KR20090116210A - 글리피칸-3 측정용 분석방법을 이용한 암 진단 방법 및 암진단 키트 - Google Patents

글리피칸-3 측정용 분석방법을 이용한 암 진단 방법 및 암진단 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글리피칸-3(Glypican-3)를 특이적으로 인지하는 항체들을 이용하는 현장분석을 위한 면역크로마토그래피 방법, 복합마커 분석을 위한 루미넥스 어세이 시스템(Luminex assay system), 바이오 센서를 위한 단백질 어레이(Protein array)를 이용하여 글리피칸-3의 농도를 측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 위한 측정용 킷트에 관한 것으로, 본 발명의 진단 방법 및 킷트는 간암, 유방암, 대장암 등의 질환의 조기진단과 치료 성과의 평가에 유용하게 사용할 수 있으며, 안전성과 재현성이 높고 짧은 시간내에 신속하게 이루어지며, 다량의 시료를 동시에 정확하게 측정할 수 있다.
글리피칸-3, 면역크로마토그래피 스트립, 루미넥스 어세이 시스템, 단백질 어레이, 측정용 킷트

Description

글리피칸-3 측정용 분석방법을 이용한 암 진단 방법 및 암 진단 키트 {A METHOD FOR DIGNOSING CANCER AND A DIAGNOSTIC KIT USING DETECTION OF GLYPICAN-3}
본 발명은 글리피칸-3 측정용 분석방법, 이를 이용한 암 진단방법 및 키트에 관한 것으로, 보다 자세하게는 글리피칸-3을 특이적으로 인지하는 항체들을 이용하여 암 발생시 혈액 내에서 증가하는 것으로 추정되는 글리피칸-3의 양을 면역크로마토그래피 스트립, 루미넥스 어세이 시스템(Luminex assay system), 면역학적 도트 어세이(Immunodot assay) 및 단백질 어레이(Protein array)등의 방법을 이용하여 측정하는 분석방법, 이러한 분석방법을 포함하는 암 진단방법 및 이러한 분석방법 및/또는 암 진단방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.
간염, 간경변, 간암 등을 포함한 간 질환은 한국, 일본, 대만, 중국, 대부분의 동남아 국가에서 단일 질병으로는 가장 많은 환자가 발생하고 있으며, 현재는 간 질환 진단 시 요 중 빌리루빈(bilirubin)이나 우로빌리노겐(urobilinogen)의 검출정도를 보거나, 혈액 중 GOT(glutamic-oxaloacetic transaminase), GPT(glutamic pyruvic transaminase), 총 빌리루빈, 알부민, 단백질, 유산 탈수소효소 등의 양을 측정하여 생화학적 성분 변화를 보거나, B형 간염 바이러스(HBV) 또는 C형 간염 바이러스(HCV)의 항원 또는 항체를 탐지하여 간 질환을 진단하고 있다. 그 외에도 간암 진단에는 알파-페토 단백질(alpha-feto protein; AFP) 및 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen; CEA) 검사가 이용되고 있다. 그러나 간장은 복잡한 여러 기능을 지니고 있으며, 간장의 이상을 쉽게 감지하지 못하는 생체적인 특이성이 존재하고, 간 질환 조기진단기술 미비로 인하여 간 질환이 크게 악화된 후 진단되는 경우가 많아서 간 질환 치료에 어려움이 있다.
본 연구자들은 간암의 조기 임상진단과 간암 환자에 대한 질병의 진행 상황을 정확하게 반영해 주는 간암 표식자(marker)를 발굴 진단, 킷트화하고 간암 진단제로서의 우수성을 특허와 논문을 통해 발표한 바 있다.
글리피칸-3는 글리코실-포스파티딜이노시톨-연관 세포-표면 헤파란 설페이트 펩티도글리칸(glycosyl-phosphatidylinositol-anchored cell-surface heparan sulfate proteoglycans)의 새로운 패밀리로 글리피칸(glypican) 족의 존재가 보고되어 현재 글리피칸 족의 단백질로는 5종류의 글리피칸(글리피칸-1, 글리피칸-2, 글리피칸-3, 글리피칸-4 및 글리피칸-5)이 존재한다고 알려져 있다. 글리피칸-3는 발생(development)동안의 세포 분열이나 그 패턴의 제어에 매우 깊이 관여하고 있음이 알려져 있다.
또한 최근 DNA 마이크로어레이에 의해 글리피칸-3 유전자가 간암조직에서 높게 발현됨을 발견하였으며, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 글리피칸-3 mRNA는 대다수의 간암에서 높이 발현되어, 정상 간의 경우 3.2%의 발현율을 보임에 비해 간암조직에서 74.8%의 발현율이 보고된 바 있다. 이를 토대로 간암환자의 혈청에서 글리피칸-3 레벨을 ELISA로 측정한 결과 간암환자 약 53%의 의미있게 증가됨을 관찰하였고 AFP치와는 독립적으로 연관성이 없었고 두 표지자를 같이 검사할 경우 간암의 진단율을 높이는 것을 보고되었다.
