KR101243379B1

KR101243379B1 - Multi-spot Copper-Capped Nanostructure Array Biochip Using Copper Binding Peptide and Preparing Method Thereof

Info

Publication number: KR101243379B1
Application number: KR20100095612A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박태정; 김도균
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2013-03-13
Also published as: KR20120033875A

Abstract

본 발명은 구리 결합펩타이드 (copper binding peptide, CBP)를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 (multi-spot) 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기판 상에 형성된 금속 박막층, 상기 금속 박막층 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시킨 나노구조체 배열층, 상기 나노구조체 배열층 상에 형성된 구리 박막층을 포함하는 새로운 형태의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩; 상기 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 하나 이상의 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 구리층 표면에 고정되어 있어 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질과의 상호작용을 검출 및 정량화할 수 있는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은, 상기 바이오칩에 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함한 광학특성 분석 시스템을 결합함으로써, DNA, 단백질 등의 다양한 바이오 물질의 상호작용을 고감도로 검출할 수 있는 비표지 광학 바이오센서로의 응용이 가능하며, 온-사이트 모니터링에도 적용 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 탐침단백질을 고정함으로써 칩 제작공정이 단순화되고 복잡한 탐침단백질 정제공정이 필요 없게 되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다. The present invention relates to a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip in which a probe protein is immobilized using a copper binding peptide (CBP), and more particularly, to a substrate. A metal thin film layer including a formed thin metal layer, a multi-spot formed on the metal thin film layer, a nano-structure array layer having nanostructures arranged at regular intervals on each spot surface of the multi-spot, and a copper thin film layer formed on the nano-structure array layer Multi-spot copper-deposited nanostructure array biochips; A fusion protein combined with one or more CBP and probe protein on the surface of the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip is fixed on the surface of the copper layer to detect and quantify the interaction with the target biomaterial or the candidate target biomaterial. The present invention relates to a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip fixed with a probe protein using CBP.
The multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having the probe protein fixed using the CBP according to the present invention may be combined with an optical characterization system including a light source, a detector, a spectrophotometer, and a computer, such as DNA, protein, and the like. It can be applied as an unlabeled optical biosensor that can detect the interaction of various biomaterials with high sensitivity, and can also be applied to on-site monitoring. In addition, the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having the CBP-fixed probe protein according to the present invention can be fixed by selectively fixing the probe protein without chemical surface treatment process, thereby simplifying the chip fabrication process and the complex probe protein purification process. This eliminates the need for significant improvements in productivity and economics.

Description

구리 결합펩타이드를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 이의 제조방법 {Multi-spot Copper-Capped Nanostructure Array Biochip Using Copper Binding Peptide and Preparing Method Thereof}Multi-spot Copper-Capped Nanostructure Array Biochip Using Copper Binding Peptide and Preparing Method Thereof}

본 발명은 구리 결합펩타이드 (copper binding peptide, CBP)를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 (multi-spot) 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기판 상에 형성된 금속 박막층, 상기 금속 박막층 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시킨 나노구조체 배열층, 상기 나노구조체 배열층 상에 형성된 구리 박막층을 포함하는 새로운 형태의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩; 상기 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 하나 이상의 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 구리층 표면에 고정되어 있어 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질과의 상호작용을 검출 및 정량화할 수 있는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩에 관한 것이다.
The present invention relates to a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip in which a probe protein is immobilized using a copper binding peptide (CBP), and more particularly, to a substrate. A metal thin film layer including a formed thin metal layer, a multi-spot formed on the metal thin film layer, a nano-structure array layer having nanostructures arranged at regular intervals on each spot surface of the multi-spot, and a copper thin film layer formed on the nano-structure array layer Multi-spot copper-deposited nanostructure array biochips; A fusion protein combined with one or more CBP and probe protein on the surface of the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip is fixed on the surface of the copper layer to detect and quantify the interaction with the target biomaterial or the candidate target biomaterial. The present invention relates to a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip fixed with a probe protein using CBP.

지금까지 개발된 금속 나노구조체 배열 바이오칩에 적용된 금속 나노구조체는 주로 금이나 은과 같은 귀금속이 이용되었으며, 나노구조체의 합성 및 형태 제어가 가능하며 바이오물질을 쉽게 고정시킬 수 있다는 장점이 있지만, 금이나 은과 같은 금속 나노구조체는 산업적으로 적용하기에는 비싼 재료에 속한다. 이에 비해, 구리 금속 나노구조체는 나노구조체의 합성 및 형태 제어가 어렵다는 단점이 있지만 값이 싸고, 높은 전도도를 가진다는 장점이 있으며, 기존의 금속 나노구조체 뿐만 아니라 절연성 나노구조체(core)의 표면에 구리 금속(shell)을 코팅하는 core-shell 방식으로 구리 나노구조체를 제작할 수 있어 금과 은과 같은 귀금속 나노구조체를 대체할 수 있을 것으로 생각되며, 구리 나노구조체를 이용한 구리 나노구조체 배열칩에 관한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.Metal nanostructure arrays developed to date The metal nanostructures applied to biochips mainly use precious metals such as gold and silver, and have the advantage of being able to synthesize and control nanostructures and easily fix biomaterials. Metal nanostructures such as silver are expensive materials for industrial applications. On the other hand, copper metal nanostructures have the disadvantage of difficult synthesis and shape control of nanostructures, but they are inexpensive and have high conductivity, and have advantages on the surface of insulating nanocores as well as conventional metal nanostructures. It is thought that copper nanostructures can be manufactured by core-shell method of coating metal (shell), so that it is possible to replace noble metal nanostructures such as gold and silver, and research on copper nanostructure array chip using copper nanostructures It's going on steadily.

프랑스 파리VI대학의 Pileni 그룹(M.-P. Pileni et . al ., J. Phys . Chem . B, 110:7208, 2006)은 구리이온의 화학적 환원법을 이용하여 다양한 형태의 구리 나노크리스탈 (Nanocrystal)을 개발하였으며, 나노디스크 제작에 응용하였다. 미국 라이스대학의 Halas 그룹(N.J. Halas et . al ., J. Phys . Chem. B, 109:18218, 2005)은 비전착성(electroless) 도금을 위하여 우선 실리카 나노구조체의 표면에 화학결합 방법으로 구형 금 나노입자를 고정시킨 후, 비전착성 구리 도금 방법을 이용하여 구리 금속을 나노입자 표면에 코팅하여 구형 구리 나노입자를 개발하였다. 일본 큐슈대학의 Yamada 그룹(S. Yamada et . al ., Chemistry Letters, 38:326, 2009)은 이온화된 기판에 구형 금 나노입자를 고정시킨 후, 프탈로시아닌 구리 복합체(CuPc)를 스핀코팅(spin-coating) 방법으로 코팅하여 구형 구리 나노입자 배열칩을 완성하였다. 미국 노스웨스턴대 van Duyne 그룹(R.P. van Duyne et . al., Nano Letters, 7:1947, 2007)은 나노구조체 리소그래피 방법을 이용하여 기판 위에 삼각형 형태의 구리 나노구조체 배열칩을 제작하였다. 우선 기판 표면을 친수성 처리한 후, 폴리스틸렌 나노입자를 떨어뜨려 2차원 배열시켰다. 이 후 E-beam 증착기를 이용하여 구리 금속을 증착한 후, 메탄올 용액에 침전시켜 초음파 처리를 통해 폴리스틸렌 나노입자를 제거하여 삼각형 형태의 구리 나노구조체 배열칩을 완성하였다. 하지만 이런 형태의 구리 나노구조체 배열칩들은 구리 나노구조체의 제작공정의 복잡화, 제작기간의 장기화, 여러 가지 크기의 구리 나노구조체 제작의 어려움, 그리고 나노구조체의 불규칙적인 고정에 의한 재현성 확립의 어려움 등의 문제점을 가지고 있으며, 실제적으로 구리 나노구조체 배열칩이 바이오칩으로 응용된 예가 현재까지 전무한 실정이다.The Pileni group (M.-P. Pileni et . Al . , J. Phys . Chem . B , 110: 7208, 2006) at the University of Paris-Paris, France, uses a chemical reduction method of copper ions to form copper nanocrystals of various types. ), And applied to the production of nanodisks. The Halas Group of Rice University (NJ Halas et . Al . , J. Phys . Chem. B , 109: 18218, 2005) first described spherical gold on the surface of silica nanostructures by electrochemical bonding for electroless plating. After fixing the nanoparticles, a spherical copper nanoparticle was developed by coating a copper metal on the surface of the nanoparticle using a non-electrodepositable copper plating method. Yamada group at Kyushu University in Japan (S. Yamada et. Al., Chemistry Letters , 38: 326, 2009) fixed spherical gold nanoparticles on an ionized substrate, and then coated the phthalocyanine copper complex (CuPc) by spin-coating to complete the spherical copper nanoparticle array chip. Northwestern vs. van Duyne Group (RP van Duyne et. Al. , Nano Letters , 7: 1947, 2007) fabricated triangular copper nanostructure array chips on substrates using nanostructure lithography. First, the surface of the substrate was hydrophilized, and then polystyrene nanoparticles were dropped and two-dimensionally arranged. Thereafter, copper metal was deposited using an E-beam evaporator, and then precipitated in a methanol solution to remove polystyrene nanoparticles by ultrasonication, thereby completing a triangular copper nanostructure array chip. However, these types of copper nanostructure array chips have complicated manufacturing processes of copper nanostructures, prolonged production periods, difficulty in fabricating copper nanostructures of various sizes, and difficulty in establishing reproducibility by irregular fixing of nanostructures. There is a problem, and there are practically no examples where copper nanostructure array chips are applied as biochips.

