KR20110042848A - Copper-capped nanoparticle array biochip based on lspr optical properties and use thereof - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 국소 표면 플라즈몬 공명(localized surface plasmon resonance; LSPR) 광학특성을 기반으로 하는 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 기판 상에 형성된 금속 박막층, 상기 금속 박막층에 나노입자가 일정한 간격으로 배열된 나노입자 배열층, 상기 나노입자 배열층 상에 형성된 구리 박막층을 포함하는 새로운 형태의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩; 상기 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 표면에 하나 이상의 바이오리셉터가 고정되어 있어 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질과의 상호작용을 검출 및/또는 정량할 수 있는 비표지 광학 바이오센서; 및 그 용도에 관한 것이다.The present invention relates to a copper-deposited nanoparticle array biochip based on localized surface plasmon resonance (LSPR) optical properties, and more particularly, to a metal thin film layer formed on a substrate, and nanoparticles to the metal thin film layer. Is a new type of copper-deposited nanoparticle array biochip comprising a nanoparticle array layer arranged at regular intervals, a copper thin film layer formed on the nanoparticle array layer; A non-labeled optical biosensor that has one or more bioreceptors fixed on a surface of the copper-deposited nanoparticle array biochip, thereby detecting and / or quantifying interaction with a target biomaterial or a candidate target biomaterial; And uses thereof.
금속에는 자유전자가 많이 포함되어 있으며, 자유전자는 서로 상호작용을 하며 집단적으로 진동한다. 보통 이와 같은 진동을 플라즈마 진동(양자로 생각하면, 플라즈몬(Plasmon))이라고 하며, 이 중에서 금속 나노입자의 표면에서 국소적으로 진동하는 현상을 국소 표면 플라즈몬 공명(LSPR)이라고 한다. LSPR 광학특성은 광의 파장보다 작은 금이나 은, 구리와 같은 금속 나노구조가 나타내는 광학적 특징이다. 금속 나노구조체는 그 사이즈나 형태에 의해 가시영역에서 적외선 영역까지 폭넓은 파장영역의 광과 공조하며, 여러 가지 색을 나타낸다. 최근 금속 나노입자(nano-particle), 나노도트(nano-dot), 나노아일랜드(nano-island), 나노로드(nano-rod) 및 나노와이어(nano-wire) 등이 화학적으로 결합되어 LSPR 광학특성 이나 표면 증강 라만 분광법(SERS) 등의 광학현상, 또는 고주파 발생기술 등의 비선형 광학효과 등의 금속 나노구조가 갖는 기초물성을 밝혀내는 연구가 수행되고 있다. 또한 금속 나노구조체는 단순한 광학재료로서 사용되는 것뿐만 아니라 바이오 물질의 상호작용을 분석하는 바이오센서로서도 응용되고 있다. Metals contain many free electrons, which interact with each other and vibrate collectively. Such vibrations are commonly referred to as plasma vibrations (Plasmon), and local vibrations on the surface of metal nanoparticles are called local surface plasmon resonance (LSPR). LSPR optical characteristics are optical characteristics exhibited by metal nanostructures such as gold, silver and copper which are smaller than the wavelength of light. Metal nanostructures, by their size and shape, cooperate with light in a wide range of wavelengths from the visible region to the infrared region and exhibit various colors. Recently, metal nanoparticles (nano-particle), nano-dot (nano-dot), nano-island (nano-island), nano-rod (nano-rod) and nano-wire (nano-wire), etc. are chemically coupled to LSPR optical properties In addition, studies have been conducted to reveal the basic physical properties of metal nanostructures such as optical phenomena such as surface enhanced Raman spectroscopy (SERS) or nonlinear optical effects such as high frequency generation technology. Metal nanostructures are not only used as simple optical materials but also applied as biosensors to analyze the interaction of biomaterials.
LSPR 광학특성은 금속 나노입자 등의 금속 나노구조체 표면에서 발생하는 유전율 변화, 즉, 굴절율 변화에 민감하게 응답하기 때문에 수정진동자 미세저울법(quartz crystal microbalance: QCM)이나 전기화학법을 이용한 비표지 바이오센서보다도 고감도로 간편하게 바이오 물질 상호작용의 분석이 가능하다. 또한 LSPR 광학특성은 가시영역에서 흡수 피크가 얻어지기 때문에 지금까지 개발된 SPR 광학특성을 이용한 비표지 바이오센서와 비교하여 보다 간단한 광학계로서 바이오 물질 상호작용의 분석이 가능하다. LSPR optical properties are sensitive to changes in dielectric constant, that is, refractive index, occurring on the surface of metal nanostructures such as metal nanoparticles, and thus, unlabeled biomaterials using quartz crystal microbalance (QCM) or electrochemical methods. The analysis of biomaterial interactions is simpler and more sensitive than sensors. In addition, since the absorption peak is obtained in the visible region of the LSPR optical properties, it is possible to analyze biomaterial interactions as a simpler optical system as compared to the unlabeled biosensor using the SPR optical properties developed so far.
지금까지 개발된 LSPR 광학특성 기반 금속 나노입자 배열 바이오칩에 적용된 금속 나노입자는 주로 금이나 은과 같은 귀금속이 이용되었으며, 나노입자의 합성 및 형태 제어가 가능하며 바이오 물질을 쉽게 고정시킬 수 있다는 장점이 있지만, 금이나 은과 같은 금속 나노입자는 산업적으로 적용하기에는 비싼 재료에 속한다. 이에 비해, 구리 금속 나노입자는 나노입자의 합성 및 형태 제어가 어렵다는 단점이 있지만 값이 싸고, 높은 전도도를 가진다는 장점이 있으며, 기존의 금속 나노입자 뿐만 아니라 유전체 나노입자(core)의 표면에 구리 금속(shell)을 코팅하는 core-shell 방식으로 구리 나노입자를 제작할 수 있어 금과 은과 같은 귀금속 나노입자를 대체할 수 있을 것으로 생각되며, 구리 나노입자를 이용한 LSPR 광학특성 기반 구리 나노입자 배열칩에 관한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.Metal nanoparticle array based on LSPR optical properties developed so far, metal nanoparticles are mainly made of precious metals such as gold or silver, and it is possible to synthesize and control nanoparticles and to easily fix biomaterials. However, metal nanoparticles such as gold and silver are expensive materials for industrial application. On the other hand, copper metal nanoparticles have disadvantages of difficulty in synthesizing and morphological control of nanoparticles, but they are inexpensive and have high conductivity, and have copper on the surface of dielectric nanoparticles as well as conventional metal nanoparticles. Copper nanoparticles can be manufactured by core-shell method of coating metal (shell), and it is thought to be able to replace precious metal nanoparticles such as gold and silver, and copper nanoparticle array chip based on LSPR optical characteristics using copper nanoparticles Research on steadily progress.