글리피칸-3와 암발생과의 관련성에 관한 보고로는, 간암 외 난소암(Esheba GE et. al., Oncofetal Protein Glypican-3 Distinguishes Yolk Sac Tumor From Clear Cell Carcinoma of the Ovary, Am J Surg Pathol. 2008, Stadlmann S et. al, Glypican-3 expression in primary and recurrent ovarian carcinomas. Int J Gynecol Pathol. 2007, 26(3):341-4.), 유방암(Eshchenko TY et.al., Expression of different proteoglycans in human breast tumors. Biochemistry (Mosc). 2007. 72(9):1016-20.; Peters MG et. al., Inhibition of invasion and metastasis by glypican-3 in a syngeneic breast cancer model. Breast Cancer Res Treat . 2003, 80(2):221-32), 고환암(Iczkowski KA et al., New immunohistochemical markers in testicular tumors. Anal Quant Cytol Histol. 2006, 28(4):181-7; Ota S et. al., Oncofetal protein glypican-3 in testicular germ-cell tumor. Virchows Arch. 2006, 449(3):308-14; Kawakami T et, al, The roles of supernumerical X chromosomes and XIST expression in testicular germ cell tumors. J Urol. 2003, 169(4):1546-52), 위암(Lage H. et.al., Molecular analysis of therapy resistance in gastric cancer. Dig Dis. 2003, 21(4):326-38; Wichert A et. al., Glypican-3 is involved in cellular protection against mitoxantrone in gastric carcinoma cells. Oncogene. 2004, 23(4):945-55; Zhu Z et. al., Glypican-3 expression is markedly decreased in human gastric cancer but not in esophageal cancer. Am J Surg. 2002 Jul;184(1):78-83), 폐암(Powell CA et., al. Oligonucleotide microarray analysis of lung adenocarcinoma in smokers and nonsmokers identifies GPC3 as a potential lung tumor suppressor. Chest. 2002 Mar;121), 대장암, 췌장암, 림프종(lymphoma) 등이 있다.
글리피칸-3에 대한 측정방법으로 주로 효소면역흡착법(ELISA) 등과 같은 방법에 의한 방법이 사용되고 있으나, 이러한 방법들은 대부분 측정 방법이 복잡하고 측정에 소요되는 시간이 길며, 고가의 시약을 사용하고 있다. 특히 고가의 장비가 필수적인 경우가 많다.
한편, 최근 면역크로마토크래피(immunochromatography, ICA)법은 항원, 항체뿐만 아니라 호르몬, 약물 등 다양한 분야에서 여러 종류의 물질 측정이 가능해지면서 간편하고 신속한 결과를 얻을 수 있는 장점 때문에 사용량이 점차 증가되고 있는 추세이다.
또한 최근 암의 진단을 위해 단일마커를 이용하여 진단하는 방법보다는 복합마커를 이용하여 암을 진단하는 것이 알려져 있다. 이러한 복합마커를 이용한 분석방법으로서 루미넥스 분석법(Luminex assaay)는 최근 도입된 기법으로 적은 양의 시료로 최고 100개까지의 단백질을 동시에 측정할 수 있는 시스템이며, 현재 글리피칸을 루미넥스 시스템으로 측정하는 구체적인 방법에 대해서는 전혀 공지된 바가 없다.
또한 단백질 마이크로어레이(protein microarray)도 수 ㎕로 한꺼번에 복합마커를 잴 수 있는 방법으로 이러한 마이크로어레이는 바이오센서화도 가능하다는 장점을 가지며, 종래 글리피칸의 분석에 있어 이러한 단백질 마이크로어레이를 사용하는 방법 또한 전혀 공지된 바 없다.
이러한 배경 하에서 본 발명자들은 글리피칸-3 측정을 위한 현장검사용/복합마커 분석용 분석방법, 이를 이용한 암 진단방법 및 키트에 대하여 예의 연구한 결과, 글리피칸-3를 특이적으로 인지하는 항체들을 이용하는 면역크로마토 그래피, 루미넥스 어세이 시스템, 단백질 마이크로어레이를 이용하여 글리피칸-3의 양을 측정 및 분석하는 경우 간암은 물론 각종 암에 대한 빠르고 신속한 현장 검사 및 복합 마커를 이용한 검사를 가능케 함으로써 간암은 물론 각종 암에 대한 진단 및 암 발병에 대한 경고가 가능할 것임을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 글리피칸-3에 특이적인 항체를 이용하는 글리피칸-3 분석방법을 이용하는 암의 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암의 진단방법에 이용되는 글리피칸-3 분석을 위한 면역크로마토그래피용 스트립 및 이를 포함하는 키트, 루미넥스 어세이 키트, 및 단백질 마이크로어레이 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서 본 발명은 글리피칸-3에 특이적인 항체를 이용하는 글리피칸-3 분석방법을 이용하는 암의 진단방법에 관한 것이다.
