KR20100070994A - 액체 크로마토그래피용 충전 재료 및 해당 충전 재료에 의한 생체고분자의 분리·정제 방법 - Google Patents

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Abstract

단백질의 등전점에 의해 또는 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자가 용해되는 용매 중의 염농도에 의해 영향을 받는 일없이, pH 변화에 의해 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자의 흡착·탈착에 의해, 분리· 정제 혹은 포집·회수할 수 있는 신규한 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제공하는 것, 그리고, 이러한 충전 재료를 이용해서, 다량의 묽은 세포배양액으로부터 목표로 하는 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자를 농축·회수하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
생체고분자의 분리·정제 혹은 포집·회수는, 기질 및 해당 기질에 고정화된 리간드를 포함하는 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 이용한 액체 크로마토그래피에 의해 수행되고, 이때, 상기 기질은 알코올성 수산기를 그 표면에 지니는 친수성 기질이며, 상기 리간드는 이하의 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 리간드이고, 상기 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있다:
[화학식 1]
RCH(NH2)COOH
상기 식 중, R은 방향족 기 또는 C5 -7의 비이온성 지방족 기를 나타낸다.
생체고분자, 액체 크로마토그래피용 충전 재료, 기질, 리간드

Description

액체 크로마토그래피용 충전 재료 및 해당 충전 재료에 의한 생체고분자의 분리·정제 방법{PACKING MATERIAL FOR LIQUID CHROMATOGRAPHY AND PROCESS FOR SEPARATION AND PURIFICATION OF BIOPOLYMER BY MEANS OF THE PACKING MATERIAL}
본 발명은 수용액에 용해된 이온성 물질, 특히, 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자(biopolymer)를 분리·정제 또는 포집·회수하기 위하여 적합한 액체 크로마토그래피용 충전 재료, 및 이 충전 재료를 이용한 단백질의 흡착· 탈착 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 산성 수용액 중에 충전 재료의 소수성 기와, 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자의 표면 소수성 기와의 상호작용을 이용해서 용질 고분자를 흡착시키고 나서, 용리액의 pH를 중성 또는 약 알칼리성으로 변경함으로써 충전 재료를 친수성으로 변화시키고, 흡착된 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자를 탈착·용출시킴으로써 회수하는 방식으로, 해당 생체고분자를 분리·정제하기 위한 액체 크로마토그래피용 충전 재료 및 해당 충전 재료를 흡착·탈착하는 방법에 관한 것이다.
단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자를 흡착·탈착해서 분리·정제하는 액 체 크로마토그래피용 충전 재료는, 많은 경우, 수용액 중에 단백질 혹은 펩타이드를 흡착하지 않는 친수성 충전 재료를 기질(base matrix)로서 이용하여, 그 기질 표면에 단백질과 상호작용하는 작용기를 고정화시킨 구조를 지니고 있다. 이러한 친수성 기질로서는, 예를 들어 생체고분자를 침투할 수 있는 크기를 지닌 세공(pore)을 구비한 다공성 입자로 친수성 표면을 갖는 것이 사용됨으로써, 작용기를 도입하지 않으면, 실질적으로 분자 크기가 큰 순서로, 각각의 용질은 용출될 것이다.
기질에 친수성을 부여하고 있는 것은 알코올성 수산기 또는 아미드기 등의 비이온성 극성기이다. 특히, 수산기는 특정한 작용기를 고정화하기 위한 반응 부위로서 이용되고 있다.
작용기로서 소수성 기를 도입한 것이 소수적 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography)용 충전 재료 또는 역상 크로마토그래피용 충전 재료이다.
역상 크로마토그래피용 충전 재료는, 단백질 등을 용출시킬 때에, 유기 용매를 함유하는 용출액이 요구되어 단백질을 변성시키는 많은 경우에 분석에는 이용되지만, 정제 수단으로서는 그다지 이용되지 않는다.
한편, 소수적 상호작용 크로마토그래피는, 고농도 염용액 중에 단백질 등을 흡착시키고, 유기 용매를 첨가하는 일없이도 염농도를 낮춤으로써 단백질 등을 용출시킬 수 있는 분리·정제법이다. 이러한 소수적 상호작용 크로마토그래피는, 생체고분자의 복잡한 생리활성을 유지하면서 원하는 물질을 분리·정제하는 수단으로 서 이온 교환 크로마토그래피법에 버금가는 빈도로 널리 이용되며, 많은 경우에, 이온 교환 크로마토그래피법과 조합해서 사용된다. 그의 사용을 위한 주된 이유로서는, 예를 들어, 단백질이 순한(mild) 용매(조성, pH) 및 온화한 온도에서 분리될 수 있도록 하는 것, 재생·세정, 멸균 처리 혹은 엔도톡신-제거 처리 등에 대해서 비교적 안정성이 양호하고, 그의 사용 수명이 긴 것, 또한, 생체고분자와의 소수적 상호작용에 의거해서 흡착·탈착을 수행함으로써, 범용되고 있는 이온 교환법과는 분리 기구가 다른 것 등을 들 수 있다.
소수적 상호작용 크로마토그래피용 충전 재료에 이용되는 작용기는, 예를 들어, 뷰틸기, 헥실기, 옥틸기 혹은 페닐기 등의 비이온성 기일 수 있다.
최근, 특정 단백질(특정 펩타이드를 포함함)을 효율적으로 생산하는 방법으로서, 재조합 세포를 배양하여 세포 내 혹은 세포 외에 단백질을 생산하는 방법이 개발되어 이용되고 있다. 배양 상청액이나 호모지네이트액(homogenate solution) 중의 단백질의 농도는, 많은 경우에도 ℓ당 몇 g 정도이며, 통상은 더욱 낮다. 따라서, 다량의 단백질을 제조할 경우, 몇 백 내지 몇 천 리터의 배양액을 신속히 처리해서, 목적으로 하는 단백질을 함유하는 대략 정제된 제품을 포집하는 것이 요구된다. 이 목적을 위해서, 이용되는 크로마토그래피의 종류에 관계없이, 충전 재료의 단위 용적당의 목표물질의 부하 용량을 증대시키는 것이, 조작 시간의 단축과 설비의 컴팩트화에 의한 비용의 저감에 유용하며, 또한 이것은 단백질(펩타이드를 포함)의 정제 기술을 위한 중요한 인자로 된다.
여기서, 소수적 상호작용 크로마토그래피는, 단백질을 흡착시키기 위해서, 결합 완충액 중에 고농도(통상 적어도 1.5 mol/ℓ(몰/리터))의 황산암모늄이나 황산나트륨 등을 함유시킬 필요가 있다. 따라서, 다량의 배양 상청액이나 호모지네이트액을 처리하기 위해서는, 다량의 이러한 염을 필요로 하고, 그의 폐기도 문제로 되며, 정제 비용을 증가시키는 경향이 있다.
한편, 이온 교환 크로마토그래피법은, 저농도의 염 용액으로부터 단백질을 흡착시키는 데는 적합하지만, 전술한 세포 배양액은 통상 적어도 생리식염수 수준(적어도 약 0.15 mol/ℓ)의 염을 함유할 경우가 많아, 이온 교환기에 의해 단백질을 포집하기 위해서는, 탈염 또는 희석에 의해 공존하는 염의 농도를 낮출 필요가 있다. 따라서, 하나의 공정을 증가시켜 투석 또는 탈염용 칼럼에 의해 전처리를 수행하거나 또는 희석에 의해 배양액의 용적을 증가시키는 것이 필요해져, 어느 경우에도 신속히 원하는 단백질을 세포 배양액으로부터 포집하는 데 적합하지 않다.
최근, V. Kasche 등(비특허 문헌 1 참조)이나, S.C. Burton 등(특허 문헌 1, 특허 문헌 2 및 비특허 문헌 2 참조), W. Schwarz 등(비특허 문헌 3 참조)에 의해, 약 음이온 교환기와 소수성 기를 양쪽 모두 지니는 리간드를 상기 친수성 기질에 고정화시킨 충전 재료를 이용해서, 중성 내지 약염기성 pH 조건 하에서, 결합 완충액 중의 염 농도에 의해 실질적으로 영향을 받는 일없이 단백질을 흡착시키고 나서, 용출액 pH를 약산성으로 해서 리간드의 음이온 교환기를 이온화함으로써, 충전 재료를 친수성으로 변화시키고, 이에 의해, 흡착된 단백질을 용출·회수하는 것이 가능하다는 것이 보고되어 있었다. 그러나, 이러한 충전 재료는 적어도 8.5의 pH에서 등전점을 지니는 단백질을 흡착시키는 것이 불가능하거나, 또는 이러한 단백 질을 흡착시키는 것이 가능하다고 해도, 흡착량은 기껏해야 수 ㎎/㎖ 정도로 한정된다.
또한, A. Groenberg 등(특허 문헌 3 참조)에 의해, 약 양이온 교환기와 탄소, 황 및 산소로 구성되는 헤테로방향족 고리를 모두 가지는 리간드를 친수성 충전 재료 상에 고정화된 충전 재료를 이용해서, 약산성 pH 조건 하에 항체를 선택적으로 흡착시키고 나서, 약염기성 pH 조건 하에 용출시키는 것이 보고되어 있다.
그러나, 약 음이온 교환기와 소수성 기를 모두 지니는 리간드를 고정화시킨 충전 재료의 경우, 중성 내지 약염기성 조건 하에 단백질 등을 흡착시킴으로써, 염기성 단백질은 이온 배제력을 받고, 반대로, 산성 단백질의 대부분의 음이온기는 이온화되므로, 표면 친수성이 높고, 소수적 흡착력이 약하며, 흡착 용량이 적어질 것이다. 한편, 특허 문헌 3에 기재된 약 양이온 교환기와 헤테로방향족 고리를 모두 지니는 리간드를 친수성 충전 재료 상에 고정화시킨 리간드 고정화 충전 재료의 경우, 특정한 단백질(항체)의 흡착을 위한 특이성은 강하지만, 단백질 전반에의 그의 적용은 곤란해서, 그 적용 범위가 좁다.
따라서, 흡착 시에는 단백질의 등전점이나 흡착 용액 중의 염농도에 의해 실질적으로 영향받는 일없이 단백질을 흡착하는 것이 가능하고, 또한 용출 시에는 pH 조건을 제어함으로써 용출하는 것이 가능한 충전 재료의 개발이 요망되고 있다.
즉, 종래의 충전 재료에서는, 단백질의 물성(예를 들어 등전점 등)에 의해, 혹은 단백질 등의 생체고분자를 용해시키는 용매 중의 염농도에 의해 흡착량이 변화되기 쉽고, 또한, 다량의 묽은 세포배양액으로부터 목표로 하는 단백질 혹은 펩 타이드 등의 생체고분자를 농축·회수하는 것은 곤란하였다.
예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피용 충전 재료의 경우, 그러한 성능은 이온강도가 낮은 용액 중에 한정되지만, 분자량이 약 10,000 내지 70,000인 단백질에 대해서는, 약 100 g/ℓ(습윤 용적) 수준의 단백질 흡착 용량을 얻을 수 있다. 또한, 이온 교환 크로마토그래피용 충전 재료의 경우, 충전 재료의 표면에 친수성 그래프트 폴리머를 고정화시키고, 그 그래프트 폴리머에 이온 교환기를 도입함으로써, 더욱 단백질 흡착 용량이 증가할 수 있다(예를 들어, 특허 문헌 4 참조).
한편, 소수적 상호작용 크로마토그래피 및 역상 분배 크로마토그래피에 있어서는, 소수성 리간드를 스페이서 없이 또는 통상 친화성 크로마토그래피에서 이용되는 단쇄 스페이서(탄소-탄소 결합을 지니되, 탄소수가 약 3 내지 10인 탄소쇄 길이를 지닌 스페이서)를 개재해서, 충전 재료에 고정화시킨 경우, 적절한 세공 크기 및 공극률(porosity)을 지닌 기질을 이용하는 경우에도, 분자량이 약 10,000 내지 100,000인 단백질의 경우, 그 흡착 용량은, 최대라도 65 ㎎/㎖이다.
또한, 소수적 상호작용 크로마토그래피 및 역상 분배 크로마토그래피에 있어서도, 전술한 이온 교환 크로마토그래피용 충전 재료의 경우와 같이 , 그래프트 폴리머 상에 소수성 기를 도입할 수는 있지만, 단백질(펩타이드를 포함함)을 유지하는 용매 조건 하에서는, 소수성 기를 도입한 그래프트 폴리머가 응집되어, 수축됨으로써, 단백질 흡착 용량은 실질적으로 증가하지 않거나, 오히려 감소할 수도 있다. 따라서, 이 종류의 충전 재료를 이용한 소수성 결합에 의거한 흡착·탈착에 의해 또는 크로마토그래피에 의해, 흡착 용량을 증가시키는 것은 불가능한 상태이 다(예를 들어, 특허 문헌 5 참조).
특허 문헌 1: 미국 특허 제5,652,348호 공보
특허 문헌 2: 미국 특허 제5,945,520호 공보
특허 문헌 3: 국제 공개 제WO2005/082483호 공보
특허 문헌 4: 일본국 공개 특허 제2008-232764호 공보
특허 문헌 5: 일본국 특허 제3,059,443호 공보
비특허 문헌 1: Journal of Chromatography, 510 (1990) p.149-154
비특허 문헌 2: Journal of Chromatography A, 814 (1998) p. 71-81
비특허 문헌 3: Journal of Chromatography A, 908, 1-2 (2001) p. 251-263.
본 발명은 상기의 배경기술을 감안하여 이루어진 것으로서, 그 목적은, 단백질의 등전점이나, 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자가 용해되는 용매의 염농도에 의해 영향을 받는 일없이, pH의 변화에 의해 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자의 흡착·탈착에 의해 해당 생체고분자의 분리·정제 또는 포집·회수를 수행할 수 있는 신규한 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제공하는 것, 및 이러한 충전 재료에 의해서, 다량의 묽은 세포 배양액으로부터 목표로 하는 단백질 등의 생체고분자를 농축·회수하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 특정한 α-아미노산 또는 아미노메틸벤조산을 아마이드 결합 또는 우레탄 결합을 개재해서 기질에 고정화시킨 액체크로마토그래피용 충전 재료, 기질에 직접 고정화된 특정한 리간드와, 특정한 스페이서를 개재해서 상기 기질에 고정화된 특정한 리간드를 지니는 액체 크로마토그래피용 충전 재료, 및 이러한 충전 재료를 이용한 단백질의 분리·정제 또는 포집·회수 방법을 찾아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, 이하에 나타낸 바와 같은 소수성 아미노산류를 고정화시킨 액체 크로마토그래피용 충전 재료, 및 이러한 충전 재료를 이용한 생체고분자의 분리·정제 또는 포집·회수 방법을 제공한다.
[1] 기질 및 해당 기질에 고정화된 리간드를 포함하는 액체 크로마토그래피용 충전 재료로서,
(1) 상기 기질은 알코올성 수산기를 표면에 지니는 친수성 기질이고;
(2) 상기 리간드는 이하의 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리간드이며:
[화학식 1]
RCH(NH2)COOH
상기 식 중, R은 방향족 기 또는 C5 -7의 비이온성 지방족 기를 나타냄;
(3) 상기 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있고;
(4) 상기 기질에 고정화된 상기 리간드의 양은 상기 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 20 mmol/ℓ(밀리몰/리터) 이상인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[2] 상기 α-아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 류신, 노르류신 및 α-아미노옥탄산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 상기 [1]항에 따른 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[3] 상기 기질은 천연 고분자계 담체, 합성 고분자계 담체 및 무기계 담체로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피용 담체인 것인, 상기 [1]항 또는 [2] 항에 따른 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[4] 상기 기질은 다공성 입자이고, 그의 제한 한계 분자량(exclusion limit molecular weight)은 풀루란(pullulan)으로 환산해서 10,000 이상인 것인, 상기 [1]항 내지 [3]항 중 어느 한 항에 따른 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[5] 기질, 해당 기질에 직접 고정화된 리간드 및 스페이서를 개재해서 상기 기질에 고정화된 리간드를 포함하는 액체 크로마토그래피용 충전 재료로서,
(1) 상기 기질은 알코올성 수산기를 표면에 지니는 친수성 기질이고;
(2) 상기 스페이서는 알코올성 수산기를 지니는 합성 고분자, 또는 다당류이며;
(3) 상기 리간드는 이하의 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리간드이고:
[화학식 1]
RCH(NH2)COOH
상기 식 중, R은 방향족 기 또는 C5 -7의 비이온성 지방족 기를 나타냄;
(4) 상기 기질에 직접 고정화된 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있으며;
(5) 상기 스페이서를 개재하여 상기 기질에 고정화된 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 스페이서에 고정화되어 있고;
(6) 상기 기질에 고정화된 상기 리간드의 양은 상기 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 30 mmol/ℓ 이상인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[6] 상기 α-아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 류신, 노르류신 및 α-아미노옥탄산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 상기 [5]항에 따른 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[7] 상기 기질은 천연 고분자계 담체, 합성 고분자계 담체 및 무기계 담체로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피용 담체인 것인, 상기 [5]항 또는 [6]항에 따른 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[8] 상기 기질은 다공성 입자이고, 그의 제한 한계 분자량은 풀루란으로 환산해서 100,000 이상인 것인, 상기 [5]항 내지 [7]항 중 어느 한 항에 따른 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[9] 상기 다당류는 음이온 교환기를 지니지 않는 중량 평균 분자량이 10,000 이상인 다당류, 또는 그의 유도체인 것인, 상기 [5]항 내지 [8]항 중 어느 한 항에 따른 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
[10] 상기 [1]항 내지 [4]항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서, 기질 중의 알코올성 수산기를 유기 용매 중의 1,1-카보닐비스-1H-이미다졸로 활성화시키고 나서 유기 용매 또는 함수 유기 용매 중에서 리간드 중의 아미노기와 반응시켜, 우레탄 결합에 의해 상기 리 간드를 상기 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
[11] 상기 [1]항 내지 [4]항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서, 카복실기를 기질에 도입하고 나서, 카보다이이미드를 촉매로서 이용해서 리간드의 아미노기와 반응시켜, 아마이드 결합에 의해 상기 리간드를 상기 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
[12] 상기 [5]항 내지 [9]항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서, 기질 중의 알코올성 수산기 및 스페이서 중의 알코올성 수산기를 유기 용매 중의 1,1-카보닐비스-1H-이미다졸로 활성화시키고 나서 유기 용매 또는 함수 유기 용매 중에서 리간드 중의 아미노기와 반응시켜, 우레탄 결합에 의해 상기 리간드를 직접 또한 상기 스페이서를 개재해서 상기 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
[13] 상기 [5]항 내지 [9]항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서, 카복실기를 기질 및 스페이서에 도입하고 나서, 카보다이이미드를 촉매로서 이용해서 리간드의 아미노기와 반응시켜, 아마이드 결합에 의해 상기 리간드를 직접 또한 상기 스페이서를 개재해서 상기 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
[14] 액체 크로마토그래피에 의해 생체고분자를 분리·정제 또는 포집·회수 하는 방법으로서, 상기 [1]항 내지 [9]항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 이용해서 pH 5 이하의 산성 수용액 중에서 상기 생체고분자를 흡착시키는 단계; 및 이어서, 해당 흡착된 생체고분자를 중성 혹은 pH 9 이하의 약염기성 조건 하에 탈착시키는 단계를 포함하는, 생체고분자의 분리·정제 또는 포집·회수 방법.
