KR20100032924A

KR20100032924A - 감마-세크레타제 억제제로서의 아제핀 유도체

Info

Publication number: KR20100032924A
Application number: KR1020107002906A
Authority: KR
Inventors: 멜린다 조이 호프 밀러; 워렌 제이예 포터; 존 케빈 렐; 알무데나 루비오-에스테반
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2007-08-14
Filing date: 2008-08-04
Publication date: 2010-03-26
Also published as: EP2178844A1; CN101778826B; KR101136260B1; US8188069B2; CN101778826A; CA2694209C; MX2010001754A; CA2694209A1; BRPI0815135A2; JP2010536766A; EA017286B1; AU2008287124B2; AU2008287124A1; WO2009023453A1; EA201070278A1; US20100197660A1; JP5385904B2

Abstract

본 발명은, 하기 화학식 I의 화합물, 이를 포함하는 제약 조성물, 및 이의 사용을 위한 방법을 기재한다.
<화학식 I>

Description

감마-세크레타제 억제제로서의 아제핀 유도체{AZEPINE DERIVATIVES AS GAMMA-SECRETASE INHIBITORS}

후기 단계에서 인지 및 행동 악화를 특징으로 하는 알츠하이머병은 중요한 사회적 및 경제적 관심사로 대두되었다. 신경원섬유 매듭(neurofibrillary tangle) 및 신경반(neuritic plaque)은 일반적으로 알츠하이머병에 걸린 개체의 기억 및 인지와 관련된 뇌 영역에서 발견된다. 이러한 반은 또한 다운 증후군, 네덜란드형 유전성 뇌출혈 및 다른 신경퇴행성 장애를 갖는 개체의 뇌에서 발견된다. 신경반은 주로 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 신경독성 및 고도 집합성 펩티드 단편인 아밀로이드 β (Aβ) 펩티드로 구성되어 있다. Aβ 펩티드는 APP를 β-세크레타제 (BACE)로 단백질 가수분해한 다음, γ-세크레타제로 하나 이상의 후속 C-말단 절단함으로써 형성된다. 따라서, γ-세크레타제의 억제는 알츠하이머병 뿐만 아니라 아밀로이드반을 특징으로 하는 다른 질환의 치료 또는 예방을 위한 관심 표적이다. 알츠하이머병 및 다른 장애의 치료에 유용한 것으로 교시된 γ-세크레타제 억제제는 당업계에 공지되어 있다 (WO 98/28268 및 WO 04/080983). 본 발명은 추가의 γ-세크레타제 억제제를 제공한다. 본 발명의 특정 화합물은 바람직한 치료 지수(therapeutic index)를 나타낸다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서,

R¹은 히드록시 또는 플루오로이고;

R²는 C₁-C₄ 알킬이고;

R³은 수소 또는 페닐이고;

R⁴는 수소, 페닐 또는 C₁-C₄ 알킬이고;

R⁵는 수소 또는 페닐이며;

단, R³, R⁴ 및 R⁵ 중 하나는 수소 이외의 것이고, 다른 둘은 수소이다.

또다른 실시양태에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 및 제약상 허용되는 희석제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 약제로서의 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

하나의 방법면에서, 본 발명은 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 아밀로이드 β 펩티드를 감소시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아밀로이드 β 단백질을 감소시키기 위한 의약의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

특정 방법 실시양태에서, 본 발명은 알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 알츠하이머병을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 알츠하이머병 진행의 예방 또는 억제를 필요로 하는 환자에게 유효량의 화학식 I의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병의 진행을 예방 또는 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 알츠하이머병의 진행을 예방 또는 억제하기 위한 의약의 제조에 있어서 화학식 I의 화합물의 용도를 제공한다.

상기 화학식에서 사용된 일반적인 화학 용어는 그의 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들어, 용어 "C₁-C₄ 알킬"은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸 및 tert-부틸을 포함한다.

용어 "질소 보호기"는, 계획된 반응 조건에 안정하지만 재생성된 아민과 상용성인 시약 및 반응 조건에 의해 선택적으로 제거될 수 있는 잔기를 의미하는 것으로 여겨진다. 이러한 기는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Chapter 7, John Wiley and Sons Inc., (1999)] 참조). 고려된 질소 보호기는 적합한 카르바메이트, 예컨대 tert-부톡시카르보닐을 포함한다.

당업자는 화학식 I의 모든 화합물이 하기 구조에서 "*"로 표시된 3개 이상의 키랄 중심을 갖는다는 것을 이해할 것이다.

본 발명이 모든 개별 부분입체이성질체 뿐만 아니라 상기 화합물의 부분입체이성질체의 혼합물 (라세미체 포함)을 고려하지만, 화학식 I의 화합물에 대한 바람직한 부분입체이성질체는 하기 화학식 i에 예시된 것이다.

<화학식 i>

화학식 I의 화합물은 γ-세크레타제의 유용한 억제제이지만, 화합물의 특정 유형이 바람직하다. 하기 문단에서 이러한 바람직한 유형을 기재한다:

a) R¹이 히드록시임;

b) R²가 메틸임;

c) R⁴가 수소 또는 페닐임;

d) R⁴가 페닐임;

e) R²가 메틸이고, R⁴가 페닐인 화학식 I의 화합물;

f) R¹이 히드록시이고, R²가 메틸이고, R⁴가 페닐인 화학식 I의 화합물; 및

g) 하기 화학식 ii의 화합물:

<화학식 ii>

화학식 I의 화합물은 γ-세크레타제의 억제제이다. 따라서, 본 발명은 또한 γ-세크레타제의 억제를 필요로 하는 포유동물에게 γ-세크레타제 억제량의 화학식 I의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 γ-세크레타제를 억제하는 방법을 제공한다. 화학식 I의 화합물의 투여에 의해 치료될 포유동물은 인간인 것이 바람직하다.

γ-세크레타제의 억제제로서, 본 발명의 화합물은 A-β 펩티드의 생산을 억제하는데 유용하므로, 과잉의 Aβ 펩티드 수준으로 인한 장애의 치료에 유용하다. 따라서, 화학식 I의 화합물은 알츠하이머병, 경도 인지 장애, 다운 증후군, 네덜란드형 아밀로이드증을 수반한 유전성 뇌출혈, 대뇌 아밀로이드 혈관병증, 다른 퇴행성 치매, 예컨대 혼합된 혈관 및 퇴행성 기원의 치매, 파킨슨병과 관련된 치매, 진행성 핵상 마비와 관련된 치매, 피질 기저 변성과 관련된 치매, 및 미만성 루이 소체형 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 유용한 것으로 생각된다.

본 발명의 화합물은 다양한 절차에 의해 제조될 수 있으며, 이들 중 일부는 하기 반응식에 예시되어 있다. 당업자는 화학식 I의 화합물을 제공하기 위해 하기 반응식에서의 개별 단계가 변할 수 있음을 인식할 것이다. 화학식 I의 화합물을 제조하는데 필요한 단계의 특정 순서는 합성될 특정 화합물, 출발 화합물, 및 치환된 잔기의 상대적 적응성에 좌우된다. 또한, 개별 이성질체, 거울상이성질체 또는 부분입체이성질체는 화학식 I의 화합물의 합성 중 임의의 편리한 시점에서 분리될 수 있다.