본 발명자들은 LSPR 광학특성을 이용하여 다중검체 바이오물질을 하나의 칩으로 동시에 검출할 수 있는 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 제작하였다(대한민국 특허출원 제10-2009-00099702호). 본 발명자들에 의해 개발된 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩은 DNA을 포함하여, RNA, 펩타이드, 단백질 등의 다양한 바이오물질의 상호작용을 검출할 수 있는 LSPR 광학특성 기반 비표지 광학 바이오센서로 응용가능하다는 장점을 가지고 있다. 한편, 탐침단백질을 바이오칩 표면에 고정시키기 위한 칩 표면의 화학적 처리 방법이 복잡하고, 이는 비특이적인 표적 바이오물질과 결합하기도 하고, 탐침단백질과의 결합력이 약할 뿐만 아니라 많은 화학물질에 영향을 받을 수 있기 때문에 다양한 탐침단백질-표적 바이오물질 간의 상호작용을 검출 및 정량화 하는데 제한이 있었으며, 탐침단백질을 바이오칩 표면에 고정하기 위해서는 높은 순도가 요구되어 복잡한 정제공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 면이 있었다. The inventors have fabricated a copper-deposited nanoparticle array biochip capable of simultaneously detecting multiple sample biomaterials with one chip using LSPR optical properties (Korean Patent Application No. 10-2009-00099702). The copper-deposited nanoparticle array biochip developed by the present inventors can be applied as a non-labeled optical biosensor based on LSPR optical properties that can detect interactions of various biomaterials such as RNA, peptides, proteins, including DNA. Has the advantage. On the other hand, the method of chemical treatment of the chip surface for fixing the probe protein on the surface of the biochip is complicated, which may bind to non-specific target biomaterials, and may not only be weakly bound to the probe protein, but also may be affected by many chemicals. Therefore, there was a limitation in detecting and quantifying the interaction between various probe protein-target biomaterials, and in order to fix the probe protein on the surface of the biochip, high purity was required and a complicated purification process was included.

한편, 구리에 선택적으로 결합하는 바이오물질로서 펩타이드 형태의 물질이 알려져 있다. 예를 들어, 치매를 유발하는 펩타이드와 프리온 단백질이 구리와 결합력이 강한 것으로 알려져 있으며(Ma, Q.F. et al., Biopolymers, 2005, 79:74, Ma, Q. et al., 2006, 27:841, Kawano, T., Int. J. Biol. Sci., 2007, 3: 57), 이러한 이론적 배경을 본 발명의 구리 증착형 바이오칩 표면에 선택적으로 결합하는 고정화 기능으로서 활용하고자 한다.On the other hand, peptide-type substances are known as biomaterials that selectively bind to copper. For example, dementia-inducing peptides and prion proteins are known to have strong binding to copper (Ma, QF et al., Biopolymers, 2005, 79:74, Ma, Q. et al., 2006, 27: 841 , Kawano, T., Int. J. Biol. Sci., 2007, 3: 57), this theoretical background is intended to be utilized as an immobilization function that selectively binds to the copper-deposited biochip surface of the present invention.

이에, 본 발명자들은 종래의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩의 문제점을 해소하고 특이적이고 안정적으로 탐침단백질을 고정할 수 있는, 경제적인 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제공하고자 예의 노력한 결과, 신규한 CBP를 분리하여 이와 탐침단백질을 융합한 융합단백질이 위치 특이적으로 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 상에 고정되는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제조하고, 또한 고정된 융합단백질이 표적 바이오물질과 특이적으로 결합하여 효율적으로 상호반응을 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
Accordingly, the present inventors have made diligent efforts to solve the problems of conventional copper-deposited nanoparticle array biochips and provide an economical copper-deposited nanostructure array biochip that can fix probe proteins in a specific and stable manner. To prepare a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip in which probe proteins are immobilized using CBP in which a fusion protein fused with a probe protein is immobilized on a copper-deposited nanostructure array biochip. The present invention was completed by confirming that the fusion protein can specifically bind to the target biomaterial and efficiently analyze the interaction.

본 발명의 목적은 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 이용하여 탐침단백질이 특이적이고 안정적으로 바이오칩 상에 고정되어 있는, 새로운 형태의 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.An object of the present invention is a multi-spot copper-deposited nanostructure, in which a probe protein is immobilized on a biochip by using a fusion protein combined with a CBP and a probe protein. An array biochip and a method of manufacturing the same are provided.

본 발명의 다른 목적은, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 및 광학특성 분석 시스템을 이용한 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질의 측정방법을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a method for measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial using a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip on which the probe protein is fixed using CBP and an optical characterization system.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 기판(제1층) 상에 금속 박막층(제2층)을 형성시키는 단계; (b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시켜 나노구조체 배열층(제3층)을 형성시키는 단계; (c) 상기 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 고정시키는 단계를 포함하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the steps of (a) forming a metal thin film layer (second layer) on the substrate (first layer); (b) forming a multi-spot on the metal thin film layer (second layer), and forming a nano-structure array layer (third layer) by arranging nanostructures at regular intervals on each spot surface of the multi-spot; (c) forming a copper thin film layer (fourth layer) on the nanostructure array layer (third layer); And (d) fixing the fusion protein to which the CBP and the probe protein are coupled on the copper thin film layer (fourth layer). Provide a method.

본 발명은 또한, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법을 제공한다.
The present invention also provides a method for measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial, using a copper-deposited nanostructure array biochip in which the probe protein is fixed using the CBP.

본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은, 기존의 구리 증착형 나노입자 배열 바이오칩을 이용한 LSPR 기반 광학 바이오칩이 가지는 장점을 동일하게 가지고 있을 뿐만 아니라, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩에 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함한 광학특성 분석 시스템을 결합함으로써, DNA, 단백질 등의 다양한 바이오 물질의 상호작용을 고감도로 검출할 수 있는 비표지 광학 바이오센서로의 응용이 가능하며, 온-사이트 모니터링에도 적용 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 탐침단백질을 고정함으로써 칩 제작공정이 단순화되고 복잡한 탐침단백질 정제공정이 필요 없게 되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.
The multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip in which the probe protein is fixed using the CBP according to the present invention has the same advantages as the LSPR-based optical biochip using the conventional copper-deposited nanoparticle array biochip. By combining the optical characterization system including a light source, a detector, a spectrophotometer, and a computer to a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip on which the probe protein is fixed using the CBP, interaction of various biomaterials such as DNA, protein, etc. It can be applied as an unlabeled optical biosensor which can detect with high sensitivity, and can be applied to on-site monitoring. In addition, the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having the CBP-fixed probe protein according to the present invention can be fixed by selectively fixing the probe protein without chemical surface treatment process, thereby simplifying the chip fabrication process and the complex probe protein purification process. This eliminates the need for significant improvements in productivity and economics.