본 발명의 액체 크로마토그래피용 충전 재료는, 소수성 기와 카복실기를 지니는 리간드가 친수성 기질에 고정화되어 있고, 산성 수용액 중에서는 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자를 흡착하고, 중성 내지 약염기성 조건 하에서는 상기 흡착된 생체고분자를 탈착시킬 수 있으므로, 이러한 생체고분자의 소수성 및 이온성에 따라서 이러한 생체고분자를 용출시켜 회수할 수 있다.
또, 본 발명의 액체 크로마토그래피용 충전 재료가 특정한 스페이서(알코올성 수산기를 지닌 합성 고분자 또는 다당류)를 개재해서 기질에 고정화된 상기 리간드를 지니는 경우, 이러한 스페이서를 개재해서 상기 리간드가 상기 기질에 고정화되어 있지 않은 충전 재료와 비교해서, 충전 재료의 단위 용적당의 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자의 결합 용량을 증가시키는 것이 가능하고, 이에 따라, 신속하고 효율적으로 생체고분자를 분리·정제 또는 농축·회수할 수 있다.
또한, 본 발명의 액체 크로마토그래피용 충전 재료는, 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자가 용해되는 용매의 염농도에 의해 영향받는 일없이, pH의 변화에 의해 생체고분자의 흡착·탈착에 의해, 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자를 분리·정제 또는 포집·회수하는 것이 가능한 분리 재료이다.
또, 본 발명의 상기 분리·정제 또는 포집·회수 방법에 의하면, 다량의 묽은 세포 배양액으로부터 단백질 혹은 펩타이드 등의 비교적 불안정한 생체고분자를 보다 컴팩트한 설비로 신속하게 다량으로 분리·정제 또는 농축·회수할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 생리식염수의 농도 또는 그 이상 농도의 염을 함유하는 세포 배양 상청액을, pH 조정 등의 단지 간편한 전처리 후에, 본 발명의 충전 재료에 접촉시킴으로써 단백질 혹은 펩타이드 등의 생체고분자를 분리·정제 또는 농축·회수할 수 있다.
본 발명에 있어서, 제1의 액체 크로마토그래피용 충전 재료는, 기질 및 해당 기질에 고정화된 리간드를 포함하는 액체 크로마토그래피용 충전 재료로서,
(1) 상기 기질은 알코올성 수산기를 표면에 지니는 친수성 기질이고;
(2) 상기 리간드는 이하의 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리간드이며:
[화학식 1]
RCH(NH2)COOH
상기 식 중, R은 방향족 기 또는 C5 -7의 비이온성 지방족 기를 나타냄;
(3) 상기 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있 고;
(4) 상기 기질에 고정화된 상기 리간드의 양은 상기 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 20 mmol/ℓ 이상이다.
또, 본 발명에 있어서, 제2의 액체 크로마토그래피용 충전 재료는, 기질, 해당 기질에 직접 고정화된 리간드 및 스페이서를 개재해서 상기 기질에 고정화된 리간드를 포함하는 액체 크로마토그래피용 충전 재료로서,
(1) 상기 기질은 알코올성 수산기를 표면에 지니는 친수성 기질이고;
(2) 상기 스페이서는 알코올성 수산기를 지니는 합성 고분자, 또는 다당류이며;
(3) 상기 리간드는 이하의 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리간드이고:
[화학식 1]
RCH(NH2)COOH
상기 식 중, R은 방향족 기 또는 C5 -7의 비이온성 지방족 기를 나타냄;
(4) 상기 기질에 직접 고정화된 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있으며;
(5) 상기 스페이서를 개재하여 상기 기질에 고정화된 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 스페이서에 고정화되어 있고;
(6) 상기 기질에 고정화된 상기 리간드의 양은 상기 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 30 mmol/ℓ 이상이다.
이들은 각각 액체 크로마토그래피용 충전 재료로서, 리간드가 기질에 고정화되어 있고, 이들은, 기질이 알코올성 수산기를 표면에 지니는 친수성 기질이고, 상기 리간드가 상기 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리간드이며, 또한 상기 리간드가 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있는 점에서 공통이다.
본 발명의 액체 크로마토그래피용 충전 재료에 이용하는 기질은, 알코올성 수산기를 그 표면에 지니는 친수성 기질이며, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 크로마토그래피용 담체로서 통상 사용되는, 천연 고분자계 담체, 합성 고분자계 담체 또는 무기계 담체 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 천연 고분자계 담체로서는, 예를 들어 셀룰로스, 아가로스(agarose) 혹은 덱스트란 등의 다당류를 들 수 있다. 합성 고분자계 담체로서는, 예를 들어, 2-하이드록시에틸(메타)아크릴레이트, 2-하이드록시메틸(메타)아크릴레이트 혹은 하이드록시프로필(메타)아크릴레이트 등의 수산기 함유 단량체를, 에틸렌 글라이콜 다이(메타)아크릴레이트 혹은 다이비닐벤젠 등의 가교성 단량체와 혼합하고, 이들을 중합개시제의 존재 하에 중합함으로써 조제한 것 등을 들 수 있다. 무기계 담체로서는, 예를 들어, 실리카, 제올라이트 등을 들 수 있다.
또, 본 발명에 있어서, 기질의 형태로서는, 예를 들어, 구상 입자, 비구상(non-spherical) 입자, 막, 모놀리스(monolith)(연속체) 등을 들 수 있지만, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서는, 이들 중, 수용성 고분자(예를 들어, 단백질 혹은 펩타이드 등)의 크기 배제 크로마토그래피용 충전 재료로서 이용가능한 액체 크로마토그래피용 담체이며, 알코올성 수산기를 그 표면에 지닌 것을 적합하게 사용할 수 있다.
구체적으로는, (메타)아크릴산 에스테르계 모노머 또는 (메타)아크릴아마이드계 모노머로 대표되는 모노머를 가교성 모노머와 공중합시켜서 입자화한 것[예를 들어, (메타)아크릴산 에스테르계 충전 재료 또는 (메타)아크릴아마이드계 충전 재료 등]이나, 아세트산 비닐과 가교제(2 작용성 이상의 모노머)를 공중합시켜 입자화하고 나서, 아세트산 비닐 모노머 단위를 가수분해함으로써 얻어진 것, 또는 예를 들어 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 등으로 대표되는 다당류를 가교시켜 얻어진 것(다당계 충전 재료)을 적합하게 사용할 수 있다.
특히, (메타)아크릴산 에스테르계 충전 재료로서는, 예를 들어, 2-하이드록시에틸(메타)아크릴레이트와 에틸렌 글라이콜 다이(메타)아크릴레이트의 공중합체의 입자, 글라이시딜 메타크릴레이트와 에틸렌 글라이콜 다이(메타)아크릴레이트의 공중합체의 입자를 물 또는 다가 알코올로 글리시딜기를 개환부가시켜 얻어진 입자 등을 들 수 있다.
또, (메타)아크릴아마이드계 충전 재료로서는, 예를 들어, 2-하이드록시에 틸(메타)아크릴아마이드와 N,N'-메틸렌 다이(메타)아크릴아마이드의 공중합체의 입자 등을 들 수 있다.
또한, 다당계 충전 재료로서는, 예를 들어, 아가로스, 덱스트란 혹은 셀룰로스 등의 다당류를 에피할로하이드린 혹은 C2 -8의 폴리메틸렌 다이할로겐 등으로 가교시켜 해당 다당류의 수산기들을 가교시킴으로써 얻어진 충전 재료 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 충전 재료로서 충분한 흡착 용량을 확보하기 위해서는, 사용되는 기질은 다공성 입자이며, 그의 세공 크기는 처리될 수용성 고분자(예를 들어, 단백질 혹은 펩타이드 등)의 분자 크기보다 큰 것이 바람직하다. 상기 제1의 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 경우, 기질의 배제 한계 분자량은 풀루란으로 환산해서 10,000 이상이 바람직하다. 또, 상기 제2의 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 경우, 기질의 배제 한계 분자량은 풀루란으로 환산해서 100,000 이상이 바람직하다. 더 많은 흡착 용량을 얻기 위해서는, 유효 표면적이 충분히 큰 것이 필요하다. 극도로 큰 세공 또는 비다공성 충전 재료도 기능을 제공할 수 있지만, 그들의 유효 표면적은 적고, 흡착 용량은 적어지는 경향이 있다.
또, 시료 용액 및 용리액을 실용적인 유속에서 흐르게 할 경우의 통액성(liquid flowability)을 고려하면, 충전 재료는 물리적인 강도를 지닐 것이 요구된다. 다공성 충전 재료의 경우, 순수에서의 팽윤도는 12.5 ㎖/g 이하가 바람직하다.
상기 제2의 액체 크로마토그래피용 충전 재료에 있어서, 스페이서는, 알코올성 수산기를 지니는 합성 고분자, 또는 다당류이며, 음이온 교환기를 지니지 않는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들어, 풀루란, 덱스트란, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스 등을 들 수 있다. 이러한 스페이서의 분자량은 너무 작으면, 기질의 세공 내벽에 고정화되었을 경우, 세공 내를 채울 수 없고, 생체고분자의 결합 용량을 증가시키는 효과는 한정적일 것이다. 한편, 상기 분자량이 너무 크면, 기질의 세공 내에 진입할 수 없고, 기질의 외부 표면에밖에 고정화될 수 없어, 흡착 용량을 증가시키는 효과는 매우 적을 것이다. 따라서, 스페이서의 중량 평균 분자량은 10,000 이상이 바람직하다. 중량 평균 분자량의 상한은 기질의 배제 한계 분자량에 의존한다. 그러나, 이러한 고분자의 분자량 분포는 통상 넓고, 중량 평균 분자량의 상한은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 알코올성 수산기를 지니는 합성 고분자 또는 다당류를 기질에 고정화시키는 방법으로서는, 예를 들어, 우선 에피할로하이드린 또는 폴리알코올의 폴리글라이시딜에터와 기질을, 강 알칼리성 수성 매체 중에, 부가 및/또는 탈할로겐화수소하고, 기질을 에폭시-활성화한 후, 잔류하는 에피할로하이드린 또는 폴리알코올의 폴리글라이시딜에터를 세정 제거 후, 물에 용해된 알코올성 수산기를 지니는 합성 고분자 또는 다당류와 혼합하고, 강 알칼리성 조건 하에 부가반응시켜, 고정화하는 방법 등을 들 수 있다.
상기 방법에 있어서, 에피할로하이드린으로서는, 예를 들어, 에피클로로하이 드린 또는 에피브로모하이드린 등을 사용할 수 있고, 또한, 폴리알코올의 폴리글라이시딜에터로서는, 예를 들어, 에틸렌 글라이콜, 뷰테인다이올, 프로필렌 글라이콜, 글라이세린, 펜타에리트리톨, 소르비톨, 다이글라이세롤 등의 폴리글라이시딜에터를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 리간드는, 소수성 기와 카복실기를 지닌 것이다. 구체적으로는, 상기 화학식 1로 표시되는 소수성 기를 지닌 α-아미노산, 또는 아미노메틸벤조산이다. 소수성 기를 지니는 α-아미노산으로서는, 방향족 기를 지닌 α-아미노산이나, C5 -7의 비이온성 지방족 기를 지닌 α-아미노산이 본 발명의 기능을 발휘하는 리간드가 될 것이다. 구체적으로는, 방향족 기를 지닌 α-아미노산으로서는, 예를 들어, 페닐알라닌 또는 트립토판 등을 들 수 있다. 비이온성 지방족 기를 지닌 α-아미노산으로서는, 구체적으로는, 류신, 노르류신 또는 α-아미노옥탄산 등을 들 수 있다. 이들 α-아미노산류에는 광학이성체가 있지만, L-이성질체, D-이성질체 및 라세미체에 관계없이 본 발명의 기능을 발휘한다.
본 발명에 있어서, 사용하는 리간드의 종류에 따라서는, 리간드 밀도가 너무 높을 경우에 소수성이 지나치게 강해져서, 처리될 수용성 고분자(예를 들어 단백질 혹은 펩타이드 등)를 흡착했을 때에 그것을 변성시켜 버려, 회수율이 저하하는 경향이 있다. 이러한 경우에는, 소수성 리간드로서 기능하지 않지만, 소수성을 조절하기 위해서 중성 내지 산성 아미노산이나, 친수성 아민을, 본 발명의 리간드와 함께 도입할 수 있다.
중성 내지 산성 아미노산으로서는, 예를 들어 글라이신, 알라닌, β-알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 글루탐산 또는 타이로신 등을 들 수 있다.
또, 친수성 아민으로서는, 예를 들어, 에탄올아민, 2-아미노-(2-하이드록시메틸), 1,3-프로페인다이올 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 이러한 리간드를 기질에 도입하는 방법은, 소수성 결합에 의해서 단백질 등을 유지할 수 있도록 리간드 밀도를 충분히 높게 할 수 있는 것 및 음이온 교환기가 실질적으로 공존하지 않는 것이 필요 조건으로서 요구된다. 즉, 얻어지는 충전 재료에 음이온 교환기가 공존하면, 산성 pH에서 이온으로 분해되어, 충전 재료의 친수성을 증가시켜, 소수적 상호작용을 방해하게 된다. 본 발명에 있어서 리간드를 도입하는 방법은, 이러한 조건을 충족시키는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니다. 그 구체적인 예로서, 이하의 두 가지 방법을 언급할 수 있다.
제1합성 방법은, 기질 중의 알코올성 수산기를 유기 용매 중의 1,1-카보닐비스-1H-이미다졸(이하, "CDI"로 간략히 약칭함)로 활성화시킨 후, 해당 활성화된 기를 유기 용매 또는 함수 유기 용매 중에서 리간드의 아미노기와 반응시켜, 우레탄 결합에 의해 상기 리간드를 상기 기질에 도입하는 방법이다.
제2합성 방법은, 기질에 카복실기를 도입한 후, 카보다이이미드류를 촉매로서 이용해서 그것과 리간드의 아미노기를 반응시켜, 아마이드 결합에 의해 상기 리간드를 상기 기질에 도입하는 방법이다.
상기 제2합성 방법에 있어서, 기질에 카복실기를 도입하는 방법으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들어, 기질의 알코올성 수산기에 대해서 할로겐화 카복실산류를 알칼리성 조건 하에 반응시키는 방법, 할로하이드린을 알칼리성 조건 하에 부가시켜, 에폭시기를 도입하고, 머캅토 카복실산(예를 들어 머캅토아세트산 혹은 머캅토프로피온산 등)을 중성 혹은 약 알칼리성 조건 하에 반응시키는 방법, 또는 알릴 글라이시딜 에터를 부가하여 알릴기를 도입하고, 머캅토카복실산을 산성 조건 하에 반응시키는 방법 등을 들 수 있다.