화학식 I의 화합물은 하기 반응식에 기재된 바와 같이 제조될 수 있으며, 여기서 변수 R², R³, R⁴ 및 R⁵는 상기 정의된 바와 같고, 변수 Pg는 질소 보호기이다.

<반응식 I>

아민 (a)를 당업자에게 널리 공지된 표준 아미드 형성 조건 하에 반응시켜 아미드 (b)를 얻는다. 적합하게 질소-보호된 알라닌, 예를 들어 N-(tert-부톡시카르보닐)-알라닌 또는 이의 동등물, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 카르복실레이트 염을 적합한 용매, 예컨대 디클로로메탄, 디메틸포름아미드 (DMF) 또는 테트라히드로푸란 (THF)에서 펩티드 커플링제, 예컨대 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 또는 n-프로필포스폰산 무수물, 및 적절한 아민, 예컨대 N-메틸모르폴린, 디이소프로필에틸아민 또는 트리에틸아민과 반응시켜 아미드 (b)를 얻는다. 필요하다면, 첨가제, 예컨대 4-(디메틸아미노)피리딘 및/또는 1-히드록시벤조트리아졸 또는 이의 동등물을 반응 혼합물에 첨가하여 반응을 촉진시킬 수 있다. 별법으로, 아실화제를 비롯한 다른 카르복실산 동등물, 예컨대 적절한 아실이미다졸 또는 적절한 산 할라이드를 아민 (a)와 직접 반응시켜 목적하는 아미드 (b)를 얻을 수 있다. 이어서, 아미드 (b)를 당업자에게 널리 공지된 조건 하에 탈보호시킨다 (예를 들어, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Third Edition, Chapters 2 and 7, John Wiley and Sons Inc., (1999)] 참조). 이어서, 이렇게 생성된 아민을 상기 기재된 표준 아미드 커플링 조건 하에 2-히드록시이소발레르산 또는 2-플루오로이소발레르산과 반응시켜 화학식 I의 화합물을 얻는다.

필수 아민 (a)는 하기 반응식에 기재된 바와 같이 제조할 수 있으며, 여기서 변수 R², R³, R⁴ 및 R⁵는 상기 정의된 바와 같고, X는 -NR_aR_b 또는 -OR_a이고, 변수 R_a 및 R_b는 독립적으로 C₁-C₄ 알킬이다.

<반응식 II>

적절하게 치환된 니트로벤젠 (c)를 밀봉 튜브 내 승온에서 적절한 아민 및 인 트리아미드와 반응시켜 X가 -NR_aR_b인 중간체 (d)를 얻거나, 또는 밀봉 튜브 내 승온에서 적절한 C₁-C₄ 알콜 및 트리알킬포스핀과 반응시켜 X가 -OR_a인 중간체 (d)를 얻는다. 이어서, 중간체 (d)를 물과 반응시켜 락탐 (e)를 얻는다. 이어서, 이 락탐을 표준 조건 하에, 예를 들어 칼륨 tert-부톡시드 또는 세슘 카르보네이트와 같은 적합한 염기의 존재 하에 알킬 할라이드와 반응시켜 N-알킬화함으로써 N-알킬화 락탐 (f)를 제조한다. 락탐 (f)를 칼륨 tert-부톡시드와 같은 적합한 염기와 반응시킨 후 이소아밀 니트라이트와 반응시켜 필수 아민 잔기를 도입함으로써 옥심 (g)를 얻을 수 있다. 이어서, 이러한 옥심을 표준 조건 하에, 예를 들어 아세트산 중 아연 분말과 반응시켜 환원시킴으로써 목적하는 아민 (a)를 얻는다.

제조 1

디에틸-(5-페닐-3H-아제핀-2-일)-아민

4-니트로-비페닐 (26.35 g, 132.3 mmol), 디에틸아민 (137.0 mL, 1.32 mol) 및 헥사에틸인 트리아미드 (72.6 mL, 265.0 mmol)의 혼합물을 2개의 압력 튜브 사이에 분할하였다. 튜브를 밀봉하고, 내용물을 16시간 동안 120 내지 125℃로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 압력 튜브의 내용물을 합하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 물 (2 x 100 mL)로 세척하였다. 수성 불용성 물질을 디클로로메탄으로 희석하고, 물 (100 mL)로 세척하고, 1 N HCl (2 x 150 mL)로 추출하였다. 수성 산 층을 디클로로메탄 (3 x 200 mL)으로 세척하였다. 수성 산 층을 NaOH 펠렛을 이용하여 알칼리성 (pH 12)으로 만들고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기 층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 소량의 헥사에틸포스포르아미드로 오염된 짙은 갈색 유성 고체로서 표제 중간체 6.89 g (22％)을 수득하였다. 산 층으로부터의 디클로로메탄 세척물을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 대략 66％의 헥사에틸포스포르아미드 및 34％의 HCl 염으로서의 표제 중간체로 이루어진 짙은 갈색 액체 80 g을 수득하였다. 이 물질을 디클로로메탄 (100 mL)으로 희석하고, 1 N HCl (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 수성 층을 NaOH 펠렛을 이용하여 알칼리성 (pH 13)으로 만들고, 디클로로메탄 (2 x 300 mL)으로 추출하였다. 합한 유기 층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 대략 30％ 헥사에틸포스포르아미드로 오염된 짙은 갈색 결정으로서 표제 중간체 18.81 g을 수득하였다. 표제 화합물을 추가 정제 없이 다음 반응으로 전달하였다.

MS: (m/z) = 241.2 (M+1).

하기 화합물을 본질적으로 제조 1의 방법에 의해 제조하였다.

제조	화합물	MS (m/z)
2	디에틸-(5-이소프로필-3H-아제핀-2-일)-아민	207.3 (M+1)
3	디에틸-(4-페닐-3H-아제핀-2-일)-아민과 디에틸-(6-페닐-3H-아제핀-2-일)-아민의 혼합물	-

제조 4

5-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온

조 디에틸-(5-페닐-3H-아제핀-2-일)-아민 (12.47 g)을 물 (10.0 mL) 및 2-메톡시-에탄올 (40.0 mL)에 첨가하고, 생성된 혼합물을 환류로 가열하고, 4½일 교반하였다. 휘발성 물질을 진공 하에 제거하고, 잔류물을 디클로로메탄으로 희석하고, 0.1 N HCl (2 x 200 mL) 및 포화 수성 NaHCO₃ (2 x 200 mL)으로 세척하였다. 유기 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜, 짙은 갈색 고체로서 조 표제 화합물 (9.63 g)을 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 다음 반응으로 전달하였다.

MS: (m/z) = 186.1 (M+1).

하기 화합물을 본질적으로 제조 4의 방법에 의해 제조하였다.