미국 라이스대의 Halas 그룹(N.J. Halas et. al., J. Phys. Chem. B, 109:18218, 2005)은 비전착성(electroless) 도금을 위하여 우선 실리카 나노입자의 표면에 화학결합 방법으로 구형 금 나노입자를 고정시킨 후, 비전착성 구리 도금 방법을 이용하여 구리 금속을 나노입자 표면에 코팅하여 구형 구리 나노입자를 개발하였으며, 도금된 구리 금속의 두께에 따라 LSPR 광학밴드가 변화하는 것을 관찰하였다. 일본 큐슈대의 Yamada 그룹(S. Yamada et. al., Chemistry Letters, 38:326, 2009)은 이온화된 기판에 구형 금 나노입자를 고정시킨 후, 프탈로시아닌 구리 복합체(CuPc)를 스핀코팅(spin-coating) 방법으로 코팅하여 구형 구리 나노입자 배열칩을 완성하였으며, 금 나노입자 배열칩과 구리 나노입자 배열칩의 LSPR 광학특성을 비교 분석하였다. 미국 노스웨스턴대 van Duyne 그룹(R.P. van Duyne et. al., Nano Letters, 7:1947, 2007)은 나노입자 리소그래피 방법을 이용하여 기판 위에 삼각형 형태의 구리 나노입자 배열칩을 제작하였다. 우선 기판 표면을 친수성 처리한 후, 폴리스틸렌 나노입자를 떨어뜨려 2차원 배열시켰다. 이 후 E-beam 증착기를 이용하여 구리 금속을 증착한 후, 메탄올 용액에 침전시켜 초음파 처리를 통해 폴리스틸렌 나노입자를 제거하여 삼각형 형태의 구리 나노입자 배열칩을 완성하였다. 이들 그룹은 또한 제작된 구리 나노입자의 크기, 형태, 구리 산화막의 두께 등에 따른 LSPR 광학특성을 측정하여 발표하였다. 하지만 이런 형태의 LSPR 광학특성 기반 구리 나노입자 배열칩들은 구리 나노입자의 제작공정의 복잡화, 제작기간의 장기화, 여러 가지 크기의 구리 나노입자 제작의 어려움, 그리고 나노입자의 불규칙적인 고정에 의한 재현성 확립의 어려움 등의 문제점을 가지고 있으며, 실제적으로 LSPR 광학특성 기반 구리 나노입자 배열칩이 바이오칩으로 응용된 예가 현재까지 전무한 실정이다.The Halas Group of Rice, USA (NJ Halas et. Al. , J. Phys. Chem. B , 109: 18218, 2005) first proposed spherical gold nanoparticles by chemical bonding to the surface of silica nanoparticles for electroless plating. After the particles were fixed, spherical copper nanoparticles were developed by coating copper metal on the surface of the nanoparticles using a non-electrodepositable copper plating method, and the LSPR optical band was observed to change according to the thickness of the plated copper metal. The Yamada Group (S. Yamada et. Al. , Chemistry Letters , 38: 326, 2009) of the Kyushu University of Japan immobilized spherical gold nanoparticles on an ionized substrate and then spin-coated the phthalocyanine copper complex (CuPc). The spherical copper nanoparticle array chip was completed by coating with), and LSPR optical characteristics of the gold nanoparticle array chip and the copper nanoparticle array chip were compared and analyzed. The Van Duyne Group (RP van Duyne et. Al. , Nano Letters , 7: 1947, 2007) of Northwestern United States fabricated triangular copper nanoparticle array chips on a substrate using nanoparticle lithography. First, the surface of the substrate was hydrophilized, and then polystyrene nanoparticles were dropped and two-dimensionally arranged. Thereafter, copper metal was deposited using an E-beam evaporator, and then precipitated in a methanol solution to remove polystyrene nanoparticles by ultrasonication, thereby completing a triangular copper nanoparticle array chip. These groups also reported and measured LSPR optical properties according to the size, shape, thickness of copper oxide film, etc. of the fabricated copper nanoparticles. However, these types of LSPR optical chip based copper nanoparticle array chips have complicated manufacturing process of copper nanoparticles, prolonged production time, difficulty in producing copper nanoparticles of various sizes, and reproducibility by irregular fixing of nanoparticles. It is difficult to solve these problems, and practically no examples of LSPR optical characteristics based copper nanoparticle array chips have been applied as biochips.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술의 여러 가지 특징들을 이용하고 문제점을 개선하고자 예의 노력한 결과, LSPR 광학특성을 이용하여 다중검체 바이오 물질을 하나의 칩으로 동시에 검출할 수 있는 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제작하였다. 본 발명자들에 의해 개발된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩은 일정한 크기의 실리카 나노입자를 유리기판 위에 고정시킨 후, 배열된 나노입자들의 표면에 증착기를 이용하여 여러 가지 두께의 구리 금속을 증착시킴으로써 여러 가지 크기의 나노입자를 기판 표면에 배열시키는 것과 같은 효과를 얻을 수 있으며, 그에 따른 흡광도 강도 등의 LSPR 광학특성을 조절할 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, DNA, RNA, 펩타이드, 단백질 등의 다양한 바이오 물질의 상호작용을 검출할 수 있는 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서로 응용가능하다는 것을 확인 하고 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the present inventors have made efforts to use various features of the prior art and to improve the problems. As a result, the copper-deposited nanoparticle array biochips capable of simultaneously detecting multiple sample biomaterials with one chip using LSPR optical characteristics Was produced. The copper-deposited nanoparticle array biochip developed by the present inventors has fixed silica nanoparticles of a certain size on a glass substrate, and then deposits copper metals of various thicknesses on the surface of the arrayed nanoparticles using a vapor deposition machine. It was confirmed that the same effect as arranging the nanoparticles of the branch size on the surface of the substrate, and thereby can adjust the LSPR optical properties such as absorbance intensity. In addition, it was confirmed that the present invention can be applied as a non-labeled optical biosensor based on LSPR optical properties capable of detecting the interaction of various biomaterials such as DNA, RNA, peptide, protein, etc., and completed the present invention.
본 발명의 목적은 LSPR 광학특성을 기반으로 하는 새로운 형태의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.It is an object of the present invention to provide a new type of copper-deposited nanoparticle array biochip based on LSPR optical properties and a method of manufacturing the same.
본 발명의 다른 목적은 새로운 형태의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩에 바이오리셉터가 고정되어 있는 비표지 광학 바이오센서 및 상기 비표지 광학 바이오센서를 이용한 바이오 물질의 측정방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a non-labeled optical biosensor in which a bioreceptor is fixed to a new type of copper-deposited nanoparticle array biochip and a method of measuring biomaterials using the unlabeled optical biosensor.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 기판(제1층) 상에 금속박막층(제2층)을 형성시키는 단계; (b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 나노입자를 일정한 간격으로 배열시켜 나노입자 배열층(제3층))을 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 나노입자 배열층(제3층) 상부에 LSPR 광학특성을 발생시키는 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계를 포함하는 구리(copper) 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 제조방법; 및 상기 방법에 의해 제조된, 금속 박막층(제2층) 상에 일정한 간격으로 배열된 나노입자 배열층(제3층)) 상에 LSPR 광학특성을 발생시키는 구리 박막층(제4층)이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 구리(copper) 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (a) forming a metal thin film layer (second layer) on the substrate (first layer); (b) forming a nanoparticle array layer (third layer) by arranging nanoparticles on the metal thin film layer (second layer) at regular intervals; And (c) forming a copper thin film layer (fourth layer) that generates LSPR optical characteristics on the nanoparticle array layer (third layer); And a copper thin film layer (fourth layer) for generating LSPR optical characteristics on the nanoparticle array layer (third layer) arranged at regular intervals on the metal thin film layer (second layer) prepared by the above method. Provided is a copper-deposited nanoparticle array biochip characterized in that the present invention.
