KR20100014593A - 하프니아 파이타제 - Google Patents

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KR20100014593A
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polypeptides
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소렌 플렌스테드 라센
카르스텐 쇼홀름
라스 코베로에 스코브
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노보자임스 에이/에스
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Abstract

본 발명은 파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 유래의 파이타제에 관련되며, 이것의 아미노산 서열은 첨부한 서열 목록에 SEQ ID NO: 10로서 나타나 있다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체, 벡터 및 숙주 세포, 그리고 폴리펩티드의 제조방법 및 특히 동물 사료에서의 사용방법에 관한 것이다.
파이타제, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 하프니아 알베이

Description

하프니아 파이타제{HAFNIA PHYTASE}
(서열 목록 및 기탁한 미생물)
서열 목록
본 발명은 서열 목록의 문서 사본 및 컴퓨터 판독가능한 형태를 포함한다. 컴퓨터 판독가능한 형태의 내용은 본원에 참조로 모두 포함된다
생물학적 물질의 기탁
파이타제 생산 박테리아 균주를 덴마크의 토양으로부터 분리하였다. 균주는 산성 pH 최적조건 및 높은 열안정성을 갖는 파이타제를 생산하는 것으로 입증되었다. 균주는 하프니아 알베이(Hafnia alvei)로 확인되었고 이를 독일 잠룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)(DSMZ)에 부다페스트 조약의 협정하에 2007년 3월 21일에 기탁하고 하기 수탁 번호를 부여받았다.
기탁 수탁 번호 기탁일
Hafnia alvei NN020125 DSM 19197 2007년 3월 21일
본 발명은 파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 폴리펩티드는 하프니아 알베이로부터 유래된 파이타제에 관련되며, 이것의 아미노산 서열은 첨부한 서열 목록에 SEQ ID NO: 10로서 나타나 있다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구 조체, 벡터 및 숙주 세포, 그리고 폴리펩티드의 제조방법 및 특히 동물 사료에서의 사용방법에 관한 것이다.
파이타제는 잘 알려진 효소이며, 사람을 포함하여 동물을 위한 식량에 이들을 첨가하는 이점이 있다. 파이타제는 많은 진균 및 박테리아 균주를 포함하여 매우 많은 공급원으로부터 분리되어 왔다.
본 발명의 목적은 파이타제 활성을 갖는 대안적인 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 수정된, 보다 바람직하게는 개선된 특성, 예컨대 상이한 기질 특이성, 높은 특이적 활성, 증가된 안정성(산-안정성, 열-안정성 및/또는 프로테아제 안정성, 특히 펩신 안정성 등), 변경된 pH 최적조건(더 낮은 또는 더 높은 pH 최적조건 등) 및/또는 동물 사료에서의 개선된 성능(개선된 파이테이트의 방출 및/또는 분해 등)이 있다.
발명의 개요
본 발명은 (a) (i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 10의 성숙한 폴리펩티드 부분과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드; (b) (i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 10의 성숙한 폴리펩티드 부분 중 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입, 및/또는 보존적 치환을 포함하는 변형체; 및/또는 (c) (i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 10의 성숙한 폴리펩티드 부분의 단편으로 구 성된 군에서 선택된, 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 (b) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338과 적어도 75% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된, 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체, 재조합 발현 벡터 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 이러한 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (i) SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 1 내지 99으로 구성된 신호 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 구조체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 동물 사료에서 본 발명의 파이타제를 사용하는 방법, 그리고 폴리펩티드를 함유하는 동물 사료 및 동물 사료 첨가 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 예컨대 에탄올, 맥주, 와인과 같은 발효 산물의 제조에서 본 발명의 파이타제를 사용하는 방법에 관한 것이며, 이 방법에서 발효는 본 발명 의 파이타제의 존재하에서 행한다.
본 발명은 식물성 단백질을 포함하는 단백질을 본 발명의 파이타제로 처리하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 125 내지 500FYT/kg 사료 투여된 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 파이타제와 시트로박터 브라키(Citrobacter braakii) 파이타제 간의 비교에 있어서 시험관내 인큐베이션 후 잔류 이노시톨-포스페이트 결합된 인을 나타낸다.
도 2는 250 FYT/kg 사료 및 500 FYT/kg 사료 투여된 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 파이타제와 페니오포라 라이시(Peniophora lycii) 파이타제 간의 시험관내 인큐베이션 후 잔류 이노시톨-포스페이트 결합된 인의 비교를 나타낸다.
도 3은 하프니아 알베이(Hafnia alvei) 파이타제의 규명된 결정 3차원 구조에 대한 구조 좌표의 첨부자료를 나타낸다.
정의
파이타제 활성: 본 명세서에서 파이타제 활성(파이타제)을 갖는 폴리펩티드는 파이테이트(미오-이노시톨 헥사키스포스페이트)의 (1) 미오-이노시톨 및/또는 (2) 이것의 모노-, 디-, 트리-, 테트라- 및/또는 펜타-포스페이트 및 (3) 무기 포스페이트로의 가수분해를 촉매하는 효소이다.
인터넷에서 ENZYME 사이트(www.expasy.ch/enzyme/)는 효소의 명칭에 대한 정보의 리포지터리이다. 이것은 기본적으로 생화학 및 분자생물학의 국제 연맹의 명명 위원회(IUB-MB)의 추천에 기반하며 EC(Enzyme Commission) 넘버가 제공된 특징 화된 효소의 각 유형을 설명한다(Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). 또한 NC-IUBMB로부터의 핸드북 Enzyme Nomenclature, 1992를 참조한다.
ENZYME 사이트에 따르면, 3개 상이한 유형의 파이타제가 알려져 있다: 3-파이타제(미오-이노시톨 헥사포스페이트 3-포스포히드롤라제, EC 3.1.3.8), 6-파이타제(미오-이노시톨 헥사포스페이트 6-포스포히드롤라제, EC 3.1.3.26) 및 5-파이타제(EC 3.1.3.72). 본 발명의 목적을 위해, 모든 유형이 파이타제 정의에 포함된다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 파이타제는 산 히스티딘 포스파타제의 과에 속하며, 이는 대장균(Escherichia coli) pH 2.5 산 포스파타제 (유전자 appA) 및 아스퍼질러스 아와모리(Aspergilllus awamorii) 파이타제 A 및 B (EC: 3.1.3.8) (유전자 phyA 및 phyB)와 같은 진균 파이타제를 포함한다. 히스티딘 산 포스파타제는 서열 유사성의 두 영역을 공유하며, 각각 보존된 히스티딘 잔기에 집중된다. 이들 두 히스티딘은 효소의 촉매 메커니즘에 포함되는 것으로 보인다. 제1 히스티딘은 N-말단부에 위치하고 포스포-히스티딘 중간체를 형성하는 한편, 제2 히스티딘은 C-말단부에 위치하고 가능하게는 프로톤 공여체로서 작용한다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 파이타제는 보존된 활성 부위 모티프, 즉 R-H-G-X-R-X-P을 가지며, 여기서 X는 어떤 아미노산을 지정한다(SEQ ID NO: 10에 나타낸 성숙한 파이타제의 아미노산 18 내지 24 참조).
본 발명의 목적을 위해서, 파이타제 활성은 FYT의 단위로 결정되며, 하나의 FYT은 하기 조건하에서 분당 1마이크로-몰 무기 오르소 포스페이트를 유리시키는 효소의 양이다: pH 5.5; 온도 37℃; 기질: 0.0050mol/l 농도의 소듐 파이테이트(C6H6O24P6Na12). 적절한 파이타제 분석법은 WO 00/20569의 실시예 1에 기재된 FYT 및 FTU 분석법이다. FTU는 사료 및 예비혼합물 내의 파이타제 활성을 결정하기 위한 것이다. 또한 파이타제 활성은 본원의 실시예의 파이타제 분석법을 사용하여 결정할 수 있다.
pH 최적조건: 본 발명의 폴리펩티드의 pH-최적조건은 미리 정해진 농도 및 고정된 인큐베이션 온도에서 기질을 사용하여 여러 pH-값에서 파이타제를 인큐베이션함으로써 결정된다. 그 다음 파이타제 활성 대 pH의 그래프 표현으로부터 pH-최적조건이 결정된다. 특정 실시형태에서, FYT 분석법이 사용되며, 즉 하기 실시예에서 행하는 바와 같이 기질은 5mM 소듐 파이테이트이고, 반응온도는 37℃이고, 여러 pH-값에서 FYT 단위로 활성이 결정된다. 또 다른 특정 실시형태에서, 실시예 중 어느 하나의 파이타제 분석법이 사용된다. 비교적 낮은 pH-최적조건은 pH 5.0 미만, 예컨대 pH 4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5 미만, 또는 심지어 2.0 미만의 pH-최적조건을 의미한다. 비교적 높은 pH-최적조건은 pH 5.0을 초과, 예컨대 pH 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5을 초과, 또는 심지어 9.0을 초과하는 pH-최적조건을 의미한다.
분리된 폴리펩티드: 본원에 사용되는 용어 "분리된 폴리펩티드"는 SDS-PAGE에 의해 결정되는 바와 같이, 적어도 20% 순수한, 바람직하게는 적어도 40% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 60% 순수한, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 가장 더 바람직하게는 적어도 95% 순수한 폴리펩티드를 의미한다.
실질적으로 순수한 폴리펩티드: 본원에서 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 10중량% 이하, 바람직하게는 8중량% 이하, 보다 바람직하게는 6중량% 이하, 보다 바람직하게는 5중량% 이하, 보다 바람직하게는 4중량% 이하, 3중량% 이하, 보다 더 바람직하게는 2중량% 이하, 가장 바람직하게는 1중량% 이하, 가장 더 바람직하게는 0.5중량% 이하의, 본래 결합되어 있는 다른 폴리펩티드 물질을 함유하는 폴리펩티드 제조물을 의미한다. 그러므로, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 제조물에 존재하는 총 폴리펩티드 물질의 적어도 92중량% 순수한, 바람직하게는 적어도 94중량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 95중량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 96중량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 96중량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 97중량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 98중량% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 99중량% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99.5중량% 순수한, 가장 더 바람직하게는 100중량% 순수한 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드는 실질적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다. 특히, 폴리펩티드가 "본질적으로 순수한 형태"인 것, 즉 폴리펩티드 제조물이 본래 결합된 다른 폴리펩티드 물질이 본질적으로 없는 것이 바람직하다. 이는 예컨대 잘 알려진 재조합 방법 또는 종래의 정제 방법을 사용하여 폴리펩티드를 제조함으로써 달성할 수 있다.
본원에서, 용어 "실질적으로 순수한 폴리펩티드"는 "분리된 폴리펩티드" 및 분리된 형태의 폴리펩티드"와 동의어이다.
동일성: 두 아미노산 서열 또는 두 뉴클레오티드 서열 간의 관련성은 파라미터 "동일성"에 의해 설명된다.
본 발명의 목적을 위해서, 두 아미노산 서열 간의 동일성 정도 및 두 뉴클레오티드 서열 간의 동일성 정도는 단백질과 DNA 정렬에 모두 유용한 Needleman-Wunsch 정렬(즉 전역 정렬)인 프로그램 "align"에 의해 결정된다. 디폴트 점수화 행렬 BLOSUM50 및 디폴트 동일성 행렬이 단백질 및 DNA 정렬에 각각 사용된다. 갭 중의 첫번째 잔기에 대한 패널티는 단백질에 대하여 -12이고 DNA에 대하여 -16이다. 한편 갭 중 추가의 잔기에 대한 패널티는 단백질에 대하여 -2이고 DNA에 대하여 -4이다.
"Align"은 FASTA 패키지 버전 v20u6의 부분이다(W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, 및 W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98 참조). FASTA 단백질 정렬은 갭 크기에 제한없이 Smith-Waterman 알고리즘을 사용한다("Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith and M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197 참조).
Needleman-Wunsch 알고리즘은 Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453에 설명되어 있으며 Myers 및 W. Miller에 의한 정렬 프로그램은 "Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (Computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17에 설명되어 있다.
또한 표적 (또는 샘플, 또는 테스트) 서열과 특정 서열(예컨대 SEQ ID NO: 10에 나타낸 성숙한 파이타제의 아미노산 1 내지 413) 간의 동일성 정도는 하기와 같이 결정될 수 있다: 서열을 프로그램 "align"을 사용하여 정렬한다. 정렬에서 완전한 매치의 수("N-완전한-매치")가 결정된다(완전한 매치는 정렬의 동일한 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 의미하며, 대개 정렬에서 "|"로 지정됨). 특정 서열의 길이(아미노산 잔기의 수)가 결정된다("N-특정", 상기 언급한 예에서 = 413). 동일성의 정도는 "N-완전한-매치"와 "N-특정" 간의 비로서 계산된다(백분율 동일성으로의 환산을 위해 100을 곱함).
대안적 실시형태에서, 표적 (또는 샘플, 또는 테스트) 서열과 특정 서열 (예컨대 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413) 간의 동일성의 정도는 하기와 같이 결정된다: 프로그램 "align"을 사용하여 두 서열을 정렬한다. 정렬에서 완전한 매치의 수("N-완전한-매치")가 결정된다(완전한 매치는 정렬의 동일한 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 의미하며, 대개 정렬에서 "|"로 지정됨). 두 정렬된 서열의 공통 길이, 즉 정렬의 오버랩 부분 내의 아미노산의 총수("N-오버랩")가 결정된다. 동일성의 정도는 "N-완전한-매치"와 "N-오버랩" 간의 비로서 계산된다(백분율 동일성으로의 환산을 위해 100을 곱함). 한 실시형태에서, N-오버랩은 정렬에 의해 생성된 트레일링 및 리딩 갭이 존재한다면 이를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, N-오버랩은 정렬에 의해 생성된 트레일링 및 리딩 갭이 존재한다면 이를 배제한다.
또 다른 대안적 실시형태에서, 표적 (또는 샘플, 또는 테스트) 서열과 특정 서열(예컨대 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413) 간의 동일성 정도를 하기와 같이 결정한다: 프로그램 "align"을 사용하여 서열을 정렬한다. 정렬 내의 완전한 매치의 수("N-완전한-매치")를 결정한다(완전한 매치는 정렬의 동일한 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 의미하며, 대개 정렬에서 "|"로 지정됨). 표적 서열의 길이(아미노산 잔기의 수)를 결정한다("N-표적"). 동일성의 정도는 "N-완전한-매치"와 "N-표적" 간의 비로서 계산된다(백분율 동일성으로의 환산을 위해 100을 곱함).
바람직하게는, 오버랩(상기 정의한 "N-오버랩"을 특정 서열 내의 아미노산의 수("N-특정")로 나누고 100을 곱함)은 특정 서열의 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%이다. 이는 샘플 서열이 특정 서열에 대하여 정렬될 때 특정 서열의 아미노산의 적어도 20%(바람직하게는 25-95%)가 오버랩에 포함된다는 것을 의미한다.
대안적으로, 오버랩은 표적 (또는 샘플, 또는 테스트) 서열의 적어도 20%이고(상기 정의한 "N-오버랩"을 상기 정의한 "N-표적"으로 나누고 100을 곱함), 보다 바람직하게는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 적어도 95%이다. 이는 특정 서열에 대하여 정렬될 때 표적 서열의 아미노산의 적어도 20%(바람직하게는 25-95%)가 오버랩에 포함된다는 것을 의미한다.
폴리펩티드 단편: 본원에서 용어 "폴리펩티드 단편"은 특정 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 10, 또는 그것의 상동 서열의 성숙한 펩티드 부분의 아미노 및/또는 카 르복실 말단으로부터 결실된 하나 이상의 아미노산을 갖는 폴리펩티드로서 정의되며, 단편은 파이타제 활성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 단편은 적어도 350, 360, 370, 380, 390, 400, 405, 또는 적어도 410의 아미노산 잔기를 함유한다.
부분서열: 본원에서 용어 "부분서열"은 특정 서열, 예컨대 SEQ ID NO: 9, 또는 그것의 상동 서열의 성숙한 펩티드 암호화 부분의 5' 및/또는 3' 말단으로부터 결실된 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 뉴클레오티드 서열로서 정의되며, 부분서열은 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드 단편을 암호화한다. 특정 실시형태에서, 부분서열은 적어도 1050, 1080, 1110, 1140, 1170, 1200, 1215, 1230, 1245, 1260, 1275, 1290, 1305, 1320, 또는 적어도 1335의 뉴클레오티드를 함유한다.
대립유전자 변형체: 본원에서 용어 "대립유전자 변형체"는 동일한 염색체좌를 차지하는 유전자의 둘 이상의 대안적 형태를 나타낸다. 대립유전자 변형체는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 군집 내에서 다형성(polymorphism)으로 될 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵할 수 있거나(암호화된 폴리펩티드에 변화 없음) 또는 변경된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 폴리펩티드의 대립유전자 변형체는 유전자의 대립유전자 변형체에 의해 암호화된 폴리펩티드이다.
실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드: 본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드"는 다른 외부의 또는 원하지 않는 뉴클레오티드가 없고 유전자 조작 단백질 제조 시스템에서 사용하기에 적합한 형태인 폴리뉴클레오티드 제조물을 의미한다. 따라서, 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 10질량% 이하, 바람직하게는 8질량% 이하, 보다 바람직하게는 6질량% 이하, 보다 바람직하게는 5 질량% 이하, 보다 바람직하게는 4질량% 이하, 보다 바람직하게는 3질량% 이하, 보다 더 바람직하게는 2질량% 이하, 가장 바람직하게는 1질량% 이하, 가장 더 바람직하게는 0.5질량% 이하의 본래 결합된 다른 폴리뉴클레오티드 물질을 함유한다. 그러나 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 프로모터 및 터미테이터와 같은 자연 발생 5' 및 3' 미번역 영역을 포함한다. 실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드는 적어도 90% 순수한, 바람직하게는 적어도 92질량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 94질량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 95질량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 96질량% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 97질량% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 98질량% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99질량% 순수한, 가장 더 바람직하게는 적어도 99.5질량% 순수한 것이 바람직하다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수한 형태인 것이 바람직하다. 특히, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드는 "본질적으로 순수한 형태"인 것, 즉 폴리뉴클레오티드 제조물은 본래 결합된 다른 폴리뉴클레오티드 물질이 없는 것이 바람직하다. 본원에서, 용어 "실질적으로 순수한 폴리뉴클레오티드"는 "분리된 폴리뉴클레오티드" 및 "분리된 형태의 폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 폴리뉴클레오티드는 게놈, cDNA, RNA, 반합성, 합성 기원, 또는 이들의 조합일 수 있다.
핵산 구조체: 본원에 사용된 용어 "핵산 구조체"는 자연 발생 유전자로부터 분리되거나 또는 자연계에 달리 존재하지 않는 방식으로 핵산의 세그먼트을 함유하도록 변형된 단일- 또는 이중-가닥의 핵산 분자를 의미한다. 용어 핵산 구조체는 핵산 구조체가 본 발명의 암호화 서열의 발현에 필요한 조절 서열을 함유하는 경우 "발현 카세트"와 동의어이다.
조절 서열: 본원에서 용어 "조절 서열"은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요하거나 유리한 모든 구성요소들을 포함한다. 각 조절 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 동질적이거나 이질적일 수 있다. 이러한 조절 서열은 리더 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열 및 전사 터미테이터를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 최소한 조절 서열은 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함한다. 조절 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 암호화 영역과 조절 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입할 목적으로 연결자와 함께 제공될 수 있다.
작동가능하게 연결된: 본원에서 용어 "작동가능하게 연결된"은 조절 서열이 폴리펩티드의 암호화 서열의 발현을 지시하도록 폴리뉴클레오티드 서열의 암호화 서열에 대하여 적절한 위치에 위치한 형태를 나타낸다.
암호화 서열: 본원에서 사용할 때 용어 "암호화 서열"은 그것의 단백질 산물의 아미노산 서열을 직접 특정하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 암호화 서열의 바운더리는 대개 ATG 개시 코돈 또는 GTG 및 TTG와 같은 대안적인 개시 코돈으로 시작하는 오픈 리딩 프레임에 의해 일반적으로 결정된다. 암호화 서열은 DNA, cDNA, 또는 재조합 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
성숙한 폴리펩티드 부분: 본원에서 사용될 때 용어 "성숙한 폴리펩티드 부분" 또는 "성숙한 펩티드 부분"은 그것의 유전 장치의 일부로서 폴리펩티드를 암호 화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포에 의해 분비된 폴리펩티드의 부분을 의미한다. 다시 말하면, 성숙한 폴리펩티드 부분은 신호 펩티드가 암호화된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 지시하는 그것의 기능을 수행하고 분리된 후 남아있는 폴리펩티드의 부분을 의미한다. SEQ ID NO: 10의 예상되는 신호 펩티드 부분은 그것의 아미노산 -33 내지 -1이며, 이는 SEQ ID NO: 10의 예상되는 성숙한 폴리펩티드 부분이 그것의 아미노산 1 내지 413에 해당한다는 것을 의미한다. 그러나, 숙주 세포로부터 숙주 세포까지 약간의 변형이 발생할 수 있으므로, 표현 성숙한 폴리펩티드 부분이 바람직하다.
