KR20110050100A - Improvement of scnt bovine embryos in in vivo culture - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 소 복제 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 탈핵된 소 난자에 귀 섬유아세포를 이식하여 만들어진 체세포 복제 수정란의 초기단계에서 체외 배양액(0.4% 소혈청알부민을 함유한 기본배지(CR1 medium))에 50nM 트리코스타틴 에이(TSA ; Trichostatin A, 미합중국 시그마사(Sigma), Cat. No.: T-8552)를 첨가하여 20시간 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 배양함으로서 기존의 소 복제 수정란의 체외배양체계와 비교하여 보다 효과 있는 배양체계를 제공하기 위한 소 복제 수정란의 체외 배양 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for in vitro culture of bovine cloned fertilized egg, and more specifically, in vitro culture medium (0.4% bovine serum albumin containing 0.4% bovine serum albumin) in the early stage of somatic cloned fertilized egg made by transplanting ear fibroblasts into denuclearized bovine eggs (CR1 medium)) by adding 50 nM Trichostatin A (TSA; Trichostatin A, Sigma, Cat. No .: T-8552) for 20 hours, and incubating under tricostatin A free condition. The present invention relates to an in vitro culture method of bovine cloned fertilized eggs to provide a more effective culture system compared to the existing in vitro culture system of bovine cloned fertilized eggs.
최근 가축의 형질전환기술 및 복제동물 생산 실험이 전 세계에서 행해지고 있다. 이들 실험에서는 수정란을 체외에서 조작하는 것이 필수적인 과정이다. 따라서 보다 효과적이고 안정적인 체외배양체계를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 형질전환 소의 경우, 인슐린제제 신약개발에 있어서 주목받고 있다. 왜냐하면, 인슐린 생산에 있어, 기존의 동물세포(중국 햄스터 난소 세포(CHO cell ; Chinese hamster ovary cell) 등) 배양방법에 비해 형질전화동물을 이용할 경우, 10분의 1 이하 수준의 생산단가가 소요되며, 향후 의약품으로서의 비중이 점차적으로 커질것으로 예상되는 인슐린 생산단가 절감을 통한 치료비용의 감소가 이루어지게 될 것이기 때문이다. Recently, livestock transformation techniques and cloned animal production experiments have been conducted around the world. In these experiments, manipulating the fertilized egg in vitro is an essential process. Therefore, researches are being actively conducted to develop more effective and stable in vitro culture system. In particular, in the case of transgenic cattle, attention has been paid in the development of new drugs for insulin preparation. Because, in the production of insulin, compared to the conventional method of culturing animal cells (CHO cell (Chinese hamster ovary cell, etc.)) using transgenic animals, production costs of less than one tenth is required. This is because the cost of treatment will be reduced by reducing the production cost of insulin, which is expected to increase gradually as a drug.
본 발명은 소 복제 수정란의 체외배양에 있어서 발생하는 낮은 세포의 발생율에 대한 문제점을 해결하기 위함에 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명에서는 소 복제 수정란의 초기단계에서 체외 배양액(0.4% 소혈청알부민(BSA)를 함유한 기본배지(CR1 medium)에 50nM 트리코스타틴 에이를 첨가하여 20시간 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건 하에서 배양함으로써 세포의 발생율(세포수)을 증가시켰다.The present invention is intended to solve the problem of low incidence of cells occurring in in vitro culture of bovine cloned fertilized egg. In order to solve this problem, in the present invention, after incubation for 20 hours by adding 50nM tricostatin A to the basal medium (CR1 medium) containing the culture medium (0.4% bovine serum albumin (BSA) in the initial stage of bovine replication fertilized egg, Incubation (cell count) of cells was increased by culturing under conditions free of trichostatin A.
소 복제 수정란의 배양에 있어서, 0.4% 소혈청알부민이 함유된 조건에서 기본배지(CR1)에 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하여 체외에서 소 복제 수정란을 배반포로 배양하는 배양단계를 포함하여 이루어짐을 특징으로 한다.In the culture of bovine cloned fertilized egg, a culture step of culturing bovine cloned fertilized egg blastocyst in vitro by treating 50nM tricostatin A in the basal medium (CR1) for 20 hours under conditions containing 0.4% bovine serum albumin. It features.
