KR20090116475A - 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의정확도를 분석하는 방법 - Google Patents

마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의정확도를 분석하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 이용하여 마이크로어레이의 프로브 핵산의 서열 및/또는 길이의 정확도를 조사하는 방법을 제공한다.
마이크로어레이, 엑소뉴클레아제, 정확도

Description

마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 방법{Method of analyzing the accuracy of probe nucleic acids immobilized on a microarray substrate}
본 발명은 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 방법에 관한 것이다.
핵산 마이크로어레이는 핵산이 고정되어 있는 영역이 기판상에 고밀도로 배열되어 있는 것을 말한다. 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있다. 또한, 상기 마이크로어레이의 제조방법에는 일반적으로 포토리소그래피를 이용하는 방법이 알려져 있다. 포토리소그래피를 이용하는 경우, 제거가능한 기로 보호된 단량체가 도포된 기판 표면상의 고정 영역을 에너지원에 노출시켜 보호기를 제거하고, 제거가능한 기로 보호된 단량체를 커플링시키는 단계를 반복함으로써, 핵산의 어레이를 제조할 수 있다. 이 경우, 기판상에 고정되는 핵산은 단량체를 하나씩 연장시키는 방식으로 합성된다. 또한, 스팟팅 (spotting) 법에 의하는 경우, 마이크로어레이는 이미 합성된 핵산을 일정한 영역에 고정시킴으로써 고정된다. 이 러한 핵산 마이크로어레이의 제조방법은 예를 들면, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호에 개시되어 있다. 핵산 마이크로어레이 및 그의 제조방법에 관한 상기 문헌은 원용에 의하여 본 명세서에 그 전체로서 포함되어진다.
종래 기술에 의하면, 핵산은 기판상에서 인 시튜로 포토리소그래피를 이용하여 합성되거나, 액체 또는 고상으로 별도로 합성된 후 기판상에 고정된다. 포토리소그래피와 같은 방법에 의하여 인 시튜로 합성하는 방법은 상기 영역이 고밀도로 배열될 수 있는 장점이 있으나, 합성되는 핵산의 길이 또는 서열의 정확도를 검사하기 어려운 점이 있다. 프로브 핵산의 합성 시에 합성 정확도는 Pn로 표시될 수 있다. 이때 P는 각 뉴클레오티드가 정확하게 삽입될 확률을 나타내며, n은 핵산의 길이를 나타낸다. 따라서, 핵산의 길이가 길어짐에 따라 핵산 자체에 오류가 발생할 확률이 높아진다. 따라서, 합성되는 핵산의 서열의 정확도 및 길이의 정확도를 검사하여야 필요가 있다.
미국특허에 제7,332,274호에는 생물물질의 마이크로어레이의 품질을 검사하는 방법이 기재되어 있다. 구체적으로, 프로브와 프로브와 혼성화하지 않고 세척에 의하여 제거될 수 있는 발광 또는 열 발생 화합물의 혼합물을 기판상에 스팟팅하고, 각 스팟으로부터 나오는 빛 또는 열을 측정하여 각 스팟에 대한 수치 데이터를 생성하고, 마이크로어레이를 세척하여 발광 또는 열 발생 화합물을 제거하고, 상기 수치 데이터로부터 스팟으로부터 나오는 발광 또는 열의 산술 평균을 계산하는 단계를 포함하는, 생물물질의 마이크로어레이의 품질을 검사하는 방법이 기재되어 있 다. 또한, 상기 방법에 프로브 분자를 상기 프로브와 혼성화되는 경우, 발광 또는 열을 발생시키는 화합물로 표지되고 프로브 서열에 완전 상보적인 표적 분자를 혼성화시키고, 각 스팟으로부터 나오는 빛 또는 열을 측정하는 단계를 더 포함하는 방법이 기재되어 있다.
