KR20110014563A

KR20110014563A - 악티노마두라 나미비엔시스로부터 유래된 고도로 브릿징된 펩타이드

Info

Publication number: KR20110014563A
Application number: KR1020107022012A
Authority: KR
Inventors: 마르크 브뢴슈트루프; 한스 귀링; 홀거 호프만; 요아힘 빙크; 로데리히 쥐쓰무트; 티모 슈미데러
Original assignee: 사노피-아벤티스
Priority date: 2008-04-02
Filing date: 2009-03-18
Publication date: 2011-02-11
Also published as: MX2010010115A; JP2011516048A; CA2720173A1; RU2010144778A; HK1155762A1; EP2271665B1; US20110144001A1; EP2271665A1; CN102046652B; MY159790A; RU2498995C2; JP5653900B2; AU2009231118A1; AR071125A1; ATE541856T1; CN102046652A; WO2009121483A1; IL208239A0; KR101612275B1; CL2009000791A1

Abstract

본 발명은 악티노마두라 나미비엔시스(Actinomadura namibiensis) 균주(DSM 6313)로부터 수득할 수 있는 소위 화학식 I의 라비린토펩틴(Labyrinthopeptin) 유도체, 세균 감염, 바이러스 감염 및/또는 통증을 치료하기 위한 이의 용도, 이를 포함하는 약제학적 조성물, 프리프로-라비린토펩틴, 프로-라비린토펩틴, 및 프리프로-라비린토펩틴 및 프로-라비린토펩틴을 암호화하는 DNA에 관한 것이다.
[화학식 I]

위의 화학식 I에서,
{A}, {B}, {C}, R₁ 내지 R₆, m 및 n은 본원에서 정의된 바와 같다.

Description

악티노마두라 나미비엔시스로부터 유래된 고도로 브릿징된 펩타이드{Highly bridged peptides from Actinomadura namibiensis}

몇몇의 고도로 브릿징된 펩타이드는 문헌에 공지되어 있으며, 예를 들면, 청자고둥(cone snail)으로부터 분리된 코노펩타이드[참조: Terlau & Olivera, Physiol. Rev. 2004, 84, 41-68] 또는 그람 양성 세균 공급원으로부터 분리된 소위 란티바이오틱스(lantibiotics)[참조: Chatterjee et al., Chem. Rev. 2005, 105, 633-683]이다. 상기 펩타이드는 각종 용도를 갖는다. 란티바이오틱 니신은, 예를 들면, 수년 동안 식품 보존제로서 사용되고 있다.

코노펩타이드는 통증, 당뇨병, 다발성 경화증 및 심혈관 질환의 치료에 유용하며, 현재 전임상 또는 임상 실험 중에 있다. 코노펩타이드의 예로는 α-GI(서열: ECCNPACGRHYSC^*, ^*아미드화됨, 연결: 1-3, 2-4) 및 α-GID(서열: IRγCCSNPACRVNNOHVC, 연결: 1-3, 2-4), 여기서 O/Hyp는 하이드록시프롤린이고, 연결은 각각의 특이적인 이황화 결합과 관련된 시스테인의 위치, 예를 들면, α-GID의 1번→3번 및 2번→4번을 나타낸다:

라비린토펩틴(Labyrinthopeptin)으로 명명되는 고도로 브릿징된 펩타이드의 신규한 그룹은 최근에 발견되었다(유럽 특허원 제EP06020980.6호). 소위 라비린토펩틴은, 하기 화학식의 화합물에 의해 도시된 바와 같이, 펩타이드 쇄를 가로지르는 독특한 브릿징된 모티프를 나타낸다:

본 발명자들은 라비린토펩틴 부류의 더욱 고도로 브릿징된 펩타이드를 악티노마두라 나미비엔시스(Actinomadura namibiensis) 미생물 균주(DSM 6313)로부터 분리할 수 있음을 최근에 밝혀냈다. 상기 화합물은 유럽 특허원 제EP06020980.6호에 기재된 라비린토펩틴 유도체와 명백하게 상이하다.

본 발명의 양태는 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물, 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비율의 혼합물, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염이다.

[화학식 I]

위의 화학식 I에서,

{A}는

로부터 선택된 그룹이고;

{B}는

로부터 선택된 그룹이고;

{C}는

로부터 선택된 그룹이고;

R₁은 R₁' 또는 그룹

[여기서, R₁'은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬]이고;

R₂는 OH, NH₂, NH-(C₁-C₆)알킬, NH-(C₁-C₄)알킬렌-페닐 또는 NH-(C₁-C₄)알킬렌-피리딜이고;

R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH(C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₆)알킬렌-C(O)N[(C₁-C₄)알킬]₂이거나, R₃ 및 R₄는 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하고;

R₅ 및 R₆은 서로 독립적으로 H 또는 OH이거나, R₅ 및 R₆은 함께 =O이고;

m 및 n은 서로 독립적으로 0, 1 또는 2이고;

단, {A}가

이고 {B}가

이고 {C}가

인 경우, R₃ 및 R₄는 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하지 않을 수 있다.

바람직하게는, {A}는

이고, {B}는

이고, {C}는

이다.

더욱 바람직하게는, {A}는

이고, {B}는

이고, {C}는

이고, R₁은 바람직하게는 그룹 R₁'(여기서, R₁'은 바람직하게는 H이다)이고, R₂는 바람직하게는 OH이다.

R₃ 및 R₄는 바람직하게는 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬 또는 (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂이거나, 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성한다. 더욱 바람직하게는, R₃ 및 R₄는 H이거나, 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성한다. 가장 바람직하게는, R₃ 및 R₄는 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성한다.

R₅ 및 R₆은 바람직하게는 H 또는 OH(여기서, R₅가 OH인 경우 R₆은 H이고, R₅가 H인 경우 R₆은 OH이다)이거나, R₅ 및 R₆은 함께 =O이다. 더욱 바람직하게는, R₅는 OH이고 R₆은 H이거나, R₅는 H이고 R₆은 OH이다.

바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 화합물임을 특징으로 한다.

[화학식 II]

위의 화학식 II에서,

R₁은 R₁' 또는 그룹

[여기서, R₁'은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬, 바람직하게는 H이다]이다.

더욱 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 화학식 III의 화합물임을 특징으로 한다.

[화학식 III]

위의 화학식 III에서,

R₁은 R₁' 또는 그룹

[여기서, R₁'은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬, 바람직하게는 H이다]이고;

R₂는 OH, NH₂, NH-(C₁-C₆)-알킬, N[(C₁-C₆)-알킬]₂, NH-(C₁-C₄)-알킬렌-페닐 또는 NH-(C₁-C₄)-알킬렌-피리딜, 바람직하게는 H이고;

R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬 또는 (C₁-C₄)-알킬렌-C(O)NH₂이다.

R₁이 R₁'인 화학식 II와 화학식 III의 화합물은 이하 라비린토펩틴 A1로 명명된다.

R₁이 그룹

인 화학식 II와 화학식 III의 화합물은 이하 라비린토펩틴 A3으로 명명된다.

더욱 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 화학식 IV의 화합물임을 특징으로 한다.

[화학식 IV]

위의 화학식 IV에서,

R₁은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬이고;

R₂는 OH, NH₂, NH-(C₁-C₆)-알킬, N[(C₁-C₆)-알킬]₂, NH-(C₁-C₄)-알킬렌-페닐 또는 NH-(C₁-C₄)-알킬렌-피리딜이고;

화학식 IV의 화합물은 라비린토펩틴 A2로 명명된다.

바람직하게는, 화학식 I의 화합물에서, m 및 n은 둘 다 0이거나, 둘 다 2이거나, m이 0이고 n은 2이거나, m이 2이고 n은 0이다. 가장 바람직하게는, m 및 n은 둘 다 0이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 화학식 I의 화합물의 모든 명백한 화학적 등가물에 관한 것이다. 이러한 등가물은 약간의 화학적 차이만을 나타내고 동일한 약리 효과를 갖거나 온화한 조건 하에 본 발명에 따른 화합물로 전환되는 화합물이다. 또한, 상기 등가물은, 예를 들면, 화학식 I의 화합물의 염, 환원 생성물, 산화 생성물, 부분 가수분해 처리 에스테르, 에테르, 아세탈 또는 아미드, 및 당업자가 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있는 등가물이며, 이에 추가하여, 모든 광학적 이성질체 및 부분입체이성체 및 모든 입체이성체 형태이다.

달리 지시되지 않는다면, 화학식 I의 화합물의 키랄 중심은 R 배열 또는 S 배열로 존재할 수 있다. 본 발명은 광학적으로 순수한 화합물 및 입체이성체 혼합물, 예를 들면, 에난티오머 혼합물 및 부분입체이성체 혼합물 둘 다에 관한 것이다.

화학식 I의 화합물의 생리학적으로 허용되는 염은, 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, page 1418, 1985]에 기재된 바와 같이, 이의 유기 염 또는 무기 염 둘 다인 것으로 이해된다. 이의 물리적 및 화학적 안정성 및 이의 용해도로 인해, 산 그룹에 대해 특히 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 암모늄의 염이 바람직하며; 염기 그룹에 대해 특히 염산, 황산 또는 인산의 염, 또는 카복실산 또는 설폰산, 예를 들면, 아세트산, 시트르산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산 및 p-톨루엔설폰산이 바람직하다.

