys Asp Asp Asp Asp Val Asp Glu Thr Pro Asn Thr Thr Glu Asp Tyr 35 40 45 Asp Thr Thr Thr Glu Phe Asp Tyr Gly Asp Ala Thr Pro Cys Gln Lys 50 55 60 Val Asn Glu Arg Ala Phe Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val Leu Ile 85 90 95 Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr Leu Leu 100 105 110 Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro Leu Trp 115 120 125 Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met Cys Lys 130 135 140 Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe 145 150 155 160 Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val 165 170 175 Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr Ser Val 180 185 190 Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile Ile Phe 195 200 205 Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro Tyr Phe 210 215 220 Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile Leu Gly 225 230 235 240 Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu 245 250 255 Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val 260 265 270 Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Thr Pro 275 280 285 Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu 290 295 300 Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln Val Thr 305 310 315 320 Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala 325 330 335 Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Val Phe Phe Arg Lys 340 345 350 His Ile Thr Lys Arg Phe Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr Arg Glu 355 360 365 Thr Val Asp Gly Val Thr Ser Thr Asn Thr Pro Ser Thr Gly Glu Gln 370 375 380 Glu Val Ser Ala Gly Leu 385 390 <210> 122 <211> 1170 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 atggacagca aaggttcgtc gcagaaaggg tcccgcctgc tcctgctgct ggtggtgtca 60 aatctactct tgtgccaggg tgtggtctcc gattacaaag atgatgatga tgtcgacgaa 120 actccaaaca ccacagagga ctatgacacg accacagagt ttgactatgg ggatgcaact 180 ccgtgccaga aggtgaacga gagggccttt ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg 240 ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc 300 aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctt 360 tttcttatta ctctcccatt gtgggctcac tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat 420 gcaatgtgca aattattcac agggctgtat cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc 480 atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa 540 gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt 600 gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt 660 ggcccttatt ttccacgagg atggaataat ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg 720 ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt 780 cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt 840 gtttactttc tcttctggac tccctataac attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa 900 ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca 960 gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc aatcccatca tctatgcctt cgttggggag 1020 aagttcagaa ggtatctctc ggtgttcttc cgaaagcaca tcaccaagcg cttctgcaaa 1080 caatgtccag ttttctacag ggagacagtg gatggagtga cttcaacaaa cacgccttcc 1140 actggggagc aggaagtctc ggctggttta 1170 <210> 123 <211> 400 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Met Asp Ser Lys Gly Ser Ser Gln Lys Gly Ser Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ser Asn Leu Leu Leu Cys Gln Gly Val Val Ser Asp Tyr 20 25 30 Lys Asp Asp Asp Asp Val Asp Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile 35 40 45 Arg Asn Thr Asn Glu Ser Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr 50 55 60 Asp Tyr Gly Ala Pro Cys His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala 65 70 75 80 Gln Leu Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val 85 90 95 Gly Asn Met Leu Val Val Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys 100 105 110 Cys Leu Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu 115 120 125 Phe Leu Ile Thr Leu Pro Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp 130 135 140 Val Phe Gly Asn Ala Met Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile 145 150 155 160 Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg 165 170 175 Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe Ala Leu Arg Ala Arg Thr Val 180 185 190 Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Ile Ile Ile Trp Ala Leu Ala Ile Leu 195 200 205 Ala Ser Met Pro Gly Leu Tyr Phe Ser Lys Thr Gln Trp Glu Phe Thr 210 215 220 His His Thr Cys Ser Leu His Phe Pro His Glu Ser Leu Arg Glu Trp 225 230 235 240 Lys Leu Phe Gln Ala Leu Lys Leu Asn Leu Phe Gly Leu Val Leu Pro 245 250 255 Leu Leu Val Met Ile Ile Cys Tyr Thr Gly Ile Ile Lys Ile Leu Leu 260 265 270 Arg Arg Pro Asn Glu Lys Lys Ser Lys Ala Val Arg Leu Ile Phe Val 275 280 285 Ile Met Ile Ile Phe Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr Asn Leu Thr Ile 290 295 300 Leu Ile Ser Val Phe Gln Asp Phe Leu Phe Thr His Glu Cys Glu Gln 305 310 315 320 Ser Arg His Leu Asp Leu Ala Val Gln Val Thr Glu Val Ile Ala Tyr 325 330 335 Thr His Cys Cys Val Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Arg 340 345 350 Phe Arg Lys Tyr Leu Arg Gln Leu Phe His Arg Arg Val Ala Val His 355 360 365 Leu Val Lys Trp Leu Pro Phe Leu Ser Val Asp Arg Leu Glu Arg Val 370 375 380 Ser Ser Thr Ser Pro Ser Thr Gly Glu His Glu Leu Ser Ala Gly Phe 385 390 395 400 <210> 124 <211> 1200 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 atggacagca aaggttcgtc gcagaaaggg tcccgcctgc tcctgctgct ggtggtgtca 60 aatctactct tgtgccaggg tgtggtctcc gattacaaag atgatgatga tgtcgacctg 120 tccacatctc gttctcggtt tatcagaaat accaacgaga gcggtgaaga agtcaccacc 180 ttttttgatt atgattacgg tgctccctgt cataaatttg acgtgaagca aattggggcc 240 caactcctgc ctccgctcta ctcgctggtg ttcatctttg gttttgtggg caacatgctg 300 gtcgtcctca tcttaataaa ctgcaaaaag ctgaagtgct tgactgacat ttacctgctc 360 aacctggcca tctctgatct gctttttctt attactctcc cattgtgggc tcactctgct 420 gcaaatgagt gggtctttgg gaatgcaatg tgcaaattat tcacagggct gtatcacatc 480 ggttattttg gcggaatctt tttcatcatc ctgctgacga ttgacaggta cctggccatc 540 gtccacgccg tgtttgcctt gcgggcacgg accgtcactt ttggtgtcat caccagcatc 600 atcatttggg ccctggccat cttggcttcc atgccaggct tatacttttc caagacccaa 660 tgggaattca ctcaccacac ctgcagcctt cactttcctc acgaaagcct acgagagtgg 720 aagctgtttc aggctctgaa actgaacctc tttgggctgg tattgccttt gttggtcatg 780 atcatctgct acacagggat tataaagatt ctgctaagac gaccaaatga gaagaaatcc 840 aaagctgtcc gtttgatttt tgtcatcatg atcatctttt ttctcttttg gaccccctac 900 aatttgacta tacttatttc tgttttccaa gacttcctgt tcacccatga gtgtgagcag 960 agcagacatt tggacctggc tgtgcaagtg acggaggtga tcgcctacac gcactgctgt 1020 gtcaacccag tgatctacgc cttcgttggt gagaggttcc ggaagtacct gcggcagttg 1080 ttccacaggc gtgtggctgt gcacctggtt aaatggctcc ccttcctctc cgtggacagg 1140 ctggagaggg tcagctccac atctccctcc acaggggagc atgaactctc tgctgggttc 1200 <210> 125 <211> 374 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 125 Met Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys 20 25 30 His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu 35 40 45 Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val 50 55 60 Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro 85 90 95 Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met 100 105 110 Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile 115 120 125 Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His 130 135 140 Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr 145 150 155 160 Ser Val Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile 165 170 175 Ile Phe Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro 180 185 190 Tyr Phe Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile 195 200 205 Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly 210 215 220 Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg 225 230 235 240 Ala Val Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp 245 250 255 Thr Pro Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe 260 265 270 Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln 275 280 285 Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile 290 295 300 Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Ser Leu Phe His Ile Ala Leu 305 310 315 320 Gly Cys Arg Ile Ala Pro Leu Gln Lys Pro Val Cys Gly Gly Pro Gly 325 330 335 Val Arg Pro Gly Lys Asn Val Lys Val Thr Thr Gln Gly Leu Leu Asp 340 345 350 Gly Arg Gly Lys Gly Lys Ser Ile Gly Arg Ala Pro Glu Ala Ser Leu 355 360 365 Gln Asp Lys Glu Gly Ala 370 <210> 126 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 126 Met Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys 20 25 30 His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu 35 40 45 Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val 50 55 60 Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr 65 70 75 80 Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro 85 90 95 Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met 100 105 110 Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile 115 120 125 Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His 130 135 140 Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr 145 150 155 160 Ser Val Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile 165 170 175 Ile Phe Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro 180 185 190 Tyr Phe Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile 195 200 205 Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly 210 215 220 Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg 225 230 235 240 Ala Val Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp 245 250 255 Thr Pro Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe 260 265 270 Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln 275 280 285 Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile 290 295 300 Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Val Phe Phe 305 310 315 320 Arg Lys His Ile Thr Lys Arg Phe Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr 325 330 335 Arg Glu Thr Val Asp Gly Val Thr Ser Thr Asn Thr Pro Ser Thr Gly 340 345 350 Glu Gln Glu Val Ser Ala Gly Leu 355 360 <210> 127 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Met Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser 1 5 10 15 Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys 20 25 30 His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala 35 40 <210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 128 Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met Cys Lys 1 5 10 <210> 129 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro Tyr Phe 1 5 10 15 Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg 20 25 <210> 130 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 130 Gln Glu Phe Phe Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp 1 5 10 15 Gln <210> 131 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Met Asp Tyr Gln Val Ser Ser Pro Ile Tyr Asp Ile Asn Tyr Tyr Thr 1 5 10 15 Ser Glu Pro Cys Gln Lys Ile Asn Val Lys Gln Ile Ala Ala Arg Leu 20 25 30 Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn 35 40 45 Met Leu Val Ile Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Arg Leu Lys Ser Met 50 55 60 Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Phe Phe Leu 65 70 75 80 Leu Thr Val Pro Phe Trp Ala His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe 85 90 95 Gly Asn Thr Met Cys Gln Leu Leu Thr Gly Leu Tyr Phe Ile Gly Phe 100 105 110 Phe Ser Gly Ile Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu 115 120 125 Ala Val Val His Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe 130 135 140 Gly Val Val Thr Ser Val Ile Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser 145 150 155 160 Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr Arg Ser Gln Lys Glu Gly Leu His Tyr 165 170 175 Thr Cys Ser Ser His Phe Pro Tyr Ser Gln Tyr Gln Phe Trp Lys Asn 180 185 190 Phe Gln Thr Leu Lys Ile Val Ile Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu 195 200 205 Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys 210 215 220 Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg Leu Ile Phe Thr Ile 225 230 235 240 Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Ala Pro Tyr Asn Ile Val Leu Leu 245 250 255 Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser 260 265 270 Asn Arg Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr 275 280 285 His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe 290 295 300 Arg Asn Tyr Leu Leu Val Phe Phe Gln Lys His Ile Ala Lys Arg Phe 305 310 315 320 Cys Lys Cys Cys Ser Ile Phe Gln Gln Glu Ala Pro Glu Arg Ala Ser 325 330 335 Ser Val Tyr Thr Arg Ser Thr Gly Glu Gln Glu Ile Ser Val Gly Leu 340 345 350 <210> 132 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 cgagagggcc tttgggatcc aactgctgcc 30 <210> 133 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 ggcagcagtt ggatcccaaa ggccctctcg 30 <210> 134 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 gcaaattggg atccaactcc tgcc 24 <210> 135 <400> 135 000 <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 gcaaattggg gcccaactgc tgcc 24 <210> 137 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 ggcagcagtt gggccccaat ttgc 24 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 ctcttgtgcc agggtgtggt ctccga 26 <210> 139 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 gatcgaagct ttcagaaccc agcagagagt tcatg 35 <210> 140 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 gactatactt atttctgttt tcattgtcat tctcctgaac acc 43 <210> 141 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 cgccaagctt cattataaac cagccgaga 29 <210> 142 <211> 31 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 acgcgtcgac gaaactccaa acaccacaga g 31 <210> 143 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 gttcaggaga atgacaatga aaacagaaat aagtatagtc 40 <210> 144 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 cattctcctg aacaccttcc aagacttcct gttcaccca 39 <210> 145 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 gccaagcttc cagtgtgatg gatatctga 29 <210> 146 <211> 40 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 tgggtgaaca ggaagtcttg gaaggtgttc aggagaatga 40 <210> 147 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 caggtgcagc tggtggagtc tgg 23 <210> 148 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 gaagagacgg tgaccattgt ccctt 25 <210> 149 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 gaaattgtgc tgactcagtc tccagac 27 <210> 150 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 gtttgatctc caccttggtc cctc 24 <210> 151 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 ggcagtggat ctgggacaga tttcacc 27 <210> 152 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 ggtgaaatct gtcccagatc cactgcc 27 <210> 153 <211> 88 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 ttatgctggg cccagctctg tcccacaccg cggtcacatg gcaccacctc tcttgcagct 60 tccaccaaag gcccatccgt cttccccc 88 <210> 154 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 tcatattctc tagatcattt acccagagac agggagagg 39 <210> 155 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 155 cagcgtggtg acagtgccct ccagcag 27 <210> 156 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 156 ctgctggagg gcactgtcac cacgctg 27 <210> 157 <211> 12754 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 157 ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaat 60 acataactga gaatagagaa gttcagatca aggttaggaa ggggtggaca tccaaaccgt 120 tcgatcgaat tcattgcggt aaaacgttcc gtacctttta tgtattgact cttatctctt 180 caagtctagt tccaatcctt cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag gatatctgtg 240 gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gtccccagat gcggtcccgc 300 gtctctctgt cgtcttatac ccggtttgtc ctatagacac cattcgtcaa ggacggggcc 360 gagtcccggt tcttgtctac caggggtcta cgccagggcg cctcagcagt ttctagagaa 420 ccatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtgcc ttatttgaac 480 taaccaatca gttcgcttct ggagtcgtca aagatctctt ggtagtctac aaaggtccca 540 cggggttcct ggacttttac tgggacacgg aataaacttg attggttagt caagcgaaga 600 cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga gctcaataaa agagcccaca