한국특허 제0436554호에는 엑소뉴클레아제 I을 이용하여 DNA의 5' 말단이 기판에 고정되고 3' 말단의 -OH기가 노출된 비혼성화된 (non-hybridized) DNA 프로브를 제거함으로써, 유전자 분석용 센서 소자의 기판 위에 고정화된 핵사의 혼성화 검출 강도를 증가시키는 방법이 기재되어 있다. 또한, 국제특허공개 WO0/114995호에는 프로브 핵산과 표적 핵산의 상보쇄 부위에 결합하는 인터칼레이터로부터의 형광 강도를 측정함으로써 혼성화를 검출하는 방법이며, 상기 인터칼레이터가 비특이적으로 결합하는 것으로 인해 노이즈 형광의 발생을 유인하는 단일쇄 핵산 및/또는 핵산 부분을 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해서 소화하는 공정을 적어도 포함하는 혼성화 검출 방법이 기재되어 있다.
그러나, 이러한 선행기술에 의하더라도, 마이크로어레이에 고정되어 있는 핵산의 길이 및/또는 서열의 정확도를 조사할 수 있는 보다 효율적인 방법이 여전히 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 기판상에 프로브 핵산이 3' 말단 또는 5' 말단을 통하여 고정되어 있는 영역이 배열되어 있는 마이크로어레이를 제공하는 단계; 3' 말단 및 5' 말단 중 하나 이상의 말단이 검출가능한 신호 물질로 표지되어 있는 상기 프로브 핵산에 상보적인 표적 핵산을 상기 프로브 핵산과 혼성화시키는 단계; 3' 엑소뉴클레아제 및 5' 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 상기 혼성화 반응 산물과 반응시켜, 상기 프로브 핵산과 혼성화되지 않아 단일가닥으로 남아 있는 상기 표적 핵산의 3' 말단 및 5'말단 중 하나 이상의 말단에 표지된 검출가능한 신호물질을 제거하는 단계; 및 상기 효소 반응 산물로부터 남아 있는 신호를 측정하고, 상기 측정된 신호 값을 대조군 실험으로부터 얻어진 신호 값과 비교하여, 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 단계를 포함하는, 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 기판상에 프로브 핵산이 3' 말단 또는 5' 말단을 통하여 고정되어 있는 영역이 배열되어 있는 마이크로어레이를 제공하는 단계를 포함한다. "마이크로어레이"란 기판상에 프로브 핵산이 3' 말단 또는 5' 말단을 통하여 고정 되어 있는 영역이 배열되어 있는 것을 의미하는 것으로 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 영역은 상기 기판에 고밀도 배열되어 있는 것으로, 예를 들면 400/cm2 이상, 103/cm2, 104/cm2의 밀도로 배열되어 있는 것이다. 상기 프로브 핵산은 기판상에서 포토리소그래피 법에 의하여 인 시튜로 합성되거나 (예, 미국특허 제5,744,305호, 제5,143,854호 및 제5,424,186호), 액상 또는 고상에서 합성된 후 기판상에 스팟팅에 의하여 고정된 것일 수 있다 (예를 들면, Stimpson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383, 1995). 액상 또는 고상 핵산 합성 방법은 잘 알려져 있다. 포토리소그래피 법에 의하는 경우, 상기 영역이 고밀도 기판상에 배열될 수 있는 장점이 있으나, 합성되는 프로브 서열의 정확도를 담보하기가 어렵다. 반면, 액상 및 고상에서 합성된 프로브 핵산은, 합성시에 프로브 서열의 정확도를 담보할 수 있는 반면, 별도의 고정 과정, 예를 들면 스팟팅 (spotting)에 의하는 경우, 배열되는 영역의 밀도가 높지 않다는 단점이 있다.
본 발명의 일 구체예는 상기 프로브 핵산은 3' 말단을 통하여 기판상에 고정되어 있고, 5' 말단이 노출되어 있는 것이다. 또한, 다른 구체예는 상기 프로브 핵산은 5' 말단을 통하여 기판상에 고정되어 있고, 3' 말단이 노출되어 있는 것이다.