본 발명에 따르면 탈핵된 소 난자에 귀 섬유아세포를 이식하여 만들어진 체세포 복제 수정란의 초기단계에서 체외 배양액(0.4% 소혈청알부민을 함유한 기본배지(CR1 medium))에 50nM 트리코스타틴 에이(TSA ; Trichostatin A, 미합중국 시그마사(Sigma), Cat. No.: T-8552)를 첨가하여 20시간 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 배양함으로서 기존의 소 복제 수정란의 체외배양체계와 비교하 여 보다 효과 있는 배양체계를 제공하기 위한 소 복제 수정란의 체외 배양 방법이 제공되는 효과가 있다.According to the present invention, 50 nM trichostatin A (TSA; Trichostatin) in an in vitro culture medium (CR1 medium containing 0.4% bovine serum albumin) in the early stage of somatic cloning embryos made by transplanting ear fibroblasts into denuclearized bovine eggs. A, US Sigma, Cat.No .: T-8552) and incubated for 20 hours, and then incubated in the absence of trichostatin A, compared to the existing in vitro culture system of bovine cloned fertilized eggs An in vitro culture method of bovine cloned fertilized eggs to provide a culture system is effective.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 0.4% 소혈청알부민이 함유된 조건에서 기본배지(CR1)에 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하여 체외에서 소 복제 수정란을 배반포로 배양하는 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 배반포기까지 배양하여 대리모에 이식할 수 있도록 하는데 그 특징이 있다.The present invention is treated with 50 nM trichostatin A in basal medium (CR1) for 20 hours in a condition containing 0.4% bovine serum albumin and cultured in vitro to incubate bovine cloned fertilized egg with blastocysts, and then betrayed under conditions without trichostatin A. It is characterized by the fact that it can be cultured to give up to be transplanted into surrogate mothers.
종래의 방법에서는 소 복제 수정란을 0.4%의 소혈청알부민과 10% 우태혈청이첨가된 기본배지(CR1 medium)에서 배양시켜 왔다. 그러나 이러한 소혈청알부민 (BSA, Sigma, A8806)과 10% 우태혈청만 포함된 배지에서는 세포의 발생율(세포수)을 증가시키지 못하였다.In the conventional method, bovine cloned embryos have been cultured in a CR1 medium supplemented with 0.4% bovine serum albumin and 10% fetal bovine serum. However, the medium containing only bovine serum albumin (BSA, Sigma, A8806) and 10% fetal bovine serum did not increase the incidence of cells (cell count).
그러나 본 발명에서는 상기의 소 복제 수정란을 기본배지 (0.4% 소혈청알부민이 함유된 기본배지에 50nM 트리코스타틴 에이(Trichostatin A, 미합중국 소재 시그마사(Sigma), Cat. No.: T-8552)를 첨가하는 본 발명의 방법에 의하여 세포의 발생율이 현저하게 증가하였다.However, in the present invention, the above bovine cloned fertilized egg was used as a base medium (50% M Trichostatin A (Sigma, Cat. No .: T-8552) in a base medium containing 0.4% bovine serum albumin). The incidence of cells was markedly increased by the method of the present invention which was added.
이러한 방법은 종래의 소 복제 수정란 배양법보다 그 효율이 뛰어난 수정란 체외배양법을 제공하고 있다.This method provides a fertilized egg in vitro culture method which is more efficient than the conventional bovine cloned fertilized egg culture method.
이하, 이와 같은 본 발명을 다음 실시 예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠 지만, 본 발명이 다음 실시 예에 한정된 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples, but the present invention is not limited to the following examples.
실시예 1 : 소 복제 수정란의 생산Example 1 Production of Bovine Cloned Embryos
제 1 단계 : 체외성숙Stage 1: in vitro maturation
체외성숙(In vitro maturation)을 위한 배지는 다음과 같이 준비하였다.The medium for in vitro maturation was prepared as follows.
