KR20100064985A - 인간 및 마우스에서 발현하는 ｌ1ｃａｍ에 특이적으로 결합하는 재조합 단일클론항체 및 그 이용 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 및 마우스에서 발현되는 L1CAM (L1 cell adhesion molecule) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로서, 구체적으로는 인간 및 마우스에서 발현되는 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편, 상기 항체의 단편을 생산하는 재조합 단일클론항체를 코딩하는 벡터, 상기 단일클론항체를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
L1CAM, 단일클론항체, 항암, Ab4

Description

인간 및 마우스에서 발현하는 Ｌ1ＣＡＭ에 특이적으로 결합하는 재조합 단일클론항체 및 그 이용{RECOMBINANT MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO L1CAM EXPRESSED IN HUMANS AND MICE AND THE USE THEREOF}
본 발명은 인간 및 마우스에서 발현되는 L1CAM (L1 cell adhesion molecule) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것으로서, 구체적으로는 인간 및 마우스에서 발현되는 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편, 상기 항체의 단편을 생산하는 재조합 단일클론항체를 코딩하는 벡터, 상기 단일클론항체를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
L1CAM (L1 cell Adhesion Molecule, CD171)은 세포 표면에서 세포간부착 (cell to cell adhesion)을 중개하는 면역글로블린 수퍼패밀리 세포부착단백질들 (Immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs) 중의 하나로, 그 분자량은 200 ~ 220 kDa 이다. L1CAM은 NILE(NGF-Inducible Large External) 당단백질이라는 이름으로 뉴런(neuron)과 뉴런(neuron)사이에서 부착을 중개하고, 신경돌기(neurite)의 성장과 뉴런(neuron)의 이동 등에 관여하는 단백질로 처음 알려졌다 (Lee et al., PNAS 74, 5021, 1997; McGuire JC and Greene LA 15, 357, 1978). 인간 L1CAM은 1257 아미노산 잔기로 구성되어 있고, 세포막을 한번 통과하며 아미노기 부분이 세포막 외부에 존재하고 카복시 부분이 세포질 부분에 존재하는 타입(type) 1 에 속하는 내재성 막 단백질 (Integral membrane glycoprotein) 이다. 세포외 부분에는 면역글로불린 (immunoglobulin) 타입(type) 2 에 속하는 도메인이 6개, 화이브로넥틴 (fibronectin) III 유사 도메인이 5개 존재하며 20 개의 N-당화-부위(N-glycosylation sites)가 존재한다. L1CAM은 정상적인 인간에서는 뇌에서 가장 풍부하게 발현되고, 몇몇 조혈세포들과 일부 신장세포 등과 말초 신경(peripheral nerves)과 갱글리언(ganglions)에서 발현되나 그 외의 모든 세포들에서는 발현되지 않는다 (Huszar et al., Human Pathology 37, 1000-1008, 2006). 최근 흑색종 (melaoma), 신경아세포종(neuroblastoma), 난소암, 대장암 및 자궁내막암 등 암세포들에서 L1CAM이 과발현되고, L1CAM이 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 하며, L1CAM 과발현이 암의 나쁜 예후와 관련이 있고 양성 종양에서는 전혀 L1CAM이 발현되지 않는다는 것들이 알려지게 됨에 따라, L1CAM이 암치료제의 타겟으로 부각되기 시작하였다.
L1CAM에 대한 항체를 이용한 암의 진단 및 치료방법에 관해서는 다음과 같은 보고들이 있다. 유럽 특허출원 EP 1 172 654 A1 및 미국 특허출원 US 2004/0259084호는, L1CAM이 난소암, 자궁내막암 또는 그러한 암의 소인의 존재에 대한 표식이 된다는 전제 하에, 난소암 또는 자궁내막암의 진단 및 예후판정을 위해 L1CAM에 대 한 항체를 이용하여 환자의 샘플로부터 L1CAM 존재 여부와 양을 결정하는 것을 특징으로 하는 수단, 및 세포 독성을 가진 약물과 L1CAM 항체를 결합시켜 환자에게 투여하여 암을 치료하는 방법에 대해 개시하고 있다.
또한, 미국 특허출원 US 2004/0115206호는 암세포에서 세포 성장을 저해하고 세포사를 유도할 수 있는 유효량의 항 L1CAM 항체를 세포에 접촉(contacting)시키는 것에 의해 세포의 성장을 억제하고 세포 사멸을 유도하는 것이 개시되어 있다.
또한, 국제출원 PCT/EP2005/008148은 난소암 및 자궁내막암에서 과발현되는 L1CAM 단백질 및 그들의 발현을 저해하는 조성물 및 이를 이용하여 난소암 및 자궁내막암을 예방 및 치료하는 방법을 제공한다. 이 문헌은 L1CAM 단백질의 기능을 저해하는 L1CAM 항체 및 그의 유도체를 포함하는 조성물이 난소암 및 자궁내막암의 기능을 억제하여 암세포의 이동 및 진전을 저지하여 암의 치료가 가능하다고 기재하고 있다. 본 발명자들은 담도암의 새로운 암 치료 타겟으로서 L1CAM에 대한 생쥐 단일클론항체 A10-A3를 개발한 바 있다 (대한민국 등록특허:제756051호).
그러나 상기 기술된, 지금까지 개발된 항체들은 인간 L1CAM에는 결합하지만 마우스의 L1CAM에는 결합하지 못하였다. 그 이유는 항체를 제조하기 위하여 인간 L1CAM을 생쥐에 면역시키는 경우 인간 L1CAM에 특이적인 항체가 생성되지만 자가 항원인 생쥐 L1CAM에 결합하는 항체는 거의 생성되지 않기 때문이다. 항체의 항암효능을 검증하기 위한 동물실험은 주로 인간 암세포를 이식시킨 nude mouse를 이용하는데, 이때 인간 L1CAM에는 결합하지만 생쥐 L1CAM에는 결합하지 않는 항체는 인 간 암조직에만 결합하고 생쥐의 일부 정상 조직(예, 뇌, 몇 조혈세포, 일부 신장세포, 말초 신경)에서 발현하는 L1CAM에는 결합하지 않기 때문에, 암환자에서 항체의 임상실험을 하는 경우에 비하여 항체의 항암 효능 및 독성 평가가 정확하게 이루어 질 수 없다. 이러한 문제를 해결하기 위해서는 인간 L1CAM과 생쥐 L1CAM에 다 결합하는 항체의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 마우스 및 인간 L1CAM을 동시에 인식하는 항체를 개발하기 위하여 인간 L1CAM을 생쥐에 주사하는 방법을 사용하지 않고, 인간 항체 라이브러리로부터 마우스 및 인간 L1CAM 단백질을 이용한 패닝(panning)을 수행한 결과, 신규한 항체("Ab4"라 명명함)를 개발하고, 상기 신규 항체가 생쥐 및 인간 L1CAM 단백질의 Ig5 도메인에 특이적으로 결합할 뿐만 아니라, 암세포의 성장 및 이동을 효과적으로 억제하는 항체임을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 및 마우스에서 발현되는 L1CAM 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단일클론항체의 단편을 생산하는 재조합 단일클론항체를 코딩하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
따라서 하나의 양태로서 본 발명의 목적은 인간 및 마우스(mouse, 생쥐)에서 발현되는 L1CAM (L1 cell adhesion molecule) 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "L1CAM (L1 cell adhesion molecule)"은 세포 표면에서 세포간 부착 (cell-to-cell adhesion)을 중개하는 면역글로불린 수퍼패밀리 세포부착단백질들 (immunoglobulin superfamily cell adhesion molecules, CAMs)에 속하는 내재성 막 당단백질(integral membrane glycoprotein)중 하나이다. L1CAM은 원래 뉴런, 조혈세포 및 신장 세포 등에서 발견되며 (Bateman, et al, EMBO J. 15:6050-6059; 1996), 그 기능은 뉴런의 이동, 신경 돌기의 성장, 세포 이동에 관여한다. 이러한 L1CAM은 일반적으로 세포막 결합 형태 또는 세포막의 유리된 형태 로 존재하며, 바람직하게 본원 발명의 단일클론항체는 상기 두 형태의 모든 L1CAM에 결합할 수 있다.
사람의 L1CAM 유전자는 마우스와 쥐의 L1CAM 상동체 (homolog)에서 축퇴성 올리고뉴클레오타이드 (degenerate oligonucleotide)를 프로브 (probe)로 사용하여 인간 태아의 뇌 cDNA 라이브러리 (cDNA library)로부터 분리하였다 (Hlavin, M. L. & Lemmon, V. Genomics 11: 416-423, 1991). L1CAM은 주로 뇌에서 발현되는 것으로 알려졌지만 몇몇 다른 정상조직에서 발현되는 것이 보고되었으며, 최근에는 여러 암세포에서도 발견되기 시작하였다. 본 발명의 L1CAM은 암 세포 또는 암 조직에서 발현되는 L1CAM과 관련된 것으로서, 상기 L1CAM에 대한 단일클론항체인 Ab4를 이용하여 암의 성장 및 이동를 억제함으로써 암을 치료하기 위함에 그 목적이 있다.