본 명세서에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 또는 PNA일 수 있다. 상기 프로브 핵산 또는 표적 핵산은 길이가 4 내지 200bp, 4 내지 100bp, 4 내지 50bp, 4 내지 30bp, 4 내지 20bp, 4 내지 15bp, 10 내지 30bp, 10 내지 20bp, 15 내지 30bp의 길이를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한, 3' 말단 및 5' 말단 중 하나 이상의 말단이 검출가능한 신호 물질로 표지되어 있는 상기 프로브 핵산에 상보적인 표적 핵산을 상기 프로브 핵산과 혼성화시키는 단계를 포함한다. 상기 검출가능한 신호물질은, 당업계에 알려진 신호 물질일 수 있다. 예를 들면, 상기 신호 물질은, 형광성 물질, 및 방사선 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 신호물질은 3' 말단 또는 5' 말단 중 어느 하나의 말단에는 신호발생물질이 표지되어 있고 다른 말단에는 형광 흡수자가 표지되어 있어, 상기 형광 흡수자가 상기 엑소뉴클레아제에 의하여 제거되는 경우, 신호가 발생하는 것일 수 있다. 상기 형광 흡수자 (quencher)의 예 및 신호발생물질의 예에는 하기하는 바와 같다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 신호 물질은 표적 핵산의 3' 말단에 표지되어 있는 것이다. 다른 구체예는 상기 신호 물질은 표적 핵산의 5' 말단에 표지되어 있는 것이다. 또 다른 구체예는 형광 흡수자가 3' 말단에 결합되어 있고, 5' 말단에는 신호발생물질이 결합되어 있는 것이다. 또 다른 구체예는 형광 흡수자가 5' 말단에 결합되어 있고, 3' 말단에는 신호발생물질이 결합되어 있는 것이다. 본 명세서에 있어서, 상기 3' 말단 또는 5' 말단에 표지되어 있다는 것은 3' 말단 또는 5' 말단의 뉴클레오티드에 결합되어 있어, 3' 엑소뉴클레아제 또는 5' 엑소뉴클레아제의 작용에 의하여 3' 말단 또는 5' 말단 뉴클레오티드의 제거에 의하여, 신호물질 또는 형광 흡수자가 제거될 수 있는 것을 의미한다.
3' 말단 또는 5' 말단 중 어느 한쪽이 흡광흡수자로 표지되어 있고, 다른 한쪽이 신호물질로 표지되어 있는 표적 핵산의 예는, 형광 염료와 흡광흡수자를 포함 하는 자가-흡수 형광 표적 핵산일 수 있다. "자가-흡수 형광 표적 핵산 (self-quenching fluorescence target nucleic acid)"는 형광 염료와 에너지 전이 (FRET)에 의하여 반응하는 흡광흡수자로 구성되는 한 쌍의 표지로 표지될 것일 수 있다.
여기서, "표지 (label)"란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 5'-트리포스페이트에 결합할 수 있고 (i) 검출가능한 신호를 제공하고 (ii) 예를 들면, FRET에 의하여 제공된 검출가능한 신호를 변경하기 위하여 다른 표지와 반응하고, (iii) 혼성화를 안정화하고, 예, 이중가닥을 형성하는 기능 중에서 하나 이상을 기능을 하는 임의의 모이어티를 의미한다.
"흡수 (quenching)"란 기작에 상관없이 흡광흡수자 (quencher)에 의하여 야기된 형광 염료의 형광 감소를 의미한다. "자가 흡수 (self quenching)"란 분자내, 에너지 전이 효과, 예를 들면 FRET (fluorescence resonance energy transfer)를 의미하는 것으로, 형광 염료와 흡광흡수자는 플루오로포어로부터 흡광흡수자로 에너지 전이가 일어나도록 하는 구조로 표적 핵산상에 연결되어 형광 염료에 의한 형광의 감소를 초래한다. 상기 자가 흡수 효과는 표적 핵산이 상보체에 혼성화하거나 5' 뉴클레아제 작용에 의하여 형광 염료의 절단이 일어나 형광 염료와 흡광흡수자가 분리되는 것에 의하여 감소하거나 소실될 수 있다.
상기 형광 염료는 플루오레세인 (fluorescein)과 같은, 잔텐 염료 (xanthene dye)일 수 있다. 상기 형광 염료는 통상 상기 흡광흡수자로부터 12 nt 이상 분리된 것일 수 있다. 상기 형광 염료는 표적 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단에 결합하고, 흡광흡수자는 표적 핵산의 반대편 말단에 결합할 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산은 형광 염료가 5' 뉴클레오티드에, 흡광흡수자가 3' 뉴클레오티드에 표지된 것일 수 있다. 상기 흡광흡수자는 상기 형광 염료의 파장에 따른 분할을 위하여 비형광 물질이거나, 또는 형광물질일 수 있다. 이러한 형광 염료-흡광흡수자 쌍을 포함하는 표적 핵산은, 일반적으로 TaqManTM 프로브가 알려져 있으며, 5' 뉴클레아제 활성을 필요로 한다. 상기 프로브는 증폭 중에 잘려져 존재하는 이중가닥 DNA의 양에 비례하여 형광 신호를 방출한다 (미국특허 제5,538,848호, 제5,804,375호, 제6,358,679호 참조).
