KR20100040697A

KR20100040697A - Ｇｒｓ단백질 또는 이의 단편의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20100040697A
Application number: KR1020090096877A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 박민철
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2009-10-12
Publication date: 2010-04-20
Also published as: EP2351575B1; KR101102485B1; EP2351575A4; WO2010041913A2; US20110256119A1; EP2351575A2; WO2010041913A9; US8901081B2; WO2010041913A3

Abstract

본 발명은 전체길이의 GRS 단백질 또는 이의 단편, 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편은 특이적으로 암세포 사멸을 유도하는 활성이 우수하므로 이를 함유하거나 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 함유하는 본 발명의 조성물은 항암용으로 유용하게 사용될 수 있다.

GRS, 단백질, 항암용, 조성물

Description

ＧＲＳ단백질 또는 이의 단편의 신규한 용도{NOVEL USE OF GRS PROTEIN OR FRAGMENT THEREOF}

본 출원은 2008년 10월 10일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2008-0099784호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 GRS 단백질 또는 이의 단편, 또는 이들을 암호화하는 핵산의 신규한 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 GRS 단백질 또는 이의 단편, 또는 이들을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

암이란 세포가 분화(differentiation)능력을 상실하여 세포의 성장(growth)및 증식(proliferation)이 조절되지 않아 과잉증식이 나타나는 세포의 집합을 말한다. 대부분의 암은 발암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자(tumor suppressor gene)의 변이가 58단계에 걸쳐 일어나 궁극적으로 암세포가 생성된다는 다단계 발암설(multistep carcinogenesis)로 설명되고 있다. 암을 유발하는 발암 유전자가 활성화되면 세포의 비정상적인 증식이 유도되며, 종양억제 유전자가 활성화되면 세포의 비정상적인 증식이 억제되고 세포사멸 프로그램이 작동되어 특정 세포를 사멸 시킴으로써 암세포의 생성을 차단한다고 알려져 있다.

한편, 세포사멸(apoptosis)이란 세포괴사(necrosis)와 더불어 세포의 소멸을 일으키는 메카니즘을 말하는 것으로, 물리적 외상 또는 독성 화학물질 등에 의해 우발적으로 일어나는 괴사와는 달리 유전자에 의해 결정된 세포의 자기 파괴(genedirected cellular self-destruction) 또는 예정된 세포 사멸(programmed cell death)로 불린다. 다세포 생물은 끊임없는 세포의 증식과 사망간의 균형을 통해 세포 수의 항상성을 유지하는데, 정상적인 생리 상태에서 세포의 사멸이 일어나는 기전이 바로 세포사멸이다.

세포사멸의 과정은 형태학적, 생리학적 변화를 기준으로 초기, 중기, 말기의 3단계로 크게 나눌 수 있다. 초기에는 탈수에 의해 세포 크기가 줄어들고 세포막에 수포(bleb)가 생기며 50 kb 이상의 큰 DNA가 깨어지기 시작하고 세포내 칼슘의 농도가 증가한다. 중기에는 DNA가 180~200 bp 정도로 단편화되어 DNA 전기영동을 하였을 때 사다리 형태와 같은 양상을 나타내고, 말기에는 세포막의 기능이 완전히 소실되며 주위의 세포에 의해 포식되는 과정을 거치게 된다. 또한, 세포사멸이 진행되면 서브-G1-하이포이배체(sub-G1 hypodiploid) 세포의 수가 증가하는 것으로 알려져 있다(Nicoletti, I., Miglorati, G., Pagliacci, M.C., Grignani, F. and Riccardi, C., J. Immunol. Methods 139(2):271-9, 1991; Steven W. Sherwood, James P. Sheridan and Robert T. Schimke, Experimental Cell Research 215: 373-379, 1994).

이와 같은 세포사멸은 올챙이의 꼬리 흡수 등과 같이 생물체의 정상적인 발달 및 분화에 관여하며, 태아의 손과 발 형성, 월경, 그리고 뇌의 뉴런 사이의 시냅스 형성의 경우 흔히 볼 수 있다. 또한, 항상성(homeostasis) 유지에 관련 있을 뿐 아니라, 전체 개체에 위협이 될 수 있는 세포를 제거하는 역할을 하여 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)에 의해 바이러스에 감염된 세포를 제거하는 방법 중 하나이기도 하다.

최근에 암세포의 증식 억제가 세포사멸의 유도와 관련이 있다는 사실이 확인되었다. 현재 사용되고 있는 방사선 치료 및 화학치료제, 예컨대 5FU, 아드리아마이신 및 탁솔은 생체외 인간의 암종 세포에서 세포사멸을 유도한다(K. Sugamura et

al., Cancer 79:12, 1997; S. M. Tu et al., Cancer Lett. 93:147, 1995; R. M. Gangemi et al., Science 784:550, 1990).

따라서 항암제로 이용하기 위하여 암세포의 세포사멸을 유도할 수 있는 물질을 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예컨대, 한국특허공개 제 2004-59495호에는 암세포의 세포사멸을 유도하는 아가리쿠스 추출물을 포함하는 조성물이 개시되어 있고, 한국특허공개 제 2001-7007571호에는 암세포의 세포사멸을 유도하는 화합물 7-아릴-6(z)-헵타트리에노산레틴아미드가 개시되어 있다. 하지만 상기와 같은 항암제들은 아직 널리 이용되지는 않고 있으며, 암세포뿐만 아니라 정상세포의 사멸을 일으켜 부작용이 큰 것으로 알려져 있다.

한편 상기 GRS(glycyl-tRNA synthetase) 단백질은 아미노아실 tRNA 합성에 관여하는 단백질로 알려져 있으나, 상기 단백질이 항암활성이 있는지 여부에 대해서는 알려진 바가 전혀 없다.

이에 본 발명자들은 항암 활성이 있는 단백질을 연구하던 중, GRS 단백질 또는 이의 단편이 특이적으로 암세포의 사멸을 유도하는 활성이 있음을 밝혀 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 GRS 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 GRS(glycyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 GRS(glycyl-tRNA synthetase) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 항암용 조성물은 GRS 단백질 또는 이의 단편을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 GRS 단백질 또는 이의 단편은 특이적으로 암세포 사멸을 유도하는 활성이 있어 항암용 조성물의 유효 성분으로 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명자들은 상기 GRS 단백질이 특이적으로 암세포 사멸을 유도하는 활성이 있는지 여부를 확인하기 위하여, 먼저 혈청결핍 상태에서 면역세포인 대식세포에서 GRS 단백질이 특이적으로 분비됨을 확인하였다(<실시예 1> 참조).

