KR102048205B1 - Composition for growth media of mammals early embryo comprising secretory leukocyte peptidase inhibitor and method for culturing mammals early embryo in vitro to keep normal developmental speed using the same - Google Patents

Abstract

본 발명은 포유동물 초기 배아 성장 배양액 조성분으로 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제를 포함하는 포유동물 초기 배아 성장 배양액 조성물 및 이를 이용한 정상 발생 속도 유지를 위한 체외 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래의 체외 배양된 배아에 비해 체내에서의 발생속도와 유사하게 발생속도를 촉진시키고, 착상율을 향상시킬 수 있는 배양액 조성물과 이를 이용한 체외 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 포유동물 초기 배아의 성장 배양액에 포함되어 있는 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제는 체내와 유사하게 체외에서 배양되는 배아의 발생을 진행시킬 수 있으며, 다양한 발생인자의 발현수준을 상향조절하여 종래의 체외 배양방법을 통해 배양되는 배아에 비해 초기 배아의발생율과 착상율을 향상시킬 수 있다. 본 발명은 따라 불임 의학이나 배아 분화를 이용한 임상 등에 적용될 수 있다.The present invention relates to a mammalian early embryo growth culture composition comprising a leukocyte protease inhibitor secreted as a mammalian early embryo growth culture composition, and to an in vitro culture method for maintaining a normal development rate using the same. The present invention relates to a culture solution composition and an in vitro culture method using the same that promote the development rate and improve the implantation rate similarly to the development rate in the body compared to the cultured embryo.
The secretory leukocyte protease inhibitors contained in the growth culture of early mammalian embryos according to the present invention can progress the development of embryos cultured in vitro similar to the body, and up-regulate the expression level of various development factors. In vitro culture method can improve the incidence and implantation rate of early embryos compared to the cultured embryos. The present invention can be applied accordingly to clinical use using infertility medicine or embryo differentiation.

Description

분비 백혈구 단백질분해효소 억제제를 포함하는 포유동물 초기 배아 성장 배양액 조성물 및 이를 이용한 정상 발생 속도 유지를 위한 포유동물 초기 배아의 체외 배양방법{COMPOSITION FOR GROWTH MEDIA OF MAMMALS EARLY EMBRYO COMPRISING SECRETORY LEUKOCYTE PEPTIDASE INHIBITOR AND METHOD FOR CULTURING MAMMALS EARLY EMBRYO IN VITRO TO KEEP NORMAL DEVELOPMENTAL SPEED USING THE SAME}COMPOUND FOR GROWTH MEDIA OF MAMMALS EARLY EMBRYO COMPRISING SECRETORY LEUKOCYTE PEPTIDASE INHIBITOR AND METHOD FOR CULTURING MAMMALS EARLY EMBRYO IN VITRO TO KEEP NORMAL DEVELOPMENTAL SPEED USING THE SAME}

본 발명은 포유동물 초기 배아 성장 배양액 조성분으로 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제를 포함하는 포유동물 초기 배아 성장 배양액 조성물 및 이를 이용한 정상 발생 속도 유지를 위한 체외 배양방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래의 체외 배양된 배아에 비해 체내에서의 발생속도와 유사하게 발생속도를 촉진시키고, 착상율을 향상시킬 수 있는 배양액 조성물과 이를 이용한 체외 배양방법에 관한 것이다.The present invention relates to a mammalian early embryo growth culture composition comprising a leukocyte protease inhibitor secreted as a mammalian early embryo growth culture composition, and to an in vitro culture method for maintaining a normal development rate using the same. The present invention relates to a culture solution composition and an in vitro culture method using the same that promote the development rate and improve the implantation rate similarly to the development rate in the body compared to the cultured embryo.

포유동물에서 초기 배아의 발생 속도는 정확하게 조절된다. 수정란은 착상 전에 포배기로 반드시 도달해야하는데 이는 배란 이후에 엄격하게 제한된 시기에서만 자궁이 생리학적으로 착상을 준비하기 때문이다. 종래의 연구에서는 단순 탄수화물과 알부민을 포함하는 배양액에서 초기의 체외 배아를 발생시킬 수 있는 것으로 밝혀졌으나(Jin and O’Neill, 2014; Whitten and Biggers, 1968), 이 조건들은 착상을 완성시키기에 충분하지 않다. 완성된 배아를 얻기 위해서는 아미노산과 성장인자를 포함하는 다른 요소들이 배양 배지에 첨가되어야 하지만, 이 시기 동안 발생 속도를 조절하는데 관여하는 조절 기작들에 대한 연구가 아직 충분히 이루어지지 않았다.The rate of development of early embryos in mammals is precisely controlled. The fertilized egg must reach the blastocyst before implantation because the uterus prepares the implantation physiologically only in a strictly limited time after ovulation. Previous studies have shown that early in vitro embryos can be generated in cultures containing simple carbohydrates and albumin (Jin and O'Neill, 2014; Whitten and Biggers, 1968), but these conditions are sufficient to complete implantation. Not. Other factors, including amino acids and growth factors, must be added to the culture medium to obtain a complete embryo, but there are not enough studies on the regulatory mechanisms involved in controlling the rate of development during this time.

본 발명자들은 종래 연구에서 착상이 지연된 마우스 모델에서 휴면기인 포배기에서 발현되거나 발현되지 않은 유전자를 분리하기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)-기반 공제잡종형성(subtraction hybridization) 방법을 사용하여 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제(secretory leukocyte peptidase inhibitor, SLPI)를 분리하였다. SLPI로는 ALK1, ALP, 항백혈구단백질분해효소(antileukoprotease), BLPI, HUSI, MPI, WAP4 및 WFDC1 등이 알려져 있다. 자궁에서 Slpi mRNA 발현은 스테로이드 호르몬에 의해 조절되고, Slpi mRNA는 쥐(rat)의 임신 4에서 5일째 되는 날과 사람의 분비기(secretory phase) 동안 대부분 표피세포에 국한되어 나타난다. 아울러, SLPI 단백질은 자궁액(uterine fluid) 뿐만 아니라, 수란관의 협부(isthmus), 팽대부(ampulla) 및 누두부(infundibulum)에서 발견된다.In the previous study, we used a polymerase chain reaction (PCR) -based subtraction hybridization method to separate genes expressed or not expressed in dormant blastocysts in a mouse model with delayed implantation. Enzyme inhibitor (secretory leukocyte peptidase inhibitor, SLPI) was isolated. As SLPI, ALK1, ALP, antileukoprotease, BLPI, HUSI, MPI, WAP4 and WFDC1 are known. Slpi mRNA expression in the uterus is regulated by steroid hormones, and Slpi mRNA is mostly localized to epidermal cells during the 4th to 5th day of rat gestation and during the secretory phase of humans. In addition, SLPI proteins are found in the uterine fluid, as well as in the isthmus, ampulla and infundibulum of the oviduct.

SLPI는 키모트립신, 트립신, 백혈구 엘라스타제 및 카텝신 G에 대해 억제 활성을 가지고 있다. 또한 SLPI는 숙주를 감염과 상해로부터 보호한다. 아울러, 자가분비 및 측분비 방법으로 세포 생리학적으로 기능적인 중개자 역할을 한다. 예를 들어, SLPI는 프로스타글란딘 E₂의 합성, 전사 인자의 활성 및 세포 증식에 관여한다. 또한, CD34⁺ 골수 조혈전구세포에서는 SLPI의 하향조절이 세포-주기 결손으로 인한 감소된 골수 분화로 이어진다고 밝혀졌다. 그러나 SLPI의 착상 전 배아에서의 역할은 여전히 연구되지 않은 상태이다.SLPI has inhibitory activity against chymotrypsin, trypsin, leukocyte elastase and cathepsin G. SLPI also protects the host from infection and injury. In addition, it acts as a cell physiologically functional mediator by the method of self-secretion and lateral secretion. For example, SLPI is involved in the synthesis of prostaglandin E ₂ , the activity of transcription factors and cell proliferation. In addition, downregulation of SLPI in CD34 ⁺ bone marrow hematopoietic progenitor cells has been shown to lead to reduced bone marrow differentiation due to cell-cycle defects. However, the role of SLPI in preimplantation embryos remains unstudied.

대한민국 공개특허 제10-2008-0077779호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2008-0077779

본 발명의 목적은 종래의 체외 배양방법에 비해 초기 배아의 발생율 및 착상율(임신율)을 향상시킬 수 있는 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제를 포함하는 포유동물 초기 배아의 성장 배양액과 이를 이용한 포유동물 초기 배아의 체외 배양방법을 제공하는 것이다.Disclosure of the Invention An object of the present invention is to provide a growth medium for early mammalian embryos comprising secreted leukocyte protease inhibitors and early mammalian embryos using the same, which can improve the incidence and implantation rate (pregnancy rate) of early embryos compared to conventional in vitro culture methods. It is to provide an in vitro culture method.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 성장 배양액 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a growth culture composition of the early mammalian embryo, characterized in that it comprises a secretory leukocyte protease inhibitor.

상기 조성물은 혈소판 활성화 인자(platelet activating factor)를 더 포함할 수 있다.The composition may further comprise a platelet activating factor.

첨가되는 혈소판 활성화 인자의 농도는 0.5 nM ~ 500 nM일 수 있고, 바람직하게는 1 nM ~ 500 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1 nM ~ 50 nM일 수 있다.The concentration of platelet activating factor added may be 0.5 nM to 500 nM, preferably 1 nM to 500 nM, and more preferably 1 nM to 50 nM.

본 발명에서 사용되는 혈소판 활성화 인자(platelet activating factor, PAF)는 혈소판에 작용하여 응집반응 방출작용을 촉진시키거나, 평활근세포(수축반응), 백혈구(활성화)를 비롯한 대부분의 세포에 작용하여 생리활성을 유도하는 인지질의 일종으로, 백혈구, 대식세포, 비만세포, 혈관내피세포 등에서 포스포리파아제 A2의 작용으로 생산되는 물질로 알려져 있다. The platelet activating factor (PAF) used in the present invention acts on platelets to promote the release of aggregation reactions, or to act on most cells including smooth muscle cells (shrinkage), leukocytes (activation) and biological activity It is a kind of phospholipid to induce, is known as a substance produced by the action of phospholipase A2 in leukocytes, macrophages, mast cells, vascular endothelial cells and the like.