형광 염료에는 플루오레세인(fluorescein), 로다민 (rhodamine) (예를 들면, 미국특허 제5,366,960호, 제5,936,087호, 제6,051,719호), 시아닌 (cyanines) (미국특허 제6,080,868호, WO 97/45539), 금속 포르피린 복합체 (WO 88/04777)가 포함될 수 있다. 플루오레세인 염료의 예에는, 6-카르복실플루오레세인 (6-FAM) 1, 2',4',1,4,-테트라클로로플루오레세인 (TET) 2 및 2',4',5',7',1,4-헥사클로로플루오레세인 (HEX) 3 (미국특허 제5,654,442호), 2',7'-디메톡시-4',5'-디클로로-6-카르복시로다민 (JOE) 4, 2'-클로로-5'-플루오로-7',8'-융합된 페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 5 (미국특허 제 5,188,934호 및 제5,885,778호), 2'-클로로-7'-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인 6 (미국특허 제6,008,379호)이 포함된다 (하기 식1-6 참조). 플루오레세인과 로다민 염료는 1,4-디클로로 치환기를 가질 수 있다 (하기 식 5-6에 나타낸 바와 같은 아래쪽 링). 또한, 형광 염료는 Cy3 또는 Cy5인 것일 수 있다.
Figure 112008032612499-PAT00001
Figure 112008032612499-PAT00002
Figure 112008032612499-PAT00003
Figure 112008032612499-PAT00004
Figure 112008032612499-PAT00005
Figure 112008032612499-PAT00006
식 중 X는 프로브와 연결되는 부분이다.
흡광흡수자에는, (i) 테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA) 7, 테트라프로파노-6-카르복시로다민 (ROX) 8로 구성된 군으로부터 선택되는 로다민 형광 염료, 및 (ii) 디아조 화합물, 예를 들면 9-11, 및 (iii) 11, 안트라퀴논, 말라카이트 그린, 니트로티아졸 및 니트로이미다졸화합물 등을 포함한 시아닌 염료가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
Figure 112008032612499-PAT00007
Figure 112008032612499-PAT00008
Figure 112008032612499-PAT00009
Figure 112008032612499-PAT00010
Figure 112008032612499-PAT00011
식 중 X는 프로브와 연결되는 부분이다.
본 명세서에 있어서, 상기 표적 핵산은 프로브 핵산에 완전 상보적이고, 프로브 핵산과 동일한 길이를 가진 것이 바람직하다. 여기서 "프로브 핵산과 동일한 길이"라는 것은 프로브 핵산의 합성하는 때에 그 의도한 프로브 핵산의 길이를 의 미하는 것으로, 합성 과정에 있어서의 오류 비율에 의하여 실제로 합성된 프로브 핵산 중에는 그 의도한 길이보다 길거나 짧은 것이 존재할 수 있는데, 이들을 제외하는 의미이다.
상기 혼성화는 핵산 혼성화와 관련된 업계에서 알려진 혼성화 조건이 사용될 수 있다. 예를 들면, 버퍼 중에서 4℃에서 14시간 동안 방치하는 것이 될 수 있다. 상기 혼성화 조건은 엄격하지 않은 혼성화 조건이 바람직하다. 이는 포토리소그래피와 같은 인 시튜 프로브 핵산 합성과정에서는 길이가 짧거나 기간 프로브 핵산이 합성되는 것뿐만 아니라 잘못된 염기가 삽입된 프로브 핵산이 만들어질 수 있는데, 이들 잘못 삽입된 프로브 핵산에 대하여도 혼성화가 일어나도록 하는 것이다.
