KR20100088007A

KR20100088007A - 율피 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20100088007A
Application number: KR1020090007126A
Authority: KR
Inventors: 이철호; 송경식; 오원근; 양금진; 김용훈; 노정란; 강길태; 최동희; 문지선
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2009-01-29
Filing date: 2009-01-29
Publication date: 2010-08-06
Also published as: KR101206543B1

Abstract

본 발명은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 지방간 예방 또는 치료용 조성물, 상기 추출물을 포함하는 지방산생합성효소(FAS) 활성 억제용 조성물, 상기 추출물을 포함하는 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제(CPT) 활성 증진용 조성물 및 상기 추출물을 포함하는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

율피 추출물, 지방산생합성효소, 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제, 중성지방, 지방간

Description

율피 추출물을 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 조성물 {A COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OF FATTY LIVER COMPRISING AN EXTRACT OF CHESTNUT INNER SHELL}

최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 인하여 위생환경이 개선되고 식생활의 향상으로 섭취열량 또한 급속한 증가가 이루어지고 있는 반면, 운동은 부족하고 소비되는 열량은 적어 체내에 과도한 영양분의 축적 등으로 인한 각종 성인병의 발생이 증가하고 있다. 이와 같은 성인병 중 특히 지방간은 과도한 지방이나 알코올 섭취, 간의 지방합성 증가, 중성지방 배출 및 연소 감소 등으로 인하여 간에 지방이 축적되어 발생하며, 일반적으로 간에서 축적된 지방의 비중이 5%이상일 때 지방간으로 정의된다.

지방간에서 축적된 지방의 대부분은 중성지방(triglyceride)이며, 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있다. 알코올성 지방간은 알코올을 과다 섭취하여 간에 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하게 된다. 일부에서는 지방간이 단순히 간에 지방이 축적되는 현상 정도로 생각하고 있으나, 알코올성 지방간으로 판명된 환자의 50%, 비알코올성 지방간으로 판명된 환자의 30%는 간경변으로 발전한다는 사실을 고려할 때, 지방간은 매우 심각한 간질환의 하나라고 보아야 할 것이다.

특히 알코올성 지방간은 만성 간 질환으로 진행될 수 있는데, 알코올성 지방간의 환자들 중에서 10-35%가 간염으로, 8-20%가 간경변증으로 진행되는 것으로 보고되고 있으며, 비알코올성 지방간 환자에 비하여 알코올성 지방간 환자들이 간경변증을 보다 많이 가지고 있고 또한 간염으로 진행될 가능성이 높은 것으로 보아, 알코올성 지방간은 더욱 심각한 문제이다.

현재 지방간을 약물학적으로 치료하는데 유용한 약제는 거의 없는 상태이며 운동과 식이요법만이 권장되고 있으나, 실제로 이러한 방법에 의한 지방간의 치료효율은 매우 낮아 유효한 치료제 개발이 요구된다. 지방간이 당뇨병 및 비만상태에서 관찰되는 세포의 인슐린 저항성과 관련성이 있다고 확인되면서 일부 메트폴민(metformin)과 같은 혈당 강하제가 지방간 치료에 효과가 있는 것으로 보고되었으나, 상기 약물은 간 독성 또는 젖산증과 같은 부작용을 유발한다는 문제점이 있 다. 이외에 대체 약물보조요법으로서 베타인(betaine), 글루큐로네이트(glucuronate), 메티오닌(methionine), 콜린(choline) 및 친지방(lipotrophic) 제제가 보조적으로 이용되기도 하지만, 이들에 대한 의약학적 근거가 완전히 증명된 것은 아니다. 따라서, 효과가 탁월하면서도 부작용을 유발하지 않는 안전한 지방간 치료제의 개발이 절실한 실정이다.