acccctcact 660 cggcgcgcca gtcctccgat agactgcgtc gcccgggtac gcgaagacaa gcgcgcgaag 720 acgaggggct cgagttattt tctcgggtgt tggggagtga gccgcgcggt caggaggcta 780 tctgacgcag cgggcccatg cccccccccc cccgtattcc caataaagcc tcttgctgtt 840 tgcatccgaa tcgtggactc gctgatcctt gggagggtct cctcagattg attgactgcc 900 gggggggggg gggcataagg gttatttcgg agaacgacaa acgtaggctt agcacctgag 960 cgactaggaa ccctcccaga ggagtctaac taactgacgg cacctcgggg gtctttcatt 1020 tggaggttcc accgagattt ggagacccct gcctagggac caccgacccc cccgccggga 1080 ggtaagctgg ccagcggtcg gtggagcccc cagaaagtaa acctccaagg tggctctaaa 1140 cctctgggga cggatccctg gtggctgggg gggcggccct ccattcgacc ggtcgccagc 1200 tttcgtgtct gtctctgtct ttgtgcgtgt ttgtgccggc atctaatgtt tgcgcctgcg 1260 tctgtactag ttagctaact agctctgtat ctggcggacc aaagcacaga cagagacaga 1320 aacacgcaca aacacggccg tagattacaa acgcggacgc agacatgatc aatcgattga 1380 tcgagacata gaccgcctgg cgtggtggaa ctgacgagtt ctgaacaccc ggccgcaacc 1440 ctgggagacg tcccagggac tttgggggcc gtttttgtgg cccgacctga ggaagggagt 1500 gcaccacctt gactgctcaa gacttgtggg ccggcgttgg gaccctctgc agggtccctg 1560 aaacccccgg caaaaacacc gggctggact ccttccctca cgatgtggaa tccgaccccg 1620 tcaggatatg tggttctggt aggagacgag aacctaaaac agttcccgcc tccgtctgaa 1680 tttttgcttt cggtttggaa gctacacctt aggctggggc agtcctatac accaagacca 1740 tcctctgctc ttggattttg tcaagggcgg aggcagactt aaaaacgaaa gccaaacctt 1800 ccgaagccgc gcgtcttgtc tgctgcagcg ctgcagcatc gttctgtgtt gtctctgtct 1860 gactgtgttt ctgtatttgt ctgaaaatta gggccagact ggcttcggcg cgcagaacag 1920 acgacgtcgc gacgtcgtag caagacacaa cagagacaga ctgacacaaa gacataaaca 1980 gacttttaat cccggtctga gttaccactc ccttaagttt gaccttaggt cactggaaag 2040 atgtcgagcg gatcgctcac aaccagtcgg tagatgtcaa gaagagacgt tgggttacct 2100 caatggtgag ggaattcaaa ctggaatcca gtgacctttc tacagctcgc ctagcgagtg 2160 ttggtcagcc atctacagtt cttctctgca acccaatgga tctgctctgc agaatggcca 2220 acctttaacg tcggatggcc gcgagacggc acctttaacc gagacctcat cacccaggtt 2280 aagatcaagg tcttttcacc agacgagacg tcttaccggt tggaaattgc agcctaccgg 2340 cgctctgccg tggaaattgg ctctggagta gtgggtccaa ttctagttcc agaaaagtgg 2400 tggcccgcat ggacacccag accaggtccc ctacatcgtg acctgggaag ccttggcttt 2460 tgacccccct ccctgggtca agccctttgt acaccctaag accgggcgta cctgtgggtc 2520 tggtccaggg gatgtagcac tggacccttc ggaaccgaaa actgggggga gggacccagt 2580 tcgggaaaca tgtgggattc cctccgcctc ctcttcctcc atccgccccg tctctccccc 2640 ttgaacctcc tcgttcgacc ccgcctcgat cctcccttta tccagccctc actccttctc 2700 ggaggcggag gagaaggagg taggcggggc agagaggggg aacttggagg agcaagctgg 2760 ggcggagcta ggagggaaat aggtcgggag tgaggaagag taggcgccga gatctctcga 2820 ggttaaactt aagctatgga cagcaaaggt tcgtcgcaga aagggtcccg cctgctcctg 2880 ctgctggtgg tgtcaaatct atccgcggct ctagagagct ccaatttgaa ttcgatacct 2940 gtcgtttcca agcagcgtct ttcccagggc ggacgaggac gacgaccacc acagtttaga 3000 actcttgtgc cagggtgtgg tctccgatta caaagatgat gatgatagcg ctgaagacaa 3060 taatatgtta cctcagttca tccacggcat actatcaaca tgagaacacg gtcccacacc 3120 agaggctaat gtttctacta ctactatcgc gacttctgtt attatacaat ggagtcaagt 3180 aggtgccgta tgatagttgt tctcattctc tatttacacg aagtatccaa gagcttgatg 3240 aaggggccac cacaccgtat gactacgatg atggtgagcc ttgtcataaa accagtgtga 3300 agagtaagag ataaatgtgc ttcataggtt ctcgaactac ttccccggtg gtgtggcata 3360 ctgatgctac taccactcgg aacagtattt tggtcacact agcaaattgg agcttggatc 3420 ctgcctccgc tctactcgct ggtgttcatc tttggttttg tgggcaacat gctggtcgtc 3480 ctcatcttaa taaactgcaa tcgtttaacc tcgaacctag gacggaggcg agatgagcga 3540 ccacaagtag aaaccaaaac acccgttgta cgaccagcag gagtagaatt atttgacgtt 3600 aaagctgaag tgcttgactg acatttacct gctcaacctg gccatctctg atctgctttt 3660 tcttattact ctcccattgt gggctcactc tgctgcaaat tttcgacttc acgaactgac 3720 tgtaaatgga cgagttggac cggtagagac tagacgaaaa agaataatga gagggtaaca 3780 cccgagtgag acgacgttta gagtgggtct ttgggaatgc aatgtgcaaa ttattcacag 3840 ggctgtatca catcggttat tttggcggaa tcttcttcat catcctcctg acaatcgata 3900 ctcacccaga aacccttacg ttacacgttt aataagtgtc ccgacatagt gtagccaata 3960 aaaccgcctt agaagaagta gtaggaggac tgttagctat gatacctggc tattgtccat 4020 gctgtgtttg ctttaaaagc caggacggtc acctttgggg tggtgacaag tgtgatcacc 4080 tggttggtgg ctgtgtttgc ctatggaccg ataacaggta cgacacaaac gaaattttcg 4140 gtcctgccag tggaaacccc accactgttc acactagtgg accaaccacc gacacaaacg 4200 ttctgtccca ggaatcatct ttactaaatg ccagaaagaa gattctgttt atgtctgtgg 4260 cccttatttt ccacgaggat ggaataattt ccacacaata aagacagggt ccttagtaga 4320 aatgatttac ggtctttctt ctaagacaaa tacagacacc gggaataaaa ggtgctccta 4380 ccttattaaa ggtgtgttat atgaggaaca ttttggggct ggtcctgccg ctgctcatca 4440 tggtcatctg ctactcggga atcctgaaaa ccctgcttcg gtgtcgaaac gagaagaaga 4500 tactccttgt aaaaccccga ccaggacggc gacgagtagt accagtagac gatgagccct 4560 taggactttt gggacgaagc cacagctttg ctcttcttct ggcatagggc agtgagagtc 4620 atcttcacca tcatgattgt ttactttctc ttctggactc cctataatat tgtcattctc 4680 ctgaacacct tccaggaatt ccgtatcccg tcactctcag tagaagtggt agtactaaca 4740 aatgaaagag aagacctgag ggatattata acagtaagag gacttgtgga aggtccttaa 4800 cttcggcctg agtaactgtg aaagcaccag tcaactggac caagccacgc aggtgacaga 4860 gactcttggg atgactcact gctgcatcaa tcccatcatc gaagccggac tcattgacac 4920 tttcgtggtc agttgacctg gttcggtgcg tccactgtct ctgagaaccc tactgagtga 4980 cgacgtagtt agggtagtag tatgccttcg ttggggagaa gttcagaagg tatctctcgg 5040 tgttcttccg aaagcacatc accaagcgct tctgcaaaca atgtccagtt ttctacaggg 5100 atacggaagc aacccctctt caagtcttcc atagagagcc acaagaaggc tttcgtgtag 5160 tggttcgcga agacgtttgt tacaggtcaa aagatgtccc agacagtgga tggagtgact 5220 tcaacaaaca cgccttccac tggggagcag gaagtctcgg ctggtttata atgactcgag 5280 ctctctagag ggcccgtttg tctgtcacct acctcactga agttgtttgt gcggaaggtg 5340 acccctcgtc cttcagagcc gaccaaatat tactgagctc gagagatctc ccgggcaaac 5400 acctgcagcc aagcttatcg ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg 5460 gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta tggacgtcgg ttcgaatagc 5520 tattttattt tctaaaataa atcagaggtc tttttccccc cttactttct ggggtggaca 5580 tccaaaccgt tcgatcgaat agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaat acataactga 5640 gaatagagaa gttcagatca aggttaggaa cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag 5700 tcattgcggt aaaacgttcc gtacctttta tgtattgact cttatctctt caagtctagt 5760 tccaatcctt gtctctctgt cgtcttatac ccggtttgtc gatatctgtg gtaagcagtt 5820 cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gtccccagat gcggtcccgc cctcagcagt 5880 ttctagagaa ccatcagatg ctatagacac cattcgtcaa ggacggggcc gagtcccggt 5940 tcttgtctac caggggtcta cgccagggcg ggagtcgtca aagatctctt ggtagtctac 6000 tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtgcc ttatttgaac taaccaatca 6060 gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga aaaggtccca cggggttcct 6120 ggacttttac tgggacacgg aataaacttg attggttagt caagcgaaga gcgaagacaa 6180 gcgcgcgaag acgaggggct gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggcgcgcca 6240 gtcctccgat agactgcgtc gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg 6300 cgagttattt tctcgggtgt tggggagtga gccgcgcggt caggaggcta tctgacgcag 6360 cgggcccatg ggcacatagg ttatttggga gaacgtcaac catccgactt gtggtctcgc 6420 tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcatgg 6480 gtaacagttt cttgaagttg gtaggctgaa caccagagcg acaaggaacc ctcccagagg 6540 agactcacta actgatgggc agtcgccccc agaaagtacc cattgtcaaa gaacttcaac 6600 gagaacaaca ttctgagggt aggagtcgaa tattaagtaa tcctgactca attagccact 6660 gttttgaatc cacatactcc aatactcctg aaatagttca ctcttgttgt aagactccca 6720 tcctcagctt ataattcatt aggactgagt taatcggtga caaaacttag gtgtatgagg 6780 ttatgaggac tttatcaagt ttatggacag cgcagaaaga gctggggaga attgtgaaat 6840 tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 6900 aatacctgtc gcgtctttct cgacccctct taacacttta acaataggcg agtgttaagg 6960 tgtgttgtat gctcggcctt cgtatttcac atttcggacc ggtgcctaat gagtgagcta 7020 actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 7080 gctgcattaa tgaatcggcc ccacggatta ctcactcgat tgagtgtaat taacgcaacg 7140 cgagtgacgg gcgaaaggtc agccctttgg acagcacggt cgacgtaatt acttagccgg 7200 aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 7260 cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc ttgcgcgccc ctctccgcca 7320 aacgcataac ccgcgagaag gcgaaggagc gagtgactga gcgacgcgag ccagcaagcc 7380 gacgccgctc gccatagtcg tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 7440 gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 7500 agtgagtttc cgccattatg ccaataggtg tcttagtccc ctattgcgtc ctttcttgta 7560 cactcgtttt ccggtcgttt tccggtcctt ggcatttttc gccgcgttgc tggcgttttt 7620 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 7680 aaacccgaca ggactataaa cggcgcaacg accgcaaaaa ggtatccgag gcggggggac 7740 tgctcgtagt gtttttagct gcgagttcag tctccaccgc tttgggctgt cctgatattt 7800 gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 7860 ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ctatggtccg caaaggggga 7920 ccttcgaggg agcacgcgag aggacaaggc tgggacggcg aatggcctat ggacaggcgg 7980 aaagagggaa gcccttcgca ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 8040 gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 8100 ccgcgaaaga gtatcgagtg cgacatccat agagtcaagc cacatccagc aagcgaggtt 8160 cgacccgaca cacgtgcttg gggggcaagt cgggctggcg tgcgccttat ccggtaacta 8220 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 8280 caggattagc agagcgaggt acgcggaata ggccattgat agcagaactc aggttgggcc 8340 attctgtgct gaatagcggt gaccgtcgtc ggtgaccatt gtcctaatcg tctcgctcca 8400 atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 8460 cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt tacatccgcc acgatgtctc 8520 aagaacttca ccaccggatt gatgccgatg tgatcttcct gtcataaacc atagacgcga 8580 gacgacttcg gtcaatggaa cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 8640 accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 8700 gcctttttct caaccatcga gaactaggcc gtttgtttgg tggcgaccat cgccaccaaa 8760 aaaacaaacg ttcgtcgtct aatgcgcgtc tttttttcct tctcaagaag atcctttgat 8820 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 8880 gagattatca aaaaggatct agagttcttc taggaaacta gaaaagatgc cccagactgc 8940 gagtcacctt gcttttgagt gcaattccct aaaaccagta ctctaatagt ttttcctaga 9000 tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 9060 aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc agtggatcta ggaaaattta 9120 atttttactt caaaatttag ttagatttca tatatactca tttgaaccag actgtcaatg 9180 gttacgaatt agtcactccg acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 9240 gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 9300 tggatagagt cgctagacag ataaagcaag taggtatcaa cggactgagg ggcagcacat 9360 ctattgatgc tatgccctcc cgaatggtag accggggtca gctgcaatga taccgcgaga 9420 cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 9480 cagaagtggt cctgcaactt cgacgttact atggcgctct gggtgcgagt ggccgaggtc 9540 taaatagtcg ttatttggtc ggtcggcctt cccggctcgc gtcttcacca ggacgttgaa 9600 tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 9660 ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat ataggcggag gtaggtcaga 9720 taattaacaa cggcccttcg atctcattca tcaagcggtc aattatcaaa cgcgttgcaa 9780 caacggtaac gatgtccgta cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 9840 tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 9900 gcaccacagt gcgagcagca aaccataccg aagtaagtcg aggccaaggg ttgctagttc 9960 cgctcaatgt actagggggt acaacacgtt ttttcgccaa agctccttcg gtcctccgat 10020 cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 10080 ttctcttact gtcatgccat tcgaggaagc caggaggcta gcaacagtct tcattcaacc 10140 ggcgtcacaa tagtgagtac caataccgtc gtgacgtatt aagagaatga cagtacggta 10200 ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 10260 tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga ggcattctac gaaaagacac 10320 tgaccactca tgagttggtt cagtaagact cttatcacat acgccgctgg ctcaacgaga 10380 acgggccgca gttatgccct taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 10440 attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt 10500 attatggcgc ggtgtatcgt cttgaaattt tcacgagtag taaccttttg caagaagccc 10560 cgcttttgag agttcctaga atggcgacaa ctctaggtca tcgatgtaac ccactcgtgc 10620 acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 10680 aaggcaaaat gccgcaaaaa agctacattg ggtgagcacg tgggttgact agaagtcgta 10740 gaaaatgaaa gtggtcgcaa agacccactc gtttttgtcc ttccgtttta cggcgttttt 10800 agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 10860 gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat tcccttattc ccgctgtgcc 10920 tttacaactt atgagtatga gaaggaaaaa gttataataa cttcgtaaat agtcccaata 10980 acagagtact cgcctatgta atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 11040 cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta 11100 taaacttaca taaatctttt tatttgttta tccccaaggc gcgtgtaaag gggcttttca 11160 cggtggactg cagattcttt ggtaataata gtactgtaat acctataaaa ataggcgtat 11220 cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 11280 gctcccggag acggtcacag tggatatttt tatccgcata gtgctccggg aaagcagagc 11340 gcgcaaagcc actactgcca cttttggaga ctgtgtacgt cgagggcctc tgccagtgtc 11400 cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 11460 gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gaacagacat tcgcctacgg 11520 ccctcgtctg ttcgggcagt cccgcgcagt cgcccacaac cgcccacagc cccgaccgaa 11580 ttgatacgcc gtagtctcgt gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg 11640 cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac 11700 ctaacatgac tctcacgtgg tatacgccac actttatggc gtgtctacgc attcctcttt 11760 tatggcgtag tccgcggtaa gcggtaagtc cgacgcgttg tgttgggaag ggcgatcggt 11820 gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag 11880 ttgggtaacg ccagggtttt acaacccttc ccgctagcca cgcccggaga agcgataatg 11940 cggtcgaccg ctttccccct acacgacgtt ccgctaattc aacccattgc ggtcccaaaa 12000 cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc 12060 caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac catacccacg gggtcagtgc tgcaacattt 12120 tgctgccgcg ttccttacca cgtacgttcc tctaccgcgg gttgtcaggg ggccggtgcc 12180 ccggacggtg gtatgggtgc ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat 12240 cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga 12300 ggctttgttc gcgagtactc gggcttcacc gctcgggcta gaaggggtag ccactacagc 12360 cgctatatcc gcggtcgttg gcgtggacac cgcggccact tgccggccac gatgcgtccg 12420 gcgtagaggc gattagtcca atttgttaaa gacaggatat cagtggtcca ggctctagtt 12480 ttgactcaac aatatcacca acggccggtg ctacgcaggc cgcatctccg ctaatcaggt 12540 taaacaattt ctgtcctata gtcaccaggt ccgagatcaa aactgagttg ttatagtggt 12600 gctgaagcct atagagtacg agccatagat aaaataaaag attttattta gtctccagaa 12660 aaagggggga tgaaagacga cttcggatat ctcatgctcg gtatctattt tattttctaa 12720 aataaatcag aggtcttttt cccccctact ttct 12754 <210> 158 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 158 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Tyr Asn Trp Asn Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 159 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Trp Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly 85 90 95 Thr His Trp Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 160 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 161 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 161 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 162 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Gly 20 25 30 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 35 40 45 Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 163 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 163 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 164 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Asn Trp Asn Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 165 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 165 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 166 <211> 1350 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 166 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tacattgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaatg atcaatccta gtggtggtcg cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggacctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt tttactgtgc gagagagaga 300 tggtataagt ggaacttcga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcctcagctt ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcacc 420 tccgagagca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 480 gtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540 tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacg 600 aagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt 660 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720 tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840 gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260 gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320 aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1350 <210> 167 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tacattgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaatg atcaatccta gtggtggtcg cacaagctac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggacctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt tttactgtgc gagagagaga 300 tggtataagt ggaacttcga tgcttttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 168 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 168 agctactata tacat 15 <210> 169 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 atgatcaatc ctagtggtgg tcgcacaagc tacgcacaga agttccaggg c 51 <210> 170 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 gagagatggt ataagtggaa cttcgatgct tttgatatc 39 <210> 171 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcacc 90 <210> 172 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 172 tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg ga 42 <210> 173 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 173 agagtcacca tgaccaggga cacgtccacg agcacagtct acatggacct gagcagcctg 60 agatctgagg acacggccgt gttttactgt gcgaga 96 <210> 174 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 174 tggggccaag ggacaatggt caccgtctcc tca 33 <210> 175 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Trp Tyr Lys Trp Asn Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 210 215 220 Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 Lys <210> 176 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Arg Trp Tyr Lys Trp Asn Phe Asp Ala Phe Asp Ile Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 177 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Ser Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 178 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Met Ile Asn Pro Ser Gly Gly Pro Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 179 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Glu Arg Trp Tyr Lys Trp Asn Phe Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 180 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 <210> 181 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly 1 5 10 <210> 182 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Asp 1 5 10 15 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 183 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 184 <211> 663 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 184 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccaac agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacacgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc agcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttacagtact 300 cctcggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaac gaactgtggc tgcaccatct 360 gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 420 ctgctgaaga acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 480 caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 540 ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 600 gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 660 tag 663 <210> 185 <211> 339 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 185 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca agtccagcca gagtgtttta tacagctcca acaataagaa ctacttagct 120 tggtaccaac agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttactgggc atctacacgg 180 gaatccgggg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcc agcaggctga agatgtggca gtttattact gtcagcaata ttacagtact 300 cctcggacgt tcggccaagg gaccaaggtg gaaatcaaa 339 <210> 186 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 186 aagtccagcc agagtgtttt atacagctcc aacaataaga actacttagc t 51 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 187 tgggcatcta cacgggaatc c 21 <210> 188 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 188 cagcaatatt acagtactcc tcggacg 27 <210> 189 <211> 69 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 189 gacatcgtga tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgc 69 <210> 190 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 190 tggtaccaac agaaaccagg acagcctcct aagctgctca tttac 45 <210> 191 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 191 ggggtccctg accgattcag tggcagcggg tctgggacag atttcactct caccatcagc 60 agccagcagg ctgaagatgt ggcagtttat tactgt 96 <210> 192 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 192 ttcggccaag ggaccaaggt ggaaatcaaa 30 <210> 193 <211> 220 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 193 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Gln Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 194 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 194 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Gln Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 195 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 195 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 196 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 196 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 197 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 197 Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Arg Thr 1 5 <210> 198 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 198 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys 20 <210> 199 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 199 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 200 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 200 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Gln Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 201 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 201 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 202 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = E or D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X = Q, N, R, K or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X = A, G, W or Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = W, Y, K, R or H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = K, R, H, W, Y, T or S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = Y, W, N or Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X = A, G or V <400> 202 Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Phe Asp Ile 1 5 10 <210> 203 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X = Q or R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X = A or W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X = W or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = W or K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X = Y or N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X = A or V <400> 203 Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Asp Xaa Phe Asp Ile 1 5 10

Claims (31)

  1. 인간 CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로서, 항체는
    (a) 인간 CCR2의 제1 세포외 루프 내에 포함된 에피토프에 결합하거나;
    (b) 인간 CCR2의 제2 세포외 루프 내에 포함된 에피토프에 결합하거나;
    (c) 인간 CCR2의 제1 세포외 루프 및 제2 세포외 루프 둘 다 내에 포함된 에피토프에 결합하는 것인 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 부분은 다음의 특성 중 하나 이상을 보유하는 것인 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분:
    (a) 인간 CCR5에 대한 이의 선택도보다 100배 이상 높은 인간 CCR2에 대한 선택도는 갖는 특성;
    (b) 2.0×10-7 M 이하의 KD로 인간 CCR2에 결합하는 특성;
    (c) CCR2에 대한 결합에 대해 MCP-1 및/또는 MCP-3과 경쟁하는 특성;
    (d) MCP-1에 반응하여 Ca2 + 이동을 감소시키는 특성;
    (e) MCP-1에 반응하여 콜라겐 I mRNA 합성을 감소시키는 특성;
    (f) MCP-1에 반응하여 인간 단핵구에서의 pERK 인산화를 감소시키는 특성;
    (g) MCP-1에 반응하여 인간 단핵구의 주화성을 감소시키는 특성; 및
    (h) MCP-1에 반응하여 인간 단핵구에서의 액틴 중합을 감소시키는 특성.