본 발명은 또한, 상기 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 구리 박막층에 하나 이상의 바이오리셉터를 고정시키는 것을 특징으로 하는 비표지 광학 바이오센 서의 제조방법; 및 상기 방법에 의해 제조된, 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 구리 박막층에 하나 이상의 바이오리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 비표지 광학 바이오센서를 제공한다.The present invention also provides a method for manufacturing an unlabeled optical biosensor, characterized in that at least one bioreceptor is fixed to a copper thin film layer of the copper-deposited nanoparticle array biochip; And at least one bioreceptor is fixed to the copper thin film layer of the copper-deposited nanoparticle array biochip manufactured by the above method.
본 발명은 또한, 상기 비표지 광학 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법을 제공한다. The present invention also provides a method for measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial, using the unlabeled optical biosensor.
본 발명에 따른 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩은, 기존의 다양한 형태의 금 및 은 등의 금속 나노입자 배열 바이오칩을 이용한 LSPR 기반 광학 바이오칩이 가지는 장점을 동일하게 가지고 있을 뿐만 아니라, 상기 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩에 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함한 LSPR 광학특성 분석 시스템을 결합함으로써, DNA, 단백질 등의 다양한 바이오 물질의 상호작용을 고감도로 검출할 수 있는 비표지 광학 바이오센서로의 응용이 가능하며, 온-사이트 모니터링에도 적용 가능하다. 또한, 광학, 전자, 촉매작용 등과 같은 분야에 다양하게 응용될 수 있는 장점을 가지는 금이나 은과 같은 금속 나노입자에 비해, 구리 금속 나노입자는 값이 싸고, 높은 전도도를 가진다는 장점이 있어 금과 은과 같은 금속 나노입자를 대체할 수 있을 것으로 예상된다.The copper-deposited nanoparticle array biochip according to the present invention not only has the same advantages as LSPR-based optical biochips using metal nanoparticle array biochips such as gold and silver of various types, but also the copper-deposited nanoparticles By incorporating LSPR optical characterization systems including light sources, detectors, spectrophotometers and computers into particle array biochips, applications to unlabeled optical biosensors that can detect the interaction of various biomaterials such as DNA and proteins with high sensitivity Yes, it's also applicable to on-site monitoring. In addition, copper metal nanoparticles are inexpensive and have high conductivity compared to metal nanoparticles such as gold or silver, which have various advantages in fields such as optics, electronics, and catalysis. It is expected to replace metal nanoparticles such as and silver.
본 발명은, 일 관점에서, (a) 기판(제1층) 상에 금속박막층(제2층)을 형성시 키는 단계; (b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 나노입자를 일정한 간격으로 배열시켜 나노입자 배열층(제3층))을 형성시키는 단계; 및 (c) 상기 나노입자 배열층(제3층) 상부에 LSPR 광학특성을 발생시키는 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계를 포함하는 구리(copper) 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 제조방법; 및 상기 방법에 의해 제조된, 금속 박막층(제2층) 상에 일정한 간격으로 배열된 나노입자 배열층(제3층)) 상에 LSPR 광학특성을 발생시키는 구리 박막층(제4층)이 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 구리(copper) 증착형 나노입자 배열 바이오칩에 관한 것이다.The present invention, in one aspect, (a) forming a metal thin film layer (second layer) on the substrate (first layer); (b) forming a nanoparticle array layer (third layer) by arranging nanoparticles on the metal thin film layer (second layer) at regular intervals; And (c) forming a copper thin film layer (fourth layer) that generates LSPR optical characteristics on the nanoparticle array layer (third layer); And a copper thin film layer (fourth layer) for generating LSPR optical characteristics on the nanoparticle array layer (third layer) arranged at regular intervals on the metal thin film layer (second layer) prepared by the above method. The present invention relates to a copper vapor deposition-type nanoparticle array biochip.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 유리, 폴리스틸렌, Polyethylene terephthalate(PET), 폴리카보네이트, 실리콘 및 석영으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기에 열거한 종류의 기판은 편광에 대해서 이방성을 나타내지 않고, 가공성이 우수한 효과가 있다. 특히, 상기 유리, 폴리스티렌, PET 및 폴리카보네이트는 백색광에 대해서 투명한 특성을 나타낸다. 기판의 표면이 색깔을 띠게 되면 입사한 백색광이 기판 표면으로부터 반사를 하게 되고, LSPR 특성과 같은 광학특성에 영향을 미치게 된다. 따라서 입사한 백색광이 반사하지 않고 투과하는 특성을 가진 투명한 기판을 사용하는 것이 바람직하다. In the present invention, the substrate may be selected from the group consisting of glass, polystyrene, polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, silicon and quartz. The board | substrate of the kind mentioned above does not show anisotropy with respect to polarization, and has the effect excellent in workability. In particular, the glass, polystyrene, PET and polycarbonate exhibit a transparent property against white light. When the surface of the substrate becomes colored, the incident white light is reflected from the surface of the substrate and affects optical properties such as LSPR characteristics. Therefore, it is preferable to use a transparent substrate having a property of transmitting white light without reflection.
본 발명에 있어서, 상기 기판의 두께는 0.1~20mm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 상기 각 기판에 대해 현재까지 제작되었거나 도입 가능한 기판 중에서 본 발명에 사용해도 무방한 최저 두께치와 최고 두께치를 나타내었다. 즉 본 발명에서는 0.1~20mm 두께의 기판을 사용할 때, 기판에 의해 LSPR 광학특성이 영향 받지 않는 바이오칩을 제조할 수 있다.In the present invention, the thickness of the substrate may be characterized in that 0.1 ~ 20mm, which represents the lowest thickness and the highest thickness value that can be used in the present invention among the substrates produced or introduced to date for each of the substrates. It was. That is, in the present invention, when using a substrate having a thickness of 0.1 ~ 20mm, it is possible to manufacture a biochip that LSPR optical properties are not affected by the substrate.
본 발명에 있어서, 상기 금속 박막층으로는 SAM(Self-assembly monolayer)막을 형성시켜 나노입자를 고정할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 사용 가능한 금속의 종류로서는 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni), 아연(Zn) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택하여 사용하는 것이 가능하다. In the present invention, the metal thin film layer is not particularly limited as long as it can form a self-assembly monolayer (SAM) film to fix nanoparticles. For example, the types of metals that can be used include gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), aluminum (Al), platinum (Pt), nickel (Ni), zinc (Zn), and mixtures thereof. It is possible to select and use from the group.