또, 제2합성 방법에 있어서, 카보다이이미드로서는, 유기 용매계용에는, 예를 들어, 다이아이소프로필카보다이이미드 혹은 다이사이클로헥실카보다이이미드 등을 사용할 수 있고, 수계 또는 물과 유기 용매의 혼합계용에는, 예를 들어, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염, N-사이클로헥실-N'-(2-모르폴리노에틸)카보다이이미드-메조-p-톨루엔설폰산염 등을 사용할 수 있다. 또한, 기질에 카복실기를 도입한 후, 카보다이이미드류에 의해 카복실기를 활성화시킬 때에, N-하이드록시숙신이미드(이하, "NHS"로 간단히 약칭할 경우가 있음) 또는 1-하이드록시벤조트라이아졸을 공존시켜, 아미노기를 지닌 리간드와 반응시킴으로써, 부반응을 억제할 수도 있다.
그런데, B. H. J. Hofstee 등의 문헌[Biochemical and Biophysical research communications, 63 (1975) p. 618-624] 혹은 M. Kim 등의 문헌[Journal of Chromatography, 585 (1991) p.45-51]에서 보고되어 있는 바와 같이, 전술한 방법 이외의 방법으로, 소수성 아미노산을 기질에 도입하는 것은 이미 알려져 있다. 그 러나, 상기 B. H. J. Hofstee 등에 의해 보고된 바와 같이, 브롬화시안 활성화법에 의해서는 충분히 소수성 아민을 도입할 수 없고, 용리액으로서 고농도의 용액을 사용하지 않으면 단백질을 흡착할 수 없다.
또, 기질에 에폭시기나 포르밀기를 도입한 후, 2급 아민 결합에 의해 아미노산을 도입할 수 있다. 그러나, 이러한 방법에서는, 산성 조건 하에서 아미노기가 이온화되고, 중성 조건 하에서는 아미노기와 카복실기가 모두 부분적으로 이온화되며, 염기성 조건 하에서는 카복실기가 이온화된다. 따라서, 상기 M. Kim 등의 보고에 기재되어 있는 바와 같이, 저이온강도의 용리액에서는, 단백질을 정전기적 상호작용에 의해 흡착하는 것이 가능하지만, 소수적 상호작용은 강하게 작용하지 않아, 용리액의 이온강도가 증가함에 따라 단백질은 방출된다. 따라서, 리간드의 고정화에 의해 음이온 교환기가 형성되는 이러한 리간드의 도입 방법은, 본 발명에 있어서는 채용될 수 없다. 또한, 본 발명에 있어서, 기질에 고정화된 리간드의 양은, 상기 제1의 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 통상 20 mmol 이상이거나, 또는 상기 제2의 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 통상 30 mmol 이상이다.
상기 합성 방법에 의해 얻어진 본 발명의 액체 크로마토그래피용 충전 재료는, 소수성 기와 카복실기를 지닌 리간드가 기질에 고정화되어 있는 충전 재료일 것이다.
또, 상기 방법에 의해 기질에 스페이서를 고정화하고 또한 상기 합성 방법에 의해 기질에 리간드를 고정화함으로써, 기질에 직접 고정화된 리간드와, 스페이서 를 개재해서 기질에 고정화된 리간드를 가진 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 얻는 것이 가능해진다.
예를 들어, 기질의 알코올성 수산기와 스페이서의 알코올성 수산기를 유기 용매 중의 1,1-카보닐비스-1H-이미다졸로 활성화시킨 후, 해당 활성화된 기들을 유기 용매 또는 함수 유기 용매 중에서 리간드의 아미노기와 반응시켜, 우레탄 결합에 의해 상기 리간드를 직접 또한 스페이서를 개재해서 상기 기질에 도입함으로써, 또는 기질 및 스페이서에 카복실기를 도입하고 나서, 카보다이이미드를 촉매로서 이용해서 리간드의 아미노기와 반응시켜, 아미노 결합에 의해 리간드를 직접 그리고 스페이서를 개재해서 기질에 도입함으로써, 제2의 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 얻는 것이 가능해진다.
또한, 이와 같이 해서 얻어진 충전 재료에 있어서, 기질에 직접 고정화된 리간드는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 포함되는 아미노기를 기재해서, 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있고, 스페이서를 개재해서 기질에 고정화된 리간드는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에 포함되는 아미노기를 개재해서 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 스페이서에 고정화되어 있다.
본 발명의 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 액체 크로마토그래피용 칼럼에 충전시키고, pH 5 이하(바람직하게는, pH가 3 내지 5)의 용리액을 흐르게 하면, 칼럼 내의 pH가 내려가, 카복실기의 이온화가 감소하고,이에 따라, 상기 충전 재료의 표면의 소수성이 증가하게 된다. 이 시점에서, 상기 충전 재료가, 소수성 표면 을 가지는 용질(예를 들어 단백질 혹은 펩타이드 등)이 용해된 시료 용액과 접촉하게 되면, 용질은 충전 재료에 흡착된다. 또한, 본 발명에 있어서는, 시료용액에 산 또는 알칼리를 첨가하여, 그 pH를 5 이하의 산성 용액으로 하는 것이 바람직하다.
이어서, 비흡착 성분을 상기 용리액과 동일한 pH를 지닌 용리액으로 세정한 후, 해당 용리액의 pH를 서서히 증가시키면, 충전 재료 중의 카복실기의 이온화(이온화의 비율)가 증가하고, 반대로 충전 재료 표면의 소수성은 감소하는 경향이 있다. 그 후, 중성 또는 pH 9 이하의 약염기성 조건 하에, 흡착되어 있던 용질이 그 표면 소수성에 따라서 상기 충전 재료로부터 탈착되어 용출될 것이다.
이와 같이, 본 발명에 있어서는, 용질과 충전 재료 간의 소수적 상호작용을 약화시킴으로써, 용질의 소수성 및 이온성에 의거한 분리·정제에 의해 각각의 용질을 용출·회수할 수 있다. 또한, 이 시점에서, 급격하게 용리액의 pH를 중성 또는 약염기성 조건까지 증가시키면, 흡착되어 있던 용질을 농축된 용액의 형태로 용출·회수할 수도 있다.
실시예
이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 결코 이들로 제한되지 않는 것으로 이해할 필요가 있다. 또한, 이하의 실시예 및 비교 예로 이용하는 기질은 각각 알코올성 수산기를 그 표면에 지닌 담체(친수성 기질)이다. 상기 기질의 수성 조건에서의 다공성 구조에 관한 물성을 배제 한계 분자량 및 공극률에 의해 평가하였다. 그 측정 방법은 다음과 같다.
배제 한계 분자량 및 공극률의 측정:
친수성 기질의 겔 슬러리 수용액(gel slurry aqueous solution)을 이용해서, 내경 10.7㎜, 길이 150㎜의 스테인레스강제 칼럼에 최고 충전 밀도로 상기 기질을 충전하였다. 다음에, RI-8020 검출기(토소사(TOSOH CORPORATION) 제품)를 장비한 HPLC 시스템(토소사 제품)에 상기 충전 칼럼을 장착하였다.
이어서, 표준물질로서 분자량이 40,000,000인 덱스트란, 표 1에 기재된 각 분자량의 풀루란 및 폴리에틸렌 글라이콜을 이용해서, 0.5 ㎖/분의 유속으로 각종 분자량을 지닌 상기 표준물질을 주입하고, 그 용출량으로부터 배제 한계 분자량을 구하였다. 또한, 덱스트란과 에틸렌 글라이콜의 용출량 및 칼럼 용적으로부터 공극률을 구하였다.
측정에 사용한 친수성 기질은, 예컨대, 폴리메타크릴산 에스테르계 다공성 충전 재료[토요펄(TOYOPEARL) HW-65C, HW-55C 및 HW-50C(이상, 토소사 제품)], 가교 아가로스계 충전 재료[세파로스 6-패스트 플로(Sepharose 6-Fast Flow )(GE헬스케어사(GE Healthcare) 제품)] 및 가교 덱스트란계 충전 재료[세파덱스(Sephadex) G-25(GE헬스케어사 제품)]의 5가지 충전 재료이다. 얻어진 결과를 표 1에 나타낸다.
기질 배제 한계 분자량 표준 고분자 공극률(%)
HW65C 2,100,000 풀루란 75
HW60C 600,000 풀루란 74
HW50C 10,000 풀루란 78
세파로스 6FF 400,000 풀루란 90
세파덱스 G25 3,000 PEG1 ) 70
1) PEG: 폴리에틸렌 글라이콜
제조예 1
알코올성 수산기를 표면에 지닌 폴리메타크릴산 에스테르계 다공성 충전 재료[토요펄 HW-60C(토소사 제품)]을, 유리 필터(glass filter) 상에서, 다이옥세인(dioxane) 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크(suction dry-gel cake)를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g과 다이옥세인 100 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크(separable flask)에 가하여, 교반하였다. CDI 60 mmol을 다이옥세인 30 g에 용해시키고, 30℃의 일정 온도에서 상기 CDI 용액을 상기 분리형 플라스크에 적하하였다. 적하 후, 1시간 동안 교반을 계속하였다. 그 후, 슬러리를 유리 필터에 의해 여과하고, 다이옥세인 용매로 상기 겔을 세정하여, 미반응 CDI나 부생성물을 제거함으로써, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다.
얻어진 겔 케이크 전체량을 재차 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 100 ㎖의 다이메틸포름아마이드(이하, "DMF"라 약칭함)를 가해서 교반하였다. L-페닐알라닌 24 mmol과 글라이신 6 mmol을 1 mol/ℓ의 수산화나트륨을 함유하는 수용액 25 ㎖에 용해시키고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 상기 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 1이라 칭한다.
이온 교환 용량의 측정:
세정된 충전 재료 1(석션 드라이-겔 케이크) 10 g을 15 ㎖의 순수에 현탁시켜, 유리 필터가 장착된 내경 20㎜의 유리 칼럼에 붓고, 흡인 여과에 의해 용매를 제거하였다. 형성된 베드(bed)(칼럼에 퇴적된 충전 재료 부분)로부터, 10 ㎖를 넘는 충전 재료 부분을 제거하고(즉, 칼럼 내의 충전 재료가 10 ㎖로 됨), 0.5 mol/ℓ 염산 30 ㎖로 2회 세정하고, 그 후 순수 40 ㎖로 여과액의 pH가 5 이상으로 될 때까지 세정을 반복하였다. 세정된 충전 재료를 꺼내고, 200 ㎖의 비이커에 옮기고 나서, 100 ㎖의 0.5 mol/ℓ의 염화나트륨 용액에 현탁시키고, 자동 적정 장치(COM-450, 히라누마 산교(주)(Hiranuma Sangyo Corporation) 제품)를 이용하여 0.5 mol/ℓ 수산화나트륨 용액으로 적정하였다. 종점은 pH 8.5였다. 종점까지의 적정 액체 용적으로부터 산출된 이온 교환 용량은 125 밀리당량(meq)/ℓ였다. 상기 충전 재료 1에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은 해당 충전 재료 1의 이온 교환 용량에 대응하고 125 mmol/ℓ이다.
제조예 2
제조예 1과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 겔 케이크 전체량을 재차 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 100 ㎖의 DMF를 가하고 나서 교반하였다. DL-페닐알라닌 24 mmol과 에탄올아민 6 mmol을 1 mol/ℓ의 수산화나트륨 수용액 25 ㎖에 용해시키고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 2라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 80 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 2에 대한 페닐알라닌-리간드의 도입량은, 해당 충전 재료 2의 이온 교환 용량에 대응하고, 80 mmol/ℓ이다.
제조예 3
제조예 1과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 겔 케이크 전체량을 재차 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 100 ㎖의 DMF를 가해서 교반하였다. 4-아미노메틸벤조산 30 mmol을 1 mol/ℓ의 수산화나트륨 수용액 25 ㎖에 용해시키고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 3이라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 105 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 3에 대한 4-아미노메틸벤조산-리간드의 도입량은, 해당 충전 재료 3의 이온 교환 용량에 대응하고, 105 mmol/ℓ이다.
제조예 4
제조예 1과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 겔 케이크 전체량을 재차 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 100 ㎖의 DMF를 가하고 나서 교반하였다. L-류신 30 mmol을 1 mol/ℓ의 수산화나트륨 수용액 25 ㎖에 용해시키고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 4라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 110 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 4에 대한 류신-리간드의 도입량은, 해당 충전 재료 4의 이온 교환 용량에 대응하고, 110 mmol/ℓ이다.
제조예 5
가교 아가로스계 충전 재료[세파로스 6-패스트 플로(GE헬스케어사 제품)]를 유리 필터 상에서, 다이옥세인 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g을 제조예 1과 마찬가지 방법으로 반응·처리하여 충전 재료 5를 얻었다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 100 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 5에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 5의 이온 교환 용량에 대응하고, 100 mmol/ℓ이다.
제조예 6
알코올성 수산기를 표면에 지닌 폴리메타크릴산 에스테르계 다공성 충전 재료[토요펄 HW-65C(토소사 제품)]를 유리 필터 상에서, 다이옥세인 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g을, 제조예 1과 마찬가지 방법으로 반응·처리해서 충전 재료 6을 얻었다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 80 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 6에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 6의 이온 교환 용량에 대응하고, 80 mmol/ℓ이다.
제조예 7
알코올성 수산기를 표면에 지닌 폴리메타크릴산 에스테르계 다공성 충전 재료[토요펄 HW-50C(토소사 제품)]를 유리 필터 상에서, 다이옥세인 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g을 제조예 1과 마찬가지 방법으로 반응·처리해서 충전 재료 7을 얻었다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 185 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 7에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 7의 이온 교환 용량에 대응하고, 185 mmol/ℓ이다.
제조예 8
가교 덱스트란계 충전 재료[세파덱스 G-25(GE헬스케어사 제품)]를 유리 필터 상에서, 다이메틸설폭사이드(이하, "DMSO"라 약칭함) 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g과 DMSO 100 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 가하고 나서, 교반하였다. CDI 60 mmol을 다이옥세인 30 g에 용해시키고, 30℃의 일정 온도에서 상기 CDI 용액을 상기 분리형 플라스크에 적하하였다. 적하 후, 1시간 동안 교반을 계속하였다. 그 후, 상기 슬러리를 유리 필터에 의해 여과하고, DMSO 용매에서 얻어진 겔을 세정하여, 미반응 CDI나 부생성물을 제거함으로써, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다.
얻어진 겔 케이크 전체량을 재차 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 100 ㎖의 DMSO를 가하고 나서 교반하였다. L-페닐알라닌 24 mmol과 글라이신 6 mmol을, 1 mol/ℓ의 수산화나트륨을 함유하는 수용액 25 ㎖에 용해시키고, 50 ㎖의 DMSO를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 상기 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMSO, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 8이라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 160 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 8에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 8의 이온 교환 용량에 대응하고, 160 mmol/ℓ이다.
제조예 1 내지 제조예 8에 의해 조제한 각 충전 재료의 기질, 활성화제, 리간드 및 이온 교환 용량을 표 2에 나타낸다.
충전
재료		 제조예 기질 활성
화제		 리간드 1)
(몰비)		 이온
교환
용량		 단백질 용출량(㎖) BSA 흡착량
meq/ℓ STI BSA IgG CHY ㎎/㎖ 회수율
(%)
1 1 HW60C CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 125 20.9 37.3 38.7 42.9 60 95
2 2 HW60C CDI DL-Phe:EA
(8/2)		 80 27.0 40.1 40.5 42.3 57 95
3 3 HW60C CDI 4-AMBA 105 50.0 50.0 50.0 50.2 55 97
4 4 HW60C CDI L-Leu 110 6.0 36.4 30.7 24.6 57 94
5 5 세파로스 6FF CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 100 18.5 34.5 34.0 41.2 58 95
6 6 HW65C CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 80 18.0 33.8 33.0 40.6 34 95
7 7 HW50C CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 185 21.0 34.2 31.5 40.6 24 92
8 8 세파덱스 G25 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 160 13.0 25.5 21.4 25.4 5 90
1) EA: 에탄올아민, 4-AMBA: 4-아미노메틸벤조산, L-Leu: L-류신
제조예 9
제조예 1에서도 이용한 토요펄 HW-60C(토요사 제품)을 유리 필터 상에서 순수에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 순수 치환한 후, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 120 g과 클로로아세트산나트륨 0.8 mol 및 순수 140 ㎖를 500 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반하면서, 반응온도 50℃에서 48% 수산화나트륨 수용액을 1.6 mol의 수산화나트륨에 상당하는 양으로 상기 분리형 플라스크에 적하하였다. 적하 종료 후 1시간 반응을 계속하고, 얻어진 겔을 순수로 세정하였다. 이 반응에 의해 얻어진, 이온 교환기로서 카복시메틸기를 지닌 겔을 CM 이온 교환 충전 재료 1이라 칭한다(CM은 카복시메틸의 약어임). 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 이온 교환 용량을 측정한 바, 155 meq/ℓ였다.
팽윤도의 측정:
CM 이온 교환 충전 재료 1을 0.5 mol/ℓ 수산화나트륨 30 ㎖로 2회 세정하고, 그 후 순수 40 ㎖로 여과액의 pH가 8.5 이하로 될 때까지 세정을 반복하였다. 세정된 충전 재료(석션 드라이-겔 케이크) 10 g을 15 ㎖의 순수에 현탁시켜, 유리 필터가 장착된 내경 20㎜의 유리 칼럼에 붓고, 흡인 여과에 의해 용매를 제거하였다. 형성된 베드로부터, 10 ㎖ 이상의 충전 재료를 제거하고, 그 후, 남은 10 ㎖의 충전 재료를 유리 필터에 옮기고 나서, 0.5 mol/ℓ 염산 30 ㎖로 2회 세정하였다. 그 후, 순수 40 ㎖로 여과액의 pH가 5 이상으로 될 때까지 충전 재료의 세정을 반복하였다. 40 ㎖의 아세톤으로 2회 세정한 후, 세정된 충전 재료를 꺼내고, 40℃에서 감압 하 건조시켜, 충전 재료 10 ㎖의 중량을 측정하여 팽윤도를 산출하였다[팽윤도(㎖/g) = 체적(㎖)/중량(g)]. 이 충전 재료의 팽윤도는 5.2 ㎖/g이었다.