상기와 같이 본 발명에서는 글리피칸-3에 특이적인 항체를 이용하며, 이러한 항체는 바람직하게는 다클론항체 또는 단일클론항체이다.
다클론 항체는 상기한 글리피칸-3 간암마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하고 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단일클론항체는 당해 기술분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다.(Kohler et al., European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포 는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로서 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌 글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.
글리피칸-3를 선택적으로 인식하는 단일 클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 방법으로는 특이항체를 이용하여 방사능면역분석법(RIA), 효소면역흡착법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western blotting) 및 유세포 분석법등이 있으며 조직에서의 면역조직화학법(Immunohistochemistry), ELISPOT을 이용한 분석들이 있다. 일반적으로 생물학적 시료가 세포용출액이나 혈액인 경우 ELISA 기법으로 정량하고 있으며 조직인 경우는 면역조직화학법을 사용하고 있으며 세포인 경우는 ELISPOT이나 유세포 분석법을 사용하고 있다. 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 하거나 조직에서의 면역조직화학법의 경우 정량분석이 안 되며 효소면역흡착법(ELISA)의 경우 시료양이 많이 필요하며 단일 시험만을 측정할 수 있다는 단점이 있다.
상기의 하이브리도마 세포가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 암 진단방법에서는 글리피칸-3에 특이적인 항체가 생물학적 시료에 포함되어 있는 글리피칸-3와 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 상기 형성된 항원-항체 복합체를 검출하게 된다.
본 발명에서 사용된 용어 “생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체 또는 동일한 에피토프를 특이성을 가지는 항체와 반응시켜서 글리피칸-3의 발현 정도를 측정할 수 있다.
본 발명에서 “항원-항체 복합체”는 생물학적 시료중의 글리피칸-3의 발현 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 글리피칸-3 단백질과 단일클론항체 또는 다클론항체와의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.
본 발명에서 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용한다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다. 검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타 제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horse-radish peroxidase, HRP), β-라타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu³+, Eu³+ 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자(microparticles)로는 콜로이드 금(colloidal gold particles), 착색된 라텍스(colored latex) 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 57Co, 3H, 125I, 125I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.
구체적인 양태로서, 본 발명에서 암의 진단을 위해 사용하는 글리피칸-3 측정을 위한 분석방법은 면역크로마토그래피법, 면역도트 어세이법(immunodot assay), 루미넥스(Luminex) 어세이 시스템을 이용한 분석법 및 단백질 마이크로어레이법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분석방법이다. 바람직하게는 면역크로마토그래피법 또는 루미넥스 어세이 시스템을 이용한 방법이다.
면역크로마토그래피 분석법은 최근 진단 면역학 분야에서 현장검사용으로 사용되고 있는 방법으로서, 피검 시료 중에 피검 물질이 존재하는 경우, 피검 물질과 결합할 수 있는 특이적 결합 물질을 고정화한 고정상에, 상기 피검 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 특이적 결합물질 및 표식성을 가지는 표지 복합체가 피검 물질과 복합체를 형성하고, 고정상에 결합한 표지체를 검출하는 것에 의해 피검 시료 중의 피검 물질의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 암 진단방법에 이용되는 분석방법의 경우에는, 생물학적 시료 내의 글리피칸-3가 피검 물질이며, 이러한 피검물질이 샘플패드에 적용되어 이동하기 시작하면서 탐지용 항체로서 표지체와 결합된 글리피칸-3에 특이적인 항체와 반응을 하여 항원-항체 결합체 형태로 계속하여 전개된다. 이동하면서 반응막에 고정되어 있는 포획 항체와 한번 더 반응을 하여 샌드위치 형태의 복합체를 만든다. 포획항체는 반응막에 고정되어 있기 때문에 항원-항체 반응이 계속하여 일어나면 복합체의 축적이 포획 항체의 고정면에서 이루어진다. 단백질은 육안으로는 투명하기 때문에 복합체의 생성 여부와 상대적인 양을 부착된 상기 표지체, 바람직하게는 콜로이드 금 입자 또는 착색된 라텍스의 검출에 의해 글리피칸-3의 존재여부 및 암의 발병 여부를 판단할 수 있게 된다. 바람직하게는 본 발명의 암 진단방법에서는 글리피칸-3에 특이적인 항체를 포함하는 면역크로마토그래피용 스트립 또는 이를 포함하는 키트를 사용하여 면역크로마토그래피 분석법을 수행할 수 있다.
따라서, 또 다른 양태로서 본 발명은 글리피칸-3에 특이적인 항체를 포함하는 면역크로마토그래피용 스트립에 관한 것이다. 바람직하게, 본 발명에 따른 면역크로마토그래피용 스트립은,
(a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad),
(b) 시료 내의 글리피칸-3와 결합하는 결합패드(conjugate pad),
(c) 글리피칸-3의 단일클론항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조 선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane),
(d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad), 및
(e) 지지체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이러한 상기 스트립의 구체적인 구조는 도 4에 도시되어 있다.