  3. 제1항에 있어서, 인간 CCR2의 제1 세포외 루프는 서열 번호 128의 아미노산 서열을 포함하고; 인간 CCR2의 제2 세포외 루프는 서열 번호 129의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  4. (a) 서열 번호 12에 기재된 VH CDR1, 서열 번호 13에 기재된 VH CDR2 및 서열 번호 14에 기재된 VH CDR3;
    (b) 서열 번호 48에 기재된 VH CDR1, 서열 번호 49에 기재된 VH CDR2 및 서열 번호 50에 기재된 VH CDR3;
    (c) 서열 번호 84에 기재된 VH CDR1, 서열 번호 85에 기재된 VH CDR2 및 서열 번호 86에 기재된 VH CDR3; 및
    (d) 서열 번호 177에 기재된 VH CDR1, 서열 번호 178에 기재된 VH CDR2 및 서열 번호 179에 기재된 VH CDR3
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) 서열 번호 30에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 31에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 32에 기재된 VL CDR3;
    (b) 서열 번호 66에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 67에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 68에 기재된 VL CDR3;
    (c) 서열 번호 102에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 103에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 104에 기재된 VL CDR3; 및
    (d) 서열 번호 195에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 196에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 197에 기재된 VL CDR3
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열을 더 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  6. (a) 서열 번호 30에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 31에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 32에 기재된 VL CDR3;
    (b) 서열 번호 66에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 67에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 68에 기재된 VL CDR3;
    (c) 서열 번호 102에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 103에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 104에 기재된 VL CDR3; 및
    (d) 서열 번호 195에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 196에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 197에 기재된 VL CDR3
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  7. 제5항에 있어서, 서열 번호 84에 기재된 VH CDR1, 서열 번호 85에 기재된 VH CDR2, 서열 번호 86에 기재된 VH CDR3, 서열 번호 102에 기재된 VL CDR1, 서열 번호 103에 기재된 VL CDR2 및 서열 번호 104에 기재된 VL CDR3을 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  8. 서열 번호 202 및 서열 번호 203으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 CDR3을 포함하는, 인간 CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  9. 서열 번호 11, 서열 번호 47, 서열 번호 83, 서열 번호 176, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 11, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 47, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 83, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 176, 서열 번호 162와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 11, 서열 번호 158과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 47, 서열 번호 160과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 83, 서열 번호 164와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 176, 서열 번호 11과 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 47과 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 83과 90% 이상 동일한 아미노산 서열 및 서열 번호 176과 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 가변(VH) 도메인 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  10. 서열 번호 29, 서열 번호 66, 서열 번호 101, 서열 번호 113, 서열 번호 194, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 29, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 66, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 101, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 113, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 194, 서열 번호 159와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 29, 서열 번호 161과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 66, 서열 번호 163과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 101, 서열 번호 163과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 113, 서열 번호 165와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 194, 서열 번호 29와 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 66과 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 101과 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 113과 90% 이상 동일한 아미노산 서열 및 서열 번호 194와 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열을 포함하는, CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  11. 제8항에 있어서, 서열 번호 29, 서열 번호 66, 서열 번호 101, 서열 번호 113, 서열 번호 194, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 29, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 66, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 101, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 113, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 194, 서열 번호 163과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 29, 서열 번호 159와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 66, 서열 번호 161과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 101, 서열 번호 161과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 113, 서열 번호 165과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 194, 서열 번호 29와 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 66과 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 101과 90% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 번호 113과 90% 이상 동일한 아미노산 서열 및 서열 번호 194와 90% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 경쇄 가변(VL) 도메인 아미노산 서열을 더 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  12. (a) 단일클론 항체 4.40(ATCC 수탁 번호 PTA-6981), 4.22(ATCC 수탁 번호 PTA-6980), 4.39 및 4.9(ATCC 수탁 번호 PTA-6979)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3; 또는
    (b) 단일클론 항체 4.40, 4.22, 4.39 및 4.9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체의 경쇄로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3; 또는
    (c) 단일클론 항체 4.40, 4.22, 4.39 및 4.9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체의 중쇄로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3, 및 단일클론 항체 4.40, 4.22, 4.39 및 4.9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체의 경쇄로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3
    을 포함하는, CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  13. 서열 번호 10, 서열 번호 46, 서열 번호 82, 서열 번호 116, 서열 번호 175, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 10, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 46, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 82, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 116, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 175, 서열 번호 162와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 10, 서열 번호 158과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 46, 서열 번호 160과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 82, 서열 번호 160과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 116 및 서열 번호 164와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 175로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 포함하는, 인간 CCR2에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 단일클론 항체.
  14. 제13항에 있어서, 서열 번호 28, 서열 번호 64, 서열 번호 100, 서열 번호 112, 서열 번호 193, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 28, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 64, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 112, 보존적 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 193, 서열 번호 163과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 28, 서열 번호 159와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 64, 서열 번호 161과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 100, 서열 번호 161과 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 112 및 서열 번호 165와 비교하여 생식선 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 193으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄를 더 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체.
  15. 제14항에 있어서, 항체는
    (a) 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 28의 아미노산 서열을 갖는 경쇄,
    (b) 서열 번호 46의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 64의 아미노산 서열을 갖는 경쇄,
    (c) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 100의 아미노산 서열을 갖는 경쇄,
    (d) 서열 번호 82의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 112의 아미노산 서열을 갖는 경쇄,
    (e) 서열 번호 116의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 112의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및
    (f) 서열 번호 175의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 및 서열 번호 193의 아미노산 서열을 갖는 경쇄
    로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄를 갖는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  16. 제15항에 있어서, 중쇄 아미노산 서열은 서열 번호 116이고, 경쇄 아미노산 서열은 서열 번호 112인 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  17. 제5항에 있어서, 4.40, 4.40 A68G S230P, 4.39, 4.22 및 4.9로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항체의 하나 이상의 VH FR1, FR2, FR3 또는 FR4 및/또는 VL FR1, FR2, FR3 또는 FR4 아미노산 서열을 더 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  18. 제17항에 있어서, 중쇄 불변 도메인을 더 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  19. 제18항에 있어서, 경쇄 불변 도메인을 더 포함하는 단리된 인간 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분.
  20. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  21. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 생산하는 단리된 세포주.
  22. 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
  23. 제22항에 따른 핵산 분자를 포함하고, 핵산 분자에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 임의로 포함하는 벡터.
  24. CCR2 매개 질환의 증상의 치료, 예방 또는 경감을 필요로 하는 피험체에게 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 투여하는 단계를 포함하는 상기 피험체에서 CCR2 매개 질환의 증상을 치료, 예방 또는 경감하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 피험체는 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 이식편 거부 반응, 죽상동맥경화증, 비만, HIV 감염, 신경병증성 통증, 협착증, 재협착증, 다발성 경화증, 섬유증, 노화성 황반 변성, 포도막염, 각막 감염 및 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 병증 또는 질환을 앓고 있는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 섬유증은 간 섬유증인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 간 섬유증은 C형 간염 바이러스(HCV) 감염, B형 간염 바이러스(HBV) 감염, 알콜성 지방 간염(ASH) 또는 비알콜성 지방 간염(NASH)에 기인하는 것인 방법.
  28. CCR2 매개 질환의 증상의 치료, 예방 또는 경감을 필요로 하는 피험체에서 CCR2 매개 질환의 증상을 치료, 예방 또는 경감하기 위한 약제의 제조를 위한, 제1항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 용도.
  29. 제28항에 있어서, 피험체는 염증성 질환, 알레르기성 질환, 자가면역 질환, 이식편 거부 반응, 죽상동맥경화증, 비만, HIV 감염, 신경병증성 통증, 협착증, 재협착증, 다발성 경화증, 섬유증, 노화성 황반 변성, 포도막염, 각막 감염 및 암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 병증 또는 질환을 앓고 있는 것인 용도.
  30. 제29항에 있어서, 상기 섬유증은 간 섬유증인 용도.