또, 이 건조된 충전 재료를 원소 분석용 시료로서 이용해서, CHN 전자동분석장치(퍼킨엘머사(Perkin Elmer) 제품, 2400II 형태)에 의해 질소 중량 퍼센트를 측정하였다. 또한, 제조예 10 이후도, 건조된 충전 재료의 원소분석을 마찬가지 방법으로 실시하였다.
제조예 10
제조예 9에서 합성한 CM 이온 교환 충전 재료 1 60 g을 유리 필터 상에서 0.5 mol/ℓ의 염산, 다음에 순수로 여과액이 중성이 될 때까지 세정하였다. 또한, 다이옥세인 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 60 g과 다이옥세인 150 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고 나서, N-하이드록시숙신이미드(이하, "NHS"라 약칭함) 30 mmol과 다이아이소프로필카보다이이미드(이하, "DIC"라 약칭함) 30 mmol을 가하고 나서 교반하였다. 30℃에서 4시간 교반을 계속하고 나서, 슬러리를 유리 필터에 의해 여과하였다. 얻어진 겔을 다이옥세인 용매에 의해 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거함으로써, 다이옥세인-석션 드라이-겔 케이크 63.5 g을 얻었다. 이 반응으로부터 얻어진 겔 케이크를 NHS 활성화 충전 재료 1이라 칭한다.
이 NHS 활성화 충전 재료 1을 20 g 취하여, 100 ㎖의 분리형 플라스크에 가하고 나서, 20 ㎖의 다이옥세인, 0.1 mol/ℓ의 인산염 완충액(pH 6.9) 40 ㎖ 및 L-트립토판 12 mmol을 가해서 교반하였다. 25℃에서 16시간 반응 후, 이 반응액을 여과해서 제거하고 나서, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ 염산, 순수 및 0.1 mol/ℓ 수산화나트륨의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 충전 재료를 충전 재료 9라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 충전 재료 9의 이온 교환 용량을 측정한 바, 148 meq/ℓ였다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 충전 재료 9의 팽윤도를 측정한 바 4.8 ㎖/g이었다.
제조예 11
제조예 10에서 합성한 NHS 활성화 충전 재료 1을 20 g 취하여, 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 이어서, 20 ㎖의 다이옥세인, 0.1 mol/ℓ의 인산염 완충액(pH 6.9) 40 ㎖ 및 L-페닐알라닌 12 mmol을 가해서 교반하였다. 25℃에서 16시간 반응 후, 이 반응액을 여과해서 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ 염산, 순수, 0.1 mol/ℓ 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 10이라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 148 meq/ℓ였다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 4.8 ㎖/g이었다.
제조예 12
제조예 10에서 합성한 NHS 활성화 충전 재료 1을 20 g 취하여, 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 이어서, 20 ㎖의 다이옥세인, 0.1 mol/ℓ 인산염 완충액(pH 6.9) 40 ㎖ 및 α-아미노옥탄산 12 mmol을 가해서 교반하였다. 25℃에서 16시간 반응 후, 이 반응액을 여과해서 제거하고 나서, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ 염산, 순수 및 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 11이라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 148 meq/ℓ였다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 4.8 ㎖/g이었다.
제조예 13
제조예 9에서 합성한 CM 이온 교환 충전 재료 1 30 g(35 ㎖에 상당함)과 35 ㎖의 순수를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 4.8로 조정하였다. 다음에, 다이옥세인 30 ㎖와 NHS 10.9 mmol을 상기 분리형 플라스크에 가하고 나서 교반 혼합하여, NHS를 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(이하, "EDC"라 약칭함) 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 2시간 교반을 계속해서 반응시켰다. 반응액을 여과에 의해 제거하고 나서, 얻어진 겔을 순수 및 다이옥세인의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거해서, 흡인 여과시켜 다이옥세인-석션 드라이-겔 케이크 31.5 g을 얻었다. 얻어진 겔 케이크를 NHS 활성화 충전 재료 2라 칭한다.
NHS 활성화 충전 재료 2를 20 g 취하여, 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고 나서, 20 ㎖의 다이옥세인과 0.1 mol/ℓ 인산염 완충액(pH 6.9) 40 ㎖와 4-아미노메틸벤조산 12 mmol을 가해서 교반하였다. 25℃에서 16시간 반응 후, 이 반응액을 여과해서 제거하고, 이어서, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 12라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 12의 이온 교환 용량을 측정한 바, 146 meq/ℓ였다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 12의 팽윤도를 측정한 바, 4.8 ㎖/g이었다.
제조예 14
제조예 6에서도 사용한 토요펄 HW-65C(토소사 제품)를 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복하여, 순수 치환한 후, 흡인 여과해서, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 90 g, 클로로아세트산나트륨 0.6 mol 및 순수 140 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반하면서, 반응온도 50℃에서 48% 수산화나트륨 수용액을 1시간에 걸쳐서 적하하였다(1.2 mol의 수산화나트륨에 상당함). 적하 후, 1시간 반응을 계속하고, 얻어진 겔을 순수로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 CM 이온 교환 충전 재료 2라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 115 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 5.0 ㎖/g이었다.
제조예 15
제조예 14에서 합성한 CM 이온 교환 충전 재료 20 g(25 ㎖에 상당)과 45 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.0으로 조정하였다. 다음에, 다이옥세인 25 ㎖, NHS 5.7 mmol 및 L-트립토판 2.85 mmol을 상기 분리형 플라스크에 가해서 교반 혼합하여, 용해시켰다. EDC 5.3 mmol을 2.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 40℃에서 첨가하고, 6시간 교반을 계속해서 반응을 행하였다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 13이라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 108 meq/ℓ였다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 4.8 ㎖/g이었다.
제조예 16
제조예 14에서 합성한 CM 이온 교환 충전 재료 20 g(25 ㎖에 상당)과 45 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.0으로 조정하였다. 다음에, 다이옥세인 25 ㎖와 NHS 5.7 mmol과 L-트립토판 2.85 mmol을 상기 분리형 플라스크에 가해서 교반 혼합하여, 용해시켰다. EDC 3.8 mmol을 2.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 40℃에서 첨가하고, 6시간 교반을 계속해서 반응을 행하였다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 14라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 108 meq/ℓ였다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 4.8 ㎖/g이었다.
제조예 17
제조예 1과 마찬가지 방법으로, 가교 아가로스계 약 양이온 교환 겔[CM-세파로스 패스트 플로(GE헬스케어사 제품)]의 이온 교환 용량을 측정한 바, 105 meq/ℓ였다.
이 가교 아가로스계 약 양이온 교환 겔을 유리 필터 상에서 순수로 현탁과 여과를 반복하여, 순수 치환한 후, 흡인 여과해서, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 17 g(20 ㎖에 상당)과 36 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.0으로 조정하였다. 다음에, 다이옥세인 20 ㎖, NHS 4.2 mmol 및 DL-페닐알라닌 2.1 mmol을 상기 분리형 플라스크에 가해서 교반·혼합하여, 용해시켰다. EDC 4.2 mmol을 2 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 16시간 교반을 계속해서 반응을 행하였다. 이 반응액을 유리 필터 상에서 여과에 의해 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 15라 칭한다. 제조예 1과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 98 meq/ℓ였다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 10.6 ㎖/g이었다.
제조예 18
제조예 6에서도 이용한 토요펄 HW-65C(토소사 제품)를 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복하여, 순수 치환한 후, 흡인 여과해서, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 60 g, 순수 100 g 및 에피클로로하이드린 0.4 mol을 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반하여 혼합해서 45℃의 온도로 하였다. 교반하여, 반응온도를 45℃로 유지하면서, 48% 수산화나트륨 0.38 mol을 2시간에 걸쳐서 상기 분리형 플라스크에 적하하고, 적하 종료 후 2시간 동안 교반을 계속해서 반응을 행하였다. 반응 혼합물을 유리 필터에 의해 여과하고, 미반응물이나 부생성물을 순수로 세정 제거해서, 에폭시 활성화 충전 재료용의 석션 드라이-겔 케이크 31.2 g을 얻었다.
이 에폭시 활성화 충전 재료용의 석션 드라이-겔 케이크 30 g과, DL-페닐알라닌 25 mmol, 순수 40 ㎖, 다이옥세인 20 ㎖ 및 탄산나트륨 10 mmol을 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반해서 반응 온도를 25℃로 유지하면서, 16시간 반응을 행하였다. 이 반응 혼합물을 유리 필터에 의해 여과하고, 미반응물이나 부생성물을 50% 다이옥세인, 0.1 mol/ℓ의 염산, 순수, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정 제거하여, DL-페닐알라닌이 2급 아미노 결합에 의해 도입된 충전 재료를 얻었다. 이 충전 재료를 충전 재료 16이라 칭한다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 4.7 ㎖/g이었다.
제조예 19
제조예 18에서 합성한 에폭시 활성화 충전 재료의 석션 드라이-겔 케이크 30 g, 순수 90 ㎖ 및 0.1 mol/ℓ의 염산 10 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반해서 반응온도를 80℃로 유지하면서, 4시간 반응시켜, 에폭시기를 개환에 의해 다이올기로 전환시켰다. 이 다이올 충전 재료를 순수로 세정하고 나서, 해당 세정된 다이올 충전 재료의 전체량과, 순수 50 ㎖ 및 과요오드산 나트륨 13 mmol을 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣어, 교반해서 반응온도를 40℃로 유지하면서, 1.5시간 반응시켜, 다이올기를 포르밀화하고 나서, 순수로 세정해서 포르밀화된 충전 재료를 얻었다. 이 포르밀화된 충전 재료의 전체량과 DL-페닐알라닌 30 mmol, 순수 60 ㎖ 및 다이옥세인 30 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반해서 반응온도 25℃에서 용해시킨 후, 5 내지 10℃로 냉각시켰다. 수소화 붕소나트륨 40 mmol을 12 ㎖의 순수에 용해시키고, 30분 동안 상기 분리형 플라스크에 적하하였다. 1시간 반응 후, 온도를 25℃로 올리고, 더욱 30분간 반응을 행하였다. 이 반응 혼합물을 유리 필터에 의해 여과하고, 미반응물이나 부생성물을 50% 다이옥세인, 0.1 mol/ℓ의 염산, 순수, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정 제거하여, DL-페닐알라닌이 2급 아미노 결합에 의해 도입된 충전 재료를 얻었다. 이 충전 재료를 충전 재료 17이라 칭한다. 또, 제조예 9와 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 4.8 ㎖/g이었다.
제조예 9 내지 제조예 19에서 조제한 각 충전 재료의 기질, 활성화제, 리간드, 이온 교환 용량 및 원소분석결과를 함께 표 3에 나타낸다.
충전
재료		 제조예 기질 활성화제 리간드1 ) 이온
교환
용량		 분석
요소		 단백질 용출량(㎖) BSA 흡착량
meq/ℓ 질소% STI BSA IgG CHY ㎎/㎖ 회수율
(%)
CM-1 9 HW60C CM 155 <0.3 2.8 2.8 5.8 5.3 <2 측정
불가능
9 10 제조예9 DIC L-Trp 148 0.8 25.5 3.9 39.3 41.8 60 95
10 11 제조예9 DIC L-Phe 148 0.4 21.0 36.2 37.1 40.2 59 95
11 12 제조예9 DIC ACA 148 0.4 8.5 42.6 33.4 29.3 60 93
12 13 제조예9 EDC 4-AMBA 146 0.4 48.0 48.0 48.0 48.1 60 96
CM-2 14 HW65C CM 115 <0.3 2.8 2.8 5.5 4.6 <2 측정
불가능
13 15 제조예 14 EDC L-Trp 108 0.5 28.0 38.0 38.2 40.6 32 95
14 16 제조예 14 EDC L-Trp 115 0.5 3.4 21.3 20.8 14.3 28 96
15 17 CM-세파로스 FF EDC DL-Phe 98 0.4 18.0 33.5 29.6 24.0 56 95
16 18 HW65C ECH DL-Phe 측정
불가능		 0.6 2.9 2.9 5.7 4.9 <2 측정
불가능
17 19 HW65C 포밀 DL-Phe 측정
불가능		 0.4 2.9 2.9 5.6 4.8 <2 측정
불가능
1) CM: 카복시메틸, L-Trp: L-트립토판, L-Phe: L-페닐알라닌, ACA: α-아미노옥탄산, 4-AMBA: 4-아미노메틸벤조산
실시예 1
제조예 1 내지 제조예 4에서 제조된 충전 재료 1 내지 충전 재료 4에 대해서, 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타낸다.
또, pH 구배 용출법에 의한 단백질의 흡착 및 용출, 그리고, BSA 흡착 용량의 측정 및 회수율의 측정은 다음과 같이 행하였다.
(1) pH 구배 용출법에 의한 단백질의 흡착 및 용출:
표 2에 나타낸 충전 재료를 내경 7.5㎜, 길이 75㎜의 스테인레스 칼럼에 각각 충전하였다. 송액 펌프(CCPM-II), 오토샘플러(AS-8020), 자외-가시 흡광도계(UV-8020) 및 시스템 제어기(SC-8020)로 이루어진 액체 크로마토그래피 시스템(토소사 제품)에 이들 충전 칼럼을 장착하였다. 이어서, 이하의 크로마토그래피 조건 하에 조작을 행하여, 각 시료의 주 피크의 용출시간을 측정하였다.
크로마토그래피 조건 1:
용리액 1: 50 mmol/ℓ 아세트산 완충액(0.15 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 4.5)
용리액 2: 50 mmol/ℓ 인산 완충액(0.15 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 7.2)
용출법: 용리액 1 100%에서부터 용리액 2 100%까지 60분간 선형 구배 용출하고 나서, 용리액 2 100%에서 5분간 용출 후, 용리액 1 100%에서 15분간 재생 평형화
용리액의 유속: 1.0 ㎖/분
시료: 대두 트립신 저해제(soybean trypsin inhibitor)(이하, "STI"라 약칭함), 소 혈청알부민(이하, "BSA"라 약칭함), 인간 γ-글로불린(이하, "IgG"라 약칭함) 및 소 α-키모트립시노겐 A(이하, "CHY"라 약칭함)
시료 농도: 각 2.0 g/ℓ(용리액 1에 용해)
시료 주입량: 0.2 ㎖
온도: 25℃
검출: 자외선 흡수, 파장: 280 ㎚.
(2) BSA 흡착 용량의 측정 및 회수율의 측정:
200 ㎖의 삼각 플라스크에, 30 ㎖의 흡착용 완충액과, 표 1 및 표 2에 나타낸 충전 재료 중 하나 1.0 ㎖를 투입하였다. 상기 흡착용 완충액에 BSA를 7.5 g/ℓ의 농도로 용해시킨 용액 10 ㎖를 상기 삼각 플라스크에 첨가하고, 온도 25℃에서 3.0시간 진탕하여, BSA를 흡착시켰다. 그 후, 그 상청액을 흡착용 완충액으로 2배로 희석하고, 흡광도를 측정하였다. 충전 재료를 넣지 않는 블랭크도 상기와 마찬가지 방법으로 희석시키고, 흡광도를 측정하였다. 양자의 차이로부터, BSA 흡착량을 구하였다.
흡광도 차: △I = Ib - W × Is
Ib: 2배 희석 블랭크의 흡광도
Is: 2배 희석 상청액의 흡광도
W: 충전 재료 중에 들어가 있는 수분에 관한 계수(모든 충전 재료에서 W=1.015)
BSA 흡착량: A = 80 × F(△I)
F(△I): 흡광도와 BSA 농도 간의 함수
여기서, BSA 흡착량을 구할 때에, 농도가 0.75 g/ℓ 및 1.5 g/ℓ인 BSA 용액을 준비하여, 미리 파장 280 ㎚에서 그들의 흡광도를 측정해두고, BSA 농도와 파장 280 ㎚에서의 자외 흡광도의 관계식을 작성해두었다.
다음에, BSA가 흡착된 충전 재료를 흡착용 완충액 30 ㎖로 씻어내고, 필터가 장착된 칼럼(내경 10㎜)으로 옮기고 나서, 흡착되지 않은 BSA를 더욱 흡착용 완충액 10 ㎖로 씻어내었다. 다음에, 용출용 완충액을 칼럼에 붓고, 그 용출액 45 ㎖ 이상을 50 ㎖의 메스 플라스크에 포집하여 회수해서, 용출용 완충액으로 희석하여, 흡광도를 측정하였다. 흡광도와 BSA 농도와의 관계에 관한 함수로부터 BSA 회수량을 산출하였다. 산출한 흡착량과 회수량으로부터 회수율을 산출하였다.
흡착용 완충액: 50 mmol/ℓ 아세트산 완충액(0.15 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 4.0)
용출용 완충액: 0.1 mol/ℓ 트리스-염산 완충액(0.3 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 8.5).
