KR20110013409A - 항체-펩티드 융합 상승체 - Google Patents

항체-펩티드 융합 상승체 Download PDF

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KR20110013409A
KR20110013409A KR1020107025849A KR20107025849A KR20110013409A KR 20110013409 A KR20110013409 A KR 20110013409A KR 1020107025849 A KR1020107025849 A KR 1020107025849A KR 20107025849 A KR20107025849 A KR 20107025849A KR 20110013409 A KR20110013409 A KR 20110013409A
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Abstract

동일한 질병의 발생 또는 진행 과정에 작용하는 항체와 펩티드가 융합되어 서로의 본래의 기능을 상승시키는 작용이 개시된다.

Description

항체-펩티드 융합 상승체{Antibody-peptide fused synergibody}
본 명세서에 개시된 기술은 융합 단백질에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 항체와 펩티드가 융합되어 상승 효과를 내는 융합 단백질에 관한 것이다.
최근 항체를 질병의 치료 목적으로 많이 사용하고 있다. 항체는 생체외에서도 그리고 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 이합체(dimer) 구조를 가지므로 항원에 대한 접착능(avidity)이 매우 높다.
한편, 항원에 대해 높은 결합 특이성을 가지는 펩티드는 치료 효능 또한 우수하여 항체와 더불어 치료법에 유용하게 사용될 수 있다. 그러나, 펩티드는 생체 내에서 매우 불안정한 물질이며 반감기가 짧기 때문에 의약품으로 사용되기 위해서는 안정성과 반감기를 높이기 위한 수단이 필요하다. 신생혈관형성(angiogenesis)은 이미 존재하는 혈관으로부터 새로운 혈관을 성장시키는 것과 관련된 생리학적 과정이다. 신생혈관형성은 상처의 치유와 같이 한 개체의 성장 및 발생에 있어 정상적인 과정이다. 그러나, 신생혈관형성은 또한 휴지 상태의 종양이 악성 상태로 전이함에 있어 기초적인 단계이다.
본 명세서에 개시된 것은, 융합 단백질을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 것은, 항체와 펩티드가 결합된 융합 단백질인 상승체(synergibody)를 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 일실시예에 따른 항체-펩티드 융합 상승체는, 두 종 이상의 단백질이 결합된 융합 단백질로서, 항체; 및 생물학적으로 활성인 펩티드를 포함하며, 상기 항체 및 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 동일한 질병의 발생 또는 진행 과정에 작용한다.
본 명세서에 개시된 일실시예에 따른 약제학적 조성물은, 동일한 질병의 발생 또는 진행 과정에 작용하는 항체와 펩티드의 융합 단백질을 유효성분으로서 포함 한다. 상기 항체와 펩티드의 융합 단백질은 항체; 및 생물학적으로 활성인 펩티드를 포함하며, 상기 항체 및 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 동일한 질병의 발생 또는 진행 과정에 작용한다.
본 명세서에 개시된 일실시예에 따른 항체-펩티드 융합 상승체의 제조방법은, 상기한 항체-펩티드 융합 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하는 단계; 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함 한다.
본 명세서에 개시된 항체-펩티드 융합 상승체는, 동일한 질병의 발생 또는 진행 과정에 작용하여 상승 효과를 나타내는 효과가 있다.
본 명세서에서 "융합 상승체"라 함은, 둘 이상의 단백질이 융합된 융합 단백질로서 융합되지 않은 개별 단백질의 각 기능이 융합에 의해 상승하는 특징을 갖는 융합 단백질을 가리킨다. 여기서 "상승"이라 함은, 개별 단백질의 본래 기능에 비교하여 융합 단백질의 기능이 개선된 것, 향상된 것, 우수해진 것, 높아진 것, 강해진 것 등을 의미하는 것이다. 본 명세서에 개시된 융합 상승체는, 그 상승의 정도가 어느 정도인지는 불문하고 본래 기능에 비해 조금이라도 상승되면 모두 포함하는 것이다.
본 명세서에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 모두 포함한다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 단편도 포함한다.
본 명세서에서 "펩티드"라 함은 펩티드 결합에 의해 아미노산들이 결합된 아미노산의 중합체를 의미하며, 아미노산의 길이는 특별히 제한되지 않는다.
본 명세서에서 "상보성-결정 부위 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 부위 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다.
본 명세서에서 "타겟"이라 함은, 항체 또는 펩티드가 결합되어 작용을 하는 대상, 즉 DNA, RNA, 단백질과 같은 생체분자를 의미할 수 있다. 또한 '타겟' 이라 함은 항체 또는 펩티드가 투여되는 궁극적인 목적, 즉 특정 질병, 또는 그 치료 및 예방을 의미할 수 있다. 예컨대, 타겟은 신생혈관형성(angiogenesis)일 수도 있고 암(cancer)일 수도 있다.
본 명세서에서 "생물학적으로 활성인"은, 체내에서 생물학적으로 작용하여 특정 기능을 수행하는 것을 의미한다. 예컨대, 체내에서 특정 단백질 또는 DNA와 같은 생분자와 결합하여 그 생분자의 작용을 촉진하거나 저해하는 것이 될 수 있다.
본 명세서에서 "연결된"은, 공유결합으로 연결된 것 뿐만 아니라, 비공유결합으로 연결된 것도 포함한다. 또한, 직접 연결된 것 뿐만 아니라 링커 등의 매개자를 통해 연결된 것도 포함한다.
암 조직의 신생혈관형성 과정을 보면, 먼저, 암 조직에서 신생혈관형성을 위해 암세포가 기존의 혈관을 선택하는 혈관공용(cooption)이 발생한다. 그런 다음, 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2, Ang-2) 경로에 의해 상기 공용된 기존의 혈관의 기능을 파괴시키는 혈관퇴화(vessel regression)가 일어난다. 기존 혈관의 퇴화로 인해 암 조직 내의 환경은 저산소(hypoxia) 환경이 되어 신생혈관이 형성될 수 있는 조건을 제공하게 된다. 이 조건 하에서 혈관내피세포성장인자(Vascular Endothelial Cell Growth Factor, VEGF)의 발현을 증가시켜 새로운 혈관이 생성된다.
안지오포이에틴은 신생혈관형성을 촉진하는 성장 인자이다. 안지오포이에틴에는 Ang-1, Ang-2, Ang-3 및 Ang-4 등이 알려져 있다. Ang-1 및 Ang-2는 성숙한 혈관의 형성에 필요하다. 그 중 Ang-2는 ANGPT2로도 알려져 있으며, ANGPT1 및 TIE2 둘 다에 대한 자연발생적 길항제(antagonist)이며 혈관 리모델링 부위에서만 발현된다.
혈관내피세포성장인자(Vascular Endothelial Cell Growth Factor, VEGF)는, 특히 혈소판-유도 성장인자(Platelet-derived growth factor)의 아류로서, 신생혈관형성과 관련된 중요한 신호 단백질이다.
본 발명은 항체와 펩티드의 장점만을 결합시킨 것에 그 핵심이 있다. 항체는 최근에 질병 치료제의 용도로 많이 사용되고 있다. 항체는 생체 외에서도 그리고 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 이합체(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다.
한편, 항원 결합능을 지니는 펩티드에 기초한 치료법 역시 펩티드의 높은 특이성과 우수한 치료 효능으로 인해 최근 각광받고 있다. 그러나, 펩티드는 매우 불안정하고 반감기가 짧은 단점이 있다. 본 발명의 일실시예에 따른 항체-펩티드 융합 상승체는 상기한 항체의 장점들과 상기한 펩티드의 장점들만을 결합시킨 것이다.
본 발명의 일실시예에 따른 상승체에 있어서, 생물학적으로 활성인 펩티드는 7개 내지 50개의 아미노산 개수로 구성될 수 있다. 아미노산이 50개를 초과하는 경우 융합되는 항체의 본래 기능을 방해할 수 있기 때문이며, 아미노산 개수가 7개 미만이면 항원에 대한 결합능(affinity)이 현저히 감소하기 때문이다. 상기 펩티드는 재조합 융합 방식에 의해 항체와 결합될 수 있다. 펩티드는 항체의 중쇄(heavy chain) 또는 경쇄(light chain)에 결합될 수 있다. 특히, 항체의 중쇄 C-말단에 결합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 일실시예에 따른 상승체에 있어서, 상기 펩티드와 상기 항체는 서로 다른 타겟에 작용하는 것으로 구성될 수 있다. 다시 말하면, 상승체 중 항체 부분이 어떤 타겟에 결합하는 경우, 펩티드 부분은 다른 타겟에 결합할 수 있다. 즉, 동시동소(同時同所)에서 두 개의 타겟에 작용할 수 있는 것이다. 따라서, 상기 상승체의 각각의 항체 부위와 펩티드 부위는 동일한 질병의 발생 또는 진행 과정에 작용하며, 그 작용에 시너지 효과를 만들어 낼 수 있다. 한편, 상승체의 항체부가 가지는 이합체 구조로 인해 펩티드 부위에도 동반 이합체 구조를 유도하도록 함으로써 전체 융합 단백질의 각 타겟에 대한 접착능이 매우 높은 동반 상승효과를 가지게 된다.