성숙한 폴리펩티드 암호화 부분: 본원에서 사용하는 경우 용어 "성숙한 폴리펩티드 암호화 부분" 또는 "성숙한 폴리펩티드 암호화 서열"은 성숙한 폴리펩티드 부분을 암호화하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 부분을 의미한다. 예컨대, SEQ ID NO: 9에 대해서 예상되는 성숙한 폴리펩티드 암호화 부분은 뉴클레오티드 100 내지 1338에 해당한다(SEQ ID NO: 10의 암호화 아미노산 1 내지 413).
발현: 용어 "발현"은 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형 및 분비를 포함하는 폴리펩티드의 제조에 수반되는 어떤 단계를 의미하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
발현 벡터: 본원에서 용어 "발현 벡터"는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 직쇄형 또는 원형 DNA 분자로서 정의되며, 그것의 발현을 위해 제공되는 추가 뉴클레오티드에 동작가능하게 연결된다.
숙주 세포: 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체를 사용한 형질전환, 트랜스펙션, 형질도입 등에 감수성이 있는 어떤 세포 형태를 포함한다.
변형: 본원에서 용어 "변형"은 특정 폴리펩티드, 예컨대 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413으로 구성된 폴리펩티드의 어떤 화학적 변형, 및 그 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 유전자 조작을 의미한다. 변형(들)은 아미노산(들)의 치환(들), 결실(들) 및/또는 삽입(들) 및 아미노산 측쇄(들)의 대체(들)를 의미한다.
인공 변형체: 본원에 사용하는 경우, 용어 "인공 변형체"는 SEQ ID NO: 9의 성숙한 파이타제 암호화 부분의 변형된 뉴클레오티드 서열을 발현하는 유기체에 의해 제조되는 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9에 개시된 뉴클레오티드 서열의 성숙한 파이타제 암호화 부분의 변형에 의한 인간의 개입을 통해 얻어진다.
파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드
제1 양태에서, 본 발명은 파이타제 활성을 갖고 적어도 75%의 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413 (즉, 성숙한 폴리펩티드)에 대한 동일성 정도를 갖는 아미노산 서열을 갖는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 동일성의 정도는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%이며, 파이타제 활성을 갖는다(이하 "동종 폴리펩티드").
다른 특정 실시형태에서, 동종 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413과 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 아미노산이 다른 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열의 성숙한 부분을 포함하거나, 또는 그것의 대립유전자 변형체; 또는 파이타제 활성을 갖는 그것의 단편이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413, 또는 그것의 대립유전자 변형체; 또는 파이타제 활성을 갖는 그것의 단편을 포함한다.
제2 양태에서, 본 발명은 (i) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338, (ii) SEQ ID NO: 9의 성숙한 폴리펩티드 암호화 부분, 및/또는 (iii) (i) 및 (ii) 중 어느 하나의 상보 가닥, 및/또는 (iv) (i), (ii) 또는 (iii)의 부분서열과 적어도 중간, 바람직하게는 중간, 긴축 조건하에서 혼성화한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다(J. Sambrook, E.F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). SEQ ID NO: 9의 부분서열은 적어도 100 인접한 뉴클레오티드 또는 바람직하게는 적어도 200개 인접한 뉴클레오티드를 함유한다. 또한, 부분서열은 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드 단편을 암호화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 혼성화는 적어도 중간-높은, 적어도 높은, 또는 적어도 매우 높은 긴축 조건하에서; 바람직하게는 중간-높은, 높은 또는 매우 높은 긴축 조건하에서 발생한다.
대안적 실시형태에서, 혼성화는 매우 낮은, 또는 낮은 긴축 조건하에서 행한다.
SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 부분서열, 및 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열 또는 그것의 단편은, 핵산 프로브를 디자인하여 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 상이한 속 또는 종의 균주로부터 파이타제 활성을 갖는 DNA 암호화 폴리펩티드를 식별 및 클로닝하는데 사용될 수 있다. 특히, 이러한 프로브를 표준 써던 블로팅 과정에 따라 목적하는 속 또는 종의 게놈 또는 cDNA와의 혼성화에 사용하여 그 안의 해당 유전자를 식별 및 분리할 수 있다. 이러한 프로브는 전체 서열 보다 상당히 짧을 수 있지만, 적어도 14, 바람직하게는 적어도 25, 보다 바람직하게는 적어도 35, 가장 바람직하게는 적어도 70 뉴클레오티드 길이이어야 한다. 그러나, 핵산 프로브는 적어도 100 뉴클레오티드 길이인 것이 바람직하다. 예컨대, 핵산 프로브는 길이가 적어도 200 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 300 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 400 뉴클레오티드, 또는 가장 바람직하게는 적어도 500 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 더욱 긴 프로브, 예컨대 적어도 600 뉴클레오티드, 적어도 바람직하게는 적어도 700 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 800 뉴클레오티드, 또는 가장 바람직하게는 적어도 900 뉴클레오티드 길이인 핵산 프로브를 사용할 수 있다. DNA 및 RNA 프로브 모두를 사용할 수 있다. 통상적으로 프로브는 해당 유전자를 검출하기 위해 표지된다(예컨대, 32P, 3H, 35S, 비오틴 또는 아비딘을 사용하여). 이러한 프로브는 본 발명에 포괄된다.
그러므로 이러한 다른 유기체로부터 제조된 게놈 DNA 라이브러리는, 상술한 프로브와 혼성화되고 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 대하여 스크린된다. 이러한 다른 유기체로부터의 게놈 또는 다른 DNA는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기이동, 또는 다른 분리 기술에 의해 분리될 수 있다. 라이브러리로부터의 DNA 또는 분리된 DNA는 니트로셀룰로오스 또는 다른 적절한 담체 물질로 이동 및 고정화될 수 있다. SEQ ID NO: 9 또는 그것의 부분서열과 동종인 클론 또는 DNA를 식별하기 위해서, 써던 블롯에 담체 물질을 사용한다.
본 발명의 목적을 위해서, 혼성화는 뉴클레오티드 서열이 매우 낮은 긴축 조건 내지 매우 높은 긴축 조건하에서 SEQ ID NO: 9에 나타난 뉴클레오티드 서열, 그것의 상보 가닥 또는 그것의 부분서열에 해당하는 표지된 핵산 프로브로 혼성화되는 것을 의미한다. 이들 조건하에서 핵산 프로브가 혼성화되는 분자는 X선 필름을 사용하여 검출할 수 있다.
특정 실시형태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 1-8 중 어느 하나이다. 다른 특정 실시형태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 450, 뉴클레오티드 450 내지 900, 또는 뉴클레오티드 900 내지 1338의 상보 가닥이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 10의 폴리펩티드의 성숙한 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 그것의 부분서열이다. 또 다른 특정 실시형태에서, 핵산 프로브는 SEQ ID NO: 9, 특히 그것의 성숙한 폴리펩티드 암호화 영역 중 어느 하나이다.
적어도 100 뉴클레오티드 길이의 긴 프로브를 위해서, 매우 낮은 긴축 조건 내지 매우 높은 긴축 조건은 42℃에서 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 마이크로그램/ml 절단 및 변성된 연어 정자 DNA, 및 매우 낮은 긴축 및 낮은 긴축을 위한 25% 포름아미드, 중간 및 중간-높은 긴축을 위한 35% 포름아미드 또는 높은 및 매우 높은 긴축을 위한 50% 포름아미드 중 어느 하나에서, 표준 써던 블로팅 과정에 따라 최적으로 12 내지 24시간 동안의 예비혼성화 및 혼성화로서 정의된다.
적어도 100 뉴클레오티드 길이의 긴 프로브를 위해서, 담체 물질은 마지막으로 2X SSC, 0.2% SDS를 사용하여 15분 동안, 바람직하게는 적어도 45℃(매우 낮은 긴축), 보다 바람직하게는 적어도 50℃(낮은 긴축), 보다 바람직하게는 적어도 55℃(중간 긴축), 보다 바람직하게는 적어도 60℃(중간-높은 긴축), 보다 더 바람직하게는 적어도 65℃(높은 긴축), 가장 바람직하게는 적어도 70℃(매우 높은 긴축)에서 각각 3회 세정한다.
약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드 길이인 짧은 프로브를 위해서, 긴축 조건은 Bolton and McCarthy에 따른 계산(1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390)을 사용하여 계산된 Tm 미만의 약 5℃ 내지 약 10℃에서 ml 당 0.9M NaCl, 0.09M 트리스-HCl pH 7.6, 6mM EDTA, 0.5% NP-40, 1X 덴하르트 용액, 1mM 소듐 피로포스페이트, 1mM 소듐 단일염기 포스페이트, 0.1mM ATP 및 0.2mg 효모 RNA에서 표준 써던 블로팅 과정에 따라 예비혼성화, 혼성화 및 혼성화 후 세정으로서 정의된다.
약 15 뉴클레오티드 내지 약 70 뉴클레오티드 길이인 짧은 프로브를 위해서, 담체 물질은 계산된 Tm 미만의 5℃ 내지 10℃에서 15분 동안 6X SCC 플러스 0.1% SDS에서 1회, 6X SSC를 사용하여 15분 동안 각각 2회 세정한다.
염-함유 혼성화 조건하에서, 효과적인 Tm은 성공적인 혼성화를 위해 프로브와 DNA에 결합된 필터 사이에 필요한 동일성 정도를 조절하는 것이다. 효과적인 Tm을 하기 식을 사용하여 결정하여 두 DNA에 필요한 동일성 정도를 결정하여 다양한 긴축 조건하에서 혼성화할 수 있다.
효과적인 Tm = 81.5 + 16.6(log M[Na+]) + 0.41(%G+C) - 0.72(% 포름아미드)
(www.ndsu.nodak.edu/instruct/mcclean/plsc731/dna/dna6.htm 참조)
"G+C"는 프로브 중 뉴클레오티드 G 및 T의 함유량을 나타낸다. 중간 긴축을 위해서, 예컨대 포름아미드는 35%이고 5X SSPE을 위한 Na+ 농도는 0.75M이다.
한 양태에서, 본 발명은 파이타제 활성 및 하기 물리화학적 특성(실질적으로 순수한 폴리펩티드 상에서 분석됨)을 갖는 분리된 폴리펩티드에 관한 것이다:
(i) E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88)의 특이적 활성의 적어도 50%의 파이테이트에 대한 특이적 활성과 같은 높은 특이적 활성, 특이적 활성은 파이타제 효소 단백질 mg 당 FYT의 단위로 측정됨;
(ii) 산-안정성; 예컨대
(a) 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 65%, 적어도 70%, 또는 적어도 75%의, HEPES 버퍼 pH 7.0에서 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 잔류 활성에 대한 글리신/염산 버퍼 pH 2.2에서 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 잔류 활성;
(b) 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의, HEPES 버퍼 pH 7.0에서 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 잔류 활성에 대한 글리신/염산 버퍼 pH 3.0에서 37℃에서 밤새 인큐베이션 후 잔류 활성; 및/또는
(c) E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88)의 잔류 활성과 비교하여 적어도 50%의, 25, 30, 35 또는 37℃, 바람직하게는 37℃의 온도에서, 그리고 2.2, 2.4, 2.5, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4 또는 3.5의 pH, 바람직하게는 pH 2.2 또는 3.0의 글리신/염산 버퍼에서의 2시간 인큐베이션 후 잔류 파이타제 활성;
(iii) 열-안정성, 예컨대 E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88)의 잔류 활성에 비하여 적어도 50%의, 5.5의 pH 및 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 95℃의 온도에서의 인큐베이션의 0.5, 1, 1.5, 또는 2시간, 바람직하게는 0.5시간 후 잔류 파이타제 활성;
대안적으로, 시차 주사 열량 (DSC) 측정법을 사용하여 정제된 파이타제 단백질의 변성 온도, Td를 결정할 수 있다. Td는 단백질의 열-안정성의 지표이고: Td가 높을수록 열-안정성이 높다. DSC 측정법은 다양한 pH값에서, 예컨대 Micro Cal사의 DSC를 사용하여 행할 수 있다. 주사는 20-90℃으로부터 일정한 주사 속도 1.5℃/분으로 행한다. 바람직한 pH값은 4.0 및 5.5, 바람직하게는 4.0이다. DSC를 행하기 전에, 파이타제를 예컨대 적절한 버퍼(예컨대 25mM 소듐 아세테이트 pH 4.0; 0.1M 소듐 아세테이트, pH 5.5)에서 평형화된 NAP-5 컬럼(Pharmacia)을 사용하여 탈염한다. 데이터-처리는 MicroCal Origin 소프트웨어(버전 4.10)을 사용하여 행하고, 변성 온도, Td(용융 온도, Tm이라고도 함)는 온도 기록도에서 피크의 정점에서의 온도로서 정의된다.
(iv) 프로테아제-안정성, 예컨대 E. coli appA (SPTREMBL:Q8GN88)의 잔류 활성에 비하여 적어도 50%의, 0.1 mg/ml 펩신의 존재하에서 20, 25, 30, 35, 또는 37℃, 바람직하게는 37℃의 온도 및 5.5의 pH에서 0.5, 1, 1.5 또는 2시간, 바람직하게는 1시간 인큐베이션 후 잔류 파이타제 활성; 및/또는
(v) FYT 분석 및/또는 하기 설명되는 실시예 4의 분석법을 사용하여 결정되는 pH 5.0 미만, 예컨대 pH 4.5, 4.0, 3.5, 3.0, 2.5, 또는 심지어 2.0 미만의 pH-최적조건,
상기 양태 (i)의 특정 실시형태에서, 특이적 활성은 E. coli appA의 특이적 활성의 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 적어도 150%이다. 상기 양태 (ii) 내지 (iv)의 각 특정 실시형태에서, 잔류 활성은 E. coli appA의 잔류 활성의 적어도 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 또는 적어도 150%이다.
제5 양태에서, 기질 pNP-포스페이트 상에서 측정된 pH 5.0 및 37℃에서의 본 발명의 효소의 활성은 기질 파이테이트 상에서 측정된 효소 활성의 11% 미만이다. 바람직하게는, 비율은 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 미만, 또는 5% 미만이다. 파이테이트 가수분해에 대한 pNP의 비율은 효소의 진정한 파이타제 성질의 지표이다. 파이테이트 상의 활성에 대한 pNP 상의 활성의 높은 비율은 해당 효소가 상대적으로 낮은 기질 특이성을 갖는 포스파타제라는 것의 지표인 반면, 낮은 비율은 이것이 기질로서 파이테이트를 더욱 특이적으로 수용하는 효소라는 지표이다.
제6 양태에서, 본 발명의 파이타제는 시험관내 모델에서 페니오포라 라이시(Peniophora lycii)로부터의 파이타제와 비교하여 바람직하게는 그것의 적어도 110%, 보다 바람직하게는 그것의 적어도 120%, 130%, 또는 적어도 140%의 높은 인(P) 방출을 갖는다. 한 실시형태에서, 시험관내 모델에서 0.25 FYT/g 사료 투여된 본 발명의 파이타제는 0.25 FYT/g 사료 투여된 페니오포라 라이시로부터의 파이타제에 의해 방출되는 인에 비하여 적어도 150% 인(P)을 방출한다. 바람직하게는, 방출은 적어도 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 또는 적어도 180%이다. 또 다른 실시형태에서, 시험관내 모델에서 0.75 FYT/g 사료 투여된 본 발명의 파이타제는 0.75 FYT/g 사료 투여된 페니오포라 라이시로부터의 파이타제에 의해 방출되는 인에 비하여 적어도 150% 인(P)을 방출한다. 바람직하게는, 방출은 적어도 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 또는 적어도 190%이다.
제7 양태에서, 본 발명의 파이타제는 시간, t = 0에서의 활성과 비교하여 적어도 20%의, 37℃ 0.1M 글리신/HCl 버퍼, pH 2.0에서 4시간 동안 인큐베이션 후의 잔류 활성을 가지며, 활성(및 잔류 활성)을 37℃ 및 pH 5.5에서 1% (w/v) Na-파이테이트 상에서 0.25M Na-아세테이트 버퍼 pH 5.5를 사용하여 분석하고, 버퍼 블라인드는 제외된다. 바람직한 실시형태에서, 잔류 활성은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 적어도 80%이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 파이타제는 시간, t = 0에서의 활성과 비교하여 적어도 20%의, 37℃ 및 0.1M 글리신/HCl 버퍼, pH 2.5에서 1일(24시간) 동안의 인큐베이션 후의 잔류 활성을 가지며, 활성(및 잔류 활성)을 37℃ 및 pH 5.5에서 1%(w/v) Na-파이테이트 상에서 0.25M Na-아세테이트 버퍼 pH 5.5를 사용하여 분석하고, 버퍼 블라인드는 제외된다. 바람직한 실시형태에서, 잔류 활성은 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 또는 적어도 80%이다.
제8 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 10 중 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 인공 변형체 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드에 관한 것이다. 삽입은 분자 내부 및/또는 분자의 N-말단 및/또는 C-말단일 수 있으며 이 경우 연장을 나타내기도 한다. 바람직하게는, 아미노산 변화는 경미한 현상, 즉 보존적 아미노산 치환; 적은 결실, 통상적으로 1 내지 약 30 아미노산; 아미노-말단 메티오닌 잔기와 같은 적은 아미노- 또는 카르복실-말단 연장; 최대 약 20-25 잔기의 적은 연결자 펩티드; 또는 총 전하 또는 폴리-히스티딘 트랙트(tract), 항원 에피토프 또는 결합 도메인과 같은 또 다른 기능을 변화시킴으로써 정제를 용이하게 하는 적은 연장 - 다시 말하면: 단백질의 폴딩 및/또는 활성에 현저하게 영향을 미치지 않는 변화이다.
보존적 치환의 예는 염기성 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산(글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산(글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산(류신, 이소류신 및 발린), 방향족 아미노산(페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산(글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌 및 메티오닌)의 군 내에 있다.
보존적 치환의 또 다른 예는 비표준 아미노산(4-히드록시프롤린, 6-N-메틸 리신, 2-아미노이소부티르산, 이소발린 및 알파-메틸 세린 등)을 사용한 20개 표준 아미노산의 치환이다. 보존적 치환은 또한 유전 암호에 의해 암호화되지 않은 아미노산 및 비천연 아미노산으로의 치환을 포함할 수 있다. "비천연 아미노산"은 단백질 합성 후 변형되거나, 그리고/또는 그들의 측쇄(들) 내에 표준 아미노산과는 다른 화학적 구조를 갖는다. 비천연 아미노산은 화학적으로 합성될 수 있으며, 바람직하게는 시중에서 입수가능하고, 피페콜산, 티아졸리딘 카르복실산, 디히드로프롤린, 3- 및 4-메틸프롤린 및 3,3-디메틸프롤린을 포함한다.
대안적으로, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 물리적-화학적 특성이 변경되는 현상이다. 예컨대, 아미노산 변화는 폴리펩티드의 열 안정성을 개선시키고, 기질 특이성을 변경시키고, pH 최적조건을 변화시킨다.
모체 폴리펩티드 내의 필수 아미노산은 부위 지정 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발과 같은 당업계 알려진 과정에 따라 식별할 수 있다(Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). 후자 기술에서, 단일 알라닌 돌연변이는 분자 내의 모든 잔기에 도입되고 얻어진 돌연변이체 분자를 생물학적 활성(즉 파이타제 활성)에 대하여 테스트하여 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 식별한다. 또한 Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708 참조. 효소의 활성 부위 또는 다른 생물학적 상호작용은 또한 추정 접촉 부위 아미노산의 돌연변이와 조합하여 핵자기공명, 결정학, 전자회절 또는 광친화성 라벨링과 같은 기술에 의해 결정되는 구조의 물리적 분석에 의해 결정될 수 있다. 예컨대 de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309:59-64 참조. 필수 아미노산의 동일성은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드와 관련된 폴리펩티드를 사용한 동일성 분석으로부터 추론될 수 있다.
단일 또는 다수 아미노산 치환은 Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; 또는 WO 95/22625에 개시된 것과 같이, 돌연변이 유발, 재조합 및/또는 셔플링에 이어지는 관련 스크리닝 과정의 공지된 방법을 사용하여 이루어지고 테스트할 수 있다. 사용할 수 있는 다른 방법은 오류-유발 PCR, 파지 디스플레이(예컨대 Lowman et al., 1991, Biochem. 30:10832-10837; 미국 특허 No. 5,223,409; WO 92/06204), 및 영역-지정 돌연변이 유발(Derbyshire et al., 1986, Gene 46:145; Ner et al., 1988, DNA 7:127)을 포함한다.