L1CAM이 암과의 연관성과 관련하여, L1CAM이 흑색종 (melanoma), 신경아세포종 (neuroblastoma), 난소암 및 대장암 등 여러 암에서 발현되는 것이 보고 되었으며 (Takeda, et al., J. Neurochem. 66:2338-2349, 1996; Thies et al, Eur. J. Cancer, 38:1708-1716, 2002; Arlt et al., Cancer Res. 66:936-943, 2006; Gavert et al., J. Cell Biol. 168:633-642, 2005), 막 결합 형(membrane bound form) 외에도 절단된 산물(cleavage product)이 세포 외로 분비되는 것으로부터 알 수 있다 (Gutwein et al., FASEP J. 17(2):292-4, 2003). 본 발명은 이러한 L1CAM을 발현하는 암세포를 저해함으로써, L1CAM의 발현과 관련된 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있는 Ab4 항체에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 면역 반응에 관여하는 면역 항체를 의미하며, 면역글로불린 (immunoglobulin)이라고도 한다. 이러한 항체는 Y자 형의 단일 분자로, 중쇄 (heavy chain) 및 경쇄 (light chain)으로 이루어져 있다. 따라서 본 발명의 항체는 면역학적으로 특정 항원(antigen)과 반응성인 면역글로불린 분자를 포함하며, 다클론항체 (polyclonal antibody) 및 단일클론항체 (monoclonal antibody)를 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체 (chimeric antibody)(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체 (예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전 공학에 의해 생산된 형태를 포함한다. 또한, 상기 항체는 항원결합능력을 가지는 단편, 예를 들면, Fab', F(ab')2, Fab, Fv 및 IgG를 포함하는, 항체의 항원 결합 부위를 포함한다. 또한, 상기 용어는 재조합 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)을 나타내고, 이가 (bivalent) 또는 양특이성 분자, 디아바디(diabody), 트리아바디 (tribody) 및 테트라바디 (terabody)를 포함한다. 이가 및 양특이성 분자는 예를 들면, Kostelny 등 (1992, J. Immunol., 148:1547), Pack 및 Pluckthun (1992, Biochemistry, 31:1579), Hollinger 등 (1993, Supra), Gruber 등 (1994, J. Immunol., 5368), Zhu 등 (1997, Protein Sci., 6:781 등), Hu 등 (1996, Cancer Res., 56:3055), Adams 등 (1993, Cancer Res., 53:4026) 및 McCartney 등 (1995, Protein Eng., 8:301)에 기술되어 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "단일클론항체"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위 (에피토프 (epitope))에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체 를 의미한다. 통상적으로, 상이한 에피토프들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 달리, 단일클론항체는 항원상의 단일 에피토프에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 (hybridoma)의 배양 또는 파지디스플레이 (phage display) 방법에 의해 생산될 수 있기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 장점을 갖는다.
본 발명의 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 필요에 의해 정제하여 사용될 수 있다. 이러한 정제 방법의 예로는 투석, 염 침전, 이온교환크로마토그래피, 크기배제크로마토그래피, 친화성크로마토그래피 등이 있으나, 상기예에 의해 본 발명의 항체 정제 방법이 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명은 인간 및 마우스의 L1CAM에 대한 에피토프를 동시에 인식하는 단일클론항체를 제조하였고, 이를 Ab4라 명명하였으며, 해당 단일클론항체를 파지디스플레이 기법으로 생산함으로서 항원결합부위 (Fab)를 대량으로 생산하였다.
상기 단일클론항체는 항원과 결합하여, 그 작용을 억제하거나 중화(neutralization) 시키며, 세포를 죽일 수 있다. 예를 들면, 암세포를 특이적으로 인식하는 단일클론항체는 암세포의 성장이나 이동에 관여하는 세포 표면 접착 분자나 수용성 분자에 결합하여 그 작용을 억제 또는 중화시킬 수 있고, 항원과 결합된 항체는 보체를 활성화시킬 수 있으며, 활성화된 보체에 의해 항원이 제거되도 록 할 수 있다. 또한 상기 단일클론항체는 항원에 결합하여 그 항원이 식균세포에 의해 더욱 잘 제거되게 할 수도 있다. 단일클론항체가 결합되어 있는 항원 세포는 자연살해세포 (NK cell)에 의해 보다 쉽게 살해당함으로써, 상기 단일클론항체를 이용하여 항원을 제거하는 데 이용할 수 있다. 그러므로 본 발명의 항체 자체만으로 면역반응을 통한 항원 제거 및 항원 감소 효과를 기대할 수 있는바, 본 발명의 항체는 암의 진단 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 담도암 및 폐암의 효과적인 치료제로 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는, Ab4 항체를 이용하여 암세포의 증식 및 이동을 억제시킴을 확인하였으며 (실시예 10 및 11) 이러한 Ab4가 암세포를 포식 자살 또는 살해시킴으로써 궁극적으로는 암을 치료할 수 있음을 확인하였다.
특히 본원 발명에서 사용된 항체는 L1CAM에 대한 인간 단일클론 항체로서, 바람직하게 본 발명의 항체는 인간 및 마우스의 L1CAM을 모두 인식가능한 단일클론항체에 관한 것이다. 기존에 개발된 L1CAM에 대한 항체는 인간 L1CAM에는 결합할 수 있으나, 마우스의 L1CAM에는 결합하지 못하는데, 이러한 항체를 사용하는 경우, 인간 암세포을 이식시킨 마우스모델에서 그 항암효능을 시험한다면 마우스의 일부 정상조직(예, 뇌, 몇 조혈세포, 일부 신장세포, 말초 신경)에서 발현되는 L1CAM에는 결합하지 않기 때문에, 마우스 모델을 이용한 항체의 효능 및 독성 평가가 정확하게 이루어질 수 없다. 그러나 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM을 동시에 인식하는 단일클론 항체는 인간 L1CAM을 발현하는 암세포에도 결합하지만 L1CAM을 발현하는 마 우스의 정상조직에 결합할 수 있으며, 이러한 현상은 인간 L1CAM에 결합하는 항체를 암환자에 투여했을 때 L1CAM을 발현하는 정상조직과 암조직에 결합할 수 있는 상황과 유사하다. 따라서, 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM을 동시에 인식하는 단일클론 항체를 개발하여 인간 암을 이식한 마우스 모델에서 암치료 효능을 정확하게 평가한다면 임상적으로 유용한 L1CAM 특이 항체치료제로 효과적으로 사용될 수 있음은 자명하다. 또한 Ab4는 인간 단일클론항체이기 때문에 인체 면역반응을 유발하지 않을 것으로 예상하고 있다.
바람직하게 본 발명의 Ab4 항체는 L1CAM 내의 Ig5 영역에 결합하여 그 활성을 억제하고 면역반응을 유도할 수 있다. 본 발명자들은 본 발명의 단일클론항체 Ab4가 결합하는 L1CAM 내의 도메인을 확인하기 위하여, 인간 L1CAM-Fc (이하 L1Fc라 한다)과 대한민국 특허출원 제10-2006-0107428호에 기재된 L1CAM 결손 변이체들을 각각 발현하는 플라스미드들, 즉, L1Ig(1-6)Fc, L1Ig(1-5)Fc, L1Ig(1-4)Fc, L1Ig(1-3)Fc, L1FnFc를 HEK293T 세포에 트랜스팩션시키고 L1CAM 단백질들을 발현시켰다. 이렇게 발현된 L1CAM 및 L1CAM 결손 변이체 단백질들을 전기천공 (electrophoresis)시킨 후, 웨스턴 블럿을 수행하는 한편, Ab4를 1차 항체로, anti-hIgG(Fc)-HRP를 2차 항체로 사용하여 검출한 결과, Ab4 항체는 L1Fc, L1Ig(1-6)Fc, L1Ig(1-5)Fc에는 결합하지만, L1Ig(1-4)Fc, L1Ig(1-3)Fc, L1FnFc에는 결합하지 않는 것으로 보아(도 6), Ab4가 L1CAM의 다섯번째 면역글로불린 도메인인 Ig5에 결합함을 확인하였다. 따라서 바람직하게 본 발명의 단일클론항체는 L1CAM의 다섯 번째 면역글로불린-유사 도메인 (Ig5)에 선택적으로 결합하여 L1CAM을 발현하는 암세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공할 수 있다.
상기 서술한 바와 같이, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 부위 및 가변 부위 (상기 부위는 '도메인'으로 또한 알려져 있음)를 함유한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 부위는, "상보성 결정 영역 (complementarity-determining resion, CDR)"라고 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 "구조 영역 (framework region, FR)"을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
본 발명의 단일클론항체는 경쇄 가변부위 및 중쇄 가변부위를 모두 포함하는 단일클론항체일 수 있다. 한편, 본 발명의 단일클론항체는 상보성 결정 영역 (CDR)에 공지의 치료용 항체의 구조 영역 (FR)을 접합시켜 제조할 수 있다. 바람직하게 상기 구조 영역은 도 4a 및 4b에 개시된 아미노산 서열을 가질 수 있다.
바람직한 일 양태로서, 본 발명의 단일클론항체에서 상기 CDR은 서열번호 3으로 정의되는 경쇄 CDR1, 서열번호 4로 정의되는 CDR2, 및 서열번호 5로 정의되는 CDR3로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 CDR 영역을 포함할 수 있으며, 본발명은 상기 CDR을 포함하는 경쇄 가변 부위를 갖는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공한다. 더욱 바람직하게 본 발명의 단일클론항체는 서열번호 1로 정의되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 단편일 수 있다.
또한 바람직한 일 양태로서, 본 발명의 단일클론항체는 서열번호 6으로 정의되는 중쇄 CDR1, 서열번호 7로 정의되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 8로 정의되는 중쇄 CDR3로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 CDR 영역을 포함할 수 있으며, 본발명은 상기 CDR을 포함하는 중쇄 가변부위를 갖는 단일클론항체 또는 이의 단편을 제공한다. 더욱 바람직하게 본 발명의 단일클론항체는 서열번호 2로 정의되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 단편일 수 있다.
바람직한 일 양태로서, 본 발명의 단일클론항체는 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편으로서 사용될 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 바람직하게 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원결합부위를 대량생산하기 위하여, 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 제한없이 사용할 수 있음은 자명하다. 항원결합부위의 대량생산을 위한 방법의 예로는 하이브리도마를 이용한 방법 또는 파지 디스플레이 방법에 의할 수 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 단일클론항체 Ab4의 대량생산방법이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 파지 디스플레이 방법을 이 용하여 Ab4를 생산하는 한편, 상기 방법으로 생산된 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 벡터에 클로닝하여 불변영역과 연결시킴으로서 전체 IgG (whole IgG)를 생산하였다. 또한 이렇게 제작된 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행에 수탁번호 KCTC11431BP로 기탁하였다.