더욱 바람직하게는, 화학식 I 내지 IV의 화합물은 {A}가

이고 {B}가

이고 {C}가

이고 R₁이

(여기서, R₁'은 H이다)이고 R₂가 H이고 R₃ 및 R₄가 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하고 R₅가 H이고 R₆이 OH이고 m 및 n이 0인 화학식 I의 화합물인, 화학식 V의 화합물, 가장 바람직하게는 화학식 VI의 화합물에 나타낸 바와 같은 입체화학을 특징으로 한다.

[화학식 V]

[화학식 VI]

본 발명의 추가의 양태는 화학식 VII의 화합물, 바람직하게는 화학식 VIII의 합물을 특징으로 하는 화학식 I의 화합물이다.

[화학식 VII]

[화학식 VIII]

상기 화학식 V 및 VI의 화합물은 라비린토펩틴 A3을 의미하고, 화학식 VII 및 VIII의 화합물은 라비린토펩틴 A1을 의미한다.

본 발명의 화합물의 추가의 특징에서, 상기 펩타이드 잔기는 리보솜 펩타이드 합성으로부터 예상되는 전구체로 다시 전환되었다. 잔기 4 및 13에서의 α, α-이치환된 아미노산은 선행 문헌에 존재하지 않는다. 상기 아미노산은 화학식 II 및 III의 화합물에 대하여 하기에 나타낸 바와 같이 β 위치에서의 하이드록실 그룹이 치환된 Ser 잔기로서 기재될 수 있다:

(서열번호 1)

라비린토펩틴 A2에 대한 선행 유럽 특허원 제EP06020980.6호에서, 하기 리보솜 전구체는 생합성에 대한 지식의 부재로 추정되었다:

(서열번호 2)

라비린토펩틴의 생합성(하기 참조)에서의 새로운 관점에 기초하여, 화학식 IV의 화합물에 대한 생합성 전구체는 다음과 같이 기재된다:

(서열번호 3)

본 발명은 또한

a) 하나 이상의 화학식 I의 화합물이 배양 배지에 축적될 때까지 적합한 조건 하에 상기 배양 배지에서 악티노마두라 나미비엔시스 균주(DSM 6313), 또는 이의 변이체 및/또는 돌연변이체 중 하나를 발효시키는 단계;

b) 상기 배양 배지로부터 화학식 I의 화합물을 분리하는 단계; 및

c) 경우에 따라, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물을 유도체화하고/하거나, 경우에 따라, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물 또는 상기 단계 b)에서 분리된 화합물의 유도체를 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시키는 단계를 포함하는, 제1항에 기재된 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

바람직하게는, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물은 m 및 n이 둘 다 0이고, R₁이 R₁' 또는 그룹

(여기서, R₁'은 H이다)이고, R₂가 OH인 화학식 II의 화합물임을 특징으로 한다.

더욱 바람직하게는, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물은 m 및 n이 둘 다 0이고 R₁이 H이고 R₂가 OH이고 R₃ 및 R₄가 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH(C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₆)알킬렌-C(O)N[(C₁-C₄)알킬]₂인 화학식 IV의 화합물로 상기 단계 c)에서 후속적으로 유도체화되는 라비린토펩틴 A2이다.

상기 배지는 하나 이상의 통상적인 탄소원, 하나 이상의 질소원 및 하나 이상의 통상적인 유기 염을 함유하는 영양 용액 또는 고체 배지이다.

본 발명에 따른 방법은 실험실 규모(㎖ 내지 ℓ 규모)로 발효시키기 위해 및 산업 규모(㎥ 규모)로 발효시키기 위해 사용될 수 있다.

상기 발효에 적합한 탄소원은 동화가능한 탄수화물 및 당 알콜, 예를 들면, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스 또는 D-만니톨, 및 탄수화물 함유 천연 생성물, 예를 들면, 맥아 추출물 또는 효모 추출물이다. 질소 함유 영양물질의 예로는 아미노산; 펩타이드, 단백질 및 이들의 분해 생성물, 예를 들면, 카제인, 펩톤 또는 트립톤; 고기 추출물; 효모 추출물; 글루텐; 예를 들면, 옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 목화 나무로부터의 분쇄 종자; 알콜 생산으로부터의 증류 잔사; 고기 가루; 효모 추출물; 암모늄 염; 질산 염이 있다. 합성 또는 생합성으로 수득된 하나 이상의 펩타이드(들)인 질소원이 바람직하다. 무기 염의 예로는 알칼리 금속, 알칼리 토 금속, 철, 아연, 코발트 및 망간의 염산 염, 탄산 염, 황산 염 또는 인산 염이 있다. 미량 원소의 예로는 코발트 및 망간이 있다.

본 발명에 따른 라비린토펩틴을 형성하는데 특히 적합한 조건은 효모 추출물 0.05 내지 5%, 바람직하게는 0.1 내지 2.5%; 카시톤 0.2 내지 5.0%, 바람직하게는 0.1 내지 2%; CaCl₂ ×　2H₂O 0.02 내지 1.0%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5%; MgSO₄ ×　7H₂O 0.02 내지 1.5%, 바람직하게는 0.05 내지 0.7%; 및 시아노코발아민 0.00001% 내지 0.001%이다. 소정의 % 값은 각각의 경우에 총 영양 용액의 중량을 기준으로 한다.

상기 미생물은 호기적으로 배양된다, 즉, 예를 들면, 진탕 또는 교반시키면서 진탕 플라스크 또는 발효통에 침지되거나, 고체 배지에서, 경우에 따라, 공기 또는 산소에 통과시킨다. 미생물은 약 18 내지 35℃, 바람직하게는 약 20 내지 32℃, 특히 27 내지 30℃의 온도 범위에서 배양된다. pH 범위는 4 내지 10, 바람직하게는 6.5 내지 7.5이어야 한다. 미생물은 일반적으로 이러한 조건 하에 2 내지 10일, 바람직하게는 72 내지 168시간 동안 배양된다. 미생물은 유리하게는 수개의 단계로 배양된다, 즉 하나 이상의 예비 배양균을 초기에 액체 영양 배지에서 제조한 후, 이러한 예비 배양균을, 예를 들면, 1:10 내지 1:100의 용적 비율로 실제 생산 배지, 즉 주요 배양물에 접종한다. 예비 배양균은, 예를 들면, 균주를 생장 세포 또는 포자의 형태로 영양 용액에 접종하고 약 20 내지 120시간, 바람직하게는 48 내지 96시간 동안 생장시킴으로써 수득된다. 생장 세포 및/또는 포자는, 예를 들면, 고체 또는 액체 영양 기질, 예를 들면, 효모 한천 상에서 균주를 약 1 내지 15일, 바람직하게는 4 내지 10일 동안 생장시킴으로써 수득될 수 있다.

라비린토펩틴 유도체는 공지된 방법을 사용하고 천연 물질의 화학적, 물리적 및 생화학적 특성을 고려하여 배지로부터 분리되고 정제될 수 있다. HPLC를 사용하여 배지에서 또는 각각의 분리 단계에서 각각의 라비린토펩틴 유도체의 농도를 시험하였으며, 편리하게 형성된 물질의 양을 보정 용액과 비교한다.

분리의 경우, 배양균 브로쓰 또는 고체 배지와의 배양균을 임의로 동결 건조하고, 유기 용매, 또는 물과 유기 용매의 혼합물을 사용하여, 바람직하게는 50 내지 90%의 유기 용매를 함유하는 라비린토펩틴 유도체를 동결 건조물로부터 추출한다. 유기 용매의 예로는 메탄올 및 2-프로판올이 있다. 유기 용매 상은 본 발명에 따른 천연 물질을 함유하고, 경우에 따라, 진공 하에 농축되고, 추가로 정제된다.

본 발명에 따른 하나 이상의 화합물의 추가의 정제는 적합한 물질, 바람직하게는, 예를 들면, 분자체, 실리카겔, 알루미늄 옥사이드, 이온 교환체 또는 흡착제 수지 또는 역상(RP; reversed phase) 크로마토그래피에 의해 실시된다. 이러한 크로마토그래피를 사용하여 라비린토펩틴 유도체를 분리한다. 완충, 염기성 또는 산성 수용액, 또는 수용액과 유기 용액의 혼합물을 사용하여 라비린토펩틴 유도체를 크로마토그래피하였다.

수용액 또는 유기 용액의 혼합물은 5 내지 99%, 바람직하게는 5 내지 50%의 유기 용매, 또는 유기 용매와 혼화가능한 모든 완충 수용액의 농도의 모든 수 혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올, 2-프로판올 또는 아세토니트릴인 것으로 이해된다. 사용되는 완충액은 상기 열거된 것과 동일하다.

라비린토펩틴 유도체는, 예를 들면, MCl(흡착 수지, 일본 미쯔비시) 또는 앰버라이트(Amberlite) XAD[토소하스(TOSOHAAS)], 또는 다른 소수성 재료, 예를 들면, RP-8 또는 RP-18 상의 역상 크로마토그래피에 의해 상이한 극성에 기초하여 분리된다. 이외에도, 실리카겔, 산화알루미늄 등의 정상 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다.

완충, 염기성 또는 산성 수용액은, 예를 들면, 0.5M 이하의 농도의 물, 인산염 완충액, 아세트산 및 시트르산 암모늄 완충액, 및 바람직하게는 1% 이하의 농도의 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 암모니아 및 트리에틸아민, 또는 당업자에게 공지된 시판중인 모든 산 및 염기인 것으로 이해된다. 완충 수용액의 경우, 0.1%의 아세트산 암모늄이 특히 바람직하다.