도 1은 본 발명의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제작과정 및 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 일례를 나타낸 모식도이다.
도 2는 구리 결합단백질(CBP)과 탐침단백질을 융합 발현시키기 위한 발현카세트의 유전자지도로서, 플라스미드 pET-CBP2 cassette의 유전자 지도이다.
도 3은 구리 결합단백질(CBP)과 탐침단백질인 신종플루 표면항원의 융합단백질을 발현시키기 위한 유전자지도로서, 플라스미드 pET-CBP2-H1a의 유전자 지도이다.
도 4는 본 발명의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하여 CBP와 결합된 H1N1 항원(탐침단백질)의 농도에 따른 바이오칩의 기능성을 검사한 결과이다.
도 5는 본 발명의 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩과 광학특성 분석 시스템을 이용하여 H1N1 항원-항체 반응을 검출한 결과이다.
도 6은 본 발명의 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 H1N1 항체의 농도에 따른 검출 효율을 측정한 결과이다.1 is a schematic diagram showing an example of a manufacturing process of a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip of the present invention and an example of a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip on which a probe protein is fixed using CBP.
FIG. 2 is a genetic map of an expression cassette for fusion expression of copper binding protein (CBP) and probe protein, and is a genetic map of the plasmid pET-CBP2 cassette.
3 is a gene map for expressing a fusion protein of a copper binding protein (CBP) and a probe protein of swine flu surface antigen, which is a gene map of plasmid pET-CBP2-H1a.
Figure 4 is a result of testing the functionality of the biochip according to the concentration of H1N1 antigen (probe protein) coupled with CBP using the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip of the present invention.
5 is a result of detecting the H1N1 antigen-antibody reaction using the probe protein-fixed multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip and optical characterization system using the CBP of the present invention.
6 is a result of measuring the detection efficiency according to the concentration of the H1N1 antibody of the probe protein-fixed multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip using the CBP of the present invention.

본 발명은 일 관점에서, (a) 기판(제1층) 상에 금속 박막층(제2층)을 형성시키는 단계; (b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시켜 나노구조체 배열층(제3층)을 형성시키는 단계; (c) 상기 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 고정시키는 단계를 포함하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법에 관한 것이다.The present invention in one aspect, (a) forming a metal thin film layer (second layer) on the substrate (first layer); (b) forming a multi-spot on the metal thin film layer (second layer), and forming a nano-structure array layer (third layer) by arranging nanostructures at regular intervals on each spot surface of the multi-spot; (c) forming a copper thin film layer (fourth layer) on the nanostructure array layer (third layer); And (d) fixing the fusion protein to which the CBP and the probe protein are coupled on the copper thin film layer (fourth layer). It is about a method.

본 발명에 있어서, 상기 CBP는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드인 것을 특징으로 할 수 있다. In the present invention, the CBP may be characterized in that the peptide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.

본 발명에서는 R3 peptide와 프리온 펩타이드(prion proetein:PrP) 유래의 구리에 선택적으로 결합하는 펩타이드를 분리하였고, 각각 서열번호 1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며 CBP1, CBP2로 명명하였다.In the present invention, peptides that selectively bind to R3 peptide and prion peptide (prion proetein: PrP) -derived copper were isolated, respectively, represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and named CBP1, CBP2.

서열번호 1: H₂N - KTNMKHMAVNITKQHTVTTTT - COOH (CBP1)SEQ ID NO: 1 H ₂ N-KTNMKHMAVNITKQHTVTTTT-COOH (CBP1)

서열번호 2: H₂N - VQSKCGSKDNIKHVPGGG - COOH (CBP2)SEQ ID NO: H ₂ N-VQSKCGSKDNIKHVPGGG-COOH (CBP2)

본 발명에 있어서, 상기 기판 (제1층)은 유리, 폴리스틸렌, Polyethylene terephthalate(PET), 폴리카보네이트, 실리콘 및 석영으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기에 열거한 종류의 기판은 편광에 대해서 이방성을 나타내지 않고, 가공성이 우수한 효과가 있다. 특히, 상기 유리, 폴리스티렌, PET 및 폴리카보네이트는 백색광에 대해서 투명한 특성을 나타내는 재료이다. 기판의 표면이 색깔을 띠게 되면 입사한 백색광이 기판 표면으로부터 반사를 하게 되고, LSPR 특성과 같은 광학특성에 영향을 미치게 된다. 따라서 입사한 백색광이 반사하지 않고 투과하는 특성을 가진 투명한 기판을 사용하는 것이 바람직하다. In the present invention, the substrate (first layer) may be selected from the group consisting of glass, polystyrene, polyethylene terephthalate (PET), polycarbonate, silicon and quartz. The above-mentioned types of substrates do not exhibit anisotropy with respect to polarization, and have an excellent processability. In particular, the glass, polystyrene, PET and polycarbonate are materials exhibiting transparent properties to white light. When the surface of the substrate becomes colored, the incident white light is reflected from the surface of the substrate and affects optical properties such as LSPR characteristics. Therefore, it is preferable to use a transparent substrate having a property of transmitting white light without reflection.

본 발명에 있어서, 상기 기판 (제1층)의 두께는 0.1~20mm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 상기 각 기판에 대해 현재까지 제작되었거나 도입 가능한 기판 중에서 본 발명에 사용해도 무방한 최저 두께치와 최고 두께치를 나타내었다. In the present invention, the thickness of the substrate (first layer) may be characterized in that 0.1 ~ 20mm, which is the lowest thickness value that can be used in the present invention among the substrates produced or introduced so far for each of the substrates. And the maximum thickness value.

본 발명에 있어서, 상기 금속 박막층 (제2층)으로는 SAM(Self-assembly monolayer)막을 형성시켜 나노구조체를 고정할 수 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 사용 가능한 금속의 종류로서는 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni), 아연(Zn) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택하여 사용하는 것이 가능하다. In the present invention, the metal thin film layer (second layer) is not particularly limited as long as it can form a self-assembly monolayer (SAM) film to fix the nanostructure. For example, the types of metals that can be used include gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), aluminum (Al), platinum (Pt), nickel (Ni), zinc (Zn), and mixtures thereof. It is possible to select and use from the group.

본 발명에 있어서, 상기 나노구조체로는 LSPR 특성과 같은 광학특성에 영향을 미치지 않는 유전체로 이루어진 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 사용 가능한 나노구조체의 종류로서는 나노입자(nano-particle), 나노도트(nano-dot), 나노아일랜드(nano-island), 나노로드(nano-rod) 및 나노와이어(nano-wire) 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 유전체 나노구조체의 직경은 10-200nm인 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직한 것은 100nm이다. 유전체 나노구조체의 직경이 10nm 이하이면 LSPR 광학특성이 발생하지 않으며, 유전체 나노구조체의 직경이 200nm이상이면 플라즈몬 현상에 의해 여기되는 LSPR 광학특성의 측정이 불가능하다. 또한, 사용하는 나노구조체의 직경에 따라서 LSPR 광학밴드의 파장영역이 달라질 수 있다.In the present invention, the nanostructure is not particularly limited as long as it is made of a dielectric material that does not affect optical properties such as LSPR properties. For example, the types of nanostructures that can be used include nano-particles, nano-dots, nano-island, nano-rods, and nano-wires. It may be characterized in that it is selected from the group consisting of. The diameter of the dielectric nanostructures may be characterized in that 10-200nm, most preferably 100nm. If the diameter of the dielectric nanostructure is 10 nm or less, LSPR optical properties do not occur. If the diameter of the dielectric nanostructure is 200 nm or more, the measurement of LSPR optical properties excited by the plasmon phenomenon is impossible. In addition, the wavelength region of the LSPR optical band may vary depending on the diameter of the nanostructure to be used.