제조	화합물	MS (m/z)
5	5-이소프로필-1,3-디히드로-아제핀-2-온	152.1 (M+1)
6	4-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온과 6-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온의 혼합물	-

제조 7

2-부톡시-5-페닐-3H-아제핀

22 리터 반응 플라스크에 가열 맨틀, 오버헤드 교반 장치, 응축기, 첨가 깔대기, 온도계 탐침기 및 질소 입구/출구를 장착하였다. 플라스크를 질소로 철저히 퍼징하고, 반응 전반에 걸쳐 질소 하에 유지하였다. 플라스크에 4-니트로비페닐 (1700 g, 8.53 mol) 및 1-부탄올 (3793 g, 51.2 mol)을 충전시켰다. 생성된 혼합물을 환류로 가열하여 맑은 용액을 형성하였다. 트리부틸포스핀 (3500 g, 17.3 mol)을 첨가 깔대기에 충전시키고, 고온 4-니트로비페닐 용액에 적가하였다. 온도는 환류를 유지하는데 필요한 만큼 점차적으로 증가하였다. 반응을 기체 크로마토그래피 분석에 의해 완료되었는지 모니터링하였다. 반응물을 냉각시키고, 물 (500 mL)을 첨가하였다. 반응물을 오일로 농축시킨 후, 석유 에테르 (8.0 L)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 -40℃로 냉각시키고, 여과하여, 목적하지 않은 트리부틸포스핀 옥시드를 제거하였다. 여액을 다시 농축시키고, 석유 에테르 (8.0 L)를 첨가하였다. 혼합물을 냉각시키고, 여과하였다. 생성된 여액을 오일로 농축시키고, 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표제 화합물 (908 g, 44％)을 수득하였다.

MS: (m/z) = 242.1 (M+1).

제조 8

5-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온

2-부톡시-5-페닐-3H-아제핀 (908 g, 3.42 mol)을 2B-3 에탄올 (8172 mL) 및 탈이온수 (2724 mL)에 용해시켰다. 용액을 오토클레이브에 충전시키고, 20시간 동안 150℃로 가열하였다. 용액을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류 물을 톨루엔 (2 x 2 L)으로부터 공비 증류에 의해 제거하였다. 잔류 고체를 톨루엔 (1.7 L)에 용해시키고, 95 내지 100℃로 가열하였다. 용액을 90℃ 미만으로 냉각시키고, 헵탄 (약 4.8 mL/g)을 첨가하였다. 용액을 실온으로 냉각시킨 다음, 빙조를 사용하여 0 내지 5℃로 냉각시켰다. 고체를 여과하고, 헵탄으로 세척하고, 건조시켜, 옅은 갈색 고체로서 표제 화합물 (559 g, 88％)을 수득하였다.

MS(EI): (m/z) = 185.1.

제조 9

1-메틸-5-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온

5-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온 (168.5 g, 911.3 mmol)을 테트라히드로푸란 (1300 mL)과 합하고, 용액을 약 -30℃로 냉각시켰다. 칼륨 tert-부톡시드 (107.4 g, 956.9 mmol)를 한번에 첨가하였다. 발열이 관찰되고, 반응 내용물이 -12℃로 가온되었다. 발열이 잠잠해졌을 때, 내용물을 -25℃로 재냉각시키고, 요오도메탄 (113.5 mL, 1.823 mol)을 첨가하여 약간의 발열이 일어났다. 반응 내용물을 실온으로 가온하고, 교반하였다. 10시간 후, 반응 혼합물을 메틸 tert-부틸 에테르 (1300 mL)로 희석하고, 포화 염화암모늄 용액 (2 x 250 mL), 물 및 포화 염화나트륨 수용액으로 추출하였다. 합한 수성 층을 다시 메틸 tert-부틸 에테르 (200 mL)로 추출하였다. 메틸 tert-부틸 에테르 추출물을 합하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하였다. 용액을 회전식 증발을 통해 농축시켜 갈색 분말 잔류물로서 표제 화합물 (185 g, 100％)을 수득하였다. 물질을 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다.

하기 화합물을 본질적으로 제조 9의 방법에 의해 제조하였다.

제조	화합물	MS (m/z)
10	5-이소프로필-1-메틸-1,3-디히드로-아제핀-2-온	166.2 (M+1)
11	1-메틸-4-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온	정확한 질량: 계산치: 200.1075, 실측치: 200.1058
12	1-메틸-6-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온	정확한 질량: 계산치: 200.1075, 실측치: 200.1077

제조 13

1-메틸-5-페닐-1H-아제핀-2,3-디온 3-옥심

1-메틸-5-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온 (183 g, 918.4 mmol)을 테트라히드로푸란 (1500 mL)과 합하고, 용액을 -25℃ 내지 -30℃로 냉각시켰다. 이소아밀 니트라이트 (148.1 mL, 1.102 mol)를 첨가한 후, 칼륨 tert-부톡시드 (108.2 g, 964.4 mmol)를 첨가하여, 약 -5℃로 발열이 일어났다. 용액을 -10℃로 재냉각시킨 다음, 실온으로 서서히 가온하였다. 반응 내용물을 밤새 교반하였다. 반응 내용물을 3 N 수성 HCl (300 mL)로 희석하여 pH 약 2가 되었다. 이어서, 메틸 tert-부틸 에테르 (4 L)로 희석하고, 내용물을 0.5 내지 1.0 N HCl (2 x 600 mL) 및 포화 수성 염화나트륨으로 세척하였다. 짙은 유기 층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 테트라히드로푸란으로 습윤된 잔류물을 얻었다. 잔류물을 시클로헥산 (300 mL)으로 희석하고, 농축시켜, 조 잔류물 약 275 g을 얻고, 이를 메틸 tert-부틸 에테르 (450 mL) 및 시클로헥산 (1000 mL)에 슬러리화하였다. 슬러리를 약 40℃로 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 여과하고, 시클로헥산으로 헹구었다. 40℃에서 진공 건조시켜 갈색 분말로서 표제 화합물 (169 g, 81％)을 수득하였다.

하기 화합물을 본질적으로 제조 13의 방법에 의해 제조하였다.

제조	화합물 명칭	MS (m/z)
14	5-이소프로필-1-메틸-1H-아제핀-2,3-디온-3-옥심	195.1 (M+1)
15	1-메틸-6-페닐-1H-아제핀-2,3-디온 3-옥심	정확한 질량: 계산치: 229.0977, 실측치: 229.0975
16	1-메틸-4-페닐-1H-아제핀-2,3-디온 3-옥심	정확한 질량: 계산치: 229.0977, 실측치: 229.0980