이에 본 발명자들은 부작용이 없고, 효과적인 지방간 치료제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 율피 추출물이 지방산생합성효소를 억제하고 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1의 활성을 증진시킴으로서, 간 조직내 중성지방 합성의 억제 및 산화 촉진기능을 수행하여 지방간을 예방 또는 치료 할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방산생합성효소(FAS) 활성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제(CPT) 활성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서 본 발명은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어, '율피'는 밤나무과에 속하는 밤나무(Castanea crenata)의 과실을 싸고 있는 짙은 갈색의 속껍질로서 밤 과실로부터 분리하여 햇볕에 말린 후 사용한다. 기존에는 율피 추출물을 화장품의 재료로써, 피부 도포용으로 사용된 특허가 주를 이루었으며, 율피 추출물이 지방간의 예방 또는 치료용으로 사용된 예는 없었다. 바람직하게 본 발명은 상기 율피 추출물을 사용하여 지방간을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 비알코올성 또는 알코올 성 지방간이 유도된 마우스 모델에 율피 추출물을 포함하는 조성물을 경구 투여하는 경우, 지방간이 억제되는 효과를 확인하였다(실시예 3 내지 7).

본 발명에서의 용어, '지방간'은 정상세포내에는 존재하지 않는 중성지방이 간 세포 내에 비정상적으로 침착되어 보이는 현상이(Lombardi, 1966) 나타난 것을 말한다. 정상 간은 약 5%가 지방조직으로 구성되어 있으며 중성지방, 지방산, 인지질, 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스터가 지방의 주성분이나, 일단 지방간이 발생되면 대부분의 성분이 중성지방으로 대체되며, 중성지방의 양이 간 중량의 5 %이상이면 지방간으로 진단된다(Alpers et al.,1993).

지방간은 간세포 내의 지방대사 장애나 과잉지방을 운반하는 과정에서의 결함 등에 의하여 초래되는 것으로서, 주로 간에서의 지방대사 장애로 인하여 발생한다. 상기 지방간에서 축적된 지방의 대부분은 중성지방(triglyceride)이며, 지방간은 크게 비만, 당뇨병, 고지혈증, 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간과 과음으로 인한 알코올성 지방간으로 나눌 수 있다.

상기 '비알코올성 지방간'은, 알코올 섭취 과거력이 없으면서 지방간을 동반하는 경우를 말하며, 비만, 당뇨, 고지혈증 등 대사성 질환과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 비알코올성 지방간에는 단순히 간 내에 지방이 축적된 것 뿐만 아니라, 비알코올성 지방간염(non-alcoholic steatohepatitis) 및 말기 섬유화 간질환등이 여기에 속한다.

'알코올성 지방간'은 알코올을 많이 섭취하게 되어 간에서 지방 합성이 촉진 되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하게 되는 것을 말한다. 알코올은 체내에 저장되지 못하고 간에서 산화작용에 의하여 완전히 없어지게 되는데, 구체적으로 보면, 간에서 알코올은 크게 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase : ADH) 경로, 미소체 알코올 산화체계(microsomal ethanol oxidizing system : MEOS) 경로 및 카탈라제(catalase) 경로의 세가지 경로에 의해 대사되어 아세트알데히드로 변환되고, 이는 다시 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase : ALDH)에 의하여 아세트염으로 대사된다. 이때, 아세트알데히드는 독성이 있어 간세포에 손상을 줄 수 있고, 또한 이러한 알코올의 대사 결과 지방산이 많이 만들어져 간에 지방이 축적되게 되는데, 상기와 같은 원인으로 간에 축적된 지방간을 알코올성 지방간이라고 한다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 비알코올성 지방간 외에도 액체 알코올 다이어트를 이용하여 알코올성 지방간이 유도된 마우스에 율피 추출물을 포함하는 조성물을 투여한 결과, 지방간 억제능 효과를 확인하였다(실시예 7).

지방간은 대부분 비만과 관련이 있는 것으로 알려져 있으나, 이외에도 마르거나 정상인 사람에게서도 나타날 수 있는 질환이다(Gastroenterology., 107, 1103 ∼ 1109 (1994)). 이와 같은 사실은 지방간이 있는 환자의 40%(32/81)가 정상 체질량 지수를 보였다는 보고에 의해서도 뒷받침 될 수 있다(Nucl Med Mol Imaging., 40, 243 ∼ 248 (2006)). 특히 비만이 아닌 군에서 중성지방이 주요 요소로 작용하는 것으로 보고(J.Clin.Gastroenterol., 40, 745 ∼ 752 (2006))되었으며, 지방간이 있는 환자의 경우 정상군보다 콜레스테롤, 중성지방의 수치가 통계적으로 유의하게 높게 나타나 비만이 아닌 경우에 있어서, 지방간과 중성지방 간의 연관성이 높다는 사실을 보여주고 있다.