표 2에 나타낸 충전 재료는, 풀루란으로 환산한 배제 한계 분자량 800,000, 공극률 75%인 기질(토요펄 HW-60C)을 CDI에 의해 활성화시킨 후, 각종 리간드를 도입하여 제조한 충전 재료였다. 이들은 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 유지하고, 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다.
예를 들어, 각 충전 재료의 pKa를 측정한 경우, 4-아미노메틸벤조산을 도입한 충전 재료 3은, 그 pKa가 약 5.1로, 그 밖의 리간드를 도입한 3종류의 충전 재료의 pKa인 4.2보다 높았다. 따라서, 충전 재료 3의 경우, 용출액의 pH가 보다 높은 pH에서 충전 재료가 친수화되어, 단백질이 용출되므로, 용출시간이 지연되고 있었다.
한편, L-류신을 리간드로서 지니는 충전 재료 4는, 소수성이 비교적 약하기 때문에, 보다 낮은 이온화에 의해 친수화되어, 대부분의 단백질에 대해서 용출시간이 빨라져 있었다. 그러나, BSA에 대해서는, 비교적 강한 상호작용이 관찰되었다.
또, BSA 흡착량은, 이들 충전 재료 모두에서, 55 내지 60 ㎎/㎖의 범위 내였고, 리간드에 따라 다소의 차이는 있지만, 충전 재료에 이용한 기질(토요펄 HW-60C)의 BSA에 대한 유효 표면적에 의해 대체로 결정되고 있었다. 또한, 회수율은 모은 경우에 있어서 94% 이상의 수준으로 높았다.
실시예 2
제조예 10 내지 12에서 제조된 충전 재료 9 내지 11에 대해서, 실시예 1과 마찬가지 방법으로, 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 3에 나타낸다.
충전 재료 9 내지 11은, 충전 재료 1 내지 4와 마찬가지로, 토요펄 HW-60C를 기질로서 사용하고, 카복시메틸기를 도입한 충전 재료를 이용해서 아마이드 결합에 의해 소수성 아미노산을 도입한 충전 재료였다.
표 3으로부터 명백한 바와 같이, 각각의 리간드를 아마이드 결합에 의해 도입한 충전 재료의 그룹(충전 재료 9 내지 11)도, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 유지하고 나서, 해당 흡착된 단백질은 pH가 증가함에 따라 용출된 것으로 확인되었다.
또, 리간드로서 α-아미노옥탄산을 도입한 충전 재료 11은, 소수성이 비교적 약하기 때문에, 충전 재료 4와 같은 이유로, 그 밖의 리간드를 도입한 충전 재료와는 다른 선택성으로 단백질을 용출하였다.
BSA 흡착량에 대해서는, 모든 충전 재료에서 56 내지 60 ㎎/㎖의 범위 내였고, 리간드에 따라 다소의 차이는 있지만, 충전 재료에 이용된 기질(토요펄 HW-60C)의 BSA에 대한 유효 표면적에 의해 대체로 결정되고 있었다. 또, 회수율은 모든 경우에 있어서 93% 이상의 수준으로 높았다.
실시예 3
제조예 5 내지 제조예 8에서 제조된 충전 재료 5 내지 8은, 충전 재료 1과는 세공 물성의 다른 기질을 이용하였고, 충전 재료 1과 마찬가지 방법으로 CDI 활성화 후, L-페닐알라닌과 글라이신을 도입한 충전 재료의 그룹이었다. 이들 충전 재료에 대해서, 실시예 1과 마찬가지 방법으로, 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2로부터 명백한 바와 같이, 충전 재료 5는 충전 재료 1과 유사한 배제 한계 분자량을 지녔지만, 공극률이 큰 기질(세파로스 6-패스트 플로(GE헬스케어사 제품))로부터 합성되어 있다. 각 단백질의 용출거동, BSA 흡착량 및 회수율도 충전 재료 1과 유사한 결과를 나타내었다.
또, 충전 재료 6은, 공극률이 충전 재료 1과 유사하지만, 배제 한계 분자량이 크고, 단백질에 대한 유효 표면적이 적은 기질(토요펄 HW-65C(토소사 제품))로부터 합성되어 있다. 각 단백질의 용출거동은 유사한 결과를 나타내었지만, BSA 흡착량은 충전 재료 1의 57%였다. 회수율은 마찬가지 결과를 나타내었으므로, 목적으로 하는 기능이 확인되었다.
또한, 충전 재료 7은, 공극률이 충전 재료 1과 유사하지만, 배제 한계 분자량이 조금 작은 기질(토요펄 HW-50C(토소사 제품))로부터 합성되고 있어, 분자량이 적어도 몇만 이상인 단백질이 침투할 수 있는 세공은 한정적이다. 리간드 결합량은 가장 많지만, IgG와 같은 고분자량 단백질의 보유 시간이 약간 적었고, 그 밖의 단백질에 대해서는, 충전 재료 1과 유사한 값이었다.
BSA 흡착량은 충전 재료 1의 40%였고, 회수율은 유사한 결과를 나타내었다. 단백질의 분자 크기에 의해 흡착량이 영향을 받지만, 식염수 정도의 염농도에서 용해된 단백질을 약산성 조건 하에 흡착시키고, 중성 조건 하에 용출시킨다고 하는 기능이 확인되었다.
또한, 충전 재료 8은 배제 한계 분자량이 작아지고, 단백질이 침투할 수 있는 세공은 거의 없는 기질(세파덱스 G-25(GE헬스케어사 제품))로부터 합성되어 있다. 이 때문에, 리간드는 세공 내부에도 도입될 수 있지만, 단백질과 접촉할 수 있는 리간드는, 입자의 외부 표면에 도입된 부분만으로 한정되는 것으로 여겨진다. 따라서, 단백질의 회수율은 동등한 수준이었지만, 흡착량은 대단히 적은 결과를 나타내었다.
이 충전 재료 8은, 식염수 정도의 염농도 중에 용해된 단백질을 약산성 조건 하에 흡착시키고, 중성 조건 하에 용출시킨다고 하는 기능이 확인되었다.
실시예 4
제조예 13에서 얻어진 충전 재료 12에 대해서, 실시예 1과 마찬가지 방법으로, 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 3에 나타낸다.
충전 재료 12는, 충전 재료 1 내지 4와 마찬가지 방법으로, 토요펄 HW-60C를 기질로 해서 카복시메틸기를 도입한 충전 재료를 이용하고, 아마이드 결합에 의해 4-아미노메틸벤조산을 도입한 것이다.
표 3으로부터 명백한 바와 같이, 아마이드 결합에 의해 이 리간드를 도입한 충전 재료 12도, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 유지하고 나서, pH 증가에 따라 용출된 것으로 확인되었다.
충전 재료 12는, 그 pKa가 약 5.0이고, 충전 재료 3과 같은 이유로, 그 밖의 리간드를 도입한 충전 재료와는 다른 선택성으로 단백질을 용출하였다.
BSA 흡착량에 대해서도, 60 ㎎/㎖로, 토요펄 HW-60C를 기질로서 이용한 다른 충전 재료의 흡착량과 유사하다. 또, 회수율은 96%의 수준으로 높았다. 따라서, 이 충전 재료도 목표로 하는 기능을 지니는 것으로 확인되었다.
실시예 5
제조예 15 및 16에서 제조된 충전 재료 13 및 14에 대해서, 실시예 1과 마찬가지 방법으로 각 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 3에 나타낸다.
충전 재료 13 및 14는, 세공 크기가 큰 토요펄 HW-65C를 기질로서 이용하여, 여기에 카복시기를 도입 후, 모두 리간드로서 트립토판을 아마이드 결합에 의해 고정화시킨 충전 재료였다. EDC 사용량의 증감에 의해 고정화량에 차이가 관측되었다. 원소분석으로부터 얻어진 질소 %는 충전 재료 13에서는 0.8%였고, 충전 재료 14에서는 0.3%였다. 이러한 리간드 고정화량의 차이가 단백질의 용출량의 차이로서 나타났다.
한편, BSA 흡착량에 대해서는, 상기 각각의 충전 재료에서 32 ㎎/㎖ 및 30㎎/㎖였으므로, 리간드 고정화량의 차이에도 불구하고, 유사한 결과를 보였다. 이것은, 충전 재료에 이용한 기질의 BSA에 대한 유효 표면적에 의해 흡착량이 대체로 결정되기 때문인 것으로 설명될 수 있다. 또, 회수율은 95% 이상의 수준으로, 높았다.
실시예 6
충전 재료 15는, 아가로스계 충전 재료[상품명: CM-세파로스 패스트 플로우]에 카복시메틸기를 도입한 충전 재료를 기질로서 이용하고, 리간드로서 DL-페닐알라닌을 아마이드 결합에 의해 도입한 충전 재료이다. 실시예 1과 마찬가지 방법으로, 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3으로부터 명백한 바와 같이, BSA 흡착량은 60 ㎎/㎖로, 토요펄 HW-60C을 기질로 하는 다른 충전 재료의 흡착량과 유사하다. 또, 회수율은 95%의 수준으로 높았다.
비교예 1
제조예 9 및 14에서 합성한 CM 이온 교환 충전 재료 1 및 2에 대해서, 실시예 1과 마찬가지 방법으로, 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3으로부터 명백한 바와 같이, 이들 충전 재료는, 염농도가 낮은 경우 양이온 교환작용에 의해 BSA가 유지되어 흡착되어 있다. 하지만, 흡착용 완충액에 0, 15 mol/ℓ의 염화나트륨을 함유하고 있기 때문에, BSA는 흡착되지 않고, 용출되었다. 따라서, 친수성 CM 이온 교환 충전 재료에서는, 사전처리로서 희석 혹은 탈염 처리가 필요하므로, 본 발명의 목적은 달성될 수 없다.
비교예 2
제조예 18에서 합성한 충전 재료 16에 대해서, 실시예 1과 마찬가지 방법으로, 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3으로부터 명백한 바와 같이, 소수성에 기초한 단백질 흡착은 일어나지 않았고, 도입된 단백질은 모두 직선으로 통과하여 용출되었다.
충전 재료 16에 있어서, 리간드인 페닐알라닌에 속하는 카복실기는 에폭시기에 결합된 아미노기와 공존한다. 따라서, 아미노기는 산성 조건 하에서 이온화되는 한편 카복실기는 염기성 조건 하에서 이온화될 것이므로, 이들 두 작용기는 중간 범위 조건 하에서 이온화될 것이다. 즉, 충전 재료 16은 충분한 소수성을 나타내지 못하므로, 용리액의 pH 변화에 의한 단백질의 흡착·탈착 목적을 달성하는 데 실패하였다.
비교예 3
제조예 19에서 합성한 충전 재료 17에 대해서, 실시예 1과 마찬가지 방법으로, 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3으로부터 명백한 바와 같이, 소수성에 기초한 단백질 흡착은 일어나지 않았고, 도입된 단백질은 모두 직선으로 통과하여 용출되었다.
충전 재료 17에 있어서는, 충전 재료 16과 마찬가지로, 리간드인 페닐알라닌에 속하는 카복실기는 환원 처리가 수반되는 포르밀기 결합에 의해 얻어지는 2급 아미노기와 공존한다. 따라서, 충전 재료 16과 같은 이유로, 충전 재료 17은 충분한 소수성을 나타내지 못하므로, 용리액의 pH 변화에 의한 단백질의 흡착·탈착 목적을 달성하는 데 실패하였다.
제조예 20
알코올성 수산기를 표면에 지닌 폴리메타크릴산 에스테르계 다공성 충전 재료[토요펄 HW-65C(토소사 제품)]를, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하고, 이러한 기질 슬러리의 순수를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 200 g과 순수 300 ㎖ 및 100 g의 클로로메틸옥시레인(chloromethyloxirane)을 1ℓ의 분리형 플라스크에 넣어, 반응온도를 45℃로 유지하면서 교반 하에, 85 g의 48% 수산화나트륨을 2시간에 걸쳐서 적하하였다. 적하 후, 더욱 1시간 반응시키고 나서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 제조하였다. 이 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량과, 중량 평균 분자량이 500,000인 덱스트란 130 g 및 순수 350 ㎖를 상기 1 ℓ의 분리형 플라스크에 넣고, 온도를 25℃로 유지해서 교반하면서 덱스트란을 용해시켰다. 또, 10 g의 48% 수산화나트륨을 가하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 덱스트란 고정화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 제조하였다. 이것을 중간 기질 1이라 칭한다. 중간 기질 1의 덱스트란 고정화량은 이하의 방법으로 측정하였다.
다당 고정화량의 측정 1:
중간 기질 1(석션 드라이-겔 케이크) 10 g을 15 ㎖의 순수에 현탁시키고 나서, 유리 필터가 장착된 내경 20㎜의 유리 칼럼에 붓고, 흡인 여과에 의해 용매를 제거하였다. 형성된 베드(칼럼에 퇴적된 충전 재료 부분)의 높이로부터, 기질의 용적을 얻었다. 이것과는 별도로, 중간 기질 1(석션 드라이-겔 케이크)을 5 g 취하여, 50℃에서 감압 하에 건조시키고, 이때의 중량을 측정하였다. 이 드라이 겔과 2 mol/ℓ의 염산 20 ㎖를 환류 응축기가 장착된 100 ㎖의 삼각 플라스크에 가하고 나서, 90℃에서 150분간 덱스트란을 가수분해시켰다. 반응 후, 기질을 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하고, 재차 50℃에서 감압 하 건조시키고, 이때의 중량을 측정하였다. 가수분해 전후의 기질의 건조 중량의 차이로부터 덱스트란 고정화량을 구하였다. 얻어진 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
중간 기질 기질 다당 (평균 분자량) 다당 고정화량
㎎/g 드라이 겔 측정법
중간 기질 1 HW65C 덱스트란(500,000) 110 가수분해+중량 측정법
중간 기질 2 HW65C 덱스트란(200,000) 98 가수분해+중량 측정법
중간 기질 3 HW65C 풀루란(200,000) 100 가수분해+중량 측정법
중간 기질 4 HW55C 덱스트란(70,000) 65 가수분해+중량 측정법
중간 기질 5 HW50C 덱스트란(10,000) 15 가수분해+중량 측정법
중간 기질 6 세파로스 6FF 덱스트란(200,000) 200 중량 측정법
중간 기질 7 세파덱스 G25 덱스트란(200,000) 3 이하 중량 측정법
중간 기질 8 HW65C HECel1 )(400,000) 52 가수분해+중량 측정법
HECel: 하이드록시에틸셀룰로스
다음에, 중간 기질 1(석션 드라이-겔 케이크) 50 ㎎을 N,N-다이메틸포름아마이드(이하, "DMF"라 약칭함) 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g과 DMF 100 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반하였다. CDI 60 mmol을 다이옥세인 30 g에 용해시키고, 30℃의 일정 온도에서 CDI 용액을 상기 분리형 플라스크에 적하하였다. 적하 후, 1시간 동안 교반을 계속하였다. 그 후, 슬러리를 유리 필터에 의해 여과하고, DMF 용매로 상기 겔을 세정하여, 미반응 CDI나 부생성물을 제거해서, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다.
얻어진 겔 케이크 전체량을 재차 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 100 ㎖의 다이메틸포름아마이드(이하, "DMF"라 약칭함)를 가해서 교반하였다. L-페닐알라닌 24 mmol과 글라이신 6 mmol을, 1 mol/ℓ의 수산화나트륨을 함유하는 수용액 25 ㎖에 용해시키고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 상기 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 18이라 칭한다.
이온 교환 용량의 측정:
세정된 충전 재료 18(석션 드라이-겔 케이크) 10 g을 15 ㎖의 순수에 현탁시켜, 유리 필터가 장착된 내경 20㎜의 유리 칼럼에 붓고, 흡인 여과에 의해 용매를 제거하였다. 형성된 베드(칼럼에 퇴적된 충전 재료 부분)로부터, 10 ㎖를 넘는 충전 재료 부분을 제거하고(즉, 칼럼 내의 충전 재료가 10 ㎖로 됨), 0.5 mol/ℓ 염산 30 ㎖로 2회 세정하였다. 그 후, 순수 40 ㎖로 여과액의 pH가 5 이상으로 될 때까지 세정을 반복하였다. 세정된 충전 재료를 꺼내고, 200 ㎖의 비이커에 옮기고 나서, 100 ㎖의 0.5 mol/ℓ의 식염수에 현탁시키고, 자동 적정 장치(COM-450, 히라누마 산교(주) 제품)를 이용하여 0.5 mol/ℓ 수산화나트륨 용액으로 적정하였다. 종점은 pH 8.5였다. 종점까지의 적정 액체 용적으로부터 산출된 이온 교환 용량은 125 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 18에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 18의 이온 교환 용량에 대응하고 115 mmol/ℓ이다.
제조예 21
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 토요펄 HW-65C를 이용해서, 동일조건 하에, 에폭시 활성화 기질 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량과, 중량 평균 분자량이 200,000인 덱스트란 150 g 및 순수 350 ㎖를 1 ℓ의 분리형 플라스크에 넣고, 온도를 25℃로 유지해서 교반하면서 덱스트란을 용해시켰다. 또, 10 g의 48% 수산화나트륨을 투입하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 덱스트란 고정화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 제조하였다. 얻어진 겔 케이크를 중간 기질 2라 칭한다. 상기 중간 기질 2의 덱스트란 고정화량은 제조예 20과 마찬가지 방법으로 측정하였다. 얻어진 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
다음에, 중간 기질 2를 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 CDI 활성화 겔 케이크 전체량을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, L-페닐알라닌과 글라이신을 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 19라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 110 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 19에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 19의 이온 교환 용량에 대응하고, 110 mmol/ℓ이다.