제조 17

3-아미노-1-메틸-5-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온

1-메틸-5-페닐-1H-아제핀-2,3-디온 3-옥심 (25 g, 109 mmol)을 아세트산 (80 mL), 메탄올 (80 mL) 및 물 (40 mL)과 합하고, 슬러리를 약 5℃로 냉각시켰다. 아연 분말 (29.81 g, 436 mmol)을 여러번 나누어 첨가하였다. 반응 내용물을 다시 실온으로 냉각시켰다. 2시간 후, 반응 내용물을 셀라이트(Celite)^® 패드 상에서 여과하고, 메탄올로 헹구었다. 메탄올의 대부분이 제거될 때까지 여액을 회전식 증발을 통해 농축시켰다. 이어서, 유성 자색 용액을 디클로로메탄 (200 mL)으로 희석하여 일부 중간체 침전물이 생성되었다. 진한 슬러리를 여과하여 백색 분말로서 아연 아세테이트를 제거하였다. 생성된 자색 여액을 디클로로메탄 (200 mL)으로 더 희석하고, 수산화암모늄 용액 (2 x 100 mL)으로 추출하였다. 유기 추출물을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 자색 오일 21.5 g (92 ％)을 수득하였다. 온 에틸 아세테이트 (200 mL)로 희석시, 미세 침전물이 관찰되었고, 이를 여과에 의해 제거하였다. 남아있는 에틸 아세테이트 용액을 기체 염화수소 (약 5 g, 137 mmol)로 처리하여 초기에 진한 슬러리를 얻었으며, 이는 염화수소를 전부 첨가하였을 때 묽어졌다. 슬러리를 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 내용물을 여과하고, 45℃에서 진공 건조시켜, 갈색 분말로서 표제 중간체의 HCl 염 (22.9 g, 94％)을 수득하였다. HCl 염 22.9 g을 150 mL의 1 N 수산화나트륨 및 디클로로메탄으로 처리하였다. 층을 분리하고, 디클로로메탄 층을 포화 중탄산나트륨 용액으로 더 세척하였다. 이어서, 디클로로메탄 용액을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜, 적갈색 오일로서 표제 화합물 19.6 g을 수득하였다.

하기 화합물을 본질적으로 제조 17의 방법에 의해 제조하였다.

제조	화합물	MS (m/z)
18	3-아미노-5-이소프로필-1-메틸-1,3-디히드로-아제핀-2-온	181.1 (M+1)
19	3-아미노-1-메틸-4-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온	정확한 질량 (나트륨 염): 계산치: 237.1004, 실측치: 237.1001
20	3-아미노-1-메틸-6-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온	정확한 질량: 계산치: 214.1106, 실측치: 214.1105

제조 21

(S)-[1-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르

3-아미노-1-메틸-5-페닐-1,3-디히드로-아제핀-2-온 (330 g, 1.54 mol)을 디클로로메탄 (3 L), N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닌 (291.4 g, 1.54 mol) 및 히드록시벤조트리아졸 수화물 (259.5 g, 1.617 mol)과 합하였다. 용액을 약 10℃로 냉각시켰다. 이 용액에 디이소프로필에틸아민 (335.4 mL, 1.925 mol), 이어서 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (310.1 g, 1.617 mol)를 첨가하고, 내용물을 실온으로 점차적으로 가온하였다. 3.5시간 후, 반응 내용물을 물 (1000 mL)에 붓고, 층을 분리하였다. 유기 층을 물 (1000 mL), 0.1 N HCl (1000 mL), 포화 NaHCO₃ 용액 (1000 mL) 및 최종적으로 포화 염화나트륨 수용액으로 더 세척하였다. 디클로로메탄 층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전식 증발을 통해 농축시켜, 황갈색 포말로서 표제 화합물 (약 574 g, 97％)을 수득하였다. 물질은 다음 단계에 직접 사용하기에 충분한 순도였다.

하기 화합물을 본질적으로 제조 21의 방법에 의해 제조하였다.

제조	화합물	MS (m/z)
22	[(S)-1-(5-이소프로필-1-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르	352.1 (M+1)
23	[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-4-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르	정확한 질량 (나트륨 염): 계산치: 408.1899, 실측치: 408.1896
24	[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르	정확한 질량: 계산치: 386.2080, 실측치: 386.2073

제조 25

(S)-2-아미노-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일)-프로피온아미드

-5℃에서 냉각된 트리플루오로아세트산 용액 (800 mL)에 디클로로메탄 (2 L) 중 (S)-[1-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-카르밤산 tert-부틸 에스테르 (564 g, 1.46 mol)의 용액을 첨가 깔대기를 통해 첨가하였다. 반응 내용물을 0℃에서 2시간 동안 교반하였으며, 이 시점에서 반응 분취액은 단지 미량의 출발 물질이 남아있음을 나타내었다. 반응 내용물을 회전식 증발을 통해 농축시키고, 디클로로메탄으로 재희석하고, 재농축시켜, 시럽을 얻었다. 시럽 오일을 디클로로메탄 (2 내지 3 L)으로 희석하고, 10％ 탄산나트륨 용액 (2 L)에 첨가하였다. 추가의 10％ 탄산나트륨 용액 (2 L)이 수성 층의 염기성 pH를 만드는데 필요하였다. 층을 분리하고, 수성 층을 디클로로메탄 (600 mL)으로 재추출하였다. 이어서, 합한 유기 층을 포화 중탄산나트륨 (1000 mL)으로 추출하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전식 증발을 통해 농축시켜, 유성 포말로서 표제 중간체 (약 435 g)를 수득하였으며, 이의 대략 406 g (97％)이 표제 화합물이었다.

하기 화합물을 본질적으로 제조 25의 방법에 의해 제조하였다.

제조	화합물	MS (m/z)
26	(S)-2-아미노-N-(5-이소프로필-1-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일)-프로피온아미드	252.1 (M+1)
27	(S)-2-아미노-N-(1-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일)-프로피온아미드 히드로클로라이드	정확한 질량: 계산치: 286.1556, 실측치: 286.1558
28	(S)-2-아미노-N-(1-메틸-2-옥소-4-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일)-프로피온아미드 히드로클로라이드	정확한 질량: 계산치: 286.1556, 실측치: 286.1548

제조 29

(S)-2-플루오로-3-메틸-부티르산

3-갤런 날진(Nalgene)^® 용기에 트리에틸아민 트리-히드로플루오라이드 (4.06 L, 25.1 mol), (S)-2-아미노-3-메틸-부탄산 (147.9 g, 1.26 mol) 및 아질산나트륨 (113 g, 1.64 mol)을 충전시켰다. 실온에서 12 내지 15시간 교반하였다. 날진^® 용기에 냉수 (5 L) 및 디에틸 에테르 (7 L)를 부었다. 교반한 다음, 층을 분리하였다. 유기 상을 물 (3 L)로 세척하였다. 합한 수성 층을 디에틸 에테르 (3 L)로 추출하였다. 합한 유기 층을 물 (3 L), 이어서 포화 수성 중탄산나트륨으로 세척하였다. 포화 수성 중탄산나트륨 층의 pH를 1 N 황산을 사용하여 pH 4 미만으로 조정하였다. 디에틸 에테르 (2 x 2 L)로 추출하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 조 온도가 30℃를 초과하지 않도록 하면서 회전식 증발에 의해 감압 하에 농축시켜, 약 85 내지 90％ 순도 및 약 60％의 거울상이성질체 잉여를 갖는 오일로서 표제 화합물 60 g을 수득하였다.