샘플패드는 시료, 즉 상기 언급된 생물학적 시료를 점적 등에 의해 적용시켜 스트립 내로 흡수시키는 것이며, 흡수된 시료는 모세관 현상에 의하여 결합패드를 통과하고 반응막을 따라 이동하게 된다. 바람직하게 결합패드는 미소입자와 접합된 글리피칸-3 특이적인 항체를 포함하고, 더욱 바람직하게는 콜로이드성 금 입자 또는 착색된 미소입자(colored micro particle)와 접합된 글리피칸-3 특이적인 항체를 포함한다. 이러한 반응막은 바람직하게는 니트로셀룰로오스(NC)막 및/또는 유리섬유(GF)막이며, 글리피칸-3에 특이적인 항체가 처리되어 있다. 또한, 흡수패드는 막의 반대편 말단에 위치하며 모세관 현상에 의해 막을 따라 이동한 생물학적 시료를 흡수하고, 지지체는 이러한 스트립의 구성요소를 지지하기 위한 것으로 바람직하게는 플라스틱이다.
또한, 또 다른 양태로서 본 발명은 상기 면역크로마토그래피용 스트립을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다. 면역크로마토그래피 스트립 제조 방법은 통상적인 스트립 제조방법에 따라 실시할 수 있다. 본 발명의 면역크로마토그래피 스 트립은 바람직하게는 카세트(casette) 또는 막대(stick) 형태이다.
한편, 면역도트 어세이(immunodot assay)는 니트로셀룰로오스 또는 폴리피닐리덴 플루오라이드(PVDF)와 같은 막 고체 지지체상에 도트-블럿(dot blot) 기구를 사용하여 특정한 펩타이드들을 부착시켜 신속하고 민감한 면역효소적검출을 하는 방법이다.
바람직하게, 본 발명에서는,
(a) 상기 생물학적 시료를 도트-블럿 기구를 이용하여 막에 도트(dot)를 찍는 단계;
(b) 글리피칸-3에 특이적인 항체를 상기 막에 반응시키는 단계; 및
(c) 표지체가 접합된 2차 항체를 가하고 발색시키는 단계를 포함하는 면역도트 어세이 분석법을 수행할 수 있다.
또한, 루미넥스 어세이(Luminx assay)는 생물학적 시료의 복합적인 분석을 위한 어세이로서, 유세포분석(flow cytometry)의 원리에 기초한 다루기 쉬운 분석법이다. 이러한 루미넥스 어세이 시스템은 하나의 마이크로플레이트 웰 내에서 약 100개 정도까지의 피검대상을 복합적으로 분석할 수 있다. 따라서, 이러한 루미넥스 어세이 시스템을 이용한 분석법은 최고의 정확도를 보증하는 반면 매우 빠르고 비용 효과가 큰 바이오어세이를 수행할 수 있는 기회를 부여한다.
이러한 루미넥스 어세이 시스템은 비드를 사용하며, 이러한 비드는 앞서 언 급된 표지체, 바람직하게는 형광물 등으로 레이블되며, 글리피칸-3에 특이적인 항체는 상기 비드에 흡착시켜 사용할 수 있다. 바람직하게는 상기 비드는 폴리스티렌계통이다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 인간 글리피칸-3 단백질에 대한 다클론항체를 비드에 컨주게이션 시킨 후, 인간 글리피칸-3 재조합 단백질을 희석하여 부가 및 PBS-T 용액을 사용하여 세척한 연후에, 글리피칸-3 단백질에 대한 단일클론항체를 희석한 후 반응시키고 세척하였다. 이후 PE가 접합된 2차 항체를 부가하여 세척 후 루미넥스 분석기로 측정하여 루미넥스 시스템을 확립한 연후에 샌드위치형 루미넥스 키트를 제작하고 상기 루미넥스 시스템을 이용하여 글리피칸-3 농도를 측정하였다.
또한, 또 다른 양태로서 본 발명은 글리피칸-3에 특이적인 항체를 포함하는 루미넥스 어세이용 키트에 관한 것으로, 바람직하게 상기 키트는
(a) 고상형 항체로서 형광비드가 흡착된 글리피칸-3에 대한 다클론항체;
(b) 검출 항체로서 글리피칸-3에 대한 단일클론항체; 및
(c) 효소결합항체로서 PE가 결합된 2차 항체를 포함하는 샌드위치형 루미넥스 어세이용 키트이다.
또한, 상기 키트는 추가적으로 혈청 희석용액, 인산염 완충액과 같은 세척액 및 글리피칸-3 표준 용액 등을 추가로 포함할 수 있다.
이러한 구체적인 루미넥스 어세이 방법 및 키트는 미국 특허 제6,599,331호, 제6,592,822호 및 제6,268,222호 등의 종래 기술을 참고하여 실시할 수 있다.