물 100%로 시작하여 유기 용매 100%로 종결되는 농도 구배를 사용하여 크로마토그래피를 수행할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 95%의 아세토니트릴의 직선 농도 구배로 크로마토그래피를 수행한다.

또는, 겔 크로마토그래피 또는 소수성 상 크로마토그래피를 수행할 수도 있다. 겔 크로마토그래피는, 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 또는 공중합체 겔로 수행될 수 있다. 상기 크로마토그래피 단계의 순서는 바꿀 수 있다.

라비린토펩틴이 입체이성체로 존재하는 한, 이들은 공지된 방법, 예를 들면, 키랄 칼럼을 사용하는 분리법에 의해 분리될 수 있다.

그 자체로 공지된 방법[참조: J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992], 예를 들면, 산 무수물과의 반응 또는 디알킬 카보네이트 또는 디알킬 설페이트와의 반응에 의해 OH 그룹을 에스테르 또는 에테르 유도체로 유도한다. 그 자체로 공지된 방법[참조: J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992], 예를 들면, 각각의 CONH₂ 그룹에 대하여 암모니아와의 반응에 의해 또는 각각의 알킬 에스테르에 대하여 임의로 활성화된 알킬 화합물과의 반응에 의해 COOH 그룹을 에스테르 또는 아미드 유도체로 유도한다. 각각의 라비린토펩틴 유도체를 산소 또는 공기에 노출시킴으로써 -CH₂-S-CH₂- 그룹을 -CH₂-S(O)-CH₂- 그룹 또는 -CH₂-S(O)₂-CH₂- 그룹으로 산화시킬 수 있다. 그 자체로 공지된 방법[참조: A. Henschen, Analysis of cyst(e)ine residues, disulfide bridges, and sulfhydryl groups in proteins, in: B. Wittmann-Liebold, J. Salnikov, V.A. Erdman (Eds.), Advanced Methods in Protein Microsequence Analysis, Springer, Berlin, 1986, pp. 244-255], 예를 들면, 디티오트레이톨에 의한 훤원 및 요오드화알킬을 사용한 알킬화를 사용하여, 디설파이드를 환원시킨 후, 임의로 유리 SH 그룹을 알킬화시킨다. R₃ 및 R₄가 H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH(C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₆)알킬렌-C(O)N[(C₁-C₄)알킬]₂인 화학식 I의 화합물로의 설파이드 환원은, 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하는 화학식 I의 화합물을, (C₁-C₆)알킬-할로겐화물 또는 할로겐-(C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂, 할로겐-(C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH(C₁-C₄)알킬 또는 할로겐-(C₁-C₆)알킬렌-C(O)N[(C₁-C₄)알킬]₂와 디티오트레이톨(일반적인 문헌)의 존재하에 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 할로겐은 F, Cl, Br 또는 I이다.

악티노마두라 나미비엔시스 미생물 균주의 분리균은 제DSM　6313호 하에 1991년 1월 23일에 부다페스트 조약의 규칙에 따라 독일 브라운슈바이크 38124 마쉐로더 벡 1B(2008년 현재: 인호펜슈트라쎄 7B) 소재의 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 식별 번호 FH-A 1198 하에 독일 프랑크푸르트 소재의 훽스트 아게(Hoechst AG)에 의해 기탁되었다. 악티노마두라 나미비엔시스 미생물 균주는 추가로 문헌[참조: Wink et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2003, 53, 721-724]에 기재되어 있다.

악티노마두라 나미비엔시스(DSM　6313) 대신에, 본 발명에 따른 화합물을 하나 이상 합성하는 이의 돌연변이체 및/또는 변이체를 사용할 수도 있다.

돌연변이체는 게놈의 하나 이상의 유전자가 여전히 기능적이고 유전가능한 본 발명에 따른 화합물을 생산하는 미생물의 능력을 담당하는 유전자 또는 유전자들로 변형된 미생물이다.

이러한 돌연변이체는 물리적 수단, 예를 들면, 방사선, 예를 들면, 자외선 또는 X선, 또는 화학적 돌연변이원, 예를 들면, 에틸 메탄설포네이트(EMS), 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논(MOB) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG)을 사용하여 그 자체로 공지된 방식으로 생산되거나 문헌[참조: Brock et al., Biology of Microorganisms, Prentice Hall, pages 238-247, 1984]에 기재된 바와 같이 생산될 수 있다.

변이체는 미생물의 표현형이다. 미생물은 환경에 적응하는 능력을 가지며, 따라서 고도로 발달된 생리학적 유연성을 나타낸다. 미생물의 모든 세포는 표현형 적응과 관련되며, 변화의 성질은 유전적으로 영향을 받지 않으며, 변형 조건 하에 가역적이다[참조: H.　Stolp, Microbial ecology: organism, habitats, activities., Cambridge University Press, Cambridge, GB, page 180, 1988].

본 발명에 따른 화합물을 하나 이상 합성하는 돌연변이체 및/또는 변이체에 대한 스크리닝은 발효 배지를 임의로 동결 건조하고, 동결 건조물 또는 발효 브로쓰를 상기 정의된 유기 용매, 또는 물과 유기 용매의 혼합물로 추출하고, HPLC 또는 TLC에 의해 분석하거나 생물학적 활성을 시험함으로써 달성된다.

발효 조건은 악티노마두라 나미비엔시스(DSM　6313) 및 이의 돌연변이체 및/또는 변이체에 적용될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태는 세균 감염, 특히 그람 양성 세균에 의해 야기된 세균 감염, 바이러스 감염 및/또는 통증, 특히 신경병성 통증 또는 염증 유발 통증을 치료하기 위한 상기 정의된 화학식 I의 화합물의 용도이다.

상기 기재된 약제(또한 약제학적 제제 또는 약제학적 조성물로서도 언급된다)는 치료량의 하나 이상의 상기 기재된 바와 같은 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물, 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비율의 혼합물, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 물질(또는 비히클) 및/또는 첨가제(또는 부형제)를 함유한다.

약제는, 예를 들면, 환제, 정제, 래커 정제, 피복 정제, 과립제, 경질 및 연질 젤라틴 캡슐, 용액제, 시럽, 유화액, 현탁액 또는 에어로졸 혼합물의 형태로 경구 투여될 수 있다. 그러나, 예를 들면, 좌제의 형태로 직장으로 투여될 수도 있거나, 주사 용액 또는 주입 용액, 마이크로캡슐, 임플란트 또는 막대의 형태로 비경구적으로, 예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 피하로 투여될 수도 있거나, 예를 들면, 연고, 용액제 또는 팅크제의 형태로 경피 또는 국소적으로 투여될 수도 있거나, 예를 들면, 에어로졸 또는 비강 분무기의 형태로 다른 방식으로 투여될 수도 있다.

본 발명에 따른 약제는 그 자체로 공지되고 당업자에게 익숙한 방식으로 제조되며, 약제학적으로 허용되는 불활성 무기 및/또는 유기 담체 물질 및/또는 첨가제는 상기 정의된 바와 같은 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물(들), 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비율의 혼합물, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물에 추가하여 사용된다. 환제, 정제, 피복 정제 및 경질 젤라틴 캡슐 제조의 경우, 예를 들면, 락토오스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 이의 염 등을 사용할 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐 및 좌제의 담체 물질은, 예를 들면, 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 천연 오일 또는 경화유 등이다. 용액제, 예를 들면, 주사 용액, 또는 유화액 또는 시럽의 제조에 적합한 담체 물질은, 예를 들면, 물, 식염수, 알콜, 글리세롤, 폴리올, 수크로오스, 전화당, 글루코오스, 식물성유 등이다. 마이크로캡슐, 임플란트 또는 막대에 적합한 담체 물질은, 예를 들면, 글리콜산과 락트산의 공중합체이다. 약제학적 제제는 통상적으로 화학식 I의 화합물 및/또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 및/또는 이의 전구약물을 약 0.5 내지 약 90중량% 함유한다. 약제에서 상기 기재된 바와 같은 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물의 활성 성분, 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비율의 혼합물, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물의 양은 통상적으로 약 0.5 내지 약 1000mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 500mg이다.

상기 기재된 바와 같은 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물의 활성 성분, 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비율의 혼합물, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물, 및 담체 성분에 추가하여, 약제학적 제제는 하나 이상의 첨가제, 예를 들면, 충전제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정제, 유화제, 보존제, 감미료, 착색제, 향미제, 방향제, 증점제, 희석제, 완충 물질, 용매, 가용화제, 데포(depot) 효과 달성용 제제, 삼투압 변경용 염, 피복제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 둘 이상의 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물, 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비율의 혼합물, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물을 함유할 수도 있다. 약제학적 제제가 둘 이상의 화학식 I의 화합물을 함유하는 경우, 각각의 화합물의 선택은 약제학적 제제의 특정한 총괄적인 약리학적 프로파일을 목적으로 할 수 있다. 예를 들면, 단기간 작용하는 높은 효능의 화합물을 장기간 작용하는 낮은 효능의 화합물과 배합할 수 있다. 화학식 I의 화합물 중의 치환체의 선택에 관하여 허용되는 유연성은 화합물의 생물학적 및 물리화학적 특성을 상당히 제어할 수 있게 하여, 이러한 목적의 화합물을 선택할 수 있게 한다. 더욱이, 하나 이상의 화학식 I의 화합물에 추가하여, 약제학적 제제는 또한 하나 이상이 치료학적 또는 예방학적 활성 성분을 함유할 수도 있다.