또한 본 발명자들은 DNA에 손상을 가하여 세포 사멸을 유도하는 아드리아마이신(adriamycin)을 대식세포 및 암세포 각각에 처리한 경우에도 대식세포의 경우에만 특이적으로 GRS 단백질이 분비됨을 확인하였다(<실시예 2-1> 참조). 또한 세포사멸이 유도될 수 있는 글루코오스 결핍 상태에서도 대식세포의 경우에만 특이적으로 GRS 단백질이 분비됨을 확인하였다(<실시예 2-2> 참조).

이에 본 발명자들은 세포사멸이 유도되는 과정에서 면역세포인 대식세포에서만 상기 GRS 단백질이 분비됨을 착안하여 상기 GRS 단백질이 항암활성을 가지는지 살펴보았다. 먼저 상기 대식세포에서 분비된 GRS 단백질이 다른 세포들의 세포 표면에 결합됨을 알아내었다(<실시예 3> 참조). 또한 FACS 또는 MTT assay를 통하여 GRS 단백질의 항암활성 여부를 살펴본 결과, 상기 GRS 단백질이 암세포만 특이적으로 사멸시키고 신경세포, 면역세포, 신장세포 등 다른 세포에 대해서는 그렇지 않음을 알 수 있었으며(<실시예 4-1> 및 <4-2> 참조), 암세포에 GRS 단백질을 처리한 경우에 한하여 카스파제 3의 활성 형태가 관찰됨으로써 DNA 단편화가 발생하여 세 포 사멸이 유도됨을 추가적으로 확인하였다(<실시예 4-3> 참조). 나아가 본 발명자들은 GRS 단백질이 상기와 같이 암세포를 사멸하는 구체적인 기작(mechanism)을 살펴본 결과 세포성장이나 세포사멸에 관여하는 것으로 알려진 p38 kinase 관련 기작에 영향을 미쳐, 암세포 사멸을 유도함을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 신호전달분자에 미치는 GRS의 영항을 알아보고자, HeLa 세포에 GRS를 처리하고 ERK (extracellular-signal regulated kinase), p38 MAPK 및 Jun N-말단 키나제와 같은 미토젠-활성 단백질 키나제들 (mitogen-activated protein kinase:MAPK)에 미치는 영향을 살펴본 결과, 인산화 ERK 및 p38 MAPK는 GRS 단백질 처리시 시간이 지남에 따라 감소되었음을 확인하였다. 또한, TNF-α는 상기 3종류의 MAPK를 모두 인산화시켜, GRS가 HeLa 세포에 있어서 TNF-α와는 다른 기작으로 작용함을 확인할 수 있었다. 나아가, 본 발명자들은 GRS 단백질에 의한 세포사가 미토콘드리아와 연관성이 있는지를, 세포내 Bax 및 Bcl-2의 수치와 사이토크롬 C 의 분비수치로 확인한 결과, 항 아폽토시스 매개자인 Bcl-2의 수치가 감소하고, 사이토크롬 C의 분비가 촉진됨을 확인하여, HeLa 세포에서의 GRS의 친아폽토시스(proapoptotic) 활성을 확인할 수 있었다(<실시예 6> 참조).

마지막으로 본 발명자들은, GRS 단백질 중에서 사이토카인 활성이 있는 부분을 알아내고자, 도 13 내지 14와 같이 4개의 GRS 단백질의 단편을 제작하여, 그중 1개의 불용성 단편을 제외한 3개의 단편을 HeLa 및 RAW 264.7 세포주에 첨가하여 세포 생존도를 조사한 결과, 서열번호 6번으로 표시되는 4번 단편이 친아폽토시스성 사이토카인 활성을 가짐을 확인하였다. 상기 4번 단편은 총장 GRS 아미노산서열 의 511번째 아미노산에서 마지막 685번째 아미노산까지로 이루어져 있으며 C-말단 안티코돈 결합 도메인(511번째 아미노산에서 674번째 아미노산)을 포함하는 단편이다.

따라서 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편은 특이적으로 암세포 사멸을 유도하는 활성이 있어 항암용 조성물의 유효 성분으로 효과적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물에 함유되는 GRS 단백질 또는 이의 단편은 천연형 또는 재조합 GRS 단백질 또는 이들과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질을 말한다. 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 단백질에는 천연형/재조합 GRS 단백질 또는 이의 단편과 그 기능적 동등물(functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다.

상기 "기능적 동등물"에는 천연형 단백질 아미노산 중 일부 또는 전부가 치환되거나, 아미노산의 일부가 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체로서 천연형 GRS 단백질 또는 이의 단편과 실질적으로 동등한 생리활성을 갖는 것을 말한다. 상기 "기능적 유도체"는 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질 또는 이의 단편으로서 천연형 GRS 단백질과 실질적으로 동등한 생리 활성을 갖는 것을 의미한다.

본 발명의 GRS 단백질 또는 이의 단편은 포유동물로부터 유래된 것일수 있으며, 바람직하게는 상기 포유동물은 인간을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 GRS 단백질 또는 이의 단편은 서열번호 1 또는 서열번호 3 내지 6으로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 말한다.

본 발명에 사용된 GRS 단백질 또는 이의 단편은 상기 서열로부터 유전공학적 방법으로 제조될 수 있다(Park et al., J. Biol. Chem. 274:166673- 166676, 1999).

한편 본 발명의 항암용 조성물은 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함한다. 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간으로부터 유래된 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA를 말한다. 가장 바람직하게는 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 서열번호 2 또는 7의 염기서열을 가질 수 있다.

상기 핵산은 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 감염(infection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

상기 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법이다(Nabel, E. G., et al., Science, 249:1285-1288, 1990). 상기 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).

또한, 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 바이러스 발현 벡터로는 이에 한정되지는 않으나, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 등이 포함된다. 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 작제된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다(Miller, A.D., Nature, 1992, 357:455-460). FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로 바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec. Cell Biol., 6:2895-2902, 1986). 비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다(Rosenfeld, M.A., et al., Cell, 68:143-

155, 1992; Jaffe, H.A. et al., Nature Genetics, 1:372-378, 1992; Lemarchand, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6482-6486, 1992). 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al., Nature Genetics, 1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터가 본 발명의 항암용 조성물에 사용될 수 있다.

상기 GRS 또는 이의 단편을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직의 암세포를 치료 하기 위한 유효량으로 표적 암세포 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 있는 암의 경우에는 본 발명의 항암용 조성물을 암에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다. 이때, X-선, 소노그램(sonogram), 또는 광섬유 시스템(fiberoptic visualization system)과 같은 영상 장치가 표적조직의 위치확인과 바늘 또는 도관의 주입에 사용될 수 있다. 그밖에, 직접적으로 도달할 수 없거나 분석학적으로 분리해낼 수 없는 암의 경우에 본 발명에 따른 항암용 조성물을 혈액순환계 내로 투여할 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 약학적 조성물을 말한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸-또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 약학적 조성물은 이에 한정되지 않지만 경구 투여용 제형으로 제핵산과 약학적으로 허용 가능한 염을 부형제와 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신)와 활탁제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효 량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 암의 치료 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 '개체(subject)'란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환자(patient)일 수 있다.