본 발명에 따른 상승체는 항체와 펩티드가 직접 결합되어 있는 것뿐만 아니라 링커에 의해 매개되어 있는 것도 포함된다. 항체를 코딩하는 유전자와 펩티드를 코딩하는 유전자 역시 사이에 링커 DNA 서열에 의해 매개되어 있는 것도 포함된다.
본 발명의 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 항체는 Ang-2에 대한 결합 활성을 갖는 항체, Ang-2를 저해하는 항체 또는 Ang-2에 결합하는 항체이고, 상기 펩티드는 VEGFR-2에 대한 결합 활성을 갖는 항체, VEGF와 VEGFR 사이의 결합을 저해하는 항체, VEGFR-2에 결합하는 항체 또는 VEGFR-2의 활성을 저해하는 펩티드이다.
본 명세서에서 개시된 Ang-2 저해 항체 중쇄(Heavy chain)의 각 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)의 아미노산 서열의 예를 들면 하기 표 1과 같다.
항체 명칭 중쇄 아미노산 서열
CDR1 CDR2 CDR3
SAITAng-2-1 DYGVS
(서열번호: 1)		 VIWGGGSTYYNSVLKS
(서열번호: 2)		 HEGSDAMDY
(서열번호: 3)
SAITAng-2-2 DYVIS
(서열번호: 4)		 EIYPGSGSTYYNEKFKG
(서열번호: 5)		 SRGDYYAMDY
(서열번호: 6)
SAITAng-2-3 SFGMH
(서열번호: 7)		 YISSDSSTIYYADTVKG
(서열번호: 8)		 EGGYDDYYAMDY
(서열번호: 9)
SAITAng-2-4 DYYIN
(서열번호: 10)		 EIYPGSGDTYYNEKFKG
(서열번호: 11)		 YGYKGVYFDYWGQS
(서열번호: 12)
본 명세서에서 개시된 Ang-2 저해 항체의 경쇄(light chain)의 각 CDR의 아미노산 서열의 예를 들면 하기 표 2와 같다.
항체 명칭 경쇄 아미노산 서열
CDR1 CDR2 CDR3
SAITAng-2-1 KASQNVGTNVA
(서열번호: 13)		 RHPTGTV
(서열번호: 14)		 SNITAIVDVRWRHQAGNQT
(서열번호: 15)
SAITAng-2-2 KASQDINNYIT
(서열번호: 16)		 YTSTLQP
(서열번호: 17)		 LQYDNLLTFGGGTKLEIK
(서열번호: 18)
SAITAng-2-3 LASQTIGTWLA
(서열번호: 19)		 AATSLAD
(서열번호: 20)		 QQLYSIPLTFGGGTKLEIK
(서열번호: 21)
SAITAng-2-4 SASSSVSSSYLH
(서열번호: 22)		 RTSNLAS
(서열번호: 23)		 QQWSGYPFTFGAGTKLELK
(서열번호: 24)
한편, 본 명세서에서 개시된 VEGFR-2 활성화를 블로킹하는 생물학적으로 활성인 펩티드의 아미노산 서열의 예를 들면 하기 표 3과 같다.
펩티드 명칭 아미노산 서열
DTN6VEGFR-2-1 TGSDDLCYTFPCMHY (서열번호: 25)
DTN8VEGFR-2-2 EAGKETCGYEWQYCPRP (서열번호: 26)
DTN9VEGFR-2-3 EAGAYWCKAWGLSPCLVT (서열번호: 27)
DTN10VEGFR-2-4 TGSGRMCDGSGPPTNCWFT (서열번호: 28)
DTN11VEGFR-2-5 PGSQGYCHLNMRYQWICDSE (서열번호: 29)
본 발명의 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한, 상기 항체는 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 또한, 항원 결합 단편도 포함한다.
본원에 기재된 항체 또는 생물학적으로 활성인 펩티드의 아미노산 서열 변형물(들)이 고려된다. 예를 들면, 이러한 항체 및 생물학적 활성인 펩티드의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 및 생물학적 활성인 펩티드의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드를 변화를 상기 항체 및 생물학적 활성인 펩티드 핵산에 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는, 예를 들면 항체 및 생물학적 활성인 펩티드의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및(또는) 잔기로의 삽입 및(또는) 잔기의 치환이 포함된다. 최종 작제물에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합도 가능한데, 단 최종 작제물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 상기 아미노산 변화는 또한, 항-Ang2 항체 및 생물학적 활성인 펩티드의 해독 후 과정을 변형시킬 수 있는데, 예를 들면 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.
돌연변이 유발에 바람직한 위치인, 항-Ang2 항체 및 생물학적 활성 펩티드의 특정 잔기 또는 영역을 동정하는데 유용한 방법이 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기서는, 표적 잔기 또는 잔기 그룹을 동정하고 (예를 들면, 하전된 잔기, 예를 들면 arg, asp, his, lys 및 glu), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킴으로써, 상기 아미노산과 Ang-2 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이어서, 이러한 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 부위들은, 추가의 또는 기타 변이체를 치환 부위에 또는 치환 부위 대신에 도입함으로써 정련된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되긴 하지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 소정의 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발을 수행하고, 발현된 항-Ang2 항체 또는 펩티드 변이체를 대상으로 하여, 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.
또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기로써 대체된, 항-Ang2 항체 또는 생물학적 활성 펩티드 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환적 돌연변이 유발에 가장 큰 관심을 끄는 부위에는 초가변 부위가 포함되지만, FR 변형도 또한 고려된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환부"란 표제 하에 표 4에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 4에서 "예시적 치환부"로 명명되거나 아미노산 부류를 참조하여 다음에 추가로 기재된 바와 같은 보다 실재적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝하게 된다.
원래 아미노산 예시적인 잔기 치환 바람직한 잔기 치환
Ala (A) val; leu; ile Val
Arg (R) lys; gln; asn Lys
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg Gln
Asp (D) glu; asn Glu
Cys (C) ser; ala Ser
Gln (Q) asn; glu Asn
Glu (E) asp; gln Asp
Gly (G) ala Ala
His (H) asn; gln; lys; arg Arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine Leu
Leu (L) norleucine; ile ; val; met; ala; phe Ile
Lys (K) arg; gln; asn Arg
Met (M) leu; phe; ile Leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr Tyr
Pro (P) ala Ala
Ser (S) thr Thr
Thr (T) ser Ser
Trp (W) tyr; phe Tyr
Tyr (Y) trp; phe ; thr; ser Phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine Leu
항체 또는 펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 항-Ang2 항체 또는 생물학적 활성 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 항체에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다 (특히, 상기 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
항체 또는 생물학적 활성 펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 항체에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 항체 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
항체로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
인간화된 항-Ang-2 항체를 코딩하는 분리된 핵산, 그 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포 및 그 항체를 생산하는 재조합 기술 또한 제공된다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체를 코딩하는 핵산이 분리되어 추가 클로닝(DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 안으로 삽입된다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 종래 절차들(예컨대, 항체의 헤비 및 라이트 체인을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 분리되고 시퀀싱된다. 많은 벡터들이 사용 가능하다. 벡터의 구성요소들로는 이에 한정되지는 않지만, 통상 신호 서열, 복제 오리진, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다.
여기에서 벡터 내에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위해 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 효모 또는 진핵 세포이다.
숙주 세포는 상기 언급된 항-Ang-2 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되어, 프로모터를 유도하고, 형질전환체를 선별하거나 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기에 적합하도록 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다.
본 발명의 일실시예에 따른 상승체의 제조방법은 다음과 같이 수행될 수 있다:
1. 항체의 제조 및 스크리닝
항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, 항-Ang-2 항체는 마우스 모노클로날 항체를 이용해서 Schwaber 등의 논문에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang-2와의 결합능에 기초하여 개별 모노클로날 항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 모노클로날 항체 멤버들에 대해 Ang-2에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.