또한, 단백질 마이크로어레이법은 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 피검물질과 결합할 수 있는 탐침을 부착시켜 피검물질을 검출하는 분석법이다. 본 발명의 진단방법에서는 글리피칸-3에 대한 특이적인 항체를 탐침으로서 사용한다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 인간 글리피칸-3에 대한 다클론항체를 Proteagen의 웰침(Well chip)에 코팅하고, BSA 용액으로 블로킹한 후 인간 글리피칸-3 재조합 단백질과 함께 혈청시료를 희석하여 부가한 후 반응시켜 이후 PBS-T 용액을 이용하여 세척하였다. 이후, 인간 글리피칸-3에 대한 단일클론항체를 희석한 후 반응시키고 세척한 연후에, Cy3가 접합된 2차 항체를 부가한 후 세척하였고, 형광물질의 발광정도를 측정하여 단백질 마이크로어레이 시스템을 확립한 연후에, 샌드위치형 단백질 마이크로어레이 키트를 제조하여 상기 키트 및 단백질 마이크로어레이 시스템을 이용하여 글리피칸-3 농도를 측정하였다.
따라서, 또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 글리피칸-3에 특이적인 항체를 포함하는 단백질 마이크로어레이용 키트에 관한 것으로, 바람직하게 상기 키트는,
(a) 고상형 항체로서 슬라이드에 결합된 글리피칸-3에 대한 다클론항체;
(b) 검출 항체로서 글리피칸-3에 대한 단일클론항체; 및
(c) 효소결합항체로서 Cy3가 결합된 2차 항체 용액을 포함하는 샌드위치형 단백질 마이크로어레이용 키트이다.
바람직하게 상기 키트는, 추가적으로 혈청희석용액, 세척액 및 글리피칸-3 표준액을 포함할 수 있다.
상기와 같은 글리피칸-3에 특이적인 항체를 이용하는 면역크로마토그래피법, 면역도트 어세이법, 루미넥스 어세이 시스템을 이용한 분석법 또는 단백질 마이크로어레이법을 사용하는 본 발명에 따른 암 진단 방법은 간암에 국한되지 않고 대장암, 유방암, 위암, 고환암, 난소암등 광범위한 암의 진단, 바람직하게는 간암의 진단에 매우 유용하며, 이는 종래 글리피칸-3의 검출을 위한 ELISA 등의 방법과는 달리 하나의 마커가 아닌 다종의 복합 마커를 매우 신속하고 정확하게 분석할 수 있다는 장점을 갖는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
글리피칸-3을 특이적으로 인지하는 항체들을 이용한 면역크로마토그래픽 스트립을 이용한 방법, 면역도트 어세이(Immunodot assay), 루미넥스 어세이 시스템(Luminex assay syste)m 및 단백질 마이크로 어레이(Protein array)등의 암 진단 방법과 이를 위한 측정용 킷트 등을 통하여 간암, 유방암, 대장암 등의 질환의 현장분석, 복합마커 분석 및 바이오 센서의 개발이 가능하게 되어 조기진단 및 치료과정의 평가에 유용하게 사용할 수 있다.
실시예 1 : 글리피칸 -3 단백질에 대한 항체선정 및 특성조사
글리피칸-3에 대한 항체 중 단일클론 항체와 다클론항체(R&D systems, Inc. Minneapolis, MN USA) 두가지 종류의 항체를 선정 샌드위치형 측정방법(Sandwich assay)에 사용하였다.
인간 글리피칸-3 재조합 단백질(human glypican-3 recombination protein)를 0.1M carbonate buffer(pH 9.6)을 이용하여 1㎍/ml의 농도로 희석하여 96-well 마이크로타이터 플레이트에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 overnight 코팅을 한 후 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)을 이용하여 3번 세척하였다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 블럭킹(blocking) 해 준 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 인간 글리피칸-3 재조합 단백질에 대한 항체를 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 1000배 희석된 HRP가 접합된 2차 항체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하였고, 마지막으로 OPD(o-phenylenediamine dihydrochloride)를 이용하여 발색하였다. 발색된 시료의 흡광도는 490nm 파장에서 ELISA reader (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. ELISA 실험결과 항체의 역가는 도 1과 같았다.
실시예 2 : 글리피칸 -3 단백질에 대한 면역도트 어세이 확립.
다클론 항체를 이용하여 면역도트 방법을 확립하여 혈청 중 글리피칸-3의 분비정도를 비교하였다.
나이트로 셀룰로우스 멤브레인에 표준액과 함께 2배, 5배, 10배, 20배 희석한 혈청시료를 2㎕씩 dot을 찍은 후 상온에서 건조시키고, 1% BSA, 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(1% BSAT)로 blocking 하였다. 글리피칸-3에 대한 다클론 항체(1:1000)를 반응시킨 후 2차항체 접합 HRP(1:2000)를 가하고 DAB(3, 3‘-diamino benzidine)으로 발색시켰다. 발색된 정도를 스캔하여 발색정도를 비교하였다. 도 2A는 발색된 모습이며 도 2B는 표준곡선이며 도 2C는 혈청에 대한 결과이다. 간암의 경우 정상보다 많이 분비되는 것을 알 수 있었다(도 2C).