파지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화 (immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적인 항체의 파지 디스플레이 기술은 1) 파지의 외피 단백질(coat protein) p (또는 p) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 항체가변영역을 포함하는 서열을 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열에 의해 코딩되는 항체 가변영역의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 항체 융합단백질 라이브러리와 결합할 수 있는 항원을 처리하는 단계; 4) 항원에 결합된 항체-파지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 용출된 파지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 항체가변영역의 서열을 결정하는 단계로 구성된다.
상기 단계에서 항체 라이브러리를 구축하기 위해 사용될 수 있는 파지는, 예를 들면 필라멘트성 파지 (filamentous phage)로 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff, Xf, Pf1 또는 Pf3 파지가 있으나, 상기 예들에 의하여 본 발명에서 사용 가능한 파지의 종류가 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 필라멘트성 파지의 표면상에 이종 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있는 벡터의 예로는, fUSE5, fAFF1, fd-CAT1 또는 fdtetDOG 등의 파지 벡터 또는 pHEN1, pComb3, pComb8, pKRIBB-Fab 또는 pSEX 등의 파지미드 벡터가 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 pKRIBB-Fab 파지미드 벡터를 사용하여 Ab4를 생산하였다.
또한, 증폭을 위한 재조합 파지의 성공적인 재감염을 위해 요구되는 야생형 외피 단백질을 제공하기 위해 사용될 수 있는 헬퍼 파지에는, 예를 들어 M13K07 또는 VSCM13 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 VSCM13이다.
위와 같이 제조된 인간 단일클론항체는 공지의 방법을 사용하여 동물세포에서 생산할 수 있다. 상기 '인간 단일클론 항체'는 치료용 약제로 사용했을 때 부작용이 생길 확률이 아주 낮은 장점을 가지고 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 제조된 Ab4를 인간 Ig (immunoglobulin)형태로 전환시키기 위하여 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변영역을 중쇄와 경쇄의 불변영역에 이들을 각각 연결시키는 벡터를 제조함으로써 인간 Ig 형태를 갖는 단일클론항체를 제조하였다. 또한 이러한 인간 Ig 형태를 제조할 수 있는 벡터를 수탁번호 KCTC11431BP로 기탁함으로써, 향후 상기 벡터가 도입된 미생물에 의해, 안정적으로 본 발명의 항체를 생산가능하도록 하였다.
바람직하게 본 발명의 Ab4를 포함하는 단일클론항체는 암 세포에서 발현되는 L1CAM을 인식하여 결합함으로써 L1CAM의 활성을 저해하고, 그 결과 암세포의 성장과 이동을 억제하며, 보다 구체적으로는 L1CAM의 Ig5 영역에 결합하여 L1CAM이 발현되는 암을 치료하는 단일클론항체이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "암 (cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양 (tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉 성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양 (benign tumor)과 악성 종양 (malignant)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라 부르며, 바람직하게 본 발명의 단일클론항체 Ab4를 이용하면, 담도암, 폐암, 난소암, 피부암, 대장암 또는 췌장암 등에서 발현되는 L1CAM을 특이적으로 인식하여 L1CAM의 활성을 억제할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Ab4 항체가 L1CAM을 발현하는 세포의 증식에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 인간 담도암 세포의 배양액에 넣어 암 세포의 증식 억제 및 이동 억제능을 확인하였다. 보다 구체적으로는 L1CAM의 Ig5 도메인에 결합하여 L1CAM이 발현되는 암의 치료 및 예방에 사용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 이러한 Ab4의 암 치료 효과를 확인하였다 (실시예 11, 12).
본 발명의 단일클론항체는 간세포, HUVEC(인간 유래의 탯줄정맥내피세포), 말초혈액 림프구(periperal blood lymphocyte) 등 정상 세포에는 결합하지 않으나(실시예 9), 담도암, 폐암, 대장암, 간암, 난소암, 위암, 피부암 및 유방암 등 다른 암세포주에의 결합능을 가질 수 있다. 다만 본 발명의 단일클론항체의 결합능이 상기 암주에 한정되는 것은 아니다. 궁극적으로 본 발명은 상기 항원-항체의 결합을 통하여 암세포의 성장 및 이동을 억제시켜 암을 치료할 수 있다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 상기 항체의 단편을 생산하는 재조합 단일클론항체를 코딩하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명자들은 본 발명의 단일클론항체의 에피토프와 결합하는 부위와 관련된 가변영역을 대량생산하기 위한 파지 디스플레이를 제조하는 한편, 상기 파지 디스플레이에 의해 생산된 Ab4를 전체 Ig (whole Ig (immunoglobulin))으로 제조하기 위해, 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 인간 경쇄 및 중쇄 불변영역과 연결시킨 벡터를 제조하였다. 바람직하게 상기 벡터는 당업계에서 통상적으로 사용되는 미생물에 형질전환시킴으로써 발현시킬 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 중쇄 리더 시퀀스와 중쇄 가변영역을, 경쇄 리더 시퀀스와 경쇄 가변영역을 각각 재조합 PCR을 이용하여 연결시켰고, 이를 추출하여 분리 정제하였다. 그 후 이를 제한효소로 절단하고 벡터의 중쇄와 경쇄 불변영역 위쪽에 각각 클로닝하여 벡터를 제조하 는 한편, 상기 벡터를 2008년 11월 21일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (수탁번호: KCTC11431BP).
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 단독으로 투여되어, 암을 치료 또는 예방할 수 있음은 자명하나, 바람직하게 상기 단일클론항체에 공지의 치료제가 결합되거나 또는 약제학적으로 허용가능한 담체가 포함될 수 있으며, 상기 치료제와 약제학적으로 허용가능한 담체를 동시에 포함할 수도 있다. 상기 공지의 치료제가 본 발명의 항체에 직접 또는 간접적으로 결합되는 경우 보다 효과적인 암 치료물질을 제공할 수 있다.
바람직하게 본 발명의 상기 단일클론항체에 치료제가 결합된 항암용 조성물에 있어서, 단일클론항체에 결합할 수 있는 치료제란 단일클론항체에 공지의 치료제를 직접 또는 간접적으로 결합시켜 보다 효과적인 암 치료물질을 제공할 수 있는 물질을 의미한다. 항체와 결합될 수 있는 치료제에는 방사성핵종, 약제, 림포카인, 독소, 이중특이적 항체 등을 포함한다. 또한, 상기한 방사선핵종에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 약제 또는 독소의 예로서, 에토포시드, 테니포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 시스-백금 동족체, 블레오마이신류, 에스페라미신류, 5-플루오로우라 실, 멜팔란 및 기타 질소 머스타드 등을 들 수 있으나, 상기 예에 의해 본원발명의 항체에 결합될 수 있는 약제 또는 독소가 제한되는 것은 아니다.
바람직한 양태로서 본 발명은 상기 단일클론항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암용 조성물을 포함할 수 있다. 바람직하게 다른 담체와 함께 약제학적 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체가 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 다음의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 항암용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 항암용 조성물은 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한 제약 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 항암용 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 또한 본 발명의 항체 조성물 은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
본 발명은 인간 및 마우스에서 발현되는 L1CAM 단백질 모두에 결합하는 인간 단일클론항체 Ab4를 제조하였다. 이 항체는 암세포의 표면에 결합하여 암세포의 성장 및 이동을 억제하는 효과를 확인함으로써, 여러 암 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
실시예 1. 인간 Fab 항체 라이브러리의 제조
(실시예 1-1) 인간 B 세포로부터 항체 유전자 증폭 및 클로닝
인간 항체 라이브러리를 만들기 위한 B 림파구는 혈액, 비장, 임파절, 골수로부터 얻었다. 혈액은 10명의 건강한 혈액기증자들로부터 얻어 피콜 (Sigma, 미국) 농도구배 방법을 이용하여 림파구를 분리하였고 RNAzol B (TEL-TEST, INC, 미국)를 첨가하여 모든 RNA를 추출하였다. 다음 10㎍의 모든 RNA와 1㎍의 올리고(dT) 프라이머 (0.5 ㎍/㎕ GIBCO, BRL), DEPC로 처리한 RNase-free 증류수 8 ㎕를 첨가 하여 70℃에 10분간 반응시킨 후 4℃에서 1분간 반응하였다. 위의 혼합물에 1 ㎕의 RNase 저해제 (GIBCO, BRL, 미국), 1 ㎕의 0.1M DTT (GIBCO, BRL, 미국), 1㎕의 2.5mM dNTP mix (GIBCO, BRL, 미국)와 역전사효소 (Superscript II, Gibco BRL, 미국)를 첨가하여 42℃, 50분간 반응하고, 90℃, 5분간 반응한 다음 4℃에 10분간 방치하여 cDNA를 합성하였다.
비장, 임파절, 골수로부터의 모든 RNA 는 Biochain 사(미국)로 부터 구입하였고 상기의 방법으로 cDNA를 합성하여 사용하였다.
이들 cDNA를 주형으로 인간항체의 경쇄 유전자와 중쇄 유전자를 인간 항체의 점라인 (germline) 데이터베이스인 MRC의 V-base (www.vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)에 표기되어 있는 프라이머 세트를 본 발명자들이 사용한 벡터에 적합하도록 변형한 다음 중합효소연쇄반응으로 증폭하였다.
중합효소연쇄반응 조건으로 0.5 ㎍ 의 cDNA, 1 ㎕의 센스 프라이머 (50 pmol/㎕), 1 ㎕의 안티센스 프라이머(50 pmol/㎕), 5 ㎕의 10 x Taq DNA 중합효소 완충용액, 1 ㎕의 10 mM dNTP 혼합물 (Mixture), 0.2 ㎕의 Taq DNA 중합효소를 넣고, 증류수를 사용하여 총 반응액을 50 ㎕로 맞춘 후 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로, 30번 반복해 수행하였다. 이 때 카파 (kappa) 경쇄 가변영역을 증폭하는데 사용한 프라이머는 표 1 및 서열번호 9번 내지 25번 서열, 람다 (lambda) 경쇄가변영역을 증폭하는데 사용한 프라이머는 26번 내지 43번 서열 및 중쇄 가변영역을 증폭하는데 사용한 프라이머들은 46번 내지 63번 서열이었다.