최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제외한 나머지 부분을 인간의 면역글로블린 G1(Immunoglobulin G1, IgG1)으로 치환된 키메릭 항체화될 수 있다. 키메릭 항체화 공정은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예컨대 공지된 특허(EP0355068, EP0363712, EP0491351)에 개시되어 있는 방법에 의해 키메릭 항체화될 수 있다. 키메릭 항체는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다.
키메릭 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체를 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다 (Almagro, J. C. and Fransson, J., "Humanization of antibodies," Frontiers in Bioscience, 13(2008), 1619-1633).
2. 펩티드의 스크리닝
펩티드는 예컨대, 공지된 파아지 라이브러리로부터 스크리닝될 수 있다. 예컨대, VEGFR-2로 코팅된 비드에 파아지 라이브러리를 가하여 VEGFR-2에 결합하는 파아지를 선별하고 선별된 파아지로부터 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 클로닝하여 아미노산 서열을 얻을 수 있다.
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 VEGFR-2와의 결합능에 기초하여 개별 펩티드를 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA와 같은 분석 및 세포-기반 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다.
3. 융합 단백질 상승체의 제조
선별된 항체를 코딩하는 DNA 서열과 선별된 펩티드를 코딩하는 DNA 서열이 연결되어 있는 유전자를 재조합 DNA 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 얻어진 재조합 DNA 서열을 벡터에 삽입한다. 상기 벡터를 숙주 세포에 도입시킨 후 세포를 배양하여 융합 단백질을 제조할 수 있다.
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang-2와의 결합능 및 VEGFR-2와의 결합능에 기초하여 개별 융합 단백질 상승체가 동시에 두 가지 타겟에 결합능을 가지는가에 대해 검정할 수 있다. 경쟁적 ELISA와 같은 방법을 통해 결합체들에 대해 분자적 상호작용 분석 또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 그 작용에 시너지 효과를 검정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따른 약제학적 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 융합 단백질을 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 안정화제 등과 함께 혼합하여, 수용액, 동결건조 또는 다른 건조 조제물의 저장성 있는 형태로 제조될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 안정화제는 적용되는 투여량 및 농도에서 안전하여야 하며, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 버퍼; 아스코르빈산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; (옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 네소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸)과 같은 보존제; 저분자량의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글라이신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 단당류, 다당류 및 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이팅제를 포함한다.
본 명세서에서 언급하는 조제물은 치료에 필요한 경우 하나 이상의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 활성 성분들끼리 서로의 활성에 역작용하지 않는 것이 바람직하다. 상기 보조적 활성 성분은 원하는 목적에 유효한 양으로 본 발명에 의한 약제학적 조성물에 존재할 수 있다.
활성 성분은, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중에, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))에 게시되어 있다. 생체내 투여에 사용되는 약물은 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 수행된다. 한편, 서방형 제제도 제조될 수 있다. 서방형 제제의 적합한 예에는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐과 같은 성형품 형태이다. 서방형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔류(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드류(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 LUPRON DEPOT(상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주입가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하내, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 장기간의 연속 관주와 같은 공지된 방법 의해 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료되는 질환의 유형, 심각성 및 질환의 진행 과정, 투여되는 약제학적 조성물이 예방 목적인지 치료 목적인지, 이전의 치료법, 환자의 임상 병력 및 약물에 대한 반응, 및 재량 및 주치의에 따라 달라질 것이다. 이 약물은 일시에 또는 일련의 치료를 통해 환자에 적합하게 투여된다. 예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1㎍/kg 내지 20mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 15mg/kg)의 항체가 1회 이상의 분리된 투여 또는 연속 관주에 의한 환자에의 투여에 대한 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량은 상기 언급한 인자에 의존하여 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 이상이다. 증상에 따라 며칠 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 원하는 질환 징후가 억제될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
실시예
<실시예 1: Ang-2 저해 항체의 제조 및 활성 검정>
1. 항-Ang-2 마우스 항체 제조
항-Ang-2 항체는 BALB/c 마우스(5주령, 암컷)에 인간 제대정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)로부터 분비되는 Ang-2 단백질을 투여하여 인위적으로 면역반응을 유도한 후 Schwaber 등의 논문에 기재된 공지된 방법에 의해 개별 항체를 생산하는 하이브리도마들을 제조하였다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447). 상기 논문 기재 전체가 여기에 참조로서 통합된다.
2. 항-Ang-2 항체 생산 하이브리도마(Hybridoma) 선별 및 항체 정제
상기 얻어진 개별 항체 생산 하이브리도마들로부터 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang-2와의 결합능에 기초하여 19개의 母 하이브리도마로부터 분화시킨 1,824개 중 18개의 항-Ang-2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마(3A5F, 6G2F, 15G1F, 17B1F, 21A3F, 25C2F, 28H5F, 30H3F, 1B2F, 8E4F, 16B1F, 22E9F, 23A4F, 24D5F, 26E4F, 27H1F, 29E1F, 31F4F)를 선별하였다. 그런 다음 각각의 하이브리도마를 DMEM (Dulbeco"s Modified Eagle"s Medium)에서 배양한 후 배양액을 모아 프로테인 G-친화성 크로마토그래피법으로 각각의 하이브리도마에서 생산되는 항-Ang-2 모노클로날 항체를 정제하였다.
3. Ang-2:Tie-2 중화(neutralization) ELISA (경쟁적 ELISA(Competitive ELISA))
결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 50 μg/ml 농도의 우혈청알부민(Bovine Serum Albumin, BSA)이 포함된 DMEM 배양액에 녹여진 인간 Tie-2의 수용성 세포외(extracellular) 부위와 인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hTie2-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 이때 코팅된 hTie2-Fc 농도는, 1nM 농도의 재조합 hAng-2(인간 Ang-2에 his tag이 붙어 있는 재조합 단백질; R&D Systems)에 결합하는 최대 결합농도의 75%에 준하는 농도로 하였다. 그런 다음, 0.1% Tween-20이 포함된 PBS (Phosphate Buffer Saline)로 플레이트를 5회 씻은 후, 5% BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. Ang-2:Tie-2 neutralization ELISA를 위해 각각의 항-Ang-2 항체를 1%의 BSA와 1nM의 hAng-2가 함유된 PBS로 100nM로부터 4배씩 희석시켜 6.1pM 농도까지 보정하였다. 100μl의 항체/hAng-2 용액을 각각의 웰에 넣은 후, 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 0.1%의 Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, 항-His 항체 (GE Healthcare)를 1%의 BSA가 함유된 PBS로 1:3,000 비율로 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 그런 다음, 플레이트 각각의 웰에 1%의 BSA가 함유된 PBS로 1:10,000 비율로 희석시킨 100 μl의 Goat anti-mouse-IgG-HRP (Pierce)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.1%의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 플레이트 각 웰에 100 μl의 TMB 기질 (SIGMA)을 첨가하여 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H2SO4 용액 50μl로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통해 Ang-2:Tie-2의 결합력에 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구함으로써 항-Ang-2 항체가 Ang-2와 Tie-2간의 결합력을 중화(neutralization )시킬 수 있음을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 5와 같다.
항체 명칭 Ang-2:Tie-2 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
관련성 없는 대조구 >100
SAITAng-2-1 0.764
SAITAng-2-2 1.859
SAITAng-2-3 0.822
SAITAng-2-4 1.012
4. 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 방식을 이용한 항원 친화도 (Kd values) 측정
Ang-2 항원에 대한 정확한 친화도를 측정하기 위하여 BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한 SPR 방식으로 항원 친화도를 측정하였다. 20ug/ml 농도의 재조합 hAng-2(R&D Systems)을 pH4.5 아세테이트[acetate] 용액과 amine coupling kit(GE Healthcare)를 이용하여 센서칩 CM5(GE Healthcare)에 고정화 시켰다. 상기 2에서 얻어진 항체를 100nM부터 2배 희석하는 방식으로 0.78125nM까지 8개 농도로 희석 시킨 후 각각을 센서칩에 고정화된 항원과 결합 및 해리(pH 2.2 글리신-HCl 용액 사용)시키며 항원-항체 친화도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6과 같다.