본 발명에 있어서, 상기 제3층의 나노구조체 배열층을 금속 박막층 (제2층)에 다중 스팟 형태로 형성시키기 위해서는 다공성 마스크를 이용하여 수행하는 것이 가능하다. 상기 다공성 마스크는 금속 박막층에 협착되어 마스크 표면에 형성된 다공 안으로만 나노구조체를 일정한 간격으로 배열되도록 하며, 금속 박막층 표면에 다중 스팟 형태를 형성시킨다. 본 발명에 있어서 사용 가능한 다공성 마스크는 고무평판, 실리콘평판 및 이들의 혼합물 등으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 다공성 마스크는 상기 평판의 표면에 펀칭기 등을 이용하여 다공을 형성시킴으로서 완성된다.In the present invention, in order to form the nanostructure array layer of the third layer in the form of multiple spots on the metal thin film layer (second layer), it is possible to perform using a porous mask. The porous mask is narrowed to the metal thin film layer so that the nanostructures are arranged at regular intervals only into the pores formed on the mask surface, and forms a multi-spot shape on the metal thin film layer surface. The porous mask usable in the present invention may be selected from the group consisting of rubber plates, silicon plates and mixtures thereof, and the porous mask is completed by forming pores on the surface of the plate using a punching machine or the like. do.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 다공성 마스크의 다공수는 1~300개인 것을 특징으로 할 수 있으며, 이는 상기 각 다공성 마스크에 대해 현재까지 제작되었거나 도입 가능한 다공성 마스크 중에서 본 발명에 사용해도 무방한 다공수의 최저치와 최고치를 나타내었다.In addition, in the present invention, the porous number of the porous mask may be characterized in that 1 to 300, which may be used in the present invention among the porous masks manufactured or introduced to date for each of the porous masks. The lowest and highest values are shown.

본 발명에 있어서, 상기 나노구조체 배열층 (제3층)을 금속 박막층 (제2층)에 일정한 간격으로 배열시키기 위해서, 상기 금속 박막층을 카르복실기로 개질하고, 나노구조체 표면을 아민기로 개질한 다음 공유결합시키는 것이 바람직하다. 상기 금속 박막층을 카르복실기로 개질하는 방법으로는 4,4’-dithiodibutylic acid(DDA)를 이용하여 카르복실기를 가지는 SAM막을 형성시키는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아울러, 상기 나노구조체 표면을 아민기로 개질하는 방법으로는 상기 나노구조체 표면을 3-aminopropyltriethoxy silan (γ-APTES)를 이용하여 아민기로 개질시키는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.In the present invention, in order to arrange the nanostructure array layer (third layer) on the metal thin film layer (second layer) at regular intervals, the metal thin film layer is modified with a carboxyl group, and the nanostructure surface is modified with an amine group and then shared. It is preferable to combine. As a method of modifying the metal thin film layer using a carboxyl group, a method of forming a SAM film having a carboxyl group using 4,4′-dithiodibutylic acid (DDA) may be used, but is not limited thereto. In addition, as a method of modifying the surface of the nanostructures with an amine group, a method of modifying the surface of the nanostructures with an amine group using 3-aminopropyltriethoxy silan (γ-APTES) may be used, but is not limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 금속 박막층 (제2층) 및 구리 박막층 (제4층)의 박막 형성은 스파터법, 증착법, 이온 플레이팅법, 전기도금법, 무전기도금법 등에 의해 수행하는 것이 가능하다. 금속 박막층 및 구리 박막층의 두께는 나노구조체 배열층 (제3층)의 나노구조체의 모양, 크기, 배열 상태에 따라 임의로 결정할 수 있다. 예를 들어, 100nm의 실리콘 구형 나노입자의 경우, 금속 박막층의 두께는 30nm∼50nm이며, 구리 박막층의 두께는 20nm∼40nm로 제작하는 것이 바람직하다.In the present invention, the thin film formation of the metal thin film layer (second layer) and the copper thin film layer (fourth layer) can be performed by the spatter method, the vapor deposition method, the ion plating method, the electroplating method, the electroless plating method, or the like. The thickness of the metal thin film layer and the copper thin film layer can be arbitrarily determined according to the shape, size, and arrangement state of the nanostructure of the nanostructure array layer (third layer). For example, in the case of 100 nm silicon spherical nanoparticles, the thickness of the metal thin film layer is 30 nm to 50 nm, and the thickness of the copper thin film layer is preferably 20 nm to 40 nm.

본 발명에 있어서, 상기 구리 박막층의 두께에 따라 LSPR 광학특성에 의해 발생하는 LSPR 광학밴드 피크의 흡광도 강도가 달라지는 특성을 나타낸다. 따라서, 구리 박막층의 두께에 따라 다양한 흡광도 영역에서 반응할 수 있는 새로운 형태의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제공할 수 있다.In the present invention, the absorbance intensity of the LSPR optical band peak generated by the LSPR optical characteristic is varied depending on the thickness of the copper thin film layer. Accordingly, it is possible to provide a novel multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip that can react in various absorbance regions depending on the thickness of the copper thin film layer.

본 발명에 있어서, 상기 구리 박막층 표면에 선택적으로 결합하는 구리결합단백질 (CBP)를 이용하여, 구리 박막층에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 고정된 형태의 바이오리셉터를 제공하는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 바이오칩을 제공할 수 있다.In the present invention, by using a copper binding protein (CBP) that selectively binds to the surface of the copper thin film layer, multi-spot copper deposition to provide a bioreceptor in which a fusion protein is fixed to the CBP and the probe protein is bonded to the copper thin film layer It is possible to provide a type nanostructure biochip.

본 발명은, 또 다른 관점에서, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법에 관한 것이다. In still another aspect, the present invention relates to a method for measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial, using a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip in which a probe protein using CBP is fixed.

본 발명에 따른 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법은 (a) 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩과 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 (b) 광학특성 분석 시스템을 이용하여 광학특성 변화를 분석하여, 상기 탐침단백질과 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 상호작용을 검출 및 정량하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.The method for measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial according to the present invention includes (a) a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip on which a probe protein is fixed using the CBP, and a target biomaterial or a candidate target biomaterial. Contacting the sample; And (b) analyzing the optical property change by using the optical property analysis system to detect and quantify the interaction of the probe protein with the target biomaterial or the candidate target biomaterial.

구체적으로, 상기 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 입사광을 수직방향으로 조사하고, 상기 입사광에 대해 바이오칩 표면에서 반사된 반사광의 국소 표면 플라즈몬 공명 (localized surface plasmon resonance, LSPR) 광학특성을 광원, 검출기, 분광광도계 및 컴퓨터를 포함하는 LSPR 광학특성 분석 시스템을 이용해서 측정한다. 또한, 상기 광학특성을 측정하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 방법이라면, 이에 국한되지 않고 사용할 수 있다.Specifically, the incident light is irradiated vertically on the surface of the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip on which the probe protein using CBP is fixed, and the localized surface plasmon resonance of the reflected light reflected from the surface of the biochip with respect to the incident light is localized. surface plasmon resonance (LSPR) optical properties are measured using an LSPR optical characterization system including a light source, a detector, a spectrophotometer and a computer. In addition, the method for measuring the optical properties can be used as long as it is a method commonly used in the art, without being limited thereto.

본 발명에 있어서, 상기 표적 바이오물질 또는 후보 표적바이오 물질은 탐침단백질과 상호작용이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 사용 가능한 표적 바이오물질 또는 후보 표적바이오 물질의 종류로서는 항원, 항체, 리간드(ligand), RNA, DNA, PNA 및 합텐(hapten)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, the target biomaterial or candidate target biomaterial is not particularly limited as long as it can interact with the probe protein. For example, the usable target biomaterial or candidate target biomaterial may be selected from the group consisting of antigen, antibody, ligand, RNA, DNA, PNA, and hapten.

상기 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료는 표적 바이오물질 또는 후보 표적 바이오물질을 포함하는 용액으로, 혈액, 타액, 오줌, 코피, 눈물, 배설물, 조직추출액 및 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다.The sample containing the target biomaterial or the candidate target biomaterial is a solution containing the target biomaterial or the candidate target biomaterial and is selected from the group consisting of blood, saliva, urine, nosebleed, tear, feces, tissue extract and culture solution. It may be characterized by, but not limited to.

본 발명에 따른 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 각각의 다중 스팟에 하나 이상의 탐침단백질을 고정화하는 것이 가능하므로, 다중검체 검출용 비표지 광학 바이오센서로 응용하는 것이 가능하다.
The multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having the probe protein fixed using the CBP according to the present invention is capable of immobilizing one or more probe proteins at each of the multiple spots, and thus is applied as an unlabeled optical biosensor for detecting multiple samples. It is possible to.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for illustrating the present invention and that the scope of the present invention is not construed as being limited by these embodiments.