위의 중합효소연쇄반응 생산물을 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 을 이용하여 분리 정제한 후 각각의 유전자 양쪽 끝에 경쇄의 경우에는 BstXI (Roche, 스위스) 인식서열을, 중쇄의 경우에는 SfiI (Roche, 스위스) 인식서열을 달아 주기 위하여 연장 중합효소연쇄반응을 위에서와 동일한 조건으로 20번 반복하여 수행하였고 같은 방법으로 분리 정제하였다. 경쇄를 연장 증폭하는데 사용한 프라이머는 표 1 및 서열번호 44번과 45번 서열이었고, 중쇄를 연장 증폭하는데 사용한 프라이머는 64번과 65번 서열이었다.
상기에서 만들어진 염기단편을 경쇄의 경우에는 제한효소 BstXI (Roche, 스위스)으로, 중쇄의 경우에는 SfiI (Roche, 스위스)으로 절단하였고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex)을 이용하여 분리 정제하였다.
구분 프라이머 서열
9 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCRACATCCAGATGACCCAG-3’
10 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGMCATCCAGTTGACCCAG-3’
11 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGCCATCCRGATGACCCAG-3’
12 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGTCATCTGGATGACCCAG-3’
13 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGATATTGTGATGACCCAG-3’
14 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGATRTTGTGATGACTCAG-3’
15 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAAATTGTGTTGACRCAG-3’
16 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAAATAGTGATGACGCAG-3’
17 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAAATTGTAATGACACAG-3’
18 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGACATCGTGATGACCCAG-3’
19 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAAACGACACTCACGCAG-3’
20 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGAAATTGTGCTGACTCAG-3’
21 5’-GCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCCGATGTTGTGATGACACAG-3’
22 5’-TGGTGCAGCCACCGTACTGGCTTTGATCTCCACCTTGGTCCC-3’
23 5’-TGGTGCAGCCACCGTACTGGCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC-3’
24 5’-TGGTGCAGCCACCGTACTGGCTTTGATATCCACTTTGGTCCC-3’
25 5’-TGGTGCAGCCACCGTACTGGCTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC-3’
26 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGTCTGTGCTGACTCAG-3’
27 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGTCTGTGYTGACGCAG-3’
28 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGTCTGTCGTGACGCAG-3’
29 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGTCTGCCCTGACTCAG-3’
30 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCTCCTATGWGCTGACTCAG-3’
31 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCTCCTATGAGCTGACACAG-3’
32 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCTCTTCTGAGCTGACTCAG-3’
33 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCTCCTATGAGCTGATGCAG-3’
34 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGCYTGTGCTGACTCAA-3’
35 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGSCTGTGCTGACTCAG-3’
36 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCAATTTTATGCTGACTCAG-3’
37 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGRCTGTGGTGACTCAG-3’
38 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGACTGTGGTGACCCAG-3’
39 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCWGCCTGTGCTGACTCAG-3’
40 5’-GCTACCGTAGCACAGGCAGCCCAGGCAGGGCTGACTCAG-3’
41 5’-TGGTGCAGCCACCGTACTGGCTAGGACGGTGACCTTGGTCCC-3’
42 5’-TGGTGCAGCCACCGTACTGGCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCC-3’
43 5’-TGGTGCAGCCACCGTACTGGCGAGGGCGGTCAGCTGGGTGCC-3’
44 5’-GAGGAGGAGGAGGAGGAGGCTATCGCCATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCACAGGCAGCC-3’
45 5’-GACGACGACGACGACGACTGGTGCAGCCACCGTACTGGC-3'
46 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTKCAGCTGGTGCAG-3’
47 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTTGTGCAG-3’
48 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTCCAGCTGGTACAG-3’
49 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCARATGCAGCTGGTGCAG-3’
50 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGATCACCTTGAAGGAG-3’
51 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCACCTTGARGGAG-3’
52 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGCAGCTGGTGGAG-3’
53 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAG-3’
54 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG-3’
55 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTGCAGCTGCAGGAG-3’
56 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAG-3’
57 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGCAGCTGGTGCAG-3’
58 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAG-3’
59 5’-GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTSCAGCTGGTGCAA-3’
60 5’-GCCCTTGGCCGTGCTGGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC-3’
61 5’-GCCCTTGGCCGTGCTGGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC-3’
62 5’-GCCCTTGGCCGTGCTGGCCGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC-3’
63 5’-GCCCTTGGCCGTGCTGGCCGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC-3’
64 5’-GACGACGACGACGACGACCTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCC-3’
65 5’-GACGACGACGACGACGACGCCCTTGGCCGTGCTGGCCGA-3’
66 5’-GAGGAGGAATTCCGGCGCCGGGAAAGATGGTCGTGGCG-3'
67 5’-CTCTAGATGCATGTCACTCGAGGAGCCTCAC-3'
68 5’-CTTATCGAATTCCGGCGCCGGGAAAGATG-3'
69 5’-TCTAGACTCGAGAACTCGCACAGGGCC-3'
70 5’-CTACAGGTGTCCTCTCCGAGGTCCAGCTG-3'
71 5’-CCGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGG-3'
72 5’-TCTGGTGTTGAAGGAGACATCCAGTTG-3'
73 5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGATCTCCAGCTTGGT-3'
74 5’-GACGAATTCACTCTAACCATGGAA-3'
75 5’-GGAGTGGACACCTGTAG-3'
76 5’-TGCAAAGCTTCGGCACGAGCA-3'
77 5’-TCCTTCAACACCAGACAAC-3'
(실시예 1-2) 클로닝 및 대장균에 형질전환
인간 항체 라이브러리는 2단계 클로닝법에 의하여 만들어졌다. 첫 단계로는 pKRIBB-Fab 파지미드 벡터를 제한효소 BstXI (Roche, 스위스)으로 절단한 후 경쇄 유전자들을 그 자리에 클로닝하여 경쇄 라이브러리를 제조했다. 두 번째 단계로는 경쇄 라이브러리를 제한효소 SfiI (Roche, 스위스)으로 절단하여 그 자리에 중쇄 유전자들을 클로닝하였다.
첫 단계로 경쇄 라이브러리를 구축하기 위하여 pKRIBB-Fab 파지미드 벡터를 제한 효소 BstXI로 절단하고, 0.6% 아가로스 젤(Agarose gel (Cambrex))을 이용하여 분리 정제하였고, 자가-결합 (self-ligation) 시험을 하였다. 이때 1 x 105/1 ㎍ DNA 이하인 경우에만 벡터로 사용하였다.
정제된 벡터와 정제된 경쇄 유전자들을 몰/2몰 비율로 사용하여 20㎕의 10 x 리가아제 (ligase) 완충용액, 10 ㎕의 T4 DNA 리가아제 (ligase)와 살균 증류수를 넣어 200 ㎕가 되도록 한 후, 16℃에서 밤새 반응시켰다. 다음 날 라이게이션 (ligation) 산물을 글리코겐을 가하고 에탄올 침전법으로 농축한 후 대장균의 형질전환에 사용하였다.
대장균의 형질전환 (transformation)은 전기천공 (electoporation)을 이용하였다. 전기천공 수용성 대장균 (Electrocompetent E.coli) (TG1)에 상기에서 만들어진 라이게이션 산물을 2.5 kV, 200 Ω, 25 ㎌D 조건으로 엘렉트로포레이션 (BioRad Gene Pulser Xcell 이용) 하였다. 이렇게 형질전환된 대장균은 23.5 cm x 23.5 cm x 20.0 cm 의 암피실린 (ampicilin)과 글루코오스(glucose), 마그네슘 (magnesium)을 함유하고 있는 SOB 고형 배지 플레이트에 도말하여 밤새 37℃에서 키운 후 암피실린과 글루코즈, 마그네슘을 함유하고 있는 2YT 액체 배지를 이용하여 회수하였고 글리세롤을 최종 농도 20%로 가하여 -80℃에 보관하였다. 이 때 만들어진 라이브러리의 크기는 전기천공 후 얻어진 대장균을 다단계로 희석하여 암피실린을 함유한 2YT 플레이트에 도말한 다음 37℃에서 밤새 키운 후 얻어진 cfu (colony forming unit)의 개수를 측정함으로써 결정하였다. Vκ의 경우 2.3 x 108 cfu의 라이브러리가, Vλ 의 경우 2.8 x 108 cfu의 라이브러리를 얻을 수 있었다.
두번째 단계로 중쇄 라이브러리를 구축하기 위하여 경쇄 라이브러리를 제한 효소 BstXI 으로 절단하고, 0.6% Agarose gel 을 이용하여 분리 정제하였고, 자가-결합 시험을 하였다. 이때 1 x 105/1 ㎍ DNA 이하인 경우에만 벡터로 사용하였다.
라이게이션과 대장균의 형질전환은 경쇄 라이브러리 제조 방법과 동일하게 하였고 위와 같은 실험을 60회 이상 반복하여 5 x 1010 cfu의 서로 다른 항체가 존재하는 대형 인간 항체 라이브러리를 구축하였다.
실시예 2: 인간 Fab 항체 라이브러리를 제시 (display)하는 파지 라이브러리 (phage library) 제조
실시예 1의 인간 Fab 항체 라이브러리에서 경쇄부분의 카파 (kappa) 라이브러리와 람다 (lambda) 라이브러리를 6:4로 섞어 그 중 1.7 x 1011 클론을 암피실린 (ampicilline, 100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT 배지 (Bactotryptone 16 g, 효모 추출물 (Yeast extract) 10 g, NaCl 5 g in 1 liter H2O, pH 7.0) 2.1 리터에 넣고 37℃에서 OD 600 = 0.7-0.8 까지 (약 2 시간 정도) 흔들면서 키운 후 보조 파지 VCSM13을 20배 가하고 카나마이신(kanamycin) (70 ㎍/㎖) 을 첨가하여 30°C에서 밤새 키웠다. 다음날, 한일 supra22K 원심분리기 (No.11 rotor 이용)를 이용하여 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상등액을 취한 후 NaCl과 PEG8000을 각각 최종 농도 500 mM, 5 mM 되도록 가하여 얼음 속에 2 시간 동안 방치하였다. 다음, 10,000 rpm 에서 1 시간 동안 동일한 원심분리기(No.9 rotor 이용)를 이용하여 원심분리하여 파지를 침전시킨 후 5 ㎖ 의 PBS에 용해하였다. Legend Micro17 (Sorvall, 미국) 초원심분리기를 이용하여 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액만 취한 후 0.2 ㎛ 일회용 필터(Sartorius stedim biotech, 스위스) 로 여과하였다. 이 때 만들어진 항체를 디스플레이한 파지의 수는 7.2 x 1013이었다.
