KR20110050100A - 소 복제 수정란의 체외배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탈핵된 소 난자에 귀 섬유아세포를 이식하여 만들어진 체세포 복제 수정란의 초기단계에서 체외 배양액(0.4% 소혈청알부민을 함유한 기본배지(CR1 medium))에 50nM 트리코스타틴 에이(TSA ; Trichostatin A, 미합중국 시그마사(Sigma), Cat. No.: T-8552)를 첨가하여 20시간 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 배양함으로서 기존의 소 복제 수정란의 체외배양체계와 비교하여 보다 효과 있는 배양체계를 제공하기 위한 소 복제 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것이다.

섬유아세포, 소, 체외배양, 복제 수정란, 트리코스타틴 에이

Description

소 복제 수정란의 체외배양 방법 {IMPROVEMENT OF SCNT BOVINE EMBRYOS IN IN VIVO CULTURE}

본 발명은 소 복제 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 탈핵된 소 난자에 귀 섬유아세포를 이식하여 만들어진 체세포 복제 수정란의 초기단계에서 체외 배양액(0.4% 소혈청알부민을 함유한 기본배지(CR1 medium))에 50nM 트리코스타틴 에이(TSA ; Trichostatin A, 미합중국 시그마사(Sigma), Cat. No.: T-8552)를 첨가하여 20시간 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 배양함으로서 기존의 소 복제 수정란의 체외배양체계와 비교하여 보다 효과 있는 배양체계를 제공하기 위한 소 복제 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것이다.

최근 가축의 형질전환기술 및 복제동물 생산 실험이 전 세계에서 행해지고 있다. 이들 실험에서는 수정란을 체외에서 조작하는 것이 필수적인 과정이다. 따라서 보다 효과적이고 안정적인 체외배양체계를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 형질전환 소의 경우, 인슐린제제 신약개발에 있어서 주목받고 있다. 왜냐하면, 인슐린 생산에 있어, 기존의 동물세포(중국 햄스터 난소 세포(CHO cell ; Chinese hamster ovary cell) 등) 배양방법에 비해 형질전화동물을 이용할 경우, 10분의 1 이하 수준의 생산단가가 소요되며, 향후 의약품으로서의 비중이 점차적으로 커질것으로 예상되는 인슐린 생산단가 절감을 통한 치료비용의 감소가 이루어지게 될 것이기 때문이다.

본 발명은 소 복제 수정란의 체외배양에 있어서 발생하는 낮은 세포의 발생율에 대한 문제점을 해결하기 위함에 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 소 복제 수정란의 초기단계에서 체외 배양액(0.4% 소혈청알부민(BSA)를 함유한 기본배지(CR1 medium)에 50nM 트리코스타틴 에이를 첨가하여 20시간 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건 하에서 배양함으로써 세포의 발생율(세포수)을 증가시켰다.

소 복제 수정란의 배양에 있어서, 0.4% 소혈청알부민이 함유된 조건에서 기본배지(CR1)에 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하여 체외에서 소 복제 수정란을 배반포로 배양하는 배양단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 탈핵된 소 난자에 귀 섬유아세포를 이식하여 만들어진 체세포 복제 수정란의 초기단계에서 체외 배양액(0.4% 소혈청알부민을 함유한 기본배지(CR1 medium))에 50nM 트리코스타틴 에이(TSA ; Trichostatin A, 미합중국 시그마사(Sigma), Cat. No.: T-8552)를 첨가하여 20시간 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 배양함으로서 기존의 소 복제 수정란의 체외배양체계와 비교하 여 보다 효과 있는 배양체계를 제공하기 위한 소 복제 수정란의 체외 배양 방법이 제공되는 효과가 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 0.4% 소혈청알부민이 함유된 조건에서 기본배지(CR1)에 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하여 체외에서 소 복제 수정란을 배반포로 배양하는 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 배반포기까지 배양하여 대리모에 이식할 수 있도록 하는데 그 특징이 있다.

종래의 방법에서는 소 복제 수정란을 0.4%의 소혈청알부민과 10% 우태혈청이첨가된 기본배지(CR1 medium)에서 배양시켜 왔다. 그러나 이러한 소혈청알부민 (BSA, Sigma, A8806)과 10% 우태혈청만 포함된 배지에서는 세포의 발생율(세포수)을 증가시키지 못하였다.