본 발명에서의 사용되는 용어, '예방 또는 치료'란 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 이용함으로써, 지방간과 관련된 질환의 발병을 억제시키거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, 특히 '치료'란, 상기 조성물을 사용하여 지방간 관련 질환을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 바람직하게 본 발명의 율피 추출물을 포함하는 약학적 조성물은 간 조직내 중성지방의 축적을 억제함으로써 지방간에 관련된 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 율피 추출물을 유효성분으로 하는 약학 조성물은 지방간을 가진 개체라면, 해당 개체의 다른 조직이 비만인지 여부와 무관하게 지방간에 대한 우수한 억제효과를 나타냄을 확인하였다.

본 발명에 따른 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간, 보다 상세하게는 알코올성 지방간의 예방 또는 치료를 위한 '약학적 조성물'은 약학적으로 유효한 양의 율피 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 유효한 양'이란, 상기 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 추출물의 양을 말한다.

상기 '약학적으로 허용되는'이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

본 발명에 따른 율피추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물의 통상적인 1일 투여량은 10 내지 1,000 ㎎/㎏, 바람직하게는 10 내지 200 ㎎/㎏의 범위일 수 있고, 1회 또는 수 회로 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 150 ㎎/㎏의 농도로 1일 1회 4주 동안 경구투여함으로써, 지방간이 유도된 마우스 모델을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다(실시예 2 및 7). 본 발명의 목적상, 율피 추출물을 포함하는 약학적 조성물의 투여량이 상기 투여량에 한정되는 것은 아니며, 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자를 고려하여 결정될 수 있다.

바람직하게 본 발명의 조성물은, 투여를 위해 상기 유효성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있으며, 이들 약제학적으로 허용되는 담체, 약제학적 조성물의 제제, 이들 제제를 제조하는 방법의 실례는 공지된 방법에 의한다.

또한 바람직하게 본 발명의 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

바람직하게 본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게 본 발명의 실시예에서는 경구 투여를 통하여 지방간 억제능을 확인하였다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방산생합성효소(Fatty Acid Synthetase, FAS) 활성 억제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어, '지방산생합성효소(fatty acid synthase, FAS)'란, 지방세포의 분화에 있어 초기에 발현되는 효소 중의 하나(J. Biol. Chem., 255, 4745∼4750 (1980))이다. 지방산생합성효소는 아세틸 코에이(acetyl-CoA)와 말로닐 코에이(malonyl-CoA)로부터 팔미테이트(palmitate)를 생산하는 역할을 한다. 상세하게는 과도한 음식의 섭취로 하여 소비되지 않는 열량들은 지방산생합성효소의 작용에 의하여 저장 지질인 중성지방의 형태로 세포 내에 저장되게 되는데, 특히 지방간의 진행에 있어서 중성지방의 축적이 관여한다고 알려져 있다(J. Clin. Invest., 98, 1575∼1584 (1996)).

바람직하게 본 발명은, 지방산생합성효소(FAS)의 활성을 억제함으로써 간세포내 중성지방의 생성억제 또는 분해를 촉진하는 것을 특징으로 하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 고지방 사료를 섭취시켜 비만이유도된 마우스에 상기 본 발명의 율피 추출물을 경구 투여하여 지방산생합성효소의 활성도를 산화된 NADPH의 양으로 측정한 결과, 지방산의 합성이 감소되었음을 확인하였다(실시예 4). 또한, 알코올성 지방간 유도 마우스 모델에 율피 추출물을 경구 투여한 결과 알코올성 지방간을 유의적으로 억제하였음을 확인하였다(실시예 7).

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1(carnitine palmitoyltransferase, CPT)의 활성 증진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어, '카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1(carnitine palmitoyltransferase, CPT)'는 지방산의 이화 작용에 관여하는 효소로서, 세포 조직 내 긴 사슬 지방산(long-chain fatty acid)을 미토콘드리아(mitochondria) 내로 수송시켜 지방산을 전달함으로써 기초대사량을 증가시키는 역할을 한다. 즉, 지방산 산화 (β-oxidation)를 촉진시키는 작용(Molecular Aspects of Medicine, 25, 495∼520 (2004))을 하기 때문에, 간세포 내 지방산의 산화가 촉진되어 간에서의 지방축적을 억제하는 효과를 얻을 수 있다.