제조예 22
제조예 20과 마찬가지로, 토요펄 HW-65C를 이용해서, 동일조건 하에, 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 이 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량과, 중량 평균 분자량이 200,000인 풀루란 150 g 및 순수 350 ㎖를 1 ℓ의 분리형 플라스크에 넣고 나서, 온도를 25℃로 유지해서 교반하면서 풀루란을 용해시켰다. 그 후, 10 g의 48% 수산화나트륨을 투입하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 풀루란 고정화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 제조하였다. 이것을 중간 기질 3이라 칭한다. 이 중간 기질 3의 풀루란 고정화량은 제조예 20과 마찬가지 방법으로 측정하였다. 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
다음에, 중간 기질 3을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 CD1활성화 겔 케이크 전체량을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, L-페닐알라닌과 글라이신을 실온 조건 하에 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 20이라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 135 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 20에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 20의 이온 교환 용량에 대응하고, 135 mmol/ℓ이다.
제조예 23
알코올성 수산기를 표면에 지닌 폴리메타크릴산 에스테르계 다공성 충전 재료[토요펄 HW-55C(토소사 제품)]를, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하고 나서, 이러한 기질 슬러리의 순수를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
제조예 20과 동일조건 하에, 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량과, 중량 평균 분자량이 70,000인 덱스트란 150 g 및 순수 350 ㎖를 1 ℓ의 분리형 플라스크에 넣고 나서, 온도를 25℃로 유지해서 교반하면서 덱스트란을 용해시켰다. 그 후, 10 g의 48% 수산화나트륨을 투입하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 덱스트란 고정화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 얻었다. 이것을 중간 기질 4라 칭한다. 이 중간 기질 4의 덱스트란 고정화량은 제조예 20과 마찬가지 방법으로 측정하였다. 이 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
다음에, 중간 기질 4를 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 CDI 활성화 겔 케이크 전체량을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, L-페닐알라닌과 글라이신을 실온 하에 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 21이라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 145 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 21에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드의 도입량은, 해당 충전 재료 21의 이온 교환 용량에 대응하고, 145 mmol/ℓ이다.
제조예 24
알코올성 수산기를 표면에 지닌 폴리메타크릴산 에스테르계 다공성 충전 재료[토요펄 HW-50C(토소사 제품)]를, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 이러한 기질 슬러리의 순수를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
제조예 20과 동일 조건 하에, 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량과, 중량 평균 분자량이 10,000인 덱스트란 150 g 및 순수 350 ㎖를 1 ℓ의 분리형 플라스크에 넣고 나서, 온도를 25℃로 유지하면서 교반하여 덱스트란을 용해시켰다. 또, 10 g의 48% 수산화나트륨을 투입하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 덱스트란 고정화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 얻었다. 이것을 중간 기질 5라 칭한다. 이 중간 기질 5의 덱스트란 고정화량은 제조예 20과 마찬가지 방법으로 측정하였다. 그 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
다음에, 중간 기질 5를 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 CDI 활성화 겔 케이크 전체량을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, L-페닐알라닌과 글라이신을 실온 조건 하에 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 22라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 188 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 22에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 22의 이온 교환 용량에 대응하고, 188 mmol/ℓ이다.
제조예 25
가교 아가로스계 충전 재료[세파로스 6-패스트 플로(GE헬스케어사 제품)]를, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 이러한 기질 슬러리의 순수를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 겔 케이크 120 g과, 순수 180 ㎖ 및 60 g의 클로로메틸옥시레인을 0.5ℓ의 분리형 플라스크에 넣어, 반응온도를 45℃로 유지해서 교반하면서 51 g의 48% 수산화나트륨을 2시간에 걸쳐서 적하하였다. 적하 후, 1시간 계속 반응시키고 나서, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크 126.9 g을 얻었다.
이 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량의 5/6, 즉 105.75 g과, 중량 평균 분자량이 200,000인 덱스트란 75 g 및 순수 175 ㎖를 상기 0.5 ℓ의 분리형 플라스크에 넣고, 온도를 25℃로 유지해서 교반하면서 덱스트란을 용해시켰다. 그 후, 5 g의 48% 수산화나트륨을 투입하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 덱스트란 고정화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 114.7 g을 얻었다. 이것을 중간 기질 6이라 칭한다. 이 중간 기질 6의 덱스트란 고정화량은, 기질도 산으로 가수분해될 수 있으므로, 이하에 나타낸 다당 고정화량의 측정 2의 방법으로 측정하였다.
다당 고정화량의 측정 2:
우선, 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크 10 g을 50℃에서 감압 하에 건조시켜, 그 중량을 측정하였다. 이어서, 이 중량에 덱스트란 고정화 반응에 이용한 겔 케이크의 중량을 곱하여, 건조 중량을 측정하였다. 다음에, 중간 기질 6(석션 드라이-겔 케이크) 10 g을 50℃에서 감압 하에 건조시켜, 중량을 측정하였다. 이어서, 얻어진 중량에 상기 중간 기질 6의 겔 케이크 중량을 곱하여 건조 중량을 얻었다. 상기 중간 기질 6의 건조 중량과 반응에 이용한 에폭시 활성화 기질의 건조 중량의 차이가 고정화 덱스트란의 중량이며, 이것은 (중간 기질 6의 건조 중량) g당의 (고정화 덱스트란의 중량) ㎎으로서 산출되었다. 얻어진 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
다음에, 상기 중간 기질 6을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 CDI 활성화 겔 케이크 전체량을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, L-페닐알라닌과 글라이신을 실온 조건 하에 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 23이라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 85 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 23에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 23의 이온 교환 용량에 대응하고, 85 mmol/ℓ이다.
제조예 26
가교 덱스트란계 충전 재료[세파덱스 G-25(GE헬스케어사 제품)]를 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 이러한 기질 슬러리의 순수를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 이 겔 케이크 120 g과, 순수 180 ㎖ 및 60 g의 클로로메틸옥시레인을 0.5ℓ의 분리형 플라스크에 넣어, 반응온도를 45℃로 유지해서 교반하면서 51g의 48% 수산화나트륨을 2시간에 걸쳐서 적하하였다. 적하 후, 더욱 1시간 반응시키고 나서, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크 123.6 g을 얻었다.
이 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량의 5/6, 즉 103.0 g과, 중량 평균 분자량이 200,000인 덱스트란 75 g 및 순수 175 ㎖를 상기 0.5 ℓ의 분리형 플라스크에 넣고, 온도를 25℃로 유지해서 교반하면서 덱스트란을 용해시켰다. 그 후, 5 g의 48% 수산화나트륨을 투입하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 덱스트란 고정화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 103.5 g을 얻었다. 얻어진 겔 케이크를 중간 기질 7이라 칭한다. 이 중간 기질 7의 덱스트란 고정화량은, 기질도 산에 의해 가수분해될 수 있으므로, 전술한 다당 고정화량의 측정 2의 방법으로 측정하였다. 얻어진 측정 결과를 표 4에 나타내지만, 중량 증가는 측정오차범위 내였다.
다음에, 상기 중간 기질 7을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 얻어진 CDI 활성화 겔 케이크 전체량을 이용해서, 제조예 20과 마찬가지 방법으로, L-페닐알라닌과 글라이신을 실온 조건 하에 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 24라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바 163 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 24에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 24의 이온 교환 용량에 대응하고, 163 mmol/ℓ이다.
제조예 20 내지 제조예 26에서 조제한 중간 기질의 다당 고정화량은 표 4에 나타낸다.
제조예 27
토요펄 HW-65C를, 유리 필터 상에서, 다이옥세인 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g과 다이옥세인 100 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반하였다. CDI 60 mmol을 다이옥세인 30 g에 용해시키고, 30℃의 일정 온도에서 CDI 용액을 상기 분리형 플라스크에 적하하였다. 적하 후, 1시간 동안 교반을 계속하였다. 그 후, 상기 슬러리를 유리 필터에 의해 여과하고, 상기 겔을 다이옥세인 용매로 세정하여, 미반응 CDI나 부생성물을 제거하여, CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다.
얻어진 겔 케이크 전체량을 재차 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 100 ㎖의 DMF를 가하고 나서 교반하였다. L-페닐알라닌 24 mmol과 글라이신 6 mmol을 1 mol/ℓ의 수산화나트륨을 함유하는 수용액 25 ㎖에 용해시키고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 상기 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 25라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 80 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 25에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 25의 이온 교환 용량에 대응하고, 80 mmol/ℓ이다.
제조예 28
가교 아가로스계 충전 재료[세파로스 6-패스트 플로(GE헬스케어사 제품)]를, 유리 필터 상에서, 다이옥세인 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 50 g을 제조예 26과 마찬가지 방법으로 반응시키고 처리해서 충전 재료 26을 얻었다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 100 meq/ℓ였다. 해당 충전 재료 26에 대한 페닐알라닌과 글라이신의 총 리간드 도입량은, 해당 충전 재료 26의 이온 교환 용량에 대응하고, 100 mmol/ℓ이다.
제조예 29
제조예 20에서 합성한 중간 기질 1(석션 드라이-겔 케이크) 50 g을 이용해서, 제조예 1과 마찬가지 방법으로 CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다.
얻어진 겔 케이크의 절반량을 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 교반하였다. 4-아미노메틸벤조산 12 mmol과 글라이신 3 mmol을 1 mol/ℓ의 수산화나트륨을 함유하는 수용액 12.5 ㎖에 용해시키고, 25 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 상기 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 27이라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 115 meq/ℓ였다. 상기 충전 재료 27에 대한 4-아미노메틸벤조산과 글라이신의 총 리간드량은, 해당 충전 재료 27의 이온 교환 용량에 대응하고, 115 mmol/ℓ이다.
제조예 30
제조예 29에서 합성한 CDI 활성화 석션 드라이-겔 케이크의 나머지의 절반량을 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 50 ㎖의 DMF를 가해서 교반하였다. α-아미노옥탄산 15 mmol을, 1 mol/ℓ의 수산화나트륨을 함유하는 수용액에 용해시키고, 25 ㎖의 DMF를 가해서 혼합하였다. 이 아미노산 용액을 한번에 상기 분리형 플라스크에 투입하고, 실온에서 16시간 교반하여 반응시켰다.
반응 종료 후, 얻어진 겔을, 재차 유리 필터 상에서, DMF, 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 용액 및 순수의 순으로 세정하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 28이라 칭한다.
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 105 meq/ℓ였다. 해당 충전 재료 28에 대한 α-아미노옥탄산의 리간드량은, 해당 충전 재료 28의 이온 교환 용량에 대응하며, 105 mmol/ℓ이다.
제조예 20 내지 30에 의해 제조된 각 충전 재료의 기질, 활성화제, 리간드 및 이온 교환 용량을 표 5에 나타낸다.
충전
재료		 제
조
예		 기질 활성화제 리간드1 )
(몰비)		 이온
교환
용량
meq/ℓ		 단백질 용출량(㎖) BSA 흡착량 IgG 흡착량
BSA IgG CHY ㎎/㎖ 회수율(%) ㎎/㎖ 회수율(%)
18 20 중간
기질 1		 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 115 33.0 34.2 40.6 104 96 126 95
19 21 중간
기질 2		 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 110 32.5 33.4 40.1 103 96 121 95
20 22 중간
기질 3		 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 135 32.7 33.6 40.2 108 96 124 95
21 23 중간
기질 4		 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 145 33.5 33.0 41.2 104 95 86 94
22 24 중간
기질 5		 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 188 31.4 29.6 42.6 32 94 20 94
23 25 중간
기질 6		 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 110 30.9 32.4 38.3 106 96 94 95
24 26 중간
기질 7		 CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 163 26.2 23.4 27.8 10 94 10 92
25 27 HW65C CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 80 33.8 33.0 40.6 34 95 38 94
26 28 세파로스 6FF CDI L-Phe:Gly
(8/2)		 100 34.5 34.0 41.2 58 95 60 94
27 29 중간
기질 2		 CDI 4-AMBA 115 48.5 48.5 48.8 98 93 115 92
28 30 중간
기질 2		 CDI ACA 105 42.2 32.1 28.4 95 93 106 93
1) L-Phe: L-페닐알라닌, Gly: 글라이신, 4-AMBA: 4-아미노메틸벤조산, ACA: α-아미노옥탄산
제조예 31
제조예 21에서 합성한 중간 기질 2의 겔 케이크 120 g, 클로로아세트산나트륨 0.8 mol 및 순수 240 ㎖를 500 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 교반하면서, 반응온도 50℃에서 48% 수산화나트륨 수용액을 1.1 mol의 수산화나트륨에 상당하는 양으로 1시간에 걸쳐서 상기 분리형 플라스크에 적하하였다. 적하 종료 후, 3시간 반응을 계속하고, 얻어진 겔을 순수로 세정하였다. 이 반응에 의해 얻어진, 이온 교환기로서 카복시메틸기를 지닌 겔을 CM 중간 기질 2라 칭한다(이하, CM은 카복시메틸의 약칭임). 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 160 meq/ℓ였다.
얻어진 CM 중간 기질 2의 겔 케이크 60 g을 유리 필터 상에서, 0.5 mol/ℓ의 염산, 이어서 순수로 해당 여과액이 중성이 될 때까지 세정하였다. 또한, 다이옥세인 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 60 g과 DMF 150 ㎖를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고 나서, N-하이드록시숙신이미드(이하, "NHS"라 약칭함) 35 mmol과 다이아이소프로필카보다이이미드(이하, "DIC"라 약칭함) 30 mmol을 투입해서 교반하였다. 30℃에서 2시간 교반을 계속하고 나서, 슬러리를 유리 필터에 의해 여과하였다. 얻어진 겔을 다이옥세인 용매로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거함으로써, 다이옥세인-석션 드라이-겔 케이크 63.5 g을 얻었다. 이 반응으로부터 얻어진 겔 케이크를 NHS 활성화 충전 재료 1이라 칭한다.
이 NHS 활성화 충전 재료 1을 20 g 취하여, 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고 나서, 10 ㎖의 다이옥세인, 0.1 mol/ℓ의 인산염 완충액(pH 6.9) 40 ㎖ 및 L-트립토판 6 mmol을 가해서 교반하였다. 25℃에서 16시간 반응 후, 이 반응액을 여과해서 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ 염산, 순수 및 0.1 mol/ℓ 수산화나트륨의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 충전 재료를 충전 재료 29라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 29의 이온 교환 용량을 측정한 바, 152 meq/ℓ였다. 또, 상기 충전 재료 29의 팽윤도를 측정한 바, 4.0 ㎖/g이었다.
팽윤도의 측정:
충전 재료 29를 0.5 mol/ℓ 수산화나트륨 30 ㎖로 2회 세정하고, 그 후, 순수 40 ㎖로 여과액의 pH가 8.5 이하로 될 때까지 세정을 반복하였다. 세정된 충전 재료(석션 드라이-겔 케이크) 10 g을 15 ㎖의 순수에 현탁시켜, 유리 필터가 장착된 내경 20 ㎜의 유리 칼럼에 붓고, 흡인 여과해서 용매를 제거하였다. 형성된 베드로부터, 10 ㎖를 넘는 충전 재료 부분을 제거하고 나서, 남은 10 ㎖의 충전 재료를 유리 필터로 옮기고, 0.5 mol/ℓ 염산 30 ㎖로 2회 세정하였다. 그 후, 순수 40 ㎖로 여과액의 pH가 5 이상으로 될 때까지 충전 재료의 세정을 반복하였다. 40 ㎖의 아세톤으로 2회 세정한 후, 세정된 충전 재료를 꺼내어, 40℃에서 감압 하에 건조시켜, 충전 재료 10 ㎖의 중량을 측정하여, 팽윤도를 산출하였다[팽윤도(㎖/g) = 체적(㎖)/중량(g)]. 이 충전 재료의 팽윤도는 5.2 ㎖/g이었다.
또, 이 건조된 충전 재료를 원소 분석용 시료로서 이용해서, CHN 전자동분석장치(퍼킨엘머사 제품, 2400II 형태)에 의해 질소 중량 백분율을 측정하였다. 또한, 제조예 32 이후도, 건조된 충전 재료의 원소분석을 마찬가지 방법으로 실시하였다.
제조예 32
제조예 22에서 합성한 중간 기질 3의 겔 케이크 120 g을 이용해서, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 이온 교환기로서 카복시메틸기를 지닌 CM 중간 기질 3의 겔을 합성하였다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 180 meq/ℓ였다.
얻어진 CM 중간 기질 3의 겔 케이크 60 g을 유리 필터 상에서, 0.5 mol/ℓ의 염산, 이어서 순수로 해당 여과액이 중성이 될 때까지 세정하였다. 또한, DMF 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 60 g을 제조예 29와 마찬가지 방법으로 NHS와 반응시켜, NHS 활성화 충전 재료를 합성하였다.