상기 본 발명의 약학적 조성물은 그 자체를 그대로 투여하거나 상술한 바와 같은 여러 제형으로 제조되어 투여될 수 있으며, 바람직하게는 원하는 효과 즉, 내피세포 사멸 및/또는 항암 효과가 도출될 때까지 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 경로로 투여될 수 있다. 즉, 경구 또는 비경구, 예컨대 구강, 근육내, 정맥내, 피내, 동맥내, 골수내, 경막내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 설하 또는 피하 투여되거나, 위장관, 점막 또는 호흡기로 투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 피부에 직접적으로 도포하는 방법 또는 상기 폴리펩티드를 주사용 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부 아래층에 일정량을 주입하거나 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 피부에 직접 도포될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 표적 세포나 조직(예: 피부 세포나 피부 조직)에 고친화성 결합을 유발하는 분자와 결합되거나 상기 분자 내에 캡슐화된 형태로 투여될 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 스테롤(예: 콜레스테롤), 지질(예: 양이온 지질, 비로좀 또는 리포좀) 또는 표적 세포 특이적 결합제(예: 표적세포 특이적 수용체에 의해 인지되는 리간드)와 결 합될 수 있다. 적합한 커플링제 또는 가교제로는 예컨대 단백질 A, 카보디이미드, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오테이트 (SPDP) 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 본 발명의 폴리펩티드의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 개체에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 본 발명의 약학적 조성물은 투여 목적에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 1회 투여시 0.1㎍ 내지 1g의 유효용량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 유효 용량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 치료가 필요한 개체의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 각 개체에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 투여목적에 따라 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

상기 본 발명의 항암용 조성물은 암의 치료에 매우 효과적이다. 상기 암으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또 는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종과 같은 암 또는 이들 암의 하나 이상의 조합일 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편은 특이적으로 암세포 사멸을 유도하는 활성이 우수하므로 이를 함유하거나 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 함유하는 본 발명의 조성물은 항암용으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

혈청결핍 상태에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비 확인

35mm 디쉬에 암세포인 HELA, A549, H322, HCT+/- 및 HCT+/+와 면역세포의 일종인 대식세포 RAW를 각각 도말하고 18시간 배양한 다음, 혈청이 결핍된 배지(1㎖)로 수세하였다. 상기 수세 후 0, 12, 24, 36 시간이 지난 다음 배지와 전체 세포 용해물(whole cell lysate)에 함유된 단백질을 각각 취득하고 항-GRS 및 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행함으로써 상기 각 세포에서 GRS 단백질이 분비되는 지 여부를 확인하였다.

구체적으로 배지에 함유된 단백질을 수득하기 위해 상기 세포 배양액을 3000rpm 속도로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고 다시 20,000g 속도로 4℃에서 15분 동안 원심 분리하여 상층액을 분리한 다음 이에 100% TCA(Trichloroacetic acid) 100㎕를 첨가(최종 10%)하여 단백질을 침전시키기 위해 4℃에서 하룻밤 동안 배양하고 18,000g 속도로 4℃에서 10분 동안 원심 분리하였다. 상기 원심분리 후 상층액을 제거한 뒤 100mM의 HEPES(pH 8.0) 55㎕를 첨가하고 5초 동안 볼텍싱한 다음 5x sample 버퍼 15㎕를 첨가하여 배지에 함유된 단백질을 수득하였다.

한편 전체 세포 용해물에 함유된 단백질을 수득하기 위하여 0.5% 트리톤 x-100, 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 25mM 트리스-HCL (pH 7.4) 및 프로테아제 억제제가 함유된 용액을 세포가 있는 디쉬에 200㎕를 첨가한 다음 4℃에서 30분 동안 혼합한 후 12,000rpm 속도로 4℃에서 15분 동안 원심 분리한 뒤 Brad-ford 법을 이용하여 단백질을 정량하였다.

상기 각 취득한 단백질을 8% SDS-PAGE에 로딩하여 분리한 뒤 항-GRS 및 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하고 그 결과를 도 1에 기재하였다.

상기 도 1에 기재된 바와 같이, 혈청결핍 상태에서 대식세포의 경우 GRS 단백질(서열번호 1)이 분비되지만 암세포의 경우 거의 분비되지 않음을 알 수 있었다. 또한 튜불린의 경우와 비교하면 대식세포에서 GRS 단백질만이 특이적으로 분비됨을 알 수 있었다. 특히 대식세포에서 혈청결핍 상태가 12시간 동안 지속된 후 GRS 단백질이 분비됨을 알 수 있었다.

<실시예 2>

세포사멸이 유도되는 과정에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비

<2-1> 아드리아마이신(adriamycin)을 처리한 경우

상기 <실시예 1>에서 혈청결핍 상태가 길어진 경우에 비로소 GRS 단백질이 분비되므로, GRS 단백질의 분비여부가 세포사멸에 의한 것인지 또는 GRS 단백질의 아미노아실 활성(aminoacyl activity)이 소실되기 때문인지를 확인하였다. 구체적으로 35mm 디쉬에 암세포인 HELA, HCT+/-를, 면역세포의 일종인 대식세포 RAW를 도말하고 18시간 배양하였다. 상기 배양물을 혈청이 결핍된 배지(1㎖)로 수세하여 아드리아마이신 1㎍/㎖를 처리한 후 0, 0.5, 1, 2, 4 시간이 지난 다음 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 배지와 전체 세포 용해물(whole cell lysate)에 함유된 단백질을 각각 취득하고 항-GRS 및 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행함으로써 상기 각 세포에서 GRS 단백질이 분비되는지 여부를 확인하여 그 결과를 도 2A에 기재하였다.

상기 도 2A에 기재된 바와 같이, DNA에 손상을 가하여 세포 사멸을 유도하는 아드리아마이신(adriamycin)을 처리한 경우에도 <실시예 1>과 마찬가지로 대식세포의 경우에만 특이적으로 GRS 단백질이 분비됨을 알 수 있었다.