혼성화 결과, 프로브 핵산과 표적 핵산은 혼성화되어 이중가닥 핵산을 형성한다. 이때 프로브 핵산 중에서 합성과정에서의 오류에 의하여 뉴클레오티드가 삽입되지 않아 의도한 프로브 핵산의 길이보다 짧은 프로브 핵산은, 의도한 프로브 핵산의 길이와 동일하고 완전 상보적인 표적 핵산과 혼성화하는 경우, 3' 말단 또는 5' 말단 부분에 단일가닥이 남게 된다. 즉, 프로브 핵산이 3' 말단을 통하여 기판에 결합되어 있는 경우, 의도한 길이보다 짧은 프로브 핵산은 표적 핵산과 혼성화되면 3' 오버행 (overhang) 뉴클레오티드를 형성하게 된다. 또한, 프로브 핵산이 5' 말단을 통하여 기판에 결합되어 있는 경우, 의도한 길이보다 짧은 프로브 핵산은 표적 핵산과 혼성화되면 5' 오버행 (overhang) 뉴클레오티드를 형성하게 된다. 이러한 3' 오버행 및 5' 오버행 뉴클레오티드 서열은 3' 또는 5' 엑소뉴클레아제에 의하여 제거될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 3' 엑소뉴클레아제 또는 5' 엑소뉴클레아제 효소를 상기 혼성화 반응 산물과 반응시켜, 상기 프로브 핵산과 혼성화되지 않아 단일가닥으로 남아 있는 상기 표적 핵산의 3' 말단 또는 5' 말단에 표지된 검출가능한 신호물질을 제거하는 단계를 포함한다.
본 단계에서, 상기 3' 엑소뉴클레아제 및 5' 엑소뉴클레아제는 개별 효소 (individual enzyme)이거나 효소 복합체의 일부분인 것일 수 있다. 엑소뉴클레아제 효소를 반응시키는 조건은, 4XSSC 버퍼 중에 0.002X SDS 시약을 포함하는 pH 7-8에서 반응시키는 것이다. 이러한 엑소뉴클레아제 반응 조건은 일반적으로 상기 혼성화 조건과 서로 적합성 (compatible)하다. 따라서, 상기 혼성화 반응에서 사용된 반응액에 엑소뉴클레아제를 반응액을 단순히 첨가함으로써, 반응이 이루어질 수 있다. 또한, 혼성화 반응 후, 세척 한 후, 엑소뉴클레아제 처리가 이루어질 수도 있다.
상기 엑소뉴클레아제는 생명체 내에서 사용되는 자기 복제용 DNA 폴리어머라제 또는 이들의 재조합 변이체가 포함된다. 예를 들면, 대장균 DNA 폴리머라제 I, 클레나우 단편, phi29 DNA 폴리머라제, vent DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, 및 T7 DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. DNA 중합에 필요한 전구체 물질이 반응물 중에서 공급하지 않거나, 공급할 필요가 없기 때문에, 엑소뉴클레아제 활성은 DNA 폴리머라제 활성과 동일한 효소 중에 존재하여도 된다.
이러한 엑소뉴클레아제 반응에 의하여, 3' 말단 또는 5' 말단에 오버행을 가 진 프로브 핵산은 3' 말단 또는 5' 말단에 표지되어 있던 신호 물질은 제거된다. 따라서, 엑소뉴클레아제를 처리하지 않은 것에 비하여 발생되는 신호 값은 상대적으로 감소한다. 이러한 감소된 양의 수준으로부터, 프로브 핵산 어레이의 품질을 조사할 수 있다.
도 1은 엑소뉴클레아제의 처리에 의하여 3' 오버행에 표지되어 있는 신호물질이 제거되는 것을 도식적으로 나타낸 도면이다. 도 1에 의하면, 프로브 핵산이 고정된 기판에 표적 핵산을 혼성화하고, T4 DNA 폴리머라제를 처리한 경우, 3' 오버행의 제거에 의하여 3' 말단에 표지되어 있는 형광물질인 Cy3가 제거된다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제는 프로브 핵산이 3' 말단을 통하여 기판에 고정되어 있는 경우, 5' 엑소뉴클레아제가 바람직하며, 프로브 핵산이 5' 말단을 통하여 기판에 고정되어 있는 경우, 3' 엑소뉴클레아제가 바람직하다. 이 경우 프로브와 표적의 혼성화 후에, 단일가닥으로 존재하는 표적 핵산뿐만 아니라, 프로브 핵산이 엑소뉴클레아제의 작용을 받는 것을 방지할 수 있다.