세척용 dPBS(미합중국 소재 기브코 비알엘사(GIBCO BRL), Cat. No. : 14190-144);Washing dPBS (GIBCO BRL, Cat. No .: 14190-144);
배양용 TCM199(미합중국 소재 기브코 비알엘사(Cat. No. : 11150);Cultivation TCM199 (Gibco Bielsa, USA) (Cat. No .: 11150);
소듐피루베이트(Sodium pyrubate ; 미합중국 시그마사(Sigma), Cat. No.: P2256);Sodium pyrubate (Sigma, Cat. No .: P2256);
항생제-항진균제(미합중국 소재 기브코 비알엘사, Cat. No. : 15240);Antibiotic-antifungal agents (Gibco Vialelsa, Cat. No .: 15240);
에스트라디올(Estradiol ; 미합중국 시그마사 Cat. No. : E8875);Estradiol (US Sigma Cat. No .: E8875);
난포자극호르몬(FSH ; 카나다 소재 비오니케사(BIONICHE), Cat. No. : DIN00867357);Follicle-stimulating hormone (FSH; BIONICHE, Cat. No .: DIN00867357);
우태혈청(FBS ; 미합중국 소재 기브코 비알엘사, Cat. No. : 16141-079).Fetal Bovine Serum (FBS; Gibco Vialelsa, Cat. No .: 16141-079).
배양액을 미리 스톡(stock)으로 준비하여 냉장 혹은 냉동에 보관하였다. 25℃의 생리식염수를 이용해 도축장으로부터 난소를 실험실로 운반하여 18G의 바늘을 이용하여 난소로부터 미성숙난자를 회수한 다음, 상기 세척용 d-PBS 배지에서 3회 세척 후, 배양용 TCM199배지에서 3회 세척하여 수집하였다. 체외성숙 배양액은 배양용 TCM199에 0.2mM 소듐피루베이트, 10㎕/㎖ 100x 항생제-항진균제, 1㎍/㎖ 난포자극호르몬, 100㎕/㎖ 우태혈청, 1㎍/㎖ 에스트라디올을 첨가하였다. 배양액은 난 자를 배양 전에 미리 5%의 이산화탄소(CO2)가 있는 39 ℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 온도와 이산화탄소의 농도를 조절하였다. 수집된 난자들은 4-웰(well) 접시(dish)에 들어있는 성숙배지에 웰당 50개 정도의 난자를 넣어 20 내지 22시간 동안 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 성숙시켰다.The culture was prepared in stock and stored in refrigeration or freezing. The ovaries were transported from the slaughterhouse to the laboratory using saline at 25 ° C. to recover the immature eggs from the ovaries using 18G needles, washed three times in the d-PBS medium for washing, and then three times in the culture TCM199 medium. Collected by washing. In vitro maturation broth was added 0.2 mM sodium pyruvate, 10 μl / ml 100 × antibiotic-antifungal, 1 μg / ml follicle stimulating hormone, 100 μl / ml fetal bovine serum, 1 μg / ml estradiol. The culture medium was adjusted temperature and carbon dioxide concentration for 2 hours in a 39 ℃ incubator containing 5% of carbon dioxide (CO 2 ) before incubation. The collected eggs were placed in a mature medium in a 4-well dish, and 50 eggs per well were matured in a saturated humidity incubator of 39 ° C. and 5% carbon dioxide for 20 to 22 hours.