상기 배양액 조성물은 2세포기 또는 8세포기의 포유동물 초기 배아에 처리될 수 있다.The culture composition may be treated in early mammalian embryos of 2 or 8 cell phase.

상기 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제는 재조합단백질 형태일 수 있다.The secreted leukocyte protease inhibitor may be in the form of a recombinant protein.

상기 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제의 농도는 0.01 ~ 10 μg/ml일 수 있다.The secretion leukocyte protease inhibitor concentration may be 0.01 ~ 10 μg / ml.

상기 배양액 조성물은 착상에 관여하는 착상인자(implantation factors)의 발현을 조절할 수 있으며, 상기 착상인자는 기질 금속단백분해효소-14(MMP-14), 호중구 엘라스타제(NE) 및 금속단백분해효소-1 조직 억제제(TIMP-1)일 수 있다.The culture composition can regulate the expression of implantation factors involved in implantation, the implantation factors are substrate metalloproteinase-14 (MMP-14), neutrophil elastase (NE) and metalloproteinase -1 tissue inhibitor (TIMP-1).

또한 본 발명은, 포유동물의 초기 배아에 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제를 처리하는 단계를 포함하는 포유동물 초기 배아의 체외 배양방법을 제공한다.The present invention also provides a method for in vitro culturing of an early mammalian embryo comprising the step of treating the secreted leukocyte protease inhibitor in the early embryo of the mammal.

상기 처리하는 단계에서 혈소판 활성화 인자를 추가로 처리할 수 있다.In the processing step, the platelet activating factor may be further processed.

상기 초기 배아는 초기 배아는 2세포기 또는 8세포기의 포유동물 초기 배아일 수 있다.The early embryo may be a mammalian early embryo of two-cell or eight-cell stage.

또한 본 발명은, 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제를 포함하는 배지에 포유동물의 초기 배아를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 초기 배아의 체외 배양방법을 제공한다.The present invention also provides a method for in vitro culturing of an early mammalian embryo comprising culturing the early embryo of the mammal in a medium containing a secreted leukocyte protease inhibitor.

상기 배지는 혈소판 활성화 인자를 더 포함할 수 있다.The medium may further comprise platelet activating factors.

상기 배양은 20 ~ 130 시간 동안 수행될 수 있다.The culture may be performed for 20 to 130 hours.

본 발명에 따른 포유동물 초기 배아의 성장 배양액에 포함되어 있는 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제는 체내와 유사하게 체외에서 배양되는 배아의 발생을 진행시킬 수 있으며, 다양한 발생인자의 발현수준을 상향조절하여 종래의 체외 배양방법을 통해 배양되는 배아에 비해 초기 배아의 발생율과 착상율을 향상시킬 수 있다. 본 발명은 따라 불임 의학이나 배아 분화를 이용한 임상 등에 적용될 수 있다.The secretory leukocyte protease inhibitors contained in the growth culture of early mammalian embryos according to the present invention can progress the development of embryos cultured in vitro similar to the body, and up-regulate the expression level of various development factors. In vitro culture method can improve the incidence and implantation rate of early embryos compared to the cultured embryos. The present invention can be applied accordingly to clinical use using infertility medicine or embryo differentiation.

도 1은 체외에서 난할시기동안 감소된 발생 속도 및 Slpi 발현 수준에 관한 것으로 (A)는 체외에서 배양된 배아와 체내의 배아가 포배기로 발생하는 비율을 시간에 따라 측정한 결과이며, *은 체내와 체외에서 유의적으로 차이가 있음을 의미하고(P<0.05, t-test), (B)는 SLPI와 베타-액틴(beta-actin) 및 토끼의 알파-글로빈(α-globin)의 mRNA 발현양을 비교한 결과이며, PN은 전핵 시기 배아, 2-C는 2세포기 배아, 4-C는 4세포기 배아, 8-C는 8세포기 배아, Mor는 상실배기, Bla는 포배기를 의미하고, (C)는 체내와 체외 배아의 Slpi 발현 수준을 실시간(Real-time) PCR로 분석한 결과로, 4.5pc는 배아기 4.5(embryonic stage 4.5)를 의미하고, (D)는 체내 착상 전 시기 배아의 SLPI에 대해 온조직표본 면역형광화학법(whole mount immunofluorochemistry)을 수행하여, 염색 강도를 공초점 현미경으로 분석한 이미지이며, 1은 1세포기 배아, 2는 2세포기 배아, 3은 4세포기 배아, 4는 8세포기 배아, 5는 상실배기, 6은 초기 포배기, 7은 부화기 배아(hatching-stage embryo), 8은 음성 대조군인 부화기 배아(negative control with hatching-stage embryo)의 이미지이다.
도 2는 배아 내로 Slpi-특이적 ODN의 전이(translocation)와 Slpi mRNA의 녹다운(knockdown)에 관한 것으로 (A)는 5‘ 말단에서 6FAM과 연결된 ODNs(20 μM)으로 배양된 초기 배아의 형광 현미경 사진이며, 1은 4세포기, 2, 3은 8세포기, 4, 5는 포배기 배아이고, (B)는 Slpi 안티센스 ODN을 처리하고 배아 시기에 따라 Slpi mRNA 양을 관찰한 결과를 전기영동으로 나타닌 이미지로, Cont는 대조군, S-ODN은 Slpi 센스-올리고디옥시리보뉴클레오티드, AS-ODN은 Slpi 안티센스-올리고디옥시리보뉴클레오티드이며, *은 대조군과 안티센스-ODN, #은 센스-ODN과 안티센스-ODN이 유의적으로 차이가 있다는 의미이고(P<0.05, t-test), (C)는 웨스턴 블로팅을 통해 SLPI의 단백질 수준을 나타낸 이미지이다.
도 3은 Slpi 녹다운 유무에 따른 초기 배아의 지연된 발생을 나타낸 결과로, A와 C는 Slpi 센스 ODN 처리한 결과이고, B와 D는 Slpi 안티센스 ODN을 처리한 결과이며, n은 실험에서 사용된 배아의 전체수를 의미하고, *은 대조군에 대해 유의적으로 차이가 있다는 의미이다(P<0.05, x²-test).
도 4는 발생 지연(developmental delay)에 대한 Slpi 녹다운의 발생 시기별 효과(stage-specific effect)에 관한 것이다. 20 μM의 센스 ODN 또는 안티센스 ODN을 포함하는 배지에서 2세포기 배아 시기부터 배양한 결과(A)와 8세포기 배아 시기부터 배양한 결과(B)에 관한 데이터로서 각각 hCG 주사시간을 기준으로 96시간때와 120 시간때에 상실배기와 포배기까지 발생시킨 결과를 나타내고 있으며, *은 대조군에 대해 유의적으로 차이가 있다는 의미이다(P<0.05, ANOVA, t-test).
도 5는 8세포기에 안티센스 ODN을 24시간동안 처리하여 일시적인 Slpi 녹다운을 유도하였을 때 감소된 발생 능력(potency)을 나타낸 결과로 Bla는 포배기, Exp는 팽창된 배아(expanded embryo), Hat은 부화기 배아(hatching embryo), Sh는 수축된 배아(shrunken embryo)이고, *은 대조군에 대해, #은 센스-ODN과 안티센스-ODN이 유의적으로 차이가 있다는 의미이다(P<0.05, x²-test).
도 6은 체외 배아에 Slpi 안티센스 ODN을 처리한 이후에 재조합 SLPI 단백질을 처리하여 발생 속도가 회복되는 것을 확인한 결과에 관한 것으로 (A) hCG 주사 시간을 기준으로 96시간과 120시간째에 포배기의 비율 및 (B) 팽창(expansion) 및 부화(hatching)의 누적율(accumulate rate)을 SLPI 농도에 따라 확인한 결과(120h)이고 (C)와 (D)는 대조군과 Slpi 안티센스 ODN이 처리된 배아에 SLPI를 처리하여 회복되는 발생을 배아시기별로 관찰한 결과로 그래프에 나와있는 숫자는 시기별 배아수/실험에 사용된 총 배아수를 의미하고, AS는 안티센스 ODN을 의미하며, *은 대조군과 실험군에 대해, #은 동일한 농도에서 96시간과 120시간이 유의적으로 차이가 있다는 의미이다(P<0.05, x²-test).
도 7은 발생 인자의 발현 프로파일에서 SLPI가 유도하는 변화에 관한 것으로 (A)는 대조군과 SLPI를 포함하는 배양액에서 2세포기 배아를 포배기까지 발생시킨 후 대리모에 이식한 후의 착상율을 비교한 그래프이고 (B)는 배아시기별 배지 내에 있는 유전자의 전사 프로파일을 나타낸 결과로 n은 이식된 전체 배아의 수를 의미하고, Mor은 상실배기, mBla는 중기 포배기, Exp는 팽창된 배아(expanded embryo), Hat은 부화기 배아(hatching embryo)이고, *은 대조군과 실험군이 유의적으로 차이가 있다는 의미이다(P<0.05, x²-test(A), t-test(B)).
도 8은 대조군(무처리군), SLPI 단독 처리군 및 SLPI와 혈소판 활성 인자(platelet activating factor, PAF)의 처리군의 배아 발생 속도를 비교한 것으로, 각각의 배양액을 포함하는 배지에서 2세포기 배아를 각각 배양 후 72시간(hCG 주사 시간을 기준으로 96시간째) 및 96시간(hCG 주사 시간을 기준으로 120시간째)에 포배 단계로의 배아 발생 속도를 비교한 그래프이다. 그래프 안의 숫자는 포배로 발생한 배아수/모수를 나타낸 것이다. * : P < 0.05 control과 비교; #: P < 0.05 SLPI와 SLPI + PAF 비교, 도면 상단의 a는 ANOVA 통계법을 이용하였을 때 96시간 째 그룹 간에 P < 0.05로 유의하다라는 것을 의미하고, b는 ANOVA 통계법을 이용하였을 때 120시간 째 그룹 간에 P < 0.05로 유의하다라는 것을 의미한다.
도 9는 대조군(무처리군), SLPI 단독 처리군 및 SLPI와 혈소판 활성 인자(platelet activating factor, PAF)의 처리군의 착상율을 비교한 것으로, 각각의 배양액을 포함하는 배지에서 2세포기 배아를 각각 배양 후 72시간(hCG 주사 시간을 기준으로 96시간째)에 대리모에 이식한 후의 착상율을 비교한 그래프이다. * : P < 0.05 control과 비교; #: P < 0.05 SLPI와 SLPI + PAF 비교, 도면 상단의 a는 ANOVA 통계법을 이용하였을 때 96시간 째 그룹 간에 P < 0.05로 유의하다라는 것을 의미한다.Figure 1 relates to the reduced incidence rate and Slpi expression level during incubation period in vitro, (A) is a result of measuring the rate of development of embryos cultured in vitro and embryonic blastocyst over time, * is the body ( P <0.05, t-test), and (B) indicate the mRNA expression of SLPI, beta-actin, and alpha-globin in rabbits. PN stands for pronuclear embryos, 2-C stands for 2-cell embryos, 4-C stands for 4-cell embryos, 8-C stands for 8-cell embryos, Mor stands for embryonic embryos, Bla stands for blastocysts. (C) is the result of real-time PCR analysis of Slpi expression levels in the in vitro and in vitro embryos. 4.5pc means embryonic stage 4.5 and (D) pre-implantation period. Whole tissue immunofluorochemistry was performed on the SLPI of the embryo, and staining intensity was analyzed by confocal microscopy. 1 is 1-cell embryo, 2 is 2-cell embryo, 3 is 4-cell embryo, 4 is 8-cell embryo, 5 is loss embryo, 6 is early blastocyst, 7 is hatching-stage embryo , 8 is an image of the negative control with hatching-stage embryo.
Figure 2 relates to the translocation of Slpi -specific ODN and knockdown of Slpi mRNA into embryos (A) is a fluorescence microscope of early embryos incubated with ODNs (20 μM) linked to 6FAM at the 5 'end. Photograph, 1 is 4-cell stage, 2, 3 is 8-cell stage, 4, 5 is blastocyst embryo, (B) is treated with Slpi antisense ODN and the result of observing Slpi mRNA amount according to embryo phase is electrophoresis In the image shown, Cont is the control, S-ODN is Slpi sense- oligodioxyribonucleotide , AS-ODN is Slpi antisense- oligodioxyribonucleotide , * is the control and antisense-ODN, # is the sense-ODN and antisense-ODN. There is a significant difference ( P <0.05, t-test), (C) is an image showing the protein level of the SLPI through Western blotting.
Figure 3 shows the delayed development of early embryos with or without Slpi knockdown, A and C is the result of Slpi sense ODN treatment, B and D is the result of Slpi antisense ODN treatment, n is the embryo used in the experiment Means the total number of *, and * means that there is a significant difference with respect to the control ( P <0.05, x ² -test).
4 relates to the stage-specific effect of Slpi knockdown on developmental delay. Data on the results of incubation from the two-cell embryo phase (A) and the culture from the eight-cell embryo phase (B) in media containing 20 μM sense or antisense ODN, respectively, based on hCG injection time. It shows the result of loss and blastocyst at the time and 120 hours, and * means that there is a significant difference with the control group ( P <0.05, ANOVA, t-test).
FIG. 5 shows the reduced potency when the antisense ODN was induced for 24 hours in 8 cell phase and induced temporary Slpi knockdown. Bla is an blastocyst, Exp is an expanded embryo, and Hat is an incubator embryo. (hatching embryo), Sh is shrunken embryo, * is the control group, # is the difference between sense-ODN and antisense-ODN ( P <0.05, x ² -test) .
Figure 6 relates to the results of the recovery of the developmental rate by treating the recombinant SLPI protein after treatment with Slpi antisense ODN in vitro embryos (A) ratio of blastocyst at 96 hours and 120 hours based on hCG injection time And (B) the cumulative rate of expansion and hatching (accumulate rate) according to SLPI concentration (120h) and (C) and (D) are SLPI in control and Slpi antisense ODN-treated embryos. The number shown in the graph indicates the total number of embryos used in the experiment / time of embryos, AS means antisense ODN, and * indicates control and experimental groups. For #, mean that there is a significant difference between 96 and 120 hours at the same concentration ( P <0.05, x ² -test).
7 is related to SLPI-induced changes in the expression profile of developmental factors. (B) shows the transcription profile of the genes in the embryonic medium, where n is the total number of embryos transplanted, Mor is the embryonic embryo, mBla is the middle embryo, Exp is the expanded embryo, Hat is a hatching embryo and * means that the control and experimental groups were significantly different ( P <0.05, x ² -test (A), t-test (B)).
8 is a comparison of the embryo development rate of the control group (untreated group), SLPI-only group and SLPI and platelet activating factor (PAF) treated group, the two-cell phase in the medium containing each culture medium Embryos were incubated at 72 hrs (96 h based on hCG injection time) and 96 h (120 h based on hCG injection time) after culturing stage. The numbers in the graph represent the number of embryos / parameters generated by blastocysts. *: Compared with P <0.05 control; #: P <0.05 Comparison between SLPI and SLPI + PAF, a at the top of the figure means that P <0.05 was significant among the 96-hour group using the ANOVA statistical method, and b was 120 hours using the ANOVA statistical method. P <0.05 is significant between groups.
9 is a comparison of the implantation rate of the control group (untreated group), the SLPI-only group and SLPI and platelet activating factor (PAF) treatment group, the two-cell embryo in the medium containing each culture medium It is a graph comparing the implantation rate after transplantation to surrogate mothers 72 hours after each culture (96 hours based on hCG injection time). *: Compared with P <0.05 control; #: P <0.05 Comparison between SLPI and SLPI + PAF, a at the top of the figure means that P <0.05 is significant between the groups at 96 hours when ANOVA statistical method is used.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. The objects, features and advantages of the present invention will be readily understood through the following examples. The present invention is not limited to the embodiments described herein and may be embodied in other forms. The embodiments introduced herein are provided to sufficiently convey the spirit of the present invention to those skilled in the art. Therefore, the present invention should not be limited by the following examples.