항체 명칭 온 레이트(On rate) (1/Ms) 오프 레이트(Off Rate) (1/s) 친화도(Affinity) (Kd, nM)
SAITAng-2-1 6.135 X 105 2.901 X 10-4 0.473
SAITAng-2-2 4.332 X 105 4.769 X 10-4 1.101
SAITAng-2-3 5.012 X 105 3.023 X 10-4 0.603
SAITAng-2-4 5.121 X 105 4.769 X 10-4 0.931
5. 항-Ang-2 마우스 항체 유전자 클로닝
상기 2에서 얻어진 각각의 항체생산 하이브리도마(2x106 세포)로부터 RiboPureTM Kit (Ambion, cat# AM1924)를 이용하여 전체 RNA를 얻었다. 그런 다음, 이를 주형(template)으로 하여 Protoscript® First Strand cDNA Synthesis Kit(New England Biolab)로 1차 단일가닥 cDNA를 합성하였다. 이후, Mouse Ig-Primer Set(Novagen)를 이용하여 써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 하기 프로그램을 가동시켜 각 하이브리도마에서 생산되는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 부위(variable region) 유전자 서열만 증폭시켰다: 94℃에서 5분간; [94℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 35 사이클; 72℃에서 6분간; 4℃로 냉각. 각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)으로 세정하였다.
상기 확보된 PCR 결과물들을 pGEM-T Easy(Promega)에 클로닝한 후 공시된 방법으로 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하였다. 그 결과 표 1과 2에 나타난 CDR 서열들을 확보할 수 있었다.
6. 키메릭 항체의 발현 및 정제
상기 5에서 얻어진 중쇄와 경쇄의 가변 부위를 각각 서로 다른 벡터에 클로닝시켰다. 중쇄 가변 부위는 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter)를 가지고 있으며 인간 IgG1의 불변영역(constant region)과 Fc 영역을 포함하는 벡터에 클로닝하였다. 경쇄는 CMV 프로모터를 가지고 있으며, 인간 IgG1의 불변 영역을 포함하고 있는 벡터에 클로닝을 하였다. 구체적으로 중쇄와 그를 포함하는 벡터는 SfiI(Roche)와 NheI(Roche)의 제한효소(restriction enzyme)를 처리하고, 경쇄와 그를 포함하는 벡터는 SfiI(Roche)과 BglII(Roche)의 제한 효소를 처리한 후, T4 DNA Ligase(New England Biolab)로 라이게이션(ligation)을 시켜 원하는 가변 부위가 포함된 키메릭 항체 발현용 중쇄 벡터와 경쇄 벡터를 제조하였다. 이렇게 하여 얻어진 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터를 HEK-293E 세포 (한국생명공학연구원, 분양)에 같이 트랜스펙션(transfection)시켰다. 상기 세포를 혈청(serum)을 넣지 않은 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Invitrogen)배지에서 배양 시키면서 3일 간격으로 총 4번 동안 배양액을 갈아주었다. 상기 배양을 통해 얻어진 배양액은 서열번호 44, 46, 48 또는 50 (중쇄) 및 서열번호 45, 47, 49 또는 51, 및 표 1 및 2의 CDR의 가변 부위의 서열을 갖는 중쇄와 경쇄로 구성된 키메릭 항체를 포함하였다. 상기 발현된 키메릭 항체가 함유된 배양액을 원심분리를 통하여 잔류 하는 세포 및 불순물을 제거한 후 항체 Fc 영역과 강한 친화력을 갖는 Protein A를 이용한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법을 통해 항체를 정제하였다.
7. 세포-기반 기능성 분석(cell-based functional assay)
키메릭 항체는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 본 발명에서는 BD BioCoat™ Angiogenesis System-Endothelial Cell Tube Formation (BD Biosciences)을 이용하였다. 영하 20℃에 보관된 BD Matrigel Matrix로 코팅된 BD Falcon 96-well Black/Clear 플레이트를 4℃에서 6시간 동안 천천히 녹인 후, 무균의 클린벤치 상에서 플레이트의 매트 커버를 제거하였다. 이후 37℃, 5% CO2 조건에서 30분간 Matrigel™ Matrix가 폴리머를 형성하도록 정치하였다. 페트리디쉬 상에서 70-80% 세포밀도(confluence)로 10% 우태혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 EGM-2 MV(Lonza) 배지에서 배양한 HUVEC에 0.5% 트립신(Trypsin-EDTA, Gibco)을 처리하여 부유화시킨 후, 이를 다시 10% 우태혈청이 있는 배양액에 세포농도가 4x105 세포/ml이 되도록 재현탁시켰다. 이때, 상기 5에서 발현 및 정제한 각각의 항-Ang-2 키메릭 항체 5μM씩을 함께 넣어 재현탁시켜 주었다. 그런 다음 이를 각 50 μl(약 2x104 세포)씩을 플레이트의 각 웰에 분주하고 37℃, 5% CO2 조건에서 18시간 배양하였다. 그런 다음, 배양액을 제거하고 BD Matrigel™ Matrix 상에 형성된 세포의 튜브(tube)가 손상되지 않도록 조심하면서 100μl의 Hanks' balanced salt solution(HBSS, Invitrogen)으로 각 웰을 2회 씻은 후, HBSS에 8 μg/ml의 농도로 녹인 calcein AM(BD sciences) 용액 50μl씩을 각 웰에 첨가하였다. 이렇게 처리한 플레이트를 37℃, 5% CO2 조건에서 약 30분간 반응시킨 후, 각 웰의 calcein AM(BD sciences) 용액을 제거하고, 다시 HBSS로 2회 씻어 주었다. 마지막으로 BD Matrigel™ Matrix 상에 형성된 HUVEC의 전체 튜브의 길이를 형광현미경 상에서 이미지를 얻고, 이를 MetaMorphㄾ software (Universal Imaging Corporation™, http://www.moleculardevices.com)로 분석하였다. 그 결과는 하기 표 7과 같다.
항체 명칭 HUVEC(2x104 세포) 전체 튜브의 길이(픽셀)
관련성 없는 대조구 12,227 ± 1,232
SAITAng-2-1 (키메릭) 5,139 ± 832
SAITAng-2-2 (키메릭) 7,721 ± 773
SAITAng-2-3 (키메릭) 5,012 ± 984
SAITAng-2-4 (키메릭) 6,117 ± 1,043
<실시예 2: VEGFR-2에 결합하는 펩티드의 스크리닝 및 활성검정>
VEGFR-2 결합 펩티드는 랜덤 펩티드 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선별될 수 있다. 펩티드 파아지 디스플레이는 다음과 같은 과정을 통해 수행되었다:
1. VEGFR-2 코팅된 자성 비드의 제조
1A. 자성 비드 상에의 VEGFR-2 고정화
비-특이적 용출(하기 섹션 2D 참조)을 위해서, 비오틴화된 재조합 VEGFR-2 단백질(인간 VEGFR-2의 수용성 extracellular 부위와 인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질; R&D Systems)을 스트렙타비딘 다이나비드(Streptavidin Dynabeads, Dynal) 상에 고정시켰다. 1차 선별은 모두 3회 라운드 과정을 수행하였으며, 제 1 라운드 과정을 수행하기 위한 비오틴화된 재조합 VEGFR-2 단백질 농도는, 비드 스톡 100ml 당 4mg으로 하였다.
한편, 항원(VEGFR-2)-특이적 용출(하기 섹션 2E 참조)을 위한 제 2 라운드 과정을 수행하기 위해서, 비오틴화된 재조합 VEGFR-2 단백질을 비드 스톡 50ml 당 2mg의 농도로 스트렙타비딘 다이나비드 상에 고정시켰다. 제 2 라운드에서는 비드에 대한 단백질의 코팅 농도를 비드 스톡 50ml 당 비오틴화된 VEGFR-2 단백질 1mg까지 감소시켰다(하기 섹션 2E 참조). 자석을 이용하여 비드를 튜브의 한쪽면으로 유도한 후 피펫팅으로 꺼냈다. 그리고 비드를 포스페이트 버퍼 살린(Phosphate buffer saline, PBS)으로 5회 세척하고 PBS에서 재현탁시켰다.
비오틴화된 VEGFR-2 단백질의 코팅방법으로는, 상기 농도로 조정된 기-세척된 비드에 단백질을 첨가시키고 상온에서 1시간 동안 회전하면서 인큐베이션시킨 후 4℃에서 몇 시간 내지 밤새 회전시키면서 인큐베이션하는 방법을 취하였다. 이후, VEGFR-2 단백질이 코팅된 비드에 최종 농도 1%가 되도록 BSA를 첨가한 후 4℃에서 밤새 회전시키며 인큐베이션시켜 더 이상의 반응을 블로킹시켰으며, 그 결과로 얻어진 VEGFR-2가 코팅된 비드를 PBS로 5회 세척하고 이후의 선별 라운드에 이용하였다.