바람직하게 본 발명의 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체 에 투여하는 경우, CPT의 활성을 촉진시킬 수 있고, 간세포 내 중성지방 생성억제 및 분해를 촉진할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, 본 발명의 율피 추출물을 경구 투여한 후, CPT의 활성도를 측정한 결과, 지방산의 분해 및 산화가 촉진되어 간 조직 내 지방 축적을 억제하는 효과를 확인하였다(실시예 4). 또한, 알코올성 지방간이 유도된 마우스 모델에 율피 추출물을 투여한 결과 알코올성 지방간을 유의적으로 억제하였음을 확인하였다(실시예 7).

또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 율피 추출물을 포함하는 지방간의 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서의 용어, '개선'이란, 본 발명의 율피 추출물을 포함하는 건강기능식품 조성물을 투여함으로써, 지방간의 증상을 완화시키는 효과를 나타내는 것을 의미한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하여, 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 건강 식품으로는 본 발명의 율피 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있으나, 상기 예에 의해 제조 가능한 형태가 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 건강기능식품은 추가적인 첨가제를 포함할 수 있으며, 그 종류에는 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 바람직하게 상기 첨가할 수 있는 기능성 식품으로는 음료(알코올성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼 및 마말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티 및 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터 및 치즈 등), 식용식물유지, 마가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장 및 소스 등) 등에 본 발명의 율피 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

바람직하게 본 발명의 율피 추출물은, (a) 분쇄된 율피를 중량 대비 10배 부피의 에탄올로 상온에서 2회 추출하여 감압 및 농축하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서의 수득한 율피 추출물을 중량의 2배에 해당하는 증류수를 넣고 동결 건조하여 율피 추출물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서의 수득한 율피 추출물을 베타 싸이클로덱스트린 (β-cyclodextrin)과 1 : 2 비율로 혼합한 다음 증류수로 용해하는 단계를 이용하여 제조할 수 있으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 추출 방법이 제한없이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 율피 추출물이 간조직에서 지방합성을 저해시키는 지방산생합성효소의 활성을 억제하고, 지방의 산화를 촉진하는 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제의 활성을 촉진하여 간조직 내 지방의 축적을 억제함으로써 지방간을 억제하는 효과를 갖는, 율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 지방간 개선용 건강기능식품을 제공할 수 있다.

실시예 1. 율피 추출물의 제조

율피를 건조시켜 분쇄한 다음 중량 대비 10배 부피의 에탄올을 넣고 상온에서 2회 추출하여 얻어진 용액을 감압 및 농축하고, 중량의 2배에 해당하는 증류수를 넣고 동결건조하여 율피 추출물을 얻었다. 이렇게 추출된 율피 추출물은 베타 싸이클로덱스트린 (β-cyclodextrin)으로 1 : 2 비율로 혼합한 다음 증류수로 용해하여 동물실험에 사용하였다.

실시예 2. C57BL/6 마우스를 이용한 고지방 사료 급여 및 율피 추출물 경구투여

고지방 사료의 섭취에 의해 지방간이 유도되는 것으로 알려진 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 21% 유지방(milk fat) 및 0.15% 콜레스테롤(cholesterol (wt/wt))을 포함하고 있는 고지방식이 (Western diet, Dyets Inc., PA, USA)를 섭취시키면서, 베타 싸이클로덱스트린과 1 : 2 비율로 혼합한 율피 추 출물을 증류수로 용해시켜 150 ㎎/㎏의 농도로 1일 1회 11주 동안 경구투여 하였으며, 대조군에는 고지방식이와 실험군에서 사용된 동일한 양의 베타 싸이클로덱스트린을 증류수에 용해하여 경구투여 하였다. 고지방 사료의 자세한 조성은 표 1 에 나타내었으며, 사료와 물은 모든 동물들이 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 동물실의 사육조건은 온도 22±2℃, 습도 55±10% 및 조명 12h시간 주기의 명암으로 조절되는 SPF-barrier 환경에서 유지하면서 실험을 수행하였다.

