KR20100065526A - Culture media for early mammalian embryo and method using thereof - Google Patents

Abstract

PURPOSE: A composition of medium for culturing mammal initial embryo is provided to stably develop initial embryo and to apply to clinic. CONSTITUTION: A medium for culturing in vivo mammal initial embryo contains 0.1-10 ug/ml of secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI). The SLPI is a recombinant protein of human SLPI. The culture medium is used in development stage including 2-cell stage, 4-cell stage, morula stage, and blastocyst stage. In a method for in vivo culturing mammal initial embryo, the culture medium is used for developing mammal initial embryo.

Description

포유동물 초기 배아의 배양액 및 배양 방법 {Culture media for early mammalian embryo and method using thereof}Culture media for early mammalian embryo and method using YoY

본 발명은 포유동물의 체외 발생에 있어서 초기 배아의 배양액 및 배양 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 포유동물의 초기 배아를 체외에서 배양할 때, 착상전 단계까지 체내와 유사하게 발생, 분화할 수 있도록 하기 위하여 기존의 배양액에 특정 물질을 첨가하는 것을 특징으로 하는 배양액 및 배양 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a culture medium and a culture method of early embryos in vitro development of mammals. Specifically, in the culture of the early embryo of the mammal in vitro, in order to be able to develop and differentiate similarly to the body up to the pre-implantation stage in the culture medium and culture method, characterized in that the addition of a specific substance to the culture medium It is about.

1960년대 이후 포유동물의 초기 배아를 체외에서 배양하면서 그 특성에 대한 연구가 진행되어 왔다. 이후 다양한 분야의 발전과 함께 초기 배아의 체외 배양에 대한 기초적 지식은 의학에 응용되었고 또한 가축산업에도 응용되었다.Since the 1960s, early mammalian embryos have been cultured in vitro to study their properties. Since then, with the development of various fields, basic knowledge of in vitro culture of early embryos has been applied to medicine and also to livestock industry.

의학적 응용에서는 생식의학 분야에 가장 활발히 적용되고 있다. 그러나 좋은 결과를 만들어 내기 위한 시도의 걸림돌로 작용하는 것 중의 하나가 체외에서 배양한 배아가 모체 자궁내막에 보다 잘 착상하도록 하는 조건의 형성이다. 이 조건에는 자궁내막의 분화 및 배아의 착상전 단계로의 분화와 관련된 것을 포함한다.In medical applications, it is most actively applied to the field of reproductive medicine. However, one of the obstacles to attempts to produce good results is the formation of conditions that allow embryos grown in vitro to better implant into the maternal endometrium. These conditions include those associated with differentiation of the endometrium and differentiation of the embryo into the preimplantation stage.

착상 전 초기 배아의 체외발생을 돕기 위하여 다양한 배양액이 개발되어 왔다. 즉, 무기염류와 포도당, 피루브산과 같은 간단한 영양물질을 함유한 배양액이나 아미노산, 비타민 등을 첨가한 배양액 등이 개발되었다. 이러한 배양액의 개발은 특정 첨가물의 함량, 또는 첨가하지 않음을 통하여 개발되어 왔다. 다른 한편으로는 표준배양액에 기능성 물질을 첨가하여 특정 세포의 체외 배양을 진행시키는 측면에서 개발되어 왔다.Various cultures have been developed to help in vitro development of early embryos before implantation. That is, a culture solution containing a simple nutrient such as inorganic salts, glucose and pyruvic acid, a culture solution containing amino acids, vitamins, and the like have been developed. The development of such cultures has been developed through the addition or no addition of certain additives. On the other hand, the development of in vitro culture of specific cells by adding a functional substance to the standard culture solution.

포유동물의 착상전 초기 배아 발생은 종 특이적으로 주어진 시간 내에 포배기 단계로 발생하여야 한다는 근본적인 특성을 갖고 있다. 만약 주어진 시간 안에 특정 단계로 발생하지 못할 경우 자궁내막에 배아가 착상하는 것이 불가능하게 되며 결과적으로는 개체군의 감소로 이어진다. Early embryo implantation in mammals has the fundamental property that species-specific embryonic development should occur within a given stage. If it does not occur at any stage within a given time, it may not be possible for the embryo to implant in the endometrium, resulting in a decrease in population.

체내에서 초기 배아의 발생은 수란관과 자궁에서 진행되며 이들 기관에서 분비되는 특정 조절물질에 영향을 받아 그리고 초기 배아 발생 동안 배아에서 합성 분비되는 특정 물질이 수란관과 자궁에 영향을 미쳐 배아가 착상시기에 착상할 수 있는 단계로 조절되며 진행된다. 포유동물의 초기 배아는 수정 후 착상에 이르는 동안 모체의 생식수관 및 배아 자체로부터 기원한 생물학적 활성분자에 의해 발생이 조절된다. 따라서, 체외배양을 통한 초기 배아 발생유도는 배아가 갖고 있는 능력에 의존적인 것임을 알 수 있다. The development of early embryos in the body proceeds in the oviduct and uterus and is influenced by specific regulators secreted by these organs, and certain substances synthesized in the embryo during early embryo development affect the oviduct and uterus, so that the embryos are implanted at the time of implantation. It is controlled and progressed to conceivable stages. Early embryonic mammalian development is regulated by biologically active molecules derived from the maternal genital tract and the embryo itself during fertilization after implantation. Therefore, it can be seen that early embryonic induction through in vitro culture is dependent on the capacity of the embryo.