본 발명은, 또한, 상기 효소 반응 산물로부터 남아 있는 신호를 측정하고, 상기 측정된 신호 값을 대조군 실험으로부터 얻어진 신호 값과 비교하여, 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 단계를 포함한다. "상기 효소 반응 산물로부터 남아 있는 신호"란 3' 오버행 또는 5' 오버행의 제거에 의하여 3' 말단 또는 5' 말단에 표지되어 있는 신호 물질이 제거되고 남아 있는 상기 혼성화 산물 중의 신호 물질에 의하여 방출되는 신호를 의미한다. 상기 신호 는 형광 또는 방사선 신호일 수 있다.
상기 비교하는 단계는, 측정된 신호 값이 대조군 실험으로부터 얻어진 신호 값에 비하여 일정한 수준 이하이면 상기 마이크로어레이의 프로브 핵산은 불량인 것으로 판정하는 단계를 더 포함한다. 즉, 상기 측정된 신호 값을 대조군 실험으로부터 얻어진 신호 값과 비교하여, 대조군 신호 값보다 일정 수준 이하이면, 불량품으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 신호 값이 대조군 실험 값에 비하여, 90이하, 80%이하, 70%이하이면, 마이크로어레이를 불량품으로 판정하는 것일 수 있다.
상기 대조군 실험은, 엑소뉴클레아제 효소 반응 단계를 포함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되는 것이거나, 정확도가 높은 핵산 합성 방법, 예를 들면, 액상 또는 고상 합성 방법에 의하여 미리 합성되고 서열의 정확도가 검정된된 프로브 핵산이 스폿팅에 의하여 고정되어 있는 마이크로어레이를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 방법에 의하면, 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 간단하고 정확하게 검사할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
서열번호 1 내지 10 (각각 길이가 25, 24, 23, 21, 19, 17, 15, 13, 11, 9bp)의 뉴클레오티드 서열을 가진 프로브 핵산을 Bioneer (한국)으로부터 구입하였다. 상기 프로브 핵산의 3' 말단을 아미노헥실기로 변형시키고 이를 표면이 감마-아미노프로필트리에톡시실란 (GAPTES)으로 코팅되어 있는 기판의 표면에 스팟터 (Catesion 사)를 이용하여 200㎛ 내지 300㎛ 간격으로 스팟팅하였다. 스팟팅에 사용된 각 프로브 핵산의 농도는 각각 12nM, 160nM, 0.8μM, 4μM, 20μM이었다. 그 외에 서열번호 1 내지 10의 프로브 핵산을 서열번호 1: 서열번호 2: 서열번호 3: 서열번호 4: 서열번호 5: 서열번호 6: 서열번호 7: 서열번호 8: 서열번호 9: 서열번호 10 = 10 ㎕: 9㎕: 8㎕: 7㎕: 6㎕: 5㎕: 4㎕: 3㎕: 2㎕: 1㎕ (이하 high mix), 5㎕: 5㎕: 5㎕: 5㎕: 5㎕: 5㎕: 5㎕: 5㎕: 5㎕: 5㎕ (이하 even mix), 1㎕: 2㎕: 3㎕: 4㎕: 5㎕: 6㎕: 7㎕: 8㎕: 9㎕: 10㎕ (이하 low mix)의 비율로 혼합하여 스팟팅하였다. 각 종류의 프로브 핵산은 각각 3개 스팟씩 배열하였다. low mix, even mix, 및 high mix에서 농도는 서열번호 1 내지 10의 서열의 전체 농도를 의미한다.
여기에 서열번호 1의 서열에 완전 상보적인 서열번호 11의 표적 핵산으로서, 3' 말단에 Cy3가 결합되어 있는 표적 핵산을 혼성화시켰다. 혼성화는 10nM 표적 핵산을 포함하는 6X SSC (150mM NaCl, 15mM 소듐 시트레이트), 0.002% SDS 함유 버퍼 (pH 7.0) 중에서 4℃에서 12시간 동안 이루어졌다. 반응 후, 2X SSC (150mM NaCl, 15mM 소듐 시트레이트), 0.002% SDS 함유 버퍼로 세척하였다.