제 2 단계 : 소의 귀(ear)로부터 세포를 분리하여 체세포주를 확립하는 단계Second step: separating the cells from the cow's ear to establish a somatic cell line
성체의 귀 선단에서 떼어 낼 부위 주변의 체모를 깎고, 소독용 알코올과 베타딘으로 소독하였다. 멸균된 기구로 1 내지 2㎝ 넓이의 피부 조직을 절제한 다음, 50㎖ 시험관에 세척용 dPBS를 준비하여 절제된 조직을 넣어 4℃로 냉장 보관하여 실험실로 운반하였다. 실험실로 가져와서 다시 세척용 dPBS 용액으로 세정한 다음, 멸균된 집게로 고정한 후, 체모를 포함한 피부와 연골조직을 멸균된 가위나 칼날(blade)로 분리하여, 연골조직과 연한 피부내측 조직을 채취하였다. 조직편을 다시 세척용 dPBS 용액으로 세정 후, 칼날(blade)로 세절한 다음, 트립신-에틸렌디아민사초산(trypsin-EDTA) 용액을 첨가하여 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 배양시켰다. 정치 후, 원심 분리용 시험관에 옮겨 와동(vortexing)과 피펫작업(pipetting) 후, 세척용 dPBS 용액을 첨가하여 100 x g에서 5분간 원심 세정하였다. 최종 원심세정 후, 침전 세포를 10% 우태혈청이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM ; Dulbecco's Modified Eagles Medium, 기브코 비알엘사, Cat. No.:12100-046)에 부유시킨 후, 세포 배양용 배양접시로 옮겨 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 배양시켰다.Hairs around the area to be detached from the tip of the adult ear were shaved and disinfected with rubbing alcohol and betadine. After dissecting 1 to 2 cm of skin tissue with a sterile instrument, prepared dPBS for washing in a 50 ml test tube, put the excised tissue and refrigerated at 4 ℃ and transported to the laboratory. Bring it to the laboratory, wash it again with dPBS solution for washing, fix it with sterile forceps, and separate skin and cartilage tissue including hairs with sterile scissors or blades to collect cartilage tissue and soft skin tissue. It was. The tissue pieces were washed again with a washing dPBS solution, and then sliced with blades, and then cultured in a saturated humidity incubator at 39 ° C. and 5% carbon dioxide by adding trypsin-EDTA solution. After standing, the mixture was transferred to a centrifuge test tube, and after vortexing and pipetting, a washing dPBS solution was added and centrifuged at 100 x g for 5 minutes. After final centrifugation, the precipitated cells were suspended in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; Dulbecco's Modified Eagles Medium, Gibco Bielsar, Cat. No.:12100-046) to which 10% fetal calf serum was added. The plate was transferred to a culture plate and cultured in a saturated humidity incubator at 39 ° C. and 5% carbon dioxide.
세포가 배양접시 바닥 면에 부착하여 분열 증식하여 단층이 형성되면, 이를 1차 세포주의 성립으로 간주하였다. 단층이 형성된 1차 세포주는 계대배양을 다음과 같이 실시하였다. 배양접시의 배양액을 버리고, 0.25% 트립신, 1mM 에틸렌디아민사초산 용액을 첨가하여 3분 동안 정치 후, 10% 우태혈청이 첨가된 둘베코 변형 이글 배지가 들어있는 원심분리용 시험관으로 옮겨 800 x g에서 5분간 원심분리 시켰다. 상등액을 버리고, 새로운 둘베코 변형 이글 배지를 넣어 재부유시킨 후, 적당량을 새로운 페트리디쉬에 분주한 후, 배지를 첨가하여 39℃, 5% 이산화탄소의 포화습도 배양기 내에서 배양시켰다. When cells adhered to the bottom plate of the culture plate and proliferated and formed a monolayer, this was regarded as the establishment of the primary cell line. Primary cell lines with monolayers were passaged as follows. Discard the culture medium from the dish, add 0.25% trypsin and 1 mM ethylenediaminesacetic acid solution, and leave for 3 minutes, then transfer to a centrifuge test tube containing Dulbecco's modified Eagle's medium with 10% fetal calf serum at 800 xg. It was centrifuged for 5 minutes. The supernatant was discarded, resuspended with fresh Dulbecco's modified Eagle's medium, and the appropriate amount was dispensed into fresh Petri dishes, followed by addition of medium and incubated in a saturated humidity incubator at 39 ° C. and 5% carbon dioxide.