제조 30

(S)-2-플루오로-3-메틸-부티르산의 거울상이성질체 잉여 풍부

2-플루오로-3-메틸부티르산 (~235.5 g, 1.96 mol)을 에틸 아세테이트 (2.9 L)에 녹이고, R-(+)-α-메틸벤질아민 (237.5 g, 1.96 mol)을 첨가 깔대기를 통해 적가하였다. 40℃로의 온도 증가가 관찰되었다. 용액을 냉각시키자, 슬러리가 생성되었고, 이를 실온에서 45분 동안 교반하였다. 이어서, 슬러리를 여과하고, 여과 케이크를 에틸 아세테이트 (300 mL)로 헹구었다. 습윤 케이크를 에틸 아세테이트 (4.5 L)에 현탁시키고, 환류로 가열하였다. 추가의 에틸 아세테이트 (450 mL)를 첨가하여 용액을 얻은 다음, 용액을 실온에서 밤새 방치하였다. 생성된 슬러리를 여과하고, 여과 케이크를 에틸 아세테이트 (200 mL)로 헹구었다. 여과 케이크를 40℃에서 진공 건조시켜 분말로서 (S)-2-플루오로-3-메틸부티르산의 (R)-+-α-메틸벤질아민 염 262.3 g을 수득하였다. 이 염의 거울상이성질체 잉여는 목적하는 (S) 이성질체에 대해 키랄 모세관 전기영동 분석시 94％ 초과인 것으로 밝혀졌다.

(S)-2-플루오로-3-메틸부티르산의 (R)-+-α-메틸벤질아민 염 (252 g, 1.044 mol)을 1 N 염산 (1472 mL)에 첨가하고, 디에틸 에테르 (2 x 2.5 L)로 추출하였다. 유기 층을 합하고, 1 N 염산 (600 mL)으로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 조 온도가 30℃를 초과하지 않도록 하면서 회전식 증발에 의해 감압 하에 농축시켜, 맑은 오일로서 (S)-2-플루오로-3-메틸부티르산 122 g을 97.2％ 수율로 수득하였다. 산의 거울상이성질체 잉여는 키랄 모세관 전기영동 분석시 96％인 것으로 밝혀졌다.

실시예 1

(S)-2-히드록시-3-메틸-N-[(S)-1-((S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드

(S)-2-아미노-N-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일)-프로피온아미드 (406 g, 1.423 mol)를 디클로로메탄 (3 L)과 합하고, 용액을 0 내지 2℃로 냉각시켰다. 이 용액에 (S)-2-히드록시-3-메틸-부티르산 (168.1 g, 1.423 mol), 히드록시벤조트리아졸 수화물 (239.7 g, 1.565 mol) 및 디이소프로필에틸아민 (310 mL, 1.779 mol)을 첨가하여 약간의 발열이 일어났다. 내용물을 다시 약 4℃로 냉각시키고, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드 (286.5 g, 1.494 mol)를 첨가하였다. 반응 내용물을 실온으로 점차적으로 가온하였다. 4.5시간 (온도 14℃)에서의 고성능 액체 크로마토그래피 분석은 약 5％의 미반응 출발 아민이 존재함을 나타내었다. 추가 1 내지 1.5시간의 교반 후, 반응 내용물을 물 (1000 mL)로 켄칭하고, 층을 분리하였다. 디클로로메탄 층을 물 (1000 mL), 0.1 N HCl (1000 mL), 포화 중탄산나트륨 (1000 mL) 및 최종적으로 포화 수성 염화나트륨으로 더 추출하였다. 이어서, 디클로로메탄 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 회전식 증발을 통해 농축시켜, 황갈색 포말로서 커플링된 생성물의 조 부분입체이성질체 혼합물 (505 g)을 수득하였다. 이성질체를, 키랄팩(Chiralpak)^® AD 컬럼을 사용하며 100％ 메탄올로 용리시키는 키랄 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 이성질체 분획으로부터 용리 용매의 제거시, 첫번째로 용리되는 이성질체 대략 210 g을 황갈색 포말로서 회수하고, 목적하는 이성질체 2에 대해서도 대략 220 g (44％)을 황갈색 분말로서 회수하였다. 두번째로 용리되는 이성질체는 목적하는 (S,S,S)-부분입체이성질체이었다. 표제 화합물 대략 140 g을 아세톤 (1000 mL) 및 물 (95 mL)에 녹였다. 현탁된 입자가 관찰되지 않을 때까지 용액을 회전식 증발기 상에서 가열하였다. 용액을 오버헤드 교반기가 장착된 플라스크에 옮기고, 물 (2750 mL)을 15분에 걸쳐 점차적으로 첨가하였다. 생성된 슬러리를 실온으로 냉각시킨 다음, 여과하고, 케이크를 20％ 아세톤/물 용액 (650 mL)으로 헹구었다. 40℃에서 밤새 진공 건조시킨 후, 표제 화합물 대략 102 g을 회수하였다.

MS (m/z): 386.2 (M+1).

하기 화합물을 본질적으로 실시예 1의 방법에 의해 제조하였다.

실시예	화합물	MS (m/z)
2	(S)-2-플루오로-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드	정확한 질량: 계산치: 388.2036; 실측치: 388.2021
3	(S)-2-히드록시-N-[(S)-1-(5-이소프로필-1-메틸-2-옥소-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-3-메틸-부티르아미드	352.3 (M+1)
4	(S)-2-히드록시-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-4-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드	정확한 질량: 계산치: 386.2080; 실측치: 386.2075
5	(S)-2-히드록시-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드	정확한 질량: 계산치: 386.2080; 실측치: 386.2078
6	(S)-2-플루오로-3-메틸-N-[(S)-1-(1-메틸-2-옥소-6-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드	정확한 질량: 계산치: 388.2037; 실측치: 388.2031

실시예 7

(S)-2-히드록시-3-메틸-N-[(S)-1-((S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드의 절대 배열의 측정

디클로로메탄에 용해된 (S)-2-히드록시-3-메틸-N-[(S)-1-((S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드 (실시예 1, 두번째로 용리되는 분획)의 용액에 n-펜탄을 증기 확산시켜 결정을 성장시켰다. (S)-2-히드록시-3-메틸-N-[(S)-1-((S)-1-메틸-2-옥소-5-페닐-2,3-디히드로-1H-아제핀-3-일카르바모일)-에틸]-부티르아미드의 단결정을 얇은 유리 섬유 상에 탑재하고, -173℃에서 질소 스트림에 함침시켰다. MoKα 방사선 공급원 (λ = 0.71073 Å) 및 SMART 1000CCD 면적 검출기가 장착된 P4 회절계 (브루커(Bruker)-AXS, 미국 위스콘신주 메디슨 소재)를 사용하여 데이타를 수집하였다. SAINT 프로그램 (Sheldrick, GM. SHELXS86, Acta Cryst. A46, 467-473 (1990)을 사용하여 셀 정화(refinement) 및 데이타 환원을 수행하였다. 단위 셀은 사방정계 파라미터 a = 8.010(5) Å, b = 20.345(15) Å, c = 25.513(19) Å을 갖는 것으로 지수화되었다. 결정 구조의 셀 부피는 4157(5) Å³이고, 밀도는 1.232 g/cm³이며, 단위 셀 당 2개의 분자를 가졌다. 구조를 직접적인 방법 (Sheldrick, G.M., SHELXS93, Institute fur anorg chemie, Goettingen, Germany)에 의해 해명하였다. 모든 원자 파라미터를 독립적으로 정화하였다. 공간군 선택, 즉 P2₁2₁2₁을 1.297에서 벗어난 최종 적합도를 갖는 F2 상에서 전체-매트릭스 최소-스퀘어 정화의 성공적인 수렴에 의해 확인하였다. 최종 잔류 인자 R1은 0.1905이고, 최종 정화 주기 후 최대 상이 피크 및 홀은 각각 0.988 및 -0.754 (e.A-3)이었다.