다중 multiple 스팟Spot 구리 Copper 증착형Deposition 나노구조체 배열 바이오칩의 제작 Fabrication of Nanostructured Array Biochips

슬라이드 유리기판 (도 1(a)) 표면(75㎜×25㎜×1㎜)에 진공 증착장치(신우엠에스티, 대한민국)를 이용하여 크롬과 금을 각각 진공증착하여 금속 박막층을 적층하였다 (도 1(b)). 구체적으로, 중간 금속 박막층으로 크롬은 5nm의 두께로 증착시키고, 금속 박막층으로 금의 두께는 40㎚로 제어 가능하였다. 다음에 금 박막층 표면에 다공성 마스크를 흡착시킨 후, 각각의 다공성 안에 1mM 4,4’-dithiodibutylic acid(DDA)를 이용해서 SAM막을 형성하였다. 다음에 각각의 다공성 안에 400mM EDC를 첨가하고, 당 표면에 도입된 카르복실기의 활성화를 수행한 후, 3-aminopropyltriethoxysilane(γ-APTES)으로 표면 수식을 수행한 직경 100㎚의 실리카 나노구조체를 금 박막층 표면에 공유결합을 이용하여 배열시켰다 (도 1(c)). 다음에 직경 100㎚의 실리카 나노구조체가 배열된 나노구조체 배열층 표면에 구리 박막(30㎚)을 진공증착하여, 도 1(d)에 나타난 바와 같이, 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 제조하였다.
A metal thin film layer was deposited by vacuum depositing chromium and gold on a slide glass substrate (FIG. 1A) surface (75 mm × 25 mm × 1 mm) using a vacuum deposition apparatus (Shinwoo MST, Korea). 1 (b)). Specifically, chromium was deposited to a thickness of 5 nm as the intermediate metal thin film layer, and the thickness of gold was controlled to 40 nm as the metal thin film layer. Next, after adsorbing a porous mask on the surface of the gold thin film layer, a SAM film was formed using 1 mM 4,4'-dithiodibutylic acid (DDA) in each porosity. Next, 400mM EDC was added to each porosity, and after activation of the carboxyl groups introduced on the sugar surface, the surface of the gold thin film layer was coated with a silica nanostructure of 100 nm in diameter subjected to surface modification with 3-aminopropyltriethoxysilane (γ-APTES). It was arranged using a covalent bond (Fig. 1 (c)). Next, a thin copper film (30 nm) was vacuum-deposited on the surface of the nanostructure array layer on which the silica nanostructures having a diameter of 100 nm were arranged, thereby producing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip as shown in FIG. It was.

LSPRLSPR 광학특성 분석 시스템을 이용한 다중 Multiplex Using Optical Characteristic Analysis System 스팟Spot 구리 Copper 증착형Deposition 나노구조체 배열 바이오칩 표면의 Nanostructure array of biochip surface LSPRLSPR 광학특성 분석 Optical Characteristic Analysis

LSPR 광학특성 분석 시스템은 텅스텐-할로겐 광원(파장 360㎚∼2000㎚, Ocean Optics, Inc., 미국), 검출기(파장 300㎚∼1100㎚, Ocean Optics, Inc., 미국), 검출기로 검출된 광을 분광하는 분광광도계(파장 200㎚∼1100㎚, Ocean Optics, Inc., 미국)와 분광광도계에서 얻어진 결과를 처리하는 분광광도계 분석처리 프로그램(Ocean Optics, Inc., 미국)으로 구성된다. 이때, 상기 텅스텐-할로겐 광원과 검출기는 하나의 광원 프로브에 구비되어 있다. LSPR 광학특성 분석 시스템을 이용한 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 표면의 LSPR 광학특성 분석은 텅스텐-할로겐 광원으로부터 방출되는 입사광을 수직방향으로 바이오칩 표면에 입사시킨 후, 반사되는 반사광을 검출기를 통해서 검출하고, 분광광도계를 거쳐 분광된 반사광을 분광광도계 분석처리 프로그램을 통하여 분석하여, 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 LSPR 광학특성을 측정하였다.
LSPR optical characterization system includes tungsten-halogen light source (wavelength 360nm ~ 2000nm, Ocean Optics, Inc., USA), detector (wavelength 300nm ~ 1100nm, Ocean Optics, Inc., USA), light detected by detector Spectrophotometer (wavelength 200 nm to 1100 nm, Ocean Optics, Inc., USA) for spectroscopy and spectrophotometer analysis program (Ocean Optics, Inc., USA) for processing the results obtained from the spectrophotometer. In this case, the tungsten-halogen light source and the detector are provided in one light source probe. LSPR optical characterization of multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip surface using LSPR optical characterization system allows incident light emitted from tungsten-halogen light source to enter the biochip surface in the vertical direction, and then reflects reflected light through a detector In addition, the reflected light spectroscopically through the spectrophotometer was analyzed through a spectrophotometer analysis program, and the LSPR optical characteristics of the copper-deposited nanostructure array biochip were measured.

구리 Copper 결합펩타이드Binding peptide CBPCBP (( coppercopper bindingbinding peptidepeptide )의 분리)

알츠하이머를 발생시키는 것으로 알려져 있는 tau protein (Ma, Q.F. et al., Biopolymers, 2005, 79:74), R3 peptide (Ma, Q. et al., 2006, 27:841), 그리고 프리온(prion protein; PrP)에 기반에 구리결합펩타이드의 절편(Kawano, T., Int. J. Biol. Sci., 2007, 3: 57)의 경우 copper binding 특성이 있는 것으로 알려져 있다. 이 중 본 발명에서는 R3 peptide(서열번호 1)과 PrP 기반 펩타이드의 절편(서열번호 2)을 이용하여 구리기판 위에 결합시키는 방법을 도입하고자 하였다. 그리고 이들로부터 유래되는 단백질을 각각 CBP1(서열번호 1)과 CBP2(서열번호 2)로 명명하였으며 이들을 구리 결합단백질로 하고 바이오센서로 응용이 가능한 형태의 단백질과 융합하여 응용하고자 하였다. Tau proteins (Ma, QF et al., Biopolymers, 2005, 79:74), R3 peptides (Ma, Q. et al., 2006, 27: 841), which are known to generate Alzheimer's, and prion proteins; PrP) -based fragments of copper binding peptides (Kawano, T., Int. J. Biol. Sci., 2007, 3: 57) are known to have copper binding properties. Among them, the present invention intends to introduce a method of binding on a copper substrate using fragments of R3 peptide (SEQ ID NO: 1) and PrP-based peptide (SEQ ID NO: 2). The proteins derived from them were named as CBP1 (SEQ ID NO: 1) and CBP2 (SEQ ID NO: 2), respectively, and they were intended to be applied by fusion with proteins of a form that can be applied as a copper-binding protein and applicable as a biosensor.

서열번호 2: H₂N - VQSKCGSKDNIKHVPGGG - COOH (CBP2)
SEQ ID NO: H ₂ N-VQSKCGSKDNIKHVPGGG-COOH (CBP2)

CBPCBP 와 Wow 탐침단백질의Probe protein 융합단백질을The fusion protein 코딩하는 유전자의 Of the gene that encodes 클로닝Cloning