1B. 네거티브 선별 비드 준비
네거티브 선별을 위해서 부가적인 비드를 준비하였다. 비오틴화된 VEGFR-2의 인큐베이션 단계를 생략한 것을 제외하고는 상기 1A와 같은 절차를 거쳐 각 패닝 조건에 대해 500μl의 비드 스톡을 준비하였다. 마지막 세척 단계에서 비드를 5개의 100μl 분획으로 나누었다.
2. VEFGR-2 결합 파아지의 선별
2A. 모두 7종(표 8)의 펩티드 파아지 디스플레이 라이브러리 (Peptide phage display library, Dyax Corp)를 사용하여 VEGFR-2 결합 파아지를 선별하였다.
라이브러리 Diversity
TN6/VII 1.2 x 109 독립 형질전환체
TN7/IV 2.3 x 109 독립 형질전환체
TN8/IX 5.0 x 109 독립 형질전환체
TN9/IV 3.2 x 109 독립 형질전환체
TN10/X 2.0 x 109 독립 형질전환체
TN11/I 2.7 x 109 독립 형질전환체
TN12/I 1.4 x 109 독립 형질전환체
각 라이브러리로 하기 2D의 비-특이적 용출 및 하기 2E의 항원(VEGFR-2)-특이적 용출을 실시하였다. 결과적으로, VEFGR-2 결합 파아지의 선별을 위해 총 6개의 다른 패닝 조건들이 수행되었다. 제 1차 선별에서는 모든 세 가지의 라이브러리에 대하여 1 라운드에서 얻어진 파아지에 대해서는 비-특이적 방식으로만 파아지를 용출한 후 이어지는 다음의 선별 라운드에 넣었다. 항원(VEGFR-2)-특이적 파아지 용출은 2 및 3 라운드에서 사용되었다(섹션 2E 참조).
2B. 네거티브 선별
각 패닝 컨디션에 대해 라이브러리는 약 100개의 랜덤 라이브러리 등가물(TN6/VII은 1.2 x 1011 pfu, TN7/IV는 2.3 x 1011 pfu, TN8/IX은 5X1011 pfu, TN9/IV는 3.2 x 1011 pfu, TN10/X은 2.0 x 1011 pfu, TN11/I은 2.7 x 1011 pfu, TN12/I는 1.4X1011 pfu)을 각각의 스톡으로부터 분취하여 PBS-T(0.05% Tween-20을 갖는 PBS) 400μl에 희석하였다. 희석된 각 400μl 라이브러리 스톡을 상기 섹션 1B의 네거티브 선별을 위해 준비된 비드에 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 회전시키면서 10분간 인큐베이션시켰다. 자석을 이용하여 비드를 고정시키고 파아지 상층액을 덜어내어 모은 후 100μl PBS-T을 첨가하여 파아지 상층액을 더 모은다. 이러한 방식으로 네거티브 선별 단계를 5회 더 수행하였다.
2C. VEGFR-2 단백질 코팅된 비드를 이용한 파아지 선별
상기 섹션 1B와 같이 네거티브 선별 단계를 수행한 후 파아지 상층액을 상기 섹션 1A에서와 같이 준비된 VEGFR-2 코팅 비드에 첨가하였다. 그 혼합물을 실온에서 1-2시간 회전하면서 인큐베이션시켜, 파아지가 타겟 단백질에 결합되도록 하였다. 상층액을 제거한 후 비드를 PBS-T로 약 10회 세척한 다음 다시 PBS로 2회 세척하였다.
2D. 비-특이적 파아지 용출
상기 섹션 2C의 최종 세척액을 빼낸 후 1ml의 Min A 염 용액(60mM K2HPO4, 33mM KH2PO4, 7.6mM (NH4)2SO4 및 1.7mM 구연산 나트륨)을 상기 비드에 첨가하여 파아지를 용출하였다. 그런 다음 상기 비드 혼합물을 감염을 위한 농축된 박테리아 샘플에 직접 첨가하였다(하기 섹션 3A 및 3B).
2E. 항원(VEGFR-2)-특이적 용출
제 2 라운드를 위해 상기 섹션 2C의 마지막 세척 단계 후에, 각 컨디션 당 30분간 인큐베이션하면서, 100ml의 1pM, 0.1nM 및 10nM 재조합 VEGFR-2 단백질을 순차적으로 첨가하여 자성 비드로부터 결합된 파아지를 용출하였다. 비드에 남은 파아지는 비-특이적으로 용출하였다(섹션 2D). 10nM 재조합 VEGFR-2 단백질로부터 용출된 파아지와 비-특이적 용출물을 합하여 바로 3차 선별에 사용하였다(하기 섹션 4).
제 3 라운드를 위해 섹션 2C의 최종 세척 단계 후에, 각 컨디션 당 30분간 인큐베이션하면서, 100μl의 2% BSA, 1nM 재조합 VEGFR-2 단백질 및 10nM 재조합 VEGFR-2 단백질을 순차적으로 첨가하여 자성 비드로부터 결합된 파아지를 용출하였다. 또한, 파아지를 로테이터 상에서 10분간 100mM 트리에틸아민 용액(Sigma) 1ml로 용출하였다. 파아지 함유 용액의 pH를 0.1M Tris-HCl 0.5ml로 중화시켰다(pH 7.5). 100mM 트리에틸아민 용액으로 최종 용출시킨 후에 남겨진 파아지를 비-특이적으로 용출시켰다(섹션 2D).
3. 파아지 증폭
3A. 플레이팅 셀의 준비
대장균(XL-1 Blue MRF') 배양물을 12.5mg/ml 테트라사이클린을 함유하는 LB 배지에서 OD600 값이 0.5가 될 때까지 성장시켰다. 각 패닝 컨디션 당 20ml의 배양액을 빙냉시킨 후 원심분리하였다. 박테리아 펠릿을 1ml의 Min A 염 용액에 재현탁하였다.
3B. 형질도입
각각 다른 방법으로 용출된 각 혼합물들(섹션 2D 및 2E)을 농축된 박테리아 샘플(섹션 3A)에 첨가하고 37℃에서 15분간 인큐베이션시켰다. 2ml의 NZCYM 배지(2xNZCYM, 50μg/ml 암피실린)을 각 혼합물에 첨가한 후 37℃에서 15분간 인큐베이션하였다. 그 결과 얻어진 약 4ml 용액을 50μg/ml 암피실린을 함유한 NZCYM 한천 배지 상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
3C. 파아지 수확
상기 섹션 3B에서 NZCYM 한천 배지 플레이트를 밤새 배양하여 박테리아/파아지 혼합물인 플라크(plaque)을 형성시켰다. 각각의 플페이트에 35ml의 LB 배지를 넣어 헹구고 그 액을 모았다. 한천 배지 플레이트에 부가적인 35ml의 LB 배지로 상기 과정을 반복하였다. 그 결과 얻어진 LB 배지 중의 박테리아/파아지 혼합물을 원심분리하여 박테리아를 펠릿으로 분리하였다. 파아지 상층액 50ml를 후레쉬 튜브로 옮기고 12.5ml의 PEG 용액(20% Polyethylene glycol 8000, 3.5M 아세트산 암모늄)을 첨가하였다. 얼음 상에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후 침전된 파아지를 원심분리하고 6ml의 파아지 현탁 버퍼(250mM NaCl, 100mM Tris pH 8, 1mM EDTA)로 재현탁하였다. 남겨진 박테리아를 원심분리로 제거하고 1.5ml의 PEG 용액을 다시 첨가하여 파아지를 침전시켰다. 원심분리 단계 후에 파아지 펠릿을 400μl의 PBS에 재현탁하여 얻어진 용액을 최종 원심분리하여 남겨진 박테리아 찌꺼기를 제거하였다. 그 결과 얻어진 파아지 제조물을 표준 플라크 형성 분석법(Molecular Cloning, Maniatis et al 3rd Edition)으로 적정하였다.
4. 2회의 추가 선별 및 증폭
2차 선별에서는, 앞선 1차 선별(섹션 3C)로부터 얻어진 증폭된 파아지(1010 pfu)를 인풋 파아지로 사용하여 재선별 및 증폭시키는 과정을 수행하였다(섹션 2 및 3). 한편, 상기 섹션 2E에서 언급한 바와 같이 10nM 재조합 VEGFR-2 단백질로부터 용출된 파아지와 비-특이적 용출물을 합하여 바로 3차 선별에 사용하였으며, 상기 2차 선별로부터 얻어진 증폭된 파아지(109 pfu)를 인풋 파아지로 사용하여 3차 선별 및 증폭을 수행하였다(섹션 2 및 3). 3차 선별의 용출 단계(섹션 2D, 2E)를 완료한 후에, 용출된 파아지의 작은 분획을 플라크 형성 분석에서와 같이 플레이팅하였다(섹션 3C). 개별 플라크를 집어서 각 웰에 Tris-EDTA(TE) 버퍼 100μl를 함유한 96웰 마이크로타이터 플레이트에 넣었다. 이렇게 얻은 마스터 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 파아지가 TE 버퍼로 용출되도록 하였다.