재료의 준비Preparation of the ingredients

마우스들은 성신여대 동물관리위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 관리하였고 실험동물운영에 대한 NIH 가이드라인에 따라 유지하였다. 6-8주령의 CD-1 암컷 마우스들을 5 IU 임마 혈청 성선자극호르몬(PMSG, Sigma)으로 과배란시키고 48시간 후에 5 IU 인간융모성 성선자극호르몬(hCG, Sigma)을 처리하였다. 그 후 각각의 암컷 마우스를 수컷 마우스와 하룻밤동안 케이지에서 교미시킨 후, 다음 날 아침에 질 마개(copulation plug)를 확인하였다. 영시점(zero time point)은 hCG 주사 시간을 나타낸다.Mice were managed according to a protocol approved by the Sungshin Women's University Animal Care Committee and maintained in accordance with the NIH Guidelines for Laboratory Animal Operations. 6-8 week old CD-1 female mice were overovulated with 5 IU gonadotropin (PMSG, Sigma) and treated with 5 IU human chorionic gonadotropin (hCG, Sigma) after 48 hours. Each female mouse was then mated with the male mouse in the cage overnight, and then the copulation plug was checked the next morning. The zero time point represents the hCG injection time.

1세포기, 2세포기, 4세포기, 8세포기, 상실배기 및 포배기 배아는 수란관과 자궁으로부터 각각 hCG 주사 후 24시간, 48시간, 60시간, 72시간, 84시간 및 96시간에 Biggers-Whitten-Whittingham(BWW, Biggers et al., 1971) 배지로 불어내었다(flushed). 배아일 4.5(Embryonic day 4.5, E4.5) 배아는 120시간 후에 채취되었다.Single, two-, four-, eight-cell, amniotic and blastocyst embryos were treated with Biggers- at 24, 48, 60, 72, 84 and 96 hours after hCG injection from the oviduct and uterus, respectively. Fluted with Whitten-Whittingham (BWW, Biggers et al., 1971) medium. Embryo day 4.5 (E4.5) Embryos were harvested after 120 hours.

체외 배양된 배아를 획득하기 위해, 4세포기, 8세포기, 상실배기, 포배기 및 부화기 배아(hatching embryos)는 각각 hCG 주사 후 60시간, 72시간, 90시간, 120시간 및 138시간에 채취되었다. 채취된 배아들은 10개씩 한 그룹으로 37℃에서 5% CO², 95% 공기 및 95% 이상의 습도 분위기에서 광물성 오일(#353652, Falcon in vitro fertilization dish, Corning)을 포함하는 BWW 배지 10 μl로 배양되었다.To obtain in vitro cultured embryos, four-cell, eight-cell, mortal, hatchery and hatching embryos were harvested at 60, 72, 90, 120 and 138 hours after hCG injection, respectively. . The harvested embryos were incubated in groups of 10 each with 10 μl of BWW medium containing mineral oil (# 353652, Falcon in vitro fertilization dish, Corning) at 37 ° C in 5% CO ² , 95% air and 95% humidity. It became.

RNA 분리 및 정량 RT-PCRRNA Isolation and Quantitation RT-PCR

mRNA는 1세포기, 2세포기, 4세포기, 8세포기, 상실배기, 포배기 및 E4.5기에 있는 10개의 배아로부터 직접 분리되었다. mRNA 분리에 Oligotex direct mRNA Micro kit(QIAGEN)를 사용하였다. 배아를 파열시키기 전에, mRNA 분리에 대한 외인성 대조군으로 토끼 Hba mRNA를 선정하고 RT-PCR로 정량화하였다. 배아 mRNA의 질(quality)은 PCR로 수행하였고 토끼 Hba mRNA를 레퍼런스로 사용하였다.mRNA was directly isolated from 10 embryos at 1, 2, 4, 8, 8, blastocyst and E4.5. Oligotex direct mRNA micro kit (QIAGEN) was used for mRNA isolation. Before rupturing the embryo, rabbit Hba mRNA was selected as an exogenous control for mRNA isolation and quantified by RT-PCR. Embryonic mRNA quality was performed by PCR and rabbit Hba mRNA was used as a reference.

