KR101130755B1

KR101130755B1 - 대장암 진단 방법

Info

Publication number: KR101130755B1
Application number: KR1020090129789A
Authority: KR
Inventors: 김정회; 박승열; 센이치로 하코모리; 김진만
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2009-12-23
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2012-03-28
Also published as: KR20110072732A

Abstract

본 발명은 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin)의 N-연결 당쇄화(N-linked glycosylation)를 이용한 대장암 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 대장암 환자의 혈액 유래 베타-합토글로빈의 당쇄구조 중 알파 1-3/4 푸코스(alpha 1-3/4 fucose)가 정상인에 비해 현저히 증가되는 것을 확인함으로써, 상기 알파 1-3/4 푸코스화를 진단 마커로 이용하여 대장암 진단 키트 및 이를 이용한 대장암 진단 방법에 유용하게 사용될 수 있다.

대장암, 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin), N-연결 당쇄화(N-linked glycosylation), 알파 1-3/4 푸코스(alpha 1-3/4 fucose).

Description

대장암 진단 방법{A method for the diagnosis of colon cancer}

혈액 유래 베타-합토글로빈의 당쇄구조를 이용한 대장암 진단 키트, 및 이를 이용한 대장암 진단 방법에 관한 것이다.

암종 특이적인 당쇄는 혈액으로 배출되는데, 이러한 당쇄는 다양한 종류의 항체를 이용하여 진단의 목적으로 사용될 수 있다. 최근에는 식물에서 추출한 렉틴이 합토글로빈(haptoglobin)의 변화된 당쇄 구조를 인식하는 방법에 이용되었다. 이런 렉틴은 쉽게 이용가능하고, 가격이 저렴하며, 특이성과 반응성이 항체에 비하여 우수하기 때문에, 당쇄 구조를 검출하기 위한 목적으로 많이 이용되고 있다. 혈액내 합토글로빈의 농도는 다양한 종류의 암종 및 염증 반응에서 증가를 보이는 반면, 당쇄 구조는 모두 특이한 구조를 보이는 장점을 가지고 있다. 그러나 지금까지 병에 걸렸을 경우 당쇄 구조가 변화하는 이유에 대한 과학적 근거는 밝혀지지 않았다.

한편, 증가한 푸코스(fucose)를 측정하기 위한 방법으로 로투스 테트라고노 올로부스 렉틴(Lotus tetragonoolobus lectin)을 이용한 렉틴블라팅 방법이 사용된다. 최근에는 로투스 테트라고노올로부스 렉틴(Lotus tetragonoolobus lectin)이 외에도 AAL(Aleuria aurantia lectin)과 AOL(Aspergillus oryzae lectin)을 이용하여 췌장암 환자에게서 얻어낸 합토글로빈의 푸코스(fucose)를 보는 방법이 이용되기도 하였다.

본 발명자들은 대장암의 만성 질환인 크론씨병 및 대장궤양 환자, 및 정상인의 각각의 혈액에서 정제해 낸 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin)의 당쇄구조 분석을 통하여 차이를 비교한 결과, 베타-합토글로빈의 당쇄구조 중 알파 1-3/4 푸코스(alpha 1-3/4 fucose)가 대장암에서 많이 발견되는 것을 확인함으로써, 알파 1-3/4 푸코스화(alpha 1-3/4 fucosylation)를 마커로 이용하여 대장암을 진단할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 대장암 환자의 혈액 유래 베타-합토글로빈의 당쇄구조 중 알파 1-3/4 푸코스(alpha 1-3/4 fucose)를 이용한 마커로 이용한 대장암 진단 키트 또는 면역크로마토그래피 스트립을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 키트 또는 면역크로마토그래피 스트립을 이용하여 혈액으로부터 대장암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin) 항체, AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin) 및 알파 1-6 푸코시다제(α1-6-fucosidase)를 함유하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-결합 AAL 렉틴을 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 검체 패드에 연결되어, 항 베타-합토글로빈 항체가 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및 상기 신호검출영역의 다운스트림에 위치하고 항 AAL 렉틴 항체 또는 AAL 렉틴에 결합하는 당단백질이 선형으로 고정된 대조라인(control line)을 포함하는, 상기 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 대장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 피검체 유래 혈액에 알파 1-6 푸코시다제(α1-6-fucosidase)를 전처리하는 단계;