돌연변이 유발/셔플링 방법은 높은-처리량, 자동화 스크리닝 방법과 조합하여 숙주 세포에 의해 발현된 클로닝된, 돌연변이 유발된 폴립펩티드의 활성을 검출할 수 있다. 활성 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이 유발된 DNA 분자를 숙주 세포로부터 회수하여 당업계의 표준 방법을 사용하여 신속히 서열화한다. 이들 방법은 해당 폴리펩티드 중의 개별 아미노산 잔기의 중요성의 신속한 결정을 가능하게 하고 미지 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413의 서열 중 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 치환), 결실 및/또는 삽입의 총수는 10 이하, 바람직하게는 9 이하, 보다 바람직하게는 8 이하, 보다 바람직하게는 7 이하, 보다 바람직하게는 6 이하, 보다 바람직하게는 5 이하, 보다 바람직하게는 4 이하, 보다 더 바람직하게는 3 이하, 가장 바람직하게는 2 이하, 가장 더 바람직하게는 1이다.
SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입의 총수는 10, 바람직하게는 9, 보다 바람직하게는 8, 보다 바람직하게는 7, 보다 바람직하게는 6 이하, 보다 바람직하게는 5 이하, 보다 바람직하게는 4, 보다 더 바람직하게는 3, 가장 바람직하게는 2, 가장 더 바람직하게는 1이다. 대안적으로, SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413의 서열 중의 아미노산 치환(바람직하게는 보존적 치환), 결실 및/또는 삽입의 총수는 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12 이하, 또는 11 이하이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 사람을 포함하여 동물에 노출되었을 때 감소된 면역 반응을 일으키도록 디자인된 낮은-알레르기 유발 변형체이다. 용어 면역 반응은 폴리펩티드에 노출되는 동물의 면역 시스템에 의한 어떤 반응으로서 이해된다. 면역 반응 중 한 형태는 노출된 동물에서 IgE 수준 증가를 일으키는 알레르기 반응이다. 낮은-알레르기 유발 변형체는 당업계 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예컨대 폴리펩티드는 면역 반응에 포함되는 폴리펩티드의 폴리머 모이어티 차단부 또는 에피토프와 접합될 수 있다. 폴리머와의 접합은 예컨대 WO 96/17929, WO98/30682, WO98/35026 및/또는 WO99/00489에 설명된 바와 같이 폴리펩티드에 대한 폴리머의 시험관내 화학적 커플링을 포함할 수 있다. 여기에 추가로 또는 대안적으로 접합은 폴리펩티드에 대한 폴리머의 생체내 커플링을 포함할 수 있다. 이러한 접합은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 유전자 조작, 폴리펩티드에서 추가 글리코실화 부위를 암호화하는 공통 서열의 삽입 및 폴리펩티드를 글리코실화할 수 있는 숙주에서 폴리펩티드의 발현에 의해 달성될 수 있으며, 예컨대 WO00/26354를 참조한다. 낮은-알레르기 유발 변형체를 제공하는 또 다른 방식은 폴리펩티드가 자가-올리고머화하도록 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 유전자 조작이며, 폴리펩티드 모노머가 다른 폴리펩티드 모노머의 에피토프를 차단하여 올리고머의 항원성을 저하시킬 수 있도록 작용한다. 이러한 산물 및 이들의 제조는 예컨대 WO96/16177에 설명되어 있다. 면역 반응에 포함되는 에피토프는 WO 00/26230 및 WO 01/83559에 설명된 파지 디스플레이법과 같은 여러가지 방법 또는 EP 561907에 설명된 랜덤 접근에 의해 식별될 수 있다. 일단 에피토프가 식별되면, 그것의 아미노산 서열을 변경하여 부위 지정 돌연변이 유발과 같은 공지된 유전자 조작 기술에 의해 폴리펩티드의 변경된 면역 특성을 생성할 수 있고(예컨대 WO 00/26230, WO 00/26354 및/또는 WO00/22103 참조) 그리고/또는 폴리머의 접합은 폴리머를 위해 에피토프로 충분히 근접하여 행하여 에피토프를 차단할 수 있다.
하프니아 알베이( Hafnia alvei ) 파이타제의 3차원 구조
하프니아 알베이 파이타제(SEQ ID NO:10의 아미노산 1 내지 413)의 3차원 구조가 첨부자료에 제공된다. 예컨대 X-Ray Structure Determinations, Stout, G. K. and Jensen, L. H., John Wiley and Sons, Inc. NY 1989에 주어진 x선 결정학적 방법에 대한 원리에 따라 구조를 해석하였다. 해석된 하프니아 알베이 파이타제의 결정 구조에 대한 구조 좌표는 첨부자료에 설명된 바와 같이 표준 PDB 포맷(Protein Database Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven, Conn.)으로 주어진다. 첨부자료가 본 발명의 일부를 형성한다는 것으로 이해된다. 첨부자료는 수소원자를 제외한 중원자의 좌표를 제공한다. 효소의 첫번째 3개의 잔기는 결정 구조에서 보이지 않았으며 아미노산 180과 189 사이의 아미노산 잔기도 마찬가지이다. 그러나, 180과 189 사이의 구조는 JACKAL package사의 동종성 모델링(예컨대 Marti-Renom et al., 2000 참조) 프로그램 NEST(wiki.c2b2.columbia.edu/honiglab_public/index.php/Software:Jackal)와 CHARMm라고 불리는 시뮬레이션 소프트웨어(//accelrys.com/products/scitegic/component-collections/charmm.html)를 조합한 모델링을 사용하여 구성되었다.
파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드의 공급원
본 발명의 폴리펩티드는 어떤 속의 미생물로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 주어진 공급원과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "로부터 얻어진"은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드가 공급원에 의해 또는 공급원으로부터의 뉴클레오티드 서열이 삽입된 균주에 의해 생성된 것을 의미한다. 바람직한 양태에서, 주어진 공급원으로부터 얻어진 폴리펩티드는 세포외적으로 분비된다.
본 발명의 폴리펩티드는 박테리아 폴리펩티드일 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드는 바실러스 폴리펩티드, 또는 스트렙토마이세스 폴리펩티드와 같은 그램 양성 박테리아 폴리펩티드; 또는 그램 음성 박테리아 폴리펩티드, 예컨대 대장균(Escherichia coli), 예르시니아(Yersinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 사이트로박터(Citrobacter) 또는 슈도모나스(Pseudomonas) 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드는 감마프로테오박테리아와 같은 프로테오박테리아, 예컨대 엔테로박테리아세아와 같은 엔테로박테리아레스로부터 유래된다.
특정 양태에서, 엔테로박테리아세아로부터 유래된 폴리펩티드는 하프니아 알베이 종 폴리펩티드와 같은 하프니아 폴리펩티드이다.
본 발명의 폴리펩티드는 또한 효모 폴리펩티드 또는 사상 진균 폴리펩티드와 같은 진균 폴리펩티드일 수 있다.
상기 미생물의 균주는 American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) 및 Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)와 같은 많은 균주 보관소에서 쉽게 공중에 입수가능하다.
또한, 이러한 폴리펩티드는 상기 언급한 프로브를 사용하여 자연(예컨대 흙, 퇴비, 물 등)으로부터 분리된 미생물을 포함하여 다른 공급원으로부터 식별 및 입수할 수 있다. 자연 서식지로부터 미생물을 분리하는 기술은 당업계 공지되어 있다. 그 다음 폴리뉴클레오티드는 또 다른 미생물의 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 유사하게 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 프로브(들)로 검출하면, 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 분리 또는 클로닝할 수 있다(예컨대 Sambrook et al., 1989, 상기 참조).
본 발명의 폴리펩티드는 또한 다른 폴리펩티드가 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단 또는 그것의 단편에 융합되어 있는 융합된 폴리펩티드 또는 분리가능한 융합 폴리펩티드를 포함한다. 융합된 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 일부)을 본 발명의 뉴클레오티드 서열(또는 그것의 일부)에 융합함으로써 제조된다. 융합 폴리펩티드를 제조하는 기술은 당업계 공지되어 있으며 이들이 프레임 내에 존재하고 융합된 폴리펩티드의 발현이 동일한 프로모터(들) 및 터미테이터의 조절하에 존재하도록 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열을 라이게이션하는 것을 포함한다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9에 나타나 있다. 또 다른 바람직한 양태에서, 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 9의 성숙한 폴리펩티드 암호화 영역이다. 본 발명은 또한 유전 암호의 퇴보 때문에 SEQ ID NO: 9와 상이한 SEQ ID NO: 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 그것의 성숙한 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포괄한다. 본 발명은 또한 파이타제 활성을 갖는 SEQ ID NO: 10의 단편을 암호화하는 SEQ ID NO: 9의 부분서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 9 중 어느 하나의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 폴리뉴클레오티드에 관한 것이며, 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413으로 구성된 폴리펩티드를 암호화한다.
폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 분리 또는 클로닝하는데 사용되는 기술은 당업계 공지되어 있으며 게놈 DNA로부터의 분리, cDNA로부터의 제조 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 게놈 DNA로부터의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝은 예컨대 잘 알려진 폴리메라제 연쇄 반응(PCR) 또는 발현 라이브러리의 항체 스크리닝을 사용하여 공유된 구조적 특징을 갖는 클로닝된 DNA 단편을 검출함으로써 행할 수 있다. 예컨대 Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York 참고. 리가제 연쇄 반응(LCR), 라이게이션된 활성화된 전사 (LAT) 및 뉴클레오티드 서열-기반 증폭(NASBA)과 같은 다른 핵산 증폭 과정을 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 헤파니아의 균주, 또는 다른 또는 관련된 유기체로부터 클로닝될 수 있으며, 따라서 예컨대 뉴클레오티드 서열의 폴리펩티드 암호화 영역의 대립유전자 또는 종 변형체일 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 75%의 SEQ ID NO: 9(즉 뉴클레오티드 100 내지 1338)의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에 대한 동일성의 정도를 갖고, 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 동일성의 정도는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%이다. 대안적 실시형태에서, 동일성의 정도는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 94%, 97%, 98%, 98.0%, 98.1%, 98.2%, 또는 적어도 98.3%이다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 변형이 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드의 합성을 위해 필요할 수 있다. 폴리펩티드에 대한 용어 "실질적으로 유사한"은 폴리펩티드의 비자연적 발생 형태를 의미한다. 이들 폴리펩티드는 그것의 본래 공급원, 예컨대 특이적 활성, 열안정성, pH-최적조건 등이 상이한 인공 변형체로부터 분리된 폴리펩티드와 일부 조작 방식에서 다를 수 있다. 변형체 서열은 SEQ ID NO: 9의 폴리펩티드 암호화 영역으로서 존재하는 뉴클레오티드 서열, 예컨대 그것의 부분서열을 기준으로, 그리고/또는 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 또 다른 아미노산 서열을 발생시키지 않지만 폴리펩티드의 생성을 위해 의도되는 숙주 유기체의 코돈 사용에 해당하는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해, 또는 상이한 아미노산 서열을 발생시킬 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해 구성될 수 있다. 뉴클레오티드 치환의 일반적인 설명을 위해서는 예컨대 Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107을 참조한다.
이러한 치환은 분자의 기능에 결정적인 영역 외부에서 이루어지며 여전히 활성 폴리펩티드를 얻을 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 활성에 필수적이므로 치환되지 않은 것이 바람직한 아미노산 잔기는 부위-지정 돌연변이 유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이 유발과 같은 당업계 알려진 과정에 따라 식별될 수 있다(예컨대, Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085 참조). 후자 기술에서, 분자 내 모든 양으로 하전된 잔기에 돌연변이가 도입되고, 얻어진 돌연변이 분자를 파이타제 활성에 대하여 테스트하여 분자의 활성에 결정적인 아미노산 잔기를 식별한다. 기질-폴리펩티드 상호작용의 부위는 또한 핵자기공명 분석, 결정학 또는 광친화성 라벨링과 같은 기술에 의해 결정되는 3차원 구조의 분석에 의해 결정된다(예컨대 de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64 참조).
본 발명은 또한 본원에 정의한 바와 같이, 중간 긴축 조건, 보다 바람직하게는 중간-높은 긴축 조건, 보다 더 바람직하게는 높은 긴축 조건, 가장 바람직하게는 매우 높은 긴축 조건하에서 (i) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338, (ii) SEQ ID NO: 9의 성숙한 폴리펩티드 암호화 부분 및/또는 (iii) (i) 및/또는 (ii) 중 어느 하나의 상보 가닥과 혼성화한, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드; 또는 대립유전자 변형체 및 그것의 부분서열(상기 Sambrook et al., 1989)에 관한 것이다. 대안적 실시형태에서, 혼성화는 매우 낮은, 또는 낮은, 긴축 조건하에서 행한다.
본 발명은 또한 (a) 매우 낮은, 낮은, 중간, 중간-높은, 높은, 또는 매우 높은 긴축 조건하에서 (i) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338, (ii) SEQ ID NO: 9의 성숙한 폴리펩티드 암호화 부분, 및/또는 (iii) (i) 및/또는 (ii) 중 어느 하나의 상보 가닥과의 DNA 집단의 혼성화; 및 (b) 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 혼성화 폴리뉴클레오티드의 분리에 의해 얻어지거나 얻을 수 있다.
핵산 구조체
본 발명은 또한 조절 서열과 양립가능한 조건하에서 적절한 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드는 다양한 방식으로 조작되어 폴리펩티드의 발현을 위해 제공된다. 발현 벡터에 의존하여 벡터로의 삽입 이전에 폴리뉴클레오티드의 서열의 조작이 요망되거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 사용하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 기술은 당업계 알려져 있다.
조절 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 적절한 프로모터 서열, 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 조절 서열을 함유한다. 프로모터는 돌연변이체, 절단, 및 혼성 프로모터를 포함하는 선택한 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 어떤 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 숙주 세포에 동종의 또는 이종의 유전자 암호화 세포외 또는 세포내 폴리펩티드로부터 얻을 수 있다.
특히 박테리아 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 구조체의 전사를 지시하기 위한 적절한 프로모터의 예는 E. coli 락 오페론, 스트렙토마이세스 코엘리컬러 아가라제 유전자(Streptomyces coelicolor agarase gene)(dagA), 바실러스 서브틸리스 레반수크라제 유전자(Bacillus subtilis levansucrase gene)(sacB), 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)(amyL), 바실러스 스테아로써모필러스 말토제닉 아밀라제 유전자(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)(amyM), 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 알파-아밀라제 유전자(Bacillus amyloliquefaciens alpha-amylase gene (amyQ), 바실러스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(Bacillus licheniformis penicillinase gene)(penP), 바실러스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자 및 원핵 베타-락타마제 유전자로부터 얻어지는 프로모터(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), 및 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25)이다. 또한 프로모터는 Scientific American, 1980, 242: 74-94의 "Useful proteins from recombinant bacteria"; 및 Sambrook et al., 1989, supra에 설명되어 있다.
사상 진균 숙주 세포에서 본 발명의 핵산 구조체의 전사를 지시하는데 적절한 프로모터의 예는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 리조무코르 메이헤이(Rhizomucor miehei) 아스파르트 프로테이나제, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 나이거 산 안정 알파-아밀라제, 아스퍼질러스 나이거 또는 아스퍼질러스 아와모리 글루코아밀라제(glaA), 리조무코르 메이헤이 리파제, 아스퍼질러스 오리재 알칼리성 프로테아제, 아스퍼질러스 오리재 트리오세 포스페이트 이소메라제, 아스퍼질러스 니듈란스 아세트아미다제, 푸사리움 베네나텀(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다제(WO 00/56900), 푸사리움 베네나텀 다리아(Fusarium venenatum Daria)(WO 00/56900), 푸사리움 베네나텀 퀸(Fusarium venenatum Quinn)(WO 00/56900), 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei) 베타-글루코시다제, 트리코더마 레세이 셀로비오히드롤라제 I, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 I, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 II, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 III, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 IV, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 V, 트리코더마 레세이 자일라나제 I, 트리코더마 레세이 자일라나제 II, 트리코더마 레세이 베타-자일로시다제, 및 NA2-tpi 프로모터(아스퍼질러스 나이거 중성 알파-아밀라제 및 아스퍼질러스 오리재 트리오세 포스페이트 이소메라제를 위한 유전자로부터의 프로모터의 혼성)을 위한 유전자로부터 얻어지는 프로모터; 및 이들의 돌연변이, 절단된, 및 혼성 프로모터이다.
효모 숙주에서, 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비시아 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비시아 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비시아 알콜 디히드로게나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(ADH1,ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비시아 트리오세 포스페이트 이소메라제(TPI), 사카로마이세스 세레비시아 메탈로티오닌(CUP1), 사카로마이세스 세레비시아 3-포스포글리세레이트 키나제 및 피키아 파스토리스 알콜 옥시다제(AOX1)를 위한 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 프로모터는 Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488에 설명되어 있다.
조절 서열은 또한 적절한 전사 터미테이터 서열, 전사 종결을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 서열일 수 있다. 터미테이터 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 동작가능하게 연결된다. 선택한 숙주 세포에서 기능하는 어떤 터미테이터를 본 발명에서 사용할 수 있다.
사상 진균 숙주 세포를 위해 바람직한 터미테이터는 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니듈란스 안트라닐레이트 신타제, 아스퍼질러스 나이거 알파-글루코시다제 및 푸사리움 옥시스포럼 트립신-유사 프로테아제를 위한 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포를 위한 바람직한 터미테이터는 사카로마이세스 세레비시아 에놀라제, 사카로마이세스 세레비시아 시토크롬 C (CYC1) 및 사카로마이세스 세레비시아 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제를 위한 유전자로부터 얻어진다. 효모 숙주 세포를 위한 다른 유용한 터미테이터는 상기의 Romanos et al., 1992에 설명되어 있다.
조절 서열은 또한 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 적절한 리더 서열, mRNA의 미번역 영역이다. 리더 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 동작가능하게 연결된다. 선택한 숙주 세포에서 기능하는 어떤 리더 서열을 본 발명에서 사용할 수 있다.
조절 서열은 또한 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 적합한 리더 서열, mRNA의 비번역된 영역일 수 있다. 리더 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 조작가능하게 연결된다. 선택의 숙주 세포에서 기능하는 어떤 리더 서열을 본 발명에서 사용할 수 있다.
사상 진균 숙주 세포를 위한 바람직한 리더 서열은 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제 및 아스퍼질러스 니듈란스 트리오세 포스페이트 이소메라제를 위한 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포를 위한 적절한 리더 서열은 사카로마이세스 세레비시아 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비시아 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비시아 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비시아 알콜 디히드로제나제/글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제(ADH2/GAP)을 위한 유전자로부터 얻어진다.
조절 서열은 또한 폴리아데닐화 서열, 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 동작가능하게 연결되고 전사시 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되어 폴리아데노신 잔기를 전사되는 mRNA로 첨가하는 서열일 수 있다. 선택한 숙주 세포에서 기능하는 어떤 폴리아데닐화 서열을 본 발명에서 사용할 수 있다.
사상 진균 숙주 세포를 위한 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라제, 아스퍼질러스 니듈란스 안트라닐레이트 신타제, 푸사리움 옥시스포럼 트립신-유사 프로테아제, 및 아스퍼질러스 나이거 알파-글루코시다제를 위한 유전자로부터 얻어진다.
효모 숙주 세포를 위한 유용한 폴리아데닐화 서열이 Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990에 설명되어 있다.
조절 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 연결된 아미노산 서열을 암호화하고 암호화된 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 지시하는 신호 펩티드 암호화 영역일 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 암호화 서열의 5' 말단은 분비되는 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 영역의 세그먼트와 함께 번역 리딩 프레임에 자연적으로 연결된 신호 펩티드 암호화 영역을 본래 함유한다. 대안적으로, 암호화 서열의 5' 말단은 암호화 서열에 대하여 외래인 신호 펩티드 암호화 영역을 함유할 수 있다. 외래 신호 펩티드 암호화 영역은 암호화 서열이 신호 펩티드 암호화 영역을 자연적으로 함유하지 않는 경우 필요할 수 있다. 대안적으로, 외래 신호 펩티드 암호화 영역은 자연 신호 펩티드 암호화 영역을 간단히 대체하여 폴리펩티드의 분비를 향상시킬 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 선택한 숙주 세포의 분비 경로로 지시하는 어떤 신호 펩티드 암호화 영역을 본 발명에서 사용할 수 있다.
박테리아 숙주 세포를 위한 효과적인 신호 펩티드 암호화 영역은 바실러스 NCIB 11837 말토제닉 아밀라제, 바실러스 스테아로써모필러스 알파-아밀라제, 바실러스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실러스 리케니포르미스 베타-락타마제, 바실러스 스테아로써모필러스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM) 및 바실러스 서브틸리스 prsA을 위한 유전자로부터 얻어진 신호 펩티드 암호화 영역이다. 다른 신호 펩티드가 Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137에 설명되어 있다.
사상 진균 숙주 세포를 위한 효과적인 신호 펩티드 암호화 영역은 아스퍼질러스 오리재 TAKA 아밀라제, 아스퍼질러스 나이거 중성 아밀라제, 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라제, 리조무코르 메이헤이 아스파르트 프로테이나제, 휴미콜라 이솔렌(Humicola insolens) 셀룰라제 및 휴미콜라 랑귀노사(Humicola lanuginosa) 리파제를 위한 유전자로부터 얻어진 신호 펩티드 암호화 영역이다.