실시예 3에서 분리한 신규 구리 결합단백질인 CBP2 (서열번호 2)와 탐침단백질을 융합발현시키기 위한 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 주형 DNA 없이 서열번호 3 및 4의 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행하여 CBP2의 유전자 산물을 수득하였다. 클로닝을 위해 제한효소 NdeI의 절단위치가 서열번호 3의 프라이머에, 그리고 서열번호 4의 프라이머에는 제한효소 SalI의 절단위치가 삽입되어 플라스미드 pET-CBP2 cassette을 완성하였다 (도 2). 구리 결합단백질인 CBP2 (서열번호 2)와 신종플루 H1N1 독감의 표면항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HG)의 친수성 도메인(이하 'H1a'라 함)의 융합단백질을 발현시키는 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 주형 DNA 없이 서열번호 3 및 4의 프라이머만을 이용하여 PCR을 수행하여 CBP2-H1a의 유전자 산물을 수득하였다. H1a의 유전자 서열은 독감을 일으키는 인플루엔자 바이러스 중에서 한국형 H1N1 신종플루 바이러스 유전자 서열을 택하여 HG(NCBI Genbank No. GQ131023, EU798778, EU798779)중에서 그 일부인 454-479번째의 16개 아미노산(서열번호 5)을 코딩하는 유전자로서 E. coli에서의 codon usage(Miller, J. H., A short corse in bacterial genetics. 1992)를 활용한 새로운 염기서열(서열번호 6)을 작성하여 얻을 수 있었다. 클로닝을 위해 제한효소 HindIII의 절단위치가 서열번호 7의 프라이머에, 그리고 서열번호 8의 프라이머에는 제한효소 XhoI의 절단위치가 삽입되어 플라스미드 pET-CBP2-H1a 유전자를 획득하였다 (도 3).
PCR was performed using only primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 without template DNA in order to clone the recombinant E. coli gene, which is a novel copper binding protein isolated from Example 3, with CBP2 (SEQ ID NO: 2) and a probe protein. To obtain the gene product of CBP2. For cloning, the cleavage site of restriction enzyme Nde I was inserted into the primer of SEQ ID NO: 3 and the cleavage site of restriction enzyme Sal I was inserted into the primer of SEQ ID NO: 4 to complete the plasmid pET-CBP2 cassette (FIG. 2). Genes expressing a fusion protein of the copper binding protein CBP2 (SEQ ID NO: 2) and the hydrophilic domain of hemagglutinin (HG), a surface antigen of the H1N1 flu, are referred to as recombinant E. coli. For cloning, PCR was performed using only the primers of SEQ ID NOs: 3 and 4 without template DNA to obtain the gene product of CBP2-H1a. The gene sequence of H1a was selected from the Korean H1N1 H1N1 virus gene sequence among influenza viruses that cause influenza. As a coding gene, a new nucleotide sequence (SEQ ID NO: 6) was obtained using codon usage (Miller, JH, A short corse in bacterial genetics. 1992) in E. coli . For cloning, the cleavage site of restriction enzyme Hin dIII was inserted into the primer of SEQ ID NO: 7 and the cleavage site of restriction enzyme Xho I was inserted into the primer of SEQ ID NO: 8 to obtain the plasmid pET-CBP2-H1a gene (FIG. 3).

서열번호 3: SEQ ID NO 3:

5'- AGATATACATATGGTGCAGAGCAAATGTGGTAGCAAAGATAACATCAAA -3' (프라이머 1)5'- AGATATA CATATG GTGCAGAGCAAATGTGGTAGCAAAGATAACATCAAA-3 '(primer 1)

서열번호 4: SEQ ID NO 4:

5'- CCGGTCGACACCACCGCCCGGCACGTGTTTGATGTTATCTTTGCT -3' (프라이머 2)5'- CCG GTCGAC ACCACCGCCCGGCACGTGTTTGATGTTATCTTTGCT -3 '(Primer 2)

서열번호 5: H₂N - YHDSNVKNLYEKVRSQ - COOH (H1a)SEQ ID NO: H ₂ N-YHDSNVKNLYEKVRSQ-COOH (H1a)

서열번호 6: 5'- TATCACGATAGCAACGTTAAAAACCTGTATGAAAAAGTGCGTAGCCAG -3'SEQ ID NO: 5'- TATCACGATAGCAACGTTAAAAACCTGTATGAAAAAGTGCGTAGCCAG -3 '

서열번호 7: 5'- GACAAGCTTTATCACGATAGCAACGTTAAAAACCTGTATGAA -3' (프라이머 3)SEQ ID NO: 5'- GAC AAGCTT TATCACGATAGCAACGTTAAAAACCTGTATGAA-3 '(primer 3)

서열번호 8: SEQ ID NO: 8:

5'- CCGCTCGAGCTGGCTACGCACTTTTTCATACAGGTTTTTAAC -3' (프라이머 4)
5'- CCG CTCGAG CTGGCTACGCACTTTTTCATACAGGTTTTTAAC -3 '(Primer 4)

PCR 조건은 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 30초간, 교잡(annealing)은 56℃에서 30초간, 연장(extension)은 72℃에서 30초간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장하였다.The first denaturation was performed once at 94 ° C for 5 minutes, after which the second denaturation was at 94 ° C for 30 seconds, the annealing at 56 ° C for 30 seconds, and the extension at 72 ° C for 30 seconds. This was repeated 30 times. It was then extended for 5 minutes at 72 ° C.

상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 각각 약 80 bp (CBP2)와 160 bp (CBP2-H1a 융합) 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 CBP2의 경우 제한효소 NdeI과 SalI, CBP2-H1a의 경우 HindIII과 XhoI으로 절단한 다음, 상기 DNA 절편을 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단한 플라스미드 pET-22b(+) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-CBP2-H1a를 제작하였다.DNA obtained by PCR was subjected to agarose gel electrophoresis to separate DNA fragments of about 80 bp (CBP2) and 160 bp (CBP2-H1a fusion) sizes, respectively, which were the restriction enzymes Nde I and Sal I for CBP2. , CBP2-H1a was digested with Hin dIII and Xho I, and then the DNA fragment was cloned into plasmid pET-22b (+) (Novagen, Darmstadt, Germany) digested with Nde I and Xho I restriction enzymes to recombinant pplasmid pET. -CBP2-H1a was produced.

상기 제작된 pET-CBP2-H1a를 열충격(heat shock)방법을 이용하여 대장균 BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 100 ㎎/L)이 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/L; 트립톤, 10 g/L; NaCl, 10 g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 BL21(DE3)/pET-CBP2-H1a를 제조하였다. 도 2는 상기 제작된 플라스미드 pET-CBP2 cassette의 유전자 지도를 나타낸 것이며 도 3은 상기 제작된 플라스미드 pET-CBP2-H1a의 유전자 지도를 나타낸 것이다. The prepared pET-CBP2-H1a was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany) using a heat shock method to add LB plate medium to which ampicillin (ampicillin, 100 mg / L) was added ( Recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-CBP2-H1a was prepared by selecting from yeast extract, 5 g / L; tryptone, 10 g / L; NaCl, 10 g / L). FIG. 2 shows a genetic map of the plasmid pET-CBP2 cassette prepared above, and FIG. 3 shows a genetic map of the plasmid pET-CBP2-H1a prepared above.

본 실시예에서는 H1a의 N-말단에 CBP 단백질인 CBP2를 결합하는 형태를 사용하였으나, 본 발명의 요지상 C-말단에 CBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명한 사항이다.
In this embodiment, the form of binding CBP2, a CBP protein, to the N-terminus of H1a was used, but the same result can be obtained by using a form in which the CBP protein is bound to the C-terminus of the present invention. It is obvious to those of ordinary knowledge in Esau.

CBPCBP 와 Wow 탐침단백질의Probe protein 융합단백질Fusion protein 발현 Expression

실시예 4에서 제작한, 강력하고 유도 가능한 T7 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pET-CBP2-H1a로 형질전환된 대장균 BL1(DE3)을 배양하여 CBP2-H1a 융합단백질을 발현하였다. Powerful and inducible T7 made in Example 4 E. coli BL1 (DE3) transformed with the recombinant plasmid pET-CBP2-H1a carrying a promoter was cultured to express the CBP2-H1a fusion protein.

T7 프로모터는 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되며 pET-CBP2-H1a로 형질전환된 대장균 BL1(DE3)의 경우, 형질전환된 재조합 대장균을 LB 액체배지 200 mL가 담긴 500 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pET-CBP2-H1a 재조합 플라스미드의 유전자 발현유도는 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.4일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 유도하였다. T7 promoter is induced by IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside) and in the case of Escherichia coli BL1 (DE3) transformed with pET-CBP2-H1a, 500 mL of the recombinant recombinant E. coli containing 200 mL of LB liquid medium The flasks were inoculated and incubated at 37 ° C. Gene expression induction of pET-CBP2-H1a recombinant plasmid was induced by adding 1 mM IPTG when the optical density (OD) measured at 600 nm wavelength was 0.4.