본 발명에 있어서, 상기 기판과 금속 박막층 사이에 중간 금속 박막층을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 중간 금속 박막층의 금속은 크롬(Cr), 티타늄(Ti), 니켈(Ni) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 중간 금속 박막층의 두께는 LSPR 광학특성에 영향을 미치게 되므로, 상기 금속 박막을 기판 표면에 증착시킬 수 있는 최저 두께인 5nm로만 고정하여 사용하는 것이 바람직하다.In the present invention, it may be characterized in that it further comprises an intermediate metal thin film layer between the substrate and the metal thin film layer, the metal of the intermediate metal thin film layer is chromium (Cr), titanium (Ti), nickel (Ni) and these It may be characterized in that it is selected from the group consisting of a mixture of. In addition, since the thickness of the intermediate metal thin film layer affects LSPR optical properties, it is preferable to fix the metal thin film only to 5 nm, which is the minimum thickness that can be deposited on the substrate surface.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자로는 LSPR 특성과 같은 광학특성에 영향을 미치지 않는 유전체로 이루어진 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는 폴리스틸렌 나노입자, 폴리에틸렌 나노입자, 실리카 나노입자에서 선택하여 사용하는 것이 가능하다. 유전체 나노입자의 직경은 10-200nm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직한 것은 100nm이다. 유전체 나노입자의 직경이 10nm 이하이면 유전체 나노입자의 표면에 구리 박막을 증착하더라도 LSPR 광학특성이 발생하지 않으며, 유전체 나노입자의 직경이 200nm이상이면 유전체 나노입자의 표면에 구리 박막을 증착하더라도 플라즈몬 현상에 의해 여기되는 LSPR 광학특성의 측정이 불가능하다. 또한, 유전체 나노입자의 표면에 일정한 두께의 구리 박막을 증착하더라도 사 용되는 유전체 나노입자의 직경에 따라서 LSPR 광학밴드의 파장영역이 달라질 수 있다.In the present invention, the nanoparticles are not particularly limited as long as they are made of a dielectric material that does not affect optical properties such as LSPR properties. Specifically, it is possible to select and use from polystyrene nanoparticles, polyethylene nanoparticles, and silica nanoparticles. The diameter of the dielectric nanoparticles can be characterized in that 10-200nm, most preferably 100nm. If the diameter of the dielectric nanoparticles is less than 10 nm, LSPR optical properties do not occur even if the copper thin film is deposited on the surface of the dielectric nanoparticles. It is impossible to measure the LSPR optical properties that are excited by. In addition, even when a copper thin film having a predetermined thickness is deposited on the surface of the dielectric nanoparticles, the wavelength region of the LSPR optical band may vary according to the diameter of the dielectric nanoparticles used.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자 배열층을 금속 박막층에 일정한 간격으로 배열시키기 위해서, 상기 금속 박막층을 카르복실기로 개질하고, 나노입자 표면을 아민기로 개질한 다음 공유결합시키는 것이 바람직하다. 상기 금속 박막층을 카르복실기로 개질하는 방법으로는 4,4’-dithiodibutylic acid(DDA)를 이용하여 카르복실기를 가지는 SAM막을 형성시키는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아울러, 상기 나노입자 표면을 아민기로 개질하는 방법으로는 상기 나노입자 표면을 3-aminopropyltriethoxy silan (-APTES)를 이용하여 아민기로 개질시키는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, in order to arrange the nanoparticle array layer on the metal thin film layer at regular intervals, the metal thin film layer is preferably modified with a carboxyl group, and the surface of the nanoparticles is modified with an amine group and then covalently bonded. As a method of modifying the metal thin film layer using a carboxyl group, a method of forming a SAM film having a carboxyl group using 4,4′-dithiodibutylic acid (DDA) may be used, but is not limited thereto. In addition, as a method of modifying the surface of the nanoparticles with an amine group, a method of modifying the surface of the nanoparticles with an amine group using 3-aminopropyltriethoxy silan (-APTES) may be used, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 금속 박막층 및 구리 박막층의 박막 형성은 스파터법, 증착법, 이온 플레이팅법, 전기도금법, 무전기도금법 등에 의해 수행하는 것이 가능하다. 금속 박막층 및 구리 박막층의 두께는 나노입자 배열층의 나노입자의 모양, 크기, 배열 상태에 따라 임의로 결정할 수 있다. 예를 들어, 100nm의 실리콘 구형 나노입자의 경우, 금속 박막층의 두께는 30nm∼50nm이며, 구리 박막층의 두께는 20nm∼40nm로 제작하는 것이 바람직하다.In the present invention, the thin film formation of the metal thin film layer and the copper thin film layer can be performed by a spatter method, a deposition method, an ion plating method, an electroplating method, a radioless plating method, or the like. The thickness of the metal thin film layer and the copper thin film layer may be arbitrarily determined according to the shape, size, and arrangement state of the nanoparticles of the nanoparticle array layer. For example, in the case of 100 nm silicon spherical nanoparticles, the thickness of the metal thin film layer is 30 nm to 50 nm, and the thickness of the copper thin film layer is preferably 20 nm to 40 nm.
본 발명에 있어서, 상기 구리 박막층의 두께에 따라 LSPR 광학특성에 의해 발생하는 LSPR 광학밴드 피크의 흡광도 강도가 달라지는 특성을 나타낸다. 따라서, 구리 박막층의 두께에 따라 다양한 흡광도 영역에서 반응할 수 있는 새로운 형태의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제공할 수 있다.In the present invention, the absorbance intensity of the LSPR optical band peak generated by the LSPR optical characteristic is varied depending on the thickness of the copper thin film layer. Accordingly, it is possible to provide a new type of copper-deposited nanoparticle array biochip capable of reacting in various absorbance regions depending on the thickness of the copper thin film layer.
본 발명은, 다른 관점에서, 상기 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 구리 박막층에 하나 이상의 바이오리셉터를 고정시키는 것을 특징으로 하는 비표지 광학 바이오센서의 제조방법; 및 상기 방법에 의해 제조된, 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 구리 박막층에 하나 이상의 바이오리셉터가 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 비표지 광학 바이오센서에 관한 것이다.In another aspect, the present invention provides a method of manufacturing an unlabeled optical biosensor, characterized in that at least one bioreceptor is fixed to a copper thin film layer of the copper-deposited nanoparticle array biochip; And at least one bioreceptor fixed to the copper thin film layer of the copper-deposited nanoparticle array biochip manufactured by the above method.
본 발명에 있어서, 상기 하나 이상의 바이오리셉터를 고정화시키는 방법은 당업계에서 바이오센서 제조시 통상적으로 사용되는 바이오리셉터 고정화 방법을 이용할 수 있다.In the present invention, the method of immobilizing the one or more bioreceptors may use a bioreceptor immobilization method commonly used in the manufacture of biosensors in the art.
본 발명에 있어서, 상기 바이오리셉터는 호르몬, DNA, PNA, 효소 및 세포로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the bioreceptor may be at least one selected from the group consisting of hormones, DNA, PNA, enzymes and cells.
본 발명에서 바이오리셉터란 시료 중의 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질만을 인식하여 특이적으로 결합하는 바이오 물질을 나타내지만, 구리 박막층에 고정화가 가능한 바이오 물질이라면 이에 제한되지 않는다. 이때, 표적 바이오 물질이란 바이오리셉터와 특이적으로 결합 가능한 바이오 물질을 의미하고, 후보 표적 바이오 물질이란 바이오리셉터와 특이적으로 결합하는 것이 예측 가능한 바이오 물질을 의미한다. In the present invention, the bioreceptor refers to a biomaterial that recognizes and specifically binds only a target biomaterial or a candidate target biomaterial in a sample, but is not limited thereto. In this case, the target biomaterial refers to a biomaterial that can be specifically bound to a bioreceptor, and the candidate target biomaterial refers to a biomaterial that can be specifically bound to a bioreceptor.