2개의 입체생성 중심은 정의된 입체화학을 갖는 시판용 물질 (제조 21에서의 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-알라닌 및 실시예 1에서의 (S)-2-히드록시-3-메틸-부티르산)의 구입시에 설정되었다. 합성 동안 이들 2개의 입체생성 중심에서 유의한 입체화학 부식의 증거는 존재하지 않으므로, 실시예 1의 두번째로 용리되는 부분입체이성질체에서 (S)로서 제3 입체생성 중심을 정의하는데 결정 구조의 상대적 입체화학을 사용하였다.

실시예 A

β-아밀로이드 생산의 시험관내 억제

β-아밀로이드 생산을 억제하는 화합물의 능력을 스웨덴(Swedish) 돌연변이를 갖는 세포주에서 평가하였다. 이러한 스크리닝 검정은, 국제 특허 출원 공개 번호 94/10569에 기재된 방식으로 Lys₆₅₁Met₆₅₂에서 Asn₆₅₁Leu₆₅₂ (APP751 넘버링)으로의 이중 돌연변이를 함유하는 아밀로이드 전구체 단백질 751 (APP751)에 대한 유전자에 의해 안정하게 감염된 세포 (HEK293 = 인간 신장 세포주)를 사용하였다. 이러한 돌연변이를 통상적으로 스웨덴 돌연변이라 칭하며, "293 751 SWE"로 지명된 세포를 코닝(Corning) 96-웰 플레이트에서 웰 당 2-4 x 10⁴ 개의 세포로 10％ 소태아 혈청을 갖는 둘베코(Dulbecco) 최소 필수 배지 (시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트루이스 소재)에 도말하였다. 검정의 선형 범위 (mL 당 ~0.03 내지 1.0 ng) 내에서 β-아밀로이드 ELISA 결과를 달성하기 위해 세포 수가 중요하였다.

5％ 이산화탄소로 평형화된 인큐베이터 내 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 2시간의 인큐베이션 기간 동안 시험 화합물 원액(stock solution) (웰 당 200 μL)으로 대체하였다. 약물 원액을 100％ 디메틸 술폭시드 중에서 제조하되, 처리에 사용된 최종 약물 농도에서 디메틸 술폭시드의 농도가 0.5％를 초과하지 않고 통상적으로 0.1％와 동등하도록 하였다.

인큐베이션 기간 말기에, 각 웰로부터 100 μL의 컨디셔닝된 배지 또는 그의 적절한 희석액을, 국제 특허 출원 공개 번호 94/10569에 기재된 바와 같은 β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 13-28에 대한 항체 266 (문헌 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] 참조)으로 예비-코팅된 ELISA 플레이트로 옮기고, 4℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, β-아밀로이드 펩티드의 아미노산 1-5에 대한 표지된 항체 3D6 (문헌 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] 참조)을 사용하는 ELISA 검정을 수행하여, 생산된 β-아밀로이드 펩티드의 양을 측정하였다. β-아밀로이드 펩티드 ELISA의 결과를 표준 곡선에 피팅시키고, ng/mL β-아밀로이드 펩티드로서 표현하였으며, β-아밀로이드 펩티드 생산의 50％ 억제를 나타내는 시험 화합물의 농도 (IC₅₀)를 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism) (미국 캘리포니아주 샌디에고) 내의 4개의 파라미터 로지스틱 모델을 사용하여 평가하였다.

세포 단백질 합성에 대한 화합물의 효과는 화합물-처리된 293 751 SWE 세포에서 전체 세포 단백질 내로의 [³⁵S]메티오닌 혼입을 평가하여 측정하였다. 폴리-D-리신-코팅된 시토스타-T(Cytostar-T)^® 마이크로티터 플레이트 (아머샴(Amersham), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)에서 웰 당 2-4 x 10⁴ 개의 293 751 SWE 세포를, 1％ FBS, 20 mM HEPES 및 1μCi [³⁵S]메티오닌 (43.5 TBq/mmol; 뉴 잉글랜드 뉴클리어(New England Nuclear), 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)을 함유하는 메티오닌-무함유 DMEM에서 제조된 다양한 농도의 시험 화합물로 2시간 동안 처리하였다. 시험 화합물과 인큐베이션한 후, 전체 세포 단백질 내로의 [³⁵S]-메티오닌 혼입을 메탄올-고정, PBS-세척된 세포에서 왈락 마이크로베타(Wallac Microbeta) 섬광 계수기 (퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)를 사용하여 측정하였다.

예시된 화합물의 하나 이상의 부분입체이성질체는 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였을 때 1 μM 이하의 IC₅₀을 나타내었다. 하기 화합물을 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였으며, 이들은 하기 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

실시예 ^*	IC ₅₀ (μM)
1 (부분입체이성질체 1)	0.390 ± 0.014 (n = 3)
1 (부분입체이성질체 2)	0.005 ± 0.0007 (n = 3)
2 (부분입체이성질체 1)	3.33 ± 0.43 (n = 3)
2 (부분입체이성질체 2)	0.008 ± 0.0008 (n = 3)
3 (부분입체이성질체 1)	10.7 ± 1.8 (n = 3)
3 (부분입체이성질체 2)	0.036 ± 0.001 (n = 3)
^*본원에 사용된 어구 "부분입체이성질체 1"은 특정 실시예 번호에 의해 나타내어진 화합물의 첫번째로 용리되는 부분입체이성질체를 지칭하며, "부분입체이성질체 2"는 두번째로 용리되는 부분입체이성질체를 지칭한다.

실시예 B

β-아밀로이드 방출 및/또는 합성의 생체내 억제

이 실시예는 β-아밀로이드 방출 및/또는 합성의 생체내 억제에 대해 본 발명의 화합물을 시험할 수 있는 방법을 예시한다. 이들 실험을 위해, 3 내지 4개월령 PDAPP 마우스를 사용하였다 (문헌 [Games et al., (1995) Nature 373:523-527] 참조). 시험될 화합물에 따라, 화합물을 통상 1 내지 10 mg/mL로 제제화하였다. 화합물의 낮은 용해도 인자 때문에, 화합물을 다양한 비히클, 예컨대 옥수수유, 옥수수유 중의 10％ 에탄올, 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 (리서치 바이오케미칼즈 인터내셔날(Research Biochemicals International), 미국 매사추세츠주 나틱 소재), 및 카르복시-메틸-셀룰로스 (시그마 케미칼 코퍼레이션(Sigma Chemical Co.), 미국 미주리주 세인트루이스 소재)와 함께 제제화할 수 있었다.