실시간(Real-time) RT-PCR은 Slpi와 다른 유전자들의 발현 수준을 평가하기 위해 사용하였다. cDNA 합성은 MMLV-RT와 Taq(Stratagene)을 사용하여 수행하였다. cDNA 첫 번째 가닥은 유전자별 프라이머(표 1)와 Takara에서 제공한 프로토콜[Thermo Cycler Dice^™ Real Time System (TP800) Software Ver. 2.00. Takara Bio Inc.]을 따른 SYBR(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)을 사용하여 유전자 발현을 정량화시키기 위해 실시간 PCR에 첨가되었다; 열 프로그램(thermal program)은 FastStart Taq 중합효소를 활성화시키기 위해 95℃에서 4분간의 배양이 포함되어 있고 이어서 3단계의 PCR을 45 사이클 수행하였다. 해리곡선(dissociation curves)은 단일 PCR 산물이 증폭된 것을 확인하기 위해 각각의 PCR이 수행된 후에 생성되었다. PPia, Actb 및 H2afz 발현 수준은 Ppia 유전자를 레퍼런스로 하여 실시간 PCR을 수행하여 분석하였다(Mamo et al., 2007). 모든 실험은 세 번에 걸쳐 수행되었다.Real-time RT-PCR was used to assess the expression levels of Slpi and other genes. cDNA synthesis was performed using MMLV-RT and Taq (Stratagene). The first strand of cDNA was a primer for each gene (Table 1) and a protocol provided by Takara [Thermo Cycler Dice ^™ Real Time System (TP800) Software Ver. 2.00. Takara Bio Inc.] was added to real-time PCR to quantify gene expression using SYBR (Takara Bio Inc., Shiga, Japan); The thermal program included 4 minutes of incubation at 95 ° C. to activate FastStart Taq polymerase followed by 45 cycles of 3 steps of PCR. Dissociation curves were generated after each PCR was performed to confirm that a single PCR product was amplified. PPia , Actb and H2afz expression levels were analyzed by real time PCR with reference to the Ppia gene (Mamo et al., 2007). All experiments were performed three times.

유전자 증폭에 사용된 프라이머 서열Primer sequence used for gene amplification 유전자gene 유전자 서열
(Gene Bank Access No.)Gene sequence
(Gene Bank Access No.) SlpiSlpi SenseSense 5’-GAATCCTGTTCCCATTCGCAA-3’(서열번호 1)5'-GAATCCTGTTCCCATTCGCAA-3 '(SEQ ID NO: 1) AntisenseAntisense 5’-GGAGCAGGGAAGTAGTTTCCAGA-3’(서열번호 2)
NM_0114145'-GGAGCAGGGAAGTAGTTTCCAGA-3 '(SEQ ID NO: 2)
NM_011414 Mmp9Mmp9 SenseSense 5’-TGTACGGACCCGAAGCGGACATT-3’(서열번호 3)5'-TGTACGGACCCGAAGCGGACATT-3 '(SEQ ID NO: 3) AntisenseAntisense 5’-CGAAGGTGAAGGGAAAGTGACA-3’(서열번호 4)
NM_0135995'-CGAAGGTGAAGGGAAAGTGACA-3 '(SEQ ID NO: 4)
NM_013599 Mmp14Mmp14 SenseSense 5’-CAGTCACTCTCAGCTGCCATTG-3’(서열번호 5)5'-CAGTCACTCTCAGCTGCCATTG-3 '(SEQ ID NO: 5) AntisenseAntisense 5’-CTCATTATGCTGCCACTTGAGGC-3’(서열번호 6)
NM_0086085'-CTCATTATGCTGCCACTTGAGGC-3 '(SEQ ID NO: 6)
NM_008608 ElaneElane SenseSense 5’-CATGCTACTGGCATTGTTCCTGG-3’(서열번호 7)5'-CATGCTACTGGCATTGTTCCTGG-3 '(SEQ ID NO: 7) AntisenseAntisense 5’-CACTACCTGCACTGACCGGAAAT-3’(서열번호 8)
NM_0157795'-CACTACCTGCACTGACCGGAAAT-3 '(SEQ ID NO: 8)
NM_015779 ActbActb SenseSense 5’-TCCGTAAAGACCTCTATGCCAACAC-3’(서열번호 9)5'-TCCGTAAAGACCTCTATGCCAACAC-3 '(SEQ ID NO: 9) AntisenseAntisense 5’-TCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3’(서열번호 10)
NM_0073935'-TCCTGCTTGCTGATCCACATCT-3 '(SEQ ID NO: 10)
NM_007393 H2afzH2afz SenseSense 5’-GCTGGAAAGGACTCCGGAAA-3’(서열번호 11)5'-GCTGGAAAGGACTCCGGAAA-3 '(SEQ ID NO: 11) AntisenseAntisense 5’-TTCCTGCCAACTCAAGTACCTCTG-3’(서열번호 12)
NM_0167505'-TTCCTGCCAACTCAAGTACCTCTG-3 '(SEQ ID NO: 12)
NM_016750 PpiaPpia SenseSense 5’-CCACCGTGTTCTTCGACATCA-3’(서열번호 13)5'-CCACCGTGTTCTTCGACATCA-3 '(SEQ ID NO: 13) AntisenseAntisense 5’-GATGCCAGGACCTGTATGCTTTAG-3’(서열번호 14)
NM_0089075'-GATGCCAGGACCTGTATGCTTTAG-3 '(SEQ ID NO: 14)
NM_008907 Rabbit Hba Rabbit hba SenseSense 5’-GCAGCCACGGTGGCGAGTAT-3’(서열번호 15)5'-GCAGCCACGGTGGCGAGTAT-3 '(SEQ ID NO: 15) AntisenseAntisense 5’-GTGGGACAGGAGCTTGAAATTCAC-3’(서열번호 16)
NM_0010823895'-GTGGGACAGGAGCTTGAAATTCAC-3 '(SEQ ID NO: 16)
NM_001082389

SlpiSlpi ODNODN 처리 process

Slpi를 녹다운(knockdown)시키기 위해 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드(ODN) 방법(Cheon et al., 2003; Paria et al., 1992)을 수행하였다. 모든 가능한 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 연결을 포함하는 ODN이 합성되고 Gene Bank의 마우스 Slpi mRNA 서열(GenBank accession no. NM_011414.3)을 기반으로 한 PAGE로 정제되었다. Antisense oligodioxynucleotide (ODN) methods (Cheon et al., 2003; Paria et al., 1992) were performed to knock down Spi . ODN containing all possible phosphorothioate linkages was synthesized and purified by PAGE based on the Gene Bank's mouse Slpi mRNA sequence (GenBank accession no. NM — 011414.3).

두 가지의 ODN이 5‘말단에서 6-FAM과 함께 또는 6-FAM없이 합성되었고(Bioneer, Daejeon, Korea), ODN의 녹다운 능력을 측정하였다. 센스 ODN과 안티센스 ODN은 Slpi mRNA 서열을 이용하여 합성하였다. ODN 첫 번째 세트의 서열은: 센스 ODN 1, 5’-TTCACCATGAAGTCCTGCG-3’(서열번호 17), 안티센스 ODN 1, 5’-CGCAGGACTTCATGGTGAA-3’(서열번호 18)이고 ODN 두 번째 세트의 서열은: 센스 ODN 2, 5’-GAGAAGCCACAATGCCGT-3’(서열번호 19), 안티센스 ODN 2, 5’-ACGGCATTGTGGCTTCTC-3’(서열번호 20)이다. 안티센스 ODN 1과 2는 각각 230 bp248 bp와 377 bp394 bp 지역에서 상보적이다. 두 ODN 중 ODN 2가 배아에서 녹다운 효과가 더 효과적이었다. 그러므로, ODN 2가 모든 실험에서 사용되었다.Two ODNs were synthesized with or without 6-FAM at the 5 'end (Bioneer, Daejeon, Korea), and the knockdown ability of the ODN was measured. Sense ODN and antisense ODN were synthesized using Slpi mRNA sequence. The sequence of the first set of ODN is: sense ODN 1, 5'-TTCACCATGAAGTCCTGCG-3 '(SEQ ID NO: 17), the antisense ODN 1, 5'-CGCAGGACTTCATGGTGAA-3' (SEQ ID NO: 18) and the sequence of the second set of ODN is: Sense ODN 2, 5'-GAGAAGCCACAATGCCGT-3 '(SEQ ID NO: 19), antisense ODN 2, 5'-ACGGCATTGTGGCTTCTC-3' (SEQ ID NO: 20). Antisense ODN 1 and 2 are complementary in the 230 bp248 bp and 377 bp394 bp regions, respectively. Of the two ODNs, ODN 2 was more effective in knocking down embryos. Therefore, ODN 2 was used in all experiments.

ODN은 2세포기의 배아에 주입되었고(0, 10, 20 및 30 μM) 발생 패턴은 4일동안 매 24시간마다 분석되었다. DOTAP(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)proopyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulphate) 리포솜 처리 시약(liposomal transfection reagent)(Life Science, Roche)을 제조자의 프로토콜에 따른 처리 시약으로 사용하였다. 아울러, 배아에 대한 Slpi ODN의 효과를 측정하기 위해, 자궁-나팔관 접합부에서 분리한 8세포기 배아(72시간)를 추가로 48시간동안 Slpi ODN으로 처리하였다.ODN was injected into two-cell embryos (0, 10, 20 and 30 μM) and developmental patterns were analyzed every 24 hours for 4 days. Using liposome transfection reagent (Life Science, Roche) according to the manufacturer's protocol It was. In addition, to measure the effect of Slpi ODN on embryos, 8-cell embryos (72 hours) isolated from uterine- fallopian tube junctions were treated with Slpi ODN for an additional 48 hours.