한편 상기 분비된 단백질이 GRS 단백질인지 여부를 다시금 확인하기 위하여 면역침강(immunoprecipitation) 실험을 실시하였다. 상기 아드리아마이신이 처리한지 4시간 경과한 배양물에서 배지에 함유된 단백질을 수득하기 위해 항-GRS 1.5ug를 첨가한 다음 4℃에서 2시간동안 배양하고 PBS로 수세한 뒤 단백질 아가로스 A 25㎕를 첨가하여 4℃에서 4시간동안 배양하고 2,800rpm 속도로 4℃에서 2분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 PBS 1㎖로 수세하였다. 상기 과정을 3번 반복한 다음 sample 버퍼 65㎕를 첨가하여 5초 동안 혼합하고 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 웨스턴 블랏을 수행하였다. 또한 전체 세포 용해물에 함유된 단백질을 수득하기 위해 상기 <실시예 1>과 동일한 방법을 수행하였다. 상기 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 도 2B에 기재하였다.

상기 도 2B에 기재된 바와 같이, 상기 분비된 단백질이 GRS 단백질인지 여부를 다시금 확인할 수 있었다.

또한 상기 결과들을 토대로, 세포사멸이 유도되는 과정에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비되는 것이 단순히 세포가 완전히 사멸하였기 때문인지 아니면 어떠한 기능을 수행하기 위해 의도적으로 분비되는 것인지 여부를 추가적으로 확인하였다. 구체적으로 상기 아드리아마이신이 처리한지 0시간 또는 6시간 경과한 배양물에 트립신 EDTA를 처리하여 세포를 추출한 다음 500g 속도로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 cold PBS 0.3㎖로 세포를 재부유(resuspension)시킨 뒤cold 100% EtOH 0.7㎖를 첨가 한 뒤 5초 동안 혼합하고 -20℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양물을 500g 속도로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하여 cold PBS 1㎖를 첨가한 다음 5초 동안 혼합하고 500g 속도로 4℃에서 10분 동안 다시 원심 분리하였다. 상기 원심 분리후 상층액을 제거하고 P.I 용액 500㎕를 첨가하여 재부유한 다음 상온에서 20분 동안 배양하고 FACS로 리딩하여 사멸된 세포의 수를 측정하여 그 결과를 도 2C에 기재하였다(이때 세포주기를 측정하여 sub-G1기인 경우 사멸된 것으로 봄).

상기 도 2C에 기재된 바와 같이, 아드리아마이신에 의한 세포사멸이 유도되는 과정에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비되는 것이 단순히 세포가 완전히 사멸하였기 때문이 아니라 어떠한 기능을 수행하기 위해 의도적으로 분비됨을 알 수 있었다.

<2-2> 글루코오스 결핍 상태의 경우

실제 암세포의 경우 그 주변이 글루코오스 결핍 상태가 되어 암세포를 죽이기 위해 몰려드는 면역세포들을 세포사멸로 유도할 수 있기 때문에 글루코오스 결핍상태에서 GRS 단백질이 분비되는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 혈청결핍과 동시에 글루코오스 결핍상태에서 상기 <실시예 1>과 동일한 방법을 수행하고 그 결과를 도 3A에 기재하였다.

상기 도 3A에 기재한 바와 같이, 상기 <실시예 1>과 마찬가지로 대식세포의 경우에만 특이적으로 GRS 단백질이 분비됨을 알 수 있었다.

한편 상기 분비된 단백질이 GRS 단백질인지 여부를 다시금 확인하기 위하여 상기 <실시예 2>와 동일한 방법을 수행하여 그 결과를 도3B에 기재하였다.

상기 도 3B에 기재한 것과 같이 상기 분비된 단백질이 GRS 단백질인지 여부를 다시금 확인할 수 있었다.

또한 상기 결과들을 토대로, 글루코오스 결핍에 의한 세포사멸이 유도되는 과정에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비되는 것이 단순히 세포가 완전히 사멸하였기 때문인지 아니면 어떠한 기능을 수행하기 위해 의도적으로 분비되는 것인지 여부를 상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로 확인하고 그 결과를 도 3C에 기재하였다.

상기 도 3C에 기재한 것과 같이 글루코오스 결핍에 의한 세포사멸이 유도되는 과정에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비되는 것이 단순히 세포가 완전히 사멸하였기 때문이 아니라 어떠한 기능을 수행하기 위해 의도적으로 분비됨을 알 수 있었다.

<실시예 3>

GRS 단백질과 세포 결합 유무 확인

35mm 디쉬에 암세포인 HELA, HCT+/- 및 정상 세포 인 293을, 면역세포의 일종인 대식세포 RAW를 도말하고 18시간 배양한 다음, 혈청이 결핍된 배지(1㎖)로 수세하였다. 상기 수세 후 비오틴화된 GRS 단백질을 0,1,2,5,10㎍을 첨가하여 전체 세포 용해물(whole cell lysate)에 함유된 단백질을 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 각각 취득하고 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP 및 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과를 도 4에 기재하였다.

상기 도 4에 기재한 바와 같이, 대식세포에서 분비된 GRS 단백질이 다른 세포들의 세포 표면에 결합되어 있음을 알 수 있었다. 따라서 상기 GRS 단백질이 세포들에 어떠한 기능을 수행할 수 있는지 추가 실험을 진행하였다.

<실시예 4>

GRS 단백질의 항암 활성

<4-1> FACS에 의한 GRS 단백질의 항암활성 측정

35mm 디쉬에 암세포인 HELA, A549, HCT+/- 및 HCT+/+를, 신경세포인 BV2, SH-SY5Y를, 인간의 피부 섬유아세포인 HSF를, 면역세포의 일종인 대식세포 RAW를 도말하고 18시간 배양하였다. 상기 배양물을 혈청이 결핍된 배지(1㎖)로 수세하여 GRS 단백질 0, 100nM 또는 100nM의 열이 가해진 GRS 단백질 및 아드리아마이신 1㎍/㎖를 처리한 후, 트립신 EDTA를 추가 처리하고 세포를 분리하고 500g 속도로 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하였다. 이에 cold PBS 0.3㎖로 세포를 재부유시킨 다음 cold 100% EtOH 0.7㎖를 첨가한 뒤 5초 동안 혼합하고 -20℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양 후, 배양물을 500g 속도로 4℃에서 10분 동안 원심 분리하고 상층액을 제거한 다음 cold PBS 1㎖를 첨가하고 5초 동안 혼합한 후 500g 속도로 4℃에서 10분 동안 다시 원심 분리하여 상층액을 제거한 뒤 P.I 용액 500㎕를 첨가하여 재부유시킨 후 상온에서 20분 동안 배양하고 FACS로 리딩함으로써 세포의 DNA양을 측정하여 세포사멸이 일어날 경우에 나타나는 DNA 단편을 측정함으로써 세포 사멸 정도를 확인하였다. 상기 실험 결과를 도 5에 기재하였다(이때 세포주기를 측정하여 sub-G1기인 경우 사멸된 것으로 봄).