제 3 단계 : 난구세포 제거와 탈핵을 실시하는 단계Third step: removing the oocytes and performing denucleation
성숙시킨 난구세포로 둘러싸여 있는 수핵 난자는 미세조작을 위해 하이알루로니데이즈를 이용하여 난구세포를 제거하였다. 탈핵을 위해 TCM199(미합중국 소재 기브코 비알엘사(Cat. No.: 16141-079)를 첨가한 배지로 작업용 접시에 미소적을 만들었다. 작업용 디쉬를 조작판 위에 위치하도록 놓은 다음, 고정용 피펫은 9시 방향에 위치시키고, 탈핵용 피펫은 3시 방향에 위치시켰다. 고정용 피펫을 흡입하여 난자를 약간 고정시킨 후, 조동나사와 미동나사를 이용하여 난자의 초점을 맞추었다. 탈핵용 피펫을 상하로 움직여 제 1극체와 초점이 같도록 맞추었다. 탈핵용 피펫을 투명대를 통해 찔러 넣어 제 1극체와 주변의 약간의 세포질을 흡입하여 제거하였다.Nucleated pulmonary eggs surrounded by mature cumulus cells were removed using hyaluronidase for micromanipulation. Microplates were made on a work plate with medium added with TCM199 (Gibco Vialelsa (Cat. No .: 16141-079) for denuclearization. The work dish was placed on the operation panel, and the fixing pipette was placed at 9 o'clock. Direction, the denuclear pipette was positioned at 3 o'clock, the fixed pipette was aspirated to fix the egg slightly, and the oocytes were focused using coarse and fine screws. The denuclearization pipette was pierced through the zona pellucida to remove the first polar body and some of the surrounding cytoplasm by suction.
제 4 단계 : 미리 준비해 둔 공여세포를 탈핵된 난자에 이식하는 단계Step 4: transplanting donor cells prepared in advance into denuclearized eggs
이식을 위해 TCM199(기브코 비알엘사, Cat. No. : 12340) 배지로 작업용 접 시에 미소적을 만들어 배양기에 넣어놓았다. 탈핵이 끝나면 세정용 피펫을 이용하여 탈핵된 난자들을 이식용 배지로 옮겼다. 탈핵용 피펫을 이식용 피펫으로 바꾼 후, 7 내지 8개의 공여세포를 주입하였다. 탈핵시킬 때와 같은 방법으로 탈핵 시 생긴 절단부위를 3시 방향에 맞추었다. 이식용 피펫을 절단부위로 넣어, 유압을 걸어 1개의 공여세포를 주입시켰다. 이식이 끝난 난자들을 전기융합 시까지 3회 세척 후, 체외배양 배지에 넣어 정치시켰다. Micrografts were made in working cultures with TCM199 (Gibco Bealelsa, Cat. No .: 12340) medium for implantation and placed in the incubator. After denucleation, denuclearized eggs were transferred to a transplant medium using a washing pipette. After replacing the denuclear pipette with a transplant pipette, 7 to 8 donor cells were injected. As in the case of denuclearization, the cut portion generated during denuclearization was adjusted to the 3 o'clock position. A transplant pipette was put into the cut site and hydraulically injected to inject one donor cell. After the transplantation, the eggs were washed three times until electrofusion and placed in in vitro culture medium.
제 5 단계 : 재구성란의 융합 및 활성화 단계Step 5: fusion and activation of the reconstituted eggs
전기융합에는 만니톨 배지를 이용하였다. 2개의 전극이 있는 작업용 판(1㎜ 챔버)에 만니톨 60㎕를 넣고 BTX-세포조작기와 연결시켰다. 세포융합은 직류전압으로 전압은 200V/㎜이며, 횟수는 1회, 시간은 40㎲의 조건으로 융합시켰다. 융합시킨 난자들은 활성화시킬 때까지 체외배양 배지에서 배양시켰다. 융합 후 1시간째에, 재구성된 난자들은 20mM 6-디메틸아미노피리딘(6-DMAP)이 들어있는 체외배양배지에서 3시간동안 배양시켜 활성화시켰다.Mannitol medium was used for the electrofusion. 60 μl of mannitol was placed in a working plate (1 mm chamber) with two electrodes and connected to a BTX-cell operator. The cell fusion was a DC voltage, the voltage was 200V / mm, the number of times was fused under the conditions of 40 kW. The fused eggs were incubated in in vitro culture medium until activated. One hour after fusion, the reconstituted eggs were activated by incubation for 3 hours in an in vitro culture medium containing 20 mM 6-dimethylaminopyridine (6-DMAP).