그러나 본 발명에서는 상기의 소 복제 수정란을 기본배지 (0.4% 소혈청알부민이 함유된 기본배지에 50nM 트리코스타틴 에이(Trichostatin A, 미합중국 소재 시그마사(Sigma), Cat. No.: T-8552)를 첨가하는 본 발명의 방법에 의하여 세포의 발생율이 현저하게 증가하였다.

이러한 방법은 종래의 소 복제 수정란 배양법보다 그 효율이 뛰어난 수정란 체외배양법을 제공하고 있다.

이하, 이와 같은 본 발명을 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠 지만, 본 발명이 다음 실시 예에 한정된 것은 아니다.

실시예 1 : 소 복제 수정란의 생산

제 1 단계 : 체외성숙

체외성숙(In vitro maturation)을 위한 배지는 다음과 같이 준비하였다.

세척용 dPBS(미합중국 소재 기브코 비알엘사(GIBCO BRL), Cat. No. : 14190-144);

배양용 TCM199(미합중국 소재 기브코 비알엘사(Cat. No. : 11150);

소듐피루베이트(Sodium pyrubate ; 미합중국 시그마사(Sigma), Cat. No.: P2256);

항생제-항진균제(미합중국 소재 기브코 비알엘사, Cat. No. : 15240);

에스트라디올(Estradiol ; 미합중국 시그마사 Cat. No. : E8875);

난포자극호르몬(FSH ; 카나다 소재 비오니케사(BIONICHE), Cat. No. : DIN00867357);

우태혈청(FBS ; 미합중국 소재 기브코 비알엘사, Cat. No. : 16141-079).

배양액을 미리 스톡(stock)으로 준비하여 냉장 혹은 냉동에 보관하였다. 25℃의 생리식염수를 이용해 도축장으로부터 난소를 실험실로 운반하여 18G의 바늘을 이용하여 난소로부터 미성숙난자를 회수한 다음, 상기 세척용 d-PBS 배지에서 3회 세척 후, 배양용 TCM199배지에서 3회 세척하여 수집하였다. 체외성숙 배양액은 배양용 TCM199에 0.2mM 소듐피루베이트, 10㎕/㎖ 100x 항생제-항진균제, 1㎍/㎖ 난포자극호르몬, 100㎕/㎖ 우태혈청, 1㎍/㎖ 에스트라디올을 첨가하였다. 배양액은 난 자를 배양 전에 미리 5%의 이산화탄소(CO₂)가 있는 39 ℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 온도와 이산화탄소의 농도를 조절하였다. 수집된 난자들은 4-웰(well) 접시(dish)에 들어있는 성숙배지에 웰당 50개 정도의 난자를 넣어 20 내지 22시간 동안 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 성숙시켰다.

제 2 단계 : 소의 귀(ear)로부터 세포를 분리하여 체세포주를 확립하는 단계

성체의 귀 선단에서 떼어 낼 부위 주변의 체모를 깎고, 소독용 알코올과 베타딘으로 소독하였다. 멸균된 기구로 1 내지 2㎝ 넓이의 피부 조직을 절제한 다음, 50㎖ 시험관에 세척용 dPBS를 준비하여 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하여 실험실로 운반하였다. 실험실로 가져와서 다시 세척용 dPBS 용액으로 세정한 다음, 멸균된 집게로 고정한 후, 체모를 포함한 피부와 연골조직을 멸균된 가위나 칼날(blade)로 분리하여, 연골조직과 연한 피부내측 조직을 채취하였다. 조직편을 다시 세척용 dPBS 용액으로 세정 후, 칼날(blade)로 세절한 다음, 트립신-에틸렌디아민사초산(trypsin-EDTA) 용액을 첨가하여 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 배양시켰다. 정치 후, 원심 분리용 시험관에 옮겨 와동(vortexing)과 피펫작업(pipetting) 후, 세척용 dPBS 용액을 첨가하여 100 x g에서 5분간 원심 세정하였다. 최종 원심세정 후, 침전 세포를 10% 우태혈청이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM ; Dulbecco's Modified Eagles Medium, 기브코 비알엘사, Cat. No.:12100-046)에 부유시킨 후, 세포 배양용 배양접시로 옮겨 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 배양시켰다.