구체적으로, 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질에 대한 바이오리셉터가 아래에 나열한 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질과 바이오리셉터의 쌍과 같다. 즉, 항원에 대해서는 항체, 항체에 대해서는 항원, 합텐(hapten)에 대해서는 항합텐 항체, 항합텐 항체에 대해서는 합텐, DNA(RNA)에 대해서는 혼 성화(hybridization)되는 것이 가능한 DNA(RNA) 또는 PNA, 비오틴(biotin)에 대해서는 아비딘(abidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘 또는 스트렙타비딘에 대해서는 비오틴 또는 비오틴화 단백질, 호르몬 수용체(스트렙타비딘에인슐린 수용체)에 대해서는 호르몬(스트렙타비딘에인슐린), 호르몬(스트렙타비딘에인슐린)에 대해서는 호르몬 수용체(예를 들어, 인슐린 수용체), 효소에 대해서는 효소 기질 등이 바이오리셉터로서 바람직하다. Specifically, the bioreceptor for the target biomaterial or candidate target biomaterial is the same as the pair of target biomaterial or candidate target biomaterial and bioreceptor listed below. That is, DNA (RNA) or PNA which can be hybridized with respect to an antibody against an antigen, an antigen against an antibody, an antihapten antibody against a hapten, an hapten against an antihapten antibody, and a DNA (RNA), Abidin or streptavidin for biotin, biotin or biotinylated protein for avidin or streptavidin, hormones for streptavidin insulin receptor (streptavidin insulin) ), Hormone receptors (e.g., insulin receptors) for hormones (streptavidin insulin), enzyme substrates for enzymes, and the like are preferred as bioreceptors.
한편, 바이오리셉터로 세포 자체를 사용하는 것도 가능하며, 이 경우 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질은 세포에 있는 수용체 등을 특이적으로 인식하는 것이 가능한 바이오 물질을 사용하는 것이 바람직하다.On the other hand, it is also possible to use the cell itself as a bioreceptor. In this case, it is preferable to use a biomaterial capable of specifically recognizing a receptor or the like in the target biomaterial or candidate target biomaterial.
본 발명에 있어서, 상기 비표지 광학 바이오센서에서 바이오리셉터는 물리적 흡착 또는 화학결합에 의해 구리 박막층에 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the bioreceptor in the unlabeled optical biosensor may be fixed to the copper thin film layer by physical adsorption or chemical bonding.
본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 비표지 광학 바이오센서를 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법에 관한 것이다.In still another aspect, the present invention relates to a method for measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial, wherein the unlabeled optical biosensor is used.
본 발명에 따른 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법은 (a) 상기 비표지 광학 바이오센서와 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 입사광을 조사하고, 상기 입사광의 반사광에 대한 LSPR 광학밴드를 분석하여, 상기 바이오리셉터와 표적 바이오 물질의 상호작용을 검출 및 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.According to the present invention, a method of measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial comprises: (a) contacting a sample containing the target biomaterial or the candidate target biomaterial with the unlabeled optical biosensor; And (b) irradiating incident light and analyzing an LSPR optical band for the reflected light of the incident light to detect and quantify the interaction of the bioreceptor with the target biomaterial.
구체적으로, 상기 비표지 광학 바이오센서는 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩 표면에 바이오리셉터가 고정화된 부분으로 입사광을 수직방향으로 조사하고, 상기 입사광에 대해 바이오칩 표면에서 반사된 반사광의 LSPR 광학밴드를 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함하는 LSPR 광학특성 분석 시스템을 이용해서 측정한다. 또한, 상기 LSPR 광학밴드를 측정하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법이라면, 이에 국한되지 않고 사용할 수 있다.Specifically, the unlabeled optical biosensor irradiates incident light in a vertical direction to a portion where the bioreceptor is immobilized on a surface of a copper-deposited nanoparticle array biochip, and applies an LSPR optical band of reflected light reflected from the surface of the biochip to the incident light source. Measurements are taken using an LSPR optical characterization system, including detectors, spectrophotometers and computers. In addition, the method of measuring the LSPR optical band can be used as long as it is a method commonly used in the art, without being limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질은 항원, 항체, 리간드(ligand), RNA, DNA, PNA 및 합텐(hapten)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the target biomaterial or candidate target biomaterial may be selected from the group consisting of antigen, antibody, ligand, RNA, DNA, PNA and hapten.
상기 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 용액으로, 혈액, 타액, 오줌, 코피, 눈물, 배설물, 조직추출액 및 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.The sample containing the target biomaterial or the candidate target biomaterial is a solution containing the target biomaterial or the candidate target biomaterial, and is selected from the group consisting of blood, saliva, urine, nosebleed, tear, feces, tissue extract and culture solution. It may be characterized by, but not limited to.
본 발명에 따른 비표지 광학 바이오센서는 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 구리 박막층에 하나 이상의 바이오리셉터를 고정화하는 것이 가능하므로, 다중검체 검출용 비표지 광학 바이오센서로 응용하는 것이 가능하다.The unlabeled optical biosensor according to the present invention can be immobilized with one or more bioreceptors in a copper thin film layer of a copper-deposited nanoparticle array biochip, and thus can be applied as an unlabeled optical biosensor for detecting multiple samples.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의 해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1: 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 제작Example 1 Fabrication of Copper Evaporated Nanoparticle Array Biochips
슬라이드 유리기판(제1층) 표면(75㎜×25㎜×1㎜)에 진공 증착장치(신우엠에스티, 대한민국)를 이용하여 크롬과 금을 각각 진공증착하여 금속 박막층을 적층하였다. 구체적으로, 중간 금속 박막층으로 크롬은 5nm의 두께로 증착시키고, 금속 박막층으로 금의 두께는 40㎚로 제어 가능하였다. 다음에 금 박막층 표면에 1mM 4,4’-dithiodibutylic acid(DDA)를 이용해서 SAM막을 형성하였다. 다음에 금 박막층 표면에 400mM EDC를 첨가하고, 당 표면에 도입된 카르복실기의 활성화를 수행한 후, 3-aminopropyltriethoxysilane(-APTES)으로 표면 수식을 수행한 직경 100㎚의 실리카 나노입자를 금 박막층 표면에 공유결합을 이용하여 배열시켰다. 다음에 직경 100㎚의 실리카 나노입자가 배열된 나노입자 배열층 표면에 구리(copper) 박막(30㎚)을 진공증착하여, 도 1에 나타난 바와 같이, 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제조하였다.A metal thin film layer was deposited by vacuum depositing chromium and gold on a slide glass substrate (first layer) surface (75 mm × 25 mm × 1 mm) using a vacuum deposition apparatus (Shinwoo MST, Korea). Specifically, chromium was deposited to a thickness of 5 nm as the intermediate metal thin film layer, and the thickness of gold was controlled to 40 nm as the metal thin film layer. Next, a SAM film was formed on the surface of the gold thin film layer using 1
실시예 2: 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 LSPR 광학특성 분석 시스템을 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서의 구축Example 2 Construction of LSPR Optical Characteristics Based Unlabeled Optical Biosensor Combining Copper Evaporated Nanoparticle Array Biochip and LSPR Optical Characterization System