화학식 I의 화합물을 사용하는 경우, 복용량은 넓은 범위 내에서 다양할 수 있으며, 통상적이며, 의사에게 공지되어 있으며, 각각의 개별적인 경우에서 개개의 질환에 적합화되어야 한다. 이는, 예를 들면, 사용되는 특정 화합물, 치료 대상 질환의 성질 및 중증도, 투여 방식 및 계획, 급성 또는 만성 질환의 치료 여부 또는 예방의 수행 여부에 좌우된다. 적절한 투여량은 약제 분야에 널리 공지된 임상 접근법을 사용하여 확립될 수 있다. 일반적으로, 성인 약 75kg에서 목적하는 결과를 달성하기 위한 1일 복용량은 약 0.01 내지 약 100mg/kg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 50mg/kg, 특히 약 0.1 내지 약 10mg/kg이다(각각의 경우, 체중 1kg당 ㎎). 1일 복용량은 특히 비교적 다량의 투여의 경우에 수회, 예를 들면, 2, 3 또는 4회의 부분 투여로 분할될 수 있다. 일반적으로, 개개의 거동에 따라, 지시된 1일 복용량으로부터 상향 또는 하향으로 벗어나는 것이 필요할 수 있다.

실시예 1: 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313)의 저온 배양물의 제조

배양 배지 100㎖(멸균 전, 전분 10g, 효모 추출물 2g, 글루코오스 10g, 글리세린 10g, 옥수수 스팁 분말 2.5g, 펩톤 2g, NaCl 1g, 수돗물 1ℓ 중의 CaCO₃ 3g, pH 7.2)에 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313) 균주를 멸균된 500㎖ 들이 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에 접종하고, 27℃ 및 120rpm의 진탕기에서 72시간 동안 배양하였다. 이어서, 배양균 1㎖ 및 멸균 보존 용액(글리세린 20g, 사카로오스 10g, 탈이온수 70㎖)을 혼합하고, -80℃에서 저장하였다. 또는, 한천에서 잘 자란 배양균의 작은 조각을, 50% 멸균 글리세린 용액 1.5㎖를 함유하는 Cryotubes^®(뱅가드 인터내셔널(Vangard International))로 옮기고, 액체 질소로 -196℃에서 저장하였다.

실시예 2: 라비린토펩틴의 제조

실시예 1에 기재된 배지 100㎖를 함유하는 멸균된 500㎖ 들이 삼각 플라스크에, 한천 플레이트에서 자란 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313) 배양균을 접종하고, 27℃ 및 120rpm의 진탕기에서 배양하였다. 72시간 후, 동일 배양 배지를 동량 함유하는 추가의 삼각 플라스크에 상기 예비 배양균 2㎖를 각각 접종하고, 동일 조건하에 168시간 동안 배양하였다. 또는, 실시예 1에 기재된 배지 100㎖를 함유하는 300㎖ 들이 삼각 플라스크에, 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313) 배양균을 접종하고, 25℃ 및 180rpm에서 배양하였다. 72시간 후, 동일 배지를 동량 함유하는 추가의 삼각 플라스크에 상기 예비 배양균 5㎖를 각각 접종하고, 동일 조건하에 168시간 동안 배양하였다.

실시예 3: 라비린토펩틴의 고체 상 추출

악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313)의 40ℓ 발효를 종료한 후, 배양 브로쓰를 여과하였다. 배양 여액(약 30ℓ)을 CHP-20P 물질 약 3ℓ로 충전된 칼럼(치수: 160×200㎜)에 주입하였다. 5 내지 95% 농도 구배의 물 중의 이소프로판올을 사용하여, 화합물을 유속 250㎖/분으로 용출시켰다. 분획을 45분에 걸쳐서 매 4분마다 수집하였다. 라비린토펩틴을 함유하는 분획을 모아 동결 건조하였다(분획 8: MW = 2190Da; 분획 9: MW = 2190Da 및 2074Da; 분획 10 내지 12: MW = 2074Da).

실시예 4: RP-18 크로마토그래피를 사용한 라비린토펩틴 A1의 예비 정제

실시예 3으로부터의 분획 10 내지 12(670㎎)를 메탄올 500㎖에 용해시키고, Phenomenex Luna^® 10μ C18 (2) 예비 칼럼(치수: 21.2㎜×60㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® 10μ C18 (2) 칼럼(치수: 50㎜×250㎜)에 주입하였다. 5 내지 75% 농도 구배의 물 중의 아세토니트릴을 사용하여, 화합물을 40분에 걸쳐 유속 190㎖/분으로 용출시켰다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 9.0, 30% 암모니아 수용액을 사용하여 조정). 분획을 매 분마다 수집하였다. 분획 21 및 22는 목적하는 라비린토펩틴(MW = 2074Da)을 함유하였다. 동결 건조 후, 조 생성물 322㎎을 수득하였다.

실시예 5: 라비린토펩틴 A1의 최종 정제

실시예 4로부터의 분획 21 및 22(60㎎)를 메탄올 50㎖에 용해시키고, Waters XTerra^® 분취용 MS C18 10μ 예비 칼럼(치수: 19㎜×10㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® 5μ C18 (2) Axia 칼럼(치수: 30㎜×100㎜)에 주입하였다. 5 내지 75% 농도 구배의 물 중의 아세토니트릴을 사용하여, 화합물을 40분에 걸쳐 유속 70㎖/분으로 용출시켰다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 4.6, 수성 아세트산을 사용하여 조정). UV 유발을 사용하여 용출액을 10㎖의 분획으로 수집하였다. 라비린토펩틴 함유 분획(분획 9 내지 12)을 모았다. 동결 건조 후, 라비린토펩틴 A1 17㎎을 수득하였다.

실시예 6: RP-18 크로마토그래피를 사용한 라비린토펩틴 A3의 예비 정제

실시예 3으로부터의 분획 8(약 850㎎)을 메탄올 500㎖에 용해시키고, Phenomenex Luna^® 10μ C18 (2) 예비 칼럼(치수: 21.2㎜×60㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® 10μ C18 (2) 칼럼(치수: 50㎜×250㎜)에 주입하였다. 5 내지 75% 농도 구배의 물 중의 아세토니트릴을 사용하여, 화합물을 40분에 걸쳐 유속 190㎖/분으로 용출시켰다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 7.0). 분획을 매 분마다 수집하였다. 분획 19는 목적하는 라비린토펩틴(MW = 2190Da)을 함유하였다. 동결 건조 후, 조 생성물 48㎎을 수득하였다.

실시예 7: 라비린토펩틴 A3의 최종 정제

실시예 6으로부터의 분획 19(48㎎)를 메탄올 50㎖에 용해시키고, Waters XTerra^® 분취용 MS C18 10μ 예비 칼럼(치수: 19㎜×10㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® 5μ C18 (2) Axia 칼럼(치수: 30㎜×100㎜)에 주입하였다. 5 내지 75% 농도 구배의 물 중의 아세토니트릴을 사용하여, 화합물을 40분에 걸쳐 유속 70㎖/분으로 용출시켰다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 9.0, 30% 암모니아 수용액을 사용하여 조정). UV 유발을 사용하여 용출액을 분획으로 수집하였다. 라비린토펩틴 함유 분획(분획 9 내지 12)을 모았다. 동결 건조 후, 라비린토펩틴 A3 12㎎을 수득하였다.

실시예 8: 다이오드 어레이 및 질량 분광 검출기가 구비된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC-DAD-MS)에 의한 라비린토펩틴 A1 및 A3의 확인

라비린토펩틴 A1 및 A3을, 샘플 매니저, 2성분 용매 매니저 및 PDA(광 다이오드 어레이 검출기)가 구비된 Waters Acquity UPLC 시스템으로 분석하였다. UPLC 칼럼으로서, Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7μ, 2.1×100㎜)을 사용하고, 15분 이내에 100%의 아세토니트릴로 되는 물:아세토니트릴(9:1)의 농도 구배를 사용하여 유속 0.6㎖/분으로 용출시켰으며, 모든 용매는 6.5mM 아세트산 암모늄으로 pH 4.6까지 완충되었다. UV 스펙트럼을 200 내지 600nm의 파장에서 PDA 검출기로 기록하였다. 직각 전자분무 이온화, 샘플 속도 0.5Hz 및 원자 질량 단위 150 내지 1500의 검출 한계를 사용하여, 질량 스펙트럼을 Bruker μTOF LC MS로 기록하였다.

실시예 9: 라비린토펩틴 A1의 확인

라비린토펩틴 A1은 5.46분(PDA)에서 용출되었다. UV 스펙트럼은 λ_max가 218nm(sh) 및 279nm임을 특징으로 한다.

이중 하전 분자 이온은 음성 모드에서 m/z(I) 1035.87(4539), 1036.37(5566), 1036.87(4086), 1037.37(2296), 1037.87(1034) 및 1038.37(280)에서 관찰되었다. 양성 모드에서, 이중 하전 분자 이온은 m/z(I) 1037.88(2925), 1038.38(3252), 1038.88(2492), 1039.38(1396) 및 1039.88(623)에서 관찰되었다.