초기 배아 배양에서 배양액 첨가물과 물리적 배양조건에 따라 초기 배아에서 발현되는 특정 유전자들의 발현이 서로 다름이 여러 가지 다양한 분석 방법에 의해 밝혀지고 있다. 즉, 체세포가 스트레스 유발물질에 반응하여 이를 극복하고 생존하 려는 반응이 수정 이후 초기 배아의 체외 배양에서 진행되며, 배양액의 조성에 따라 초기 배아의 발생률이 다양하게 나타나는 이유가 된다. 따라서 체외배양액의 조성이 착상 전단계로의 배아 발생을 조절하는데 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.In early embryo culture, the expression of specific genes expressed in early embryos differs depending on the culture medium additives and physical culture conditions. In other words, the response of the somatic cells to the stress-inducing substance to overcome and survive, the fertilization proceeds in vitro culture of the early embryo after fertilization, which is the reason that the early embryo development rate varies depending on the composition of the culture medium. Therefore, it can be seen that the composition of the in vitro culture medium plays a very important role in regulating embryo development to the preimplantation stage.

초기 배아의 체외배양을 이용한 의학 등의 응용분야에서 각 분야에 적합한 배양액 조성을 찾고자 하는 노력이 계속되어 왔으나 주어진 시간 내에 특정 단계의 배아로 발생하도록 하는 것과 관련된 체외 배양에서의 여러 가지 문제점들이 해결되고 있지 않다.Efforts have been made to find a suitable composition for each field in applications such as medicine using early embryos in vitro, but many problems in in vitro culture related to causing embryos to occur at specific stages within a given time have been solved. not.

이는 임상적인 측면에서 볼 때 착상률 향상에 있어 부정적인 것이다. 생쥐를 이용한 실험의 예를 들면, 체외수정으로 얻은 생쥐의 수정란을 실험실에서 사용하는 기본 배양액에서 발생을 유도하여 대리모의 자궁이나 수란관으로 넣어 발생을 진행할 경우, 체내에서 특정 배아 단계로 갈 시기에 체외 배양에서 얻은 특정시기 배아를 특정 단계인 대리모에게 다시 넣어 주면 착상률이 매우 떨어진다. 그러나 체외에서 특정 단계로 발생한 배아를 특정 단계 이전 시기의 대리모에 넣으면 착상률이 상대적으로 좋아진다. 이는 초기 배아의 발생과정 중에 배양액에 첨가된 물질이 착상률에 있어 중요한 요소임을 단적으로 보여주는 예이다.This is negative in terms of clinical improvement in implantation rate. For example, in the case of experiments using mice, when embryos obtained from in vitro fertilization are induced in the basal culture medium used in the laboratory and inserted into the uterus or oviduct of the surrogate mother, the embryos are in vitro when they go to a specific embryonic stage. The implantation rate is very low when the embryos at a specific time from the culture are returned to the surrogate mothers. However, implantation of embryos at specific stages in vitro into surrogate mothers prior to a certain stage improves the implantation rate. This is an example showing that the material added to the culture medium during the early embryo development is an important factor in the implantation rate.

본 발명은 이러한 종래의 문제점을 해결하고자 한다. 즉, 본 발명에서는 새로운 물질을 배양액에 첨가함으로써 포유류 초기 배아의 체외 발생을 안정적으로 진행시킴과 동시에 착상률을 향상시키는 새로운 배양액 및 배양 방법을 구현하고자 한다.The present invention seeks to solve this conventional problem. That is, the present invention is to implement a new culture medium and a culture method for stably progressing in vitro development of early mammalian embryos and improving the implantation rate by adding a new substance to the culture medium.

상기 목적을 달성하기 위하여, 배아와 자궁내막 사이의 신호전달물질로서 림프구에서 발현 분비되는 분비백혈구단백분해효소억제제(Secretory Leukocyte Protease Inhibitor, 이후 "SLPI")를 선별하였다. 그리고, 6주령의 CD-1 암컷 생쥐로부터 과배란을 유도하고 수컷과 교미하도록 한 후, 2-세포기, 8-세포기, 포배기, 4.5 p.c.(태생, post coitum) 및 5.5 p.c. 배아를 획득한 후 PCR을 수행하여 배아 시기에 따른 SLPI의 특이적 발현양상을 분석한 결과, 착상전 배아는 모두 SLPI를 발현하며, 발생 단계에 따라 특이적으로 SLPI의 양적 증감이 나타나는 것을 확인하였다.In order to achieve the above object, secretory leukocyte protease inhibitors ("SLPI") expressed and secreted from lymphocytes as a signaling material between the embryo and the endometrium were selected. And induction of hyperovulation from 6-week-old CD-1 female mice and mating with males, followed by 2-cell stage, 8-cell stage, blastocyst, 4.5 p.c. (born coitum) and 5.5 p.c. As a result of analyzing the specific expression patterns of the SLPI according to the embryonic time after the embryo was obtained by PCR, all the embryos express the SLPI, and it was confirmed that the quantitative increase and decrease of the SLPI appeared specifically depending on the developmental stage. .