상기 도 5에 기재된 바와 같이, GRS 단백질은 암세포인 HELA, A549, HCT+/- 및 HCT+/+만 특이적으로 사멸시키지만 신경세포, 면역세포의 경우에는 거의 영향이 없음을 알 수 있었다. 따라서 GRS 단백질은 암세포에 한하여 세포사멸을 유도함으로써 항암용 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<4-2> MTT assay에 의한 GRS 단백질의 항암활성 측정

96웰-플레이트에 암세포인 HELA, A549, HCT+/- 및 H460을, 신장세포인 H293세포, 신경세포인 SH-SY5Y를, 인간의 피부 섬유아세포인 HSF를, 면역세포의 일종인 대식세포 RAW를 도말하여 18시간 배양하고 혈청결핍 배지로 수세한 후 100㎕의 혈청결핍 배지에 His-GRS 단백질 0, 50, 100, 150nM, 150nM의 열이 가해진 His-GRS 단백질 또는 아드리아마신 2㎍/㎖를 처리 후 24시간 동안 배양하고 각 웰당 MTT 5㎎/㎖를 10㎕를 처리한 다음 2시간 동안 배양하였다. 이후 주사기를 이용하여 상층액을 제거하고 각 웰당 DMSO 100㎕를 처리한 후 10분간 배양하고 ELISA 리더기로 570nM 파장으로 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 6에 기재하였다.

상기 도 6에 기재된 바와 같이, MTT assay를 통하여 세포의 생존 정도를 미토콘드리아의 효소 활성도를 측정함으로써 확인한 결과, GRS 단백질은 암세포인 HELA, A549, HCT+/- 및 H460만 특이적으로 사멸시키지만 신장세포, 신경세포, 면역세포의 경우에는 거의 영향이 없음을 알 수 있었다. 따라서 GRS 단백질은 암세포에 한하여 세포사멸을 유도함으로써 항암용 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<4-3> 카스파제 3(caspase 3)에 의한 GRS 단백질의 항암활성 측정

35mm 디쉬에 암세포인 HCT+/- 또는 면역세포의 일종인 대식세포 RAW를 도말하여 18시간 경과 후 혈청결핍 배지로 수세한 뒤, 1㎖의 혈청결핍 배지에 His-GRS 0, 50nM, 100nM, 150nM, 150nM의 열이 가해진 His-GRS 단백질을 처리한 다음, 24시간 동안 배양하고 리프터로 세포를 수득하였다. 상기 수득한 세포를 3000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하고 0.5% 트리톤 x-100, 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 25mM 트리스-HCL (pH 7.4) 및 프로테아제 억제제가 함유된 용액에 용해 완충액(lysis buffer) 200㎕를 첨가한 다음 4℃에서 30분 동안 혼합한 후 12,000rpm 속도로 4℃에서 15분 동안 원심 분리하여 Brad-ford 법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 상기 각 취득한 단백질을 15% SDS-PAGE에 로딩하여 분리한 뒤 항-카스파제 3 및 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하고 그 결과를 도 7에 기재하였다.

상기 도 7에 기재된 바와 같이, 암세포에 GRS 단백질을 처리한 경우에 한하여 카스파제 3의 활성 형태가 관찰됨으로써 DNA 단편화가 발생하여 세포 사멸이 유도됨을 확인할 수 있었다. 따라서 GRS 단백질은 암세포에 한하여 세포사멸을 유도함으로써 항암용 조성물의 유효한 성분으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5>

GRS 단백질의 암세포 사멸 기작

5mm 디쉬에 암세포인 HCT+/-를 도말하고 18시간 경과 후 혈청결핍 배지로 수세한 다음 1㎖의 혈청결핍 배지에 GRS 100nM 또는 LPS(lipopolysaccharides) 2㎍/㎖를 처리한 뒤 0,10,30,60,90,120분 동안 배양하고 리프터로 세포를 수득하였다. 상기 수득된 세포를 3,000rpm에서 5분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고 0.5% 트리톤 x-100, 2mM EDTA, 10% 글리세롤, 150mM NaCl, 25mM 트리스-HCL (pH 7.4) 및 프로테아제 억제제가 함유된 용액에 용해 완충액(lysis buffer) 200㎕를 첨가한 다음 4℃에서 30분 동안 혼합한 후 12,000rpm 속도로 4℃에서 15분 동안 원심 분리하여 Brad-ford 법을 이용하여 단백질을 정량하였다. 상기 각 취득한 단백질을 10% SDS-PAGE에 로딩하여 분리한 뒤 항-p-p38, 항-p38, 항-p-ERK, 항-ERK 및 항-튜불린을 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하고 그 결과를 도 8에 기재하였다.

상기 도 8에 기재한 것과 같이, GRS 단백질은 세포성장이나 세포사멸에 관여하는 것으로 알려진 p38 kinase 관련 기작에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

<실시예 6>

신호전달 분자에서 GRS 단백질의 효과

HeLa 세포주를 6웰 플레이트이 12시간동안 배양하고, 2회 세척후, 혈청결핍 DMEM 배지에서 3시간동안 방치하였다. 이후, 세포를 GRS(150 nM) 또는 TNF-α(15ng/㎖)와 함께 10, 30, 60, 90, 120 분동안 배양하고, 차가운 인산완충용액으 로 2회 세척하였다. 단백질을 150mM 염화나트륨, 1M EDTA, 1mM 소디움오르소바나데이트(sodiumorthovanadate), 20mM 소디움 플로라이드(sodium floride), 12mM β-글리세로포스페이트 (β-glycerophosphate), 10% 글리세롤, 1% 트리톤 X-100 및 프로티아제 억제제가 포함된 25mM Tris-HCl (pH 7.4) 용해완충액으로 추출되어, 10% SDS-PAGE로 분리한 후, 폴리비닐리덴 디플로이드 멤브레인 (Millipore)로 옮겼다. 총 MAPK 및 인산화 MAPK를 특이적 항체를 사용하여 면역 블롯을 실시하였다.