반응 후 얻어진 슬러리를 유리 필터 상에서 여과하고, 다이옥세인 용매에 의해 겔을 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거함으로써, 다이옥세인-석션 드라이-겔 케이크 63.3 g을 얻었다.
이 반응으로부터 얻어진 겔 케이크 NHS 활성화 충전 재료를 20 g 취하여, 재차 제조예 31과 마찬가지 방법으로 L-트립토판을 부가반응시켰다. 얻어진 겔을 마찬가지 방시으로 세정해서, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 충전 재료를 충전 재료 30이라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 30의 이온 교환 용량을 측정한 바, 172 meq/ℓ였다. 또, 상기 충전 재료 30의 팽윤도를 측정한 바, 4.0 ㎖/g이었다.
제조예 33
제조예 23에서 합성한 중간 기질 4의 겔 케이크 120 g을 이용해서, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 이온 교환기로서 카복시메틸기를 지닌 CM 중간 기질 4의 겔을 합성하였다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 185 meq/ℓ였다.
얻어진 CM 중간 기질 4의 겔 케이크 60 g을 유리 필터 상에서, 0.5 mol/ℓ의 염산, 이어서 순수로 해당 여과액이 중성이 될 때까지 세정하였다. 또한, DMF 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔 케이크의 NHS 활성화 충전 재료를 NHS 활성화 충전 재료 2라 칭한다.
NHS 활성화 충전 재료 2의 겔 케이크를 20 g 취하여, 재차 제조예 31과 마찬가지 방법으로 L-트립토판을 부가반응시켰다. 얻어진 겔을 마찬가지 방법으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 충전 재료를 충전 재료 31이라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 31의 이온 교환 용량을 측정한 바, 178 meq/ℓ였다. 또, 상기 충전 재료 31의 팽윤도를 측정한 바, 4.2 ㎖/g이었다.
제조예 34
제조예 25에서 합성한 중간 기질 6의 겔 케이크 120 g을 이용해서, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 이온 교환기로서 카복시메틸기를 지닌 CM 중간 기질 6의 겔을 합성하였다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 115 meq/ℓ였다.
얻어진 CM 중간 기질 6의 겔 케이크 60 g을 유리 필터 상에서, 0.1 mol/ℓ의 염산, 이어서, 순수로 해당 여과액이 중성이 될 때까지 세정하였다. 또한, DMF 용매에 의해 현탁과 여과를 반복하여, 함유 수분을 제거하고, 이러한 충전 재료 슬러리의 분산 용매를 흡인 여과에 의해 제거하여, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다. 이 반응으로부터 얻어진 NHS 활성화 충전 재료 겔 케이크를 NHS 활성화 충전 재료 3이라 칭한다.
NHS 활성화 충전 재료 3의 겔 케이크를 20 g 취하여, 재차 제조예 31과 마찬가지 방법으로 L-트립토판을 부가반응시켰다. 얻어진 겔을 마찬가지 방법으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 충전 재료를 충전 재료 32라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 32의 이온 교환 용량을 측정한 바, 103 meq/ℓ였다. 또, 상기 충전 재료 32의 팽윤도를 측정한 바, 4.5 ㎖/g이었다.
제조예 35
제조예 31에서 합성한 CM 중간 기질 2의 겔 케이크 30 g(35 ㎖에 상당)과 35 ㎖의 순수를 300 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.2로 조정하였다. 다음에, 상기 분리형 플라스크에 다이옥세인 30 ㎖, NHS 10.9 mmol 및 4-아미노메틸벤조산 6 mmol을 가하고 나서, 교반하여 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염(이하, "EDC"라 약칭할 경우가 있음) 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 25℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고 나서, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 33이라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 33의 이온 교환 용량을 측정한 바, 151 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 33의 팽윤도를 측정한 바, 4.0 ㎖/g이었다.
제조예 36
제조예 31에서 합성한 CM 중간 기질 2의 겔 케이크 30 g(35 ㎖에 상당)과 35 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.2로 조정하였다. 다음에, 상기 분리형 플라스크에 다이옥세인 30 ㎖, NHS 10.9 mmol 및 DL-페닐알라닌 6 mmol을 가하고 나서 교반하여 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 가하고, 25℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 34라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 34의 이온 교환 용량을 측정한 바, 153 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 34의 팽윤도를 측정한 바, 4.0 ㎖/g이었다.
제조예 37
제조예 33에서 합성한 CM 중간 기질 4의 겔 케이크 30 g(35 ㎖에 상당)과 35 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣어, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.2로 조정하였다. 다음에, 상기 분리형 플라스크에 다이옥세인 30 ㎖, NHS 10.9 mmol, DL-페닐알라닌 6 mmol 및 2-에탄올아민을 가하고 나서, 교반하여 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 25℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 여과해서 제거하고 나서, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 35라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 35의 이온 교환 용량을 측정한 바, 130 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 35의 팽윤도를 측정한 바, 4.2 ㎖/g이었다.
제조예 38
제조예 32에서 합성한 CM 중간 기질 3의 겔 케이크 30 g(35 ㎖에 상당)과 35 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.2로 조정하였다. 다음에, 상기 분리형 플라스크에 다이옥세인 30 ㎖, NHS 10.9 mmol 및 DL-트립토판 6 mmol을 가하고 나서, 교반시켜 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 25℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0, 1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 36이라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 36의 이온 교환 용량을 측정한 바, 170 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 36의 팽윤도를 측정한 바, 4.0 ㎖/g이었다.
제조예 39
제조예 34에서 합성한 CM 중간 기질 6의 겔 케이크 30 g(35 ㎖에 상당)과 35 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.2로 조정하였다. 다음에, 상기 분리형 플라스크에 다이옥세인 30 ㎖, NHS 10.9 mmol 및 DL-트립토판 6 mmol을 가하고 나서 교반하여 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 25℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 37이라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 37의 이온 교환 용량을 측정한 바, 105 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 37의 팽윤도를 측정한 바, 4.2 ㎖/g이었다.
제조예 40
CM-토요펄 650M(토소사 제품)은 HW-65C를 기질로 하는 CM 이온 교환 충전 재료였고, 그의 이온 교환 용량은 110 meq/ℓ였다. 이 충전 재료를 유리 필터 상에서 순수로 현탁과 여과를 반복하여, 순수 치환한 후, 흡인 여과해서, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 30 g(35 ㎖에 상당)과 35 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가해서, pH를 5.2로 조정하였다. 다음에, 이 분리형 플라스크에 다이옥세인 30 ㎖, NHS 10.9 mmol 및 DL-트립토판 6 mmol을 가하고 나서 교반시켜 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 25℃에서 16시간 반응을 수행하였다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고 나서, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 38이라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 38의 이온 교환 용량을 측정한 바, 102 meq/ℓ였다. 또, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 상기 충전 재료 38의 팽윤도를 측정한 바, 4.0 ㎖/g이었다.
제조예 41
가교 아가로스계 약 양이온 교환 겔[CM-세파로스 패스트 플로우(GE헬스케어사 제품)]의 이온 교환 용량을 측정한 바, 105 meq/ℓ이었다.
이 가교 아가로스계 약 양이온 교환 겔을 유리 필터 상에서 순수로 현탁과 여과를 반복하고, 순수 치환한 후, 흡인 여과해서, 석션 드라이-겔 케이크를 준비하였다.
이 겔 케이크 17 g(20 ㎖에 상당)과 36 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가하여, pH를 5.0으로 조정하였다. 다음에, 다이옥세인 20 ㎖, NHS 4.2 mmol 및 DL-페닐알라닌 2.1 mmol을 상기 분리형 플라스크에 가해서 교반 혼합하여, 용해시켰다. EDC 4.2 mmol을 2 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 16시간 교반을 계속해서 반응을 행하였다. 이 반응액을 유리 필터 상에서 여과해서 제거하고, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 39라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 98 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 그의 팽윤도를 측정한 바, 10.6 ㎖/g이었다.
제조예 42
제조예 20과 마찬가지 방법으로, 토요펄 HW-65C를 이용해서, 동일조건 하에 에폭시 활성화 기질의 석션 드라이-겔 케이크를 합성하였다. 이 에폭시 활성화 겔 케이크 전체량과, 중량 평균 분자량이 400,000인 하이드록시에틸셀룰로스 100 g을 순수 350 ㎖에 용해된 용액을 첨가해서 혼합하였다. 그 후, 반응 온도를 25℃로 유지해서 교반하면서, 10 g의 48% 수산화나트륨을 투입하고, 더욱 16시간 반응시키고 나서, 유리 필터 상에서, 순수로 현탁과 여과를 반복해서 세정하여, 하이드록시에틸셀룰로스 고정화 기질 석션 드라이-겔 케이크를 얻었다. 이와 같이 제조된 겔 케이크를 중간 기질 8이라 칭한다. 이 중간 기질 8의 하이드록시에틸셀룰로스 고정화량은 제조예 20과 마찬가지 방법으로 측정하였다. 그 측정 결과를 표 4에 나타낸다.
이와 같이 해서 합성한 중간 기질 8의 겔 케이크 120 g을 이용해서, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 이온 교환기로서 카복시메틸기를 지닌 CM 중간 기질 8의 겔을 합성하였다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 그의 이온 교환 용량을 측정한 바, 86 meq/ℓ이었다.
상기 CM 중간 기질 8의 겔 케이크 30 g(35 ㎖에 상당)과 35 ㎖의 순수를 100 ㎖의 분리형 플라스크에 넣고, 0.5 mol/ℓ 염산을 서서히 첨가해서, pH를 5.2로 조정하였다. 다음에, 다이옥세인 30 ㎖, NHS 10.9 mmol 및 DL-트립토판 6 mmol을 상기 분리형 플라스크에 가하고 나서, 교반하여 용해시켰다. 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 염산염 10.9 mmol을 3.5 ㎖의 순수에 용해시키고 나서, 상기 분리형 플라스크에 25℃에서 첨가하고, 25℃에서 16시간 반응시켰다. 이 반응액을 여과에 의해 제거하고 나서, 얻어진 겔을 50% 아세톤, 0.1 mol/ℓ의 수산화나트륨 및 순수의 순으로 세정하여, 미반응물이나 부생성물을 제거하였다. 이 반응으로부터 얻어진 겔을 충전 재료 40이라 칭한다. 제조예 20과 마찬가지 방법으로, 충전 재료 40의 이온 교환 용량을 측정한 바, 86 meq/ℓ였다. 또한, 제조예 31과 마찬가지 방법으로, 충전 재료 40의 팽윤도를 측정한 바, 4.2 ㎖/g이었다.
제조예 31 내지 제조예 42에서 조제한 각 충전 재료의 기질, 활성화제, 리간드, 이온 교환 용량 및 원소분석결과를 표 6에 나타낸다.
충전
재료		 제조예 기질 활성화제 리간드1 )
(몰비)		 이온
교환
용량		 원소
분석		 단백질 용출량(㎖) BSA 흡착량 IgG 흡착량
meq/ℓ 질소(%) BSA IgG CHY ㎎/㎖ 회수율(%) ㎎/㎖ 회수율(%)
29 31 CM 중간 기질 2 DIC L-Trp 152 0.8 31.4 33.6 35.2 100 96 120 94
30 32 CM 중간 기질 3 DIC L-Trp 172 0.9 32.8 33.9 38.4 103 96 124 94
31 33 CM 중간 기질 4 DIC L-Trp 178 1.0 35.4 38.2 41.6 104 96 86 94
32 34 CM 중간 기질 6 DIC L-Trp 103 1.2 30.5 32.0 34.2 104 95 96 94
33 35 CM 중간 기질 2 EDC 4-AMBA 151 0.5 46.6 46.8 47.2 100 95 118 92
34 36 CM 중간 기질 2 EDC DL-Phe 148 0.5 30.4 31.3 33.8 102 96 122 95
35 37 CM 중간 기질 4 EDC DL-Phe:EA
(8/2)		 130 0.5 28.8 29.6 30.2 96 96 120 95
36 38 CM 중간 기질 3 EDC L-Trp 145 0.8 34.5 35.5 38.6 106 95 124 94
37 39 CM 중간 기질 6 EDC L-Trp 105 1.3 31.8 32.5 34.2 104 94 96 94
38 40 CM-650M EDC L-Trp 102 0.7 35.5 35.9 41.5 32 95 34 93
39 41 CM-세파로스 FF EDC L-Trp 98 1.2 34.3 35.5 40.8 57 95 59 94
40 42 CM 중간 기질 8 EDC L-Trp 86 0.5 29.8 30.9 35.4 92 95 110 94
1) CM: 카복시메틸, L-Trp; L-트립토판, DL-Phe: DL-페닐알라닌, EA: 2-에탄올아민, 4-AMBA: 4-아미노페닐벤조산
실시예 7
제조예 20 내지 제조예 26에서 얻어진 충전 재료 18 내지 충전 재료 24에 대해서, 각 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크의 용출시간, 소 혈청알부민(이하, "BSA"라 약칭함) 흡착량 및 인간 γ-글로불린(이하 "IgG"라 약칭함) 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 5에 나타낸다.
또한, pH 구배 용출법에 의한 단백질의 흡착 및 용출, BSA 및 IgG흡착 용량의 측정, 그리고 회수율의 측정은 다음과 같이 행하였다.
(1) pH 구배 용출법에 의한 단백질의 흡착 및 용출:
표 5에 나타낸 충전 재료를, 내경 7.5㎜를 지닌 75㎜의 스테인레스 강제 칼럼에 각각 충전하였다. 송액 펌프(CCPM-II), 오토샘플러(AS-8020), 자외-가시흡광도계(UV-8020) 및 시스템 제어기(SC-8020)로 이루어진 액체 크로마토그래피 시스템(토소사 제품)에 이들 충전 칼럼을 장착하였다. 이어서, 이하의 크로마토그래피 조건 하에 조작을 행하여, 각 시료의 주 피크의 용출시간을 측정하였다.
크로마토그래피 조건 1:
용리액 1: 50 mmol/ℓ 아세트산 완충액(0.15 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 4.5),
용리액 2: 50 mmol/ℓ 인산 완충액(0.15 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 7.2),
용출법: 용리액 1 100%에서부터 용리액 2 100%까지 60분간 선형 구배 용출하고 나서, 용리액 2 100%에서 5분간 용출 후, 용리액 1 100%에서 15분간 재생 평형화,
용리액의 유속: 1.0 ㎖/분,
시료: 대두 트립신 저해제(이하, "STI"라 약칭함), 소 혈청알부민(이하, "BSA"라 약칭함), 인간 γ-글로불린(이하, "IgG"라 약칭함) 및 소 α-키모트립시노겐 A(이하, "CHY"라 약칭함),
시료 농도: 각 2.0 g/ℓ(용리액 1에 용해),
시료 주입량: 0.2 ㎖,
온도: 25℃
검출: 자외선 흡수, 파장: 280 ㎚.
(2) BSA 흡착 용량의 측정 및 회수율의 측정:
200 ㎖의 삼각 플라스크에, 30 ㎖의 흡착용 완충액과, 표 5에 나타낸 충전 재료 중 하나 1.0 ㎖를 투입하였다. 상기 흡착용 완충액에 BSA를 15 g/ℓ의 농도로 용해시킨 용액 10 ㎖를 상기 삼각 플라스크에 첨가하고, 온도 25℃에서 3.0시간 진탕하여, BSA를 흡착시켰다. 그 후, 그 상청액을 흡착용 완충액으로 2.5배로 희석하고, 흡광도를 측정하였다. 충전 재료를 넣지 않는 블랭크도 상기와 마찬가지 방법으로 희석시키고, 흡광도를 측정하였다. 양자의 차이로부터, BSA 흡착량을 구하였다.
흡광도 차: △I = Ib - W × Is
Ib: 2.5배 희석 블랭크의 흡광도
Is: 2.5배 희석 상청액의 흡광도
W: 충전 재료 중에 들어가 있는 수분에 관한 계수(모든 충전 재료에서 W=1.015)
BSA 흡착량: A = 80 × F(△I)
F(△I): 흡광도와 BSA 농도 간의 함수
여기서, BSA 흡착량을 구할 때에, 농도가 0.75/ℓ 및 1.5 g/ℓ인 BSA 용액을 준비해서, 미리 파장 280 ㎚에서 그들의 흡광도를 측정해두고, BSA 농도와 파장 280 ㎚에서의 자외 흡광도의 관계식을 작성해두었다.
다음에, BSA가 흡착된 충전 재료를 흡착용 완충액 30 ㎖로 씻어내고, 필터가 장착된 칼럼(내경 10㎜)으로 옮기고 나서, 흡착되지 않은 BSA를 더욱 흡착용 완충액 10 ㎖로 씻어내었다. 이어서, 용출용 완충액을 상기 칼럼에 붓고, 그 용출액 45 ㎖ 이상을 50 ㎖의 메스 플라스크에 회수해서, 상기 용출용 완충액으로 희석하여, 흡광도를 측정하였다. 흡광도와 BSA 농도와의 관계에 관한 함수로부터 BSA 회수량을 산출하였다. 산출한 흡착량과 회수량으로부터 회수율을 산출하였다.
흡착용 완충액: 50 mmol/ℓ 아세트산 완충액(0.15 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 4.0)
용출용 완충액: 0.1 mol/ℓ 트리스-염산 완충액(0.3 mol/ℓ 염화나트륨 함유, pH 8.5).