한편, SLPI mRNA 서열을 기본으로 특정부위 서열을 이용하여 센스 올리고데옥시뉴클레오타이드(sense oligodeoxynucleotide)와 안티센스(antisense) 올리고데옥시뉴클레오타이드를 합성한 후, 이들 물질을 DONAP (N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate)에 혼합하여 할구로 들어가도록 하였다. 이후 RT-PCR 방법을 이용하여 mRNA의 양적 변화를 확인하여 유전자 발현이 억제되었음을 확인하였다. 그리고, 올리고데옥시뉴클레오타이드를 처리한 후 부화 단계로 발생을 배양하면서 관찰한 결과, 센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 처리한 2-세포기 대조군의 경우 인간융모성 성선자극호르몬(human Chorionic Gonadotropin, 이후 "hCG")을 주사한 시간을 기준으로 72시간 내에 8-세포기로 발생하였으며, 96시간 후에는 포배기로 발생하였다. 또한, 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 처리하여 발현량을 감소시킨 실험군에서도 hCG를 주사한 시간을 기준으로 96시간 이후에도 많은 배아가 상실배기 단계였으며 그 이후에 다 음 단계로 발생하는 것이 관찰되었다. 이러한 결과는 초기 배아에서 발현되는 SLPI가 발생을 조절함을 직접적으로 증명하는 것이다.On the other hand, after synthesizing the sense oligodeoxynucleotide (sense oligodeoxynucleotide) and the antisense (antisense oligodeoxynucleotide) using a specific site sequence based on the SLPI mRNA sequence, these substances were synthesized with DONAP (N- [1- (2, 3-Dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethylammonium methylsulfate) was mixed to enter the blasthole. After that, the quantitative change of mRNA was confirmed using RT-PCR method to confirm that gene expression was suppressed. In addition, as a result of culturing the development in the incubation step after the oligodeoxynucleotide treatment, in the case of the 2-cell control group treated with the sense oligodeoxynucleotide (human Chorionic Gonadotropin, after "hCG Eighty-cell stage occurred within 72 hours of the time of injection of ") and blastocyst after 96 hours. In addition, even in the experimental group treated with antisense oligodeoxynucleotides to reduce the expression level, many embryos were lost stage after 96 hours from the time of hCG injection, and the next stage was observed. These results directly demonstrate that SLPI expressed in early embryos regulates development.

다른 한편으로 0 ㎍/㎖, 0.01 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖ 농도의 재조합 SLPI 단백질을 배양액에 첨가한 후 2-세포기 및 8-세포기 배아를 체외배양하여 초기 배아가 발생 양상을 분석한 결과, 0.1∼10 ㎍/㎖ 농도의 재조합 SLPI 단백질을 포함하는 배양액에서 상기의 2-세포기 및 8-세포기 배아 모두 포배기 단계로의 발생이 유의하게 진행됨을 확인할 수 있었다.On the other hand, recombinant SLPI proteins at concentrations of 0 μg / ml, 0.01 μg / ml, 0.1 μg / ml, 1 μg / ml and 10 μg / ml were added to the culture, followed by in vitro 2-cell and 8-cell embryos. As a result of the early embryo development by culture, the development of both the two-cell and eight-cell embryos in the blastocyst stage was significantly progressed in the culture medium containing the recombinant SLPI protein at the concentration of 0.1-10 ㎍ / ml. Could confirm.

상기의 결과들로부터, SLPI가 체외에서 포유동물의 배아를 배양함에 있어 초기 배아의 생존에 영향을 주지 않고 초기 배아 발생을 안정적으로 진행시킴이 증명되었다.From the above results, it was demonstrated that SLPI stably progressed early embryonic development without affecting early embryo survival in culturing mammalian embryos in vitro.

본 발명의 실시 예에 따라 SLPI를 2-세포기, 8-세포기, 치밀화 세포기, 상실배기 및 포배기 단계의 배아에 처리한 결과, 0.1∼10 ㎍/㎖의 SLPI 농도에서 각각의 단계로부터 포배기 단계로 발생하는 비율을 현저하게 증가시킴으로써 기존에 알려진, 배아가 착상전 단계까지 발생하는데 있어서의 문제점을 해결하였다. 이렇듯 포유동물 초기 배아의 체외 발생을 체내에서의 발생과 유사하게 안정적으로 진행시킴과 동시에 착상률을 향상시킴으로써 불임 의학이나 배아 분화를 이용한 임상 등의 적용이 가능하게 되었다.According to an embodiment of the present invention, as a result of treatment of SLPI in embryos of 2-cell stage, 8-cell stage, densified cell stage, blastocyst stage and blastocyst stage, each stage of blastocyst from SLPI concentration of 0.1-10 μg / ml Significantly increasing the rate of stage development solves the previously known problem of embryo development up to preimplantation stage. As described above, in vitro development of early mammalian embryos can be stably progressed similarly to development in the body, and the implantation rate can be improved, thereby enabling application of infertility medicine or clinical use of embryo differentiation.