실시예 3: 인간 L1CAM 과 마우스 L1CAM 항원의 제조
(실시예 3-1) 인간 L1CAM 항원의 제조
인간 L1CAM의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 위치 1-1112)을 암호화하는 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 pJK-dhfr2-L1-monomer(대한민국 특허출원 제10-2006-0079969호)를 우태아혈청을 10% 함유하고 있는 DMEM (Hyclone, 미국) 배지에서 키운 HEK293T 세포에 리포펙타민 (lipofectamine) 2000 (Invitrogene, 미국) 을 이용하여 형질전환 (transfection)하고 37℃, 5% CO2 항온기에서 4-6 시간 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 CD293 (Gibco, 미국) 배지로 갈아주었다. 계속해서 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하면서 3일에 한번씩 새로운 배지로 갈아주고 3회 상층액을 모은 후 CNBr 세파로우즈 (Amersham Phamacia, 영국)에 A10-A3 항체를 결합시켜 만든 컬럼 (column)을 이용하여 친화성 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다(도 1a).
(실시예 3-2) 인간 L1CAM-Fc 항원의 제조
인간 L1CAM의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 위치 1-1112)의 서열을 포함하고 있는 pJK-dhfr2-L1-monomer (대한민국 특허출원 제10-2006-0079969호)로부터 인간 L1CAM의 아미노 말단 프라이머인 표 1 및 서열번호 66번 서열과 카복시 말단 프라이머 67번 서열을 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. PCR은 먼저 50 ng의 DNA 주형, 12.5 pmol 씩의 센스 프라이머와 안티센스 프라이머, 10 mM dNTP와 DNA 중합효소 pfu (Solgent, 한국)를 DNA 중합효소 완충용액 (Solgent, 한국)에 섞어 95℃에서 5분간 전처리 반응을 시켰다. 다음, 95℃에서 45초간 DNA를 변성시키고, 58℃에서 45초간 프라이머를 결합시킨다. 72℃에서 2분간 DNA를 합성시키는 과정을 30회 반복하였고, 마지막 단계에서는 72℃에서 10분간 반응시켜 효소가 충분히 활성을 발휘하도록 하였다. 여기에서 얻어진 DNA 단편을 실시예 3-2에서와 같이 EcoRI과 XhoI 으로 처리한 후 pJK-dhfr2-Fc의 EcoRI과 XhoI 위치 사이에 클로닝하였으며, 제조된 플라스미드를 pJK-dhfr2-hL1Fc라 명명하였다.
인간 L1CAM-Fc를 발현시키기 위하여 pJK-dhfr2-hL1Fc를 실시예 2-1과 같은 방법으로 HEK293T 세포에 트랜스팩션시킨 후, 무혈청배지에서 배양하였다. 배양 상청액을 Protein G column (Upstate 사, 미국)을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하여 단백질을 정제하였다 (도 1b).
(실시예 3-3) 마우스 L1CAM 항원의 제조
마우스 L1CAM 항원은 마우스 L1CAM의 세포외 도메인과 인간 IgG1의 Fc 영역과의 융합단백질 (L1CAM-Fc) 형태로 제조하였다. 먼저 마우스 줄기세포주 SH-J1로부터 RT-PCR 과정을 통하여 증폭하고 클로닝하여 염기서열을 분석한 줄기세포 타입 (암타입과 동일) 의 L1CAM cDNA를 얻었다. 마우스 L1CAM의 세포외 부분만을 발현하는 벡터를 만들기 위하여 마우스 L1CAM의 아미노산 잔기 위치 1-1113에 해당하는 DNA 단편을 아미노 말단 프라이머인 표 1 및 서열번호 68번과 카복시 말단 프라이머 69번을 사용하여 중합효소연쇄반응으로 증폭하였고, 여기에서 얻어진 DNA 단편을 아가로즈 겔 정제 키트 (iNtRON, 대한민국)을 이용하여 분리 정제하였으며 인간 항체 IgG1 의 Fc를 가지고 있는 벡터인 pJK-dhfr2-Fc 의 EcoRI과 XhoI 사이에 클로닝하였다. 상기에서 얻어진 발현 벡터 DNA를 pJK-dhfr-mL1-Fc라 명명하였다. 이 플라스미드를 상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 HEK293T 세포에 트랜스팩션시키고 무혈청배지에서 배양한 후 상층액을 Protein G column (Upstate, 미국)을 사용하여 친화성 크로마토그래피를 수행하여, 마우스 L1CAM-Fc를 정제하였다 (도 1c).
실시예 4. 인간 L1CAM 과 마우스 L1CAM에 동시에 결합하는 인간항체의 선별
인간 L1CAM과 마우스 L1CAM을 동시에 인식하는 항체를 발굴하기 위하여 1차와 2차 패닝(panning)은 인간 L1CAM을 항원으로, 3차 패닝은 마우스 L1CAM을 사용하였다. 그 결과, 인간 L1CAM에 대하여는 2차 패닝 결과 양성 클론이 축적되기 시작하였으며 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 동시에 결합하는 클론은 3차 패닝 결과 얻을 수 있었다.
(실시예 4-1) 패닝
인간 L1CAM (monomer) 또는 마우스 L1CAM-Fc 100 ㎍을 코팅 완충용액 (15 mM Na2CO3, 34.84 mM NaHCO3, pH 9.6) 1 ㎖에 섞어 면역튜브 (Maxisorp Immunotube, Nunc 사) 에 넣고 4℃에서 밤새 코팅한 다음 0.05% Tween 20이 첨가된 PBS 용액(PBST)으로 2번 세척하고 4% 탈지분유로 1시간 동안 실온에서 블로킹 하였다. 다시 2번 세척한 후, 실시예 1의 인간 항체 라이브러리를 디스플레이하고 있는 파지 (1.6 x 1013)를 최종 농도 2% 탈지분유에 섞어 1 ㎖ 면역튜브에 넣고 37℃ 에서 1시간 동안 항원과 반응시켰다. 다음 0.5% Tween20이 첨가된 PBS로 1차 패닝의 경우 10회, 2차 패닝의 경우 20회, 3차 패닝의 경우 30회 세척하였다, 1회 세척은 1 ㎖ 의 세척용액을 넣은 후 1 ㎖용 피펫만 (pipetman) 을 사용하여 용액을 파이펫팅 (up and down) 10번 한 후 4 ㎖의 세척 용액을 더 넣고 5분간 정치하여 두는 것을 의미한다.
세척 후 항원에 결합하고 있던 파지-항체들을 0.1 M 글라이신 (pH 2.5) 1 ㎖을 사용하여 분리시킨 다음 60 ㎕의 2 M Tris HCl pH 9.0를 가하여 중화한 후 즉시 OD 600>0.8로 키운 TG1 대장균에 감염시키고 암피실린 (100 ㎍/㎖)을 함유하고 있는 2YT(2YTA) 고체배지에 도말한 후 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 이 때 각 패닝 초기에 사용한 파지의 수를 인풋 (input)으로, 세척과정을 마친 이후 글라이신 용액에 의하여 분리된 후 TG1 대장균을 통하여 만들어진 콜로니의 수를 아웃풋 (output) 파지의 수로 계산하여, 항원결합능이 있는 항체의 증폭 정도의 지표로 삼았다. 1차 패닝 결과 얻어진 콜로니들을 모아 배양한 후 실시예 1에서와 같은 방법으로 보조 파지를 넣고 배양하여 항체가 디스플레이드된 파지를 만들었고, 동일한 양의 항원에 대하여 2차, 3차 패닝을 진행하였다.
패닝 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차 패닝 후에 선택된 콜로니들을 모아 OD 600>0.8 로 37℃에서 키운 후 IPTG 를 최종농도 1 mM 로 가하여 30℃에서 밤새 발현시킨 다음 상층액에 존재하는 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였다.
간접 ELISA는, 실시예 2에서 제조한 인간 L1CAM 또는 마우스 L1CAM (100 ng/well) 을 96 웰 플레이트 (MaxiSorp, Nunc)에 코팅한 후 상기 배양 상층액 100 ㎕를 각 웰에 넣고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이어서 PBST로 3번 세척한 다음, 경쇄에 연결된 preS1 tag에 특이적으로 결합하는 마우스 항체인 AP2 (1/2000) 100 ㎕를 가한 후 PBST로 4 번 세척하였고, 항-mouse IgG(Fc-specific)-HRP 결합체(Pierce, 1/2000) 100 ㎕를 가하여 실온에서 1 시간 동안 반응 시켰다. 다시 PBST로 5 번 세척한 후, TMB (BD) 와 과산화수소수를 1:1의 비율로 섞어 100 ㎕ 씩 웰에 넣고 5 분간 반응시킨 다음 2M H2SO4를 50 ㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. 흡광 분석기 (VERSA max 사의 microplate reader)를 이용하여 450 nm 파장에서의 흡광도를 읽어 항체의 발현을 측정하였다.
그 결과, 2차 패닝 후 인간 L1CAM에 대한 결합능이 있는 클론들이 증폭되었고, 3차 패닝 후 마우스 L1CAM에 대한 결합능이 있는 클론들이 증폭되었다 (도 2).