실시예 3 : 글리피칸 -3 단백질에 대한 ELISA system 의 확립 및 킷트 제조.
3-1. 글리피칸 -3 단백질에 대한 ELISA system 의 확립
인간 글리피칸-3 단백질에 대한 다클론 항체를 0.1M carbonate buffer(pH 9.6)을 이용하여 1㎍/ml의 농도로 희석하여 96-well 마이크로타이터 플레이트에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 overnight 코팅을 한 후 0.05% Tween 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)을 이용하여 3번 세척하였다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 blocking 해 준 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 인간 글리피칸-3 재조합 단백질을 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 인간 글리피칸-3 단백질에 대한 단일클론 항체를 100㎕씩 희석한 후 2시간 동안 반응시키고 세척하였다. 2000배 희석된 HRP가 접합된 2차 항체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하였고, 마지막으로 TMB용액을 이용하여 발색시켰다. 발색된 시료의 흡광도는 490nm 파장에서 ELISA reader (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 도 3A는 각 혈청의 희석비율에 따른 글리피칸-3 단백질의 반응성을 나타낸 그림이다.
3-2. ELISA system 에 의한 환자 혈청 중 글리피칸 -3 단백질의 측정.
실시예 3-1에서 확립한 ELISA system을 이용하여 환자의 혈청 중 글리피칸 -3 단백질 농도를 측정하였다. 정상인, 급성간염, 만성간염, 간경변, 간암 환자의 혈청을 5배씩 희석한 후, 혈청 중 글리피칸-3 단백질 농도를 계산하였다. 도 3B). 실험결과에 따르면 글리피칸-3 단백질의 농도는 간암의 경우 정상치보다 통계적으로 상승된 농도를 보였다. 이 결과는 혈청 내 글리피칸-3 단백질의 농도 상승이 간암 발생과 연관이 있음을 뜻한다.
3-3. 샌드위치형 ELISA 킷트
다음의 구성요소들을 사용하여 글리피칸-3 농도 측정용 킷트를 제조하였다:
A. 고상형 항체: 항체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서, 글리피칸-3에 대한 다클론 항체 100 ㎕를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조하였다.
B. Detection 항체: 글리피칸-3 에 대한 단일클론항체
C. 효소결합 항체: 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 결합된 2차항체 용액
D. 혈청 희석용액
E. 기질액
F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액(PBS-T)
G. 표준용액: 글리피칸-3 표준액
상기 킷트를 이용하여 암 환자 중 글리피칸-3의 혈청 희석 반응을 다음과 같이 검사하였다. A의 고상형 항체, 즉 마이크로타이터 플레이트에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 3-1과 같은 샌드위치형 측정방법으로 Glypican-3 농도를 검사하였다.
실시예 4 : 면역크로마토그래피 법에 의한 글리피칸 -3 측정법 개발 및 킷트 제조
4-1. 면역 크로마토그래피 스트립의 제조
1) 항체-금 결합체(Ab-gold conjugate) 제조
항체를 콜로이달 금 입자(colloidal gold particles) 용액에 15㎍/㎖ 가한 후 실온에서 2시간 회전시키면서 반응시킨 후 10% BSA를 1/10 vol. 가하여 1% 농도가 되도록 한 후 다시 1시간 동안 반응시켰다. 12,000 rpm에서 40분간 원심분리하여 상등액을 버리고 다시 2mM borate buffer를 가하여 항체-금 결합체(Ab-gold conjugate) 용액을 세척하였다. 이와 같은 세척을 3회 실시하였다. 마지막 세척 후에 1% BSA를 함유한 2mM borate buffer를 gold 용액의 약 1/10 vol.을 가해서 현탁시켰다. 자외선 분광광도계(UV spectrophotometer)로 530 nm에서 흡광도를 측정한후 3.00이 되도록 희석하여 사용하였다. 이때 항체는 다클론항체 또는 단일클론항체이다.
2) 샘플 패드
시험하고자 하는 시료를 흡수하기 위한 부분으로서, 셀룰로스 소재로 된 것을 사용하였다.
3) 결합패드(conjugate pad)
GF 멤브레인을 수크로오스가 포함된 20 mM borate buffer로 전처리한 후, 상 기에서 제조한 항체-골드 접합체를 GF 멤브레인에 고르게 분무하고 건조시켜, 표면상에 착색 미립자 고상형 항체가 일시 고정된 GF 멤브레인을 제조하였다.
4) 나이트로셀룰로스(NC) 멤브레인 및 line 처리
나이트로셀룰로스 멤브레인(Millipore사)을 적당한 크기(0.7㎝ x 5㎝)로 자른 후, 플라스틱 백킹 하단에서 약 3.4 ㎝ 되는 지점에 대조 라인으로서 염소 항-sheep IgG(goat anti-sheep IgG)를 직선 처리하고, 2.7 ㎝ 되는 지점에 판정 라인으로서 Glypican-3에 대한 단일클론항체를 직선 처리한 다음, 건조시켜 NC 멤브레인을 제조하였다.