이하 본 발명의 실시 예들에서는, 초기 배아의 체외 발생을 안정적으로 진행시킴과 동시에 착상률을 향상시키기 위하여 기존에 알려진 여러 조절물질보다 효과적인 첨가물을 적용하여 임상에 적용하고자 다음과 같은 방법을 사용하여 증명함으로써 그 가치성을 보이고자 한다.In the following embodiments of the present invention, in order to stably progress the in vitro development of the early embryo and at the same time to improve the implantation rate by applying a more effective additives than the conventionally known regulators to prove in clinical use using the following method I want to show its value.

우선, 본 발명의 실시 예들에 따른 초기 배아를 과배아를 유도하여 준비하고 체외배양을 위하여 다양한 조건의 배양액을 이용하여 배양한다. 본 발명에 사용된 배양액은 1971년 Biggers 등에 의해 제안된 BWW(Biggers, Whitten and Whittingham) 배양액 및 1990년대에 개발된 HTF(Human Tubal Fluid) 등의 단순배양액을 변형하여 사용하였으며, 또한 복합 배양액에서의 기능을 알아보기 위하여 Ham's F 10 배양액 등, 일반적으로 당해 기술 분야에서 배아의 체외 배양을 위해 사용되는 것으로 알려진 배양액을 사용하였다. 그러나 상기의 배양액들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 쉽게 설명하기 위하여 제공하는 것일 뿐, 본 발명에 사용되는 배양액은 이에 한정되지 않음은 자명하다고 할 것이다.First, the initial embryos according to the embodiments of the present invention are prepared by inducing over embryos, and cultured using culture medium of various conditions for in vitro culture. The culture solution used in the present invention was used by modifying a simple culture solution such as Biggers, Whitten and Whittingham (BWW) culture solution proposed by Biggers et al. In 1971 and Human Tubal Fluid (HTF) developed in the 1990s. To determine the function, a culture solution generally known to be used for in vitro culture of embryos, such as Ham's F 10 culture, was used. However, the culture broths are merely provided to easily explain the present invention to those skilled in the art, and the culture broth used in the present invention is not limited thereto.

본 발명의 실시 예에서는 변형된 BWW 배양액과 HTF 변형 배양액에 SLPI를 첨가하여 사용하였으며, 착상전 배아 시기에 관계없이 사용하였다. 또한 복합배양액에서의 역할도 동일하게 모든 시기에 사용하였다.In the embodiment of the present invention, SLPI was added to the modified BWW culture and the HTF modified culture, and was used regardless of embryo timing before implantation. In addition, the role in the complex culture was also used at all times.

< 착상시기 전후 배아와 자궁에서 발현되는 유전자 동정 ><Gene identification in embryo and uterus before and after implantation>

착상 전, 후 배아와 자궁을 적출하여 mRNA를 획득하고 이를 이용하여 DNA 마이크로어레이와 PCR 방법을 기초로 한 차등발현 확인 방법을 이용하여 착상 전, 후 시기의 배아나 자궁에서 발현되는 유전자를 동정하였다. 이들 동정된 유전자 중 상호 신호전달에 관여할 것들로 추정되는 것을 그 후보물질로 하여 그 기능을 증명하고 응용가능성을 확인하였다. 후보물질로 림프구에서 발현 분비되는 SLPI를 선별하였다.Embryos and uterus were extracted before and after implantation to obtain mRNA, and the genes expressed in embryos and uterus before and after implantation were identified using differential expression method based on DNA microarray and PCR method. . The candidates of these identified genes, which are presumed to be involved in mutual signaling, were proved as functional candidates and their applicability. Candidates were selected for SLPI expression in lymphocytes.

< 초기 배아의 획득 >Early Acquisition

6주령의 CD-1 암컷 생쥐에 임마혈청 성선자극호르몬(eCG) 혹은 hCG를 주사하여 과배란을 유도하고 수컷과 교미하도록 하였다. 교미를 확인한 후 2-세포기 배아를 획득하기 위하여 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 규정에 따라 안락사를 유도한 후 수란관에서 2-세포기 배아를 획득하였다. 다른 한편으로 초기 배아 단계에 따른 SLPI의 발현 경향성 및 초기 배아단계에 따른 발생 경향성을 분석하기 위하여 2-세포기, 4-세포기, 8-세포기, 상실배기, 포배기, 4.5 p.c. 및 5.5 p.c. 배아를 획득한 후 해부현미경 하에서 건강한 배아만을 선별하였다.Six-week-old CD-1 mice were injected with gonadotropin (eCG) or hCG to induce hyperovulation and mate with males. After confirming mating, in order to obtain 2-cell embryos, euthanasia was induced according to the regulations of the National Institutes of Health, and 2-cell embryos were obtained from the oviduct. On the other hand, two-cell, four-cell, eight-cell, lost embryonic, blastocyst, 4.5 p.c. And 5.5 p.c. After acquiring the embryos, only healthy embryos were selected under a dissecting microscope.