5. 클론 분석(파아지 ELISA 및 DNA 염기서열분석)
파아지 클론은 파아지 ELISA 및 공시된 시퀀싱 방법으로 분석하였다. 이러한 두 분석으로부터 조합된 결과를 토대로 시퀀스들을 랭크하였다. 그 결과 표 3에 나타난 아미노산 서열들을 확보할 수 있었다.
5A. 파아지 ELISA
XL-1 Blue MRF' 배양물을 OD600 값이 0.5에 도달할 때까지 성장시켰다. 이 배양물 30μl를 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰로 분취하였다. 용출된 파아지(섹션 4) 10μl를 각 웰에 넣어 상온에서 15분간 박테리아를 감염시켰다. 12.5mg/ml의 테트라사이클린 및 50mg/ml의 암피실린을 함유한 LB 배지 약 100μl를 각 웰에 첨가하였다. 그 다음, 마이크로타이터 플레이트를 37℃에서 밤새 교반하면서 인큐베이션하였다.
한편, 재조합 VEGFR-2 단백질(PBS 중 1μg/ml)이 4℃에서 밤새 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트(Nunc) 상에 코팅되도록 하였다. 대조군으로서 순수한 스트렙타비딘(PBS 중 2μg/ml)을 별도의 MaxiSorp™ 플레이트 상에 코팅시켰다. 다음날, 단백질 코팅된 MaxiSorp™ 플레이트의 액체를 제거하고 각 웰을 5% 탈지유 용액으로 4℃에서 밤새 블록시켰다. 탈지유 용액을 제거한 후 웰을 PBS-T 용액으로 3회 세척하였으며, 마지막 세척 단계 후에 약 50ml의 4% 탈지분유를 함유한 PBS-T를 단백질 코팅된 MaxiSorp™ 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.
하룻밤 동안 배양된 96웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰로부터 각각의 배양액 약 50μl를 VEGFR-2 코팅된 플레이트와 대조군인 스트렙타비딘이 코팅된 플레이트의 대응 웰에 첨가하였다. 각 웰당 100μl의 혼합물이 든 두 종의 플레이트를 상온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. MaxiSorp™ 플레이트로부터 액체를 제거하고 웰을 PBS-T로 3회 세척하였다. HRP-접합된 항-M13 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 약 1:7,500으로 희석하고 희석된 용액 100μl를 MaxiSorp™ 플레이트의 각 웰에 첨가한 후 상온에서 1시간 인큐베이션시켰다. 액체를 제거하고 웰을 PBS-T로 5회 세척한 후 TMB 기질(3,3', 5, 5'-tetramethyl-benzidine, Sigma) 100μl를 각 웰에 첨가하여 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H2SO4 용액 50μl로 반응을 중지시켰으며, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다.
5B. 파아지 클론의 DNA 염기서열분석
각 파아지 클론에 대해 PCR 방법으로 DNA 염기서열분석 주형을 준비하였다. 하기 정방향/역방향 프라이머 (Forward/Reverse primer) 쌍을 사용하여 약 90여 개의 뉴클레오티드로 구성된 단편을 증폭시켰다(표 9):
프라이머 DNA 염기서열 비고
TN6 정방향 프라이머 서열번호 30: 5'-GGA GGA AGC GGC CGC GGT ACT GGC AGC-3' R; G 또는 A
W; A 또는 T
N; G 또는 A
또는 T
또는 C
Y; T 또는 C
M; A 또는 C
TN6 역방향 프라이머 서열번호 31: 5'-CCT CCT CTC TAG AGC GGA CCA GGA GC-3'
TN7 정방향 프라이머 서열번호 32: 5'-GGA GGA AGC GGC CGC ACA GAR GCW GGT-3'
TN7 역방향 프라이머 서열번호 33: 5'-CCT CCT CTC TAG AGN GGY TCM GTN CC-3'
TN8 정방향 프라이머 서열번호 34: 5'-GGA GGA AGC GGC CGC ACA GAR GCW GGT-3'
TN8 역방향 프라이머 서열번호 35: 5'-CCT CCT CTC TAG AGN GGY TCM GTN CC-3'
TN9 정방향 프라이머 서열번호 36: 5'-GGA GGA AGC GGC CGC ACA GAR GCW GGT-3'
TN9 역방향 프라이머 서열번호 37: 5'-CCT CCT CTC TAG AGN GGY TCM GTN CC-3'
TN10 정방향 프라이머 서열번호 38: 5'-GGA GGA AGC GGC CGC GGT ACT GGC AGT-3'
TN10 역방향 프라이머 서열번호 39: 5'-CCT CCT CTC TAG AGA GGA CCC GGG GC-3'
TN11 정방향 프라이머 서열번호 40: 5'-GGA GGA AGC GGC CGC CGT CCT GGT AGC-3'
TN11 역방향 프라이머 서열번호 41: 5'-CCT CCT CTC TAG AGA GGA CGA GGA GC-3'
TN12 정방향 프라이머 서열번호 42: 5'-GGA GGA AGC GGC CGC GGC ACC GGT GAC-3'
TN12 역방향 프라이머 서열번호 43: 5'-CCT CCT CTC TAG AGA GGG CCA GGA TC-3'
이때, 하기 표 10의 혼합물을 각 클론의 PCR 반응을 위해 준비하였다.
시약 튜브 당 부피(μl)
dH2O 36.25
10x PCR 버퍼(w/o MgCl2) 5
25mM MgCl2 4
10mM dNTP mix 1
100 μM 정방향 프라이머 0.25
100 μM 역방향 프라이머 0.25
5U Tag 폴리머라아제 0.25
TE 중의 파아지(섹션 4) 3
최종 반응 부피 50
써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 하기 프로그램을 가동시켰다: 94℃에서 5분간; [94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초]x 30 사이클; 72℃에서 7분간; 4℃로 냉각. 각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit (Qiagen)으로 세정하였다.
10μl의 각 PCR 반응물을 1% 아가로스 젤 상에서 전기영동시켜 PCR 반응 후 세정된 산물을 검사하였으며, 그 다음 남은 산물은 공시된 방법으로 DNA 염기서열을 분석하였다.
6. DNA 염기서열 랭킹 및 컨센서스 염기서열 결정
6A. DNA 염기서열 랭킹 및 펩티드 합성
분석된 DNA 염기서열들(섹션 5B)로부터 번역된 펩티드 서열들을 상기 섹션 5A의 ELISA 데이타와 상관시켰다. VEGFR-2 단백질이 코팅된 웰에서 높은 OD450 값을 나타내고 스트렙타비딘 코팅된 웰에서는 낮은 OD450 값을 나타낸 클론들을 더욱 중요한 것으로 평가하였다. 또한, 여러번 중복 발생된 서열들은 더욱 중요한 것으로 평가하였다. 이러한 기준에 따라 후보 서열들을 선택하였고 이를 in vitro 상에서 공시된 제조방법으로 합성(Peptron Inc., 위탁제조)하여 생물학적으로 활성인 펩티드로서의 분석을 위해 사용하였다.
6B. VEGF:VEGFR-2 중화(neutralization) ELISA (경쟁적 ELISA(Competitive ELISA))
결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위해 상기 6A에서 합성한 펩티드를 이용하여 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ 플레이트 (Nunc)를 50 μg/ml 농도의 BSA가 포함된 DMEM 배양액에 녹여진 재조합 인간 VEGF 165 (R&D Systems)로 코팅하였다. 이때 코팅된 VEGF 165 농도는 1nM 농도의 재조합 VEGFR-2와의 최대 결합농도의 75%에 준하는 농도로 하였다. 그런 다음, 0.1% Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 씻은 후, 5% BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. VEGF:VEGFR-2 중화(neutralization) ELISA를 위해 상기 6A에서 합성한 각각의 펩티드를 1%의 BSA와 1nM의 VEGFR-2가 함유된 PBS로 100nM로부터 4배씩 희석시켜 6.1pM 농도까지 보정하였다. 100μl의 펩티드/VEGFR-2 용액을 각각의 웰에 넣은 후, 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 0.1%의 Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, 마우스 항-VEGFR-2 항체(R&D Systems)를 1%의 BSA가 함유된 PBS로 1:3,000 비율로 희석하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 그런 다음, 플레이트 각각의 웰에 1%의 BSA가 함유된 PBS로 1:10,000 비율로 희석시킨 100 μl의 Goat anti-mouse-IgG-HRP(Pierce)를 첨가하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.1%의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 플레이트 각 웰에 100 μl의 TMB 기질(SIGMA)을 첨가하여 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H2SO4 용액 50μl로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통해 VEGF:VEGFR-2의 결합력에 대한 IC50를 구함으로써 상기 6A에서 합성된 펩티드만으로는 VEGF와 VEGFR-2간의 결합력을 충분하게 중화시킬 수는 없음을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 11과 같다.