고지방 사료 조성

성분	함량 (grams/㎏)
카제인 (casein)	195
메치오닌 (DL-methionine)	3
콘스타치 (Cornstarch)	150
슈크로즈 (Sucrose)	341.46
셀룰로즈 (Cellulose)	50
밀크팻 (Milk fat)	210
미네랄믹스 (Mineral mix¹)	35
비타민믹스 (Vitamin mix²)	10
칼슘카보네이트 (Calcium carbonate)	4
콜레스테롤 (Cholesterol)	1.5
에톡시퀸 (Ethoxyquin)	0.04

¹AIN-76^TM , ²AIN-93VX^TM

실시예 3. 율피 추출물 투여에 따른 고지방식이 C57BL/6 마우스 간의 중성지방 함량변화

고지방 사료를 섭취시키면서 율피 추출물을 경구로 11주간 투여한 C57BL/6 마우스로부터 간조직을 절취하여 중성지방의 농도를 분석하기 위하여 간조직을 절취하여 0.9% NaCl 용액으로 분쇄시킨 후, 클로로포름 : 메탄올 = 1 : 2로 섞은 용액을 넣고 섞어준 다음 30분 이상 정치하였다가 다시 섞어준 후, 크로르포름을 첨가하여 2분간 추가로 정치하였다. 이어서 증류수를 첨가하여 섞어주고 3,000 rpm에서 20분간 원심 분리한 다음, 아래층을 채취하는 과정을 2~3회 반복하고 탈수제를 넣었다. 미리 크로르포름으로 침지시킨 여과지를 꺼내어 깔대기에 대고 추출한 용액을 여과시킨 후 55℃를 유지하면서 건조시킨 후 지질을 추출하고, 중성지방분석용 kit (Asan Pharm Co, Korea)를 사용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하고, 표준시험물질의 흡광도를 기준으로 얻어진 중성지방의 농도를 기준으로 율피 추출물 투여군의 중성지방 함량을 산출하였다. 간조직의 지방함량은 율피 추출물을 투여한 C57BL/6 마우스 간의 중성지방함량이 40±20 mg/간(g)으로 나타나, 대조군의 132±11 mg/간(g)과 비교하여 70% 이상의 중성지방이 유의하게 감소된 것으로 관찰되었다 (도 1). 이와 같은 결과로부터 율피 추출물의 투여로 고지방식이로 유도된 C57BL/6 마우스의 지방간 형성이 효과적으로 억제되었음을 확인하였다.

실시예 4. 율피 추출물 투여에 따른 고지방식이 C57BL/6 마우스 간에서의 지방산생합성효소 및 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제의 활성변화

고지방 사료를 섭취시키면서 율피 추출물을 경구로 11주간 투여한 C57BL/6 마우스로부터 간조직을 채취하였다. 지방산생합성효소 및 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제의 활성변화를 측정하기 위하여, 절취된 간조직을 0.1 M 트리에탄올아민(triethanolamine), 0.02 M EDTA, 2 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 포함하는 완충액 (pH7.4)을 가한 후 냉각 상태에서 분쇄한 다음, 4℃, 600 g로 10분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후 4℃, 10,000 g로 20분 동안 원심 분리하여 펠렛을 얻었으며, 이 펠렛은 완충액으로 재현탁시켜 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 활성측정을 위한 미토콘드리아 효소원으로 사용하였으며, 상등액은 4℃, 100,000 g로 1시간 동안 초원심분리하여 상등액을 지방산생합성효소 활성측정을 위한 사이토졸 효소원으로 사용하였다.

지방산생합성효소의 활성측정은 125 mM 인산 칼륨(potassium phosphate) 완충액(pH 7.0), 1 mM EDTA, 16.5 uM 아세틸 코에이(acetyl-CoA), 50 uM 말로닐-코에이(malonyl-CoA), 50 uM NADPH, 1 mM β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 및 간의 효소원을 섞은 후 340 nm에서 흡광도의 변화를 분석하여 지방산생합성효소의 활성을 측정하였다. 지방산생합성효소의 활성도 단위는 간단백질 1 mg당 1분간 산화된 NADPH의 양으로 나타내었다. 또한, 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제의 활성 측정은 5,5-디티오비스-2-니트로벤조익산(5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid, DTNB)를 사용하여 팔미토일-코에이(palmitoyl-CoA)로부터 생성되는 CoASH를 측정하였다. 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 활성측정을 위하여 상기한 바와 같이 준비한 미토콘드리아 효소원을 232 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.1 mM EDTA, 220 uM 카르니틴(carnitine), 24 uM DTNB, 7 uM 팔미토일-코에이(palmitoyl-CoA), 0.09% 트리톤 X-100(Triton X-100) 등이 들어있는 용액에 첨가한 후 2분 동안 412 nm에서 흡광도 변화를 분석하여 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 활성을 측정하였다. 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제의 활성도 단위는 단백질 1 mg당 1분간 생성되는 CoASH의 양으로 나타내었다.