다음으로, 도 1 내지 도 4를 참조하여 본 발명의 구체적인 실시 예를 살펴본다.Next, a specific embodiment of the present invention will be described with reference to FIGS. 1 to 4.

도 1은 RT-PCR 방법을 이용하여 초기 배아 시기에 SLPI의 발현 양상과 SLPI 단백질의 발현과 분포를 조직형광염색법으로 분석한 그래프 및 사진이며, 도 2는 첨가물의 발현을 억제하였을 때 초기 배아의 발생이 어떻게 진행되는지를 분석한 도이며, 도 3 및 도 4는 본 발명의 구체적인 실시 예에 따라 인간의 재조합 SLPI 단백질을 서로 다른 농도 범위에서 각각 2-세포기 및 8-세포기에 처리하였을 때 독성을 보이지 않고 초기 배아의 발생을 촉진함을 확인할 수 있는 도이다.1 is a graph and photographs of the expression and distribution of SLPI protein and the expression and distribution of the SLPI protein in the early embryo phase using the RT-PCR method, Figure 2 is a diagram of the early embryo when the expression of additives is suppressed 3 and 4 are toxic when human recombinant SLPI proteins are treated in 2- and 8-cell phases at different concentration ranges, respectively, according to specific embodiments of the present invention. It is confirmed that promotes the development of early embryos without showing.

< 실시 예 1: RT-PCR 및 면역형광염색법을 이용한 초기 배아에서의 발현양상 분석 >Example 1 Analysis of Expression Patterns in Early Embryos Using RT-PCR and Immunofluorescence Staining

초기 배아에서 SLPI의 발현 양상을 분석하기 위하여 2-세포기, 8-세포기, 포배기, 4.5 p.c. 및 5.5 p.c. 배아를 획득한 후 액체 질소를 이용하여 얼렸다. 이후 전체(total) RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성한 후, PCR을 수행하여 배아 시기에 따른 SLPI의 특이적 발현양상을 비교 분석하였다. SLPI는 전핵 단계부터 발현되었으며 8-세포기 및 4.5 p.c. 단계에서 피크를 나타내었다. 본 결과를 통하여 착상전 배아는 모두 SLPI를 발현하며, 발생 단계에 따라 특이적으로 SLPI의 양적 증감이 나타나는 것을 확인하였다.Two-cell, eight-cell, blastocyst, 4.5 p.c. And 5.5 p.c. Embryos were obtained and frozen using liquid nitrogen. Then, after total RNA was isolated and cDNA was synthesized using the PCR, PCR was performed to compare and analyze specific expression patterns of SLPI according to embryonic time. SLPI was expressed from the pronuclear stage and was expressed in 8-cell stage and 4.5 p.c. The peak is shown in the steps. The results showed that all preimplantation embryos expressed SLPI, and the specific quantitative increase and decrease of SLPI appeared depending on the developmental stage.

또한, 단백질 수준에서 SLPI의 배아 시기 특이적 발현과 분포를 알아보기 위하여 조직면역형광법을 이용하였다. 전핵 단계 배아, 2-세포기, 8-세포기, 치밀화 세포기, 상실배기, 포배기 및 부화단계 배아를 획득하여 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액을 이용하여 고정하였다. 이후 SLPI 특이 항체를 이용하여 그 분포와 발현 정도를 비교분석하였다. SLPI 단백질 발현은 전핵 단계에는 미미하게 나타났으나, 이후 2-세포기 및 8-세포기로 발생하면서 그 양이 급격히 증가 하였으며 이후 다시 감소하여 치밀화 세포기 및 상실배기 단계에서는 미미하게 나타났으며, 다시 포배기 단계 이후 증가하였다.In addition, tissue immunofluorescence was used to investigate the embryonic-specific expression and distribution of SLPI at the protein level. Pronucleated embryos, 2-cell stages, 8-cell stages, densified cell stages, mortality stages, blastocysts and hatching stage embryos were obtained and fixed using 4% paraformaldehyde solution. After that, the distribution and expression level were compared using SLPI specific antibodies. The expression of SLPI protein was insignificant in the pronuclear stage, but it increased rapidly after the two-cell and eight-cell stages, and then decreased again. Increased after blastocyst phase.