그 결과, 도 9에 기재한 것과 같이, 인산화된 ERK 및 p38 MAPK가 GRS 단백질 처리시간이 경과함에 따라 증가하였으나, TNF-α의 경우는 도 10에서와 같이, 모든 MAPK의 인산화가 처리 30분 경과후에 증가되어, GRS와는 다른 기작으로 작용함을 알 수 있었다. 또한, GRS-유도성 세포사가 미토콘드리아와 연관되어 있는지를 알아보고자, 세포내 Bax와 Bcl-2 그리고 사이토크롬 C의 수준을 조사하였다. 우선 HeLa 세포를 150nM의 GRS로 지정된 시간동안 배양한 후, 세포를 수획하여 10mM 염화칼륨, 1.5 mM 염화 마그네슘, 0.5mM EDTA, 1mM DTT 및 프로티아제 억제제 (Calbiochem)가 포함된 20mM의 HEPES (pH 7.5) 저장완충액에 재부유하여 얼음에서 5분간 방치한 후 6회 균질화(homogenize) 시킨다. 상기 시료를 10,000g에서 10분간 원심분리하였다. 상층액의 단백질을 12% SDS-PAGE로 분리하여 PVDF 멤브레인으로 이동시키고, 사이토크롬 C 또는 튜블린 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 하였다. 그 결과, 도 11에 기재된 바와 같이, GRS는 세포내 Bax에는 영향을 주지 않으나, 항아폽포시스 매개자인 Bcl-2는 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 도 12에 기재된 바와 같이, 사이토크롬 C 분비는 증가시키는 것으로 나타났다. 이를 종합해 볼때, HeLa 세포에서 GRS가 친아폽토시스성 활성을 가짐을 알 수 있었다.

<실시예 7>

GRS 단백질의 사이토카인 도메인 확인

GRS 단백질에서 사이토카인 활성에 관여하는 도메인 부위를 확인하고자, 서열번호 3 내지 6으로 나타내어지는 4개의 GRS 단편을 구축하고(도 13 및 14) 이들을 GST 융합단백질로 발현하였다. 4개의 단편중 불용성 및 불안정성을 가진 F1을 제외하고 3개의 단편을 수획한 후, GST-GRS 단편 (F2-4)를 정제하고 이를 HeLa 세포주 및 RAW 264.7 세포주에 첨가하여 세포 생장도를 조사하였다. 그 결과, 도 15에 기재된 바와 같이, C-말단 안티코돈-결합 도메인이 포함된 4번 단편이 친아폽토시스성 사이토카인 활성을 지님을 확인하였다.

상기 GRS 단백질 또는 이의 단편은 특이적으로 암세포 사멸을 유도하는 활성이 우수하므로 이를 함유하거나 상기 GRS 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 함유하는 본 발명의 조성물은 항암용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 혈청결핍 상태에서 대식세포로부터 GRS 단백질이 특이적으로 분비되는지 여부를 웨스턴 블랏을 이용하여 확인한 결과이다(WCL: 전체 세포 용해물).

도 2는 아드리아마이신(adriamycin)을 처리하여 세포사멸이 유도되는 과정에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비되는지 여부를 확인한 결과이다(WCL: 전체 세포 용해물).

도 3은 글루코오스 결핍에 의해 세포사멸이 유도되는 과정에서 대식세포로부터 GRS 단백질의 분비되는지 여부를 확인한 결과이다(WCL: 전체 세포 용해물).

도 4는 대식세포에서 분비된 GRS 단백질이 암세포와 결합하는지 여부를 확인한 결과이다.

도 5는 FACS에 의하여 GRS 단백질이 특이적인 항암 활성을 가지고 있음을 나타낸 그래프이다.

도 6은 MTT assay에 의하여 GRS 단백질이 특이적인 항암 활성을 가지고 있음을 나타낸 그래프이다.

도 7은 카스파제 3(caspase 3)에 의하여 GRS 단백질이 특이적인 항암 활성을 가지고 있음을 나타낸 그래프이다.

도 8은 GRS 단백질이 암세포 사멸에 관여하는 구체적인 기작을 검토한 결과이다(A: GRS 단백질을 처리한 경우, B: LPS를 처리한 경우).

도 9는 MAPK들에 대한 GRS 단백질의 영향을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.

도 10은 MAPK들에 대한 TNF-α의 영향을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과이다.

도 11은 GRS 단백질 처리시 Bax 및 Bcl-2의 양을 웨스턴 블록으로 확인한 결과이다.

도 12는 GRS 단백질 처리시 사이토크롬 C의 양을 웨스턴 블록으로 확인한 결과이다.

도 13 및 14은 GRS 단백질 전체 아미노산 모식도 및 단편 F1 내지 F4의 위치를 나타낸 모식도이다.

도 15는 단편별 세포 생존도를 MTT 어세이 수치로 나타낸 그래프이다.