도 1은 상기와 같이 제조된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 LSPR 광학특성 분석 시스템을 결합하여 구성된 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센 서의 모식도를 나타낸 것이다. 상기 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 LSPR 광학특성 분석 시스템을 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서는 텅스텐-할로겐 광원(파장 360㎚∼2000㎚, Ocean Optics, Inc., 미국), 검출기(파장 300㎚∼1100㎚, Ocean Optics, Inc., 미국), 검출기로 검출된 광을 분광하는 분광광도계(파장 200㎚∼1100㎚, Ocean Optics, Inc., 미국)와 분광광도계에서 얻어진 결과를 처리하는 분광광도계 분석처리 프로그램(Ocean Optics, Inc., 미국)으로 구성된다. 이때, 상기 텅스텐-할로겐 광원과 검출기는 하나의 광원 프로브에 구비되어 있다. 상기 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서의 텅스텐-할로겐 광원으로부터 방출되는 입사광을 수직방향으로 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩 표면에 입사시킨 후, 반사되는 반사광을 검출기를 통해서 검출하고, 분광광도계를 거쳐 분광된 반사광을 분광광도계 분석처리 프로그램을 통하여 분석하여, 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 LSPR 광학밴드를 측정하였다.FIG. 1 shows a schematic diagram of an LSPR optical property-based unlabeled optical biosensor configured by combining the copper-deposited nanoparticle array biochip manufactured as described above and the LSPR optical property analysis system. LSPR optical properties-based unlabeled optical biosensors combining the copper-deposited nanoparticle array biochip and LSPR optical characterization system are tungsten-halogen light source (wavelength 360 nm to 2000 nm, Ocean Optics, Inc., USA), detector (wavelength 300 nm to 1100 nm, Ocean Optics, Inc., USA), spectrophotometer (wavelength 200 nm to 1100 nm, Ocean Optics, Inc., USA) and spectrophotometer for spectroscopy the light detected by the detector Spectrophotometer Analytical Processing Program (Ocean Optics, Inc., USA). In this case, the tungsten-halogen light source and the detector are provided in one light source probe. After the incident light emitted from the tungsten-halogen light source of the LSPR optical property-based unlabeled optical biosensor is incident on the surface of the copper-deposited nanoparticle array biochip in the vertical direction, the reflected reflected light is detected through a detector and then passed through a spectrophotometer. The spectroscopic reflected light was analyzed through a spectrophotometer analysis program, and the LSPR optical band of the copper-deposited nanoparticle array biochip was measured.
실시예 3: 구리 박막층의 두께에 따른 LSPR 광학밴드 특성 분석Example 3 Analysis of LSPR Optical Band Characteristics According to Thickness of Copper Thin Film Layer
실시예 1에서 제조된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩에서, 구리 박막층의 두께가 변화함에 따라 상기 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 LSPR 광학밴드의 특성 변화를 측정하였다.In the copper-deposited nanoparticle array biochip manufactured in Example 1, the change in the characteristics of the LSPR optical band of the copper-deposited nanoparticle array biochip was measured as the thickness of the copper thin film layer was changed.
실시예 1의 방법에 따라 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제조하되, 실시예 1의 구리 박막층을 진공증착할 때, 구리 박막층의 두께를 10nm, 20nm, 30nm, 40nm, 50nm, 60nm, 70nm, 80nm, 90nm 및 100nm가 되도록 제어하면서 구리 증 착형 나노입자 배열 바이오칩을 제작하였다. According to the method of Example 1 to prepare a copper-deposited nanoparticle array biochip, when vacuum depositing the copper thin film layer of Example 1, the thickness of the copper thin film layer 10nm, 20nm, 30nm, 40nm, 50nm, 60nm, 70nm, 80nm A copper-deposited nanoparticle array biochip was fabricated while controlling to be 90 nm and 100 nm.
구리 박막층의 두께와 흡광도 강도의 상관관계를 분석한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 구리 박막층의 두께가 증가할수록 LSPR 광학밴드 피크의 흡광도 강도가 증가하다가 30nm를 초과하면 다시 감소하게 되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 구리 박막층의 두께가 증가할수록 나노입자 사이의 거리가 감소하므로 LSPR 광학밴드 피크의 흡광도 강도가 감소하는 것에 기인하는 것이다. 결국, 구리 박막층의 두께가 30nm일 때 가장 높은 흡광도 피크가 나타난다는 것을 알 수 있었다.As a result of analyzing the correlation between the thickness of the copper thin film layer and the absorbance intensity, as shown in FIG. 2, the absorbance intensity of the LSPR optical band peak increases as the thickness of the copper thin film layer increases, and then decreases again when it exceeds 30 nm. there was. This result is due to the decrease in absorbance intensity of LSPR optical band peak because the distance between nanoparticles decreases as the thickness of the copper thin film layer increases. As a result, it was found that the highest absorbance peak appears when the thickness of the copper thin film layer is 30 nm.
실시예 4: 프로브 DNA의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩 표면에의 고정Example 4 Immobilization of Probe DNA on Copper-Deposited Nanoparticle Array Biochip Surfaces
(-mer)Length
(-mer)
표 1에서 서열번호 1-4는 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩 표면에 부착시킬 프로브 DNA이고, 서열번호 5-8은 각각의 프로브 DNA 와 상보적인 결합을 하는 타겟 DNA이다. 각각의 프로브 DNA는 바이오센서의 리셉터로서 구리 박막층 표면에 고정화하기 위해서 3’-말단에 티올기가 부착되도록 제작하였다. 티올기가 부착된 각각의 프로브 DNA는 disulfide bond를 환원시키기 위해 1M dithiothreitol (DTT) 용액에 처리한 후, NAP-5 컬럼(GE healthcare Co.) 으로 정제하였다.In Table 1, SEQ ID NO: 1-4 is the probe DNA to be attached to the surface of the copper-deposited nanoparticle array biochip, SEQ ID NO: 5-8 is the target DNA is complementary to each probe DNA. Each probe DNA was prepared to attach a thiol group at the 3'-end to be immobilized on the surface of the copper thin film layer as a receptor of the biosensor. Each probe DNA attached with a thiol group was treated with 1M dithiothreitol (DTT) solution to reduce disulfide bonds, and then purified by NAP-5 column (GE healthcare Co.).
실시예 5: 프로브 DNA의 농도에 따른 바이오칩의 기능성 검사Example 5: Functional test of biochip according to the concentration of probe DNA
실시예 2에서 제작된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Sau001-20 프로브 DNA의 농도에 따른 바이오칩의 기능성 검사를 실시하였다.Functional testing of the biochip according to the concentration of Sau001-20 probe DNA was performed using a non-labeled optical biosensor based on LSPR optical properties combined with the copper-deposited nanoparticle array biochip manufactured in Example 2.
Sau001-20 프로브 DNA의 길이는 20mer를 사용하였으며, 3차증류수(DDW) 버퍼를 이용하여 100nM, 1μM, 5μM, 10μM, 15μM 및 20μM의 농도로 조절한 후, 55%이상의 습도가 유지되는 조건에서 6시간 이상 반응시켜 프로브 DNA의 고정화를 유도하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, LSPR 광학밴드 피크의 wavelength shift 정도는 Sau001-20 프로브 DNA 의 농도가 10μM 이상에서 포화상태에 이르렀다. 따라서, 다음 단계의 실험에서는 10μM 이상의 농도를 가지는 프로브 DNA를 이용하여 수행하였다.The length of Sau001-20 probe DNA was 20mer, and it was adjusted to concentration of 100nM, 1μM, 5μM, 10μM, 15μM and 20μM using tertiary distilled water (DDW) buffer, and the humidity was maintained at 55% or higher. The reaction was carried out for 6 hours or more to induce the immobilization of the probe DNA. As a result, as shown in Figure 3, the wavelength shift degree of the LSPR optical band peak reached saturation when the concentration of Sau001-20 probe DNA was 10 μM or more. Therefore, the experiment of the next step was performed using probe DNA having a concentration of 10μM or more.