(실시예 4-2) 인간 L1CAM 과 마우스 L1CAM에 동시에 결합하는 인간항체의 선발
3차 패닝 후 용출된 파지들을 104, 105, 106배로 희석하여 실시예 3-1에서와 같이 TG1 대장균에 감염시킨 후 2YTA 고체배지에 도말하여 37℃ 항온기에 넣고 밤새 키웠다. 125개의 콜로니를 무작위로 선택하여 각각 2YTA 액체 배지 5 ㎖에 접종하고 37℃ 항온기에서 흔들면서 각 클론의 흡광도가 600 nm에서 0.7 과 0.8 사이가 될 때 까지 키웠다. 다음, IPTG를 최종 농도 1 mM로 가하고 30℃ 항온기에서 밤새 흔들면서 키운 후, 배양 상층액을 회수하여 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM을 동시에 인식하는 항체를 검출하기 위한 간접 ELISA를 수행하였다.
인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 결합하는 21 개의 클론들을 선택하여 플라스미드 DNA를 분리한 후 제한효소 BstNI (Roche, 스위스)로 잘라 절단 단편의 길이가 다른 클론들을 그룹화 한 후 서로 다른 단편 길이를 가진 클론들 6개(Ab4, Ab6, Ab8, Ab10, Ab12, Ab13)를 골라 염기서열을 분석한 결과, 이들이 서로 다른 클론임을 확인하였다.
실시예 5. 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 동시에 결합하는 인간항체 클론들의 항원결합능 비교
상기 6개 다른 클론들의 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 대한 항원결합능을 비교 분석하기 위하여 실시예 3의 인간 L1CAM-Fc와 마우스 L1CAM-Fc를 사용한 간접 ELISA를 수행하였다. 그 결과 Ab4의 항원결합능이 가장 높음을 확인하였다 (도 3).
실시예 6. Ab4 항체의 염기서열 및 아미노산 서열 분석
Ab4 항체의 염기서열이 도4에 나타나 있다. 이 염기서열을 IMGT 소프트웨어 (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)를 이용하여 인간 점라인 (germline) 염기서열과 비교 분석한 결과, 경쇄 가변영역은 인간 항체 점라인 카파 (Kappa) 그룹의 IGKV1-39*01 (90.68% 동일) 와, 두번째 카파 J단편 (94.87% 동일)으로부터 유래된 것임을 알 수 있었고, 점라인 카파 그룹의 IGKV1-39*01의 아미노산 서열과 비교하였을 때, 11개의 아미노산 잔기들이 치환된 것으로 분석되었다 (도 4a).
Ab4 항체의 중쇄 가변영역은 인간 항체 점라인 (germline)의 중쇄그룹 IGHV3-30*19 (97.57% 동일), 다섯번째 중쇄 J 단편 (82.35% 동일), 중쇄 HD3-10*01 의 두번째 해독틀 (Open Reading Frame)에 의하여 재조합된 항체임을 알 수 있었고, 인간 점라인 IGHV3-30*19 아미노산 서열과 비교한 결과 6개의 아미노산 잔기들이 치환된 것으로 분석되었다 (도 4b).
Ab4의 중쇄 및 경쇄 가변영역 서열은 IMGT 데이터 베이스 (IMGT data base)에 있는 어느 중쇄 및 경쇄 서열과 100% 동일하지는 않았다. 이는 Ab4가 점라인 항체가 아니고 인체 내에서 성숙과정을 거친 새로운 항체임을 증명하는 것이다.
실시예 7. Ab4의 whole IgG로 전환 및 생산
(실시예 7-1) Fab 형태의 Ab4를 whole Ig 형태로 전환
Fab 형태의 Ab4를 whole Ig 형태로 전환하기 위하여 Ab4 로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 중합효소연쇄 반응에 의하여 증폭시켰고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 을 통하여 분리한 다음 Zymo 겔 추출 키트 (Zymoresearch, 미국)을 이용하여 정제하였다. 이 때 사용한 프라이머는 중쇄 가변영역의 경우 표 1 및 서열번호 70번과 71번 서열이었고, 경쇄 가변영역의 경우 서열번호 72번과 73번 서열이었다.
다음 항체를 동물세포에서 발현 생산할 수 있도록 pdCMV-dhfrC (대한민국 특허 등록번호 제10-0476363호)로부터 중쇄와 경쇄의 리더 시퀀스를 PCR에 의하여 합성하고 분리하고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트 (Zymoresearch)을 통하여 분리 정제하였다. 이 때 사용한 프라이머는 중쇄 리더 시퀀스의 경우 표 1 및 서열번호 74번과 75번 서열이었고, 경쇄 리더 시퀀스의 경우 76번과 77번 서열이었다.
다음 중쇄 리더 시퀀스와 중쇄 가변영역을, 경쇄 리더 시퀀스와 경쇄 가변영역을 각각 재조합 (recombination) PCR을 이용하여 연결시켰고, 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 과 Zymo 겔 추출 키트를 통하여 분리 정제하였다. 중쇄 가변영역과 중쇄의 리더 펩타이드를 연결시키는데 사용한 프라이머는 표 1 및 서열번호 74번과 75번 서열이었고, 경쇄 가변영역과 경쇄의 리더 시퀀스를 연결시키는데 사용한 프라이머는 표 1 및 서열번호 76번과 73번이었다. 이것을 중쇄는 제한효소 EcoRI (Roche, 스위스)과 ApaI (Roche, 스위스)으로, 경쇄는 HimdⅢ (Roche, 스위스)와 BsiWI (Roche, 스위스)로 잘라 동일한 제한효소로 절단하고 정제한 pdCMV-dhfrC 벡터의 중쇄와 경쇄 불변영역 위쪽에 각각 클로닝하고 pdCMV-dhfrC-Ab4라 명명하였다. 본 발명자들은 상기의 pdCMV-dhfrC-Ab4 발현벡터를 2008년 11월 21일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호; KCTC11431BP).
(실시예 7-2) Ab4 항체의 발현 및 정제
상기 pdCMV-dhfrC-Ab4 DNA를 HEK293T 세포에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 미국)을 사용하여 형질전환하였다. 4-6시간 동안 37℃ 5% CO2 항온 배양기에서 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 배지 CD293 (Gibco, 미국)로 바꾸어 3일간 동일한 항온 배양기에서 배양하여 Ab4를 생산하는 상청액을 모으기 시작했다. 상기에서 얻어진 상청액 으로부터 protein G 아가로즈 컬럼(Upstate, 미국)을 통하여 Ab4 항체를 정제하였다.
그 결과, 이 항체를 환원시켰을 때에 항체의 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 55 KDa, 25 KDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드를 관찰하였다 (도 5).
실시예 8. Ab4 항체의 에피토프 분석
(실시예 8-1) L1CAM 결손 변이체들의 발현
Ab4가 결합하는 도메인을 확인하기 위하여, 실시예 5-1의 인간 L1CAM-Fc (이하 L1Fc라 한다)과 대한민국 특허출원 제10-2006-0107428호에 기재된 L1CAM 결손 변이체들을 각각 발현하는 플라스미드들, 즉, L1Ig(1-6)Fc, L1Ig(1-5)Fc, L1Ig(1-4)Fc, L1Ig(1-3)Fc, L1FnFc를 HEK293T 세포에 트랜스팩션시키고 실시예 3-1에서와 같이 상기 L1CAM 단백질들을 발현하였다.
(실시예 8-2) 웨스턴 블럿 분석
상기의 발현된 L1CAM 및 L1CAM 결손 변이체 단백질들을 8% SDS-PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)시킨 후, PVDF 막 (Millipore, 한국) 으로 옮겨 웨스턴 블럿을 하였다. 이 때 Ab4 항체를 1차 항체로, anti-hIgG(Fc)-HRP (Pierce, 1/5000)를 2차 항체로 사용하였으며 ECL 시약 (Amersham Biosciences) 으로 검출시켰다. 그 결과 Ab4항체는 L1Fc, L1Ig(1-6)Fc, L1Ig(1-5)Fc에는 결합하지만, L1Ig(1-4)Fc, L1Ig(1-3)Fc, L1FnFc에는 결합하지 않았다(도 6). 이 결과는 Ab4가 L1CAM의 다섯번째 면역글로불린 도메인인 Ig5에 결합함을 의미한다.
실시예 9. Ab4 항체의 암세포 표면에 발현하는 L1CAM에 대한 결합능 분석
Ab4 항체가 인간과 마우스의 L1CAM을 발현하는 세포 표면에 존재하는 L1CAM을 인식할 수 있는지 시험하기 위하여, 유세포 분석기 (FACS caliber)를 사용하여 인간 담도암 세포주 SCK, 인간흑색종 세포주 A375, 인간 유방암 세포주 MCF7, 마우스 흑색종 세포주 B16F10, 인간 신장암세포주 ACHN, 인간태아신장 세포주 HEK293T에 대한 결합능을 분석하였다. 구체적으로 세포를 세포 분리 완충용액 (Gibco) 4 ㎖을 가하고 37℃, 5 분간 처리한 후, 원심분리기를 이용하여 분리 완충용액을 제거하고 BSA를 1% 함유하고 있는 PBS (1% BSA-PBS) 1 ㎖에 세포를 부유시켰다. 그 중 100 ㎕ 를 96 웰 플레이트에 넣고 분리 정제한 Ab4 또는 A10-A3를 2 ㎍/웰 씩 넣고 4℃에서 1시간 동안 반응 시킨다. 1000 rpm 에서 3 분간 원심분리하여 반응액을 제거하고 1% BSA-PBS로 3번 세척한다. 1% BSA-PBS 100 ㎕를 가하여 세포를 부유시킨 다음, 검출 항체인 항 인간 Fc-FITC (Sigma, Ab4를 1차 항체로 쓴 경우) 또는 마우스 Fc-FITC (Sigma, A10-A3 를 1차 항체로 사용한 경우) 0.5 ㎍/웰 되도록 1% BSA-PBS에 용해하여 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 1시간 반응시켰다. 1% BSA-PBS 로 3번 세척한 후 세포를 500 ㎕ 1% BSA-PBS에 부유하여 FACS용 튜브로 옮겼다. PI (propidium iodide, Sigma, 미국)를 1/10000 으로 희석하여 넣고 5분 동안 실온에서 반응 시킨 후 FACS를 수행하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, Ab4는 L1CAM을 발현하는 인간 암세포주(A375, SCK, MCF-7)와 마우스 암세포주 (B16F10)에는 결합하였고, L1CAM을 거의 발현하지 않은 ACHN 세포에는 거의 결합하지 않았으며, L1CAM을 발현하지 않는 HEK293T세포에는 결합하지 않았다. 반면 인간 L1CAM에는 결합하지만 마우스 L1CAM에는 결합하지 않는 A10-A3는 A375, MCF-7에 결합하지만 B16F10에는 결합하지 않았다. 이 결과는 본 발명의 Ab4가 인간 및 마우스 L1CAM에 특이하게 결합함을 증명하는 것이다.