세포가 배양접시 바닥 면에 부착하여 분열 증식하여 단층이 형성되면, 이를 1차 세포주의 성립으로 간주하였다. 단층이 형성된 1차 세포주는 계대배양을 다음과 같이 실시하였다. 배양접시의 배양액을 버리고, 0.25% 트립신, 1mM 에틸렌디아민사초산 용액을 첨가하여 3분 동안 정치 후, 10% 우태혈청이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지가 들어있는 원심분리용 시험관으로 옮겨 800 x g에서 5분간 원심분리 시켰다. 상등액을 버리고, 새로운 둘베코 변형 이글 배지를 넣어 재부유시킨 후, 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주한 후, 배지를 첨가하여 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 배양시켰다.

제 3 단계 : 난구세포 제거와 탈핵을 실시하는 단계

성숙시킨 난구세포로 둘러싸여 있는 수핵 난자는 미세조작을 위해 하이알루로니데이즈를 이용하여 난구세포를 제거하였다. 탈핵을 위해 TCM199(미합중국 소재 기브코 비알엘사(Cat. No.: 16141-079)를 첨가한 배지로 작업용 접시에 미소적을 만들었다. 작업용 디쉬를 조작판 위에 위치하도록 놓은 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고, 탈핵용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 고정용 피펫을 흡입하여 난자를 약간 고정시킨 후, 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자의 초점을 맞추었다. 탈핵용 피펫을 상하로 움직여 제 1극체와 초점이 같도록 맞추었다. 탈핵용 피펫을 투명대를 통해 찔러 넣어 제 1극체와 주변의 약간의 세포질을 흡입하여 제거하였다.

제 4 단계 : 미리 준비해 둔 공여세포를 탈핵된 난자에 이식하는 단계

이식을 위해 TCM199(기브코 비알엘사, Cat. No. : 12340) 배지로 작업용 접 시에 미소적을 만들어 배양기에 넣어놓았다. 탈핵이 끝나면 세정용 피펫을 이용하여 탈핵된 난자들을 이식용 배지로 옮겼다. 탈핵용 피펫을 이식용 피펫으로 바꾼 후, 7 내지 8개의 공여세포를 주입하였다. 탈핵시킬 때와 같은 방법으로 탈핵 시 생긴 절단부위를 3시 방향에 맞추었다. 이식용 피펫을 절단부위로 넣어, 유압을 걸어 1개의 공여세포를 주입시켰다. 이식이 끝난 난자들을 전기융합 시까지 3회 세척 후, 체외배양 배지에 넣어 정치시켰다.

제 5 단계 : 재구성란의 융합 및 활성화 단계

전기융합에는 만니톨 배지를 이용하였다. 2개의 전극이 있는 작업용 판(1㎜ 챔버)에 만니톨 60㎕를 넣고 BTX-세포조작기와 연결시켰다. 세포융합은 직류전압으로 전압은 200V/㎜이며, 횟수는 1회, 시간은 40㎲의 조건으로 융합시켰다. 융합시킨 난자들은 활성화시킬 때까지 체외배양 배지에서 배양시켰다. 융합 후 1시간째에, 재구성된 난자들은 20mM 6-디메틸아미노피리딘(6-DMAP)이 들어있는 체외배양배지에서 3시간동안 배양시켜 활성화시켰다.

실시예 2 : 트리코스타틴 에이의 소 복제 수정란의 발달율에 대한 효과

상기 실시예 1에서 생성된 복제 수정란은 다음과 같은 배지에서 배양되었다.

(1) 기본배지(CR1) + 0.4% 소혈청알부민(BSA, 시그마사, Cat. No.: A88060)

(2) 기본배지(CR1) + 0.4% 소혈청알부민 + 50nM 트리코스타틴 에이

재구성된 난자는 임의로 두개의 그룹으로 나눈 다음, 한 그룹은 0.4% 소혈청알부민이 함유된 기본배지(CR1)에서 8세포기까지 배양하였다. 그리고 다른 한 그룹은 0.4% 소혈청알부민과 50nM 트리코스타틴 에이가 함유된 기본배지에서 20시간 배양한 다음, 0.4% 소혈청알부민만 함유된 기본배지에서 8세포기까지 배양하였다. 다음 8세포기의 세포질이 좋은 소 복제 수정란을 선택하여 10% 우태혈청이 함유된 기본배지에서 4일간 더 배양하였다. 7일 후에 각 배양액에서의 배반포까지의 발달율을 조사하였다.