고해상도 ESI-FTICR 질량 분광법에 의한 라비린토펩틴 A1의 확인: 메탄올 중의 라비린토펩틴 A1의 용액(농도 = 0.2㎎/㎖)을, 전자분무 공급원이 장착된 Bruker Apex III FTICR MS(7T 자석)로 시린지 펌프를 통해 유속 2㎕/분으로 주입하였다. 외부 보정을 사용하여 스펙트럼을 양성 방식으로 기록하였다.

실시예 10: 라비린토펩틴 A3의 확인

라비린토펩틴 A3은 4.79분(PDA)에서 용출되었다. UV 스펙트럼은 λ_max가 218nm(sh) 및 274nm(sh)임을 특징으로 한다.

이중 하전 분자 이온은 음성 모드에서 m/z(I) 1093.38(1262), 1093.88(1587), 1094.39(1201), 1094.89(686) 및 1095.38(195)에서 관찰되었다. 양성 모드에서, 이중 하전 분자 이온은 m/z(I) 1095.40(365), 1095.91(433) 및 1096.41(294)에서 관찰되었다.

고해상도 ESI-FTICR 질량 분광법에 의한 라비린토펩틴 A3의 확인(실시예 9에 기재된 바와 같은 방법):

실시예 11: 라비린토펩틴 A1의 아미노산 분석

가수분해: 라비린토펩틴 A1(0.05㎎)을 질소 대기 하에 6N HCl 및 5% 페놀로 110℃에서 24시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물을 질소 스트림 하에 건조시켰다.

비키랄(achiral) GC-MS: 가수분해물을 비스-(트리메틸실릴)트리플루오로아세트아미드(BSTFA)/아세토니트릴(1:1)로 150℃에서 4시간 동안 가열하였다. GC-MS 실험 동안, DB5 용융 실리카 모세관(디메틸-(5%-페닐메틸)-폴리실록산으로 피복된 l = 15m×0.25㎛ 용융 실리카, d_f = 0.10㎛; 온도 프로그램: T = 65°/3'/6/280℃)을 사용하였다.

키랄 GC-MS: 가수분해물을 에탄올 중의 2N HCl 200㎕로 110℃에서 30분 동안 에스테르화하고 건조시켰다. 이어서, 혼합물을 디클로로메탄 100㎕ 중의 트리플루오로아세트산 무수물(TFAA) 25㎕로 110℃에서 10분 동안 아실화하고 건조시켰다. GC-MS 동안, 용융 실리카 모세관(키라실-S-Val(Machery-Nagel)로 피복된 l = 22m×0.25㎛ 용융 실리카, d_f = 0.13㎛; 온도 프로그램: T = 55°/3'/3,2/180℃)을 사용하였다.

실시예 12: 라비린토펩틴 A1 및 A3의 구조 유전자의 확인

악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313) 미생물의 코스미드 뱅크는 pWEB-코스미드 벡터(미국 매디슨 소재의 Epicentre Biotechnologies)에 기초하여 독일 베를린 소재의 Agowa GmbH에 의해 생산되었다. 필터는 문헌[참조: Zehetner & Schafner, Methods Mol. Biol., 2001, 175, 169-188]에 기재된 방법을 적용하여 독일 베를린 소재의 RZPD GmbH에 의해 제조되었다.

라비린토펩틴 A2의 공지된 구조에 근거하여, 연장된 변성된 프라이머를 N 말단 및 C 말단[Fw: 5'-CAGGAAACAGCTATGACCGAYTGGWSNYTNTGGG-3' (서열번호 4); Rev: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGTRCANGANGCRAANARRC-3' (서열번호 5); 참조: Dabard et al., Appl. Environ. Microbiol., 2001, 4111-4118]로부터 추론되었다. 프라이머의 5' 연장은 보다 나은 검출 및 취급을 위해 예상되는 PCR 생성물 크기를 향상시킨 것이었다(PCR 조건: 95℃ 3분, 30×(95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 60초) 72℃ 7분, Taq 폴리머라제). PCR 생성물을 겔로 정제하고, 벡터 pDrive (Qiagen)에 클로닝하였다. 서열분석 결과, A2 유전자의 중간으로부터 18개 뉴클레오타이드 길이의 서열[AGTGCTGTAGCACGGGAA (서열번호 6)]을 나타냈다. 상기 18개 뉴클레오타이드 길이로 공지된 서열에 기초하여, 2단계 PCR은 더욱 많은 서열 정보를 제공하였다. 제1 단계에서, 단일 특이적 프라이머 PCR을 A2의 C 말단의 변성된 역방향(rev) 프라이머[5'-RCARCANGCRAANARRCTTCC-3' (서열번호 7)] 및 비특이적 정방향(fw) 프라이머[5'-CACGGTACCTAGACTAGTGACCAAGTGCGCCGGTC-3' (서열번호 8)]로 수행하였다[PCR 조건: 95℃ 3분, 10×(95℃ 45초, 38℃ 45초, 72℃ 3.5분), 30×(95℃ 45초, 52℃ 45초, 72℃ 3.5분) 72℃ 5분, Taq 폴리머라제]. 프라이머를 분해하기 위해 엑소뉴클레아제 I로 분해[PCR 샘플 5㎕ + 엑소뉴클레아제 I(20U/㎕) 0.5㎕, 37℃ 15분, 80℃ 15분 가열 불활성화]한 후, PCR 샘플을 제2 PCR[PCR 조건: 95℃ 3분, 30×(95℃ 45초, 56℃ 45초, 72℃ 3.5분) 72℃ 5분, Taq 폴리머라제]을 위한 주형으로 사용하였다. 공지된 18개의 뉴클레오타이드(5'-CTTCCCGTGCTACAGCACTCCC-3', 서열번호 9)를 포함하는 제1 PCR로부터의 비특이적 정방향 프라이머 및 특이적 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 쌍을 사용하여, 제2 PCR을 이중 PCR(nested-PCR) 방식으로 수행하였다. 생성물 0.4kbp를 겔로 정제하고, pDrive에 클로닝하였다. 서열분석 결과, 예상되는 A2의 C 말단의 아미노산 서열을 나타냈다. 이러한 0.4kbp 서열로부터, Dig 표지된 프로브를 PCR에 의해 제작하였다(Fw: 5'-ATGGACCTCGCCACGGGCTC-3', 서열번호 10; 5'-CTTCCCGTGCTACAGCACTCCC-3', 서열번호 11). 이러한 Dig 표지된 프로브를 사용하여 알칼리성 포스파타제로 표지된 항 Dig 항체를 통해 하이브리드화 및 검출에 의해 필터를 스크리닝하였다. 이러한 방식으로, 하나의 양성 코스미드를 수득하고 서열분석하였다.

서열 데이터를 로컬 블라스트 및 프레임플롯에 의해 분석하였다. 분석 결과, 라비린토펩틴 A2의 구조 유전자를 포함한 다음 개방 판독 프레임(orf)을 나타냈다:

이러한 orf 내에, 다음 서열은 프리프로(prepro)-라비린토펩틴 A2의 구조 유전자(선도 서열, 이어서 프로펩타이드 암호화 서열, 이어서 종결 코돈 TGA)를 나타낸다:

서열번호 13에 나타낸 DNA 서열을 해독한 결과, 프리프로-라비린토펩틴 A2의 다음 아미노산 서열(서열번호 14) 및 프로-라비린토펩틴 A2의 다음 아미노산 서열(서열번호 15)이 수득되었다:

악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313) 미생물의 효소에 의한 해독 후의 변형에 의해 프로펩타이드 서열을 라비린토펩틴 A2에 도입하였다.

실시예 13: 라비린토펩틴 A1 및 A3의 구조 결정

A2 유전자의 상류 영역은 라비린토펩틴 A2의 구조 유전자와 상동성이 높은 또 다른 작은 orf를 나타낸다. 이러한 개방 판독 프레임(orf)은 라비린토펩틴 A1 및 A3의 구조 유전자를 포함하였다. 라비린토펩틴 A1에 대한 orf는 다음 유전자 서열을 갖는다:

이러한 orf 내에, 다음 서열은 프리프로-라비린토펩틴 A1 및 A3의 구조 유전자(선도 서열, 이어서 프로펩타이드 암호화 서열, 이어서 종결 코돈 TGA)를 나타낸다:

서열번호 17에 나타낸 DNA 서열을 해독한 결과, 프리프로-라비린토펩틴 A1의 다음 아미노산 서열(서열번호 18) 및 프로-라비린토펩틴 A1의 다음 아미노산 서열(서열번호 19)이 수득되었다:

아미노산 서열은 라비린토펩틴 A1의 아미노산 분석 및 MS 분석의 결과(상기 참조)에 기초한 라비린토펩틴 A1의 예상되는 아미노산 조성과 일치하였다. 라비린토펩틴 A2의 것과 유사한 측쇄의 해독 후의 변형이 추론되었다. 아미노산의 입체화학은 아미노산 분석으로부터 제공되었다(실시예 11). 마지막으로, 데하이드로부티르산을 제공하기 위한 트레오닌(Thr) 잔기의 탈수는 고해상도 MS로부터 계산된 실험적 분자식과 일치하도록 추론되었다. 유사한 라비린토펩틴 A2의 해독 후 변형된 아미노산의 입체화학에 기초하여, 화학식 VIII의 화합물이 라비린토펩틴 A1에 대하여 유도되었다.