유도발현 후 4시간 후에 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 용액을 4℃에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 μm 여과기로 여과하여 CBP2-H1a 융합단백질을 함유하는 수용성 단백질분획을 수득하였다. 상기 단백질은 브래드포드 방법(Bradford, M. et al., Anal . Biochem., 72:248, 1976)을 이용하여 정량하였다.
Four hours after induction, the whole culture was centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes at 4 ° C, and then the supernatant was discarded and washed once with 100 mL TE buffer (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0). After centrifugation at 6000 rpm for 5 minutes at 100 ° C., the solution was suspended in 100 mL of TE buffer (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) and sonicated at 4 ° C. (Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, USA). Cells were disrupted. The crushed solution was centrifuged at 6000 rpm for 30 minutes at 4 rpm to discard insoluble protein and filtered through a 0.2 μm filter to obtain a water-soluble protein fraction containing CBP2-H1a fusion protein. The protein was quantified using the Bradford method (Bradford, M. et al. , Anal . Biochem ., 72: 248, 1976).

CBPCBP 와 Wow 결합된Combined H1N1H1N1 항원 ( Antigen ( 탐침단백질Probe Protein )의 농도에 따른 다중 ) Depending on the concentration of 스팟Spot 구리 Copper 증착형Deposition 나노구조체 배열 바이오칩의 기능성 검사 Functional inspection of nanostructure array biochip

실시예 1에서 제작된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 탐침단백질로서 H1N1 항원을 고정시키기 위하여 실시예 5에서 CBP와 H1N1 항원을 결합하여 발현된 융합단백질을 농도별로 고정시켜 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 기능성 검사를 하였다.In order to fix the H1N1 antigen as a probe protein on the surface of the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip fabricated in Example 1, the fusion protein expressed by binding the CBP and H1N1 antigens in Example 5 was fixed by concentration, and the multi-spot copper Functional inspection of the deposited nanostructure array biochip was performed.

먼저 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질은 3차증류수(DDW) 버퍼를 이용하여 1 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL 및 1 μg/mL의 농도로 조절한 후, 1시간 이상 반응시켜 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 고정화를 유도하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 농도에 따라 LSPR 광학특성 피크의 wavelength shift가 선형적으로 증가하는 것으로 융합단백질이 바이오칩 표면에 고정된 것을 확인할 수 있었으며, 100 pg/mL의 고감도 분석이 가능하였다. First, the fusion protein conjugated with CBP and H1N1 antigen was prepared using 1 pg / mL, 10 pg / mL, 100 pg / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, 100 ng / mL using tertiary distilled water (DDW) buffer. After adjusting to a concentration of 1 μg / mL, and reacted for 1 hour or more to induce the immobilization of the fusion protein binding the CBP and H1N1 antigen. As a result, as shown in FIG. 4, the wavelength shift of the LSPR optical peak was linearly increased according to the concentration of the fusion protein conjugated with the CBP and H1N1 antigens. As a result, the fusion protein was fixed to the surface of the biochip. High sensitivity analysis of pg / mL was possible.

또한, CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질을 증류수(DDW) 버퍼를 이용하여 1 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL 및 1 μg/mL의 농도로 조절한 후, 다중 스팟 금 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 표면에 1시간 이상 반응시켜 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 고정화를 유도하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질의 농도에 따라 LSPR 광학특성 피크의 wavelength shift의 변화가 없으며, 융합단백질이 바이오칩 표면에 고정화되지 않은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 기능성 검사를 통하여 CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질이 구리 표면에만 고정된다는 것을 알 수 있었다.
In addition, the fusion protein conjugated with CBP and H1N1 antigen was purified using distilled water (DDW) buffer in 1 pg / mL, 10 pg / mL, 100 pg / mL, 1 ng / mL, 10 ng / mL, 100 ng / mL and 1 After adjusting to a concentration of μg / mL, the surface of the multi-spot gold-deposited nanostructure array biochip was reacted for more than 1 hour to induce the immobilization of the fusion protein conjugated with the CBP and H1N1 antigen. As a result, as shown in Figure 4, there was no change in the wavelength shift of the LSPR optical peak according to the concentration of the fusion protein binding CBP and H1N1 antigen, it was confirmed that the fusion protein was not immobilized on the surface of the biochip. Therefore, the functional test showed that the fusion protein that binds the CBP and H1N1 antigen is fixed only on the copper surface.

CBPCBP 를 이용하여 Using H1N1H1N1 항원이 고정된 다중 Antigen-immobilized multiple 스팟Spot 구리 Copper 증착형Deposition 나노구조체 배열 바이오칩의 Nanostructured Array of Biochips H1N1H1N1 항체 검출 Antibody detection

실시예 6에서 제작된 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩 표면에 표적 바이오물질로서 100 ng/mL의 H1N1 항체를 주입한 후, 1시간 이상 반응시켜 H1N1 항원-항체 반응을 광학특성 분석 시스템을 이용하여 검출하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 상기 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하여 H1N1 항원-항체 반응 검출이 가능하다는 것을 확인하였다.
The CBP prepared in Example 6 was injected with 100 ng / mL of H1N1 antibody as a target biomaterial onto a surface of a multi-spot copper-deposited nanostructure array having H1N1 antigen immobilized thereon, and then reacted for at least 1 hour to react with H1N1 antigen-. Antibody reactions were detected using an optical characterization system. As a result, as shown in FIG. 5, it was confirmed that the H1N1 antigen-antibody reaction can be detected using a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having H1N1 antigen fixed using the CBP.

CBPCBP 를 이용하여 Using H1N1H1N1 항원이 고정된 다중 Antigen-immobilized multiple 스팟Spot 구리 Copper 증착형Deposition 나노구조체 배열 바이오칩을 이용한 Nanostructured Array Using Biochips H1N1H1N1 항체의 농도에 따른 기능성 검사 Functional test according to antibody concentration

상기 실시예 7과 마찬가지로 실시예 6에 의해 제작된 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하여 H1N1 항체의 농도에 따른 검출 효율을 측정하였다. H1N1 항체의 농도는 1 fg/mL～100 ng/mL의 범위에서 측정되었다. CBP와 H1N1 항원을 결합한 융합단백질은 1μg/mL 농도로 바이오칩 표면에 고정시켰으며, 1시간 이상 H1N1 항원과 H1N1 항체를 반응시켜 결합을 유도하였다. 도 6에 나타낸 실험 결과와 같이, H1N1 항체는 1 pg/mL라는 고감도 분석이 가능하다는 것이 확인되었으며, 1 fg/mL～100 ng/mL의 범위내에서 직선 관계에 있었다. 따라서 본 발명의 CBP를 이용하여 H1N1 항원이 고정된 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩은 저농도의 정량분석이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
As in Example 7, the detection efficiency according to the concentration of H1N1 antibody was measured using a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having H1N1 antigen fixed using CBP prepared in Example 6. The concentration of H1N1 antibody was measured in the range of 1 fg / mL to 100 ng / mL. The fusion protein conjugated with CBP and H1N1 antigen was immobilized on the surface of the biochip at a concentration of 1 μg / mL, and binding was induced by reacting the H1N1 antigen with the H1N1 antibody for at least 1 hour. As shown in FIG. 6, it was confirmed that the H1N1 antibody was capable of high sensitivity analysis of 1 pg / mL, and was in a linear relationship within the range of 1 fg / mL to 100 ng / mL. Therefore, it was found that the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having H1N1 antigen fixed using the CBP of the present invention can be quantitatively analyzed at low concentration.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to specific embodiments thereof, those skilled in the art will appreciate that such specific embodiments are merely preferred embodiments and that the scope of the present invention is not limited thereby. something to do. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Multi-spot Copper-Capped Nanostructure Array Biochip Using Copper Binding Peptide and Preparing Method Thereof <130> P10-B247 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Val Asn Ile Thr Lys Gln His Thr 1 5 10 15 Val Thr Thr Thr Thr 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agatatacat atggtgcaga gcaaatgtgg tagcaaagat aacatcaaa 49 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccggtcgaca ccaccgcccg gcacgtgttt gatgttatct ttgct 45 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> H1N1 swine influenza virus <400> 5 Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln 1 5 10 15 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1a <400> 6 tatcacgata gcaacgttaa aaacctgtat gaaaaagtgc gtagccag 48 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gacaagcttt atcacgatag caacgttaaa aacctgtatg aa 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccgctcgagc tggctacgca ctttttcata caggttttta ac 42 <110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Multi-spot Copper-Capped Nanostructure Array Biochip Using Copper Binding Peptide and Preparing Method Thereof <130> P10-B247 <160> 8 <170> Kopatentin 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Val Asn Ile Thr Lys Gln His Thr 1 5 10 15 Val Thr Thr Thr Thr 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val Gln Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly <210> 3 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 agatatacat atggtgcaga gcaaatgtgg tagcaaagat aacatcaaa 49 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccggtcgaca ccaccgcccg gcacgtgttt gatgttatct ttgct 45 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> H1N1 swine influenza virus <400> 5 Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln 1 5 10 15 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1a <400> 6 tatcacgata gcaacgttaa aaacctgtat gaaaaagtgc gtagccag 48 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gacaagcttt atcacgatag caacgttaaa aacctgtatg aa 42 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccgctcgagc tggctacgca ctttttcata caggttttta ac 42