(3) IgG 흡착 용량의 측정 및 회수율의 측정:
200 ㎖의 삼각 플라스크에, 30 ㎖의 흡착용 완충액과, 표 5에 나타낸 충전 재료 중 하나 1.0 ㎖를 투입하였다. 약 150 ㎎/㎖ 농도의 인간 혈청γ-글로불린(화학과 혈청요법 연구소(The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute) 제품) 5 ㎖를 상기 흡착용 완충액에 용해시키고 나서, 50 ㎖로 희석하였다. 이 용액 10 ㎖를 상기 삼각 플라스크에 가하고, 온도 25℃에서 3.0시간 진탕하여, IgG를 흡착시켰다. 그 후, 그 상청액을 흡착용 완충액으로 5배로 희석하고, 흡광도를 측정하였다. 충전 재료를 넣지 않은 블랭크도 상기와 마찬가지 방법으로 희석하고, 흡광도를 측정하였다. 이들 양자의 차이로부터, IgG 흡착량을 구하였다.
흡광도 차: △I = Ib - W × Is
Ib: 5배 희석 블랭크의 흡광도
Is: 5배 희석 상청액의 흡광도
W: 충전 재료 중에 들어가 있는 수분에 관한 계수(모든 충전 재료에서 W=1.015)
IgG 흡착량: A = 200 × △I/1.4
(IgG 10 g당의 흡광도는 1.4이다).
다음에, IgG가 흡착된 충전 재료를 흡착용 완충액 30 ㎖로 씻어내고, 필터를 장착한 칼럼(내경 10㎜)으로 옮기고 나서, 흡착되지 않은 IgG를 더욱 상기 흡착용 완충액 10 ㎖로 씻어내었다. 이어서, 용출용 완충액을 상기 칼럼에 붓고, 그 용출액 50 ㎖ 이상을 채취해서 회수하여, 200 ㎖의 메스 플라스크에서 상기 용출용 완충액으로 희석시키고, 흡광도를 측정하였다. 해당 흡광도로부터 IgG 회수량을 산출하였다. 산출한 흡착량과 회수량으로부터 회수율을 산출하였다.
IgG 회수량: R = 200 × Ir/1.4
Ir: 회수된 IgG 용액의 흡광도.
또한, 흡착용 완충액 및 용출용 완충액은 BSA 흡착 용량의 측정과 같은 용액을 이용하였다.
표 5에 나타낸 충전 재료 18 내지 24는, 풀루란으로 환산한 배제 한계 분자량이 10,000 내지 2,100,000 또는 폴리에틸렌글라이콜로 환산한 배제 한계 분자량이 3,000인 기질에, 비이온성 다당을 고정화시킨 중간 기질에 의해, CDI 활성화 후, L-페닐알라닌과 글라이신을 도입한 충전 재료였다. 표 5로부터 명백한 바와 같이, 이들은 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 지지하였고, 해당 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다.
또, 풀루란으로 환산한 배제 한계 분자량이 300,000 이상인 기질로부터 유도된 충전 재료 18 내지 21 및 23의 BSA 및 IgG 흡착량은 모든 경우에 있어서 85 ㎎/㎖ 이상의 수준으로 매우 높은 것으로 확인되었다.
또한, 배제 한계 분자량이 큰 기질로부터 유도된 충전 재료 18 내지 20의 경우, 분자량이 큰 IgG(분자량: 155,000)의 흡착량의 증가 효과는 높았다. 또, 배제 한계 분자량이 보다 작은 기질로부터 유도된 충전 재료 21 내지 23의 경우, BSA(분자량: 66,000)의 흡착량의 증가 효과는 크지만, IgG의 흡착량의 증가 효과는 비교적 적었다.
한편, 배제 한계 분자량이 10,000 이하인 충전 재료 22 및 24의 BSA 및 IgG 흡착량의 증가 효과는 이들 두 충전 재료에 있어서 높지 않았다. 다만, 충전 재료 22의 경우, BSA보다도 분자량이 작은 단백질(분자량 50,000 이하의 단백질) 또는 펩타이드의 흡착량이 증가할 가능성이 예측되었다. 또한, 충전 재료 24의 경우, 단백질에 대해서 입자의 외표면 밖에 사용되지 않기 때문에, 흡착 용량의 절대치의 증가는 높지 않았다.
또, 회수율은 모든 경우에 있어서 94% 이상의 수준으로 높았다.
참고예 1
제조예 27 및 28에서 제조된 충전 재료 25 및 26은, 배제 한계 분자량이 400,000 또는 2,100,000인 기질을 이용해서, CDI 활성화하고 나서, L-페닐알라닌과 글라이신을 도입한 충전 재료였다. 실시예 7과 마찬가지 방법으로, 이들 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간과, BSA 및 IgG 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 5에 나타낸다.
표 5로부터 명백한 바와 같이, 이러한 충전 재료는, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 지지하였고, 그 후 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다. 그러나, 단백질 흡착량에 적합한 세공 물성을 지닌 충전 재료 26의 경우에도, BSA 및 IgG 흡착량은 65 ㎎/㎖에 도달하지 않았다. 배제 한계 분자량이 크고, 유효 표면적이 보다 적은 충전 재료 25의 경우, 흡착량은 보다 적었다. 한편, 다당을 고정화시킨 중간 기질을 이용해서 합성한 충전 재료 18 내지 21 및 23의 흡착량은, 충전 재료 25의 것보다 약 3배 컸고, 그 성능은 다당을 고정화시킨 중간 기질을 이용함으로써 상당히 개선된 것을 알 수 있었다.
또한, 단백질 회수율은 모든 충전 재료에 있어서 94% 이상의 수준으로 높았다.
실시예 8
제조예 29 및 30에서 제조된 충전 재료 27 및 28은, 풀루란으로 환산한 배제 한계 분자량이 2,100,000인 기질을 이용해서, CDI 활성화하고 나서, 각각 4-아미노 벤조산 또는 α-아미노옥탄산을 도입한 충전 재료였다. 실시예 7과 마찬가지 방법으로, 이들 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간 및 BSA 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 5에 나타낸다.
표 5로부터 명백한 바와 같이, 이들 충전 재료는, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 지지하였고, 그 후 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다. 또한, 이들 두 충전 재료도, BSA 및 IgG 흡착량은 95 ㎎/㎖ 이상의 수준으로 매우 높은 것으로 확인되었다. 또한, 회수율은 모든 경우에 있어서 92% 이상의 수준으로 높았다.
실시예 9
제조예 31 내지 34에서 얻어진 충전 재료 29 내지 32는, 풀루란으로 환산한 배제 한계 분자량이 300,000 또는 2,100,000인 기질을 이용해서, 비이온성 다당을 고정화시킨 중간 기질을 합성하고, 카복실기를 도입한 후, 유기 용매 혼합물 중에서 카보다이이미드를 이용해서, NHS 활성화에 이어, L-트립토판을 도입한 충전 재료였다. 실시예 7과 마찬가지 방법으로, 이들 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간과, BSA 흡착량 및 IgG흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6으로부터 명백한 바와 같이, 이들 충전 재료는, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 지지하였고, 그 후 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다. 또, 모든 충전 재료에 있어서, BSA 및 IgG 흡착량이 85 ㎎/㎖ 이상의 수준으로 매우 높은 것으로 확인되었다. 배제 한계 분자량이 큰 기질로부터 유도된 충전 재료 29 및 30의 경우, 분자량이 큰 IgG 흡착량의 증가 효과가 높았다. 또한, 배제 한계 분자량이 보다 작은 기질로부터 유도된 충전 재료 31 및 32의 경우, BSA 흡착량의 증가 효과는 높았지만, IgG 흡착량의 증가 효과는 비교적 낮았다. 또한, 단백질 회수율은 모든 충전 재료에 있어서 94% 이상의 수준으로 높았다.
실시예 10
제조예 35 내지 37에서 제조된 충전 재료 33 내지 35는, 풀루란으로 환산한 배제 한계 분자량이 300,000 또는 2,100,000인 기질을 이용해서, 비이온성 다당을 고정화시킨 중간 기질을 합성하고, 카복실기를 도입한 후, 유기 용매와 물의 혼합물에서 수용성 카보다이이미드를 이용해서, NHS 활성화와 리간드를 동시에 도입한 충전 재료였다. 실시예 7과 마찬가지 방법으로, 이들 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간과, BSA 흡착량 및 IgG흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6으로부터 명백한 바와 같이, 이들 충전 재료는, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 지지하였고, 그 후 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다. 또, 모든 충전 재료에 있어서, BSA 및 IgG의 흡착량이 100㎎/㎖ 이상의 수준으로 매우 높은 것으로 확인되었다. 배제 한계 분자량이 큰 기질로부터 유도된 충전 재료 33 및 34의 경우, 분자량이 큰 IgG 흡착량의 증가 효과는 높았다. 배제 한계 분자량이 보다 작은 기질로부터 유도된 충전 재료 35의 경우, BSA 흡착량의 증가 효과는 높았지만, IgG 흡착량의 증가 효과는 비교적 낮았다. 또한, 단백질 회수율은 모든 충전 재료에 있어서 93% 이상의 수준으로 높았다.
실시예 11
제조예 38, 39 및 42에서 제조된 충전 재료 36, 37 및 40은, 풀루란으로 환산한 배제 한계 분자량이 400,000 또는 2,100,000인 기질을 이용해서, 비이온성 다당 또는 다당유도체를 고정화시킨 중간 기질을 합성하고, 카복실기를 도입한 후, 유기 용매와 물의 혼합물 중에 수용성 카보다이이미드를 이용해서, NHS 활성화와 리간드(L-트립토판)를 동시에 도입한 충전 재료였다. 실시예 7과 마찬가지 방법으로, 이들 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간과, BSA 흡착량 및 IgG 흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6으로부터 명백한 바와 같이, 이들 충전 재료는, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 지지하였고, 그 후 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다. 또한, 모든 충전 재료에 있어서, BSA 및 IgG의 흡착량은 92 ㎎/㎖ 이상의 수준으로 매우 높은 것으로 확인되었다. 배제 한계 분자량이 큰 기질로부터 유도된 충전 재료 38 및 42의 경우, 분자량이 큰 IgG의 흡착 용량의 증가 효과가 높았다. 또, 배제 한계 분자량이 보다 적은 기질로부터 유도된 충전 재료 39의 경우, BSA 흡착량의 증가 효과는 높았지만, IgG 흡착량의 증가 효과는 비교적 낮았다. 또한, 단백질 회수율은 모든 충전 재료에 있어서 94% 이상의 수준으로 높았다.
참고예 2
제조예 40 및 41에서 제조된 충전 재료 38 및 39의 기질의 배제 한계 분자량은 각각 충전 재료 36 및 37에 각각 대응하지만, 다당 스페이서는 고정화되지 않았다. 즉, 이들은 기질에 직접 카복실기가 도입된 이온 교환 충전 재료, 및 유기 용매와 물의 혼합물에서 수용성 카보다이이미드를 이용해서, NHS 활성화와 리간드(L-트립토판)를 동시에 도입한 충전 재료였다. 실시예 7과 마찬가지 방법으로, 이들 충전 재료마다 각 단백질 시료의 주 피크 용출시간과 BSA 흡착량 및 IgG흡착량을 측정하였다. 얻어진 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6으로부터 명백한 바와 같이, 이들 충전 재료는, 각종 단백질을 약산성 조건 하에 흡착하여 지지하였고, 해당 흡착된 단백질은 pH 상승에 따라 용출된 것으로 확인되었다. 그러나, 단백질 흡착량에 적합한 세공 물성을 지닌 충전 재료 39의 경우에도, BSA 및 IgG 흡착량은 65 ㎎/㎖에 도달하지 않았다. 배제 한계 분자량이 크고, 유효 표면적이 보다 적은 충전 재료 38의 경우, 흡착량은 보다 작았다. 한편, 다당을 고정화시킨 중간 기질을 이용해서 합성한 충전 재료 36 및 37의 흡착량은, 충전 재료 38의 것보다 약 3배 컸고, 그 성능은 다당을 고정화시킨 중간 기질을 이용함으로써 상당히 개선된 것을 알 수 있었다.
일본국 특허 출원 제2008-322642호(출원일: 2008년 12월 18일) 및 일본국 특허 출원 제2009-058122호(출원일: 2009년 3월 11일)의 명세서, 특허청구의 범위 및 요약을 비롯한 전체 개시내용은 참조로 그들의 전체가 본 명세서에 원용된다.

Claims (14)

  1. 기질 및 해당 기질에 고정화된 리간드를 포함하는 액체 크로마토그래피용 충전 재료로서,
    (1) 상기 기질은 알코올성 수산기를 표면에 지니는 친수성 기질이고;
    (2) 상기 리간드는 이하의 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리간드이며:
    [화학식 1]
    RCH(NH2)COOH
    상기 식 중, R은 방향족 기 또는 C5 -7의 비이온성 지방족 기를 나타냄;
    (3) 상기 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있고;
    (4) 상기 기질에 고정화된 상기 리간드의 양은 상기 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 20 mmol/ℓ(밀리몰/리터) 이상인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  2. 제1항에 있어서, 상기 α-아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 류신, 노르류신 및 α-아미노옥탄산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기질은 천연 고분자계 담체, 합성 고분자계 담체 및 무기계 담체로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피용 담체인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기질은 다공성 입자이고, 그의 제한 한계 분자량(exclusion limit molecular weight)은 풀루란(pullulan)으로 환산해서 10,000 이상인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  5. 기질, 해당 기질에 직접 고정화된 리간드 및 스페이서를 개재해서 상기 기질에 고정화된 리간드를 포함하는 액체 크로마토그래피용 충전 재료로서,
    (1) 상기 기질은 알코올성 수산기를 표면에 지니는 친수성 기질이고;
    (2) 상기 스페이서는 알코올성 수산기를 지니는 합성 고분자, 또는 다당류이며;
    (3) 상기 리간드는 이하의 화학식 1로 표시되는 α-아미노산, 및 아미노메틸벤조산으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 리간드이고:
    [화학식 1]
    RCH(NH2)COOH
    상기 식 중, R은 방향족 기 또는 C5 -7의 비이온성 지방족 기를 나타냄;
    (4) 상기 기질에 직접 고정화된 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 기질에 고정화되어 있으며;
    (5) 상기 스페이서를 개재하여 상기 기질에 고정화된 리간드는 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 중에 포함되는 아미노기를 개재한 아마이드 결합 또는 우레탄 결합에 의해 상기 스페이서에 고정화되어 있고;
    (6) 상기 기질에 고정화된 상기 리간드의 양은 상기 액체 크로마토그래피용 충전 재료 1ℓ(습윤 용적)당 30 mmol/ℓ 이상인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  6. 제5항에 있어서, 상기 α-아미노산은 페닐알라닌, 트립토판, 류신, 노르류신 및 α-아미노옥탄산으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 기질은 천연 고분자계 담체, 합성 고분자계 담체 및 무기계 담체로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피용 담체인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 기질은 다공성 입자이고, 그의 제한 한계 분자량은 풀루란으로 환산해서 100,000 이상인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 다당류는 음이온 교환기를 지니지 않는 중량 평균 분자량이 10,000 이상인 다당류, 또는 그의 유도체인 것인 액체 크로마토그래피용 충전 재료.
  10. 제1항 또는 제2항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서,
    기질 중의 알코올성 수산기를 유기 용매 중의 1,1-카보닐비스-1H-이미다졸로 활성화시키는 단계; 및 이어서, 얻어진 활성화된 기를 유기 용매 또는 함수 유기 용매 중에서 리간드 중의 아미노기와 반응시켜, 우레탄 결합에 의해 상기 리간드를 상기 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서,
    카복실기를 기질에 도입하고 나서, 카보다이이미드를 촉매로서 이용해서 리간드의 아미노기와 반응시켜, 아마이드 결합에 의해 상기 리간드를 상기 기질에 도 입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
  12. 제5항 또는 제6항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서,
    기질 중의 알코올성 수산기 및 스페이서 중의 알코올성 수산기를 유기 용매 중의 1,1-카보닐비스-1H-이미다졸로 활성화시키는 단계; 및 이어서, 얻어진 활성화된 기들을 유기 용매 또는 함수 유기 용매 중에서 리간드 중의 아미노기와 반응시켜, 우레탄 결합에 의해 상기 리간드를 직접 또한 상기 스페이서를 개재해서 상기 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
  13. 제5항 또는 제6항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 제조하는 방법으로서,
    카복실기를 기질 및 스페이서에 도입하고 나서, 카보다이이미드를 촉매로서 이용해서 리간드의 아미노기와 반응시켜, 아마이드 결합에 의해 상기 리간드를 직접 또한 상기 스페이서를 개재해서 상기 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 액체 크로마토그래피용 충전 재료의 제조 방법.
  14. 액체 크로마토그래피에 의해 생체고분자를 분리·정제 또는 포집·회수하는 방법으로서,
    제1항 또는 제2항에 규정된 바와 같은 액체 크로마토그래피용 충전 재료를 이용해서 pH 5 이하의 산성 수용액 중에서 상기 생체고분자를 흡착시키는 단계; 및 이어서, 해당 흡착된 생체고분자를 중성 혹은 pH 9 이하의 약염기성 조건 하에 탈착시키는 단계를 포함하는, 생체고분자의 분리·정제 또는 포집·회수 방법.
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