실시예 6: 프로브 DNA의 고정화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성 검사Example 6: Functional test of biochip according to immobilization reaction time of probe DNA
실시예 2에서 제작된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20의 각 프로브 DNA의 고정화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성 검사를 실시하였다.Immobilization Reaction Time of Each Probe DNA of Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 Using LSPR Optical Characteristic Unlabeled Optical Biosensor Combined with Copper Evaporated Nanoparticle Array Biochip Fabricated in Example 2 The functional test of the biochip was carried out.
각 프로브 DNA의 길이는 20mer를 사용하였으며, 10μM의 농도로 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 및 6시간동안 반응시켜 칩상의 프로브 DNA의 고정화를 유도하였다. 이 때 습도는 55% 이상이 되도록 유지시켰다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, LSPR 광학밴드 피크의 wavelength shift 정도는 4개의 프로브 DNA 모두 4시간 이후에 포화상태에 이르렀다. 따라서, 다음 단계의 실험에서는 10μM 이상의 농도를 가지는 프로브 DNA를 4시간 동안 반응시켜 칩상에 각 프로브 DNA의 고정화를 수행하였다.The length of each probe DNA was 20mer, and the immobilization of the probe DNA on the chip was induced by reacting at a concentration of 10 μM for 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, and 6 hours. At this time, the humidity was maintained at 55% or more. As a result, as shown in FIG. 4, the wavelength shift of the LSPR optical band peak reached saturation after 4 hours for all four probe DNAs. Therefore, in the experiment of the next step, the probe DNA having a concentration of 10 μM or more was reacted for 4 hours to fix each probe DNA on the chip.
실시예 6: 프로브 DNA의 고정화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성 검사Example 6: Functional test of biochip according to immobilization reaction time of probe DNA
실시예 2에서 제작된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20의 각 프로브 DNA의 고정화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성 검사를 실시하였다.Immobilization Reaction Time of Each Probe DNA of Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 Using LSPR Optical Characteristic Unlabeled Optical Biosensor Combined with Copper Evaporated Nanoparticle Array Biochip Fabricated in Example 2 The functional test of the biochip was carried out.
각 프로브 DNA의 길이는 20mer를 사용하였으며, 10μM의 농도로 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간 및 6시간동안 반응시켜 칩상의 프로브 DNA의 고정화를 유도하였다. 이 때 습도는 55% 이상이 되도록 유지시켰다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, LSPR 광학밴드 피크의 wavelength shift 정도는 4개의 프로브 DNA 모두 4시간 이후에 포화상태에 이르렀다. 따라서, 다음 단계의 실험에서는 10μM 이상의 농도를 가지는 프로브 DNA를 4시간 동안 반응시켜 칩상에 각 프로브 DNA의 고정화를 수행하였다.The length of each probe DNA was 20mer, and the immobilization of the probe DNA on the chip was induced by reacting at a concentration of 10 μM for 1 hour, 2 hours, 3 hours, 4 hours, 5 hours, and 6 hours. At this time, the humidity was maintained at 55% or more. As a result, as shown in FIG. 4, the wavelength shift of the LSPR optical band peak reached saturation after 4 hours for all four probe DNAs. Therefore, in the experiment of the next step, the probe DNA having a concentration of 10 μM or more was reacted for 4 hours to fix each probe DNA on the chip.
실시예 7: 타겟 DNA의 혼성화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성 검사Example 7: Functional test of biochip according to hybridization time of target DNA
실시예 2에서 제작된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20 프로브 DNA와 각각 상보적으로 결합하는 T3, T4, T5 및 T6 의 각 타겟 DNA와의 혼성화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성 검사를 실시하였다.Complementary binding to Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 probe DNA, respectively, using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with copper-deposited nanoparticle array biochip fabricated in Example 2 The functional test of the biochip according to the hybridization reaction time with each target DNA of T3, T4, T5 and T6 was performed.
각 프로브 DNA의 길이는 20mer를 사용하였으며, 10μM의 농도로 4시간 동안 반응시켜 각 프로브 DNA를 바이오칩 표면에 고정화하였다. 이 때 습도는 55% 이상이 되도록 유지시켰다. 다음으로 각각의 프로브 DNA와 상보적으로 결합하는 각 타겟 DNA의 길이는 35mer였으며, 1μM의 농도로 30분, 1시간, 2시간, 3시간 및 4시간동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, LSPR 광학밴드 피크의 wavelength shift 정도는 각각의 프로브 DNA와 상보적인 결합을 하는 타겟 DNA가 1시간이상 반응할 때 포화상태에 이르렀다. 따라서, 다음 단계의 실험에서는 각 프로브 DNA와 각 타겟 DNA의 혼성화 반응을 1시간 동안 수행하였다.The length of each probe DNA was 20mer, and each probe DNA was immobilized on the surface of the biochip by reacting for 4 hours at a concentration of 10 μM. At this time, the humidity was maintained at 55% or more. Next, the length of each target DNA complementarily binding to each probe DNA was 35mer, and the reaction was induced for 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 3 hours and 4 hours at a concentration of 1 μM to induce complementary binding. As a result, as shown in Fig. 5, the wavelength shift degree of the LSPR optical band peak reached saturation when the target DNAs complementary to each probe DNA reacted for 1 hour or more. Therefore, in the experiment of the next step, the hybridization reaction of each probe DNA and each target DNA was performed for 1 hour.
실시예 8: 타겟 DNA의 농도에 따른 핵산칩의 감도 검사Example 8: Sensitivity test of nucleic acid chip according to concentration of target DNA
실시예 7과 마찬가지로 실시예 2에 의해 제작된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20 프로브 DNA와 각각 상보적으로 결합하는 T3, T4, T5 및 T6 타겟 DNA의 농도에 따른 바이오칩의 검출 효율을 측정하였다. Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 probe DNA using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with copper-deposited nanoparticle array biochip fabricated by Example 2 as in Example 7 The detection efficiency of the biochip was measured according to the concentrations of T3, T4, T5, and T6 target DNAs that complementarily bind to each other.