<110> SNU R&DB Foundation <120> anti-cancer composition comprising GRS protein as an effective component <130> NP09-0068L <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(685) <223> full length of GRS <400> 1 Met Asp Gly Ala Gly Ala Glu Glu Val Leu Ala Pro Leu Arg Leu Ala 1 5 10 15 Val Arg Gln Gln Gly Asp Leu Val Arg Lys Leu Lys Glu Asp Lys Ala 20 25 30 Pro Gln Val Asp Val Asp Lys Ala Val Ala Glu Leu Lys Ala Arg Lys 35 40 45 Arg Val Leu Glu Ala Lys Glu Leu Ala Leu Gln Pro Lys Asp Asp Ile 50 55 60 Val Asp Arg Ala Lys Met Glu Asp Thr Leu Lys Arg Arg Phe Phe Tyr 65 70 75 80 Asp Gln Ala Phe Ala Ile Tyr Gly Gly Val Ser Gly Leu Tyr Asp Phe 85 90 95 Gly Pro Val Gly Cys Ala Leu Lys Asn Asn Ile Ile Gln Thr Trp Arg 100 105 110 Gln His Phe Ile Gln Glu Glu Gln Ile Leu Glu Ile Asp Cys Thr Met 115 120 125 Leu Thr Pro Glu Pro Val Leu Lys Thr Ser Gly His Val Asp Lys Phe 130 135 140 Ala Asp Phe Met Val Lys Asp Val Lys Asn Gly Glu Cys Phe Arg Ala 145 150 155 160 Asp His Leu Leu Lys Ala His Leu Gln Lys Leu Met Ser Asp Lys Lys 165 170 175 Cys Ser Val Glu Lys Lys Ser Glu Met Glu Ser Val Leu Ala Gln Leu 180 185 190 Asp Asn Tyr Gly Gln Gln Glu Leu Ala Asp Leu Phe Val Asn Tyr Asn 195 200 205 Val Lys Ser Pro Ile Thr Gly Asn Asp Leu Ser Pro Pro Val Ser Phe 210 215 220 Asn Leu Met Phe Lys Thr Phe Ile Gly Pro Gly Gly Asn Met Pro Gly 225 230 235 240 Tyr Leu Arg Pro Glu Thr Ala Gln Gly Ile Phe Leu Asn Phe Lys Arg 245 250 255 Leu Leu Glu Phe Asn Gln Gly Lys Leu Pro Phe Ala Ala Ala Gln Ile 260 265 270 Gly Asn Ser Phe Arg Asn Glu Ile Ser Pro Arg Ser Gly Leu Ile Arg 275 280 285 Val Arg Glu Phe Thr Met Ala Glu Ile Glu His Phe Val Asp Pro Ser 290 295 300 Glu Lys Asp His Pro Lys Phe Gln Asn Val Ala Asp Leu His Leu Tyr 305 310 315 320 Leu Tyr Ser Ala Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Ser Ala Arg Lys Met 325 330 335 Arg Leu Gly Asp Ala Val Glu Gln Gly Val Ile Asn Asn Thr Val Leu 340 345 350 Gly Tyr Phe Ile Gly Arg Ile Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Val Gly Ile 355 360 365 Ser Pro Asp Lys Leu Arg Phe Arg Gln His Met Glu Asn Glu Met Ala 370 375 380 His Tyr Ala Cys Asp Cys Trp Asp Ala Glu Ser Lys Thr Ser Tyr Gly 385 390 395 400 Trp Ile Glu Ile Val Gly Cys Ala Asp Arg Ser Cys Tyr Asp Leu Ser 405 410 415 Cys His Ala Arg Ala Thr Lys Val Pro Leu Val Ala Glu Lys Pro Leu 420 425 430 Lys Glu Pro Lys Thr Val Asn Val Val Gln Phe Glu Pro Ser Lys Gly 435 440 445 Ala Ile Gly Lys Ala Tyr Lys Lys Asp Ala Lys Leu Val Met Glu Tyr 450 455 460 Leu Ala Ile Cys Asp Glu Cys Tyr Ile Thr Glu Ile Glu Met Leu Leu 465 470 475 480 Asn Glu Lys Gly Glu Phe Thr Ile Glu Thr Glu Gly Lys Thr Phe Gln 485 490 495 Leu Thr Lys Asp Met Ile Asn Val Lys Arg Phe Gln Lys Thr Leu Tyr 500 505 510 Val Glu Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly Leu Gly 515 520 525 Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg Glu Gly 530 535 540 Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala Pro Phe 545 550 555 560 Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met Pro Phe 565 570 575 Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser His Lys 580 585 590 Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg Thr Asp 595 600 605 Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr Val Asn 610 615 620 Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met Arg Gln 625 630 635 640 Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp Leu Ala 645 650 655 Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro Leu Phe 660 665 670 Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu Glu 675 680 685 <210> 2 <211> 2058 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggacggcg cgggggctga ggaggtgctg gctcctctga ggctagcagt gcgccagcag 60 ggagatcttg tgcgaaaact caaagaagat aaagcacccc aagtagacgt agacaaagca 120 gtggctgagc tcaaagcccg caagagggtt ctggaagcaa aggagctggc gttacagccc 180 aaagatgata ttgtagaccg agcaaaaatg gaagataccc tgaagaggag gtttttctat 240 gatcaagctt ttgctattta tggaggtgtt agtggtctgt atgactttgg gccagttggc 300 tgtgctttga agaacaatat tattcagacc tggaggcagc actttatcca agaggaacag 360 atcctggaga tcgattgcac catgctcacc cctgagccag ttttaaagac ctctggccat 420 gtagacaaat ttgctgactt catggtgaaa gacgtaaaaa atggagaatg ttttcgtgct 480 gaccatctat taaaagctca tttacagaaa ttgatgtctg ataagaagtg ttctgtcgaa 540 aagaaatcag aaatggaaag tgttttggcc cagcttgata actatggaca gcaagaactt 600 gcggatcttt ttgtgaacta taatgtaaaa tctcccatta ctggaaatga tctatcccct 660 ccagtgtctt ttaacttaat gttcaagact ttcattgggc ctggaggaaa catgcctggg 720 tacttgagac cagaaactgc acaggggatt ttcttgaatt tcaaacgact tttggagttc 780 aaccaaggaa agttgccttt tgctgctgcc cagattggaa attcttttag aaatgagatc 840 tcccctcgat ctggactgat cagagtcaga gaattcacaa tggcagaaat tgagcacttt 900 gtagatccca gtgagaaaga ccaccccaag ttccagaatg tggcagacct tcacctttat 960 ttgtattcag caaaagccca ggtcagcgga cagtccgctc ggaaaatgcg cctgggagat 1020 gctgttgaac agggtgtgat taataacaca gtattaggct atttcattgg ccgcatctac 1080 ctctacctca cgaaggttgg aatatctcca gataaactcc gcttccggca gcacatggag 1140 aatgagatgg cccattatgc ctgtgactgt tgggatgcag aatccaaaac atcctacggt 1200 tggattgaga ttgttggatg tgctgatcgt tcctgttatg acctctcctg tcatgcacga 1260 gccaccaaag tcccacttgt agctgagaaa cctctgaaag aacccaaaac agtcaatgtt 1320 gttcagtttg aacccagtaa gggagcaatt ggtaaggcat ataagaagga tgcaaaactg 1380 gtgatggagt atcttgccat ttgtgatgag tgctacatta cagaaattga gatgctgctg 1440 aatgagaaag gggaattcac aattgaaact gaagggaaaa catttcagtt aacaaaagac 1500 atgatcaatg tgaagagatt ccagaaaaca ctatatgtgg aagaagttgt tccgaatgta 1560 attgaacctt ccttcggcct gggtaggatc atgtatacgg tatttgaaca tacattccat 1620 