다음으로, 상기 혼성화 반응 용액에 3 유니트의 T4 DNA 폴리머라제를 첨가하여, 혼성화 산물 중에서 3' 오버행을 가진 산물로부터 3' 말단 뉴클레오티드를 T4 DNA 폴리머라제의 3' -> 5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 절단하도록 하였다. 다음으로, Axxon Scanner기기를 사용하여, 552 nm에서 여기광을 가하고, 570nm에서 방출되는 광의 흡광도를 측정하였다.
도 2a는 대조군 마이크로어레이에 대한 형광측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 2b는 T4 DNA 폴리머라제를 처리한 실험군 마이크로어레이에 대한 형광측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 2a와 2b에 나타낸 바와 같이, 25 mer 표적 핵산은 프로브 핵산의 길이가 짧아짐에 따라 형광 신호가 작아졌다. 또한, T4 DNA 폴리머라제를 처리하는 경우(3유니트: 도 2b), 처리하지 않은 경우(도 2a)에 비하여 형광 신호가 감소하는 것을 알 수 있다. 이는 T4 DNA 폴리머라제에 의하여 프로브 핵산과 표적 핵산의 혼성화 산물 중에서 3' 오버행이 혼성화 산물로부터 분리될 수 있다는 것을 의미한다.
도 3은 도 2b의 결과 중 스팟팅 농도 및 프로브 핵산의 길이에 대한 T4 DNA 폴리머라제 처리의 효과를 나타내는 도면이다. 도 3에서 종축은, T4 DNA 폴리머라제를 처리하지 않은 대조군에 대한 형광 신호의 감소의 정도를 나타내는 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 프로브 핵산의 길이가 작아짐에 따라, 형광 신호의 감소 정도가 증가하는 경향을 보였다. 15mer 프로브 핵산의 경우, 형광 신호의 감소 정도가 17mer 프로브 핵산의 경우에 비하여 더 적었는데, 이는 3' 오버행이 더 적었 기 때문에 아니라, 길이가 지나치게 짧아짐에 따라 표적 핵산과의 혼성화 자체가 영향을 받은 것으로 생각된다.
도 4a와 4b는 T4 DNA 폴리머라제를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 형광 강도의 변화를 그래프로 나타낸 도면이다. 도 4a와 4b는 도 1a 및 1b의 결과 중 각 프로브 핵산을 20μM 및 4μM로 스팟팅한 마이크로어레이에 대하여, T4 DNA 폴리머라제를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 형광 강도의 변화를 나타낸 것이다. 도 4a에서, 프로브 핵산 길이와 형광 강도의 상관관계 식은, 처리 전 y=2x10-5x6.8548(R2=0.9356)이고, 처리 후 y=4281x-43604 (R2=0.9447)이었다. 도 4b에서, 프로브 핵산 길이와 형광 강도의 상관관계 식은, 처리 전 y=7x10-5x6.0419 (R2=0.9177)이고, 처리 후 y=2353x-23628 (R2=0.7877)이었다. 도 4a와 4b에 의하면, T4 DNA 폴리머라제의 처리에 의하여 형광 강도가 감소하였으며, 그 정도는 프로브 핵산의 길이가 짧아짐에 따라 더 컸다.
도 1은 엑소뉴클레아제의 처리에 의하여 3' 오버행에 표지되어 있는 신호물질이 제거되는 것을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 2a는 대조군 마이크로어레이에 대한 형광측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 2b는 T4 DNA 폴리머라제를 처리한 실험군 마이크로어레이에 대한 형광측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 3는 도 2b의 결과 중 스팟팅 농도 및 프로브 핵산의 길이에 대한 T4 DNA 폴리머라제 처리의 효과를 나타내는 도면이다.
도 4a와 4b는 T4 DNA 폴리머라제를 처리한 경우와 처리하지 않은 경우의 형광 강도의 변화를 그래프로 나타낸 도면이다. 도 4a와 4b에서, 25, 24, 23, 21,19, 17,15, 13, 11 및 9는 각각 서열번호 1 내지 10의 서열이 고정되어 있는 것을 나타내고, L, E, 및 H는 각각 low mix, even mix 및 high mix가 고정되어 있는 것을 나타낸다.