실시예 3 : 트리코스타틴 에이의 배반포기의 세포수에 대한 효과

7일 동안 배양한 배반포를 회수하여 3.7% 포르말린(formalin) 용액에서 10분간 고정한 후, 2.5㎎/㎖의 소디움아지드(sodium azide)와 2.5㎍/㎖의 훽스트 33342(Hoechst 33342 ; 시그마사, Cat. No.: B2261)가 함유된 글리세롤(3) : 인산완충용액(1)의 용액으로 염색하였다.

이때 난자의 염색과정은 다음과 같다.

슬라이드글라스의 1/3 부위에 4군데에 파라핀 점적을 형성시킨 다음, 난자를 4군데의 점 가운데에 마우스피펫으로 4 내지 10개 정도 올려놓고, 커버글라스를 덮는다. 다음, 볼펜이나 피펫팁 등의 가는 물건을 이용하여 난자를 누르고, 상기 훽스트 33342가 포함된 용액을 흘려보내고, 거름종이를 반대편에 대어 용액을 통과시킨다.

분석은 3반복을 진행한 후, SAS GLM 프로그램의 투키스 멀티플 레인지 테스트(Tukey's Multiple Range Test)에 의해 유의성을 검증하였다. 데이타는 평균±표준오차로 값을 나타내며 P<0.05이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 하기 표 1에는 소 체세표 핵이식 수정란의 체외배양용 기본배지(CR-1)의 조성을 나타내었다.

성분	농도
NaCl(시그마사 S5886)	114.7mM
KCl(시그마사 P5405)	3.1mM
NaHCO3(시그마사 S5761)	26.2mM
PSG(시그마사 G3632)	0.05%
MEM(시그마사 B7145)	1%
BME(시그마사 B6766)	2%
소듐피루베이트 (시그마사 P2256)	0.2mM
엘-글루타민 (시그마사 G5763)	1mM
엘(+)-락테이트(시그마)	1.78mM

상기 실시예 2에서 생산된 소 복제 수정란을 7일 동안 배양한 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하였을때 발달율에서는 차이를 보이지 않았다.

배양액	재구성란	배반포수	배반포기발달률(%)
기본배지 + 0.4% 소혈청알부민	234	54	23.1±5.22
기본배지 + 0.4% 소혈청알부민 + 50nM 트리코스타틴 에이(20시간)	243	60	24.7±5.22

상기 실시예 3에서 생산된 소 복제 수정란을 7일 동안 배양한 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하였을때 배반포의 세포수를 현저하게 증가시켰다.

배양액	배반포수	배반포기발달률(%)
기본배지 + 0.4% 소혈청알부민	14	77±2.23
기본배지 + 0.4% 소혈청알부민 + 50nM 트리코스타틴 에이(20시간)	15	94±2.23*
* ; P<0.05

상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 소 복제 수정란을 체외에서 배양할 때 초기단계에서 50nM 트리코스타틴 에이를 처리함으로써 세포 생존율(배반포에서의 세포수)을 증가시키는 양질의 배반포로 발달시킬 수 있는 간편한 배양법을 제공하고 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 수정란의 체외배양 과정을 필수적으로 요구하고 있는 형질 전환 동물 및 복제동물의 생산효율을 개선할 수 있는 매우 유용한 발명이다.

본 발명은 소 복제 수정란의 체외 배양 방법을 제공하고, 이는 가축의 형질전환 및 복제동물을 생산하는 산업에 이용될 수 있다.

도 1은 소 복제 수정란의 초기단계에서 기본배지에 50nM 트리코스타틴 에이를 첨가하여 20시간 동안 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 7일간 배양하여 발달한 배반포를 관찰한 촬영사진이다.

Claims (1)

1. 소 복제 수정란의 배양에 있어서,

   0.4% 소혈청알부민이 함유된 조건에서 기본배지(CR1)에 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하여 체외에서 소 복제 수정란을 배반포로 배양하는 배양단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 소 복제 수정란 체외 배양 방법.

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