실시예 10. Ab4 항체에 의한 암세포 증식 억제
Ab4 항체가 암세포의 성장에 영향을 미치는지 시험하기 위하여 L1CAM을 세포표면에 발현하고 있는 인간 담도암 세포주 Choi-CK를 6 웰 플레이트에 2 x 105 cells/웰 농도로 우태아혈청을 10% 함유하고 있는 DMEM 배지 3 ㎖에 가하고 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양하였다. 12 시간 후 분리 정제한 Ab4 항체를 10 ㎍/㎖ 농도로 첨가하고 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 72 시간 동안 배양하였다. 다음, 세포를 회수하여 0.2% 트리판 불루 (Tryphan Blue) 용액을 이용하여 살아 있는 세포의 수와 죽은 세포의 수를 CedexHiRes 세포계수기를 이용하여 측정한 후 전체 세포 중 살아 있는 세포의 수를 %로 환산하였다. 그 결과 PBS 를 가한 시료와 항체를 불활성화 하여 첨가한 시료에서는 아무런 영향이 없었고, Ab4 항체에 의하여 암세포의 증식이 억제됨을 확인하였다 (도 8).
실시예 11. Ab4 항체가 암세포의 이동을 억제
Ab4 항체가 L1CAM을 발현하고 있는 세포들의 이동에 영향을 미치는지 실험하기 위하여 QCM 24-웰 세포침투시험 키트(Chemicon, Temecula 사, 미국)를 이용하여 제작사의 지시에 따라 실험을 진행하였다. 인간 담도암 세포주 SCK에 Ab4 항체를 10 ㎍/㎖ 가하고 24 시간 동안 37℃, 5% CO2 항온 배양기에서 배양한 다음 여과지벽을 이동한 세포의 수를 형광염료를 함유하고 세포용해용액에 녹여 흡광 분석기 (VERSA max 사의 microplate reader) 를 이용하여 550 nm 파장에서의 흡광도를 읽어 이동한 세포의 양을 측정하였다.
도 9에서 보는 바와 같이 Ab4 항체에 의하여 암세포의 이동이 저해됨을 확인할 수 있었다.
실시예 12. Ab4 항체의 결합특이성 확인
Ab4 항체의 항암 효능을 사람 암세포를 이식한 마우스 모델에서 측정할 경우, Ab4는 인간 L1CAM을 발현하는 암세포에도 결합하지만 마우스 L1CAM에도 결합하기 때문에 L1CAM을 발현하는 마우스의 정상조직 (뇌, 몇몇 조혈세포, 일부 신장세포, peripheral nerves)에 결합할 수 있다. Ab4 항체의 마우스 조직에 대한 결합특이성을 확인하기 위하여, 8주된 정상적인 ICE 마우스 3마리의 수컷과 3마리의 암컷으로부터 뇌, 대장, 심장, 소장, 신장, 간, 폐, 근육, 췌장, 전립선, 위, 이자, 고환, 흉선, 난소 와 자궁을 (이 때 전립선과 고환은 수컷으로 부터, 난소와 자궁은 암컷으로부터 얻었다) 적출한 다음 세포용해 완충용액 (100 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaCl, 50 mM β-glycerophosphatate, 50 mM NaF, 100 mM Na3VO4, 0.5% NP40, 1% TritonX-100과 1개의 단백질 분해효소저해 타블렛 (Roche, 스위스)을 넣고 조직을 분쇄했다. 다음, 4℃, 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상층액 만을 취하였다. BCA (bicinchoninic acid) 단백질 정량 킷 (Pierce)를 사용하여 단백질의 농도를 결정한 후 80 ㎍ 식의 단백질을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하고 Ab4 항체와 항-인간 IgG (H+L)-HRP를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 이때 마우스 L1CAM-Fc를 발현하는 HEK293T 세포의 배양 상층액을 정량하여 양성 대조군으로 사용하였다.
그 결과, Ab4가 L1CAM을 높게 발현하는 조직인 뇌 (lane 1)과 낮게 발현하는 조직인 신장(lane 5)의 L1CAM에만 결합하고 그 외의 다른 조직들의 단백질에는 전혀 결합하지 않은 것으로 나타났다(도 10). 이 결과는 Ab4의 L1CAM에 대한 특이성을 증명하는 것이다.
본 발명에 따른 단일클론항체는 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM을 동시에 특이적으로 인식하는 항체로, 인간 암 세포의 증식과 이동을 저해하는 특성이 있는 항체를 제공함으로서, 임상적으로 유용한 L1CAM 특이 항체치료제를 조속히 개발할 수 있다.
도 1은 패닝에 사용한 인간 및 마우스 L1CAM 항원를 제조한 후 그 순수도를 8% SDS-폴리아크릴아미이드 겔을 이용하여 전기영동한 다음 쿠마씨 염색법을 이용하여 검색했다.
도 1a는 인간 L1CAM 세포외 부분 항원의 순수도; 도1b는 인간 L1CAM 세포외 부분과 Fc 융합단백질 항원의 순수도; 도1c는 마우스 L1CAM 세포외 부분과 Fc 융합단백질 항원의 순수도를 표시한다. NR은 환원시키지 않은 조건에서의 항원이고 R은 환원시킨 조건에서의 항원을 나타낸다.
도 2는 패닝 후 선택된 항체 클론 pool의 인간 L1CAM과 마우스 L1CAM에 대한 항원결합능 분석한 결과이다. 패닝 하지 않은 라이브러리와 1차, 2차, 3차 패닝 총생산물의 인간 L1cam (1-4) 과 마우스 L1cam (5-8) 에 대한 결합력을 ELISA로 측정. 1과 5: 패닝 하지 않은 라이브러리; 2와 6: 1차 패닝 총생산물; 3과 7: 2차 패닝 총생산물; 4와 8: 3차 패닝 총생산물. 각각의 패닝 결과 얻어진 총생산물을 OD600 > 0.8 로 37°C 에서 키운 후 IPTG 를 최종농도 1mM 로 가하여 30°C 에서 밤새 발현시킨 다음 상청액에 존재하는 항 L1CAM 항체를 <실시예4-1> 에 기술한 것과 같이 간접 ELISA를 통하여 검출함.
도 3은 분리한 Fab 항체 클론들의 인간 L1CAM 및 마우스 L1CAM에 대한 결합 능을 분석한 결과이다. 왼쪽 그림은 Ab4, Ab8, Ab10, Ab12 와 Ab13 항체들의 인간 L1CAM에 대한 결합능을 시험한 결과이고, 왼쪽 그림은 Ab4, Ab8, Ab10, Ab12 와 Ab13 항체들의 마우스 L1CAM에 대한 결합능을 시험한 결과이다. X 축은 Fab 항체들의 농도를 표시하고, Y축은 450 nm에서의 흡광도를 표시한다.
도 4는 Ab4 항체의 경쇄 (a)와 중쇄 (b)의 염기서열 및 아미노산 서열을 나타낸다. 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3는 LCDR1, LCDR2와 LCDR3로, 중쇄의 CDR1, CDR2, CDR3는 HCDR1, HCDR2와 HCDR3로 DNA 염기서열 위에 표시하였고 밑줄을 그어 표시하였다. 아미노산 서열은 한글자 표기 방법을 표시하였다 (A: 알라닌; C: 시스테인; D: 아스파틱 엑시드; E: 글루타믹 엑시드; F: 훼닐알라닌; G: 글라이신; H: 히스티딘; I: 아이소루신; K: 라이신; L: 루신; M: 메치오닌; N: 아스파라진; P: 프롤린; Q: 글루타민; R: 알지닌; S: 세린; T: 트레오닌; V: 발린; W: 트립토판; Y: 타이로신) IMGT software (http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/)를 이용하여 인간 germline 염기서열과 비교했을 때 다른 부분들은 별표로 아미노산 서열 위쪽에 표시하였다.
도 5는 Fab형태의 Ab4를 whole Ig 형태로 전환한 후 HEK293T 세포에서 발현시키고, protein G 아가로즈 컬럼을 통하여 정제한 Ab4의 순수도를 10% SDS-포리아크릴아마이드겔과 웨스턴 블럿 또는 쿠마씨염색법을 이용하여 측정한 결과이다.
도 6은 Ab4 항체의 에피토프을 분석하기 위하여 (A) L1Fc; (B) L1IgFc; (C) L1FnFc; (D) L1Ig(1-5)Fc; l(E) L1Ig(1-4)Fc; (F) L1Ig(1-3)Fc 등의 항원을 SDS-폴리아크릴아마이드겔을 이용하여 전기영동하고 PVDF 막에 고정한 다음 Ab4 항체와 HRP와 결합하고 있는 인간 IgGF(ab)2 를 이용하여 실험한 결과이다.
도 7은 인간 단일클론 항체 Ab4가 L1CAM을 발현하는 다양한 세포에 특이적으로 결합하는 지를 알기 위하여 L1CAM을 발현하는 인간 흑색종 세포 A375, 인간유방암세포 MCF-7, 인간 담도암세포 SCK, 마우스 흑색종세포 B16F10등과 L1CAM을 발현하지 않는 세포들인 ACHN (인간 신장암세포), 293T, 혈액중의 PBL 등을 FACS 로 분석한 결과이다 왼쪽은 Ab4 항체로 분석한 결과이고 오른쪽은 A10A3 항체로 한 결과이다.