효모 숙주 세포를 위한 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비시아 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비시아 인버타제를 위한 유전자로부터 얻어진다. 다른 유용한 신호 펩티드 암호화 영역은 상기의 Romanos et al., 1992 및 Xiong et al in Journal of Applied Microbiology 2005, 98, 418-428에 설명되어 있다.
바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 33을 암호화하는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 1 내지 99이다. 다른 바람직한 양태에서, 신호 펩티드 암호화 영역은 SEQ ID NO: 12의 아미노산 1 내지 27을 암호화하는 SEQ ID NO: 11의 뉴클레오티드 1 내지 81이다.
조절 서열은 또한 폴리펩티드의 아미노 말단에 위치한 아미노산 서열을 암호화하기 위한 프로펩티드 암호화 영역일 수 있다. 얻어진 폴리펩티드는 프로폴리펩티드 또는 프로폴리펩티드(또는 일부 경우 자이모겐)로서 알려진다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 비활성이며 프로폴리펩티드로부터의 프로펩티드의 촉매적 또는 자기촉매적 분열에 의해 성숙한 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 암호화 영역은 바실러스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE), 바실러스 서브틸리스 중성 프로테아제(nprT), 사카로마이세스 세레비시아 알파-인자, 리조무코르 미에헤이 아스파르트 프로테이나제 및 마이셀리오프토라 미셀리오프토라 테르모필라 락카제(WO 95/33836)를 위한 유전자로부터 얻을 수 있다.
신호 펩티드와 프로핍테드 영역 모두가 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 경우, 프로펩티드 영역은 폴리펩티드의 아미노 말단 다음에 위치하고 신호 펩티드 영역은 프로펩티드 영역의 아미노 말단 다음에 위치한다.
숙주 세포의 성장에 관하여 폴리펩티드의 발현의 조정을 허용하는 조정 서열을 첨가하는 것이 요망될 수 있다. 조정 시스템의 예는 조정 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 대한 반응에서 활성화 또는 억제되는 유전자의 발현을 야기하는 것이다. 원핵 시스템 내의 조절 시스템은 lac, tac 및 trp 오퍼레이터 시스템을 포함한다. 효모에서, ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템을 사용할 수 있다. 사상 진균에서, TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 아스퍼질러스 나이거 글루코아밀라제프로모터 및 아스퍼질러스 오리재 글루코아밀라제 프로모터를 조정 서열로서 사용할 수 있다. 조정 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 허용하는 것이다.
발현 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프로모터 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 상기 설명한 다양한 핵산과 조절 서열은 함께 결합하여, 하나 이상의 편리한 제한 부위를 포함하여 이러한 부위에서 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 삽입 또는 치환을 허용할 수 있는 재조합 발현 벡터를 생성할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 발현을 위한 적절한 벡터로 뉴클레오티드 서열 또는 서열을 포함하는 핵산 구조체를 삽입함으로써 발현될 수 있다. 발현 벡터의 생성에 있어서, 암호화 서열은 암호화 서열이 발현을 위한 적절한 조절 서열과 동작가능하게 연결되도록 벡터에 위치한다.
재조합 발현 벡터는 편리하게 재조합 DNA 과정을 적용할 수 있고 뉴클레오티드 서열의 발현을 야기할 수 있는 어떤 벡터(예컨대 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 통상적으로 벡터가 도입되는 숙주 세포와 벡터의 양립성에 의존할 것이다. 벡터는 직쇄형 또는 폐쇄된 원형 플라스미드일 수 있다.
벡터는 그것의 복제가 염색체 복제와 독립적인 자발적 복제 벡터, 즉 염색체외 실체로서 존재하는 벡터, 예컨대 플라스미드, 염색체외 구성요소, 미니염색체 또는 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자기-복제를 확보하기 위한 어떤 수단을 함유할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포로 도입될 때 게놈으로 통합되고 통합된 염색체(들)와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 숙주 세포의 게놈 또는 트랜스포손으로 도입되는 모든 DNA를 함께 함유하는 단일 벡터 또는 플라스미드 또는 둘 이상의 벡터 또는 플라스미드를 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터는 형질변환되는 세포의 쉬운 선택을 허용하는 하나 이상의 선택성 마커를 함유하는 것이 바람직하다. 선택성 마커는 그 산물이 살생물 또는 바이러스 내성, 중금속에 대한 내성, 영양요구체에 대한 원영양성 등을 제공하는 유전자이다.
조건적 필수 유전자는 비-항생물질 선택성 마커로서 기능할 수 있다. 박테리아인 조건적 필수 비-항생물질 선택성 마커의 비제한적 예는 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스 또는 다른 바실러스로부터의 dal 유전자이며, 이것은 박테리아들을 D-알라닌의 부재에서 배양했을 때만 필수적이다. 또한 UDP-갈락토스의 턴오버에 포함되는 유전자 암호화 효소는 세포가 갈락토스의 존재하에서 성장되거나 갈락토스의 존재를 유발시키는 배지에서 성장될 때 세포에서 조건적 필수 마커로서 기능할 수 있다. 이러한 유전자의 비제한적 예는 B. 서브틸리스 또는 B. 리케니포르미스 암호화 UTP-의존 포스포릴라제(EC 2.7.7.10), UDP-글루코스-의존 유리딜릴트랜스페라제(EC 2.7.7.12), 또는 UDP-갈락토스 에피메라제(EC 5.1.3.2)로부터의 것이다. 또한 바실러스들의 xylA와 같은 자일로스 이소메라제 유전자를 단일 탄소원으로서 자일로스와 함께 최소 배지에서 성장한 세포에서 선택성 마커로서 사용할 수 있다. 글루코네이트, gntK 및 gntP을 사용하는데 필요한 유전자는 단일 탄소원으로서 글루코네이트와 함께 최소 배지에서 성장한 선택성 마커로서 사용될 수 있다. 조건적 필수 유전자의 다른 예는 당업계 알려져 있다. 항생물질 선택성 마커는 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜, 에리스로마이신, 테트라사이클린, 네오마이신, 하이그로마이신 또는 메토트렉사트와 같은 항생물질에 대한 항생물질 내성을 부여한다.
효모 숙주 세포를 위한 적절한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3이다. 사상 진균 숙주 세포에 사용하기 위한 선택성 마커는 amdS(아세트아미다제), argB(오르니틴 카르바모일트랜스페라제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스페라제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스페라제), niaD(니트레이트 리덕타제), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 디카르복실라제), sC(설페이트 아데닐트랜스페라제) 및 trpC(안트라닐레이트 신타제), 및 이들의 동등물을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 아스퍼질러스 세포에서 사용하기에 바람직한 것은 아스퍼질러스 니듈란스 또는 아스퍼질러스 오리재의 amdS 및 pyrG 유전자 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스의 bar 유전자이다.
본 발명의 벡터는 숙주세포의 게놈으로 벡터의 통합 또는 게놈 독립적인 세포에서 벡터의 자발 복제를 허용하는 구성요소(들)를 바람직하게 함유한다.
숙주 세포 게놈으로의 통합을 위해서, 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 동종 또는 비동종 재조합에 의한 게놈으로의 통합을 위한 벡터의 다른 구성요소에 의존한다. 대안적으로, 벡터는 염색체(들) 내의 정확한 위치(들)에 동종 재조합에 의한 숙주 세포의 게놈으로의 통합을 지시하기 위한 추가의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 정확한 위치에서의 통합의 가능성을 증가시키기 위해서, 통합 구성요소는 충분한 수의 핵산, 예컨대 100 내지 10,000 염기쌍, 바람직하게는 400 내지 10,000 염기쌍, 가장 바람직하게는 800 내지 10,000 염기쌍을 함유하는 것이 바람직하며, 동종 재조합의 확률을 향상시키기 위해 해당 표적 서열과 높은 동일성 정도를 가진다. 통합 구성요소는 숙주 세포의 게놈에서 표적 서열과 동종인 어떤 서열일 수 있다. 또한, 통합 구성요소는 비암호화 또는 암호화 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 한편, 벡터는 비동종 재조합에 의해 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
자발 복제를 위해서, 벡터는 해당 숙주 세포에서 벡터의 자발적 복제를 가능하게 하는 복제의 기원을 더 포함할 수 있다. 복제의 기원은 세포에서 기능하는 자발 복제를 매개하는 어떤 플라스미드 리플리케이터일 수 있다. 용어 "복제의 기원" 또는 "플라스미드 리플리케이터"는 본원에서 플라스미드 또는 벡터를 생체내 복제가능하게 하는 뉴클레오티드 서열로서 정의된다.
복제의 박테리아 기원의 예는 E. coli에서의 복제를 허용하는 플라스미드 pBR322, pUC19, pACYC177 및 pACYC184, 및 바실러스에서의 복제를 허용하는 pUB110, pE194, pTA1060 및 pAMβ1의 복제의 기원이다.
효모 숙주 세포에서 사용하기 위한 복제의 기원의 예는 2미크론 복제의 기원, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합 및 ARS4와 CEN6의 조합이다.
사상 진균 세포에 유용한 복제의 기원의 예는 AMA1 및 ANS1(Gems et al., 1991, Gene 98:61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883)이다. AMA1 유전자의 분리 및 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구성은 WO 00/24883에 개시된 방법에 따라 달성할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오티드 중 하나 이상의 복제물을 숙주 세포로 삽입시켜서 유전자 산물의 제조를 증가시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 복제수 증가는 서열의 적어도 하나의 추가적 복제물을 숙주 세포 게놈으로 통합함으로써, 또는 폴리뉴클레오티드를 갖는 증폭가능 선택성 마커 유전자를 포함함으로써 얻을 수 있으며, 이때 선택성 마커 유전자의 증폭된 복제물을 함유하는 세포 및 이것에 의한 폴리뉴클레오티드의 추가적 복제물은 적절한 선택성 제제의 존재하에서 세포를 배양함으로써 선택할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 구성하기 위해 상기 설명한 구성요소를 라이게이션하는데 사용되는 과정은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예컨대 상기의 Sambrook et al., 1989 참조).
숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이며, 폴리펩티드의 재조합 제조에 유리하게 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 앞서 설명한 바와 같이 벡터가 염색체 성분 또는 자기-복제 염색체외 벡터로서 유지되도록 숙주 세포로 도입된다. 용어 "숙주 세포"는 복제 동안 발생하는 돌연변이에 기인하여 모세포와 동일하지 않은 모세포의 어떤 자손을 포괄한다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩티드 및 그것의 공급원을 암호화하는 유전자에 크게 의존할 것이다.
숙주 세포는 단세포 미생물, 예컨대 원핵생물, 또는 비-단세포 미생물, 예컨대 진핵생물일 수 있다.
유용한 단세포 미생물은 바실러스 세포, 예컨대 바실러스 알카로필러스, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스, 바실러스 브레비스, 바실러스 서큘란스, 바실러스 클라우시, 바실러스 코아굴란스, 바실러스 라우터스, 바실러스 렌터스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 메가테리움, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 투린기엔시스; 또는 스트렙토마이세스 세포, 예컨대 스트렙토마이세스 리비단스 및 스트렙토마이세스 뮤리너스를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 그램 양성 박테리아, 또는 E. coli 및 슈도모나스 sp.와 같은 그램 음성 박테리아와 같은 박테리아 세포이다. 바람직한 양태에서, 박테리아 숙주 세포는 바실러스 렌터스, 바실러스 리케니포르미스, 바실러스 스테아로써모필러스 또는 바실러스 서브틸리스 세포이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 바실러스 세포는 호알칼리성(alkalophilic) 바실러스이다.
박테리아 숙주 세포로 벡터의 도입은, 예컨대 컴피턴트 세포(예컨대 Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 참조)를 사용하는 원형질체 형질전환(예컨대Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), 전기천공법(예컨대 Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751 참조), 또는 접합(예컨대 Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278 참조)에 의해 행할 수 있다.
숙주 세포는 또한 포유류, 곤충, 식물 또는 진균 세포와 같은 진핵생물일 수 있다.
바람직한 양태에서, 숙주 세포는 진균 세포이다. 본원에 사용되는 "진균"은 자낭균(phyla Ascomycota), 담자균(Basidiomycota), 병꼴균(Chytridiomycota) 및 접합균(Zygomycota)(Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK에 정의됨) 및 난균(Oomycota)(Hawksworth et al., 1995, supra, page 171에 설명됨) 및 모든 미토스포릭 진균(mitosporic fungi)(상기의 Hawksworth et al., 1995)을 포함한다.
보다 바람직한 양태에서, 진균 숙주 세포는 효모 세포이다. 본원에서 사용되는 "효모"는 유포자 효모(Endomycetales), 담자균 효모 및 불완전 진균에 속하는 효모(Blastomycetes)를 포함한다. 효모의 분류는 향후 변화될 수 있으므로, 본 발명의 목적으로 위해서, 효모는 Biology and Activities of Yeast(Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)에 설명된 바와 같이 정의될 수 있다.
보다 더 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 또는 야로이야(Yarrowia) 세포이다.
가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 메타놀리카(Pichia methanolica), 사카로마이세스 카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 디아스타티커스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 더글라시(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis) 또는 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis) 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 효모 숙주 세포는 야로이야 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포이다.
또 다른 보다 바람직한 양태에서, 진균 숙주 세포는 사상 진균 세포이다. "사상 진균"은 하위 체계의 진균문 및 난균문의 모든 사상 형태를 포함한다(상기 Hawksworth et al., 1995에 정의됨). 일반적으로 사상 진균은 키틴, 셀룰로오스, 글루칸, 키토산, 만난 및 다른 복합 다당류로 구성된 균사 벽에 의해 특징화된다. 영양 생장은 균계 신장에 의하고 탄소 이화작용은 절대적으로 호기성이다. 한편, 사카로마이세스 세레비시아와 같은 효모에 의한 영양 성장은 단세포 엽상체의 버딩(budding)에 의하고 탄소 이화작용은 발효성일 수 있다.
더욱 더 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 아크레모니움(Acremonium), 아스퍼질러스(Aspergillus), 오레오바시디움(Aureobasidium), 브제르칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 코프리너스(Coprinus), 코리오러스(Coriolus), 크립토코커스(Cryptococcus), 필로바시디움(Filobasidium), Fusarium(푸사리움), 후미콜라(Humicola), 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움(Penicillium), 파네로차트(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플레유로터스(Pleurotus), 스키조필럼(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 터모아스커스(Thermoascus), 티에라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes) 또는 트리코데르마(Trichoderma) 세포이다.
가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 푸미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 포에티더스(Aspergillus foetidus), 아스퍼질러스 자포니커스(Aspergillus japonicus), 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 나이거 또는 아스퍼질러스 오리재 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미니어룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 샘부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크럼(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리치오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 술퍼레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토루로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리초테시오이데스(Fusarium trichothecioides) 또는 푸사리움 베네나텀(Fusarium venenatum) 세포이다. 또 다른 가장 바람직한 양태에서, 사상 진균 숙주 세포는 브제르칸데라 아더스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레지아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 질베스센(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 수브루파(Ceriporiopsis subrufa) 또는 세리포리옵시스 서브베미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 코프리너스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리오러스 히르수터스(Coriolus hirsutus), 휴미콜라 인솔렌스(Humicola insolens), 휴미콜라 랑퀴노사(Humicola lanuginosa), 무코르 메이헤이(Mucor miehei), 미셀리오프토라 테르모필라(Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로제눔(Penicillium purpurogenum), 파네로차트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 프레비아 라비아타(Phlebia radiata), 프레우로터스 에린지(Pleurotus eryngii), 티에라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시컬러(Trametes versicolor), 트리초데마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리초데마 코닌지(Trichoderma koningii), 트리초데르마 롱지브라치아텀(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei), 또는 트리초데르마 비리드(Trichoderma viride) 균주 세포이다.
진균 세포는 본래 공지된 방식으로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환 및 세포벽의 재생을 포함하는 과정에 의해 형질변환될 수 있다. 아스퍼질러스 및 트리초데르마 숙주 세포의 형질전환을 위한 적합한 과정은 EP 238 023 및 Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474에 설명되어 있다. 푸사리움 종의 형질변환을 위한 적합한 방법은 Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 및 WO 96/00787에 설명되어 있다. 효모는 Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 및 Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920에 설명된 과정을 사용하여 형질변환될 수 있다.
제조방법
본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서, 폴리펩티드를 야생형 형태로 제조할 수 있는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 세포는 하프니아 속, 보다 바람직하게는 하프니아 알베이이다.
본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서 숙주세포를 배양하는 단계로서, 숙주 세포는 SEQ ID NO: 9 중 어느 하나의 성숙한 폴리펩티드 암호화 영역에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 돌연변이체 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413으로 구성된 폴리펩티드를 암호화한 단계, 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에서, 세포는 당업계 잘 알려진 방법을 사용하는 폴리펩티드의 제조에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예컨대, 세포는 연구실에서 쉐이크 플라스크 배양 및 소규모 또는 대규모 발효(연속식, 배치식, 유가식 또는 고체 상태 발효를 포함), 또는 적합한 배지에서 그리고 폴리펩티드를 발현 및/또는 분리시킬 수 있는 조건하에서 작동하는 산업상 발효조에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당업계 공지된 과정을 사용하여 탄소원 및 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 행한다. 적합한 배지는 시중의 공급자로부터 입수할 수 있거나 공개된 조성에 따라 제조할 수 있다(예컨대 American Type Culture Collection의 카탈로그). 폴리펩티드가 영양 배지로 분비되면, 폴리펩티드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않으면, 세포 용해물로부터 회수될 수 있다.
폴리펩티드는 폴리펩티드에 대하여 특정된 당업계 공지된 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 이들 검출방법은 특정 항체의 사용, 폴리펩티드 산물의 형성 또는 폴리펩티드 기질의 소멸을 포함할 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드 분석은 본원에 설명된 바와 같이 폴리펩티드의 활성을 결정하는데 사용될 수 있다.
얻어진 폴리펩티드는 당업계 공지된 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드는 원심분리, 여과, 추출, 분사-건조, 증발 또는 침전을 포함하지만 여기에 제한되는 것은 아닌 종래 과정에 의해 영양 배지로부터 회수될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 크로마토그래피(예컨대 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱 및 크기 배제), 전기영동 과정(예컨대 예비 등전위 포커싱), 용해도차(예컨대 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출(예컨대 Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 참조)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 당업계 공지된 다양한 과정에 의해 정제된다.
트랜스제닉 식물
본 발명은 또한 회수가능한 양으로 폴리펩티드를 발현 및 제조하도록 본 발명의 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 트랜스제닉 식물, 식물 부위 또는 식물의 세포에 관한 것이다. 폴리펩티드는 식물 또는 식물 부위로부터 회수될 수 있다. 대안적으로, 재조합 폴리펩티드를 함유하는 식물 또는 식물 부위는 음식 또는 사료의 품질 개선, 예컨대 영양가, 미각 및 유변학적 특성의 개선, 또는 영양저해 인자의 파괴를 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드는 종자에서 내배유 저장 액포를 목표로 한다. 이는 전구체로서 적절한 신호 펩티드를 사용하여 이것을 분석함으로써 얻을 수 있으며, Horvath et al in PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, no. 4, p. 1914-1919을 참조한다.
트랜스제닉 식물은 쌍떡잎식물(dicot) 또는 외떡잎식물(monocot) 또는 이들의 조작된 변형체일 수 있다. 외떡잎식물의 예는 왕포아풀(블루 글래스, Poa)과 같은 풀, 페스투카(Festuca), 롤륨(Lolium)과 같은 사료초, 아그로스티스(Agrostis)와 같은 북방형목초, 및 곡초, 예컨대, 밀, 귀리, 호밀, 보리, 벼, 수수, 라이밀(밀(Triticum)과 호밀(Secale)의 안정화된 잡종), 및 옥수수(corn)가 있다. 쌍떡잎 식물의 예는 담배, 해바라기(Helianthus), 목화(Gossypium), 루핀, 감자, 사탕무, 완두콩, 강낭콩 및 대두와 같은 콩과식물 및 콜리플라워, 평지씨 및 밀접하게 관련된 모델 유기체 애기장대와 같은 십자화 식물(Brassicaceae 과)이 있다. 예컨대 미국특허 제5,689,054호 및 미국특허 제6,111,168호에 설명되어 있는 저급-파이테이트 식물은 조작 식물의 예이다.
식물 부위의 예는 줄기, 캘러스, 잎, 뿌리, 열매, 종자 및 구근, 그리고 이들 부위를 포함하는 개별 조직, 예컨대 표피, 잎살, 유조직, 관다발 조직, 분열 조직이 있다. 또한 엽록체, 아포플라스트, 미토콘드리아, 액포, 퍼옥시좀 및 세포질과 같은 특정한 식물 세포 구성부분이 식물 부위로 간주된다. 또한, 조직 기원인 모든 식물 세포는 식물 부위로 간주된다. 마찬가지로, 본 발명의 이용을 용이하게 하기 위해서 분리된 특정 조직 및 세포와 같은 식물 부위, 예컨대 배낭, 내배유, 호분 및 종피도 식물 부위로 간주된다.