상기 질량 분석은 Asp를 라비린토펩틴 A1과 A3 사이의 차이로서 제시하였다. 이는 라비린토펩틴 A1의 프로테아제 분해 측면 앞의 위치 -1에서 Asp를 포함하는 암호화 서열에 의해 확인되었다. 라비린토펩틴 A1 및 A3이 동일 유전자에 의해 암호화되고 선도 서열의 프로테아제 절단에서만 상이하다는 가정 하에, 추가의 Asp는 라비린토펩틴 A3의 N 말단에 존재한다. 이러한 방식으로, 화학식 V의 화합물은 라비린토펩틴 A3에 대하여 유도되었다. 유사한 라비린토펩틴 A2의 해독 후 변형된 아미노산의 입체화학에 기초하여, 화학식 VI의 화합물이 라비린토펩틴 A3에 대하여 유도되었다.

실시예 14: 라비린토펩틴 A1의 이황화 결합의 절단 및 요오드화메틸에 의한 후속적 알킬화

라비린토펩틴 A1(50㎎, 0.024mmol)을 메탄올(3㎖)에 용해시키고, 디티오트레이톨 용액(1㎖, 물 1㎖ 중의 NaHCO₃ 40㎎의 용액 중의 디티오트레이톨 75㎎으로부터 새로이 제조함)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, 이를 실온으로 냉각시키고, 요오드화메틸(50㎕, 0.80mmol)를 첨가하였다. 실온에서 4시간 후, 혼합물을 여과하고, Waters XTerra^® 분취용 MS C18 10μ 예비 칼럼(치수: 19㎜×10㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® Axia 5μ C18 (2) 칼럼(치수: 100㎜×30㎜)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 농도 구배는 물 중의 아세토니트릴 5 내지 95%로 30분 이내에 수행하였다(완충액: pH 2.0, 포름산으로 조정함). 유속은 60㎖/분이고, 피크를 UV로 분획하였다. 분획 12 및 13을 합하고, 동결 건조 후 목적하는 화합물 23.1㎎(45.5%)을 수득하였다. 생성물을 UV 분광법 및 질량 분석법(Bruker Daltonics MicroTof)에 의해 확인하였다.

RT_min = 5.46분(PDA; 실시예 8에서와 같은 LC 방법)

UV(λ_max): 217nm(sh), 279nm

ESI-MS(음성): [M-2H]^2- = 1050.894

중성의 단일 동위원소의 실험적 질량[M] = 2103.802

C₉₄H₁₂₅N₂₃O₂₅S₄에 대한 중성의 단일 동위원소의 계산된 질량: 2103.810

분자식: C₉₄H₁₂₅N₂₃O₂₅S₄

화학적 분자량 = 2105.44

실시예 15: 라비린토펩틴 A1의 이황화 결합의 절단 및 요오도-아세트아미드에 의한 후속적 알킬화

라비린토펩틴 A1(50㎎, 0.024mmol)을 메탄올(3㎖)에 용해시키고, 디티오트레이톨 용액(1㎖, 물 1㎖ 중의 NaHCO₃ 40㎎의 용액 중의 디티오트레이톨 70㎎으로부터 새로이 제조함)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이후, 이를 실온으로 냉각시키고, 요오도-아세트아미드(40㎎, 0.216mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용액을 여과하고, Waters XTerra^® 분취용 MS C18 10μ 예비 칼럼(치수: 19㎜×10㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® Axia 5μ C18 (2) 칼럼(치수: 100㎜×30㎜)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 농도 구배는 물 중의 아세토니트릴 5 내지 95%로 30분 이내에 수행하였다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 4.6, 아세트산으로 조정함). 유속은 60㎖/분이고, 피크를 UV로 분획하였다. 다음 화합물을 수득하였다:

비스-아세트아미드화 라비린토펩틴 A1:

분획 7 및 8을 합하고, 동결 건조 후 목적하는 화합물 13.3㎎(25.2%)을 수득하였다. 생성물을 UV 분광법 및 질량 분석법(Bruker Daltonics MicroTof)에 의해 확인하였다.

RT_min = 5.09분(PDA; 실시예 8에서와 같은 LC 방법)

UV(λ_max): 218nm(sh), 280nm

ESI-MS(음성): [M-2H]^2- = 1093.9022

중성의 단일 동위원소의 실험적 질량[M] = 2189.819

C₉₆H₁₂₇N₂₅O₂₇S₄에 대한 중성의 단일 동위원소의 계산된 질량: 2189.822

분자식: C₉₆H₁₂₇N₂₅O₂₇S₄

화학적 분자량 = 2191.49

모노-아세트아미드화 라비린토펩틴 A1:

분획 10 및 11을 합하고, 동결 건조 후 목적하는 화합물 5.3㎎(10.3%)을 수득하였다. 생성물을 UV 분광법 및 질량 분석법(Bruker Daltonics MicroTof)에 의해 확인하였다.

RT_min = 5.31분(PDA; 실시예 8에서와 같은 LC 방법)

UV(λ_max): 217nm(sh), 280nm

ESI-MS(음성): [M-2H]^2- = 1065.390

중성의 단일 동위원소의 실험적 질량[M] = 2132.794

C₉₄H₁₂₄N₂₄O₂₆S₄에 대한 중성의 단일 동위원소의 계산된 질량: 2132.800

분자식: C₉₄H₁₂₄N₂₄O₂₆S₄

화학적 분자량 = 2134.44

실시예 16: Boc 보호된 라비린토펩틴 A1의 합성

디메틸포름아미드(3㎖) 중의 라비린토펩틴 A1(50㎎, 0.024mmol)의 용액에, 디-3급-부틸-디카보네이트(11㎎, 0.048mmol) 및 n-에틸디이소프로필아민(6㎎, 0.048mmol)을 실온에서 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이후, Waters XTerra^® 분취용 MS C18 10μ 예비 칼럼(치수: 19㎜×10㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® Axia 5μ C18 (2) 칼럼(치수: 100㎜×30㎜)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 농도 구배는 물 중의 아세토니트릴 5 내지 95%로 30분 이내에 수행하였다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 7.0). 유속은 60㎖/분이고, 피크를 UV로 분획하였다. 분획 4 내지 7을 합하고, 동결 건조 후 목적하는 화합물 21.4㎎(40.8%)을 수득하였다. 생성물을 UV 분광법 및 질량 분석법(Bruker Daltonics MicroTof)에 의해 확인하였다.

RT_min = 5.30분(PDA; 실시예 8에서와 같은 LC 방법)

UV(λ_max): 219nm(sh), 278nm

ESI-MS(음성): [M-2H]^2- = 1085.895

중성의 단일 동위원소의 실험적 질량[M] = 2173.805

C₉₇H₁₂₇N₂₃O₂₇S₄에 대한 중성의 단일 동위원소의 계산된 질량: 2173.815

분자식: C₉₇H₁₂₇N₂₃O₂₇S₄

화학적 분자량 = 2174.49

실시예 17: 라비린토펩틴 A1의 벤질 유도체

디메틸포름아미드(2㎖) 중의 라비린토펩틴 A1(50㎎, 0.024mmol)의 용액에, 디-3급-부틸-디카보네이트(10㎎, 0.046mmol) 및 n-에틸디이소프로필아민(7㎎, 0.054mmol)을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 라비린토펩틴 A1은 완전히 사라졌다. 벤질아민(6.8㎎, 0.063mmol) 및 n-프로필 포스폰산 무수물(T3P^® 50㎕, 0.072mmol, DMF 중의 50%)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 이후, Waters XTerra^® 분취용 MS C18 10μ 예비 칼럼(치수: 19㎜×10㎜)을 포함하는 Phenomenex Luna^® Axia 5μ C18 (2) 칼럼(치수: 100㎜×30㎜)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 농도 구배는 물 중의 아세토니트릴 5 내지 95%로 30분 이내에 수행하였다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 7.0). 유속은 60㎖/분이고, 피크를 UV(220nm)로 분획하였다. 다음 2개의 화합물을 수득하였다:

라비린토펩틴 A1의 모노-벤질 유도체:

분획 7 및 8을 합하고, 동결 건조 후 목적하는 화합물 10.4㎎(19.1%)을 수득하였다. 생성물을 UV 분광법 및 질량 분석법(Bruker Daltonics MicroTof)에 의해 확인하였다.

RT_min = 7.03분(PDA; 실시예 8에서와 같은 LC 방법)

UV(λ_max): 217nm(sh), 275nm

ESI-MS(음성): [M-2H]^2- = 1130.427

중성의 단일 동위원소의 실험적 질량[M] = 2262.868

C₁₀₄H₁₃₄N₂₄O₂₆S₄에 대한 중성의 단일 동위원소의 계산된 질량: 2262.878

분자식: C₁₀₄H₁₃₄N₂₄O₂₆S₄

화학적 분자량 = 2264.63

라비린토펩틴 A1의 비스-벤질 유도체:

분획 13 및 14를 합하고, 동결 건조 후 목적하는 화합물 9.9㎎(17.5%)을 수득하였다. 생성물을 UV 분광법 및 질량 분석법(Bruker Daltonics MicroTof)에 의해 확인하였다.