도 8은 Ab4 항체가 L1CAM을 발현하는 세포의 증식에 미치는 효과를 시험하기 위하여 세포 배양 중 인간 항체 Ig 를 넣은 것 (왼쪽), Ab4를 불화성화하여 넣은 것 (중간), Ab4를 넣은 것 (오른쪽) 을 비교한 결과이다. ACHN은 인간 신장암세포로 L1CAM을 발현하지 않는 세포이고 SCK는 인간 담도암 세포로 L1CAM을 발현하는 세포이다.
도 9는 Ab4 항체가 L1CAM을 발현하는 인간 담도암세포 SCK의 이동에 미치는 효과를 시험하기 위하여 세포 배양 중 PBS 를 넣은 것 (lane 1), Ab4를 넣은 것 (lane 2), 인간 항체 Ig를 넣은 것 (lane 3) 와 L1CAM에 결합하는 마우스항체 A10A3 (lane 40)를 넣은 것을 비교한 결과이다.
도 10은 Ab4 항체가 L1CAM 이외의 다른 단백질에도 결합하는지를 시험하기 위하여 마우스 정상조직들로 부터 단백질들을 분리하여 SDS-폴리아크릴아미이드 겔로 전기영동하고 Ab4 항체를 이용하여 웨스턴 블럿한 결과이다.
1: 뇌; 2: 대장; 3: 심장; 4: 소장; 5: 신장; 6: 간; 7: 폐; 8: 근육; 9: 췌장; 10: 전립선; 11: 위; 12: 이자; 13: 고환; 14: 흉선; 15: 난소; 16: 자궁; Con: control
<110> Korea Research Istitute of Bioscience and Biotechnology <120> a Recombinant Monoclonal Antibody Specifically Binding to L1CAM Expressed in Human and Mice and the use thereof <130> PA080596/KR <160> 77 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a light chain region for Ab4 <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Thr Ile Ser Ile Tyr 20 25 30 Val Asn Trp Tyr Arg Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Glu Ser Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Val Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr His Asp Thr Arg Gln 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a heavy chain region for Ab4 <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 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tgacgcag 48 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for kappa light chain variable region <400> 18 gctggtttcg ctaccgtagc acaggcagcc gaaattgtaa tgacacag 48 <210> 19 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for kappa light chain variable region <400> 19 gctggtttcg ctaccgtagc acaggcagcc gaaacgacac tcacgcag 48 <210> 20 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for kappa light chain variable region <400> 20 gctggtttcg ctaccgtagc acaggcagcc gaaattgtgc tgactcag 48 <210> 21 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for kappa light chain variable region <400> 21 gctggtttcg ctaccgtagc acaggcagcc gatgttgtga tgacacag 48 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for kappa light chain variable region <400> 22 tggtgcagcc accgtactgg ctttgatctc caccttggtc cc 42 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for kappa light chain variable region 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variable region <400> 29 gctaccgtag cacaggcagc ccagtctgcc ctgactcag 39 <210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 30 gctaccgtag cacaggcagc ctcctatgwg ctgactcag 39 <210> 31 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 31 gctaccgtag cacaggcagc ctcctatgag ctgacacag 39 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 32 gctaccgtag cacaggcagc ctcttctgag ctgactcag 39 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 33 gctaccgtag cacaggcagc ctcctatgag ctgatgcag 39 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 34 gctaccgtag cacaggcagc ccagcytgtg ctgactcaa 39 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 35 gctaccgtag cacaggcagc ccagsctgtg ctgactcag 39 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 36 gctaccgtag cacaggcagc caattttatg ctgactcag 39 <210> 37 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 37 gctaccgtag cacaggcagc ccagrctgtg gtgactcag 39 <210> 38 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 38 gctaccgtag cacaggcagc ccagactgtg gtgacccag 39 <210> 39 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 39 gctaccgtag cacaggcagc ccwgcctgtg ctgactcag 39 <210> 40 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda light chain variable region <400> 40 gctaccgtag cacaggcagc ccaggcaggg ctgactcag 39 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for lambda 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chain variable region <400> 47 gcggcccagc cggccatggc ccaggtccag cttgtgcag 39 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 48 gcggcccagc cggccatggc csaggtccag ctggtacag 39 <210> 49 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 49 gcggcccagc cggccatggc ccaratgcag ctggtgcag 39 <210> 50 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 50 gcggcccagc cggccatggc ccagatcacc ttgaaggag 39 <210> 51 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 51 gcggcccagc cggccatggc ccaggtcacc ttgarggag 39 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 52 gcggcccagc cggccatggc cgargtgcag ctggtggag 39 <210> 53 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 53 gcggcccagc cggccatggc ccaggtgcag ctggtggag 39 <210> 54 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 54 gcggcccagc cggccatggc cgaggtgcag ctgttggag 39 <210> 55 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 55 gcggcccagc cggccatggc ccagstgcag ctgcaggag 39 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 56 gcggcccagc cggccatggc ccaggtgcag ctacagcag 39 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 57 gcggcccagc cggccatggc cgargtgcag ctggtgcag 39 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 58 gcggcccagc cggccatggc ccaggtacag ctgcagcag 39 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 59 gcggcccagc cggccatggc ccaggtscag ctggtgcaa 39 <210> 60 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 60 gcccttggcc gtgctggccg aggagacggt gaccagggtg cc 42 <210> 61 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 61 gcccttggcc gtgctggccg aggagacggt gaccagggtt cc 42 <210> 62 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 62 gcccttggcc gtgctggccg aagagacggt gaccattgtc cc 42 <210> 63 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region <400> 63 gcccttggcc gtgctggccg aggagacggt gaccgtggtc cc 42 <210> 64 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain <400> 64 gacgacgacg acgacgacct cgcggcccag ccggccatgg cc 42 <210> 65 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain <400> 65 gacgacgacg acgacgacgc ccttggccgt gctggccga 39 <210> 66 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for N-terminus of human L1CAM <400> 66 gaggaggaat tccggcgccg ggaaagatgg tcgtggc 37 <210> 67 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for C-terminus of human L1CAM <400> 67 ctctagatgc atgtcactcg aggagcctca c 31 <210> 68 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for N-terminus of mouse L1CAM <400> 68 cttatcgaat tccggcgccg ggaaagatg 29 <210> 69 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for C-terminus of mouse L1CAM <400> 69 tctagactcg agaactcgca cagggcc 27 <210> 70 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region of whole Ig <400> 70 ctacaggtgt cctctccgag gtccagctg 29 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for heavy chain variable region of whole Ig <400> 71 ccgatgggcc cttggtggag gctgaggaga cgg 33 <210> 72 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for light chain variable region of whole Ig <400> 72 tctggtgttg aaggagacat ccagttg 27 <210> 73 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for light chain variable region of whole Ig <400> 73 tgcagccacc gtacgtttga tctccagctt ggt 33 <210> 74 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for leader of heavy chain <400> 74 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 75 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for leader of heavy chain <400> 75 ggagtggaca cctgtag 17 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for leader of light chain <400> 76 tgcaaagctt cggcacgagc a 21 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for leader of light chain <400> 77 tccttcaaca ccagacaac 19

Claims (23)

  1. 인간에서 발현되는 L1CAM (L1 cell adhesion molecule) 단백질 및 마우스에서 발현되는 L1CAM 단백질에 모두 특이적으로 결합하는 단일클론항체 또는 이의 항원결합부위를 포함하는 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 L1CAM은 세포막 결합 형태 또는 세포막의 유리된 형태인 단일클론항체 또는 이의 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 3으로 정의되는 경쇄 CDR1, 서열번호 4로 정의되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 5로 정의되는 경쇄 CDR3으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 CDR을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 1로 정의되는 경쇄 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 6로 정의되는 중쇄 CDR1, 서열번호 7로 정의되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 8로 정의되는 중쇄 CDR3으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 CDR을 포함하는 중쇄 가변부위를 포함하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 서열번호 2로 정의되는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체의 단편은 Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 파지디스플레이 (phage display)로부터 생산된 것인 단일클론항체 또는 이의 단편.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단일클론항체는 재조합 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 재조합 단일클론항체는 인간 단일클론항체 (human monoclonal antibody)인 단일클론항체 또는 이의 단편.
  11. 제10항에 있어서, 상기 인간화 항체는 수탁번호 KCTC11431BP인 벡터에 의해 생산되는 것인 단일클론항체 또는 이의 단편.
  12. 제1항에 있어서, 상기 L1CAM은 암 세포 또는 암 조직에서 발현하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 단일클론항체는 L1CAM의 다섯 번째 면역글로불린-유사 도메인 (Ig5)에 선택적으로 결합하고 암세포의 증식, 이동 또는 침윤을 억제 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  14. 제12항에 있어서, 상기 암은 담도암, 폐암, 난소암, 피부암, 대장암 또는 췌장암인 것을 특징으로 하는 단일클론항체 또는 이의 단편.
  15. 기탁번호 KCTC11431BP인 제9항의 재조합 단일클론항체를 코딩하는 벡터.
  16. 제1항의 단일클론항체를 포함하는 항암용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 암은 담도암, 폐암, 유방암, 난소암, 피부암, 대장암 또는 췌장암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 단일클론항체에 치료제가 결합된 항암용 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 치료제는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 및 186Re으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 방사성 핵종, 에토포시드 테이포시드, 아드리아마이신, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신류, 시스-백금 및 그 동족체, 블레오마이신류, 에스페라이미신류, 5-플루오로우라실, 및 멜팔란으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 치료제인 항암용 조성물.
  20. 제16항에 있어서, 상기 단일클론항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암용 조성물.
  21. (a) 개체로부터 생물학적 시료를 수득하는 단계; (b) 단계 (a)의 시료에 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단일클론항체 또는 이의 단편을 접촉시키는 단계; 및 (c) L1CAM과 상기 항체의 결합을 확인하는 단계를 포함하는 L1CAM의 검출방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨인 방법.
  23. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 단일클론항체를 포함하는 항암 진단용 키트.
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