이러한 식물, 식물 부위 및 식물 세포의 후대도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 폴리펩티드를 발현하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포는 당업계 알려진 방법에 따라 구성될 수 있다. 간단히 말해서, 식물 또는 식물 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 발현 구조체를 식물 숙주 게놈으로 조합시키고, 얻어진 변형된 식물 또는 식물 세포를 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포로 번식시킴으로써 구성된다.
편리하게는, 발현 구조체는 선택한 식물 또는 식물의 부위에서 핵산 서열의 발현에 필요한 적절한 조정 서열과 동작가능하게 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산 구조체이다. 또한, 발현 구조체는 발현 구조체가 통합된 숙주 세포 및 구조체를 해당 식물로 도입하는데 필요한 DNA 서열을 식별하는데 유용한 선택성 마커를 포함할 수 있다(후자는 사용하는 DNA 도입법에 의존함).
프로모터 및 터미네이터 서열 및 선택적으로 신호 또는 전이 서열과 같은 조정 서열의 선택은, 예컨대 폴리 펩티드를 발현하기 위해 요망되는 장소, 시간 및 방법을 기준으로 결정한다. 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현은 구조적이거나 유도적일 수 있거나, 또는 특정 단계 또는 조직에 발달적일 수 있고, 유전자 산물은 특정 세포 구획, 조직, 또는 종자 또는 잎과 같은 식물 부위를 목적으로 할 수 있다. 조정 서열은, 예컨대 Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506에 설명되어 있다.
구조적 발현을 위해서, 하기 프로모터를 사용할 수 있다: 35S-CaMV 프로모터(Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294), 옥수수 유비퀴틴 1(Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and Promotor activity following transfer to protoplasts by electroporation), 또는 벼 액틴 1 프로모터(Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. and Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5' region Activity in Transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). 기관-특이적 프로모터는, 예컨대 종자, 감자 구근 및 과일과 같은 저장 싱크 조직으로부터의 프로모터(Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), 또는 분열조직과 같은 대사 싱크 조직으로부터 프로모터(Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), 벼로부터의 글루텔린, 프롤라민, 글로불린 또는 알부민과 같은 종자 특이적 프로모터(Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), 레구민 B4로부터의 잠두 프로모터 및 잠두로부터의 미지의 종자 단백질 유전자(Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), 종자 유체(oil body) 단백질로부터의 프로모터(Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), 유체(Brassica napus)로부터의 저장 단백질 napA 프로모터 또는 예컨대 WO 91/14772에 설명된 바와 같이 당업계에 알려진 다른 종자 특이적 프로모터일 수 있다. 또한, 프로모터는 벼 또는 토마토로부터의 rbcs 프로모터와 같은 잎 특이적 프로모터(Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000), 클로렐라 바이러스 아데닌 메틸트랜스페라제 유전자 프로모터(Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), 또는 벼로부터의 aldP 유전자 프로모터(Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), 또는 감자 pin2 프로모터와 같은 상처 유도 프로모터(Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588)일 수 있다. 또한, 프로모터는 온도, 건조 또는 염분 변화와 같은 비생물적 처리에 의해 유도가능하거나, 또는 프로모터를 활성화하는 외생적으로 적용된 물질, 예컨대 에탄올, 오데스트로젠, 식물 호르몬 유사 에틸렌, 아브시스산, 지베렐린산, 및/또는 중금속에 의해 유도가능할 수 있다.
프로모터 인핸서 구성요소을 사용하여 식물에서 폴리펩티드의 더 높은 발현을 달성할 수도 있다. 예컨대, 프로모터 인핸서 구성요소는 프로모터와 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 간에 위치한 인트론일 수 있다. 예컨대, 상기의 Xu et al., 1993는 발현을 향상시키기 위한 벼 액틴 1 유전자의 제1 인트론의 사용을 개시한다.
또한, 코돈 사용을 해당 식물 종에 대하여 최적화하여 발현을 개선할 수 있다(상기 언급한 Horvath et al 참조).
선택성 마커 유전자 및 발현 구조체의 어떤 다른 부분은 당업계에서 입수가능한 것들로부터 선택할 수 있다.
핵산 구조체는 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이러스-매개 형질전환, 미량주사법, 입자 주입, 유전자총 형질전환 및 전기천공법을 포함하는 당업계에 알려진 종래 기술에 따라 식물 게놈으로 조합된다(Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
현재, 다른 형질전환 방법이 더 자주 사용되더라도, 아그로박테리움 투메파시언스-매개 유전자 이동이 트랜스제닉 쌍떡잎 식물의 발생을 위해 선택한 방법이고(개요에 대해서는 Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38 참조), 외떡잎 식물을 형질전환하는데도 사용할 수 있다. 아그로박테리움 접근을 보완하는 트랜스제닉 외떡잎식물의 발생을 위해 선택한 방법은 배아 캘러스의 입자 주입(형질전환 DNA가 코팅된 미세 금 또는 텅스텐 입자) 또는 배아 발아(Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674)이다. 외떡잎 식물의 형질전환을 위한 대안적 방법은 Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428에 설명된 바와 같이 원형질체 형질전환에 기반한다.
형질전환 후, 그 안에 조합된 발현 구조체를 갖는 형질전환체를 선택하고 당업계 잘 알려진 방법에 따라 완전한 식물로 재생시킨다. 형질전환 과정은 대개 예컨대 두개의 분리 T-DNA 구조체를 사용한 동시 형질전환 또는 특이적 재조합 효소에 의한 선택 유전자의 부위 특이적 적출을 사용하여, 재생 동안 또는 발생 후 선택 유전자의 선택적 제거를 위해 디자인된다.
본 발명은 또한 (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서 본 발명의 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
트랜스제닉 동물
본 발명은 또한 트랜스제닉 비-인간 동물 및 이들의 산물 또는 구성요소에 관한 것이며, 이것의 예는 젖 및 혈액과 같은 체액, 장기, 살 및 동물 세포이다. 예컨대 포유동물 세포에서 단백질 발현을 위한 기술은 당업계 알려져 있으며, 예컨대 핸드북 Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999), 및 유전자 전사, RNA 가공 및 번역후 가공에 관련된 이 시리즈의 3개의 다른 핸드북을 참조한다. 일반적으로 말해서, 트랜스제닉 동물을 제조하기 위해서, 폴리펩티드를 발현 및 제조하도록 본 발명의 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 사용하여 선택한 동물의 선택한 세포를 형질전환한다. 폴리펩티드는 동물, 예컨대 암컷 동물의 젖로부터 회수될 수 있거나, 또는 폴리펩티드는 동물 자체의 이익을 위해, 예컨대 동물의 소화를 보조하기 위해 발현될 수 있다. 동물의 예는 이하 동물 사료로 표제된 단락에서 설명된다.
동물의 젖으로부터 폴리펩티드를 회수하기 위한 관점에서 트랜스제닉 동물을 제조하기 위해서, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를, 예컨대 적절한 젖 단백질 프로모터를 포함하는 전이유전자 발현 벡터 및 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 사용하여 해당 동물의 수정란에 삽입시킬 수 있다. 전이유전자 발현 벡터는 수정란으로 미세 주입되고, 바람직하게는 염색체로 영구적으로 통합된다. 일단 수정란이 성장 및 분열하기 시작하면, 잠재적 배아를 대리모로 이식하고, 전이유전자를 보유하는 동물을 식별한다. 그 다음 얻어진 동물을 종래 번식법에 의해 번식시킬 수 있다. 동물의 젖으로부터 폴리펩티드를 정제할 수 있고, 예컨대 Meade, H.M. et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. J. M. Fernandez and J. P. Hoeffler (eds.), Academic Press을 참조한다.
대안적으로, 폴리펩티드를 암호화하는 전이유전자를 포함하는 이종의 전이유전자 구조체를 포함하는 핵산 서열을 그것의 체세포 및/또는 생식세포의 게놈에 보유하는 트랜스제닉 비-인간 동물을 제조하기 위해서, WO 00/064247에 설명된 바와 같이 전이유전자를 폴리펩티드의 침샘 특이적 발현을 위한 제1 조정 서열로 작동가능하게 연결할 수 있다.
조성물 및 사용
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물 및 이들을 사용방법에 관한 것이다.
폴리펩티드 조성물은 당업계 알려진 방법에 따라 제조할 수 있으며, 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 예컨대, 폴리펩티드 조성물은 과립 또는 미세과립 형태일 수 있다. 조성물에 포함되는 폴리펩티드는 당업계 알려진 방법에 따라 안정화될 수 있다.
본 발명의 파이타제를 어떤 산업적 환경에서, 예컨대 파이테이트, 피트산 및/또는 미오-이노시톨의 모노-, 디-, 트리-, 테트라- 및/또는 펜타-포스페이트의 분해를 위해 사용할 수 있다. 이들 화합물의 포스페이트 모이어티가 금속 이온과 같은 2가 및 3가 양이온, 즉 칼슘, 철, 아연 및 마그네슘 그리고 미량 미네랄 망간, 구리 및 몰리브덴의 영양적으로 필수적인 이온을 킬레이트한다는 것이 잘 알려져 있다. 또한, 피트산은 정전 상호작용에 의해 단백질을 어느 정도 결합할 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 사용은 동물 사료 제조물(사람의 식품 포함) 또는 이러한 제조물의 첨가물에 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩티드는 동물 사료의 영양가의 개선을 위해 사용될 수 있다. 동물 사료(인간 식품 포함)의 영양가 개선의 비제한적 예는: 사료 소화능력 개선; 동물의 성장 촉진; 사료 효율성 개선; 단백질의 생체-이용성 개선; 소화가능한 포스페이트의 수준 증가; 파이테이트의 방출 및/또는 분해 개선; 미량 미네랄의 생체-이용성 개선; 대량 미네랄의 생체-이용성 개선; 보충적인 포스페이트, 미량 미네랄 및/또는 대량 미네랄의 첨가 필요성 제거; 및/또는 난각 품질 개선이다. 그러므로 사료의 영양가가 증가하고, 성장 속도 및/또는 체중 증가 및/또는 사료 전환(즉, 체중 증가에 대한 섭취 사료의 중량)이 개선된다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드는 비료의 파이테이트 수준 감소를 위해 사용될 수 있다.
동물, 동물 사료 및 동물 사료 첨가물
용어 동물은 사람을 포함하여 모든 동물을 포함한다. 동물의 예는 비-반추동물 및 반추 동물이다. 반추 동물은, 예컨대 양, 염소, 말 및 소, 예컨대 육용우, 젖소 및 어린 송아지와 같은 동물을 포함한다. 특정 실시형태에서, 동물은 비-반추 동물이다. 비-반추 동물은 단위 동물, 예컨대 돼지 또는 돼지들(새끼 돼지, 성장 돼지 및 암퇘지를 포함하지만 이에 한정되지 않음); 칠면조 및 닭과 같은 가금류(브로일러 닭, 레이어를 포함하지만 이에 한정되지 않음); 어린 송아지; 및 어류(연어, 송어, 틸라피아, 메기 및 잉어를 포함하지만 이에 한정되지 않음); 및 갑각류(쉬림프 및 프라운을 포함하지만 이에 한정되지 않음)을 포함한다.
용어 사료 또는 사료 조성물은 동물에 의한 섭취에 적합하거나 의도되는 어떤 화합물, 제조물, 혼합물 또는 조성물을 의미한다.
본 발명에 따른 사용에서, 폴리펩티드는 규정식 전, 후 또는 동시에 공급할 수 있다. 후자가 바람직하다.
특정 실시형태에서, 사료에 첨가되는 형태의 또는 사료 첨가물에 포함되는 경우의 폴리펩티드는 실질적으로 순수하다. 특정 실시형태에서, 이것은 잘 정의된다. 용어 "잘-정의된"은 파이타제 제조물이 크기-배제 크로마토그래피에 의해 결정된 바와 같이 적어도 50% 순수하다는 것을 의미한다(WO 01/58275의 실시예 12 참조). 다른 특정 실시형태에서, 파이타제 제조물은 이 방법에 의해 결정된 바와 같이 적어도 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 또는 적어도 95% 순수하다.
실질적으로 순수한 및/또는 잘-정의된 폴리펩티드 제조물이 유리하다. 예컨대, 다른 폴리펩티드의 방해 또는 오염이 본질적으로 없는 폴리펩티드를 사료에 정확하게 투여하는 것이 매우 용이하다. 용어 정확하게 투여는 특히 일관되고 일정한 결과를 얻을 목적 및 원하는 효과를 기준으로 한 최적화 투여량의 가능성을 의미한다.
그러나, 동물 사료에 사용하기 위해서, 본 발명의 파이타제 폴리펩티드는 그 정도로 순수할 필요는 없으며; 즉 다른 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 이 경우 파이타제 제조물로 명명될 수 있다.
파이타제 제조물은 (a) 사료에 직접 첨가(또는 단백질의 처리 과정에서 직접 사용)할 수 있거나, 또는 (b) 사료에 후속하여 첨가하는 사료 첨가제 또는 예비혼합물과 같은 하나 이상의 중간 조성물의 제조에 사용(또는 처리 과정에서 사용)할 수 있다. 상기 설명된 순도의 정도는 상기 (a) 또는 (b)에 따라 사용되던지 그렇지 않던지간에 원 폴리펩티드 제조물의 순도를 의미한다.
이 정도 등급의 순도를 갖는 폴리펩티드는 특히 재조합 제조방법을 사용하여 얻을 수 있는 반면, 폴리펩티드를 전통적인 발효 방법으로 제조하는 경우 이들을 쉽게 얻어지지 않고 또한 매우 높은 배치-투-배치 변형을 적용한다.
이러한 폴리펩티드 제조물을 당연히 다른 폴리펩티드와 혼합할 수 있다.
폴리펩티드는 비교적 순수한 폴리펩티드가 되는 어떤 형태, 또는 동물 사료에 첨가에 의도되는 다른 성분들과의 혼합물, 즉 소위 동물 사료를 위한 예비-혼합물과 같은 동물 사료 첨가물의 형태로 사료에 첨가할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 동물 사료, 동물 사료 첨가물, 예컨대 예비혼합물과 같은 동물 사료에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드 이외에, 본 발명의 동물 사료 첨가물은 적어도 하나의 지용성 비타민 및/또는 적어도 하나의 수용성 비타민, 및/또는 적어도 하나의 미량 미네랄을 함유한다. 사료 첨가물은 또한 적어도 하나의 대량 미네랄을 함유할 수 있다.
또한, 선택적으로 사료-첨가 성분들은 착색제, 예컨대 베타-카로틴, 아스타잔틴 및 류틴; 방향 화합물; 안정화제; 항균 펩티드; 고도불포화 지방산; 반응성 산소 발생 종; 및/또는 파이타제(EC 3.1.3.8 또는 3.1.3.26); 자일라나제(EC 3.2.1.8); 갈락타나제(EC 3.2.1.89); 알파-갈락토시다제(EC 3.2.1.22); 프로테아제(EC 3.4.-.-　), 포스포리파제 A1(EC 3.1.1.32); 포스포리파제 A2(EC 3.1.1.4); 리소포스포리파제(EC 3.1.1.5); 포스포리파제 C(3.1.4.3); 포스포리파제 D(EC 3.1.4.4); 예컨대 알파-아밀라제(EC 3.2.1.1)와 같은 아밀라제; 및/또는 베타-글루카나제 (EC 3.2.1.4 또는 EC 3.2.1.6) 중에서 선택된 적어도 하나의 폴리펩티드이다.
특정 실시형태에서, 이들 다른 폴리펩티드는 잘 정의된다(파이타제 제조물에 대하여 상기 정의한 바와 같음).
특히 바람직한 실시형태에서, 비교적 낮은 pH-최적조건을 갖는 본 발명의 파이타제는 높은 pH-최적조건을 갖는 적어도 하나의 파이타제와 조합된다. 높은 pH-최적조건의 파이타제의 바람직한 예는 바실러스 리케니포르미스 및 바실러스 서브틸리스로부터의 파이타제와 같은 비실러스 파이타제, 및 파이타제 활성을 갖는 이들의 유도체, 변형체 또는 단편이다.
본 발명의 파이타제는 또한 예컨대 아스퍼질러스 피쿰, 아스퍼질러스 나이거 또는 아스퍼질러스 아와모리 유래의 아스퍼질러스 파이타제와 같은 자낭균 파이타제; 또는 예컨대 페니오포라 라이시, 아그로사이베 페디아데스(Agrocybe pediades), 트라메트 퍼베센(Trametes pubescens) 또는 파실러스 인볼루터스(Paxillus involutus) 유래의 담자균 파이타제; 또는 파이타제 활성을 갖는 이들의 유도체, 단편 또는 변형체와 조합될 수 있다.
따라서, 본 발명의 동물 사료에서의 사용의 바람직한 실시형태, 및 본 발명의 동물 사료 첨가물 및 동물 사료의 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 파이타제는 이러한 파이타제와 조합된다.
상술한 자낭균 및 담자균 파이타제, 특히 페니오포라 라이시 유래의 RONOZYME P 파이타제 및 이들의 유도체, 변형체 및 단편은 또한 특히 동물 사료 목적으로 바실러스 파이타제, 특히 B. 리케니포르미스 파이타제 및 이들의 유도체, 단편 또는 변형체와 조합될 수 있다.
항균 펩티드(AMP's)의 예는 WO 03/044049 및 WO 03/048148에 개시된 화합물 및 폴리펩티드를 포함하여, CAP18, 류코신 A, 트리트립티신(Tritrpticin), 프로테그린-1, 타나틴, 디펜신, 락토페린, 락토페리신 및 노비스피린과 같은 오비스피린(Robert Lehrer, 2000), 플렉타신 및 스타틴, 그리고 항균 활성을 보유하는 상기의 변형체 또는 단편이 있다.
항진균 폴리펩티드(AFP's)의 예는 WO 94/01459 및 WO 02/090384에 개시된 바와 같이, 아스퍼질러스 기간테우스 및 아스퍼질러스 나이거 펩티드, 그리고 항진균 활성을 보유하는 이들의 변형체 및 단편이다.
고도불포화 지방산의 예는 C18, C20 및 C22 고도불포화 지방산, 예컨대 아라키돈산, 도코소헥사데논산, 에이코사펜타엔산 및 감마-리놀렌산이다.
반응성 산소 발생 종의 예는 과붕산염, 과황산염 또는 과탄산염과 같은 화학물질; 및 옥시다제, 옥시게나제 또는 신테타제와 같은 폴리펩티드이다.
대개 지용성 및 수용성 비타민, 그리고 미량 미네랄은 사료에 첨가하도록 의도되는 소위 예비혼합물의 일부를 형성하는 반면, 대량 미네랄은 대개 사료에 별도로 첨가된다. 이들 조성물 형태 중 어느 하나는 본 발명의 폴리펩티드로 풍부화된 경우 본 발명의 동물 사료 첨가물이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 동물 사료 첨가물은 동물 규정식 또는 사료에 0.01 내지 10.0%; 특히 0.05 내지 5.0%; 또는 0.2 내지 1.0% (%는 100g 사료 당 첨가물 g을 의미)의 수준으로 포함되도록 의도된다(또는 포함되도록 지시된다).
하기는 이들 성분의 예의 비배타적 목록이다:
지용성 비타민의 예는 비타민 A, 비타민 D3, 비타민 E, 및 비타민 K, 예컨대 비타민 K3이다.
수용성 비타민의 예는 비타민 B12, 비오틴 및 콜린, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 니아신, 엽산 및 판토텐산, 예컨대 Ca-D-판토텐산이다.
미량 미네랄의 예는 망간, 아연, 철, 구리, 요오드, 셀레늄 및 코발트이다.
대량 미네랄의 예는 칼슘, 인 및 소듐이다.
이들 성분의 영양학적 요구량(가금류 및 새끼 돼지/돼지로 예시됨)는 WO 01/58275의 표 A에 열거되어 있다. 영양학적 요구량는 이들 성분이 표시된 농도로 규정식에 제공되어야 한다는 것을 의미한다.
대안적으로, 본 발명의 동물 사료 첨가물은 WO 01/58275의 표 A에 특정된 개별 성분 중 적어도 하나를 포함한다. 적어도 하나는 하나 이상, 하나, 또는 둘, 또는 셋, 또는 넷 등 최대 열셋 모두, 또는 최대 열다섯의 모든 개별 성분을 의미한다. 보다 구체적으로, 이 적어도 하나의 개별 성분은 표 A의 컬럼 4, 또는 컬럼 5, 또는 컬럼 6에 나타낸 범위 내로 사료내-농도를 제공하도록 하는 양으로 본 발명의 첨가물에 포함된다.
본 발명은 또한 동물 사료 조성물에 관한 것이다. 동물 사료 조성물 또는 규정식은 비교적 낮은 함유량의 단백질을 갖는다. 가금류 및 돼지 규정식은 WO 01/58275의 표 B, 컬럼 2-3에 표시된 바와 같이 특징화될 수 있다. 어류 규정식은 이 표 B의 컬럼 4에 표시된 바와 같이 특징화될 수 있다. 또한 이러한 어류 규정식은 대개 200-310g/kg의 조지방 함유량을 갖는다.