Slpi ODN 처리의 가역성을 연구하기 위해, 배아에 Slpi ODN을 처리하였다. 8세포기 배아는 자궁-나팔관 접합부로부터 72시간에서 분리되었고 센스 ODN이나 안티센스 ODN을 포함하는 배지에서 24시간동안 배양되고, ODN이 없는 배지로 이식된 후 추가로 24시간동안 배양되었다. 그 후 배아의 발생 패턴을 측정하였다.To study the reversibility of Slpi ODN treatment, embryos were treated with Slpi ODN. Eight-cell embryos were isolated at 72 hours from the uterine- fallopian tube junction and incubated for 24 hours in medium containing sense ODN or antisense ODN, and then further cultured for 24 hours after transplanting into medium without ODN. The embryo development pattern was then measured.

SLPI 처리SLPI processing

1세포기, 2세포기 또는 8세포기 배아는 수란관 또는 자궁-나팔관 접합부로부터 채취되었다. 배아들은 0, 0.01, 0.1, 1 및 10 μg/ml 재조합 SLPI 단백질을 포함하는 배지에서 배양되었다(R&D System). 배아의 발생(예: 상실배기, 포배기, 부화기 및 축소기(shrunken))은 역상 현미경(Nikon) 하에서 매 12시간동안 관찰되었다.One-cell, two- or eight-cell embryos were harvested from the fallopian tube or uterine- fallopian tube junction. Embryos were cultured in medium containing 0, 0.01, 0.1, 1 and 10 μg / ml recombinant SLPI protein (R & D System). Embryonic development (eg, mortality, blastocyst, incubation and shrunken) was observed every 12 hours under a reversed phase microscope (Nikon).

Slpi 안티센스 ODN에 대한 외인성 SLPI의 회복 효과를 측정하기 위해, SLPI(1 μg/ml 및 10 μg/ml) 및 Slpi 안티센스 ODN이 배아로 동시에 주입되었다. 여기에, 2세포기 배아가 사용되었고 3일동안 배양되었다.To determine the recovery effect of exogenous SLPI on Slpi antisense ODN, SLPI (1 μg / ml and 10 μg / ml) and Slpi antisense ODN were injected simultaneously into the embryo. Here, two-cell embryos were used and incubated for three days.

온조직표본 면역형광 염색법(whole mount immunofluorexcence staining)Whole mount immunofluorexcence staining

배아는 4℃에서 PBS 내 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정되었고 온조직표본 면역형광 염색법을 수행하였다. 시료는 메탄올로 탈수되었고, 재탈수하고, FBS-TBST(10% serum in TBS+0.1% Triton)으로 블록된(blocked) 후, 5% DMSO를 포함하는 TBST에서 염소 항-마우스 SLPI 항체(R&D System)로 하룻밤동안 배양되었다. 다음에, 배아는 여러 번 세척된 후(세척 한 번에 1시간), Cy^™3 토끼 항-염소 IgG 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, PA, USA)로 하룻밤동안 배양하였다. 배아는 6번 세척되고, 도트 슬라이드(dot slides)에 올려진 후, 형광 현미경(Nikon Eclipse E800)으로 시각화되었다.Embryos were fixed with 4% paraformaldehyde in PBS at 4 ° C. and subjected to warm tissue immunofluorescence staining. Samples were dehydrated with methanol, re-dehydrated, blocked with FBS-TBST (10% serum in TBS + 0.1% Triton) and then goat anti-mouse SLPI antibody (TB & R) in TBST containing 5% DMSO. ) Was incubated overnight. The embryos were then washed several times (one hour at a time) and then incubated overnight with Cy ^™ 3 rabbit anti-goat IgG secondary antibody (Jackson ImmunoResearch, PA, USA). Embryos were washed six times, mounted on dot slides and visualized with a fluorescence microscope (Nikon Eclipse E800).

자궁 내로의 배아 이식Embryo Transfer into the Uterus

체외에서 배양된 포배기 배아는 가임신(pseudopregnancy) 4일째 되는 날에 대리모의 자궁각으로 이식되었다. 대조군으로, 교미 후 4일째 되는 날에 자궁에서 포배기 배아를 BWW로 불러내어(flushing)하여 채취하였다. 대조군 포배기 배아 또한 가임신 4일째 되는 날에 대리모의 자궁각으로 이식되었다. 모든 그룹에서 10개의 배아들은 각각의 자궁각으로 이식되었다. 배아 이식 후 15일째 되는 날, 암컷 마우스 수여자에 대해 정상적으로 발생한 배아가 존재하는지 검사하였다. CD1 암컷 마우스(8주령)는 배아 공여자로서 사용되었다. 가임신은 정관수술받은 수컷 마우스와 발정기의 암컷 마우스를 교미시킴으로써 유도되었다.The blastocyst embryos cultured in vitro were implanted into the surrogate mother's womb on day 4 of pseudopregnancy. As a control, blastocyst embryos were collected from the uterus on the 4th day after mating by flushing with BWW. Control blastocyst embryos were also implanted into the surrogate mother's uterus at day 4 of childbearing. Ten embryos from all groups were implanted into each uterine angle. On day 15 post embryo transfer, female mouse recipients were examined for the presence of embryos that developed normally. CD1 female mice (8 weeks old) were used as embryo donors. Fertility was induced by mating the vestibular male and estrous female mice.

통계 분석Statistical analysis

외인성 SLPI 실험과 ODN 실험에 대해, 발생 빈도는 카이-스퀘어(Chi-square) 테스트나 t-test와 함께 ANOVA를 사용하여 측정하였다. 결과는 P=0.05의 역치하에서 통계적으로 유의하다고 간주하였다.For exogenous SLPI experiments and ODN experiments, the incidence was measured using ANOVA with a Chi-square test or t-test. The results were considered statistically significant under the threshold of P = 0.05.

실시예 1: 체외 배양에서의 발생 지연 및 Slpi mRNA의 감소된 수준 확인Example 1 Delayed Development in In Vitro Cultures and Identification of Reduced Levels of Slpi mRNA

착상 전 배아는 상기에서 설명된 시료와 방법으로 배양되었다. 체외에서 배양된 배아는 8세포기에서 발생 속도가 감소하였다: 96시간째에 생식관에서 채취된 배아 중 54.14%만 포배기인 것을 확인하였다. 이는 체내에서 채취된 포배기의 수와 비교했을 때 통계적으로 유의하였으나(P<0.05); 120시간째에 포배기의 수는 유의적으로 차이가 없는 것으로 나타났다(도 1A).Preimplantation embryos were incubated with the samples and methods described above. Embryos cultured in vitro decreased at 8 cell stages: Only 96.14% of embryos collected from the genital tract were found to be blastocysts at 96 hours. This was statistically significant when compared to the number of blastocysts collected in the body ( P <0.05); At 120 hours, the number of blastocysts was not significantly different (FIG. 1A).

배아에서 추출한 mRNA의 양은 외인성 토끼 α-글로빈을 검출하기에 충분하였다(도 1B). Slpi mRNA는 체내 배아에서 검출되었다. 실시간 RT-PCR 분석결과, Slpi는 1세포기에서 발현이 시작되었고 발현 수준은 2세포기부터 계속 증가하고(fold change: 2.6 ± 1.707 vs. 1세포기), 4세포기에서 최대치에 이르렀다(fold change: 7.5 ± 1.484 vs. 1세포기). 그 후, Slpi mRNA의 발현 수준이 감소하였다(fold change: 8세포기, 1.8 ± 0.048; 상실배기, 0.16 ± 0.017 vs. 1세포기). 발현 수준은 E4.5기일 때 1세포기에 비해 포배기에서 5.3 ± 0.418배 증가하였다. Slpi mRNA의 발현은 체내 배아에서보다 체외 배양된 배아에서 더 낮게 나타났다. 특히 4세포기 배아에서 발현 수준이 유의적으로 더 낮게 나타났다(도 1C).The amount of mRNA extracted from the embryo was sufficient to detect exogenous rabbit α-globin (FIG. 1B). Slpi mRNA was detected in embryos in the body. Real-time RT-PCR analysis showed that Slpi began to be expressed in the 1-cell stage and the expression level increased continuously from the 2-cell stage (fold change: 2.6 ± 1.707 vs. 1-cell stage) and reached its maximum in the 4-cell stage (fold change: 7.5 ± 1.484 vs. 1 cell phase). Thereafter, the expression level of Slpi mRNA was decreased (fold change: 8 cell stage , 1.8 ± 0.048; loss stage , 0.16 ± 0.017 vs. 1 cell stage ). The expression level was 5.3 ± 0.418 fold increased in the blastocyst stage at the E4.5 stage compared to the one-cell stage. The expression of Slpi mRNA was lower in in vitro cultured embryos than in in vivo embryos. In particular, expression levels were significantly lower in 4 cell embryos (FIG. 1C).

온조직표본 면역형광화학법으로 착상 전 기간동안 SLPI의 아세포성 위치(subcellular localization)를 측정하였다. SLPI는 1세포기에서 감지되었고 부화기까지 존재하는 것을 확인하였다. SLPI 단백질의 발현 패턴은 mRNA와 유사하였다: 8세포기까지 할구의 세포질에 주로 위치하였고, 후에 측주변대(lateral peripheral zone)에 주로 위치하였다(도 1D). 이러한 결과는 착상 전 배아에서 SLPI를 발현하고, SLPI는 세포질 내에서 발생시기에 따라 특이적으로 분포하고 있다는 것을 나타내고 있다.Subcellular localization of SLPI was measured during preimplantation by warm histologic immunofluorescence. SLPI was detected in the 1-cell stage and confirmed to exist until the incubation stage. The expression pattern of the SLPI protein was similar to mRNA: it was located mainly in the cytoplasm of the blastomere up to 8 cell stage and later in the lateral peripheral zone (FIG. 1D). These results indicate that SLPI is expressed in preimplantation embryos, and that SLPI is specifically distributed in the cytoplasm according to developmental time.