RT_min = 8.31분(PDA; 실시예 8에서와 같은 LC 방법)

UV(λ_max): 214nm(sh), 276nm

ESI-MS(양성): [M+2(NH₄)]²⁺ = 1194.002

중성의 단일 동위원소의 실험적 질량[M] = 2351.937

C₁₁₁H₁₄₁N₂₅O₂₅S₄에 대한 중성의 단일 동위원소의 계산된 질량: 2351.941

분자식: C₁₁₁H₁₄₁N₂₅O₂₅S₄

화학적 분자량 = 2353.77

실시예 18: 라비린토펩틴 A1의 N 말단에서의 아실화 반응

디메틸포름아미드(2㎖) 중의 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(CDMT, 5㎎, 0.028mmol)의 용액에, n-메틸모르폴린(8.6㎎, 0.085mmol)을 실온에서 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, n-헥산 카복실산(3.3㎎, 0.028mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반한 후, 라비린토펩틴 A1(50㎎, 0.024mmol)을 첨가한 후 실온에서 2시간 동안 교반하였다. Waters XBridge Shield^® C18 10μ 예비 칼럼(치수: 19㎜×10㎜)을 포함하는 Waters XBridge Shield^® 5μ C18 (2) 칼럼(치수: 100㎜×30㎜)을 사용하여 역상 HPLC로 정제하였다. 농도 구배는 물 중의 아세토니트릴 5 내지 95%로 30분 이내에 수행하였다(완충액: 0.1% 아세트산 암모늄, pH 7.0). 유속은 60㎖/분이고, 피크를 UV(220nm)로 분획하였다. 분획 39를 동결 건조 후 목적하는 화합물 2.0㎎(3.8%)을 수득하였다. 생성물을 UV 분광법 및 질량 분석법(Bruker Daltonics MicroTof)에 의해 확인하였다.

RT_min = 5.41분(PDA; 실시예 8에서와 같은 LC 방법)

UV(λ_max): 216nm(sh), 266nm

ESI-MS(음성): [M-2H]^2- = 1084.906

중성의 단일 동위원소의 실험적 질량[M] = 2171.827

C₉₈H₁₂₉N₂₃O₂₆S₄에 대한 중성의 단일 동위원소의 계산된 질량: 2171.836

분자식: C₉₈H₁₂₉N₂₃O₂₆S₄

화학적 분자량 = 2173.52.

실시예 19: 라비린토펩틴 및 유도체에 대한 항균 활성

최종 농도가 1㎎/㎖로 되도록 화합물을 10% MeOH를 함유하는 물에 용해시켰다. 생물학적 검정을 위해 멸균된 Nunc 플레이트(크기 24×24㎝)를 사용하였다. 하나의 플레이트에 대하여, 한천 200㎖를 사용하였다. 한천을 55℃로 오토클레이브한 후 냉각시키고, 시험 유기체의 배양 현탁액 2 내지 4㎖를 플레이팅하기 전에 첨가하였다. 각각의 플레이트에 직경 6㎜의 64 필터 플레이트를 첨가하였다. 각각의 필터에 시험 용액 20㎕를 첨가하고, 28℃ 또는 37℃에서 1 내지 3일 동안 배양하였다. 억제 구역(단위: ㎜)을 기록하였다. 방법의 상세한 설명은 문헌[참조: Bauer et al., Amer. J. Clin. Pathol. 1966, 45, 493-496; Muller & Melchinger, Methoden in der Mikrobiologie, Franckhsche Verlagshandlung, Stuttgart, 1964; Mueller & Hinton, Proc. Soc. Expt. Biol. Med., 1941, 48, 330-333]에 기재되어 있다.

실시예 20: 신경병성 통증 활성

라비린토펩틴 A1을 신경병성 통증의 SNI(spared nerve injury) 마우스 모델로 연구하여 촉각 이질통증에 대한 활성을 입증하였다. 전신 마취 하에, 성인 수컷 C57B6 마우스에서 좌골 신경의 2개의 주요 가지(중량: 22.8g +/- 0.35 SEM)를 묶고, 가로로 절단하고, 비복 신경을 온전하게 남겨두었다. 촉각 이질통증을 자동 폰 프로이 시험(von Frey test)으로 측정하였다: 덤프 바늘 스틱을 사용하여, 강도를 5g 이하로 증가시키는 압력 자극에 뒷발의 발바닥 피부를 노출시켰다. 동물이 뒷발 움츠림으로 반응하는 힘(단위: 그램)을 촉각 이질통증에 대한 판독으로서 사용하였다. 6시간에 걸쳐 신경 병변 7일 후 연구를 수행하고 24시간 후 추가로 측정하였다. 신경 가로 절단 후 2일 이내에, 촉각 이질통증은 완전히 발달하였고 2주 이상에 걸쳐 안정하게 남아 있었다. 화합물을 단일 적용(3㎎/㎏)으로 정맥내 투여하였다. 정맥내 적용을 위한 비히클로서 1:1:18(에탄올:솔루톨:인산염 완충 식염수) 비히클을 선택하였다.

뒷발 움츠림 역치(PWT) 측정은 유의한 치료 효과의 계산, 기준 시간(6시간)에 대한 AUC 계산 및 후속적인 이득률(%) 계산을 위해 사용되었다. 통계학적 분석을 위해, 같은 쪽 뒷발의 PWT 값을 2개의 방식에 사용하였다: 첫째, 특정 시간(24시간 이내) 동안 PWT 값에 기초한 2원 ANOVA로, 및 둘째, 변환되지 않은 델타 AUC 값 ｜AUC1-6시간｜에 기초한 1원 ANOVA로.

반복 측정에 의한 2원 분산분석(반복 인자: 시간, 분석 변수: PWT), 이어서 보상 분석[각각의 수준의 시간 인자에 대한 그룹 인자의 효과(Winer 분석), 분석 변수: PWT] 및 후속적인 각각의 수준의 시간 인자에 대한 치료 인자에 대한 Dunnett 시험(비히클 수준에 대한 2가지 측면 비교)은 각각의 화합물에 대한 정맥내 적용 후 1 내지 6시간 동안 비히클 그룹에서 매우 유의한 차이를 나타냈다. 델타 ｜AUC1-6시간｜ 값을 사용하는 1원 ANOVA는 p <0.0001의 p 값을 나타냈다. Dunnett 분석은 라비린토펩틴 A1에 대한 유의한 치료 효과를 제공하였다. 같은 쪽 비히클 그룹(이득률 0%)의 ｜AUC1-6시간｜ 값 및 모든 3개의 그룹(이득률 100% = 최대 가능 효과)의 반대 쪽의 모든 ｜AUC1-6시간｜ 값을 사용하여 치료의 이득률(%)을 계산하였다. 이러한 경계와 비교하여, 라비린토펩틴 A1은 이득률 95%를 달성하였다.

결론적으로, 화학식 I의 화합물은 신경병성 통증의 SNI 마우스 모델에서 촉각 이질통증을 유의하게 감소시킨다.