<110> Samsung Electronics. Co., Ltd. <120> Method of analyzing the accuracy of probe nucleic acids immobilized on a microarray substrate <130> PN077768 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 25 mer probe <400> 1 ccagctatca actcgcgccc tggaa 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer probe <400> 2 cagctatcaa ctcgcgccct ggaa 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23mer probe <400> 3 agctatcaac tcgcgccctg gaa 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 21mer probe <400> 4 ctatcaactc gcgccctgga a 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 19mer probe <400> 5 atcaactcgc gccctggaa 19 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 17mer probe <400> 6 caactcgcgc cctggaa 17 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15mer probe <400> 7 actcgcgccc tggaa 15 <210> 8 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13mer probe <400> 8 tcgcgccctg gaa 13 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11mer probe <400> 9 gcgccctgga a 11 <210> 10 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9mer probe <400> 10 gccctggaa 9 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 25mer target complementary to the 25mer probe: labelled with Cy3 at its 3' terminus <400> 11 ttccagggcg cgtgttgata gctgg 25 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 24mer target derived from 25mer target labelled with Cy3 at it's 3'terminus <400> 12 ttccagggcg cgtgttgata gctg 24 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 23mer target derived from 25mer target labelled with Cy3 at its 3' terminus. <400> 13 ttccagggcg cgtgttgata gct 23

Claims (10)

  1. 기판상에 프로브 핵산이 3' 말단 또는 5' 말단을 통하여 고정되어 있는 영역이 배열되어 있는 마이크로어레이를 제공하는 단계;
    3' 말단 및 5' 말단 중 하나 이상의 말단이 검출가능한 신호 물질로 표지되어 있는 상기 프로브 핵산에 상보적인 표적 핵산을 상기 프로브 핵산과 혼성화시키는 단계;
    3' 엑소뉴클레아제 및 5' 엑소뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 상기 혼성화 반응 산물과 반응시켜, 상기 프로브 핵산과 혼성화되지 않아 단일가닥으로 남아 있는 상기 표적 핵산의 3' 말단 및 5'말단 중 하나 이상의 말단에 표지된 검출가능한 신호물질을 제거하는 단계; 및
    상기 효소 반응 산물로부터 남아 있는 신호를 측정하고, 상기 측정된 신호 값을 대조군 실험으로부터 얻어진 신호 값과 비교하여, 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 단계를 포함하는, 마이크로어레이에 고정되어 있는 프로브 핵산 서열의 정확도를 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프로브 핵산은 3' 말단을 통하여 기판상에 고정되어 있고, 5' 말단이 노출되어 있는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 신호 물질은, 형광성 물질 및 방사선 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서,상기 신호물질은 3' 말단 또는 5' 말단 중 어느 하나의 말단에는 신호발생물질이 표지되어 있고 다른 말단에는 형광흡수자 (quencher)가 표지되어 있어, 상기 형광흡수자가 상기 엑소뉴클레아제에 의하여 제거되는 경우, 신호가 발생하는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 형광성 물질은, Cy3 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 표적 핵산은 의도한 프로브 핵산의 길이와 동일한 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 프로브 핵산은 포토리소그래피에 의하여 기판상에서 합성된 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제는 DNA 폴리머라제 I 및 T4 DNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 대조군 실험은, 엑소뉴클레아제 효소 반응 단계를 포 함하지 않는 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되는 것이거나, 액상에서 합성된 프로브 핵산이 스폿팅에 의하여 고정되어 있는 마이크로어레이를 사용하는 것을 제외하고는 동일한 과정에 의하여 수행되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 비교하는 단계는, 측정된 신호 값이 대조군 실험으로부터 얻어진 신호 값에 비하여 일정한 수준 이하이면 상기 마이크로어레이의 프로브 핵산은 불량인 것으로 판정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0896634A1 (en) * 1996-11-29 1999-02-17 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Method for determining tandem repeat sequence length
US6235480B1 (en) * 1998-03-13 2001-05-22 Promega Corporation Detection of nucleic acid hybrids
US20060141481A1 (en) * 2004-12-27 2006-06-29 Mariani Brian D HSV-1 and HSV-2 primers and probes

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101516976B1 (ko) * 2013-10-30 2015-05-04 에스케이텔레콤 주식회사 표적 염기 서열 해독에서의 바이어스 제거 방법

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