펩티드 명칭 VEGF:VEGFR-2 결합에 대한 50% 저해농도 (IC50, nM)
관련성 없는 대조구 >100
DTN6VEGFR-2-1 56.747
DTN8VEGFR-2-2 49.523
DTN9VEGFR-2-3 61.889
DTN10VEGFR-2-4 46.889
DTN11VEGFR-2-5 50.652
7. 세포-기반 기능성 분석(cell-based functional assay)
상기 6A에서 합성한 펩티드를 이용하여 세포-기반 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정하였다. 상기 실시예 1의 섹션 7과 동일한 방법으로 수행하였으며, 다만 본 발명에서는 항-Ang-2 항체를 첨가하는 대신 합성 펩티드 5μM씩을 첨가하였다. 그 결과는 하기 표 12와 같다.
펩티드 명칭 HUVEC(2x104 세포) 전체 튜부의 길이 (픽셀)
관련성 없는 대조구 12,227 ± 1,232
DTN6VEGFR-2-1 11,093 ± 1,308
DTN8VEGFR-2-2 10,891 ± 1,014
DTN9VEGFR-2-3 12,101 ± 869
DTN10VEGFR-2-4 10,773 ± 992
DTN11VEGFR-2-5 11,896 ± 1,159
<실시예3: 융합 단백질 상승체의 제조 및 활성 검정>
1. 융합 단백질 상승체의 제조
상기 실시예 1에서 최종 선별된 4종의 키메릭 항-Ang-2 항체 유전자를 상기 실시예 2에서 선별된 5종의 펩티드 유전자와 일반적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 융합시켜 20종의 융합 단백질 상승체 발현 벡터를 제조하였다. 본 발명에서, 펩티드는 항체의 중쇄 C-말단에 결합시켰으며, 그 결과는 하기 표 13과 같다. 이를 상기 실시예 1의 섹션 6과 동일한 방법으로 발현 및 정제하였다. 특히, 서열번호 44, 46, 48 또는 50의 중쇄 가변 부위 유전자가 Fc 부위와 인간 IgG1 불변 부위를 포함하는 벡터 내로 클로닝된다. 그러고 나서, 상기 벡터의 Fc 부위의 C-터미널이 NotI(Roche) 및 XbaI(Roche) 제한효소에 의해 절단되고 표 3의 생물학적 활성 펩티드 유전자가 삽입된 후 T4 DNA 라이게이즈 (New England Biolab)을 사용하여 라이게이션된다. 서열번호 45, 47, 49 또는 51의 경쇄 가변 부위 유전자가 인간 IgG1의 불변 부위를 포함하는 또 다른 벡터 안으로 클로닝된다. 상기 얻어진 중쇄-생물학적 활성 펩티드 벡터, 경쇄 벡터가 HEK-293E 세포(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 안으로 트랜스펙션된다.
융합 단백질 상승체 명칭 항체-펩티드 융합 방식
Syn-Ang-VEGFR-1 SAITAng-2-1 X DTN6VEGFR-2-1
Syn-Ang-VEGFR-2 SAITAng-2-1 X DTN8VEGFR-2-2
Syn-Ang-VEGFR-3 SAITAng-2-1 X DTN9VEGFR-2-3
Syn-Ang-VEGFR-4 SAITAng-2-1 X DTN10VEGFR-2-4
Syn-Ang-VEGFR-5 SAITAng-2-1 X DTN11VEGFR-2-5
Syn-Ang-VEGFR-6 SAITAng-2-2 X DTN6VEGFR-2-1
Syn-Ang-VEGFR-7 SAITAng-2-2 X DTN8VEGFR-2-2
Syn-Ang-VEGFR-8 SAITAng-2-2 X DTN9VEGFR-2-3
Syn-Ang-VEGFR-9 SAITAng-2-2 X DTN10VEGFR-2-4
Syn-Ang-VEGFR-10 SAITAng-2-2 X DTN11VEGFR-2-5
Syn-Ang-VEGFR-11 SAITAng-2-3 X DTN6VEGFR-2-1
Syn-Ang-VEGFR-12 SAITAng-2-3 X DTN8VEGFR-2-2
Syn-Ang-VEGFR-13 SAITAng-2-3 X DTN9VEGFR-2-3
Syn-Ang-VEGFR-14 SAITAng-2-3 X DTN10VEGFR-2-4
Syn-Ang-VEGFR-15 SAITAng-2-3 X DTN11VEGFR-2-5
Syn-Ang-VEGFR-16 SAITAng-2-4 X DTN6VEGFR-2-1
Syn-Ang-VEGFR-17 SAITAng-2-4 X DTN8VEGFR-2-2
Syn-Ang-VEGFR-18 SAITAng-2-4 X DTN9VEGFR-2-3
Syn-Ang-VEGFR-19 SAITAng-2-4 X DTN10VEGFR-2-4
Syn-Ang-VEGFR-20 SAITAng-2-4 X DTN11VEGFR-2-5
2. 융합 단백질 상승체의 활성 검정
2A. Ang-2:Tie-2 중화(neutralization) ELISA (경쟁적 ELISA(Competitive ELISA))
상기 실시예 1의 섹션 3과 동일한 방법으로 수행하였으며, 다만 본 실시예에서는 Ang-2:Tie-2 neutralization ELISA를 위해 각각의 융합 단백질 상승체를 1%의 BSA와 1nM의 hAng-2가 함유된 PBS로 100nM로부터 4배씩 희석시켜 6.1pM 농도까지 보정하여 첨가하였다. 그 결과는 하기 표 14와 같다.
융합 단백질 상승체 명칭 Ang-2:Tie-2 결합에 대한 50% 저해농도 (IC50, nM)
관련성 없는 대조구 >100
Syn-Ang-VEGFR-1 0.773
Syn-Ang-VEGFR-2 0.801
Syn-Ang-VEGFR-3 0.783
Syn-Ang-VEGFR-4 0.812
Syn-Ang-VEGFR-5 0.799
Syn-Ang-VEGFR-6 1.913
Syn-Ang-VEGFR-7 2.012
Syn-Ang-VEGFR-8 2.223
Syn-Ang-VEGFR-9 1.946
Syn-Ang-VEGFR-10 1.997
Syn-Ang-VEGFR-11 0.858
Syn-Ang-VEGFR-12 0.833
Syn-Ang-VEGFR-13 0.903
Syn-Ang-VEGFR-14 0.887
Syn-Ang-VEGFR-15 0.925
Syn-Ang-VEGFR-16 1.216
Syn-Ang-VEGFR-17 0.998
Syn-Ang-VEGFR-18 1.389
Syn-Ang-VEGFR-19 1.276
Syn-Ang-VEGFR-20 1.348
2B. VEGF:VEGFR-2 neutralization ELISA (경쟁적 ELISA(Competitive ELISA))
상기 실시예 2의 섹션 6B와 동일한 방법으로 수행하였으며, 다만 본 실시예에서는 VEGF:VEGFR-2 neutralization ELISA를 위해 각각의 융합 단백질 상승체를 1%의 BSA와 1nM의 VEGFR-2가 함유된 PBS로 100nM로부터 4배씩 희석시켜 6.1pM 농도까지 보정하여 첨가하였다. 이를 통해 상기 6A에서 합성된 펩티드와는 달리 융합 단백질 상승체는 VEGF와 VEGFR-2간의 결합력을 충분하게 중화시킬 수 있음을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 15와 같다.
융합 단백질 상승체 명칭 VEGF:VEGFR-2 결합에 대한 50% 저해활성도 (IC50, nM)
관련성 없는 대조구 >100
Syn-Ang-VEGFR-1 3.367
Syn-Ang-VEGFR-2 2.968
Syn-Ang-VEGFR-3 3.174
Syn-Ang-VEGFR-4 2.848
Syn-Ang-VEGFR-5 3.084
Syn-Ang-VEGFR-6 1.559
Syn-Ang-VEGFR-7 1.763
Syn-Ang-VEGFR-8 1.476
Syn-Ang-VEGFR-9 2.045
Syn-Ang-VEGFR-10 2.159
Syn-Ang-VEGFR-11 0.872
Syn-Ang-VEGFR-12 0.854
Syn-Ang-VEGFR-13 0.914
Syn-Ang-VEGFR-14 0.889
Syn-Ang-VEGFR-15 1.047
Syn-Ang-VEGFR-16 1.162
Syn-Ang-VEGFR-17 1.048
Syn-Ang-VEGFR-18 1.648
Syn-Ang-VEGFR-19 1.312
Syn-Ang-VEGFR-20 1.380
3. 세포-기반 기능성 분석(cell-based functional assay)
상기 1에서 제조한 융합 단백질 상승체를 이용하여 세포-기반 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정하였다. 상기 실시예 1의 섹션 7과 동일한 방법으로 수행하였으며, 다만 본 발명에서는 항-Ang-2 항체를 첨가하는 대신 융합 단백질 상승체 5μM씩을 첨가하였다. 그 결과는 하기 표 16과 같다.
융합 단백질 상승체 명칭 HUVEC(2x104 세포) 전체 튜부의 길이 (픽셀)
관련성 없는 대조구 12,227 ± 1,232
Syn-Ang-VEGFR-1 4,345 ± 952
Syn-Ang-VEGFR-2 3,995 ± 896
Syn-Ang-VEGFR-3 5,043 ± 1,183
Syn-Ang-VEGFR-4 4,225 ± 1,035
Syn-Ang-VEGFR-5 4,065 ± 927
Syn-Ang-VEGFR-6 6,157 ± 1,141
Syn-Ang-VEGFR-7 5,935 ± 995
Syn-Ang-VEGFR-8 6,244 ± 935
Syn-Ang-VEGFR-9 6,055 ± 779
Syn-Ang-VEGFR-10 5,898 ± 1,037
Syn-Ang-VEGFR-11 3,925 ± 675
Syn-Ang-VEGFR-12 3,899 ± 923
Syn-Ang-VEGFR-13 4,216 ± 747
Syn-Ang-VEGFR-14 4,183 ± 698
Syn-Ang-VEGFR-15 4,116 ± 815
Syn-Ang-VEGFR-16 5,022 ± 809
Syn-Ang-VEGFR-17 5,215 ± 714
Syn-Ang-VEGFR-18 5,723 ± 736
Syn-Ang-VEGFR-19 5,329 ± 822
Syn-Ang-VEGFR-20 5,512 ± 699
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다(즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는 한, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어져서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Antibody-peptide fused synergibody <130> OF09P137/PCT <150> KR 10-2008-0048293 <151> 2008-05-23 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Val Ile Trp Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 His Glu Gly Ser Asp Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Asp Tyr Val Ile Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ser Arg Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 8 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Tyr Ile Ser Ser Asp Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 9 <211> 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Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Tyr Lys Gly Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Ser 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 51 <211> 108 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 51 Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Pro Leu 35 40 45 Ile His Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105

Claims (27)

  1. 항체; 및
    생물학적으로 활성인 펩티드를 포함하며,
    상기 항체 및 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 동일한 질병의 발생 또는 진행 과정에 작용하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 및 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는
    서로 다른 타겟에 작용하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 및 상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 신생혈관형성 과정에 작용하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체는 Ang-2에 대한 결합 활성을 갖는 항체 또는 그 단편이고,
    상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 VEGF에 대한 결합 활성을 갖는 펩티드인 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 생물학적으로 활성인 펩티드는, 7개 내지 50개의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 상기 항체의 중쇄 C-말단에 결합된 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항체는,
    서열번호 1, 4, 7 및 10 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 CDR1; 서열번호 2, 5, 8 및 11 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 CDR2; 및 서열번호 3, 6, 9 및 12 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 13, 16, 19 및 22 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 CDR1; 서열번호 14, 17, 20 및 23 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 CDR2; 및 서열번호 15, 18, 21 및 24 중 어느 하나 이상의 서열을 갖는 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항체는,
    서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 14의 CDR2, 및 서열번호 15의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
    서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2, 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 16의 CDR1, 서열번호 17의 CDR2, 및 서열번호 18의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
    서열번호 7의 CDR1, 서열번호 8의 CDR2, 및 서열번호 9의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 19의 CDR1, 서열번호 20의 CDR2, 및 서열번호 21의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
    서열번호 10의 CDR1, 서열번호 11의 CDR2, 및 서열번호 12의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 22의 CDR1, 서열번호 23의 CDR2, 및 서열번호 24의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
    로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체인 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체는
    서열번호 44, 46, 48 및 50으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 갖는 가변 부위를 포함하는 중쇄; 및
    서열번호 45, 47, 49 및 51로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 갖는 가변 부위를 포함하는 경쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 펩티드는,
    서열번호 25, 26, 27, 28 및 29로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 펩티드인 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 항체는,
    서열번호 1의 CDR1, 서열번호 2의 CDR2, 및 서열번호 3의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 13의 CDR1, 서열번호 14의 CDR2, 및 서열번호 15의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
    서열번호 4의 CDR1, 서열번호 5의 CDR2, 및 서열번호 6의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 16의 CDR1, 서열번호 17의 CDR2, 및 서열번호 18의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체;
    서열번호 7의 CDR1, 서열번호 8의 CDR2, 및 서열번호 9의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 19의 CDR1, 서열번호 20의 CDR2, 및 서열번호 21의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및
    서열번호 10의 CDR1, 서열번호 11의 CDR2, 및 서열번호 12의 CDR3를 포함하는 중쇄와, 서열번호 22의 CDR1, 서열번호 23의 CDR2, 및 서열번호 24의 CDR3를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체
    로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 항체이며,
    상기 펩티드는,
    서열번호 25, 26, 27, 28 및 29로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 펩티드인 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체.
  13. 유효성분으로서 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-펩티드 융합 상승체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 타겟의 기능을 억제하기 위한 조성물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 암을 예방 또는 치료하기 위한 조성물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-펩티드 융합 상승체를 제조하는 방법으로서,
    a. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 항체-펩티드 융합 상승체를 코딩하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하는 단계;
    b. 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및
    c. 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 a 단계는,
    타겟으로 하는 질병의 발생 및 진행에 작용하는 항체를 스크리닝하고,
    상기 항체와 동일한 질병의 발생 및 진행에 작용하는 생물학적으로 활성인 펩티드를 스크리닝한 후,
    상기 스크리닝된 항체를 코딩하는 유전자와 상기 스크리닝된 생물학적으로 활성인 펩티드를 코딩하는 유전자가 연결된 핵산 분자를 얻고, 이를 벡터에 삽입하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 a 단계는, Ang-2에 대한 결합 활성을 갖는 항체를 스크리닝하고, VEGFR-2에 대한 결합 활성을 갖는 생물학적으로 활성인 펩티드를 스크리닝한 후, 상기 스크리닝된 항체를 코딩하는 유전자와 상기 펩티드를 코딩하는 유전자가 연결된 핵산 분자를 얻고, 이를 벡터에 삽입하는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체의 제조방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 생물학적으로 활성인 펩티드는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 스크리닝되는 것을 특징으로 하는 항체-펩티드 융합 상승체의 제조방법.
  20. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 및 12의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, Ang-2에 대한 결합 활성 보유 항체의 중쇄의 CDR 도메인 또는 그 단편.
  21. 서열번호 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 및 24의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, Ang-2에 대한 결합 활성 보유 항체의 경쇄의 CDR 도메인 또는 그 단편.
  22. 서열번호 44, 46, 48 및 50의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, Ang-2에 대한 결합 활성 보유 항체의 중쇄의 가변 부위 또는 그 단편.
  23. 서열번호 45, 47, 49 및 51의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, Ang-2에 대한 결합 활성 보유 항체의 경쇄의 가변 부위 또는 그 단편.
  24. 서열번호 25, 26, 27, 28 및 29의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, VEGF에 대한 결합 활성 보유 폴리펩티드.
  25. 제20항 또는 제21항의 CDR;
    제22항 또는 제23항의 가변 부위; 및/또는
    제24항의 폴리펩티드를 포함하는 재조합 벡터.
  26. 제25항의 재조합 벡터를 포함하는 형질전환된 숙주 세포.
  27. 제20항 또는 제21항의 CDR;
    제22항 또는 제23항의 가변 부위; 및/또는
    제24항의 폴리펩티드.
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