구체적으로, 도 1의 A는 PCR을 이용하여 초기 배아의 발생 단계별 mRNA 발현의 양적 증감을 나타내는 그림이며, 도 1의 B는 발생 단계에 따른 상대적인 mRNA의 발현량을 나타내는 그림이며, 도 1의 C는 조직면역형광법을 이용하여 단백질 수준에서의 분포 및 그 양적 변화를 분석한 그림으로, a는 전핵 단계를 나타내며, b는 2-세포기를 나타내며, c는 8-세포기를 나타내며, d는 치밀화 세포기를 나타내며, e는 상실배기를 나타내며, f는 포배기를 나타내며, g는 부화 단계 배아를 나타내며, h는 부화 단계 배아 모습과 형광 사진을 겹쳐 놓은 모습을 나타내는 그림이다.Specifically, FIG. 1A is a diagram showing the quantitative increase and decrease of mRNA expression in early stages of embryonic development using PCR, and FIG. 1B is a diagram showing the relative expression level of mRNA according to stage of development, and C of FIG. 1. Is an analysis of the distribution and quantitative changes at the protein level using tissue immunofluorescence, where a represents the pronuclear stage, b represents the 2-cell group, c represents the 8-cell group, and d represents the densified cell group. E is a loss embryo, f is an blastocyst, g is a hatching embryo, h is a hatching embryo and superimposed fluorescence image.

< 실시 예 2: 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 이용한 발현 억제와 초기 배아 발생에 미치는 영향 분석><Example 2: Effect of Antisense Oligodeoxynucleotides on Expression Inhibition and Early Embryonic Development>

SLPI mRNA 서열을 기본으로 특정부위 서열을(19∼22개 염기) 이용하여 센스 올리고데옥시뉴클레오타이드와 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 합성하였다. 이후 이들 올리고데옥시뉴클레오타이드를 지질계열 물질인 DONAP에 혼합하여 할구로 들어가도록 하였다. 올리고데옥시뉴틀레오타이드의 농도는 사전 독성실험을 통하여 처리 농도를 20 μM을 확정한 후 실험에 사용하였다. 이후 RT-PCR 방법을 이용하여 mRNA의 양적 변화를 확인하여 유전자 발현이 억제되었음을 확인하였다. 다른 한편으로는 올리고데옥시뉴클레오타이드를 처리한 후 부화 단계로 발생을 배양하면서 관찰하였다. 올리고데옥시뉴클레오타이드의 억제 효과는 합성에 사용한 mRNA 서열 부위에 따라 달라지기 때문에 2 부위를 선택하여 합성하였고 세포 내로 전달된 후 분해되는 것을 억제하기 위하여 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변형을 하여 사용하였다.Sense oligodeoxynucleotides and antisense oligodeoxynucleotides were synthesized using specific region sequences (19-22 bases) based on the SLPI mRNA sequence. Afterwards, these oligodeoxynucleotides were mixed with DONAP, a lipid-based substance, to enter the blastomeres. The concentration of oligodeoxynutotide was used in the experiment after confirming the treated concentration 20 μM through the pre-toxicity test. After that, the quantitative change of mRNA was confirmed using RT-PCR method to confirm that gene expression was suppressed. On the other hand, the oligodeoxynucleotides were treated and then observed while culturing the development as a hatching step. Since the inhibitory effect of oligodeoxynucleotides depends on the mRNA sequence site used in the synthesis, two sites were selected and synthesized, and phosphorothioate modification was used to inhibit degradation after delivery into cells.

센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 처리한 2-세포기 대조군의 경우 hCG를 주사한 시간을 기준으로 72시간 내에 8-세포로 발생하였으며(도 2의 A), 96시간 후에는 포배기로 발생하였다(도 2의 B). 센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 처리한 대조군은 아무것도 처리하지 않은 대조군과 유사하게 초기 배아가 발생하는 것을 알 수 있었다(도 2의 A). 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 처리하여 발현량을 감소시킨 실험군에서는(도 2의 D) hCG를 주사한 시간을 기준으로 72시간까지는 대조군과 차이가 없었다(도 2의 A). 그러나 96시간 이후에도 많은 배아가 상실배기 단계였으며(도 2의 B), 흥미롭게도 그 이후에는 다음 단계로 발생하는 것이 관찰되었다. 따라서 hCG 주사 후 120시간 이후에는 포배기 상태였다(도 2의 C). 또한 RT-PCR 방법으로 SLPI의 mRNA 양이 감소하였음을 확인하였다(도 2의 D). 이러한 결과는 초기 배아에서 발현되는 SLPI가 발생을 조절함을 직접적으로 증명함을 밝히는 것이다.In the 2-cell control group treated with the sense oligodeoxynucleotide, 8-cell development occurred within 72 hours based on the time of hCG injection (A in FIG. 2), and 96 hours after the blastocyst (FIG. 2). B). The control group treated with the sense oligodeoxynucleotide was found to occur early embryo similarly to the control group treated with nothing (A of FIG. 2). In the experimental group treated with antisense oligodeoxynucleotides to reduce the expression level (FIG. 2D), there was no difference from the control group up to 72 hours based on the time of hCG injection (FIG. 2A). However, even after 96 hours, many embryos were in the stage of deprivation (Fig. 2B), and interestingly, it was observed that the next stage occurs. Therefore, 120 hours after hCG injection, it was blastocyst state (FIG. 2C). In addition, it was confirmed that the mRNA amount of SLPI was reduced by RT-PCR method (FIG. 2D). These results reveal directly that SLPI expressed in early embryos directly regulates development.

구체적으로, 도 2의 A는 hCG 주사를 기준으로 72시간째에 배아의 발생 상태를 나타내는 그래프 그림이며, 도 2의 B는 96시간 이후 배아의 발생?台纘쨍? 나타내는 그래프이며, 도 2의 C는 120시간 이후 배아의 발생?台纘쨍? 나타내는 그래프이며, 도 2의 D는 안티센스 올리고데옥시뉴클레오타이드를 이용하여 SLPI의 발현량을 감소시킨 것을 나타내는 그래프이다.Specifically, A of FIG. 2 is a graph showing the development of embryos at 72 hours on the basis of hCG injection, and B of FIG. 2 is the development of embryos after 96 hours. It is a graph which shows, and C of FIG. 2 shows the embryo development after 120 hours. It is a graph which shows, and D of FIG. 2 is a graph which shows that the expression amount of SLPI was reduced using antisense oligodeoxynucleotide.

< 실시 예 3: 재조합 SLPI 단백질을 이용한 초기 배아 발생에 미치는 영향 분석 ><Example 3: Analysis of impact on early embryonic development using recombinant SLPI protein>

초기 배아 자체의 SLPI 발현 억제 결과를 재확인하기 위하여 다양한 농도로 재조합 SLPI 단백질을 배양액에 첨가하여 초기 배아 발생에 미치는 영향을 분석하였다. 또한 배아 발생 시기에 따른 특이적 효과 여부를 알아보기 위하여 2-세포기, 8-세포기, 포배기에 각각 처리하였다. 인간 재조합 SLPI 단백질은 인간 SLPI의 cDNA를 끼워넣은 구조물을 대장균으로 이동시킨 후 SLPI의 발현을 유도한 후, 정제과정을 거쳐 순수분리하여 사용하였다. 다른 한편으로 동일하게 대장균에서 발현시키고 정제한 R&D Systems사의 제품을 이용하여 실험하였다.In order to reconfirm the early inhibition of SLPI expression in embryos, we analyzed the effects of recombinant SLPI protein at various concentrations on early embryo development. In addition, two-cell, eight-cell and blastocyst stages were treated to determine the specific effects of embryonic development. Human recombinant SLPI protein was used to transfer the construct containing the human SLPI cDNA to Escherichia coli, induce the expression of SLPI, and then purified and purified. On the other hand, the experiment was carried out using the product of R & D Systems, which was expressed and purified in E. coli.

0 ㎍/㎖, 0.01 ㎍/㎖, 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖, 10㎍/㎖ 농도로 SLPI를 함유케 한 후 2-세포기 배아를 96시간 동안 체외 배양하였다. 8-세포기 배아를 대상으로 한 경우 처리 후 72시간, 포배기를 대상으로 한 경우 48시간 동안 체외 배양한 후, 도립현미경을 이용하여 배아 단계를 분석하였다.After containing SLPI at concentrations of 0 μg / ml, 0.01 μg / ml, 0.1 μg / ml, 1 μg / ml, and 10 μg / ml, 2-cell embryos were in vitro cultured for 96 hours. In vitro culture was performed for 72 hours after treatment for 8-cell embryos and 48 hours for blastocysts, and embryonic stages were analyzed using an inverted microscope.

체내에서 초기 배아가 발생하는 양상을 보면 임신 3.5일(hCG 주사 후 96 시간에 해당함)에 거의 모든 배아가 포배기 단계로 발생한다. 그러나 체외에서 배양할 경우 배양을 시작한 단계에 따라 다르나 포배기 단계로 발생하는 배아는 매우 적다. 2-세포기부터 체외에서 배양하면서 0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖의 SLPI를 첨가하였을 경우 발생이 그렇지 않은 대조군에 비하여 유의하게 빨리 진행되었다(도 3의 A). 도 3의 B 및 C에서 보듯이 hCG를 주사한 시간을 기준으로 144시간이 될 때까지 대조군에 비하여 발생이 유의하게 진행됨을 알 수 있다.Early embryo development in the body shows that almost all embryos develop in the blastocyst phase at 3.5 days of pregnancy (corresponding to 96 hours after hCG injection). However, when cultured in vitro, depending on the stage of incubation, very few embryos occur during the blastocyst stage. Addition of 0.1 μg / ml, 1 μg / ml and 10 μg / ml of SLPI while in vitro cultured from 2-cell phase progressed significantly faster than the control that did not develop (FIG. 3A). As shown in B and C of FIG. 3, it can be seen that the development proceeds significantly compared to the control until 144 hours based on the time of injection of hCG.

8-세포기 배아에 처리하였을 경우에도 대조군에 비하여 포배기 단계로 발생하는 비율의 유의하게 높았다(도 4의 A). 부화단계로의 발생도 대조군에 비하여 좀 더 빨랐으며 농도의존적인 양상을 보였다(도 4의 B 및 C). 이러한 결과는 SLPI가 초기 배아의 발생을 안정적으로 진행시킴을 증명하고 있다.When treated to 8-cell embryos, the rate of blastocyst stage development was significantly higher than that of the control group (FIG. 4A). Incidence to the incubation stage was also faster than the control group and showed a concentration-dependent pattern (B and C of FIG. 4). These results demonstrate that SLPI reliably progresses early embryonic development.

구체적으로, 도 3의 A는 2-세포기에 SLPI를 처리한 후 hCG 주사를 기준으로 96시간 이후에 포배기 단계로 발생한 비율을 나타내는 그래프이며, 도 2의 B는 120시간 이후 배아의 발생을 나타내는 그래프이며, 도 2의 C는 144시간 이후 배아의 발생을 나타내는 그래프이다. 또한, 도 4의 A는 8-세포기에 SLPI를 처리한 후 hCG를 주사를 기준으로 96시간 이후 포배기 단계로 발생한 비율을 나타내는 그래프이며, 도 4의 B는 120시간 이후 배아의 발생을 나타내는 그래프이며, 도 4의 C는 144시간 이후 배아의 발생을 나타내는 그래프이다.Specifically, FIG. 3A is a graph showing the rate of blastocyst stage 96 hours after hCG injection after treatment with SLPI in 2-cell phase, and FIG. 2B is a graph showing embryo development after 120 hours. 2C is a graph showing the development of the embryo after 144 hours. 4A is a graph showing the rate of blastocyst stage after 96 hours of hCG injection after 8-cell treatment of SLPI, and FIG. 4B is a graph showing embryo development after 120 hours. 4C is a graph showing the development of embryos after 144 hours.

상기 실시 예들을 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명은 포유동물 초기 배아의 체외 발생을 안정적으로 진행시킴과 동시에 착상률을 향상시킴으로써 불임 의학이나 초기 배아와 같은 세포의 분화를 이용한 임상 등의 적용이 가능하게 되었다. 따라서, 본 발명을 통한 배양 방법은 의학산업 및 축산업에 매우 유용한 발명인 것이다.As described through the above embodiments, the present invention can be applied to infertility medicine or clinical use of differentiation of cells such as early embryos by stably progressing in vitro development of early mammalian embryos and improving implantation rate. . Therefore, the culturing method through the present invention is a very useful invention for the medical industry and the livestock industry.

도 1은 RT-PCR 및 면역형광염색법을 이용하여 초기 배아의 발생 단계에 따른 SLPI의 발현양상을 나타내는 도이다.1 is a diagram showing the expression of SLPI according to the early stages of embryonic development using RT-PCR and immunofluorescence staining.

도 2는 SLPI의 발현을 억제하였을 때 초기 배아의 발생을 나타내는 도이다.Figure 2 shows the development of early embryos when the expression of SLPI is suppressed.

도 3은 인간의 재조합 SLPI 단백질을 2-세포기에 처리하였을 때 초기 배아의 발생을 나타내는 도이다.Figure 3 shows the development of early embryos when human recombinant SLPI protein is treated in a two-cell phase.

도 4는 인간의 재조합 SLPI 단백질을 8-세포기에 처리하였을 때 독성을 보이지 않고 초기 배아의 발생을 나타내는 도이다. Figure 4 shows the development of early embryos without showing toxicity when human recombinant SLPI protein is treated in 8-cell phase.

Claims (5)

포유동물 초기 배아의 체외 배양에 사용되는 배양액에 있어서, 분비백혈구단백분해효소억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는, 포유동물 초기 배아의 배양액.A culture medium used for in vitro culture of early mammalian embryos, wherein the culture medium of early mammalian embryos comprises a secreting leukocyte protease inhibitor. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 분비백혈구단백분해효소억제제의 농도는 0.1∼10 ㎍/㎖인 것을 특징으로 하는, 포유동물 초기 배아의 배양액.The concentration of the secretion leukocyte protease inhibitor is characterized in that 0.1 ~ 10 ㎍ / ㎖, the culture medium of the early mammal embryo. 제 1항에 있어서, The method of claim 1, 상기 분비백혈구단백분해효소억제제는 사람의 분비백혈구단백분해효소억제제의 재조합단백질인 것을 특징으로 하는, 포유동물 초기 배아의 배양액.The secretory leukocyte protease inhibitor is characterized in that the recombinant protein of human secreted leukocyte protease inhibitors, culture medium of the early mammal. 제 1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 배양액은 2-세포기, 4-세포기, 상실배기, 포배기 등의 단계를 포함하는 착상전 단계까지의 발생 단계에서 사용되는 것을 특징으로 하는, 포유동물 초기 배아의 체외 배양 방법.The culture solution is characterized in that it is used in the developmental stage up to the pre-implantation stage, including the 2-cell stage, 4-cell stage, loss blast stage, blastocyst stage, etc., in vitro culture method of early mammalian embryo. 포유동물 초기 배아의 체외 배양 방법에 있어서, 배양액으로 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 배양액을 사용하는 것을 특징으로 하는, 포유동물 초기 배아의 배양 방법.The in vitro culture method of an early mammalian embryo, The culture method of an early mammalian embryo characterized by using the culture solution in any one of Claims 1-4 as a culture liquid.

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