DSMZ

DSM06313

19910123

<110> Sanofi-Aventis <120> Highly bridged peptides from Actinomadura namibiensis <130> DE2008/027 <150> EP 08290324.6 <151> 2008-04-02 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ser1 bridged with Ser4 via ch2 Ser4 bridged with Ser1 via ch2 Ser4 bridged with Cys8 via S(O)m wherein m is 0, 1 or 2 Ser4 bridged with Ser4 via S(O)m wherein m is 0, 1 or 2 Cys9 optionally bridged with Cys20 via S-S Ser10 bridged with Ser13 via CH2 Ser13 bridged with Ser10 via CH2 Ser13 bridged with Cys19 via S(O)n wherein n is 0, 1 or 2 Cys19 bridged with Ser13 via S(O)n wherein n is 0, 1 or 2 Cys20 optionally bridged with Cys9 via S-S <400> 1 Ser Asn Ala Ser Val Trp Glu Cys Cys Ser Thr Gly Ser Trp Val Pro 1 5 10 15 Phe Thr Cys Cys 20 <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ala1 bridged with Ala4 via CH2 Ala4 bridged with Ala1 via CH2 Ala4 bridged with Ala8 via S(O)m wherein m is 0, 1 or 2 Ala8 bridged with Ala4 via S(O)m wherein m is 0, 1 or 2 Cys9 bridged with Cys18 via S-S Ala10 bridged with Ala13 via CH2 Ala13 bridged with Ala10 via CH2 ala13 bridged with Ala17 via S(O)n wherein n is 0, 1 or 2 Ala19 bridged with Ala13 via S(O)n wherein n is 0, 1 or 2 Cys18 optionally bridged with Cys9 via S-S <400> 2 Ala Asp Trp Ala Leu Trp Glu Ala Cys Ala Thr Gly Ala Leu Phe Ala 1 5 10 15 Ala Cys <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Ser1 bridged with Ser4 via CH2 Ser4 bridged with Ser1 via CH2 Ser4 bridged with Cys8 via S(O)m wherein m is 0, 1 or 2 Cys8 bridged with Ser4 via S(O)m wherein m is 0, 1 or 2 Ser10 bridged with Ser13 via CH2 Ser13 bridged with Ser10 via CH2 Ser13 bridged with Ser17 via S(O)n wherein n is 0, 1 or 2 Ser19 bridged with Ser13 via S(O)n wherein n is 0, 1 or 2 <400> 3 Ser Asp Trp Ser Leu Trp Glu Cys Cys Ser Thr Gly Ser Leu Phe Ala 1 5 10 15 Cys Cys <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Forward Primer for Labyrinthopeptin A2 <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> n is a, c, g, or t <400> 4 caggaaacag ctatgaccga ytggwsnytn tggg 34 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reversed Primer for Labyrinthopeptin A2 <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 tgtaaaacga cggccagtrc angangcraa narrc 35 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Actinomadura namibiensis <400> 6 agtgctgtag cacgggaa 18 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reversed Primer of Labyrinthopeptin A2 <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is a, c, g, or t <400> 7 rcarcangcr aanarrcttc c 21 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reversed Primer of Labyrinthopeptin A2 <400> 8 cacggtacct agactagtga ccaagtgcgc cggtc 35 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Actinomadura namibiensis <400> 9 cttcccgtgc tacagcactc cc 22 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Dig-labelled probe <400> 10 atggacctcg ccacgggctc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Dig-labelled probe <400> 11 cttcccgtgc tacagcactc cc 22 <210> 12 <211> 159 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> orf for Labyrinthopeptin A2 <400> 12 tgacgcccgc acaccgttcc accgatgaga ggtgacagtc ccatggcgtc gatcctggaa 60 ctccagaacc tggacgtcga gcacgcccgc ggcgagaacc gctccgactg gagcctgtgg 120 gagtgctgta gcacgggaag cctgttcgcc tgctgctga 159 <210> 13 <211> 117 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> structural gene of prepro-Labyrinthopeptin A2 followed by stop-colon TGA <400> 13 atggcgtcga tcctggaact ccagaacctg gacgtcgagc acgcccgcgg cgagaaccgc 60 tccgactgga gcctgtggga gtgctgtagc acgggaagcc tgttcgcctg ctgctga 117 <210> 14 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Prepro-Labyrinthopeptin A2 <400> 14 Met Ala Ser Ile Leu Glu Leu Gln Asn Leu Asp Val Glu His Ala Arg 1 5 10 15 Gly Glu Asn Arg Ser Asp Trp Ser Leu Trp Glu Cys Cys Ser Thr Gly 20 25 30 Ser Leu Phe Ala Cys Cys 35 <210> 15 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Pro-Labyrinthopeptin A2 <400> 15 Ser Asp Trp Ser Leu Trp Glu Cys Cys Ser Thr Gly Ser Leu Phe Ala 1 5 10 15 Cys Cys <210> 16 <211> 135 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> orf for Labyrinthopeptin A1 <400> 16 tgaacatcca ccatggcatc catccttgag ctccaggacc tggaggtcga gcgcgccagc 60 tcggccgccg acagcaacgc cagcgtctgg gagtgctgca gcacgggcag ctgggttccc 120 ttcacctgct gctga 135 <210> 17 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> structural gene of prepro-Labyrinthopeptin A1 followed by stop-colon TGA <400> 17 atggcatcca tccttgagct ccaggacctg gaggtcgagc gcgccagctc ggccgccgac 60 agcaacgcca gcgtctggga gtgctgcagc acgggcagct gggttccctt cacctgctgc 120 tga 123 <210> 18 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Prepro-Labyrinthopeptin A1 <400> 18 Met Ala Ser Ile Leu Glu Leu Gln Asp Leu Glu Val Glu Arg Ala Ser 1 5 10 15 Ser Ala Ala Asp Ser Asn Ala Ser Val Trp Glu Cys Cys Ser Thr Gly 20 25 30 Ser Trp Val Pro Phe Thr Cys Cys 35 40 <210> 19 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Pro-Labyrinthopeptin A1 <400> 19 Ser Asn Ala Ser Val Trp Glu Cys Cys Ser Thr Gly Ser Trp Val Pro 1 5 10 15 Phe Thr Cys Cys 20

Claims

임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물, 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비율의 혼합물, 또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염.
[화학식 I]

위의 화학식 I에서,
{A}는
로부터 선택된 그룹이고;
{B}는
로부터 선택된 그룹이고;
{C}는
로부터 선택된 그룹이고;
R₁은 R₁' 또는 그룹
[여기서, R₁'은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬이다]이고;
R₂는 OH, NH₂, NH-(C₁-C₆)알킬, NH-(C₁-C₄)알킬렌-페닐 또는 NH-(C₁-C₄)알킬렌-피리딜이고;
R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH(C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₆)알킬렌-C(O)N[(C₁-C₄)알킬]₂이거나, R₃ 및 R₄는 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하고;
R₅ 및 R₆은 서로 독립적으로 H 또는 OH이거나, R₅ 및 R₆은 함께 =O이고;
m 및 n은 서로 독립적으로 0, 1 또는 2이고;
단, {A}가
이고 {B}가
이고 {C}가
인 경우, R₃ 및 R₄는 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하지 않을 수 있다.
제1항에 있어서, {A}가
이고, {B}가
이고, {C}가
인 화학식 I의 화합물.
제1항에 있어서, {A}가
이고, {B}가
이고, {C}가
이고, R₁이 바람직하게는 그룹 R₁'인 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, R₁'이 H인 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, R₂가 OH인 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, R₃ 및 R₄가 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬 또는 (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂이거나, 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하는 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, R₃ 및 R₄가 H이거나, 이들이 결합된 S 원자와 함께 이황화 그룹 S-S를 형성하는 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, R₅ 및 R₆이 H 또는 OH(여기서, R₅가 OH인 경우 R₆은 H이고, R₅가 H인 경우 R₆은 OH이다)이거나, R₅ 및 R₆이 함께 =O인 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, R₅가 OH이고 R₆이 H이거나, R₅가 H이고 R₆이 OH인 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 II의 화합물임을 특징으로 하는 화학식 I의 화합물.
[화학식 II]

위의 화학식 II에서,
R₁은 R₁' 또는 그룹
[여기서, R₁'은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬, 바람직하게는 H이다]이다.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 III의 화합물임을 특징으로 하는 화학식 I의 화합물.
[화학식 III]

위의 화학식 III에서,
R₁은 R₁' 또는 그룹
[여기서, R₁'은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬, 바람직하게는 H이다]이고;
R₂는 OH, NH₂, NH-(C₁-C₆)-알킬, N[(C₁-C₆)-알킬]₂, NH-(C₁-C₄)-알킬렌-페닐 또는 NH-(C₁-C₄)-알킬렌-피리딜, 바람직하게는 H이고;
R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬 또는 (C₁-C₄)-알킬렌-C(O)NH₂이다.
제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 화학식 IV의 화합물임을 특징으로 하는 화학식 I의 화합물.
[화학식 IV]

위의 화학식 IV에서,
R₁은 H, C(O)-(C₁-C₆)알킬 또는 C(O)-O-(C₁-C₆)알킬이고;
R₂는 OH, NH₂, NH-(C₁-C₆)-알킬, N[(C₁-C₆)-알킬]₂, NH-(C₁-C₄)-알킬렌-페닐 또는 NH-(C₁-C₄)-알킬렌-피리딜이고;
R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬 또는 (C₁-C₄)-알킬렌-C(O)NH₂이다.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, m 및 n이 0이거나, m 및 n이 2이거나, m이 0이고 n이 2이거나, m이 2이고 n이 0인 화학식 I의 화합물.
제1항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, m 및 n이 0인 화학식 I의 화합물.
a) 하나 이상의 화학식 I의 화합물이 배양 배지에 축적될 때까지 적합한 조건 하에 상기 배양 배지에서 악티노마두라 나미비엔시스(Actinomadura namibiensis) 균주(DSM 6313), 또는 이의 변이체 및/또는 돌연변이체 중 하나를 발효시키는 단계;
b) 상기 배양 배지로부터 화학식 I의 화합물을 분리하는 단계; 및
c) 경우에 따라, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물을 유도체화하고/하거나, 경우에 따라, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물 또는 상기 단계 b)에서 분리된 화합물의 유도체를 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시키는 단계
를 포함하는, 제1항에 따른 화학식 I의 화합물의 제조방법.
제15항에 있어서, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물이 화학식 II의 화합물임을 특징으로 하는 방법.
[화학식 II]

위의 화학식 II에서,
m 및 n은 0이고;
R₁은 R₁' 또는 그룹
(여기서, R₁'은 H이다)이고;
R₂는 OH이다.
제15항에 있어서, 상기 단계 b)에서 분리된 화합물이 라비린토펩틴(Labyrinthopeptin) A2이고, 상기 단계 c)에서 상기 화합물이 화학식 IV의 화합물로 유도체화되는 방법.
[화학식 IV]

위의 화학식 IV에서,
m 및 n은 둘 다 0이고;
R₁은 H이고;
R₂는 OH이고;
R₃ 및 R₄는 서로 독립적으로 H, (C₁-C₆)알킬, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH₂, (C₁-C₆)알킬렌-C(O)NH(C₁-C₄)알킬 또는 (C₁-C₆)알킬렌-C(O)N[(C₁-C₄)알킬]₂이다.
세균 감염, 바이러스 감염 및/또는 통증 치료용 약제를 제조하기 위한, 제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
제1항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
서열번호 13에 나타낸 핵산 서열을 갖는 프리프로-라비린토펩틴 A2를 암호화하는 DNA.
서열번호 14에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 프리프로-라비린토펩틴 A2.
서열번호 15에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 프로-라비린토펩틴 A2.
서열번호 17에 나타낸 핵산 서열을 갖는 프리프로-라비린토펩틴 A1을 암호화하는 DNA.
서열번호 18에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 프리프로-라비린토펩틴 A1.
서열번호 19에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 프로-라비린토펩틴 A1.