급성 효능 연구를 위해, PDAPP 마우스에게 위관영양법(gavage)으로 경구 투여하고, 3시간 후 동물을 CO₂ 마취를 통해 안락사시켰다. 아만성 연구를 위해, PDAPP 마우스에게 1일 1회 또는 1일 2회로 7일 동안 투여하고, 마지막 투여 3시간 후 살생시켰다. 1 cc 25G 5/8" 투베르쿨린 주사기/바늘 (0.5 M EDTA 용액 (pH 8.0)으로 코팅됨)을 사용하여 심장 천자에 의해 혈액을 채취하였다. 혈액을 EDTA를 함유하는 벡톤-디킨슨(Becton-Dickinson) 진공시험관에 넣고, 5℃에서 1500 x g로 15분 동안 회전 침강시켰다. 이어서, 마우스의 뇌를 제거하고, 피질 및 해마를 절개하고, 표지된 에펜도르프 튜브에 넣고, 드라이 아이스 상에서 급속 냉동시켰다.

뇌 검정

효소-결합 면역흡수 검정 (ELISA)을 위한 해마 및 피질 조직을 제조하기 위해, 각 뇌 영역을 빙냉 구아니딘 완충액 (5.0 M 구아니딘-HCl, 50 mM 트리스-HCl, pH 8.0) 10 부피에 폴리트론(Polytron)을 사용하여 균질화하였다. 균질액을 실온에서 3 내지 4시간 동안 회전 플랫폼 상에서 서서히 진탕하고, β-아밀로이드의 정량화 전에 -20℃에서 저장하였다.

뇌 균질액을 빙냉 카세인 완충액 [0.25％ 카세인, 포스페이트 완충 식염수 (PBS), 0.05％ 나트륨 아지드, 20 μg/ml 아프로티닌, 5 mM EDTA, pH 8.0, 10 μg/ml 류펩틴]을 사용하여 1:10으로 희석함으로써, 구아니딘의 최종 농도를 0.5 M로 감소시킨 후, 4℃에서 16,000 x g로 20분 동안 원심분리하였다. 필요하다면, 샘플을 더 희석하여, 0.5 M 구아니딘 히드로클로라이드가 첨가된 카세인 완충액의 첨가에 의해 ELISA 측정을 위한 최적 범위를 달성하였다. β-아밀로이드 표준물질 (1-40 또는 1-42 아미노산)은 최종 조성물이 0.1％ 소 혈청 알부민 (BSA)의 존재 하에 0.5 M 구아니딘과 동등하도록 제조하였다.

본질적으로 모든 종의 β-아밀로이드 (β-아밀로이드 1-40 및 β-아밀로이드 1-42 포함)를 정량화하는 전체 β-아밀로이드 1-x 샌드위치 ELISA는 β-아밀로이드에 대한 2종의 모노클로날 항체 (mAb)를 사용하였다. 포획 항체 266 (문헌 [P. Seubert, Nature (1992) 359:325-327] 참조)은 β-아밀로이드의 아미노산 13-28에 특이적이었다. β-아밀로이드의 아미노산 1-5에 특이적인 항체 3D6 (문헌 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94:1550-1555] 참조)을 비오티닐화하고, 검정에서 리포터 항체로서 사용하였다. 3D6 비오티닐화 절차는, 100 mM 중탄산나트륨, pH 8.5 완충액을 사용한다는 것을 제외하고는 이뮤노글로불린의 NHS-비오틴 표지화에 대한 제조자 (피어스(Pierce), 미국 일리노이주 록포드 소재) 프로토콜을 사용하였다. 3D6 항체는 분비된 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 또는 전장 APP를 인식하지 않으며, 단지 아미노 말단 아스파르트산을 갖는 β-아밀로이드 종만을 탐지하였다. 검정은 ~50 pg/ml (11 pM)의 보다 낮은 한계의 민감도를 가지며, 1 ng/ml 이하의 농도에서 내인성 뮤린 β-아밀로이드 펩티드에 대한 상호-반응성을 나타내지 않았다.

β-아밀로이드 (아미노산 1-42) 수준을 정량화하는 샌드위치 ELISA의 구성은 포획 항체로서 mAb 21F12 (문헌 [Johnson-Wood et al., PNAS USA (1997) 94:1550-1555] 참조) (β-아밀로이드의 아미노산 33-42를 인식함)를 사용하였다. 비오티닐화 3D6은 또한 ~125 pg/ml (28 pM)의 보다 낮은 한계의 민감도를 갖는 이 검정에서 리포터 항체였다.

266 및 21F12 포획 mAb를 실온에서 밤새 96-웰 면역검정 플레이트 (코스타(Costar), 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)로 10 μg 코팅하였다. 이어서, 플레이트를 흡인하고, 실온에서 1시간 이상 동안 PBS 완충액 중 0.25％ 인간 혈청 알부민으로 블로킹한 다음, 사용시까지 4℃에서 건조 저장시켰다. 플레이트를 사용 전까지 세척 완충액 (트리스-완충 식염수, 0.05％ 트윈 20)로 재수화시켰다. 샘플 및 표준물질을 플레이트에 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 플레이트를 검정의 각 단계 사이에 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 카세인 인큐베이션 완충액 (0.25％ 카세인, PBS, 0.05％ 트윈 20, pH 7.4) 중에 0.5 μg/ml로 희석된 비오티닐화 3D6을 실온에서 1시간 동안 웰에서 인큐베이션하였다. 카세인 인큐베이션 완충액 중 1:4000으로 희석된 아비딘-HRP (벡터(Vector), 미국 캘리포니아주 불링게임 소재)를 실온에서 1시간 동안 웰에 첨가하였다. 측색 기질 슬로우 TMB-ELISA (피어스, 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)를 첨가하고, 15분 동안 반응시킨 후, 2 N H₂SO₄를 첨가하여 효소 반응을 중단시켰다. 반응 생성물을, 450 nm 및 650 nm에서의 흡광도 차이를 측정하는 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices) Vmax (몰레큘라 디바이시즈, 미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)를 사용하여 정량화하였다.

실시예 1의 화합물 (두번째로 용리되는 부분입체이성질체)을 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였으며, 이들은 하기 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.

해마 전체 A-베타 감소^*
투여량 ( mg / kg )	감소율 (％) ^**
0.1	18％ (n = 1)
0.3	31 ± 13％ (n = 2)
1	48 ± 11％ (n = 3)
3	59 ± 5％ (n = 5)
10	69％ (n = 1)
^어린 (8 내지 13주령) 이형 PDAPP 마우스; 경구 투여; 투여 후 3시간에 살생. ^*평균 ± 표준 편차 (1-5 실험의 n, 각각 n은 투여 당 6 내지 8 마리의 마우스)

혈액 검정

EDTA 혈장을 시편 희석액 (0.2 gm/l 나트륨 포스페이트·H₂O (일염기성), 2.16 gm/l 나트륨 포스페이트·7H₂O (이염기성), 0.5 gm/l 티메로살, 8.5 gm/l 염화나트륨, 0.5 ml 트리톤 X-405, 6.0 g/l 글로불린-무함유 소 혈청 알부민, 및 물)에 1:1로 희석하였다. 시편 희석액 중 샘플 및 표준물질을, 뇌 검정에 대해 상기 기재된 전체 β-아밀로이드 검정 (266 포획/3D6 리포터)을 사용하여 검정하되, 기재된 카세인 희석액 대신에 시편 희석액을 사용하였다.