WO 01/58275은 US 09/779334에 대응하며 본원에 참고로 포함된다.
본 발명에 따른 동물 사료 조성물은 50-800g/kg의 조단백질 함유량을 가지며 또한 본원에 청구된 바와 같이 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다.
이에 더하여, 또는 대안적으로(상기 나타낸 조단백질 함유량에 대하여), 본 발명의 동물 사료 조성물은 10-30MJ/kg의 대사가능 에너지의 함유량; 및/또는 0.1-200g/kg의 칼슘 함유량; 및/또는 0.1-200g/kg의 이용가능한 인 함유량; 및/또는 0.1-100g/kg의 메티오닌 함유량; 및/또는 0.1-150g/kg의 메티오닌 플러스 시스테인 함유량; 및/또는 0.5-50g/kg의 리신 함유량을 갖는다.
특정 실시형태에서, 대사가능 에너지, 조단백질, 칼슘, 인, 메티오닌, 메티오닌 플러스 시스테인 및/또는 리신의 함유량은 WO 01/58275 (R. 2-5)의 표 B의 범위 2, 3, 4 또는 5 중 어느 하나 이내이다.
조단백질은 인수 6.25를 곱한 질소(N)로서 계산되며, 즉 조단백질(g/kg)= N(g/kg) x 6.25이다. 질소 함유량은 Kjeldahl법(A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)에 의해 결정된다.
대사가능 에너지는 NRC publication Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, 및 the European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5에 기반하여 계산할 수 있다.
완전한 동물 규정식에서 칼슘, 이용가능한 인 및 아미노산의 규정식 함유량은 Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7와 같은 사료 표를 기준으로 계산한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 동물 사료 조성물은 적어도 하나의 단백질을 함유한다. 단백질은 육류 및 골분 및/또는 어분과 같은 동물 단백질이거나; 또는 식물성 단백질일 수 있다. 본원에서 사용하는 용어 식물성 단백질은 변형된 단백질 및 단백질- 유도체를 포함하여 식물로부터 유래한 또는 기원한 적어도 하나의 단백질을 포함하는 어떤 화합물, 조성물, 제조물 또는 혼합물을 의미한다. 특정 실시형태에서, 식물성 단백질의 단백질 함유량은 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 또는 60% (w/w)이다.
식물성 단백질은 콩류 및 곡류와 같은 식물성 단백질원으로부터 유래할 수 있으며, 예컨대 대두분, 루핀분 및 평지씨분과 같은 콩과(Leguminosae), 십자화과, 명아주과 및 벼과의 식물로부터의 물질이다.
특정 실시형태에서, 식물성 단백질원은 콩과, 예컨대 대두, 루핀, 완두 또는 빈 중 하나 이상의 식물로부터의 물질이다.
또 다른 특정 실시형태에서, 식물성 단백질원은 명아주과, 예컨대 비트, 사탕무, 시금치 또는 퀴놀린 중 하나 이상의 식물로부터의 물질이다.
식물성 단백질원의 다른 예는 평지씨, 해바라기씨 목화씨 및 양배추이다.
대두는 바람직한 단백질원이다.
식물성 단백질원의 다른 예는 보리, 밀, 호밀, 귀리, 옥수수(콘), 쌀, 라이밀 및 수수와 같은 곡류이다.
또 다른 특정 실시형태에서, 본 발명의 동물 사료 조성물은 0-80% 옥수수; 및/또는 0-80% 수수; 및/또는 0-70% 밀; 및/또는 0-70% 보리; 및/또는 0-30% 호밀; 및/또는 0-40% 대두분; 및/또는 0-25% 어분; 및/또는 0-25% 육류 및 골분; 및/또는 0-20% 유장을 함유한다.
동물 규정식은, 예컨대 가루 사료(펠릿화되지 않음) 또는 펠릿화된 사료로서 제조될 수 있다. 통상적으로, 분쇄된 사료-재료를 혼합하고 해당 종에 대한 명세내용에 따라 충분한 양의 필수 비타민 및 미네랄을 첨가한다. 폴리펩티드는 고체 또는 액체 폴리펩티드 제형으로서 첨가할 수 있다. 예컨대, 고체 폴리펩티드 제형은 통상적으로 혼합 단계 이전 또는 도중에 첨가하고; 액체 폴리펩티드 제조물은 통상적으로 펠릿화 단계 후에 첨가한다. 폴리펩티드는 또한 사료 첨가물 또는 예비혼합물에 조합할 수 있다.
규정식 내 최종 폴리펩티드 농도는 규정식 kg 당 0.01-200mg 폴리펩티드 단백질의 범위 내, 예컨대 0.1-10 mg/동물 규정식 kg 범위 내이다(통상적인 투여량은 250 내지 2000 FYT/동물 규정식 kg 범위 내이다).
본 발명의 파이타제는 당연히 유효한 양으로, 즉 용해화 개선 및/또는 사료의 영양가 개선에 충분한 양으로 적용되어야 한다. 현재 폴리펩티드는 하기 양 중 하나 이상으로 투여되는 것으로 생각된다(투여량 범위): 0.01-200; 0.01-100; 0.5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0.05-50; 또는 0.10-10 - 모든 이들 범위는 사료 kg 당 파이타제 폴리펩티드 단백질 mg임(ppm).
사료 kg 당 파이타제 폴리펩티드 단백질 mg을 결정하기 위해서, 파이타제를 사료 조성물로부터 정제하고, 관련된 분석법을 사용하여 정제된 파이타제의 특이적 활성을 결정한다. 이러한 사료 조성물의 파이타제 활성도 동일한 분석법을 사용하여 결정하고, 이들 두 결정값에 기초하여 사료 kg 당 파이타제 단백질 mg의 투여량을 계산한다.
사료 첨가물 중의 파이타제 폴리펩티드 단백질 mg을 결정하기 위해서 동일한 원리를 적용한다. 시료가 사료 첨가물 또는 사료의 제조에 사용되는 파이타제를 이용할 수 있다면, 당연히 이 시료로부터 특이적 활성을 측정한다(사료 조성물 또는 첨가제로부터 파이타제를 정제할 필요 없음).
발효 산물의 제조방법
본 발명의 또 다른 양태는 예컨대 에탄올, 맥주, 와인, 주정박(DDG)과 같은 발효 산물의 제조방법에 관한 것이며, 이 방법에서 발효는 본 발명의 파이타제의 존재하에서 행한다. 발효 방법의 예는, 예컨대 WO 01/62947에 설명된 방법을 포함한다. 효모와 같은 발효 미생물을 사용하여 발효를 행한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 파이타제의 존재하에서 탄수화물 함유 물질(예컨대 녹말)을 배양하는 단계(효모와 같은 발효 미생물 사용) 및 (b) 배양된 탄수화물 함유 물질로부터 발효 산물을 제조하는 단계를 포함하는 발효 산물의 제조방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 파이타제의 존재하에서 탄수화물 함유 물질(예컨대 녹말)을 배양하는 단계(효모와 같은 발효 미생물 사용) 및 배양된 탄수화물 함유 물질로부터 에탄올을 제조 또는 회수하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 a) 예컨대 액화 및/또는 당화 공정에 의해 전분을 가수분해하는, 생 전분 가수분해 공정, b) 얻어진 전분을 본 발명의 파이타제의 존재하에서 발효하는 단계 및 c) 에탄올을 제조하는 단계를 포함하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.
파이타제를 어떤 적절한 단계에서, 그리고 단독으로 또는 하나 이상의 알파-아밀라제, 글루코아밀라제, 프로테아제 및/또는 셀룰라제와 같은 다른 효소와 조합하는 것을 포함하여 어떤 적절한 조성물로 발효 공정에 첨가할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명은 바이오매스를 가수분해하는 단계, 및 얻어진 바이오매스를 본 발명의 파이타제의 존재하에서 배양하는 단계(효모와 같은 발효 미생물을 사용)를 포함하는 에탄올의 제조방법을 제공한다.
신호 펩티드
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 33으로 구성된 신호 펩티드를 암호화하는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 1 내지 99로 구성된 제1 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 구조체에 관한 것이며, 여기서 유전자는 제1 뉴클레오티드 서열에 대하여 외래적이다.
본 발명은 또한 이러한 핵산 구조체를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (a) 단백질의 제조에 적합한 조건하에서 이러한 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
제1 뉴클레오티드 서열은 다른 조절 서열과 개별적으로, 또는 다른 조절 서열과 조합하여 외래 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 다른 조절 서열은 상기에 설명되어 있다.
단백질은 숙주 세포에 동종이거나 이종일 수 있다. 용어 "단백질"은 본원에서 암호화된 산물의 특정 길이를 지칭하는 것을 의미하지 않으므로, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질을 포괄한다. 용어 "단백질"은 또한 암호화된 산물을 형성하기 위해 조합된 둘 이상의 폴리펩티드를 포괄한다. 또한 단백질은 적어도 두개의 상이한 단백질로부터 얻어지는 부분 또는 완전한 폴리펩티드 서열의 조합을 포함하는 혼성 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 적어도 하나는 숙주 세포에 동종이거나 이종일 수 있다. 단백질은 상기 언급한 단백질의 자연 발생 대립유전자 및 혼성 단백질을 더 포함한다.
바람직하게는, 단백질은 호르몬 또는 그것의 변형체, 폴리펩티드, 예컨대 효소, 수용체 또는 그것의 일부, 항체 또는 그것의 일부, 또는 수용체이다. 보다 바람직한 양태에서, 단백질은 산화환원효소, 트랜스페라제, 히드롤라제, 리아제, 이소메라제 또는 리가제이다. 보다 바람직한 양태에서, 단백질은 아미노펩티다제, 아밀라제, 카르보히드라제, 카르복시펩티다제, 카탈라제, 셀룰라제, 키티나제, 큐티나제, 시클로덱스트린 글리코실트랜스페라제, 디옥시리보뉴클레아제, 에스테라제, 알파-갈락토시다제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 인버타제, 라카제, 리파제, 만노시다제, 뮤타나제, 옥시다제, 펙틴분해 폴리펩티드, 퍼옥시다제, 파이타제, 폴리페놀옥시다제, 단백질분해 폴리펩티드, 리보뉴클레아제, 트랜스글루타미나제 또는 자일라나제이다.
유전자는 어떤 원핵, 진핵 또는 다른 공급원으로부터 얻을 수 있다
여러가지 실시형태
하기는 본 발명의 추가적 실시형태이다. 청구된 모든 핵산 서열, 핵산 구조체, 재조합 발현 벡터, 재조합 숙주 세포, 폴리펩티드의 제조방법, 트랜스제닉 식물 및 동물, 및 여러가지 사용, 사용 방법 및 사료 조성물/첨가제에 관련된 해당 양태도 본원에 포함된다.
파이타제 활성, 및 시간, t = 0에서의 활성에 비하여 적어도 20%의 37℃에서 0.1M 글리신/HCl 버퍼, pH 2.0에서 4시간 동안 인큐베이션한 후 잔류 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드, 활성은 37℃ 및 pH 5.5에서 1% (w/v) Na-파이테이트에서 0.25M Na-아세테이트 버퍼 pH 5.5를 사용하여 분석하고, 버퍼 블라인드는 제외됨;
적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%의 i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413에 대한 동일성을 바람직하게 가짐.
파이타제 활성, 및 시간, t = 0에서의 활성에 비하여 적어도 20%의 37℃에서 0.1M 글리신/HCl 버퍼, pH 2.5에서, 24시간 동안 인큐베이션 후 잔류 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드, 활성은 37℃ 및 pH 5.5에서 1% (w/v) Na-파이테이트에서 0.25M Na-아세테이트 버퍼 pH 5.5를 사용하여 분석, 버퍼 블라인드는 제외;
적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%의 i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413에 대한 동일성을 바람직하게 가짐.
파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드, 여기서 기질 pNP-포스페이트 상에서 측정한 pH 5.0 및 37℃에서의 폴리펩티드의 활성은 기질 파이테이트 상에서 측정한 폴리펩티드의 활성의 11% 미만이고; 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%의 i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413에 대한 동일성을 바람직하게 가짐.
파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드, 여기서 폴리펩티드는 페니오포라 라이시로부터의 파이타제에 비하여 더 높은 인(P) 방출을 갖고; 바람직하게는 시험관내 모델에서 측정한 바와 같이; 및/또는, 여기서 폴리펩티드는 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%의 i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413에 대한 동일성을 바람직하게 가짐.
파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드, 여기서 0.25 FYT/사료 g 투여된 폴리펩티드는 역시 0.25 FYT/사료 g 투여된 페니오포라 라이시로부터의 파이타제에 의해 방출된 인에 비하여 적어도 150% 인(P)을 방출하고; 및/또는, 여기서 폴리펩티드는 i) 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%의 i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413에 대한 동일성을 바람직하게 가짐.
파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드, 0.75 FYT/사료 g 투여된 폴리펩티드는 역시 0.75 FYT/사료 g 투여된 페니오포라 라이시로부터의 파이타제에 의해 방출된 인에 비하여 적어도 150% 인(P)을 방출하고; 및/또는, 여기서 폴리펩티드는 적어도 75% 이상, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%의 i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413에 대한 동일성을 바람직하게 가짐.
I. (a) (i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413, 및/또는 (ii) SEQ ID NO: 10의 성숙한 폴리펩티드 부분과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, (b) (i) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338, (ii) SEQ ID NO: 9의 성숙한 폴리펩티드 암호화 부분, 및/또는 (iii) (i) 또는 (ii) 중 어느 하나의 상보 가닥과 적어도 중간 긴축 조건하에서 혼성화한 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; (c) 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 (a)(i)-(a)(ii)의 폴리펩티드 중 어느 하나의 변형체; 및 (d) (a)(i)-(a)(ii)의 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편으로 구성된 군에서 선택된 파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드.
II. 단락 I의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
III. (a) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413과 적어도 75% 동일성, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; (b) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338과 적어도 75% 동일성, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및 (c) (i) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338, (ii) SEQ ID NO: 9의 성숙한 폴리펩티드 암호화 부분, (iii) (i) 또는 (ii) 중 어느 하나의 상보 가닥과 적어도 중간 긴축 조건하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택된 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
IV. SEQ ID NO: 9의 성숙한 폴리펩티드 암호화 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 갖고, 돌연변이체 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 단락 II 및 III 중 어느 하나의 분리된 폴리뉴클레오티드.
V. 발현 숙주에서 폴리펩티드의 제조를 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 동작가능하게 연결된 단락 II-IV 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체.
VI. 단락 V의 핵산 구조체를 포함하는 재조합 발현 벡터.
VII. 단락 V의 핵산 구조체를 포함하는 재조합 숙주 세포.
VIII. (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서, 폴리펩티드를 야생형 형태로 제조할 수 있는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 단락 I의 폴리펩티드의 제조방법.
IX. (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구조체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 단락 I의 폴리펩티드의 제조방법.
X. 단락 I의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된 트랜스제닉 식물, 식물 부위 또는 식물 세포.
XI. 단락 I의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 트랜스제닉 비-인간 동물 또는 그것의 산물 또는 변형체.
XII. 동물 사료에서 단락 I의 적어도 하나의 폴리펩티드의 사용.
XIII. 동물 사료에 사용하기 위한 조성물의 제조에서 적어도 하나의 단락 I의 폴리펩티드의 사용.
XIV. 적어도 하나의 단락 I의 폴리펩티드를 사료에 첨가하는, 동물 사료에서 영양가의 개선방법.
XV. (a) 단락 I의 적어도 하나의 폴리펩티드; 및 (b) 적어도 하나의 지용성 비타민, (c) 적어도 하나의 수용성 비타민, 및/또는 (d) 적어도 하나의 미량 미네랄을 포함하는 동물 사료 첨가물.
XVI. 적어도 하나의 아밀라제, 적어도 하나의 추가적 파이타제, 적어도 하나의 자일라나제, 적어도 하나의 갈락타나제, 적어도 하나의 알파-갈락토시다제, 적어도 하나의 프로테아제, 적어도 하나의 포스포리파제, 및/또는 적어도 하나의 베타-글루카나제를 더 포함하는 단락 XV의 동물 사료 첨가제.
XVII. SEQ ID NO:10의 아미노산 1 내지 413의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 pH-최적조건 보다 높은 pH-최적조건을 갖는 단락 XVI의 동물 사료 첨가제.
IIXX. 50 내지 800g/kg의 조단백질 함유량을 갖고 적어도 하나의 단락 I의 폴리펩티드를 포함하는 동물 사료 조성물.
SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413과 적어도 75% 동일성, 바람직하게는 적어도 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 98.7%, 98.8%, 98.9%, 99%, 99.0%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 적어도 99.9% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이들을 갖거나 이들로 이루어진 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드.
(i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413, 및/또는
(ii) SEQ ID NO: 10의 성숙한 폴리펩티드 부분
의 서열을 포함하고, 바람직하게는 갖고; 또는
폴리펩티드 (a)는 적어도 하나의 아미노산의 결실, 삽입, 및/또는 보존적 치환을 포함하는 (i)-(ii)의 폴리펩티드 중 어느 하나의 변형체이거나; 또는
(b)는 (i)-(ii)의 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편인
파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드.
본 발명을 하기 실시예에 의해 더 설명하며 이것이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 구성되어서는 안된다.
실시예 1: 하프니아 알베이 파이타제 유전자의 클로닝
하기 히스티딘 산 포스파타제(HAP)로 다수의 정렬이 이루어졌다: appA Escherichia coli (SPTREMBL:Q8GN88), Citrobacter gillenii DSM 13694 파이타제(geneseqp:aeh04533), Citrobacter amalonaticus ATCC 25407 파이타제 (geneseqp:aeh04535), Citrobacter braakii 파이타제(geneseqp:aeh04827), 및 ypo1648 Yersinia pestis CO92 (SPTREMBL:Q8ZFP6). 두 퇴보 올리고뉴클레오티드 프라이머는 공통 배열을 기초로 디자인되었다:
Figure 112009059022124-PCT00001
여기서 Y는 T 또는 C를 나타내고, R은 A 또는 G를 나타내고, N은 A, C, G 또는 T를 나타낸다.
프라이머를 40 내지 50℃의 어닐링 온도에서 많은 박테리아 종의 PCR 스크리닝에 사용하였지만 통상적으로 프로그램을 터치 다운함에 따라 50℃으로 출발한 후 표준 PCR을 시행하기 전에 다음의 10회 사이클에 걸쳐서 각 사이클 동안 아닐링 온도를 1℃로 감소시켰다.
대략 950 bp PCR 단편 형태의 부분 파이타제 유전자가 하프니아 알베이(DSM 19197)로 식별되었다.
PCR 단편을 아가로스 겔로부터 분리하고 단편이 함께 발생한 동일한 PCR 프라이머를 사용하여 단편을 서열화하였다. 뉴클레오티드 서열의 번역에 의해, DNA 단편이 HAP 파이타제 유전자의 부분이었다는 것을 확인하였다.
유전자의 전장 뉴클레오티드 서열을 얻기 위해서, 미지의 목표 부위를 포착하도록 디자인된 DNA WALKING SPEEDUP™ Kit(DWSK-V102 from Seegene, Inc., 2nd Fl., Myungji Bldg., 142-21, Samsung-dong, Kangnam-gu, Seoul, 135-090, Korea)를 사용하였다. 이 목적으로, 6개 특정 올리고뉴클레오티드를 디자인하고 키트와 함께 사용하였다.
Figure 112009059022124-PCT00002
하프니아 알베이 DSM 19197로부터의 파이타제를 암호화하는 전장 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO: 9로서 서열 목록에 나타내며, 해당하는 암호화된 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 10에 나타낸다. SEQ ID NO:10의 첫번째 33개 아미노산(즉, 아미노산 -33 내지 -1)은 소프트웨어 Signal P V3.0 (see www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ 참조)에 의해 추정된 바와 같이 신호 펩티드이다.
실시예 2. 하프니아 알베이 파이타제 유전자의 발현
본래 프로테아제의 27개 아미노산 신호 펩티드 암호화 폴리뉴클레오티드, 바실러스 리케니포르미스로부터의 Savinase™을 하프니아 알베이로부터의 성숙한 파이타제를 암호화하는 유전자에 프레임 내의 PCR에 의해 융합하였다. SEQ ID NO: 12의 신호 펩티드를 암호화하는 신호 펩티드 암호화 서열을 SEQ ID NO: 11에 나타낸다.
융합 폴리펩티드를 위해 암호화하는 DNA를 바실러스 서브틸리스 숙주 세포 게놈 상에서 동종 재조합에 의해 통합하였다. 유전자 구조체를 바실러스 리케니포르미스 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실러스 아밀로리퀴페시언스 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 및 mRNA 안정화 서열을 포함하는 바실러스 투린기엔시스 cryIIIA 프로모터로 구성된 트리플 프로모터 시스템의 제어하에서 발현하였다(WO 99/43835에 설명된 바와 같음). 예컨대 Diderichsen et al., A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid, 30, p. 312, 1993에 설명된 바와 같이 클로람페니콜 아세틸-트랜스페라제를 위해 암호화하는 유전자를 마커로서 사용하였다.