Claims

다음 단계를 포함하는 CBP(copper binding peptide)를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법:
(a) 기판(제1층) 상에 금속 박막층(제2층)을 형성시키는 단계;
(b) 상기 금속 박막층(제2층) 상에 다중 스팟을 형성시키고, 상기 다중 스팟의 각 스팟 표면에 나노구조체를 일정한 간격으로 배열시켜 나노구조체 배열층(제3층)을 형성시키는 단계;
(c) 상기 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질을 고정시키는 단계.
Method of manufacturing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip in which a probe protein is fixed using a copper binding peptide (CBP) comprising the following steps:
(a) forming a metal thin film layer (second layer) on the substrate (first layer);
(b) forming a multi-spot on the metal thin film layer (second layer), and forming a nano-structure array layer (third layer) by arranging nanostructures at regular intervals on each spot surface of the multi-spot;
(c) forming a copper thin film layer (fourth layer) on the nanostructure array layer (third layer); And
(d) immobilizing the fusion protein in which the CBP and the probe protein are combined on the copper thin film layer (fourth layer).

제1항에 있어서, 상기 CBP는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 펩타이드인 것을 특징으로 하는 CBP(copper binding peptide)를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the CBP is a peptide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2. A method for producing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having a probe protein fixed thereto using a copper binding peptide (CBP).

제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 폴리스틸렌, PET(polyethylene terephthalate), 폴리카보네이트, 실리콘 및 석영으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the substrate is glass, polystyrene, PET (polyethylene terephthalate), polycarbonate, silicon and quartz, characterized in that the multi-spot copper deposition type nano-probe using the probe protein is fixed CBP Method for manufacturing a structure array biochip.

제1항에 있어서, 상기 기판의 두께는 0.1~20mm인 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the substrate has a thickness of 0.1 to 20 mm. The method of manufacturing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having fixed probe protein using CBP.

제1항에 있어서, 금속 박막층은 금(Au), 은(Ag), 동(Cu), 알루미늄(Al), 백금(Pt), 니켈(Ni), 아연(Zn) 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The group of claim 1, wherein the metal thin film layer is composed of gold (Au), silver (Ag), copper (Cu), aluminum (Al), platinum (Pt), nickel (Ni), zinc (Zn), and mixtures thereof. Method for producing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip is fixed to the probe protein using a CBP characterized in that it is selected from.

제1항에 있어서, 상기 나노구조체는 나노입자(nano-particle), 나노도트(nano-dot), 나노아일랜드(nano-island), 나노로드(nano-rod) 및 나노와이어(nano-wire)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the nanostructures are nano-particles, nano-dots, nano-island, nano-rods, and nano-wires. A method for manufacturing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip in which a probe protein is fixed using CBP, which is selected from the group consisting of:

제1항에 있어서, 상기 나노구조체 배열층을 금속 박막층 상에 일정한 간격으로 배열시키기 위해서, 상기 금속 박막층의 표면을 카르복실기로 개질하고, 상기 나노구조체 표면은 아민기로 개질시킨 다음, 상기 카르복실기로 개질된 금속 박막층과 아민기로 개질된 나노구조체 표면을 공유결합시키는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
According to claim 1, In order to arrange the nanostructure array layer on a metal thin film layer at regular intervals, the surface of the metal thin film layer is modified with a carboxyl group, the nanostructure surface is modified with an amine group, and then modified with the carboxyl group A method for manufacturing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip on which a probe protein is immobilized using a CBP, wherein the metal thin film layer and the surface of the nanostructure modified with an amine group are covalently bonded.

제1항에 있어서, 금속 박막층 및 구리 박막층의 형성은 스파터법, 증착법, 이온 플레이팅법, 전기도금법 및 무전기도금법으로 구성된 군에서 선택되는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the formation of the metal thin film layer and the copper thin film layer is performed by a method selected from the group consisting of a spatter method, a deposition method, an ion plating method, an electroplating method and a electroless plating method, the probe protein using the CBP is fixed Method of manufacturing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip.

제1항에 있어서, 구리 박막층의 두께에 따라 LSPR 광학특성에 의해 발생하는 LSPR 광학밴드 피크의 흡광도 강도가 달라지는 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method according to claim 1, wherein the absorbance intensity of the LSPR optical band peak generated by the LSPR optical characteristics is different depending on the thickness of the copper thin film layer, characterized in that the multi-spot copper-deposited nano-type with the fixed probe protein using CBP Method for manufacturing a structure array biochip.

제1항에 있어서, 상기 다중 스팟은 다공성 마스크를 금속 박막층(제2층)에 고정하여 형성시키는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of claim 1, wherein the multi-spot is formed by fixing a porous mask to a metal thin film layer (second layer). .

제10항에 있어서, 상기 다공성 마스크는 고무평판, 실리콘평판 및 이들의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of claim 10, wherein the porous mask is selected from the group consisting of rubber plates, silicon plates, and mixtures thereof. .

제10항에 있어서, 상기 다공성 마스크의 다공수는 1-300개인 것을 특징으로 하는 CBP를 이용한 탐침단백질이 고정되어 있는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩의 제조방법.
The method of manufacturing a multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip having fixed probe protein using CBP according to claim 10, wherein the porous mask has 1-300 pores.

제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 금속박막층(제2층) 상의 다중 스팟 각 표면에 일정한 간격으로 배열된 나노구조체 배열층(제3층) 상에 구리 박막층(제4층)이 형성되어 있고, 상기 구리 박막층(제4층) 상에 CBP와 탐침단백질이 결합된 융합단백질이 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩.
The copper thin film layer (third layer) on the nanostructure array layer (third layer), which is arranged by the method of any one of claims 1 to 12, at regular intervals on each surface of the multiple spots on the metal thin film layer (second layer). And four layers), and a fusion protein in which a CBP and a probe protein are combined is fixed on the copper thin film layer (fourth layer).

제13항의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법.
A method of measuring a target biomaterial or a candidate target biomaterial, using the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip of claim 13.

다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법:
(a) 제13항의 다중 스팟 구리 증착형 나노구조체 배열 바이오칩과 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 광학특성 분석 시스템을 이용하여 광학특성 변화를 분석하여, 탐침단백질과 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 상호작용을 검출 및 정량하는 단계.
A method for measuring a target biomaterial or candidate target biomaterial, comprising the following steps:
(a) contacting a sample comprising the multi-spot copper-deposited nanostructure array biochip of claim 13 with a target biomaterial or candidate target biomaterial; And
(b) analyzing the optical property change using an optical characterization system to detect and quantify the interaction of the probe protein with the target biomaterial or candidate target biomaterial.

제14항에 있어서, 상기 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질은 항원, 항체, 리간드(ligand), RNA, DNA, PNA 및 합텐(hapten)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법.
15. The target biomaterial or candidate according to claim 14, wherein the target biomaterial or candidate target biomaterial is selected from the group consisting of antigen, antibody, ligand, RNA, DNA, PNA, and hapten. Method for Measuring Target Biomaterials.

제15항에 있어서, 상기 시료는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질을 포함하는 용액으로, 혈액, 타액, 오줌, 코피, 눈물, 배설물, 조직추출액 및 배양액으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 표적 바이오 물질 또는 후보 표적 바이오 물질의 측정방법.
The target of claim 15, wherein the sample is a solution containing a target biomaterial or a candidate target biomaterial, and is selected from the group consisting of blood, saliva, urine, nosebleed, tears, feces, tissue extract and culture solution. Method of measuring biomaterial or candidate target biomaterial.