2) 상기 혈액을 항 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin) 항체가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;

3) 상기 기판에 AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin)을 처리한 후 세척하는 단계; 및

4) 상기 기판 위에 AAL 렉틴의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 대장암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 혈액 유래 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin)의 당쇄구조 중 알파 1-3/4 푸코스(alpha 1-3/4 fucose)가 대장암 환자에서 정상인에 비해 현저히 증가되는 것을 이용하여 상기 알파 1-3/4 푸코스를 마커로 이용하여 대장암을 진단하 는 방법을 제공한다. 따라서 피검체 유래 혈액으로부터 알파 1-6 푸코스를 특이적으로 절단하는 효소를 처리한 후, AAL 렉틴을 이용하여 알파 1-3/4 푸코스 정도를 확임함으로써, 쉽고 간단하게 대장암을 진단할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin) 항체, AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin) 및 알파 1-6 푸코시다제(α1-6-fucosidase)를 함유하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 대장암 환자와 정상인으로부터 혈액을 채취한 후, 항-합토글로빈 친화성 클로마토그래피(anti-haptoglobin-affinity) 컬럼을 이용하여 베타-합토글로빈을 분리하였다(도 1 참조). 그런 다음, 상기 베타-합토글로빈을 SDS-PAGE를 수행한 후 PVDF 막에 이동시킨 다음, 바이오틴(biotin)이 부착된 AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin) 및 엑스트라 아비딘-퍼록시다아제(ExtrAvidin-peroxidase)를 처리한 후, ECL 반응을 통하여 밴드(band)를 확인하고, AAL렉틴을 띄어내는 스티리핑(Stripping step)과정을 거친 후 안티-합토글로빈 항체를 이용하여 블라팅을 수행하였다. 이를 이용하여 합토글로빈에 연결되어 있는 푸코즈의 양을 간단히 측정할 수 있으며, 대장암에서 검출되는 밴드의 세기가 정상인에 비해 현저히 높은 것을 확인하였고, 다른 렉틴(lectin)을 이용한 실험에 서는 정상과 대장암 사이의 차이가 크게 나타나지 않은 것을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조).

또한, 본 발명자들은 푸코시다제(fucosidase)를 이용하여 Fucα1-3/4/6GlcNAc를 제거한 후, AAL 렉틴 블랏(lectin blot)을 수행하여 결과를 비교한 결과, 푸코시다제로 처리한 후 수행한 AAL 렉틴 블랏에서는 정상과 같은 신호를 보이는 것을 확인함으로써(도 5 참조), AAL이 반응하는 것은 Fucα1-3/4/6GlcNAc 때문인 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 베타-합토글로빈의 밴드를 겔내 절단(in gel digestion)을 수행하여, N-연결 글리칸(N-linked glycan)을 절단한 후, 절단된 N-연결 글리칸에 GlyKo Signal 2-AB labeling kit를 이용하여 형광물질을 결합시키고, GlyKo GlycoClean S Cartridges를 이용하여 2-AB가 붙은 글리칸만을 분리한 다음, HPLC를 이용하여 분석한 결과, 피크(peak) h, k, m에 있어 대장암이 정상에 비해 높은 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한, 상기 피크 h, k, m이 푸코스와의 관련성을 알아보기 위하여, 다양한 푸코시다제 및 효소를 이용하여 확인한 결과, 피크 h, k, m은 Fucα1-6GlcNAc가 아닌 Fucα1-3/4GlcNAc와 연관이 있는 피크임을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