5) 흡수(absorbent) 패드
면역 반응후 시료내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석 물질을 포함한 시료 용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하도록 셀룰로즈 멤브레인을 사용하였다.
6) 접착용 플라스틱 백킹
도 4에 제시된 바와 같이, 접착용 플라스틱 백킹위에 샘플 패드, 결합(conjugate) 패드, 나이트로셀룰로오스 멤브레인 및 흡수 패드를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 조립한다. 이때 샘플패드, 결합패드, 나이트로셀룰로오스 멤브레인은 서로 살짝씩 겹치게(약 1mm) 연결한다.
4-2. 결과 판정법
샘플패드에 60-70 ㎕의 시료(이때, 시료는 serum과 elution buffer의 비를 1:5)가하고 3-5분 후 대조선(control line)과 결과선(result line)의 발색 유무 및 발색 진하기를 관찰한다. 양성시료의 경우 대조선과 결과선에서 적색의 착색선을 관찰할 수 있으며, 음성시료의 경우 대조선에서만 적색의 착색선을 볼 수 있다(도 5). 이때 약 최소 1㎍/ml까지의 글리피칸-3 측정이 가능하여 좋은 반응을 보임을 확인할 수 있었다.
4-3. 면역크로마토그래피 킷트 개발
(1) 구성 요소
A. 면역크로마토그래픽 스트립
B. NC 멤브레인에 결합된 단일클론 항체
C. GF 멤브레인에 결합된 글리피칸-3에 대한 다클론 항체
D. 시료 희석용액
(2) 측정 방법
면역크로마토그래픽 스트립의 샘플 패드에 60-70 ㎕의 시료를 가하고 3-5분 후 대조선(control line)과 반응선(result line)의 발색 유무를 확인하여 암 가능성 여부를 판정한다.
실시예 5 : 글리피칸 -3 단백질에 대한 루미넥스 시스템의 확립 및 킷트제조 .
5-1. 글리피칸 -3 단백질에 대한 루미넥스 시스템의 확립
인간 글리피칸-3 단백질에 대한 다클론 항체를 비드(bead)에 결합(conjugation)시킨다. 인간 글리피칸-3 재조합 단백질을 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 인간 글리피칸-3 단백질에 대한 단일클론 항체를 100㎕씩 희석한 후 2시간 동안 반응시키고 세척하였다. 2000배 희석된 PE가 접합된 2차 항체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하였고, 루미넥스 기기로 측정한다. ㅅ세기(Intensity)와 농도와의 그래프를 그려 표준곡선을 산출한다. 실시예 5-1에서 확립한 루미넥스 시스템을 이용하여 환자의 혈청 중 글리피칸-3 단백질 농도를 측정한다.
5-2. 샌드위치형 루미넥스 킷트
다음의 구성요소들을 사용하여 글리피칸-3 농도 측정용 킷트를 제조한다.
A. 고상형 항체: 형광비드가 흡착된 글리피칸-3 다클론항체
B. Detection 항체 : 글리피칸-3 에 대한 단일클론항체
C. 효소결합 항체: PE가 결합된 2차항체 용액
D. 혈청 희석용액
F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액
G. 표준용액: 글리피칸-3 표준액
상기 킷트를 이용하여 암 환자 중 글리피칸-3의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사한다. A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 5-1과 같은 샌드위치형 측정방법으로 글리피칸-3 농도를 검사한다.
실시예 6 : 글리피칸 -3 단백질에 대한 단백질 어레이 시스템의 확립 및 킷트제조 .
6-1. 글리피칸 -3 단백질에 대한 단백질 어레이 시스템
인간 글리피칸-3 단백질에 대한 다클론 항체를 프로테아겐(Proteagen)의 Well chip 에 코팅한다. BSA용액으로 blocking 한 후 인간 글리피칸-3 재조합 ㄷ다단백질과 함께 혈청시료를 희석하여 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. 인간 글리피칸-3 단백질에 대한 단일클론 항체를 100㎕씩 희석한 후 37도에서 1시간 동안 반응시키고 세척하였다. 2000배 희석된 Cy3가 접합된 2차 항체 100㎕를 넣어 준 후 상온에서 0.5시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하였고, 532nm에서 형광물질의 발광정도를 측정한다. 세 기(intensity)와 농도와의 그래프를 그려 표준곡선을 산출한다. 실시예 6-1에서 확립한 단백질 어레이 시스템을 이용하여 환자의 혈청 중 글리피칸-3 단백질 농도를 측정한다.
6-2. 샌드위치형 단백질 어레이 킷트
다음의 구성요소들을 사용하여 글리피칸-3 농도 측정용 킷트를 제조한다.
A. 고상형 항체: 슬라이드에 결합된 글리피칸-3에 대한 다클론 항체
B. Detection 항체 : 글리피칸-3 에 대한 단일클론항체
C. 효소결합 항체: Cy3가 결합된 2차항체 용액
D. 혈청 희석용액
F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액
G. 표준용액: Glypican-3 표준액.
상기 킷트를 이용하여 암 환자 중 글리피칸-3의 혈청 희석 반응을 다음과 같이 검사한다. A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 6-1과 같은 샌드위치형 측정방법으로 글리피칸-3 농도를 검사한다.
도 1은 Glypican-3 항체에 대한 역가를 측정한 그림이다
도 2는 Immunodot assay에 관한 결과이다.
도2a는 Immunodot 실험 후 발색을 본 그림이며, 도2b는 표준곡선이며, 도2c는 임상시료 중 Glypican-3 농도를 비교한 그림이다.
도 3은 ELISA 에 대한 결과이다
도3a는 표준곡선이며, 도3b는 임상시험 결과이다. (N: 정상인, AH: 급성 간염, CH: 만성 간염, LC: 간경변, HCC: 간암 환자의 혈청)
도 4는 면역크로마토그래픽 스트립의 제작도이다. a는 위에서 본 제작도이고 b는 측면도이다.
도 5는 면역크로마토그래픽 스트립에 의해 혈액 중 Glypican-3을 측정한 결과를 나타낸 도표이다. (레인 1 : 음성시료, 레인 2 : 양성시료)

Claims (21)

  1. 글리피칸-3에 특이적인 항체를 이용하는 글리피칸-3 분석방법을 이용하되, 상기 글리피칸-3 분석방법은 면역크로마토그래피법, 면역 도트(immunodot) 어세이법, 루미넥스(Luminex) 어세이 시스템을 이용한 분석법 및 단백질 마이크로어레이법으로 구성되는 군으로부터 선택되는 방법인 암의 진단방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 진단방법은 생물학적 시료로부터 글리피칸-3를 항원-항체 복합체의 형성에 의해 측정하는 것인 진단방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 및 뇨로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 진단방법.
  4. 글리피칸-3에 특이적인 항체를 포함하는 면역크로마토그래피용 스트립.
  5. 제3항에 있어서, 상기 스트립은
    (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad),
    (b) 시료 내의 글리피칸-3와 결합하는 결합 패드(conjugate pad),
    (c) 글리피칸-3의 단일클론항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응막(membrane),
    (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad), 및
    (e) 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피용 스트립.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 스트립은 미소입자와 접합된 글리피칸-3 특이적인 항체를 결합패드에 포함하고 있는 것인 면역크로마토그래피용 스트립.
  7. 제6항에 있어서, 상기 미소입자는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle) 또는 착색된 미소 입자(colored micro particle) 인 면역크로마토그래피용 스트립.
  8. 제4항의 면역크로마토그래피용 스트립을 포함하는 암 진단 키트.
  9. 제1항에 있어서, 면역학적 도트 어세이법에 의해 글리피칸-3를 측정하되,
    (a) 생물학적 시료로 도트(dot)를 막에 찍는 단계,
    (b) 글리피칸-3에 특이적인 항체를 상기 막에 반응시키는 단계, 및
    (c) 표시체가 접합된 2차 항체를 가하고 발색시키는 단계를 포함하는 진단방법.
  10. 글리피칸-3에 특이적인 항체를 포함하는 루미넥스 어세이용 키트.
  11. 제10항에 있어서, 상기 루미넥스 어세이용 키트는 비드가 흡착된 글리피칸-3에 대한 다클론 항체, 글리피칸-3에 대한 단일클론항체 및 효소 결합 2차 항체 용액을 포함하는 것인 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 다클론 항체는 미소입자(microparticles)에 접합시켜 제조하여 만든 것인 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미소입자는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle) 또는 착색된 미소 입자(colored micro particle)인 키트.
  14. 글리피칸-3에 특이적인 항체를 포함하는 단백질 마이크로어레이.
  15. 제14항에 있어서, 상기 단백질 마이크로어레이는 슬라이드에 결합된 글리피칸-3의 다클론항체, 글리피칸-3에 대한 단일클론항체 및 효소 결합 2차 항체 용액을 포함하는 것인 마이크로어레이.
  16. 제14항의 단백질 마이크로어레이를 포함하는 암 진단용 키트.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 암은 간암, 난소암, 유방암, 고환암, 위암 및 폐암으로부터 선택되는 암인 진단방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 진단 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 진단 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 항원-항체의 복합체 검출을 위한 표지체로 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 및 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 진단 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 제4항의 면역크로마토그래프용 스트립, 제8항의 면역크로마토그래프용 스트립을 포함하는 키트, 제10항의 루미넥스 어세이용 키트, 및 제14항의 단백질 마이크로어레이 및 제16항의 단백질 마이크로어레이를 포함하는 키트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 사용하여 글리피칸-3를 측정하는 것인 진단 방법.
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