이와 같은 방법으로 지방산생합성효소 및 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제 활성을 측정한 결과, 율피 추출물을 투여한 실험군에서 지방산생합성효소의 경우에는 0.68±0.23 μ mole/min/mg 단백질(protein)을 나타내었는데, 대조군에서는 1.41±0.11 μ mole/min/mg 단백질(protein)을 보여 율피 추출물을 투여한 군에서 유의하게 지방산생합성효소의 활성이 억제되어 있는 것으로 관찰되었고, 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제의 경우에는 대조군에서 0.15±0.06 n mole/min/mg 단백질(protein)(도 2a)으로 나타난 반면, 율피 추출물을 투여한 실험군에서는 0.47±0.15 n mole/min/mg 단백질(protein)(도 2b)을 보여 대조군 보다 유의하게 활성이 증가된 것으로 나타났다. 이와 같은 결과들로부터 율피 추출물이 간에서 지방의 합성은 감소시키고 지방산의 산화는 촉진시키는 작용을 갖고 있어, 간조직 내 지방축적을 억제하는 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 5. 율피 추출물 투여에 따른 고지방식이 C57BL/6 마우스 혈액 내 GOT 및 GPT 농도변화

율피 추출물을 투여에 따른 고지방식이 C57BL/6 마우스의 혈액 내 간손상과 관련된 대표적인 지표인 글루타밀 옥살로아세틱 트랜스아미네이즈 (GOT; glutamyl oxaloacetic transaminase)와 글루타밀 피루빅 트랜스아미네이즈 (GPT; glutamyl pyruvic transaminase)에 대한 분석을 위하여 율피 추출물을 11주간 투여한 후, 각 동물의 안와정맥총(retro-orbital sinus)으로부터 해파린(heparin)이 처리된 캐필러리 튜브 (capillary tube)를 이용하여 혈액을 채취한 다음, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층부의 혈장을 얻어 자동혈액분석기(Hitachi 7150, Japan)를 이용하여 직접 분석하였다.

분석결과, 대조군에서 GOT 및 GPT의 혈액 내 농도가 81±5 IU/L 및 56±9 IU/L를 나타낸 반면, 율피 추출물 투여군에서는 63±3 IU/L 및 30±4 IU/L를 보여 대조군 보다 유의하게 감소된 것으로 관찰되었다(도 3). 이와 같은 결과로부터 율피 추출물의 투여가 고지방식이로 인한 C57BL/6 마우스 간세포 손상을 효과적으로 억제하였을 뿐만 아니라 간에 대한 보호 작용이 있다는 것을 확인하였다.

실시예 6. 율피 추출물 투여에 따른 고지방식이 C57BL/6 마우스 간조직에 대한 병리조직학적 관찰

고지방 사료의 지속적인 섭취에 따라 C57BL/6 마우스는 간조직에 지방축적이 점차적으로 증가하게 되고 지방간이 발생하게 되며 현미경적 관찰에서도 구분이 가능하다. 따라서, 율피 추출물의 투여에 의한 간조직의 지방간 억제효능에 대하여 병리조직학적인 방법을 이용하여 관찰하였다. 율피 추출물을 11주간 투여한 후, 각 동물로부터 간조직을 절취하여 10% 중성포르말린으로 48시간 동안 고정한 후, 에탄올을 이용하여 탈수시켰으며, 파라핀으로 포매하고 블록을 제작한 다음, 마이크로톰으로 4 ㎛ 두께의 조직절편을 제작하여 헤마토실린 및 에오신 (hematoxylin & eosin)으로 염색하였으며 광학현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 대조군의 간에서는 전반적으로 간조직의 세포질 내에 비정상적으로 과도한 지방과립을 포함하고 있는 간세포들과 다양한 크기의 공포형태로 관찰되는 지방변성 소견을 관찰되었으나(도 4a), 실험군은 이와 같은 지방변성 소견이 현저하게 개선되었을 뿐만 아니라 대부분의 세포가 정상적인 형태로 관찰되었다 (도 4b). 이와 같은 결과로부터 율피 추출물의 투여가 고지방식이로 유도되는 C57BL/6 마우스의 지방간을 매우 효과적으로 억제시키는 효능이 있음을 확인하였다.