gtacgagaag gagatgaaca gagaacattc ttcagtttcc ctgctgtagt tgctccattc 1680 aaatgttccg tcctcccact gagccaaaac caggagttca tgccatttgt caaggaatta 1740 tcggaagccc tgaccaggca tggagtatct cacaaagtag acgattcctc tgggtcaatc 1800 ggaaggcgct atgccaggac tgatgagatt ggcgtggctt ttggtgtcac cattgacttt 1860 gacacagtga acaagacccc ccacactgca actctgaggg accgtgactc aatgcggcag 1920 ataagagcag agatctctga gctgcccagc atagtccaag acctagccaa tggcaacatc 1980 acatgggctg atgtggaggc caggtatcct ctgtttgaag ggcaagagac tggtaaaaaa 2040 gagacaatcg aggaatga 2058 <210> 3 <211> 136 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(136) <223> Fragment 1 (1-136aa) <400> 3 Met Asp Gly Ala Gly Ala Glu Glu Val Leu Ala Pro Leu Arg Leu Ala 1 5 10 15 Val Arg Gln Gln Gly Asp Leu Val Arg Lys Leu Lys Glu Asp Lys Ala 20 25 30 Pro Gln Val Asp Val Asp Lys Ala Val Ala Glu Leu Lys Ala Arg Lys 35 40 45 Arg Val Leu Glu Ala Lys Glu Leu Ala Leu Gln Pro Lys Asp Asp Ile 50 55 60 Val Asp Arg Ala Lys Met Glu Asp Thr Leu Lys Arg Arg Phe Phe Tyr 65 70 75 80 Asp Gln Ala Phe Ala Ile Tyr Gly Gly Val Ser Gly Leu Tyr Asp Phe 85 90 95 Gly Pro Val Gly Cys Ala Leu Lys Asn Asn Ile Ile Gln Thr Trp Arg 100 105 110 Gln His Phe Ile Gln Glu Glu Gln Ile Leu Glu Ile Asp Cys Thr Met 115 120 125 Leu Thr Pro Glu Pro Val Leu Lys 130 135 <210> 4 <211> 174 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(174) <223> Fragment 2 (137-310aa) <400> 4 Thr Ser Gly His Val Asp Lys Phe Ala Asp Phe Met Val Lys Asp Val 1 5 10 15 Lys Asn Gly Glu Cys Phe Arg Ala Asp His Leu Leu Lys Ala His Leu 20 25 30 Gln Lys Leu Met Ser Asp Lys Lys Cys Ser Val Glu Lys Lys Ser Glu 35 40 45 Met Glu Ser Val Leu Ala Gln Leu Asp Asn Tyr Gly Gln Gln Glu Leu 50 55 60 Ala Asp Leu Phe Val Asn Tyr Asn Val Lys Ser Pro Ile Thr Gly Asn 65 70 75 80 Asp Leu Ser Pro Pro Val Ser Phe Asn Leu Met Phe Lys Thr Phe Ile 85 90 95 Gly Pro Gly Gly Asn Met Pro Gly Tyr Leu Arg Pro Glu Thr Ala Gln 100 105 110 Gly Ile Phe Leu Asn Phe Lys Arg Leu Leu Glu Phe Asn Gln Gly Lys 115 120 125 Leu Pro Phe Ala Ala Ala Gln Ile Gly Asn Ser Phe Arg Asn Glu Ile 130 135 140 Ser Pro Arg Ser Gly Leu Ile Arg Val Arg Glu Phe Thr Met Ala Glu 145 150 155 160 Ile Glu His Phe Val Asp Pro Ser Glu Lys Asp His Pro Lys 165 170 <210> 5 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(200) <223> Fragment 3 (311-510aa) <400> 5 Phe Gln Asn Val Ala Asp Leu His Leu Tyr Leu Tyr Ser Ala Lys Ala 1 5 10 15 Gln Val Ser Gly Gln Ser Ala Arg Lys Met Arg Leu Gly Asp Ala Val 20 25 30 Glu Gln Gly Val Ile Asn Asn Thr Val Leu Gly Tyr Phe Ile Gly Arg 35 40 45 Ile Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Val Gly Ile Ser Pro Asp Lys Leu Arg 50 55 60 Phe Arg Gln His Met Glu Asn Glu Met Ala His Tyr Ala Cys Asp Cys 65 70 75 80 Trp Asp Ala Glu Ser Lys Thr Ser Tyr Gly Trp Ile Glu Ile Val Gly 85 90 95 Cys Ala Asp Arg Ser Cys Tyr Asp Leu Ser Cys His Ala Arg Ala Thr 100 105 110 Lys Val Pro Leu Val Ala Glu Lys Pro Leu Lys Glu Pro Lys Thr Val 115 120 125 Asn Val Val Gln Phe Glu Pro Ser Lys Gly Ala Ile Gly Lys Ala Tyr 130 135 140 Lys Lys Asp Ala Lys Leu Val Met Glu Tyr Leu Ala Ile Cys Asp Glu 145 150 155 160 Cys Tyr Ile Thr Glu Ile Glu Met Leu Leu Asn Glu Lys Gly Glu Phe 165 170 175 Thr Ile Glu Thr Glu Gly Lys Thr Phe Gln Leu Thr Lys Asp Met Ile 180 185 190 Asn Val Lys Arg Phe Gln Lys Thr 195 200 <210> 6 <211> 175 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(175) <223> Fragment 4 (511-685aa) <400> 6 Leu Tyr Val Glu Glu Val Val Pro Asn Val Ile Glu Pro Ser Phe Gly 1 5 10 15 Leu Gly Arg Ile Met Tyr Thr Val Phe Glu His Thr Phe His Val Arg 20 25 30 Glu Gly Asp Glu Gln Arg Thr Phe Phe Ser Phe Pro Ala Val Val Ala 35 40 45 Pro Phe Lys Cys Ser Val Leu Pro Leu Ser Gln Asn Gln Glu Phe Met 50 55 60 Pro Phe Val Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Thr Arg His Gly Val Ser 65 70 75 80 His Lys Val Asp Asp Ser Ser Gly Ser Ile Gly Arg Arg Tyr Ala Arg 85 90 95 Thr Asp Glu Ile Gly Val Ala Phe Gly Val Thr Ile Asp Phe Asp Thr 100 105 110 Val Asn Lys Thr Pro His Thr Ala Thr Leu Arg Asp Arg Asp Ser Met 115 120 125 Arg Gln Ile Arg Ala Glu Ile Ser Glu Leu Pro Ser Ile Val Gln Asp 130 135 140 Leu Ala Asn Gly Asn Ile Thr Trp Ala Asp Val Glu Ala Arg Tyr Pro 145 150 155 160 Leu Phe Glu Gly Gln Glu Thr Gly Lys Lys Glu Thr Ile Glu Glu 165 170 175 <210> 7 <211> 528 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(528) <223> DNA sequence of Fragment 4 <400> 7 ctatatgtgg aagaagttgt tccgaatgta attgaacctt ccttcggcct gggtaggatc 60 atgtatacgg tatttgaaca tacattccat gtacgagaag gagatgaaca gagaacattc 120 ttcagtttcc ctgctgtagt tgctccattc aaatgttccg tcctcccact gagccaaaac 180 caggagttca tgccatttgt caaggaatta tcggaagccc tgaccaggca tggagtatct 240 cacaaagtag acgattcctc tgggtcaatc ggaaggcgct atgccaggac tgatgagatt 300 ggcgtggctt ttggtgtcac cattgacttt gacacagtga acaagacccc ccacactgca 360 actctgaggg accgtgactc aatgcggcag ataagagcag agatctctga gctgcccagc 420 atagtccaag acctagccaa tggcaacatc acatgggctg atgtggaggc caggtatcct 480 ctgtttgaag ggcaagagac tggtaaaaaa gagacaatcg aggaatga 528

Claims

서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장암, 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 2 또는 서열번호 7로 표시되는 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제5항에 있어서, 상기 핵산이 발현 벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제7항에 있어서, 상기 발현 벡터가 플라스미드 또는 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 플라스미드가 pRK5, pSV16B, pVL1392 및 pcDNA3으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터가 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 허피스바이러스 벡터 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.