실시예 2 : 트리코스타틴 에이의 소 복제 수정란의 발달율에 대한 효과Example 2 Effect on Development Rate of Bovine Replication Embryos of Trichostatin A
상기 실시예 1에서 생성된 복제 수정란은 다음과 같은 배지에서 배양되었다.Replication embryos produced in Example 1 were cultured in the following medium.
(1) 기본배지(CR1) + 0.4% 소혈청알부민(BSA, 시그마사, Cat. No.: A88060)(1) Basic medium (CR1) + 0.4% bovine serum albumin (BSA, Sigma, Cat.No .: A88060)
(2) 기본배지(CR1) + 0.4% 소혈청알부민 + 50nM 트리코스타틴 에이(2) Basic medium (CR1) + 0.4% bovine serum albumin + 50 nM trichostatin A
재구성된 난자는 임의로 두개의 그룹으로 나눈 다음, 한 그룹은 0.4% 소혈청알부민이 함유된 기본배지(CR1)에서 8세포기까지 배양하였다. 그리고 다른 한 그룹은 0.4% 소혈청알부민과 50nM 트리코스타틴 에이가 함유된 기본배지에서 20시간 배양한 다음, 0.4% 소혈청알부민만 함유된 기본배지에서 8세포기까지 배양하였다. 다음 8세포기의 세포질이 좋은 소 복제 수정란을 선택하여 10% 우태혈청이 함유된 기본배지에서 4일간 더 배양하였다. 7일 후에 각 배양액에서의 배반포까지의 발달율을 조사하였다.Reconstituted eggs were randomly divided into two groups, and then one group was cultured up to 8 cell stage in basal medium (CR1) containing 0.4% bovine serum albumin. The other group was incubated for 20 hours in a basal medium containing 0.4% bovine serum albumin and 50 nM trichostatin A, and then up to 8 cell stages in a basal medium containing only 0.4% bovine serum albumin. Next, a good cytoplasmic bovine cloned embryo of 8-cell stage was selected and cultured for 4 days in a basal medium containing 10% fetal bovine serum. After 7 days, the rate of development up to blastocyst in each culture was examined.
실시예 3 : 트리코스타틴 에이의 배반포기의 세포수에 대한 효과Example 3 Effect of Trichostatin A on Cell Number of Blastocysts
7일 동안 배양한 배반포를 회수하여 3.7% 포르말린(formalin) 용액에서 10분간 고정한 후, 2.5㎎/㎖의 소디움아지드(sodium azide)와 2.5㎍/㎖의 훽스트 33342(Hoechst 33342 ; 시그마사, Cat. No.: B2261)가 함유된 글리세롤(3) : 인산완충용액(1)의 용액으로 염색하였다.The blastocysts cultured for 7 days were collected and fixed in 3.7% formalin solution for 10 minutes, followed by 2.5 mg / ml sodium azide and 2.5 μg / ml Hoechst 33342 (Sigma, Cat). No .: B2261) -containing glycerol (3): Stained with a solution of phosphate buffer solution (1).
이때 난자의 염색과정은 다음과 같다. The egg dyeing process is as follows.
슬라이드글라스의 1/3 부위에 4군데에 파라핀 점적을 형성시킨 다음, 난자를 4군데의 점 가운데에 마우스피펫으로 4 내지 10개 정도 올려놓고, 커버글라스를 덮는다. 다음, 볼펜이나 피펫팁 등의 가는 물건을 이용하여 난자를 누르고, 상기 훽스트 33342가 포함된 용액을 흘려보내고, 거름종이를 반대편에 대어 용액을 통과시킨다.Paraffin droplets are formed in four places on one-third of the slide glass, and then 4 to 10 eggs are placed in the middle of the four spots with a mouse pipette, and the cover glass is covered. Next, the egg is pressed using a thin object such as a ballpoint pen or a pipette tip, the solution containing the Hoechst 33342 is poured out, and the filter paper is passed on the opposite side to pass the solution.