30℃에서 250RPM으로 쉐이크한 PS-1 배지(10% 수크로스, 4% 대두분, 1% Na3PO4-12H2O, 0.5% CaCO3, 및 0.01% 플루로닉산)에서 클로람페니콜 내성 형질전환체를 배양하였다. 2-5일 인큐베이션 후 상청액을 이동시키고 20마이크로리터의 상청액을 0.1M 소듐 아세테이트 pH 4.5 및 0.1% 이노시톨 헥사포스포산을 함유하는 1% LSB-아가로스 플레이트에서 천공한 4mm 직경 홀에 적용함으로써 파이타제 활성을 식별하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 방치하고 0.25M CaCl2 및 500mM MES(4N NaOH을 가지고 pH 6.5로 조정됨)으로 구성된 버퍼를 플레이트 위에 부었다. 플레이트를 1시간 동안 실온에 방치한 다음 이노시톨포스페이트 포스파타제, 또는 파이타제 활성을 클리어 존으로서 식별하였다.
DNA 시퀀싱에 의해 수회 파이타제 양성 형질전환체를 분석하여 구조체의 정확한 DNA 서열을 확인하였다. 하나의 정확한 클론을 선택하였다.
실시예 3. 하프니아 NN020125 파이타제 숙주의 발효
하프니아 알베이 파이타제 구조체를 보유하고 파이타제(성숙한 부분)를 발현할 수 있는 선택한 바실러스 서브틸리스의 선택한 클론을 30℃에서 250rpm으로 6일 동안 SK-1M 배지(카세인 나트륨(Arla사의 Miprodan 30) 40g, Maltodextrin 01 (Roquette사의 Glucidex 6, 카탈로그 번호 332203) 200g, 대두분 50g, Dowfax 63N10(Dow사의 비이온성 계면활성제) 0.1ml, 수돗물 최대 1000ml, CaCO3 정제 0.5g/100ml)에서 배양하였다.
실시예 4. 하프니아 알베이 파이타제의 정제
파이타제를 갖는 배양 상청액을 먼저 7200rpm 및 5℃에서 1시간 동안 원심분리하고 4개 Whatman 유리 마이크로화이버 필터(2.7, 1.6, 1.2 및 0.7 마이크로미터)의 샌드위치를 통해 여과하였다. 이어서 이 용액을 압력을 사용하는 Seitz-EKS 심층 필터를 통해 멸균 여과하였다. 그 다음, 여과한 상청액을 하기와 같이 전처리하였다:
시료 용액을 물로 세정하고 10kDa 컷-오프 한외여과 멤브레인이 구비된 한외여과 유닛(Filtron, Filtron Technology Corporation사)을 사용하여 농축하였다. 그 다음 10% (w/v) 아세트산으로 pH를 4.5로 조정하였으며, 경미한 침전을 유발하였다. 침전물에서 활성이 발견되지 않았고, 이것을 0.22마이크로미터 컷-오프로 Fast PES 보틀 탑 필터를 통한 여과에 의해 제거하였다.
전처리 후 버퍼 A로서 50mM 소듐 아세테이트 pH 4.5, 버퍼 B로서 50mM 소듐 아세테이트 + 1M NaCl pH 4.5를 사용하는 XK26 컬럼 내 S Sepharose, 대략 50ml 상에서 크로마토그래피에 의해 파이타제를 정제하였다. 컬럼으로부터의 분획을 포스타제 분석(하기 참조)를 사용하여 활성에 대하여 분석하고 활성을 갖는 분획을 모 았다.
용액을 최종 농도 1.5M을 제공하는 고체 암모늄 술페이트에 첨가하고 6M HCl을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 버퍼 A로서 25mM 비스-트리스(비스-(2-히드록시에틸)이미노-트리스(히드록시메틸)메탄)) + 1.5M 암모늄 술페이트 pH 6.0 및 버퍼 B로서 25mM 비스-트리스 pH 6.0를 사용하는 부틸-세파로스 컬럼, XK26 컬럼 내 대략 30ml에 파이타제-함유 용액을 첨가하였다. 컬럼으로부터의 분획을 포스타제 분석(하기 참조)를 사용하여 활성에 대하여 분석하고 활성을 갖는 분획을 모았다. 마지막으로, 정제된 파이타제를 함유하는 용액을 50mM 소듐 아세테이트 + 0.1M NaCl, pH 4.5으로 버퍼-교환하고 30kDa 컷-오프 멤브레인으로 Amicon ultra-15 여과장치를 사용하여 농축하였다.
SDS-PAGE로부터 측정된 분자량은 대략 40kDa이고 순도는 > 95%이었다.
실시예 5. 활성 분석
포스파타제 활성의 결정
75마이크로리터 파이타제-함유 효소 용액을 마이크로티터 플레이트 웰, 예컨대 NUNC 269620에 분배하고 75마이크로리터 기질을 첨가한다(기질 제조를 위해서, 두개의 5mg p-니트로페닐 포스페이트 정제(Sigma, Cat.No. N-9389)를 10ml 0.1M Na-아세테이트 버퍼, pH 5.5에 용해함). 플레이트를 밀봉하고 15분 인큐베이션하고, 750rpm으로 37℃에서 쉐이크한다. 인큐베이션 시간 후 75마이크로리터 정지 시약을 첨가하고(정지 시약은 수중 0.1M 디-소듐테트라보레이트임) 405nm에서의 흡광 도를 마이크로티터 플레이트 분광광도계에서 측정한다.
파이타제 활성의 결정
0.25M 소듐 아세테이트, 0.005%(w/v) Tween-20. pH5.5에 적절히 희석된 75마이크로리터 파이타제-함유 효소 용액을 마이크로티터 플레이트 웰, 예컨대 NUNC 269620에 분배하고, 75마이크로리터 기질을 첨가한다(쌀로부터의 100mg 소듐 파이테이트(Aldrich Cat.No. 274321)를 10ml 0.25M 소듐 아세테이트 버퍼, pH5.5에 용해함으로써 제조). 플레이트를 밀봉하고 15분 동안 인큐베이션하고, 750rpm으로 37℃에서 쉐이크한다. 인큐베이션 후, 75마이크로리터 정지 시약을 첨가하고(정지 시약은 10ml 몰리브데이트 용액(0.25% (w/v) 암모니아 용액 중 10% (w/v) 암모늄 헵타-몰리브데이트), 10ml 암모늄 바네데이트(0.24% 시중 제품 Bie&Berntsen사, Cat.No. LAB17650) 및 20ml 21.7% (w/v) 질산을 혼합하여 제조), 마이크로티터 플레이트 분광광도계에서 405nm에서의 흡광도를 측정한다. 파이타제 활성은 FYT 단위로 표현되고, 하나의 FYT은 상기 조건하에서 분당 1마이크로몰 무기 오르소-포스페이트를 유리시키는 효소의 양이다. 무기 포스페이트의 적절한 희석으로부터 작성된 표준 곡선을 참조하여, 또는 활성을 알고있는 파이타제 효소 제조물(이러한 활성을 알고 있는 표준 효소 제조물은 Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd로부터 요청하여 입수가능하다)의 희석으로부터 이루어진 표준 곡선을 참조하여, 측정된 파이타제 활성의 절대값을 얻을 수 있다.
특이적 파이타제 활성의 결정
소듐 아세테이트 버퍼, pH 5.5에서 파이타제의 특이적 활성을 결정하였다. 상술한 바와 같이 파이타제를 고도로 정제하였고, 즉 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 상에서 하나의 성분만이 식별되었다.
하기와 같이 아미노산 분석에 의해 단백질 농도를 결정하였다: 시료의 분취물을 진공 유리관에서 6M HCl, 0.1% 페놀 중에서 16시간 동안 110℃에서 가수분해하였다. 제조자의 지시에 따라 작동하는 Applied Biosystems 420A 아미노산 분석 시스템을 사용하여 얻어진 아미노산을 칭량하였다. 아미노산의 양으로부터 가수분해된 분취물 중 단백질의 총 질량 - 따라서 또한 농도 - 를 계산하였다.
상술한 바와 같이 파이타제 활성을 FYT 단위로 결정하고 파이타제 효소 단백질 mg 당 FYT 단위로 측정한 파이타제 활성으로서 특이적 활성을 계산하였다.
얻어진 특이적 활성은 980 FYT/단백질 mg이었다. 특이적 활성은 소듐 파이테이트 상에서 pH5.5 및 37℃에서 결정하였다.
실시예 6. 파이타제 pH 프로파일의 결정
0.25M 소듐 아세테이트 pH5.5 버퍼 대신에 버퍼 칵테일(50mM 글리신, 50mM 아세트산 및 50mM 비스-트리스)를 사용하는 것을 제외하고 "파이타제 활성의 결정" 단락에서 상기 설명한 바와 같이 37℃에서 pH 범위 2.0 내지 7.5(0.5 pH-단위 단계에서)에서 pH 프로파일을 결정하였다. 결과를 하기 표 1에 요약한다. 2.0 - 7.5의 범위 중 각 pH에 대하여 주어진 값은 최적값에 대하여 표준화한 상대 활성 %이다.
Figure 112009059022124-PCT00003
실시예 7. 파이타제 등전점의 결정
제조자에 의해 설명된 바와 같이 실행되는 등전 포커싱 겔(Invitrogen사의 Novex pH 310 IEF겔, 카탈로그 번호 EC6655A2)을 사용하여 파이타제에 대한 등전점, pI을 결정하였다. 하프니아 알베이 파이타제에 대한 pI는 약 7.4이다.
실시예 8. 파이트제 온도 프로파일
상술한 바와 같이("파이타제 활성의 결정") 필수적으로 20-90℃ 온도 범위에서 하프니아 알베이 파이타제에 대하여 온도 프로파일(온도의 함수로서 파이타제 활성)을 결정하였다. 그러나, 마이크로티터 플레이트 대신 PCR관에서 효소 반응(100마이크로리터 파이타제-함유 효소 용액+ 100마이크로리터 기질)을 행하였다. 원하는 온도에서 15분 반응 시간 후, 관을 20초 동안 20℃로 냉각하고 각 반응 혼합물의 150마이크로리터를 마이크로티터 플레이트로 이동하였다. 75마이크로리터 정지 시약을 첨가하고 마이크로티터 플레이트 분광광도계에서 405nm에서의 흡광도를 측정하였다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다. 각 온도에 주어진 숫자는 최적값에 대하여 표준화된 상대 활성(%)이다.
Figure 112009059022124-PCT00004
실시예 9. 파이타제 열안정성
아스퍼질러스 오리재 및 바실러스 서브틸리스에서 발현된 하프니아 알베이 파이타제를 시차 주사 열량계(DSC)에 의한 열안정성 측정하고 E. coli 파이타제(Danisco A/S로부터 PHYZYME XP로서 시중에서 입수가능)와 비교하였다.
하프니아 알베이 파이타제의 단백질 시료의 분취물(실시예 4에 설명한 바와 같이 정제됨)을 2 x 500ml 20mM Na-아세테이트, pH 4.0에 대하여 4℃에서 2-3시간 간격 그 다음 하룻밤 간격으로 투석하였다. 시료를 0.45㎛ 여과하고 버퍼로 약 2 A280 유닛으로 희석하였다. 측정한 정확한 흡광도 값을 하기 결과 표에 나타낸다. 투석 버퍼를 시차 주사 열량계(DSC)에서 참조로서 사용하였다. 진공 흡입을 사용하여 시료를 탈기하고 약 10분 동안 교반한다. 시중의 제품 PHYZYME XP으로부터의 E. coli 파이타제의 분취물을 실시예 4에 설명한 것과 유사한 방식으로 정제하였다.
20-80℃로부터 1.5℃/분의 일정한 주사 속도로 DSC 주사를 행하였다. 여과 시간: 16초. DSC를 행하기 전에, 적절한 버퍼(예컨대 0.1M 글리신-HCl, pH 2.5 또는 3.0; 20mM 소듐 아세테이트 pH 4.0; 0.1 M 소듐 아세테이트, pH 5.5; 0.1M 트리스-HCl, pH 7.0)에 대하여 파이타제를 투석하였다. MicroCal Origin 소프트웨어(버전 4.10)을 사용하여 데이터-처리를 행하고, 변성 시간, Td(용융 온도, Tm라고도 함)을 온도 기록도에서 피크의 정점에서의 온도로서 정의한다. 풀림 과정의 가역성을 조사하기 위해서, 짧은 냉각 단계 직후 제2 주사를 행하였다. 제2 주사를 위해서 피크 면적(피크와 기준선 사이의 면적 = 비교하는 풀림의 엔탈피)을 제1 주사의 피크 면적과 비교한다. 큰 피크(제1 주사의 피크 면적의 75-100% 사이)가 가역 풀림/접힘 과정으로서 판단된다.
아스퍼질러스 오리재와 바실러스 서브틸리스에서 발현된 하프니아 알베이 파이타제 및 E. coli 파이타제에 대한 DSC 결과를 하기 표 3에 요약한다.
Figure 112009059022124-PCT00005
상기 표에 나타낸 바와 같이, 하프니아 알베이 파이타제는 E. coli 파이타제 보다 큰 열안정성을 가졌다. 또한 하프니아 알베이 파이타제의 열안정성이 발현 숙주에 의해 영향을 받지 않았다는 것이 명확하다.
실시예 10. 하프니아 알베이 파이타제 및 E. coli 파이타제의 위 단백질분해 내성
H. alvei 파이타제 및 E. coli 파이타제(PHYZYME XP, Danisco로부터 입수가능)의 시료를 250 mM 글리신 버퍼 pH 3.0(약 1000펩신 유닛/mg 파이타제)에서 펩신(돼지 위 점막으로부터 펩신 1:60000, Wako 162-18721, 2900 Units/mg, Lot SDK5232)으로 처리하였다. 쉐이킹(750 rpm)과 함께 40℃에서 30분 동안 인큐베이션. 펩신과 인큐베이션한 후 실시예 5에 설명된 바와 같이 파이타제 활성을 결정하고 동일한 방법으로 그러나 펩신의 추가 없이 처리한 시료의 활성과 비교하였다. 결과를 하기 표 4에 요약한다.
Figure 112009059022124-PCT00006
따라서, E. coli 파이타제 및 H. alvei 파이타제는 매우 유사한 위 단백질분해 내성 특성을 갖는다.
실시예 11: 하프니아 알베이 파이타제 및 시트로박터 브라키 파이타제에 대한 시험관내 모델에서 동물 사료의 성능
하프니아 알베이 파이타제의 동물 사료 중의 성능을 시험관내 모델에서 시트로벡터 브라키 파이타제의 성능과 비교하였다. 시험관내 모델은 단위 동물 내의 위-장의 조건을 시뮬레이션하고 생체내 동물 시험에서 얻어진 결과와 매우 관련이 있다. 시료 중의 파이타제 활성을 "파이타제 활성의 결정"하의 실시예 5에 설명한 바와 같이 결정한다. 하기와 같이 비교를 행하였다:
사료 kg 당 5g 칼슘의 농도로 CaCl2를 첨가한 30% 대두분 및 70% 옥수수분으로 이루어진 사료 시료를 제조하고 40℃ 및 pH 3.0에서 30분 동안 예비-인큐베이션한 후 펩신(3000 U/사료 g) 및 적절한 투여량의 파이타제(테스트하는 모든 파이타제에 대하여 동일한 투여량을 사용하여 비교가 가능함), 예컨대 0.1 내지 1.0 파이타제 유닛 FYT/g 사료를 첨가한다. 파이타제 활성이 없는 블랭크도 참조로 포함하였다. 그 다음 시료를 40℃ 및 pH 3.0에서 60분 동안, 그 다음 pH 4.0에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
반응을 중지하고 0.5M의 최종 농도로 HCl의 첨가 및 40℃에서 2시간 동안의 인큐베이션, 그 다음 1회의 동결-융해 사이클 및 40℃에서 1시간 인큐베이션에 의해 피트산 및 이노시톨-포스페이트를 추출하였다.
Chen et al in Journal of Chromatography A (2003) vol. 1018, pp. 41-52에 설명된 바와 같이 피트산과 이노시톨-포스페이트를 고성능 이온 크로마토그래피에 의해 분리하고 Skog-lund et al in J. Agric. Food Chem. (1997), vol. 45, pp. 431-436에 설명된 바와 같이 칭량하였다.
도 1은 125 FYT/kg 사료, 250 FYT/kg 사료 및 500 FYT/kg 사료의 투여에서 시트로박터 브라키 파이타제와 비교한 하프니아 알베이 파이타제의 용량-반응을 나타낸다. 시험관내 파이타제의 효과를 시험관내 인큐베이션 후 시료에 잔존하는 잔류 이노시톨-포스페이트 결합된 인(IP-P)으로서 나타내고 파이타제가 없는 대조 시료에 잔존하는 잔류 IP-P과 비교한다. 모든 주어진 숫자는 4회 또는 5회 반복의 평균 및 표준편차이다(시험관내 인큐베이션). 하프니아 파이타제 250 FYT/kg 투여는 시험관내 시료중 잔류 IP-P의 양을 시트로박터 파이타제 125 FYT/kg와 거의 동일한 정도로 감소시켰다.
따라서, 하프니아 파이타제는 매우 양호한 잔류 이노시톨-포스페이트 결합된 인의 양 감소를 얻을 수 있었다.