  31. 제30항에 있어서, 상기 간 섬유증은 C형 간염 바이러스(HCV) 감염, B형 간염 바이러스(HBV) 감염, 알콜성 지방 간염(ASH) 또는 비알콜성 지방 간염(NASH)에 기인하는 것인 용도.
KR1020117006355A 2008-08-18 2009-08-17 Ｃｃｒ２에 대한 항체 KR101772706B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18935708P 2008-08-18 2008-08-18
US61/189,357 2008-08-18
PCT/US2009/004711 WO2010021697A2 (en) 2008-08-18 2009-08-17 Antibodies to ccr2

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20110057166A true KR20110057166A (ko) 2011-05-31
KR101772706B1 KR101772706B1 (ko) 2017-08-29

Family

ID=41347729

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117006355A KR101772706B1 (ko) 2008-08-18 2009-08-17 Ｃｃｒ２에 대한 항체

Country Status (22)

Country Link
US (2) US8710191B2 (ko)
EP (1) EP2321351B1 (ko)
JP (1) JP5685535B2 (ko)
KR (1) KR101772706B1 (ko)
CN (1) CN102239180B (ko)
AU (1) AU2009283199B2 (ko)
BR (1) BRPI0916973A2 (ko)
CA (1) CA2734578C (ko)
CO (1) CO6351802A2 (ko)
DK (1) DK2321351T3 (ko)
ES (1) ES2658117T3 (ko)
HK (1) HK1163134A1 (ko)
IL (1) IL211284A (ko)
MX (1) MX2011001911A (ko)
MY (1) MY160892A (ko)
NO (1) NO2321351T3 (ko)
NZ (1) NZ591471A (ko)
PE (1) PE20110774A1 (ko)
RU (1) RU2547595C2 (ko)
SG (2) SG10201701323TA (ko)
WO (1) WO2010021697A2 (ko)
ZA (1) ZA201101047B (ko)

Families Citing this family (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110038871A1 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 Veena Viswanth Ccr2 inhibitors for treating conditions of the eye
EP2547366A4 (en) * 2010-03-18 2013-08-07 Univ Colorado State Res Found INHIBITING AGENTS OF SUPPRESSIVE MYELOID CELLS
AU2012205763B2 (en) * 2011-01-10 2016-12-22 Novimmune S.A. Anti-TLR4 antibodies and methods of use thereof
CN102603649B (zh) * 2011-01-20 2016-05-25 赣南师范学院 一种以地巴唑为先导分子的荧光探针化合物及其制备方法
US20120288442A1 (en) * 2011-05-11 2012-11-15 Atomic Energy Council-Institute Of Nuclear Energy Research Nuclear Imaging Method Using Molecular Target Detection Agent for Liver Fibrosis
WO2012172336A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating inflammatory skin diseases
WO2012172343A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating primary sclerosing cholangitis
ES2637390T3 (es) 2011-06-13 2017-10-13 Tla Targeted Immunotherapies Ab Tratamiento de afecciones respiratorias
ES2664836T3 (es) 2011-06-13 2018-04-23 Tla Targeted Immunotherapies Ab Tratamiento de esclerosis múltiple
WO2012172344A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating conditions associated with sepsis
EP2717940B1 (en) 2011-06-13 2020-04-22 TLA Targeted Immunotherapies AB Treating conditions associated with metabolic syndrome
WO2012172337A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating cardiovascular disease
US9726666B2 (en) 2011-06-13 2017-08-08 Tla Targeted Immunotherapies Ab Diagnosing and treating inflammatory diseases
WO2012172339A2 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Ith Immune Therapy Holdings Treating inflammatory arthritis
US20140349321A1 (en) * 2011-12-16 2014-11-27 Agency For Science, Technology And Research Binding molecules against dengue virus and uses thereof
CA2877814A1 (en) * 2012-06-22 2013-12-27 Dingqiu HUANG Antigen binding proteins that bind ccr2
US8975290B2 (en) 2013-03-01 2015-03-10 Colorado State University Research Foundation Methods and compositions for enhancing an immune response, blocking monocyte migration, amplifying vaccine immunity and inhibiting tumor growth and metastasis
ES2766762T3 (es) 2013-03-13 2020-06-15 Prothena Biosciences Ltd Inmunoterapia contra Tau
NL2011406C2 (en) 2013-09-06 2015-03-10 Bionovion Holding B V Method for obtaining april-binding peptides, process for producing the peptides, april-binding peptides obtainable with said method/process and use of the april-binding peptides.
WO2016081801A1 (en) * 2014-11-21 2016-05-26 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Use of an anti-ccr2 antagonist in the treatment of an infectious disease
NL2014108B1 (en) 2015-01-09 2016-09-30 Aduro Biotech Holdings Europe B V Altered april binding antibodies.
EP3262418B1 (en) 2015-02-26 2019-05-01 Innovative Concepts in Drug Development Diagnostic markers of cognitive impairments, kits and uses thereof
KR20230070336A (ko) 2016-05-02 2023-05-22 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
CN109415432B (zh) 2016-05-02 2022-07-08 普罗塞纳生物科学有限公司 Tau免疫疗法
UA124148C2 (uk) 2016-05-02 2021-07-28 Протена Біосайенсіс Лімітед Антитіла, що розпізнають тау
RU2740902C2 (ru) * 2016-06-03 2021-01-21 Хемоцентрикс, Инк. Способ лечения фиброза печени
RU2022102328A (ru) 2016-11-23 2022-04-01 Хемоцентрикс, Инк. Способ лечения фокально-сегментарного гломерулосклероза
JP2020508436A (ja) 2016-12-07 2020-03-19 プロジェニティ， インコーポレイテッド 胃腸管の検出方法、装置およびシステム
US10980739B2 (en) 2016-12-14 2021-04-20 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a chemokine/chemokine receptor inhibitor
EP3612563A1 (en) 2017-04-19 2020-02-26 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules and uses thereof
EP3620531A4 (en) 2017-05-02 2021-03-17 National Center of Neurology and Psychiatry METHOD OF PREDICTION AND EVALUATION OF THERAPEUTIC EFFECT IN DISEASES RELATING TO IL-6 AND NEUTROPHILS
EP3619233A4 (en) 2017-05-02 2021-03-03 Prothena Biosciences Limited ANTIBODIES RECOGNIZING TAU PROTEIN
BR112020007183A2 (pt) 2017-10-11 2020-09-24 Chemocentryx, Inc. tratamento de glomeruloesclerose focal segmentado com antagonistas de ccr2
JP7235249B2 (ja) 2017-10-20 2023-03-08 学校法人兵庫医科大学 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物
US20200377571A1 (en) 2017-12-08 2020-12-03 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules and uses thereof
JP7317016B2 (ja) 2017-12-19 2023-07-28 スロゼン オペレーティング， インコーポレイテッド 抗ｌｒｐ５／６抗体及び使用方法
CN111727203B (zh) 2017-12-19 2024-04-26 瑟罗泽恩奥普瑞汀公司 Wnt替代分子和其用途
US20200023003A1 (en) 2018-07-03 2020-01-23 Fennec Pharmaceuticals Inc. Formulations of anhydrous sodium thiosulfate
EP3833762A4 (en) 2018-08-09 2022-09-28 Verseau Therapeutics, Inc. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS FOR TARGETING CCR2 AND CSF1R AND THEIR USES
WO2020069372A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Elstar Therapeutics, Inc. Csf1r/ccr2 multispecific antibodies