실시예 2: Slpi 안티센스 ODN 처리를 통한 배아의 발생 지연 확인 Example 2 Determination of Embryonic Delay Through Slpi Antisense ODN Treatment

Slpi mRNA 센스 ODN(도 2A1-3)과 안티센스 ODN(도 2A4-5)은 상기에서 설명된 방법에 따라 2세포기 배아의 할구내로 완벽하게 주입되었다. 4세포기 배아는 배양 12시간 후에 분석되었고 8세포기 배아는 20시간 후, 포배기 배아는 48시간 후에 분석되었다(도 2A). 배아에 안티센스 ODN이 처리된 결과, Slpi mRNA의 발현 수준이 효과적으로 감소하였다. 안티센스 ODN이 처리된 배아에서의 Slpi mRNA 수준을 확인하기 위해 96시간째에 실시간 PCR을 수행하여 확인한 결과, Slpi mRNA 수준이 대조군과 센스 ODN이 처리된 배아에서보다 유의하게 더 낮다는 것을 확인할 수 있었다(도 2B). Slpi mRNA sense ODN (FIGS. 2A1-3) and antisense ODN (FIGS. 2A4-5) were completely injected into the blasts of two-cell embryos according to the method described above. Four-cell embryos were analyzed after 12 hours of culture, eight-cell embryos were analyzed after 20 hours, and blastocyst embryos were analyzed after 48 hours (Figure 2A). The antisense ODN treatment of embryos effectively reduced the expression level of Slpi mRNA. Real-time PCR was performed at 96 hours to identify Slpi mRNA levels in embryos treated with antisense ODN. As a result, Slpi mRNA levels were significantly lower than those in control and sense ODN treated embryos. (FIG. 2B).

초기 배아의 발생에 대한 Slpi 녹다운 효과를 확인해본 결과, 센스-ODN 그룹에서는 배아의 발생이 임의의 시점에서도 처리된 올리고(oligo) 농도에 의존적이지 않았다(도 3A 및 C). 한편, 안티센스-ODN 그룹에서 2세포기 배아의 대부분이 24시간 이내에 8세포기 배아로 발생하는 것을 확인할 수 있었다(0, 10, 20 및 30 μM)(도 3B). 그러나 hCG 주사 후 96시간 째에, 안티센스 ODN 그룹에서 배아의 포배기 발생율은 농도 의존적인 방법으로 감소하였다(10 μM, 42%; 20 μM, 31%; 30 μM, 13%)(도 3D). 반면에 센스-ODN 그룹에서 96시간째에, 배아에서는 포배기 발생율이 감소하지 않았다(도 3C). As a result of confirming the Slpi knockdown effect on the development of early embryos, in the sense-ODN group embryo development was not dependent on the treated oligo concentration at any time point (FIGS. 3A and C). On the other hand, in the antisense-ODN group, it was confirmed that most of the two-cell embryos develop into 8-cell embryos within 24 hours (0, 10, 20 and 30 μM) (FIG. 3B). However, 96 hours after hCG injection, embryonic blastocyst development in the antisense ODN group decreased in a concentration dependent manner (10 μM, 42%; 20 μM, 31%; 30 μM, 13%) (FIG. 3D). In contrast, at 96 hours in the sense-ODN group, embryonic incidence rate did not decrease in the embryo (FIG. 3C).

실시예 3: Slpi 안티센스 ODN의 발생시기 특이적 효과 확인Example 3 Confirmation of Time-Specific Effect of Slpi Antisense ODN

실시예 2의 결과를 기반으로, 20 μM ODN을 사용하여 초기 배아의 발생 속도에 대한 SLPI의 효과를 분석하였다. 먼저, 2세포기 배아에 대해 Slpi 안티센스 ODN을 처리한 결과, 대부분의 상실배기 배아가 96시간째에서 유지되었고 배아가 120시간까지 배양되었을 때 포배기로 발생하였다. 그룹들 사이에서는 포배기 발생율에 대해 별다른 차이는 나타나지 않았다. 96시간과 120시간 사이에서 상실배기에 대한 20 μM 안티센스 ODN 처리에 따른 추세선(trend line)의 기울기는 65로 나타났다. 그러나, 0 μM과 20 μM 센스 ODN 주입이 나타내는 추세선의 기울기는 각각 44와 46이었다. 아울러, hCG 주사 후 96시간과 120시간 사이에서 포배기에 대한 20 μM 안티센스 ODN 처리에 따른 추세선의 기울기는 61이었다. 안티센스 ODN 그룹과 대조군에 대한 기울기 사이에는 유의한 차이가 있었다. 반면에, 0 μM과 20 μM 센스 ODN 그룹의 기울기는 각각 41과 47.9로 나타났으며, 유의한 차이가 없었다(도 4A). 이는 Slpi 녹다운이 8세포기 이후 배아의 발생을 지연시키는 결과로 이어지는 것을 나타내고 있다.Based on the results of Example 2, the effect of SLPI on the rate of development of early embryos was analyzed using 20 μM ODN. First, Slpi antisense ODN was treated for two-cell embryos. Most of the embryonic embryos were maintained at 96 hours and developed into blastocysts when the embryos were cultured for 120 hours. There was no difference in blastocyst incidence between groups. The slope of the trend line with 20 μM antisense ODN treatment for loss exhaustion between 96 and 120 hours was 65. However, the slopes of the trend lines indicated by the 0 μM and 20 μM sense ODN injections were 44 and 46, respectively. In addition, the slope of the trend line following the 20 μM antisense ODN treatment for blastocyst was 96 and between 96 and 120 hours after hCG injection. There was a significant difference between the slopes for the antisense ODN group and the control group. On the other hand, the slopes of the 0 μM and 20 μM sense ODN groups were 41 and 47.9, respectively, and there was no significant difference (FIG. 4A). This suggests that Slpi knockdown leads to delayed embryo development after 8 cell stage .

다음으로, 8세포기 배아(hCG 주사 후 72시간째)에 대해 Slpi 안티센스 ODN을 처리한 결과, hCG 주사 후 96시간째에서 배아의 1.11%가 상실배기로 남아있었던 반면에(P<0.05), 0 μM과 센스 ODN 그룹에서는 각각 3.74%와 3%의 배아가 상실배기에서 남아있었다. hCG 주사 후 120시간째에서 포배기로의 발생율은 대조군에서 96%, 20 μM 센스 ODN 그룹에서 97%, 그리고 20 μM 안티센스 ODN 그룹에서 99%로 나타났다. hCG 주사 후 96시간과 120시간 사이에서 포배기에 대한 20 μM 안티센스 ODN 처리에 따른 추세선의 기울기는 다른 그룹들과 유사하게 나타났다(도 4B). 이는 발생 속도에 대한 Slpi 녹다운 효과는 Slpi ODN을 주입할 때 배아 시기에 의존한다는 것을 보여준다.Next, treatment with Slpi antisense ODN for 8-cell embryos (72 hours after hCG injection) showed that 1.11% of embryos remained lost in 96 hours after hCG injection ( P <0.05), In the 0 μM and sense ODN groups, 3.74% and 3% embryos remained in the embryonic phase, respectively. The incidence to blastocysts at 120 hours after hCG injection was 96% in the control group, 97% in the 20 μM sense ODN group and 99% in the 20 μM antisense ODN group. The slope of the trendline following 20 μM antisense ODN treatment for blastocysts between 96 and 120 hours after hCG injection was similar to the other groups (FIG. 4B). This shows that the Slpi knockdown effect on the rate of development depends on embryo timing when injecting Slpi ODN.

실시예 4: Slpi 녹다운의 부화율 감소효과 확인Example 4: Confirmation of the hatching rate reduction effect of Slpi knockdown

일시적 노출 방법을 사용하여, 8세포기에서의 SLPI의 역할을 확인하였다. 8세포기 배아에 24시간동안 안티센스 ODN이 주입된 후 ODN이 없는 BWW 배지로 이식되었다. 발생 패턴은 24시간 후에 분석하였다. 그 결과, 대조군 배아의 94%와 Slpi 센스 ODN 그룹 배아의 91%는 부화기로 발생하였으나, Slpi 안티센스 ODN 그룹에서는 25%의 배아만 부화기로 발생하였다(도 5). 이는 초기 배아의 발생에서 SLPI의 역할이 배아 시기에 따라 다르다는 것을 의미한다.The transient exposure method was used to confirm the role of SLPI at 8 cell stage. Eight-cell embryos were implanted with BWW media without ODN after injecting antisense ODN for 24 hours. Developmental patterns were analyzed after 24 hours. As a result, 94% of the control embryos and 91% of the Slpi sense ODN group embryos were incubated , but only 25% of embryos were generated in the Slpi antisense ODN group (Fig. 5). This means that the role of SLPI in early embryonic development depends on the embryonic time.

실시예 5: Slpi 안티센스 ODN 처리된 체외 배양된 배아에서 SLPI를 통한 발생 지연 회복효과 확인 Example 5 Confirmation of Recovery Effect of Delayed Development through SLPI in Slpi Antisense ODN-In Vitro Cultured Embryos

2세포기 배아를 상기에 설명된 시료와 방법으로 각기 다른 농도의 재조합 SLPI가 포함된 배지에서 배양하였다. 그 결과, SLPI 처리군이 96시간째에서 2세포기부터 포배기로 이르는 배아의 발생 속도가 대조군보다 1.72-2.6시간 더 빨랐다. SLPI 처리군에서 96시간째에 포배기로의 발생은 대조군(27%)에 비해 농도 의존적인 방법으로(0.01 μg, 66%; 0.1 μg, 64%; 1 μg, 76%; 10 μg, 72%) 유의하게 더 높았다(P<0.05)(도 6A). 아울러, 120시간째에서 또한 모든 SLPI 처리군(0.01 μg, 66%; 0.1 μg, 64%; 1 μg, 76%; 10 μg, 72%)이 익스팬디드 스테이지(expanded stage)로 발생하는 배아의 축적된 비율이 대조군(46%)에 비해 유의하게 높았다. 부화율 또한 대조군(11%)에 비해 재조합 SLPI 단백질 처리군(0.01 μg, 20%; 0.1 μg, 26%; 1 μg, 25%; 10 μg, 48%)에서 유의하게 증가하였다(도 6B).Two-cell embryos were cultured in media containing different concentrations of recombinant SLPI by the samples and methods described above. As a result, the development rate of the embryo from the 2-cell stage to the blastocyst was 962-2.6 hours faster than the control group in the SLPI-treated group at 96 hours. The blastocyst development at 96 hours in the SLPI treated group was concentration dependent (0.01 μg, 66%; 0.1 μg, 64%; 1 μg, 76%; 10 μg, 72%) compared to the control group (27%). Significantly higher ( P <0.05) (FIG. 6A). In addition, at 120 hours all of the SLPI treated groups (0.01 μg, 66%; 0.1 μg, 64%; 1 μg, 76%; 10 μg, 72%) of the embryos developed into the expanded stage Accumulated percentage was significantly higher than control (46%). Incubation rate was also significantly increased in the recombinant SLPI protein treated group (0.01 μg, 20%; 0.1 μg, 26%; 1 μg, 25%; 10 μg, 48%) compared to the control (11%) (FIG. 6B).

한편, SLPI 처리로 인해 배아의 발생 속도에 대한 녹다운 효과를 극복할 수 있는지 확인하기 위해, 2세포기 배아를 20 μM 안티센스 ODN과 재조합 SLPI 단백질(1 μg/ml, 10 μg/ml)로 배양하였다. 그 결과, 96시간째에서 8 세포기의 처리군 배아가 SLPI 농도가 높아짐에 따라 대조군과 유사한 수준으로 포배강을 형성하였다(도 6C). 120시간째에도, 대조군 및 녹다운 처리군에서 배아의 발생 패턴은 SLPI 농도가 높아짐에 따라 유사하게 나타났다(도 6D). In order to determine whether the SLPI treatment can overcome the knockdown effect on the rate of embryo development, two-cell embryos were incubated with 20 μM antisense ODN and recombinant SLPI protein (1 μg / ml, 10 μg / ml). . As a result, at 96 hours, the 8-cell treated group embryos formed blastocysts at levels similar to those of the control group as the SLPI concentration was increased (FIG. 6C). Even at 120 hours, the developmental patterns of embryos in the control and knockdown treatment groups were similar as SLPI concentrations increased (FIG. 6D).

실시예 6: SLPI의 착상율 향상 및 발생인자 발현 수준의 변화 확인Example 6: improvement of implantation rate and developmental factor expression level of SLPI

SLPI 처리된 배아의 발생 완성을 측정하기 위해, 2세포기 배아를 SLPI 10 μg/ml를 포함하는 배지에서 포배기 배아로 발생시킨 후 가임신한 마우스의 자궁내강(uterine lumen)으로 이식하였다. 임신 15일째 되는 날 착상율을 확인하였다. 그 결과, 착상율은 대조군보다 SLPI 처리군에서 유의적으로 더 높게 나타났다(4배 이상 더 높음, P<0.05)(도 7A).To measure developmental development of SLPI treated embryos, two-cell embryos were developed into blastocyst embryos in a medium containing 10 μg / ml of SLPI and then implanted into the uterine lumen of pregnant mice. The implantation rate was confirmed on the 15th day of pregnancy. As a result, the implantation rate was significantly higher in the SLPI treated group than the control group (more than four times higher, P <0.05) (FIG. 7A).

착상에 영향을 주는 인자인 포배기 배아가 포함하는 세포의 수를 확인하기 위해, SLPI로 체외 배양한 후에 포배기 배아의 총 세포수와 내세포의 수를 계수하였다. 그 결과, 영양막의 총 세포수는 SLPI에 의해 영향을 받지 않았고, 대조군과 SLPI 처리된 배아 사이에서도 세포수의 차이는 없었다. 또한 SLPI는 내세포괴(inner cell mass, ICM)의 세포수와 총 세포수 사이의 비율을 변화시키지 않았다(표 2).To determine the number of cells included in the blastocyst embryo, a factor influencing implantation, the total number of cells and the number of internal cells of the blastocyst embryo were counted after in vitro culture with SLPI. As a result, the total cell number of the trophoblast was not affected by SLPI, and there was no difference in cell numbers between the control and SLPI treated embryos. SLPI also did not change the ratio between the number of cells in the inner cell mass (ICM) and the total number of cells (Table 2).

실험군
(처리된 배아 시기)Experimental group
(Processed embryo timing) 총 세포수Total cell count ICM의 세포수(ICM/총 세포수)ICM cell count (ICM / total cell count) 0 μg/ml SLPI0 μg / ml SLPI 58.7 ± 0.8558.7 ± 0.85 13.0 ± 1.49(0.2215)13.0 ± 1.49 (0.2215) SLPI-ODNSLPI-ODN 57.3 ± 0.4757.3 ± 0.47 12.4 ± 1.43(0.3043)12.4 ± 1.43 (0.3043) 1 μg/ml SLPI(2세포기)1 μg / ml SLPI (2-cell stage) 60.5 ± 0.3860.5 ± 0.38 12.7 ± 2.03(0.2099)12.7 ± 2.03 (0.2099) 10 μg/ml SLPI(2세포기)10 μg / ml SLPI (2-cell stage) 56.5 ± 1.4256.5 ± 1.42 11.8 ± 1.98(0.2088)11.8 ± 1.98 (0.2088)

아울러, 착상 인자의 발현 수준을 확인하기 위해, 상기에서 설명된 실시간 RT-PCR 방법을 수행하였다. 그 결과, 착상 인자인 MMP-9, MMP-14, TIMP-1 및 NE의 발현은 외인성 SLPI에 의해 조절되었다. MMP-14, TIMP-1 및 NE 발현 수준은 대조군보다 처리군에서 부화기 배아에 유의적으로 더 높게 나타났다. 그러나 MMP-9 발현 수준은 두 그룹 사이에서 다르지 않았다(도 7B).In addition, to confirm the expression level of the implantation factor, the real-time RT-PCR method described above was performed. As a result, the expression factors MMP-9, MMP-14, TIMP-1 and NE were regulated by exogenous SLPI. MMP-14, TIMP-1 and NE expression levels were significantly higher in hatching embryos in treated groups than in controls. However, MMP-9 expression levels did not differ between the two groups (FIG. 7B).

실시예 7: SLPI와 혈소판 활성화 인자(platelet activating factor, PAF)의 배아 발생 속도 향상 효과 확인Example 7: Confirmation of SLPI and Platelet Activating Factor (PAF) to Improve Embryonic Development

SLPI를 포함하는 배양액에 혈소판 활성화 인자를 첨가할 경우 배아의 발생 속도 및 착상율의 변화를 확인하고자, 2세포기 배아를 무처리군 배양액(대조군), 1 μg/ml SLPI 및 1 μg/ml + 1 nM PAF(활성화된 형태)을 함유한 0.4% BSA(bovine serum albumin), BWW 배양액을 포함하는 배지에서 각각 배양하였다. PAF는 시그마(Sigma사(社))에서 입수하였다. 배양 후 72시간(hCG 주사 시간을 기준으로 96시간째) 및 96시간(hCG 주사 시간을 기준으로 120시간째)에 배아 발생 단계를 분석하여 기록하였다. hGC 주사 후 96시간째 체내의 정상적인 배아는 포배 단계로 발달한 시간이다. 한편 hCG 주사 후 120시간은 체내의 정상배아는 착상단계를 수행하고 있는 부화한 단계로 발달하나 체외의 경우 팽창한 단계나 부화하는 단계이다.To determine the change in embryonic development rate and implantation rate when platelet activating factor was added to the culture medium containing SLPI, two-cell embryos were treated with untreated group culture (control), 1 μg / ml SLPI and 1 μg / ml + 1 Each was cultured in a medium containing 0.4% BSA (bovine serum albumin) containing nM PAF (activated form) and BWW culture. PAF was obtained from Sigma. Embryonic development stages were recorded at 72 h (96 h based on hCG injection time) and 96 h (120 h based on hCG injection time) after incubation. At 96 hours after hGC injection, normal embryos in the body develop into the blastocyst stage. On the other hand, 120 hours after hCG injection, the normal embryo in the body develops to the hatching stage in which the implantation stage is performed, but in the case of in vitro expansion or hatching stage.

분석 결과, hCG 주사 후 96시간째에 관찰한 배아 중 포배 단계로 발달한 배아의 비율은 대조군의 배양액에서는 26.89%, SLPI를 함유한 배양액에서는 68.9%로 나타났다. 한편, hCG 주사 후 120시간째에 관찰한 배아 중 포배이상 단계로 발생한 배아의 비율은 대조군에서는 75.63%, SLPI를 함유한 배양액에서는 87.38%로 나타났다. 체외 배양의 경우 체내의 정상 발생보다 발생속도가 매우 느리다. SLPI가 있을 경우 배아의 발생속도가 빨라지나 체내에서 발생하는 경우에 비하여는 그렇지 않다. 이는 체내의 조절 조성을 온전히 반영하지 못한 것으로 추정될 수 있다. 아울러, 이전에 PAF가 부화에 일정부분 영향을 미치는 사전 연구를 바탕으로 PAF를 SLPI와 함께 2세포기 배아를 포함하는 배양액에 처리하였다. 그 결과, 1 μg/ml SLPI와 1 nM PAF(활성화된 형태)를 동시에 함유한 배양액에서 배아를 배양할 경우 배아의 발생속도가 체내에서 발생하는 배아의 발생속도와 유사해졌다. 즉 hCG 주사 후 96시간째에 관찰한 배아 중 포배 단계로 발달한 배아의 비율이 77.97%로 SLPI를 단독으로 처리한 배양액(68.9%)에 비하여 발생율이 유의하게 증가하였다. 또한 통계적 유의성은 없었으나 hCG 주사 후 120시간째에 관찰한 배아 중 포배이상 단계로 발생한 배아의 비율은 SLPI를 단독으로 처리한 배양액(87.38%)에 비해 SLPI와 PAF를 함께 처리한 배양액에서 92.37%로 높아졌다(도 8). 이러한 결과는 SLPI가 PAF와 협동적으로 초기배아에 작용하여 배아 발생을 촉진함을 의미한다. As a result, the percentage of embryos developed in the blastocyst stage at 96 hours after hCG injection was 26.89% in control medium and 68.9% in SLPI-containing medium. On the other hand, the percentage of embryos that developed at blastocyst stage 120 hours after hCG injection was 75.63% in the control group and 87.38% in the culture medium containing SLPI. In vitro culture is much slower than normal development in the body. The presence of SLPI increases the rate of development of the embryo, but not when it occurs in the body. It may be assumed that this did not fully reflect the regulatory composition of the body. In addition, PAF was treated with a culture medium containing two-cell embryos along with SLPI, based on previous studies in which PAF partially affected hatching. As a result, when embryos were cultured in a culture medium containing 1 μg / ml SLPI and 1 nM PAF (activated form) at the same time, the rate of embryo development was similar to that of embryos in the body. The incidence rate of embryos developed during blastocyst stage at 96 hours after hCG injection was 77.97%, which was significantly higher than that of SLPI-treated medium (68.9%). There was no statistical significance, but the percentage of embryos that developed during blastocyst stage 120 hours after hCG injection was 92.37% in both SLPI and PAF-treated cultures compared to SLPI-only cultures (87.38%). Increased to (FIG. 8). These results suggest that SLPI acts on early embryos in cooperation with PAF to promote embryonic development.

실시예 8: SLPI와 혈소판 활성화 인자(platelet activating factor, PAF)의 착상율 향상 효과 확인Example 8: Confirmation of the improvement of implantation rate of SLPI and platelet activating factor (PAF)

실시예 7을 바탕으로, 배아에 SLPI와 PAF를 함께 처리하였을 때 향상된 발생속도가 배아의 발생 능력에 어떠한 영향을 미쳤는지 확인하기 위해, 실시예 7에서 배양시킨 배아로 이식실험을 수행하였다. 2세포기 배아를 배양 후 72시간, 즉 hCG 주사 시간을 기준으로 96시간째에 대리모에 이식하고, 임신 15일째에 배아가 착상되었는지 확인하였다. 그 결과, SLPI를 단독으로 처리한 처리군에 비해, SLPI와 PAF를 함께 처리한 배아의 착상율이 유의하게 증가하였다(도 9). Based on Example 7, transplant experiments were carried out with the embryos cultured in Example 7 to determine how the improved development rate affected the embryos' ability to develop when SLPI and PAF were co-treated with the embryos. Two-cell embryos were transplanted into surrogate mothers 72 hours after culture, that is, 96 hours based on hCG injection time, and confirmed whether embryos were implanted on the 15th day of pregnancy. As a result, the implantation rate of the embryo treated with SLPI and PAF was significantly increased compared to the treatment group treated with SLPI alone (FIG. 9).

상기 실험을 통하여, 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제(SLPI)를 함유한 배양액에 혈소판활성화인자(platelet activating factor)를 첨가하였을 때 발생 속도가 자연적인 상태에 보다 접근하는 것을 확인하였다. 또한 배아의 형태적 질이 좋아졌음을 착상율 향상을 통하여 확인하였다.Through the experiment, it was confirmed that the addition rate of platelet activating factor to the culture medium containing the secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI) was closer to the natural state. In addition, it was confirmed by improving the implantation rate that the morphological quality of the embryo was improved.

이러한 결과를 통하여 SLPI를 함유한 배양액에 PAF를 첨가하면 체외에서의 배아 발생을 촉진하고 발생 능력을 획득하는데 도움이 되는 것을 알 수 있다.These results indicate that the addition of PAF to the culture medium containing SLPI helps to promote embryonic development in vitro and to acquire the ability to develop.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail specific parts of the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that these specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. will be. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

<110> SUNGSHIN WOMEN`S UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR GROWTH MEDIA OF MAMMALS EARLY EMBRYO COMPRISING SECRETORY LEUKOCYTE PEPTIDASE INHIBITOR AND METHOD FOR CULTURING MAMMALS EARLY EMBRYO IN VITRO TO KEEP NORMAL DEVELOPMENTAL SPEED USING THE SAME <130> P17-0235 <150> KR 2016/0174990 <151> 2016-12-20 <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Slpi amplification <400> 1 gaatcctgtt cccattcgca a 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Slpi amplification <400> 2 ggagcaggga agtagtttcc aga 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Mmp9 amplification <400> 3 tgtacggacc cgaagcggac att 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Mmp9 amplification <400> 4 cgaaggtgaa gggaaagtga ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Mmp14 amplification <400> 5 cagtcactct cagctgccat tg 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Mmp14 amplification <400> 6 ctcattatgc tgccacttga ggc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Elane amplification <400> 7 catgctactg gcattgttcc tgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Elane amplification <400> 8 cactacctgc actgaccgga aat 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Actb amplification <400> 9 tccgtaaaga cctctatgcc aacac 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Actb amplification <400> 10 tcctgcttgc tgatccacat ct 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for H2afz amplification <400> 11 gctggaaagg actccggaaa 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer 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antisense primer for Mmp9 amplification <400> 4 cgaaggtgaa gggaaagtga ca 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Mmp14 amplification <400> 5 cagtcactct cagctgccat tg 22 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Mmp14 amplification <400> 6 ctcattatgc tgccacttga ggc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Elane amplification <400> 7 catgctactg gcattgttcc tgg 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Elane amplification <400> 8 cactacctgc actgaccgga aat 23 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Actb amplification <400> 9 tccgtaaaga cctctatgcc aacac 25 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Actb amplification <400> 10 tcctgcttgc tgatccacat ct 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for H2afz amplification <400> 11 gctggaaagg actccggaaa 20 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for H2afz amplification <400> 12 ttcctgccaa ctcaagtacc tctg 24 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for Ppia amplification <400> 13 ccaccgtgtt cttcgacatc a 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for Ppia amplification <400> 14 gatgccagga cctgtatgct ttag 24 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for rabbit Hba amplification <400> 15 gcagccacgg tggcgagtat 20 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for rabbit Hba amplification <400> 16 gtgggacagg agcttgaaat tcac 24 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> slpi sense ODN 1 <400> 17 ttcaccatga agtcctgcg 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> slpi antisense ODN 1 <400> 18 cgcaggactt catggtgaa 19 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> slpi sense ODN 2 <400> 19 gagaagccac aatgccgt 18 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> slpi antisense ODN 2 <400> 20 acggcattgt ggcttctc 18

Claims (12)

분비 백혈구 단백질분해효소 억제제 및 혈소판 활성화 인자(platelet activating factor)를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 성장 배양액 조성물.
A growth culture composition for controlling the rate of development of early mammalian embryos comprising a secretory leukocyte protease inhibitor and a platelet activating factor.
삭제delete 청구항 1에 있어서,
상기 배양액 조성물은 2세포기 또는 8세포기의 포유동물 초기 배아에 처리되는 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 성장 배양액 조성물.
The method according to claim 1,
The culture composition is a growth culture composition for controlling the rate of development of early mammalian embryos, characterized in that treated in early mammalian embryos of two-cell or eight-cell phase.
청구항 1에 있어서,
상기 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제는 재조합단백질 형태인 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 성장 배양액 조성물.
The method according to claim 1,
The secretory leukocyte protease inhibitor is a growth medium composition for controlling the rate of development of early mammalian embryos, characterized in that the recombinant protein form.
청구항 1에 있어서,
상기 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제의 농도는 0.01 ~ 10 μg/ml인 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 성장 배양액 조성물.
The method according to claim 1,
The concentration of the secretory leukocyte protease inhibitor is a growth culture composition for controlling the rate of development of early mammalian embryos, characterized in that 0.01 ~ 10 μg / ml.
청구항 1에 있어서,
상기 배양액 조성물은 착상에 관여하는 착상인자(implantation factors)의 발현을 조절하는 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 성장 배양액 조성물.
The method according to claim 1,
The culture composition is a growth culture composition for controlling the rate of development of early mammalian embryos, characterized in that for controlling the expression of implantation factors (implantation factors) involved in implantation.
청구항 6에 있어서,
상기 착상 인자는, 기질 금속단백분해효소-14(MMP-14), 호중구 엘라스타제(NE) 또는 금속단백분해효소-1 조직 억제제(TIMP-1)인 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 성장 배양액 조성물.
The method according to claim 6,
The implantation factor is matrix metalloproteinase-14 (MMP-14), neutrophil elastase (NE) or metalloproteinase-1 tissue inhibitor (TIMP-1) development of early mammalian mammal, characterized in that Growth culture composition for controlling the rate.
인간을 제외한 포유동물로부터 채취한 포유동물의 초기 배아에 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제 및 혈소판 활성화 인자를 처리하는 단계를 포함하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 체외 배양방법.
An in vitro culture method for controlling the rate of development of the early mammalian embryo comprising the step of treating the secreted leukocyte protease inhibitor and platelet activating factor in the early embryo of the mammal collected from the mammal except human.
삭제delete 분비 백혈구 단백질분해효소 억제제 및 혈소판 활성화 인자를 포함하는 배지에 인간을 제외한 포유동물로부터 채취한 포유동물의 초기 배아를 배양하는 단계를 포함하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 체외 배양방법.
An in vitro culture method for controlling the rate of early mammalian embryo comprising the step of culturing the early embryo of the mammal collected from a mammal other than human in a medium containing a secreted leukocyte protease inhibitor and platelet activating factor.
삭제delete 청구항 10에서,
상기 배양은 20 ~ 130 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 포유동물 초기 배아의 발생 속도를 조절하기 위한 체외 배양방법.In claim 10,
The culturing is in vitro culture method for controlling the rate of development of early mammalian embryos, characterized in that carried out for 20 to 130 hours.

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