핵산칩 감도 검사는 1fM∼1μM 의 타겟 DNA 농도 범위에서 수행되었다. 각 프로브 DNA는 20mer를 사용하였으며, 10μM의 농도로 4시간 동안 반응시켜 각 프로브 DNA를 바이오칩 표면에 고정화하였다. 이 때 습도는 55% 이상이 되도록 유지시켰다. 다음으로 각각의 프로브 DNA와 상보적으로 결합하는 각 타겟 DNA의 길이는 35mer였으며, 1시간 동안 반응시켜 상보적인 결합을 유도하였다. 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 제시한 핵산칩은 4종류의 타겟 DNA를 모두 100fM 의 매우 낮은 농도까지 고감도로 분석할 수 있음을 확인할 수 있었고, 100fM∼1μM의 범위내에서는 타겟 DNA 농도와 LSPR 광학밴드 피크의 wavelength shift 정도가 직선 관계를 나타내었다. 이 결과로 미루어 보아, 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서는 매우 낮은 농도의 타겟 DNA를 정량 분석할 수 있음을 알 수 있다. Nucleic acid chip sensitivity test was carried out in the target DNA concentration range of 1fM ~ 1μM. Each probe DNA was used for 20mer, and each probe DNA was immobilized on the surface of the biochip by reacting at a concentration of 10 μM for 4 hours. At this time, the humidity was maintained at 55% or more. Next, the length of each target DNA that complementarily binds to each probe DNA was 35mer, and reacted for 1 hour to induce complementary binding. As a result, as shown in Figure 6, the nucleic acid chip proposed in the present invention can be confirmed that all four kinds of target DNA can be analyzed with high sensitivity to a very low concentration of 100fM, the target within the range of 100fM ~ 1μM DNA concentration and wavelength shift of LSPR optical band peak showed a linear relationship. As a result, it can be seen that the LSPR optical properties-based unlabeled optical biosensor combined with the copper-deposited nanoparticle array biochip of the present invention can quantitatively analyze a very low concentration of target DNA.
실시예 9: 바이오칩의 타겟 DNA 염기서열의 선택적인 결합정도 검사Example 9: Selective binding test of target DNA sequence of biochip
각 프로브 DNA와 각 타겟 DNA간의 상보적 결합과 비상보적 결합을 선별적으로 검출할 수 있는 효율적인 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제조하기 위하여, 실시예 7 및 실시예 8과 동일하게, 실시예 2에 의해 제작된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20 프로브 DNA와 각각 상보적으로 결합하는 T3, T4, T5 및 T6의 각 타겟 DNA에 대한 바이오칩의 선택성 검출 효율을 측정하였다. Example 2 In the same manner as in Example 7 and Example 8 to prepare an efficient copper-deposited nanoparticle array biochip capable of selectively detecting complementary and non-complementary binding between each probe DNA and each target DNA. T3 which complementarily binds to Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 probe DNA using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with copper-deposited nanoparticle array biochip fabricated by Selectivity detection efficiency of the biochip for each target DNA of T4, T5 and T6 was measured.
각 프로브 DNA는 20mer를 사용하였으며, 10μM의 농도로 4시간 동안 반응시켜 각 프로브 DNA를 바이오칩 표면에 고정화하였다. 이 때 습도는 55% 이상이 되도록 유지시켰다. 다음으로 각각의 프로브 DNA와 상보적으로 결합하는 각 타겟 DNA의 길이는 35mer였으며, 1시간 동안 반응시켜 상보적으로 결합하는 각 타겟 DNA와 비상보적으로 결합하는 각 타겟 DNA의 특이적인 결합을 측정하였다. 각 타겟 DNA의 농도는 1μM로 하였다. Each probe DNA was used for 20mer, and each probe DNA was immobilized on the surface of the biochip by reacting at a concentration of 10 μM for 4 hours. At this time, the humidity was maintained at 55% or more. Next, the length of each target DNA that complementarily binds to each probe DNA was 35mer, and the specific binding of each target DNA that binds non-complementarily with each target DNA that reacted for 1 hour was measured. . The concentration of each target DNA was 1 μM.
구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20 프로브 DNA와 각각 상보적으로 결합하는 T3, T4, T5 및 T6의 각 타겟 DNA에 대한 바이오칩의 선택성 검출 효율을 측정하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 모든 타겟 DNA에 대해서 상보적인 각 타겟 DNA와 비상보적인 각 타겟 DNA가 선별적으로 검출 가능하였다. 따라서 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩은 하나의 바이오칩으로 다중검출 및 타겟 DNA 염기서열의 선택적 결합이 가능하다는 것이 확인되었다.T3, T4, and T5 complementarily bind to Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20, and Vvul02-20 probe DNA using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with copper-deposited nanoparticle array biochips And the selectivity detection efficiency of the biochip for each target DNA of T6. As a result, as shown in Fig. 7, each target DNA complementary to each target DNA and each target DNA complementary to each other were selectively detectable. Therefore, it was confirmed that the copper-deposited nanoparticle array biochip of the present invention is capable of multiple detection and selective binding of target DNA sequences with one biochip.
이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it will be apparent to those of ordinary skill in the art that such a specific description is merely a preferred embodiment, thereby not limiting the scope of the present invention. will be. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
도 1은 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩 및 LSPR 광학특성 분석 시스템의 일례를 나타낸 개략도이다. 1 is a schematic view showing an example of the copper-deposited nanoparticle array biochip and LSPR optical characterization system of the present invention.
도 2는 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩에서, 구리 박막층의 두께가 변화함에 따라 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 LSPR 광학밴드의 특성 변화를 측정한 결과이다.2 is a result of measuring the change in the characteristics of the LSPR optical band of the copper-deposited nanoparticle array biochip as the thickness of the copper thin film layer in the copper-deposited nanoparticle array biochip of the present invention.
도 3은 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Sau001-20 프로브 DNA의 농도에 따른 바이오칩의 기능성을 검사한 결과이다.Figure 3 is a result of testing the functionality of the biochip according to the concentration of Sau001-20 probe DNA using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with the copper-deposited nanoparticle array biochip of the present invention.
도 4는 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20의 각 프로브 DNA의 고정화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성을 검사한 결과이다.4 shows the immobilization reaction time of each probe DNA of Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with copper-deposited nanoparticle array biochip of the present invention. According to the results of testing the functionality of the biochip.
도 5는 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20 프로브 DNA와 각각 상보적으로 결합하는 T3, T4, T5 및 T6의 각 타겟 DNA와의 혼성화 반응 시간에 따른 바이오칩의 기능성을 검사한 결과이다.Figure 5 is complementary binding to Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 probe DNA, respectively, using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with copper-deposited nanoparticle array biochip of the present invention. It is a result of testing the functionality of the biochip according to the hybridization reaction time with each target DNA of T3, T4, T5 and T6.
도 6은 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩과 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20 프로브 DNA와 각각 상보적으로 결합하는 각 타겟 DNA T3, T4, T5 및 T6의 농도에 따른 바이오칩의 검출 효율을 측정한 결과이다.Figure 6 is complementary binding to Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 probe DNA, respectively, using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensor combined with copper-deposited nanoparticle array biochip of the present invention. The detection efficiency of the biochip according to the concentration of each target DNA T3, T4, T5 and T6 is measured.
도 7은 본 발명의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 결합한 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서를 이용하여 Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 및 Vvul02-20 프로브 DNA와 각각 상보적으로 결합하는 T3, T4, T5 및 T6의 각 타겟 DNA에 대한 바이오칩의 선택적 결합정도의 효율성을 측정한 결과이다.7 is complementary binding to Efm003-20, Sau001-20, Smal03-20 and Vvul02-20 probe DNA, respectively, using LSPR optical properties based unlabeled optical biosensors incorporating copper-deposited nanoparticle array biochips of the present invention. It is the result of measuring the efficiency of the selective binding degree of the biochip to each target DNA of T3, T4, T5 and T6.
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