분석은 3반복을 진행한 후, SAS GLM 프로그램의 투키스 멀티플 레인지 테스트(Tukey's Multiple Range Test)에 의해 유의성을 검증하였다. 데이타는 평균±표준오차로 값을 나타내며 P<0.05이면 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 하기 표 1에는 소 체세표 핵이식 수정란의 체외배양용 기본배지(CR-1)의 조성을 나타내었다.The analysis was repeated three times, and then the significance was verified by the Tukey's Multiple Range Test of the SAS GLM program. The data represent values as mean ± standard error and were determined to be significant when P <0.05. Table 1 below shows the composition of the basal culture medium (CR-1) for bovine tax table nuclear transfer embryos.
(시그마사 P2256)Sodium pyruvate
(Sigma P2256)
(시그마사 G5763)L-Glutamine
(Sigma G5763)
상기 실시예 2에서 생산된 소 복제 수정란을 7일 동안 배양한 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하였을때 발달율에서는 차이를 보이지 않았다.As a result of incubating the bovine cloned fertilized egg produced in Example 2 for 7 days, as shown in Table 2, when the 50 nM trichostatin A was treated for 20 hours, there was no difference in development rate.
상기 실시예 3에서 생산된 소 복제 수정란을 7일 동안 배양한 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 50nM 트리코스타틴 에이를 20시간 처리하였을때 배반포의 세포수를 현저하게 증가시켰다.As a result of incubating the bovine cloned fertilized egg produced in Example 3 for 7 days, as shown in Table 3, the cell number of the blastocyst was significantly increased when 50 nM trichostatin A was treated for 20 hours.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명은 소 복제 수정란을 체외에서 배양할 때 초기단계에서 50nM 트리코스타틴 에이를 처리함으로써 세포 생존율(배반포에서의 세포수)을 증가시키는 양질의 배반포로 발달시킬 수 있는 간편한 배양법을 제공하고 있음을 확인할 수 있었다.As described above, the present invention provides a simple culture method that can develop high quality blastocysts that increase cell viability (cell number in blastocysts) by treating 50 nM trichostatin A at an early stage when bovine replication embryos are in vitro cultured. I could confirm that it is provided.
따라서, 본 발명은 수정란의 체외배양 과정을 필수적으로 요구하고 있는 형질 전환 동물 및 복제동물의 생산효율을 개선할 수 있는 매우 유용한 발명이다. Therefore, the present invention is a very useful invention that can improve the production efficiency of transgenic animals and clones, which is indispensable for in vitro culture of fertilized eggs.
본 발명은 소 복제 수정란의 체외 배양 방법을 제공하고, 이는 가축의 형질전환 및 복제동물을 생산하는 산업에 이용될 수 있다.The present invention provides a method for in vitro culture of bovine cloned fertilized eggs, which can be used in the industry for the transformation of livestock and producing cloned animals.
도 1은 소 복제 수정란의 초기단계에서 기본배지에 50nM 트리코스타틴 에이를 첨가하여 20시간 동안 배양한 후, 트리코스타틴 에이가 없는 조건하에서 7일간 배양하여 발달한 배반포를 관찰한 촬영사진이다. 1 is a photograph taken to observe the development of blastocysts after incubation for 20 hours in the absence of trichostatin A by adding 50nM trichostatin A to the basal medium in the initial stage of bovine replication embryos.
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Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090106944A KR20110050100A (en) | 2009-11-06 | 2009-11-06 | Improvement of scnt bovine embryos in in vivo culture |
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| KR20110050100A true KR20110050100A (en) | 2011-05-13 |
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ID=44360964
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| KR (1) | KR20110050100A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102469369B1 (en) * | 2022-03-17 | 2022-11-18 | 충북대학교 산학협력단 | Medium composition for in vitro culture of mammalian fertilized eggs containing interleukin 7 |
-
2009
- 2009-11-06 KR KR1020090106944A patent/KR20110050100A/en not_active Application Discontinuation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| KR102469369B1 (en) * | 2022-03-17 | 2022-11-18 | 충북대학교 산학협력단 | Medium composition for in vitro culture of mammalian fertilized eggs containing interleukin 7 |
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