실시예 12: 하프니아 알베이 파이타제와 페니오포라 라이시 파이타제에 대한 시험관내 모델에서 동물 사료의 성능
또한 시험관내 모델에서 하프니아 알베이 파이타제의 동물 사료의 성능을 250 FYT/kg 및 500 FYT/kg 사료의 투여에서 페니오포라 라이시 파이타제의 성능과 비교하였다. 실시예 11에서 설명한 실험 프로토콜에 따라 결과를 얻었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 하프니아 알베이 파이타제는 시험관내 시료 중 잔류 IP-P양이 페니오포라 라이시 파이타제 보다 더 많이 감소하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S <120> Hafnia phytase <130> 11202.204-WO <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2123fw <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> N designates A, C, G or T. <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> N designates A, C, G or T. <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> N designates A, C, G or T. <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> N designates A, C, G or T. <400> 1 catggtgtgc gngcnccnac naa 23 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2065rev <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> N designates A, C, G or T. <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> N designates A, C, G or T. <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> R designates A or G. <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> R designates A or G. <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> N designates A, C, G or T. <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> Y designates T or C. <400> 2 cccaccaggn ggngtrttrt cnggytg 27 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2328 TSP1dw <400> 3 acttgcatcg acgttggctg 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2329 TSP2dw <400> 4 actgagcagc aatggaactc tctg 24 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2330 TSP3dw <400> 5 actgggttcc aatatcacga gtc 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2331 TSP1up <400> 6 atggtggatc gctaaatcac actg 24 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2332 TSP2up <400> 7 acgtctgccc aaacatacac g 21 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer 2333 TSP3up <400> 8 accgcccatc aggctaatc 19 <210> 9 <211> 1338 <212> DNA <213> Hafnia alvei <220> <221> CDS <222> (1)..(1338) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(99) <220> <221> mat_peptide <222> (100)..(1338) <400> 9 atg aca atc tct ctg ttt aac cgt aat aaa ccc gct att gca cag cgt 48 Met Thr Ile Ser Leu Phe Asn Arg Asn Lys Pro Ala Ile Ala Gln Arg -30 -25 -20 att tta tgt cct ctg atc gtg gct tta ttc tca ggt tta ccg gca tac 96 Ile Leu Cys Pro Leu Ile Val Ala Leu Phe Ser Gly Leu Pro Ala Tyr -15 -10 -5 gcc agt gat acc gcc cct gct ggg ttc cag ttg gaa aag gtt gtt atc 144 Ala Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Phe Gln Leu Glu Lys Val Val Ile -1 1 5 10 15 cta agc aga cat ggt gta cgc gcg cca acc aaa atg aca caa acg atg 192 Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met 20 25 30 cgc gac gtc aca cct cac cag tgg cct gaa tgg ccg gta aaa ctc ggc 240 Arg Asp Val Thr Pro His Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly 35 40 45 tat atc acg cca cgc ggc gaa cat ctg att agc ctg atg ggc ggt ttt 288 Tyr Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe 50 55 60 tat cga gag cgc ttt cag caa caa ggt tta tta cct aag gat aac tgt 336 Tyr Arg Glu Arg Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Lys Asp Asn Cys 65 70 75 cct aca cca gat gcc gtg tat gtt tgg gca gac gtc gat caa cgc aca 384 Pro Thr Pro Asp Ala Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr 80 85 90 95 cgt aaa acc ggc gag gct ttc tta gca ggt ctt gct ccc cag tgt gat 432 Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Asp 100 105 110 tta gcg atc cac cat cag caa aac act cag cag gcc gat ccg ctg ttc 480 Leu Ala Ile His His Gln Gln Asn Thr Gln Gln Ala Asp Pro Leu Phe 115 120 125 cac cct gtg aaa gcc ggt att tgt tcg atg gat aaa tca cag gta cac 528 His Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Ser Gln Val His 130 135 140 gcc gcg gtt gaa aag cag gca ggc aca ccg att gag acg ctc aat caa 576 Ala Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Thr Pro Ile Glu Thr Leu Asn Gln 145 150 155 cgc tat caa gcc tct tta gcg ctg atg agt tcg gta ctc gat ttt cca 624 Arg Tyr Gln Ala Ser Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asp Phe Pro 160 165 170 175 aaa tcc ccc tat tgt cag cag cac aac att ggc aaa ctc tgc gat ttt 672 Lys Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Asn Ile Gly Lys Leu Cys Asp Phe 180 185 190 tca cag gcg atg cct agc aga ctg gcg ata aat gac gac ggt aat aaa 720 Ser Gln Ala Met Pro Ser Arg Leu Ala Ile Asn Asp Asp Gly Asn Lys 195 200 205 gtg gct ctc gaa ggt gcc gtg gga ctt gca tcg acg ttg gct gaa att 768 Val Ala Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ala Ser Thr Leu Ala Glu Ile 210 215 220 ttc ctg ctg gaa cac gct cag gga atg cct aaa gtg gct tgg ggg aat 816 Phe Leu Leu Glu His Ala Gln Gly Met Pro Lys Val Ala Trp Gly Asn 225 230 235 att cac act gag cag caa tgg aac tct ctg ttg aaa ttg cat aat gcg 864 Ile His Thr Glu Gln Gln Trp Asn Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Ala 240 245 250 255 cag ttt gac ttg atg tcg cgc acg ccc tat atc gcc aag cat aac ggt 912 Gln Phe Asp Leu Met Ser Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly 260 265 270 act cca ctg ctg caa acc atc gcc cac gca ctg ggt tcc aat atc acg 960 Thr Pro Leu Leu Gln Thr Ile Ala His Ala Leu Gly Ser Asn Ile Thr 275 280 285 agt cgc cca ctg ccg gat att tcg cca gac aat aag atc ctg ttt att 1008 Ser Arg Pro Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile 290 295 300 gcc ggt cac gac acc aat att gcc aat att tct ggc atg tta ggg atg 1056 Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ser Gly Met Leu Gly Met 305 310 315 aca tgg aca ctt ccg gga caa cca gat aac acg cct ccg ggt ggc gct 1104 Thr Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala 320 325 330 335 ttg gtg ttt gaa cgc tgg gta gat aac gcg ggg aaa ccg tat gtt agc 1152 Leu Val Phe Glu Arg Trp Val Asp Asn Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ser 340 345 350 gtg aat atg gtg tat caa aca ctg gca cag ttg cac gac cag gcg ccg 1200 Val Asn Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu His Asp Gln Ala Pro 355 360 365 cta acg ttg cag cat cct gcg ggc agc gta cga cta aac ata ccg ggt 1248 Leu Thr Leu Gln His Pro Ala Gly Ser Val Arg Leu Asn Ile Pro Gly 370 375 380 tgc agc gat caa acg ccc gat ggc tat tgc ccg ctc tcc acc ttc agc 1296 Cys Ser Asp Gln Thr Pro Asp Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Ser 385 390 395 cgc tta gtc agc cac agc gtt gag cct gcg tgc cag ctt cct 1338 Arg Leu Val Ser His Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro 400 405 410 <210> 10 <211> 446 <212> PRT <213> Hafnia alvei <400> 10 Met Thr Ile Ser Leu Phe Asn Arg Asn Lys Pro Ala Ile Ala Gln Arg -30 -25 -20 Ile Leu Cys Pro Leu Ile Val Ala Leu Phe Ser Gly Leu Pro Ala Tyr -15 -10 -5 Ala Ser Asp Thr Ala Pro Ala Gly Phe Gln Leu Glu Lys Val Val Ile -1 1 5 10 15 Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met 20 25 30 Arg Asp Val Thr Pro His Gln Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly 35 40 45 Tyr Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe 50 55 60 Tyr Arg Glu Arg Phe Gln Gln Gln Gly Leu Leu Pro Lys Asp Asn Cys 65 70 75 Pro Thr Pro Asp Ala Val Tyr Val Trp Ala Asp Val Asp Gln Arg Thr 80 85 90 95 Arg Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Asp 100 105 110 Leu Ala Ile His His Gln Gln Asn Thr Gln Gln Ala Asp Pro Leu Phe 115 120 125 His Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Ser Gln Val His 130 135 140 Ala Ala Val Glu Lys Gln Ala Gly Thr Pro Ile Glu Thr Leu Asn Gln 145 150 155 Arg Tyr Gln Ala Ser Leu Ala Leu Met Ser Ser Val Leu Asp Phe Pro 160 165 170 175 Lys Ser Pro Tyr Cys Gln Gln His Asn Ile Gly Lys Leu Cys Asp Phe 180 185 190 Ser Gln Ala Met Pro Ser Arg Leu Ala Ile Asn Asp Asp Gly Asn Lys 195 200 205 Val Ala Leu Glu Gly Ala Val Gly Leu Ala Ser Thr Leu Ala Glu Ile 210 215 220 Phe Leu Leu Glu His Ala Gln Gly Met Pro Lys Val Ala Trp Gly Asn 225 230 235 Ile His Thr Glu Gln Gln Trp Asn Ser Leu Leu Lys Leu His Asn Ala 240 245 250 255 Gln Phe Asp Leu Met Ser Arg Thr Pro Tyr Ile Ala Lys His Asn Gly 260 265 270 Thr Pro Leu Leu Gln Thr Ile Ala His Ala Leu Gly Ser Asn Ile Thr 275 280 285 Ser Arg Pro Leu Pro Asp Ile Ser Pro Asp Asn Lys Ile Leu Phe Ile 290 295 300 Ala Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Ser Gly Met Leu Gly Met 305 310 315 Thr Trp Thr Leu Pro Gly Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly Gly Ala 320 325 330 335 Leu Val Phe Glu Arg Trp Val Asp Asn Ala Gly Lys Pro Tyr Val Ser 340 345 350 Val Asn Met Val Tyr Gln Thr Leu Ala Gln Leu His Asp Gln Ala Pro 355 360 365 Leu Thr Leu Gln His Pro Ala Gly Ser Val Arg Leu Asn Ile Pro Gly 370 375 380 Cys Ser Asp Gln Thr Pro Asp Gly Tyr Cys Pro Leu Ser Thr Phe Ser 385 390 395 Arg Leu Val Ser His Ser Val Glu Pro Ala Cys Gln Leu Pro 400 405 410 <210> 11 <211> 81 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <220> <221> CDS <222> (1)..(81) <223> Savinase signal peptide <400> 11 atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc att 48 Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile 1 5 10 15 tct gtt gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct 81 Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala 20 25 <210> 12 <211> 27 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 12 Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile 1 5 10 15 Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala 20 25

Claims (20)

  1. (a) (i) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413, 및/또는
    (ii) SEQ ID NO: 10의 성숙한 폴리펩티드 부분
    과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및
    (b) 상기 (i) 및 (ii)의 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편
    으로 구성된 군에서 선택된 파이타제 활성을 갖는 분리된 폴리펩티드.
  2. 제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  3. (a) SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338과 적어도 75% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드
    로 구성된 군에서 선택된, 파이타제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
  4. 발현 숙주에서 폴리펩티드의 제조를 지시하는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 제2항 또는 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구조체.
  5. 제4항의 핵산 구조체를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  6. 제5항의 핵산 구조체를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  7. (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서, 폴리펩티드를 야생형 형태로 제조할 수 있는 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 폴리펩티드의 제조방법.
  8. (a) 폴리펩티드의 제조 조건하에서, 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구조체를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항의 폴리펩티드의 제조방법.
  9. 제1항의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환된 트랜스제닉 식물, 식물 부위 또는 식물 세포.
  10. 제1항의 폴리펩티드를 발현할 수 있는 트랜스제닉 비인간 동물, 또는 그것의 산물 또는 구성요소.
  11. 동물 사료에서 적어도 하나의 제1항의 폴리펩티드의 사용.
  12. 동물 사료에 사용하기 위한 조성물의 제조에서 적어도 하나의 제1항의 폴리펩티드의 사용.
  13. 적어도 하나의 제1항의 폴리펩티드를 사료에 첨가하는 단계를 포함하는 동물 사료의 영양가의 개선방법.
  14. (a) 적어도 하나의 제1항의 폴리펩티드; 및
    (b) 적어도 하나의 지용성 비타민, 적어도 하나의 수용성 비타민, 적어도 하나의 미량 미네랄 또는 이들의 조합
    을 포함하는 동물 사료 첨가물.
  15. 제14항에 있어서, 적어도 하나의 아밀라제, 적어도 하나의 추가의 파이타제, 적어도 하나의 자일라나제, 적어도 하나의 갈락타나제, 적어도 하나의 알파-갈락토시다제, 적어도 하나의 프로테아제, 적어도 하나의 포스포리파제, 및/또는 적어도 하나의 베타-글루카나제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 동물 사료 첨가물.
  16. 50 내지 800g/kg의 조단백질 함유량을 갖고 적어도 하나의 제1항의 폴리펩티드를 포함하는 동물 사료 조성물.
  17. (a) 발효 미생물을 사용하여 제1항의 파이타제의 존재하에서 탄수화물 함유 물질을 발효하는 단계 및 (b) 발효된 탄수화물 함유 물질로부터 발효 산물 또는 발효 부산물을 제조하는 단계를 포함하는, 발효 산물의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 발효 산물은 에탄올, 맥주, 와인 또는 주정박(DDG)인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 10의 아미노산 1 내지 413과 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  20. 제3항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9의 뉴클레오티드 100 내지 1338과 적어도 80% 동일성, 적어도 85% 동일성, 적어도 90% 동일성, 적어도 95% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2676649C (en) 2007-01-30 2016-08-30 Novozymes A/S Polypeptides having phytase activty and polynucleotides encoding same
CA2681392C (en) 2007-03-26 2017-08-01 Novozymes A/S Hafnia phytase
EP2283124B1 (en) * 2008-04-18 2016-05-25 Danisco US Inc. Buttiauxella sp. phytase variants
ES2636369T3 (es) * 2008-09-26 2017-10-05 Novozymes A/S Variantes de fitasa de Hafnia
FR2947563B1 (fr) * 2009-07-01 2015-08-21 Biomethodes Variants ameliores d'une phytase
BR112012009483A2 (pt) * 2009-10-22 2015-09-15 Basf Se fitase, sequência de ácido nucleico isolada, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, organismo de produção recombinante, aditivo de ração animal, ração animal, e, uso de uma fitase
BR112012023840B1 (pt) * 2010-03-26 2021-06-22 Novozymes A/S Variante de fitase, métodos para produzir uma variante de fitase, para melhorar o valor nutricional de uma ração animal e para produzir um produto de fermentação, sequência de ácidos nucleicos isolada, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, composição, e, uso da fitase ou da composição
GB201102857D0 (en) 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
GB201102865D0 (en) 2011-02-18 2011-04-06 Danisco Feed additive composition
BR112013027130B1 (pt) * 2011-04-21 2021-02-23 Basf Se fitase, aditivo de alimentação animal, alimentação animal e usos de uma fitase
DK2699674T3 (da) * 2011-04-21 2016-03-21 Basf Se Syntetiske fytasevarianter
CN103492579A (zh) * 2011-04-29 2014-01-01 丹尼斯科美国公司 用纤维素酶和葡糖淀粉酶提高发酵制备乙醇的产率
ES2705533T3 (es) 2011-07-07 2019-03-25 Dupont Nutrition Biosci Aps Ensayo
GB201213801D0 (en) 2012-08-03 2012-09-12 Dupont Nutrition Biosci Aps Feed additive composition
CN105934518A (zh) 2013-09-11 2016-09-07 诺维信公司 用于生产发酵产品的方法
MX2016016871A (es) 2014-06-27 2017-04-25 Dsm Ip Assets Bv Metodo para mejorar el valor nutricional de pienso para animales.
ES2625174T3 (es) 2015-02-27 2017-07-18 Fcc Aqualia, S.A. Dispositivo y método para retirada simultánea de sulfuro de hidrógeno y dióxido de carbono del biogás
CN105154439B (zh) * 2015-08-04 2019-04-05 南开大学 对蜂房哈夫尼亚菌g5902，g5903，g5904，g5906特异的核苷酸序列
WO2017112540A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
CN111164214A (zh) 2017-09-15 2020-05-15 诺维信公司 用于改进动物饲料营养质量的酶共混物和方法
CN111183228A (zh) 2017-10-23 2020-05-19 诺维信公司 减少生物燃料发酵***中乳酸的方法
CN111867388A (zh) 2018-02-08 2020-10-30 丹尼斯科美国公司 用于酶包封的耐热蜡基质颗粒
US20210238578A1 (en) 2018-04-26 2021-08-05 Danisco Us Inc Inorganic phosphate as a stabilizer for phytase enzymes
MX2020012754A (es) 2018-05-31 2021-02-26 Novozymes As Procesos para mejorar el crecimiento y la productividad de la levadura.
AU2019384024A1 (en) * 2018-11-20 2021-06-10 International N&H Denmark Aps Engineered robust high Tm-phytase clade polypeptides and fragments thereof
BR112021014873A2 (pt) 2019-01-31 2021-10-05 Novozymes A/S Polipeptídeo, combinação de enzimas, polinucleotídeo, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método de produção de um polipeptídeo, e, processo de produção de um produto de fermentação
MX2022000355A (es) 2019-07-09 2022-03-17 Dupont Nutrition Biosci Aps Composiciones de enzimas particuladas recubiertas de grasa.
CN114423296A (zh) 2019-08-05 2022-04-29 诺维信公司 从全酒糟副产物生产高蛋白饲料成分的酶共混物和工艺
CN114615894A (zh) 2019-08-16 2022-06-10 杜邦营养生物科学有限公司 包含乳杆菌菌株组合的用于消化道健康的组合物
WO2021046073A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed composition
CN114828642A (zh) 2019-10-21 2022-07-29 杜邦营养生物科学有限公司 用于消化道健康的组合物
AR120775A1 (es) 2019-12-16 2022-03-16 Novozymes As Procesos para obtener productos de fermentación
BR112022015553A2 (pt) 2020-02-07 2022-10-04 Dupont Nutrition Biosci Aps Composições de ração para saúde animal
US20230172233A1 (en) 2020-05-15 2023-06-08 Dsm Ip Assets B.V. A method for improving the nutritional value of animal feed
EP4228425A1 (en) 2020-10-16 2023-08-23 DuPont Nutrition Biosciences ApS Feed compositions for animal health
WO2022169933A2 (en) 2021-02-03 2022-08-11 Dupont Nutrition Biosciences Aps Compositions for gut health
WO2023049488A1 (en) 2021-09-27 2023-03-30 Dupont Nutrition Biosciences Aps Feed additive compositions and methods for using the same
WO2023237543A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Means and methods for reducing phosphorus secretion by fish

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
NZ237549A (en) 1990-03-23 1993-06-25 Gist Brocades Nv Production of enhanced levels of enzymes in the seeds of transgenic plants and the use of these seeds
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
JP3355186B2 (ja) 1990-12-05 2002-12-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 改変したエピトープを有するタンパク質及びその製造のための方法
DK91192D0 (da) 1992-07-10 1992-07-10 Novo Nordisk As Protein
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5689054A (en) 1994-03-17 1997-11-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Low phytic acid mutants and selection thereof
BR9507817A (pt) 1994-06-03 1997-09-16 Novo Nordisk Biotech Inc Construção de dna enzima vetor recombinante célula hospedeira recombinante lacase de ascomicete ou deuteromicete processos para obter uma enzima de lacase para melhorar o rendimento de enzima recombinante para polimerizar um substrato de lignina ou lignossulfato em soluç o para despolimerizar in situ a pasta kraft para oxidar corantes ou precursores de corantes para pintar cabelo e para polimerizar ou oxidar um composto fenólico ou anilina composição de corante e recipiente contendo a mesma
CN1151762A (zh) 1994-06-30 1997-06-11 诺沃诺尔迪斯克生物技术有限公司 非毒性、非产毒性、非致病性镰孢属表达***及所用启动子和终止子
JPH10509324A (ja) 1994-11-24 1998-09-14 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 抑制されたアレルゲン性を有するポリペプチドの製造のための方法
WO1996017929A1 (en) 1994-12-07 1996-06-13 Novo Nordisk A/S Polypeptide with reduced allergenicity
EP0954572A1 (en) 1997-01-10 1999-11-10 Novo Nordisk A/S Enzyme coupled with polymeric molecules for skin care
JP2001511162A (ja) 1997-02-06 2001-08-07 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 付加され、そして／又は除去された付着基を有するポリペプチド−ポリマー結合体
ES2296336T3 (es) 1997-06-25 2008-04-16 Novozymes A/S Polipeptido modificado.
NZ330940A (en) 1997-07-24 2000-02-28 F Production of consensus phytases from fungal origin using computer programmes
US7078035B2 (en) 1997-08-13 2006-07-18 Diversa Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US6855365B2 (en) * 1997-08-13 2005-02-15 Diversa Corporation Recombinant bacterial phytases and uses thereof
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
WO2003066847A2 (en) 2002-02-08 2003-08-14 Novozymes A/S Phytase variants
BR9914217A (pt) 1998-10-02 2001-07-03 Novozymes As Composição de fitase sólida, processo para preparar a mesma, e, composição sólida
WO2000022103A1 (en) 1998-10-13 2000-04-20 Novozymes A/S A modified polypeptide with reduced immune response
ATE332968T1 (de) 1998-10-26 2006-08-15 Novozymes As Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
NZ511291A (en) 1998-10-30 2003-08-29 Novozymes As A method for selecting a protein variant that has reduced immunogenicity as compared with the parent or wild-type protein
WO2000026354A1 (en) 1998-10-30 2000-05-11 Novozymes A/S Glycosylated proteins having reduced allergenicity
CN100482801C (zh) 1999-03-22 2009-04-29 诺沃奇梅兹有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
EP1165806B1 (en) 1999-03-31 2005-08-03 Cornell Research Foundation, Inc. Phosphatases with improved phytase activity
US6841370B1 (en) 1999-11-18 2005-01-11 Cornell Research Foundation, Inc. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli phytase
EP1642506A3 (en) 2000-02-08 2007-04-25 DSM IP Assets B.V. Use of acid-stable subtilisin proteases in animal feed
AU2001235360A1 (en) 2000-02-23 2001-09-03 Novozymes A/S Fermentation with a phytase
EP2258835A1 (en) 2000-04-28 2010-12-08 Novozymes A/S Lipolytic enzyme variant
EP1389217B1 (en) 2001-05-04 2008-05-21 Novozymes A/S Antimicrobial polypeptide
ES2275011T3 (es) 2001-11-20 2007-06-01 Novozymes A/S Polpeptidos antimicrobianos de pseudoplectania nigrella.
JP2005513042A (ja) 2001-12-03 2005-05-12 ノボザイムス アクティーゼルスカブ スタチン様化合物
RU2318018C2 (ru) 2001-12-07 2008-02-27 Новозимс А/С Полипептиды, обладающие протеазной активностью, и нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные полипептиды
GB0422052D0 (en) 2004-10-04 2004-11-03 Dansico As Enzymes
GB0423139D0 (en) 2004-10-18 2004-11-17 Danisco Enzymes
BRPI0717181B1 (pt) 2006-09-21 2022-04-05 Basf Enzymes Llc Ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, veículo de clonagem, microrganismo transgênico, polipeptídeo de fitase, polipeptídeo imobilizado ou ácido nucleico imobilizado, processos de produção de um polipeptídeo recombinante, para hidrolisar um inositol-hexafosfato em inositol e fosfato inorgânico, para degomagem de óleo, para produção de um alimento, produto alimentício ou suplemento alimentar, para processamento de grãos de milho e de sorgo, alimento, produto alimentício ou suplemento alimentar, composição, e, uso de um polipeptídeo
CA2676649C (en) 2007-01-30 2016-08-30 Novozymes A/S Polypeptides having phytase activty and polynucleotides encoding same
US8143046B2 (en) 2007-02-07 2012-03-27 Danisco Us Inc., Genencor Division Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties
ES2550477T3 (es) 2007-02-07 2015-11-10 Danisco Us Inc. Hidrólisis de almidón utilizando fitasa con una alfa amilasa
CA2681392C (en) * 2007-03-26 2017-08-01 Novozymes A/S Hafnia phytase
ES2636369T3 (es) 2008-09-26 2017-10-05 Novozymes A/S Variantes de fitasa de Hafnia
ES2737885T3 (es) 2010-03-26 2020-01-16 Novozymes As Variantes termoestables de fitasa

Also Published As

Publication number Publication date
US7923232B2 (en) 2011-04-12
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US20080263688A1 (en) 2008-10-23
CA2681392A1 (en) 2008-10-02
DK2129781T3 (da) 2014-03-31

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