실시예 7. C57BL/6 마우스를 이용한 알코올성 지방간 유도 및 율피 추출물 투여 효능실험

율피 추출물의 알코올성 지방간에 대한 억제 효능을 알아보기 위하여 1 kcal/㎖을 기준으로 에탄올 36%, 지방 35%, 단백질 18% 및 탄수화물이 11%의 조성으로 이루어진 알코올성 액체식이 (Lieber-DeCarli Regular Ethanol diet, Dyets Inc)를 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스에 투여하면서 대조군에는 증류수를, 실험군에는 율피 추출물을 증류수로 용해시켜 150 ㎎/㎏농도로 1일 1회 4주 동안 경구투여를 시행하였다. 동물실의 사육조건은 온도 22±2℃, 습도 55±10% 및 조명 12h시간 주기의 명암으로 조절되는 SPF-barrier 환경에서 유지하면서 실험을 수행하였다. 실험을 종료한 후 율피 추출물 투여군과 대조군의 간조직을 절취하여 앞에서 설명한 바와 같은 동일한 방법으로 지방함량을 분석하여 비교한 결과, 대조군이 116±15 mg/간(g)으로 나타낸 반면, 율피 추출물을 투여한 군에서는 78±16 mg/간(g)으로 나타나, 율피 추출물의 투여가 알코올성 지방간을 억제하는 것으로 나타났다.

도 1은 고지방식이를 시행하면서 율피 추출물을 투여한 동물의 간조직 내 중성지방의 함량이 감소된 것을 나타낸 그래프이다.

도 2는 고지방식이를 시행하면서 율피 추출물을 투여한 동물 간조직의 지방산생합성효소(Fatty Acid Synthetase, FAS) 억제(도 2a) 및 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1(carnitine palmitoyltransferase, CPT) 활성 증가(도 2b)를 나타낸 그래프이다.

도 3은 고지방식이를 시행하면서 율피 추출물을 투여한 동물의 혈액 내 글루타밀 옥살로아세틱 트랜스아미네이즈 (GOT; glutamyl oxaloacetic transaminase)(도 3a) 및 글루타밀 피루빅 트랜스아미네이즈 (GPT; glutamyl pyruvic transaminase)(도 3b)가 감소된 것을 나타낸 그래프이다.

도 4는 고지방식이를 시행하면서 율피 추출물을 투여한 동물의 간조직의 지방간 소견을 나타낸 것으로서,율피 추출물을 투여군은 대조군(도 4a)과 비교하여 뚜렷하게 억제된 소견(도 4b)을 나타내었음을 확인할 수 있다.

Claims

율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지방간은 알코올성 지방간인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물의 1일 투여량은 10 내지 200 ㎎/㎏인 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함하는 약학적 조성물.
율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방산생합성효소(Fatty Acid Synthetase, FAS) 활성 억제용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 지방산생합성효소(Fatty Acid Synthetase, FAS)의 활성을 억제함으로써 간세포 내 중성지방의 생성을 저해하는 것을 특징으로하는 억제용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 간세포는 알코올성 지방간인 억제용 조성물.
율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1(carnitine palmitoyltransferase, CPT) 활성 증진용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 조성물은 카르니틴 팔미토일트랜스퍼라아제-1(carnitine palmitoyltransferase, CPT)의 활성을 촉진시킴으로써 간세포 내 중성지방 생성억제 및 분해를 촉진하는 것을 특징으로 하는 증진용 조성물.
제9항에 있어서, 상기 간세포는 알코올성 지방간인 증진용 조성물.
율피 추출물을 유효성분으로 포함하는 지방간 개선용 건강기능식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 지방간은 알코올성 지방간인 건강기능식품 조성물.