CN116726362A (zh) 2018-11-19 2023-09-12 比奥拉治疗股份有限公司 用生物治疗剂治疗疾病的方法和装置
AU2019412561A1 (en) 2018-12-24 2021-08-12 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant Fab domains
EP3911954A4 (en) * 2019-01-16 2022-11-02 Yeda Research and Development Co. Ltd BIOMARKERS FOR MODIFICATION OF CNS DISEASES
CA3131531A1 (en) 2019-03-03 2020-09-10 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
US20220204608A1 (en) * 2019-04-17 2022-06-30 Hiroshima University Therapeutic agent for urological cancer which is characterized by being administered with il-6 inhibitor and ccr2 inhibitor in combination
WO2020232127A1 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 The Research Foundation For The State University Of New York Compositions and methods to block and bind ccr2 to modulate cellular function
JP2022538222A (ja) * 2019-06-26 2022-09-01 アムニクス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｅｇｆｒ抗原結合断片およびそれを含む組成物
EP4309722A2 (en) 2019-12-13 2024-01-24 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
US20220025436A1 (en) * 2020-07-21 2022-01-27 Rutgers, The State University Of New Jersey Method and Kit For CCR2 Expression Profiling And Disease Stratification
WO2022097117A1 (en) 2020-11-09 2022-05-12 Takeda Pharmaceutical Company Ltd. Antibody drug conjugates
WO2023072916A1 (en) 2021-10-27 2023-05-04 Granite Bio Ag Antibodies targeting ccr2
CN114990073A (zh) * 2022-05-27 2022-09-02 河南农业大学 一种抗猪ccl2蛋白的单克隆抗体及其制备方法和应用

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2090473A1 (en) 1990-08-29 1992-03-01 Robert M. Kay Homologous recombinatin in mammalian cells
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP0619738B1 (en) * 1991-12-02 2003-07-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Inhibitory immunoglobulin polypeptides to human pdgf beta receptor
JPH07509137A (ja) 1992-07-24 1995-10-12 セル　ジェネシス，インク． 異種抗体の生産
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
JPH11503914A (ja) 1995-04-21 1999-04-06 セル ジェネシス，インコーポレイテッド 大ゲノムｄｎａ欠失の生成
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
SE9600820D0 (sv) 1996-03-01 1996-03-01 Pharmacia Ab Antibodies and their use
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5994619A (en) 1996-04-01 1999-11-30 University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP2314625B1 (en) 1996-12-03 2014-05-07 Amgen Fremont Inc. Transgenic mammals having human Ig loci including plural VH and Vkappa regions and antibodies produced therefrom
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
JP2002505097A (ja) 1998-03-03 2002-02-19 アブジェニックス インク． 治療薬としてのｃｄ１４７結合分子
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
US6312689B1 (en) 1998-07-23 2001-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
US6727349B1 (en) * 1998-07-23 2004-04-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Recombinant anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
JP2002522063A (ja) 1998-08-17 2002-07-23 アブジェニックス インコーポレイテッド 増加した血清半減期を有する改変された分子の生成
EP2112166B1 (en) 1998-12-23 2018-11-21 Pfizer Inc. Human monoclonal antibodies to ctla-4
MXPA02007449A (es) 2000-02-03 2003-04-14 Millennium Pharm Inc Anticuerpos anti-ccr2 humanizados y metodos para el uso de los mismos.
GB0016138D0 (en) 2000-06-30 2000-08-23 Novartis Ag Organic compounds
US20030165988A1 (en) * 2002-02-08 2003-09-04 Shaobing Hua High throughput generation of human monoclonal antibody against peptide fragments derived from membrane proteins
EP1461300B1 (en) 2001-11-30 2011-07-27 Biogen Idec MA Inc. Antibodies against monocyte chemotactic proteins
WO2003066830A2 (en) 2002-02-08 2003-08-14 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against membrane proteins
RU2339647C2 (ru) 2002-08-19 2008-11-27 Астразенека Аб Антитела против моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (мср-1) и их применение
JP4426449B2 (ja) 2002-09-12 2010-03-03 財団法人化学及血清療法研究所 ヒト抗ヒトｍｃｐ−１抗体及び該抗体フラグメント
MXPA06000176A (es) 2003-12-10 2006-06-27 Millennium Pharm Inc Anticuerpos anti-ccr2 humanizados y sus metodos de uso.
SG188175A1 (en) 2004-06-03 2013-03-28 Novimmune Sa Anti-cd3 antibodies and methods of use thereof
US7371825B2 (en) 2004-06-30 2008-05-13 Centocor, Inc. Anti-MCP-1 antibodies, compositions, methods and uses
EP1778285A2 (en) 2004-07-30 2007-05-02 Pfizer Products Inc. Treatment of ccr2 mediated diseases or disorders
WO2008060783A2 (en) 2006-10-05 2008-05-22 Centocor Ortho Biotech Inc. Ccr2 antagonists for treatment of fibrosis

Also Published As

Publication number Publication date
RU2011110169A (ru) 2012-09-27
US8710191B2 (en) 2014-04-29
MX2011001911A (es) 2011-07-04
US20140342450A1 (en) 2014-11-20
EP2321351A2 (en) 2011-05-18
JP2012500020A (ja) 2012-01-05
BRPI0916973A2 (pt) 2016-07-26
CN102239180B (zh) 2014-12-31
AU2009283199B2 (en) 2015-08-13
DK2321351T3 (en) 2017-12-18
WO2010021697A2 (en) 2010-02-25
SG10201701323TA (en) 2017-04-27
CA2734578A1 (en) 2010-02-25
CO6351802A2 (es) 2011-12-20
SG193216A1 (en) 2013-09-30
HK1163134A1 (en) 2012-09-07
AU2009283199A8 (en) 2011-06-16
IL211284A (en) 2017-07-31
CA2734578C (en) 2019-03-12
EP2321351B1 (en) 2017-11-01
US9238691B2 (en) 2016-01-19
ZA201101047B (en) 2012-04-25
US20110274696A1 (en) 2011-11-10
RU2547595C2 (ru) 2015-04-10
NZ591471A (en) 2012-08-31
CN102239180A (zh) 2011-11-09
IL211284A0 (en) 2011-04-28
MY160892A (en) 2017-03-31
WO2010021697A3 (en) 2010-09-16
NO2321351T3 (ko) 2018-03-31
AU2009283199A1 (en) 2010-02-25
JP5685535B2 (ja) 2015-03-18
ES2658117T3 (es) 2018-03-08
PE20110774A1 (es) 2011-10-13
KR101772706B1 (ko) 2017-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101772706B1 (ko) Ｃｃｒ２에 대한 항체
JP6240138B2 (ja) β‐クロトー、ＦＧＦ受容体、およびその複合体と結合するヒト抗原結合タンパク質
KR101770429B1 (ko) 인간 ｃ－ｆｍｓ 항원 결합 단백질
EP3450458B1 (en) Human antibodies to gfralpha3 and methods of use thereof
CA3020990A1 (en) Humanized anti-pacap antibodies and uses thereof
JP2005530490A (ja) インターロイキン−５に対するヒトモノクローナル抗体および方法およびこれを含む組成物
JP2018516071A (ja) 抗ｐａｃａｐ抗体及びそれらの使用
KR20110031152A (ko) Ｉｌ-６에 대한 항체 및 그의 용도
CN111303285B (zh) 靶向ox40的抗体及其制备方法和应用
JP2022527373A (ja) Ｒｅｔを結合するヒト抗体およびその使用方法
AU2011299443B2 (en) Anti-VEGFR-3 antibody compositions
JP3979008B2 (ja) Ｇ−ｃｓｆレセプターアゴニスト抗体及びそのスクリーニング方法
GLADUE et al. Patent 2734578 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant