JP7344232B2 - バイオセパレーションのための複合材料 - Google Patents
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Description
体が、生物学的試料の1種以上の成分に対し選択的吸着能を有していることにある。したがって、結合していない(又は弱く結合する)成分は、(より)強力に結合している成分から分離し、対応するブレークスルー画分に出現する。また、結合している成分を互いに分離できるようにするためには、個々の成分を選択的に脱着させる、体積及び時間に応じて変化する条件が得られるように、イオン強度、pH又は特定の置換物質(displacer)の濃度を増加又は減少させて、連続的又は段階的勾配を形成することによって溶出条件を調整することが多い。
トリックスを覆っているが、共有結合はしていない、架橋された疎水性高分子の網目(前記疎水性の網目によって、内部の空孔容積が実質的に充填されている)に、前記生物学的流体を接触させることを含み、それによって、平均分子質量が10,000Da未満である疎水性及び両親媒性分子が除去される。
平均孔径が5~500nmである多孔性支持体であって、架橋されたポリマーが充填されている、多孔性支持体を含む複合材料であって、
このポリマーは、重量平均分子量(Mw)が2,000~500,000Daであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも66%であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、
但し、重量平均分子量(Mw)が27,200であり、且つ加水分解度が70%であるポリビニルアミン及び重量平均分子量(Mw)が50,000であり、且つホルムアミド基の加水分解度が95%であるポリビニルアミンは除く、
複合材料を提供する。
a)平均孔径が5~500nmである多孔性支持体を、ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸す工程;及び
b)ポリマーを250℃未満の温度で架橋剤により架橋する工程
を含む、複合材料の製造方法であって、
ポリマーは、重量平均分子量(Mw)が2,000~500,000Daであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも66%であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、
但し、重量平均分子量(Mw)が27,200Daであり、且つホルムアミド基の加水分解度が70%であるポリビニルアミン及び重量平均分子量(Mw)が50,000Daであり、且つホルムアミド基の加水分解度が95%であるポリビニルアミンは除く、方法にも関する。
i)供給原料を本発明の複合材料と十分な時間接触させる工程;
ii)精製された供給原料から複合材料を分離する工程;
iii)任意に、精製された目的タンパク質を供給原料から単離する工程;及び
iv)任意に、複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程
を含む、方法を提供する。
本明細書において、「複合体」、「複合材料」及び「吸着材」という語は互換的に使用される。
Laser Diffractionにより求められる。
ポリマー5.25gをフラスコに秤り取り、水10mLを加える。得られた混合物を回転させて均質な混合物を得、そして、乾燥固体が認められるまで50℃の真空下で蒸発させる。固体を80℃のオーブンで15時間高真空下(≦0.1mbar)に乾燥させることにより乾燥残渣を得る。
解された基の定量に基づき求められる。
本発明の複合材料は、次に示す方法:
a)平均孔径が5~500nmである多孔性支持体を、ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸し;及び
b)ポリマーを250℃未満の温度で架橋剤により架橋するこ
により製造することができ、
ポリマーは、重量平均分子量(Mw)が2,000~500,000Daであり、ホルムアミド基の加水分解度が少なくとも66%であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、但し、重量平均分子量(Mw)が27,200Daであり、且つホルムアミド基の加水分解度が70%であるポリビニルアミン及び重量平均分子量(Mw)が50,000Daであり、且つホルムアミド基の加水分解度が95%であるポリビニルアミンは除く。
ば、メタノール、エタノール、イソプロパノール及びブタノール)及びその混合物から選択される極性プロトン性溶媒である。水が最も好ましい。
本明細書において、「供給原料(feedstock)」及び「供給物(feed)」という語は互換的に使用される。
i)供給原料を本発明による複合材料と十分な時間接触させる工程;
ii)精製された供給原料から複合材料を分離する工程;
iii)任意に、目的タンパク質を供給原料から単離する工程;及び
iv)任意に、複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程
を含む、方法を提供する。
)等の組換えタンパク質である。
ー、凝集剤又は沈殿剤の添加、遠心分離、結晶化、アフィニティークロマトグラフィー(例えば、Protein A、Protein G又はこれらの組合せを収容している分離媒体を用いる)、膜濾過、深層濾過(珪藻土又は活性炭を用いる)及びモノリシックな分離剤(monolithic separation agent)の適用が挙げられる。
次に示す出発物質を実施例の複合材料の調製に使用した:
ポリマー:
A1 Lupamin 4570(BASFから供給)(ビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマー)
A2 Lupamin 4570を加水分解度68%まで更に加水分解したもの
A3 Lupamin 4570を加水分解度86%まで更に加水分解したもの
A4 Lupamin 4570を加水分解度99%まで更に加水分解したもの
ポリマーA1~A4のホルムアミド基の加水分解度を次に示すように1H-NMRを用いて測定した。
市販のポリマー又は更に加水分解したポリマー5.25gをフラスコに秤り取り、水10mLを加えた。混合物を回転させて均質な組成物を得、そして、50℃の真空下で乾燥固体が得られるまで蒸発させた。固体を80℃のオーブンを用いて高真空下で(≦0.1mbar)15時間乾燥させることにより乾燥した残渣を得た。
Q.Wen,A.M.Vincelli,R.Pelton,“Cationic polyvinylamine binding to anionic microgels yields kinetically controlled structures”,J Colloid Interface Sci.369(2012)223-230。
ポリマーA1~A4のポリマー濃度を元素分析に基づき決定した。試料を1H-NMRの項に記載した手順と同じ手順で調製し、乾燥残渣が得られるまで実施した。元素分析装置はFLASH 2000 Organic Elemental Analyzer(Thermo Scientific)とした。
ポリマーの重量平均分子量(Mw)、多分散度(Mw/Mn)及び固有の屈折率増分(dn/dc)を次に示すように求めた。
決定した。
R(θ)=K*MCP(θ)[1-2A2 MCP(θ)]R(θ) (1)
式(1)中、R(θ)は、過剰(溶質単独に対する)レイリー(Rayleigh)比(即ち、散乱体積及び散乱体積からの距離に関し補正された、散乱光及び入射光強度の比)、Mはモル質量(分子量)、Cは分析物の濃度、K*は式(2)に従い定められるレイリー比の定数であり:
K*=(4π2(n0)2/NA(λ0)4)(dn/dc) (2)
式(2)中、n0は溶媒の屈折率、NAはアボガドロ数、λ0は入射光の真空波長、dn/dcは固有の屈折率増分、P(θ)は形状因子又は散乱関数であり、粒子の平均二乗半径(rg)に対する散乱強度の角度変化に関連し、A2は、溶質と溶媒の相互作用の目安である、第2ビリアル係数である。
SEC/MALS/RIシステムは、Shimadzu LC 20Aシステム、Wyatt Optilab rEX RI検出器及びWyatt DAWN HELEOS-II MALS検出器から構成されるものとした。
移動相:0.45M 硝酸ナトリウム水溶液+0.5%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)
流速:0.5mL/分
検出:
MALSの直線偏光レーザーの波長:658nm
RI
温度:25℃
注入量:50μL
試料の希釈:ポリマー10mg(表2に示した濃度)を移動相1.5mLで希釈
運転時間:58分
B1 シリカゲルDavisil LC 250、40~63μm(W.R.Graceから供給)
B2 シリカゲルXWP500A、35~75μm(W.R.Graceから供給)
B3 シリカゲルXWP1000A、35~75μm(W.R.Graceから供給)
多孔性支持体B1~B3の特性を次の表3に示す。
1,6-ヘキサンジオールジグリシジルエーテル(HDGE;Ipox Chemicalsから供給されているipox RD18)
1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテル(BDGE;Sigma-Aldrichから供給、及びIpox Chemicalsから供給されているipox RD3)
ポリマーA2の水溶液(ポリマーA2の11%溶液)15mLを、1,6-ヘキサンジオールジグリシジルエーテル(HDGE)の溶液(704μL)と混合することにより、架橋剤が7~9%になるようにした。架橋剤比は、反応に使用したポリマー溶液中に存在するビニルアミン単位に対する反応性基の量を考慮して算出した。混合後、0.5M NaOHを用いてpHを11に調整した。
実施例2~4並びに比較例1及び2を、表4に列挙する出発物質を使用したことを除いて比較例1と同様にして調製した。
複合材料の精製能力を測定するために、目的物質から不純物又は望ましくない化合物が除去(分離)された度合いを測定する。この目的のために、供給物中の個々の成分の濃度を、選択的測定(selective assay)を用いて決定する。精製工程の後、精製された画分に対しこの濃度測定を繰り返す。このようにして、これらの濃度及び対応する体積から、純度及び回収率の両方を算出することが可能である。
未処理且つ未希釈の細胞培養液上清CHO K1に、ヒト血漿由来hIgG(Octagam、10%溶液、Octapharma、Vienna)を2mg/mLスパイクしたものを供給物とした。
CCS1
CHO-K1(Invivo、Berlin)
細胞株:CHO-K1(2.5×106生細胞/mL)
電気伝導度:15mS/cm
平均宿主細胞由来タンパク質(HCP)濃度:100~150μg/mL
平均DNA濃度:700~1,000ng/mL
CHO-K1(Invivo、Berlin)
細胞株:CHO-K1
電気伝導度:13mS/cm
平均宿主細胞由来タンパク質(HCP)濃度:65~82μg/mL
平均DNA濃度:250~500ng/mL
求めるために、上に示した3種の物質の定量を、未精製供給物及び複合材料と所定の時間接触させた後の除去処理された供給物について実施した。次いで両方の値を比較した。
宿主細胞由来タンパク質(HCP)の除去効率を求めるためにCygnus CHO HCP Elisa Kit 3Gを使用した。Southport(USA)のCygnus TechnologiesからのCHO Host Cell Proteins 3rd Generation(#F550)を製造業者の指示(取扱説明書“800-F550,Rev.3,21JUL2015”)に従い使用し、PerkinElmer(Courtaboeuf,France)からのVictorX Spectrophotometer及び対応するソフトウェアを読取り及びデータ評価に使用した。試料をサンプル希釈液で希釈した(製品カタログ番号#I028、Cygnus Technologiesより購入)。
HCP除去率(%)=100×(上清中のHCP濃度)/(初期スパイク時のCCS中のHCP濃度)
上式における「上清」は精製後のCCSを指す。
分析試料は初期CCS(スパイクhIgG含有又は非含有)及び除去処理後の試料とした。
DNA除去率(%)=100×(上清中のDNA濃度)/(初期スパイク時のCCS中のDNA濃度)
上式における「上清」は精製後のCCSを指す。
hIgG回収率を次に示すように定量SECによって求めた。
カラム:Tosoh Bioscience LCCからのTSKgel UP SW3000 4.6 × 300mm(粒子径2μm)
移動相:100mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.7)+100mM Na2SO4+0.05% NaN3
注入量:10μL(試料を移動相で希釈)
流速:0.35mL/分
検出器:DAD 280nm
温度:25℃
回収率(%)=100×(上清中のhIgG濃度)/(初期スパイク時のCCS中のhIgG濃度)
上式における「上清」は精製後のCCSを指す。
Claims (15)
- 平均孔径が5~500nmである多孔性支持体であって、架橋されたポリマーが充填されている、多孔性支持体を含む複合材料であって、
前記ポリマーは、重量平均分子量(Mw)が2,000~500,000Daであり、前記重量平均分子量(Mw)が数平均分子量(Mn)との比(Mw/Mn)において1.2~1.3であり、ホルムアミド基の加水分解度が68%~99%であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、前記重量平均分子量は、多角度光散乱及び示差屈折率検出器を連結したサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定されたものであり、
前記架橋に用いられる架橋剤が、プロパンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グルタルジアルデヒド及びコハク酸ジアルデヒドから選択され、
但し、重量平均分子量(Mw)が27,200であり、且つ加水分解度が70%であるポリビニルアミン及び重量平均分子量(Mw)が50,000であり、且つホルムアミド基の加水分解度が95%であるポリビニルアミンは除く、複合材料。 - 前記多孔性支持体は、平均粒子径が1μm~500μmである粒子状材料である、請求項1に記載の複合材料。
- 前記多孔性支持体材料は、多孔性シリカゲルである、請求項1又は2に記載の複合材料。
- 前記ポリビニルアミンは、ビニルアミンの直鎖若しくは分岐ホモポリマー又はビニルアミン及びビニルホルムアミドのコポリマーである、請求項1~3のいずれか一項に記載の複合材料。
- 架橋されたポリマーの濃度は、乾燥した前記複合材料の総重量を基準として少なくとも3%w/wである、請求項1~4のいずれか一項に記載の複合材料。
- a)平均孔径が5~500nmである多孔性支持体を、ポリマー、架橋剤及び溶媒を含む溶液又は分散液に浸す工程;及び
b)前記ポリマーを250℃未満の温度で前記架橋剤により架橋する工程
を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の複合材料の製造方法であって、
前記ポリマーは、重量平均分子量(Mw)が2,000~500,000Daであり、前記重量平均分子量(Mw)が数平均分子量(Mn)との比(Mw/Mn)において1.2~1.3であり、ホルムアミド基の加水分解度が68%~99%であるポリビニルアミン又はポリアリルアミンから選択され、前記重量平均分子量は、多角度光散乱及び示差屈折率検出器を連結したサイズ排除クロマトグラフィーを使用して決定されたものであり、
前記架橋剤が、プロパンジオールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、グルタルジアルデヒド及びコハク酸ジアルデヒドから選択され、
但し、重量平均分子量(Mw)が27,200Daであり、且つホルムアミド基の加水分解度が70%であるポリビニルアミン及び重量平均分子量(Mw)が50,000Daであり、且つホルムアミド基の加水分解度が95%であるポリビニルアミンは除く、
方法。 - 前記溶媒は、水、アルコール、エーテル及びケトン又はこれらの混合物から選択される、請求項6に記載の方法。
- 供給原料中の目的タンパク質を精製するための、請求項1~5のいずれか一項に記載の複合材料の使用。
- 前記目的タンパク質はモノクローナル抗体である、請求項8に記載の使用。
- 供給原料中の目的タンパク質の精製方法であって:
i)前記供給原料を請求項1~5のいずれか一項に記載の複合材料と十分な時間接触させる工程;
ii)精製された前記供給原料から前記複合材料を分離する工程
を含む、方法。 - iii)前記目的タンパク質を前記供給原料から単離する工程、をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- iv)前記複合材料を溶媒で洗浄し、得られた溶液を更なる処理のために回収する工程、をさらに含む、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記目的タンパク質はモノクローナル抗体である、請求項10~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記接触の時間は少なくとも1分間である、請求項10~13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記供給原料は、宿主細胞由来タンパク質(HCP)及びDNAを含む、請求項10~14のいずれか一項に記載の方法。
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