실시예 1의 화합물 (두번째로 용리되는 부분입체이성질체)을 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 시험하였으며, 이는 3 mg/kg의 투여량 (7일 동안 b.i.d.)에서 혈장 A-베타를 54％ 감소시키는 것 (비히클 대조군에 비해 p < 0.001)으로 밝혀졌다.

또한, 당업자는 현재 알츠하이머병에 걸린 환자를 치료하거나 알츠하이머병이 발전될 위험에 있는 환자를 예방적으로 치료함으로써 알츠하이머병에 영향을 줄 수 있음을 인식한다. 따라서, 용어 "치료" 및 "치료하는"는 알츠하이머병의 진행을 늦추거나, 방해하거나, 저지하거나, 제어하거나 또는 중단시킬 수 있는 모든 방법을 지칭하는 것으로 의도되지만, 반드시 모든 증상의 전체 제거를 나타내는 것은 아니다. 따라서, 본 방법은 알츠하이머병이 발전될 위험에 있는 환자에서 알츠하이머병의 개시를 예방하고, 알츠하이버명의 진행을 억제하고, 진전된 알츠하이머병을 치료하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "유효량"의 화학식 I의 화합물은 환자에서 Aβ 펩티드 수준을 낮추는데, 특히 알츠하이머병을 치료하는데 유효한 양을 지칭한다.

본 발명의 화합물의 경구 투여가 바람직하다. 그러나, 경구 투여가 유일한 경로 또는 심지어 유일한 바람직한 경로는 아니다. 예를 들어, 경피 투여는 대체로 경구 의약을 복용하는, 건망증이 있거나 화를 잘내는 환자에게 매우 바람직할 수 있으며, 정맥내 경로가 편리한 수단으로서 바람직하거나 또는 경구 투여와 관련된 잠재적 합병증을 방지하기 위해 바람직할 수 있다. 화학식 I의 화합물은 또한 특정 상황에서 경피, 근육내, 비내 또는 직장내 경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로는 임의의 방식으로 변할 수 있으며, 약물의 물성, 환자 및 간호인의 편리함, 및 다른 관련 상황에 의해 제한될 수 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Co. (1990)] 참조).

제약 조성물은 제약 업계에 널리 공지된 방식으로 제조된다. 담체 또는 부형제는 활성 성분을 위한 비히클 또는 매체로서의 역할을 할 수 있는 고체, 반고체 또는 액체 물질일 수 있다. 적합한 담체 또는 부형제는 당업계에 널리 공지되어 있다. 제약 조성물은 경구, 흡입, 비경구 또는 국소 사용에 적합화될 수 있으며, 정제, 캡슐, 에어로졸, 흡입제, 좌제, 용액, 현탁액 등의 형태로 환자에게 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물은 경구로, 예를 들어 비활성 희석제와 함께 또는 캡슐로 또는 정제로 압축되어 투여될 수 있다. 경구 치료 투여의 목적을 위해, 화합물은 부형제와 함께 포함되며, 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서제, 현탁액, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 형태로 사용될 수 있다. 이들 제제는 활성 성분인 본 발명의 화합물을 4％ 이상 함유하여야 하지만, 특정 형태에 따라 변할 수 있으며, 편리하게는 단위 중량의 4％ 내지 약 70％일 수 있다. 조성물에 존재하는 화합물의 양은 적합한 투여량이 얻어지도록 하는 양이다. 본 발명의 바람직한 조성물 및 제제는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다.

정제, 환제, 캡슐, 트로키제 등은 또한 1종 이상의 하기 보조제를 함유할 수 있다: 결합제, 예컨대 포비돈, 히드록시프로필 셀룰로스, 미결정질 셀룰로스 또는 젤라틴; 부형제 또는 희석제, 예컨대 전분, 락토스, 미결정질 셀룰로스 또는 디칼슘 포스페이트, 붕해제, 예컨대 크로스카르멜로스, 크로스포비돈, 나트륨 전분 글리콜레이트, 옥수수 전분 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 탈크 또는 경화 식물성유; 활택제, 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 습윤제, 예컨대 나트륨 라우릴 술페이트 및 폴르소르베이트 80; 및 감미제, 예컨대 수크로스, 아스파르탐 또는 사카린이 첨가될 수 있거나 또는 향미제, 예컨대 페퍼민트, 메틸 살리실레이트 또는 오렌지 향미제. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질 이외에, 액체 담체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 지방유를 함유할 수 있다. 다른 투여 단위 형태는 예를 들어 코팅으로서, 투여 단위의 물리적 형태를 개질시키는 다른 다양한 물질을 함유할 수 있다. 따라서, 정제 또는 환제는 당, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 폴리메타크릴레이트 또는 다른 코팅제로 코팅될 수 있다. 시럽은 본 발명의 화합물 이외에 감미제로서 수크로스 및 특정 보존제, 염료 및 착색제 및 향미제를 함유할 수 있다. 이들 다양한 조성물의 제조에 사용된 물질은 사용된 양에서 제약상 순수하며 비독성이어야 한다.

화학식 I의 화합물은 일반적으로 폭넓은 투여량 범위에서 유효하다. 예를 들어, 1일 투여량은 통상 체중 kg 당 약 0.001 내지 약 30 mg의 범위에 속한다. 일부 경우에서, 상기 언급된 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 보다 적합할 수 있지만, 다른 경우에서는 훨씬 더 많은 투여량이 치료 정지에 필요한 충분한 부작용을 일으키지 않으면서 사용될 수 있으므로, 상기 투여량 범위는 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것을 의도하지 않는다. 실제 투여되는 화합물의 양은 치료될 상태, 선택되는 투여 경로, 실제 투여되는 화합물(들), 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 및 환자 증상의 중증도를 비롯한 관련 상황에 비추어 의사가 결정할 것이다.

Claims

하기 화학식 I의 화합물.
<화학식 I>

상기 식에서,
R¹은 히드록시 또는 플루오로이고;
R²는 C₁-C₄ 알킬이고;
R³은 수소 또는 페닐이고;
R⁴는 수소, 페닐 또는 C₁-C₄ 알킬이고;
R⁵는 수소 또는 페닐이며;
단, R³, R⁴ 및 R⁵ 중 하나는 수소 이외의 것이고, 다른 둘은 수소이다.
제1항에 있어서, R⁴가 수소 또는 페닐인 화합물.
제1항 또는 제2항에 있어서, R⁴가 페닐인 화합물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R¹이 히드록시이고, R²가 메틸인 화합물.
하기 화학식의 화합물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물 및 제약상 허용되는 희석제를 포함하는 제약 조성물.
약제로서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
알츠하이머병을 치료하는데 유용한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
알츠하이머병의 진행을 억제하는데 유용한 의약의 제조에 있어서 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
알츠하이머병의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 방법.
알츠하이머병 진행의 억제를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화합물을 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병 진행의 억제 방법.