따라서, 본 발명자들은 대장암 환자의 혈액 유래 베타-합토글로빈의 당쇄구조 중 알파 1-3/4 푸코스(alpha 1-3/4 fucose)가 정상인에 비해 유의적으로 증가되는 것을 확인함으로써, 상기 알파 1-3/4 푸코스화를 대장암 진단 마커로 이용할 수 있으며, 이는 베타-합토글로빈에 알파 1-6 푸코시다제 등의 알파 1-6 푸코스에 대 한 특이적인 절단 효소를 처리한 후 AAL을 수행함으로써 알파 1-3/4 푸코스에 의하여 나오는 신호를 검출함으로써, 대장암을 용이하게 진단할 수 있음을 알 수 있다.

본 발명의 대장암 진단키트에 있어서, AAL 렉틴은 바이오틴, 또는 아비딘 또는 스트렙트아비딘에 대해 바이오틴과 본질적으로 동일한 결합 작용을 갖는 바이오틴 유도체인 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트가 상기 리간드에 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것이 바람직하며, 상기 형광분자는 콜로이드 골드(colloid gold), 폴리-L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; poly L-lysine-FITC) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 대장암 진단키트는 항원-항체 결합반응, 당쇄구조-렉틴 또는 단백질-리간드 결합반응을 통하여 결합 반응을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 대장암을 진단할 수 있으며, 상기 결합 반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 대장암 진단키트는 지지체로 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴 리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 대장암 진단키트는 표지체로 발색효소 또는 형광분자는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(colloid gold), 폴리-L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; poly L-lysine-FITC), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 대장암 진단키트는 세척액으로 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 AAL 렉틴, 항 베타-합토글로빈 항체, 및 AAL 렉틴에 특이적으로 결합하는 단백질을 포함하는 대장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 제공한다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은 접착성 플라스틱 지지체와, 상기 접착성 플라스틱 지지체에 부착되어 있는 검체 패드, 컨쥬게이트 패드, 신호검출 패드 및 흡수 패드로 이루어지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 상기 면역크로마토그래피 스트립은 하기와 같은 구성을 하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 접착성 지지체;

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성.

상기 구성에 있어서, 단계 3)의 발색제는 콜로이드성 골드 파티클(gold particle)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 구성에 있어서, 단계 4)의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오즈 막으로 이루어진 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 구성에 있어서, 단계 5)의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 다공성 지지체의 상부면에 부착된 다공성 필름층을 추가로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 흡수제는 염화칼슘, 염화마그네슘, 규조토, 벤토나이트, 백운석, 석고, 실리카겔 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타나면, 피검 시료를 대장암의 양성 시료로 판정하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역크로마토그래피 스트립은, 우선 피검 시료인 혈액을 상기 검체 패드를 통해 면역크로마토그래피 스트립으로 공급된다. 상기 검체 패드는, 분석물질에 대한 선택성을 보다 향상시키기 위해 또는 상기 피검 시료에 포함될 수 있는 간섭물질에 의한 영향을 최소화하기 위해, 필터링의 기능을 추가로 가질 수 있다. 필요한 경우, 상기 검체 패드의 업스트림에 분석물질과 컨쥬게이트 사이의 반응을 증가시키거나 또는 간섭물질에 의해 영향을 배제할 수 있는 물질을 함유하는 보조 패드를 추가로 구비할 수 있다. 상기 검체 패드를 통해 도입된 혈액은 크로마토그래피적 이동을 통해 상기 검체 패드의 업스트림에 위치하는 컨쥬게이트 패드로 이동한다. 상기 컨쥬게이트 패드는 혈액에 함유되어 있는 베타-합토글로빈과 특이적으로 결합하는 항 베타-합토글로빈 항체 컨쥬게이트가 함유되어 있다. 상기 컨쥬게이트는 금입자, 라텍스 입자, 형광물질, 및 효소 등에 의해 레이블링된다. 상기 컨쥬게이트 패드를 통과한 피검 시료는 신호검출 패드로 이동한다. 상기 신호검출 패드는 상기 피검 시료에 분석물질이 존재하는 지의 여부를 검출하는 검출라인과, 분석물질의 존재 유무와 관계없이 분석키드가 정상적으로 작동하였는지 여부를 확인하는 대조라인을 포함한다. 이를 위해, 상기 검출라인에는 분석물질과 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트 사이의 결합산물에 선택적이 고 특이적으로 결합하는 물질(또는 신호검출물질)이 코팅되고, 상기 대조라인에는 상기 컨쥬게이트 패드에 함유된 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 물질이 코팅되는 것이 좋다. 상기 신호검출 패드는 다공성 멤브레인 패드로 구성되며, 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰, 나일론 등으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 항 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin) 항체, AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin) 및 알파 1-6 푸코시다제(α1-6-fucosidase)를 포함하는 대장암 진단용 조성물 또는 대장암 진단 키트를 이용하여 대장암을 진단하는 방법을 제공한다.

상기 대장암 진단 방법은 구체적으로 하기와 같은 단계로 수행되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

3) 상기 기판에 AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin)을 처리하는 단계; 및

4) 상기 기판 위에 AAL 렉틴의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 대장암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 피검체는 인간을 포함한 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간, 유인원류, 소, 돼지, 쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개 또는 고양이를 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2)의 고체기판은 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 AAL 렉틴은 리간드에 결합되고, 상기 리간드는 특이적 결합분자가 결합되고, 상기 결합분자에 발색효소 또는 형광분자가 결합된 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 결합 정도는 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 대장암 환자의 임상적 상태 분석

대장암 사례의 경우, 우선 대장내시경이나 S결장경검사를 이용하여 대장암의 발생위치 등을 파악하고, 병리학 의사가 조직검사를 통하여 진단을 내렸다. 17명의 대장암 환자를 발생위치에 따라 다음과 같이 분류하였다: "직장암(rectal cancer)" (n=6, 평균 연령: 60 yr), "상행 대장암(ascending colon cancer)" (n=5, 평균 연령: 75 yr), "하행 대장암(descending colon cancer)" (n=2, 평균 연령: 78 yr), "S상 대장암(sigmoid colon cancer)" (n=3, 평균 연령: 71 yr), 및 "맹장암(cecal cancer)" (n=1, 연령: 63 yr)의 혈액은 충남대학교 의과대학병원에서 수집하였다. 조직검사 부위의 수와 진단체계(AJCC-TNM system), 그리고 환자의 분류는 하기 [표 1]에 정리하였다. 3개의 직장암 사례(Case: # S1-S3)는 정제방법[항-합토글로빈 친화성 클로마토그래피(anti-haptoglobin-affinity chromatography) 또는 헤모글로빈 친화성 크로마토그래피(hemoglobin-affinity chromatography)]에 따른 합토글로빈의 당쇄화 변화를 비교하는데 이용하였다.

만성대장질환 사례의 경우, 대장궤양환자(UC)의 혈액(n=4, 평균 연령: 49 yr)과 크론씨병(CD)의 혈액(n=5, 평균 연령: 34 yr)을 충남대학교 의과대학병원과 Mount Sinai School of Medicine에서 수집하였다.

정상인 사례의 경우, 건강한 지원자의 혈액(n=14, 평균 연령: 28 yr)을 한국과학기술원(대전, 한국)에서 수집하였다.

모든 혈액은(대장암 환자, 만성대장질환 환자, 정상인) 채취 후 30 ~ 60 분 간 상온에 방치 후, 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상등액만을 0.45 um 필터를 통과한 후 -80℃에 사용 전까지 보관하였다.

생체검사(biospy)를 이용한 대장암 진단 및 정보

사례 번호	나이	성별	생체검사		AJCC/TNM¹	카테고리
사례 번호	나이	성별	점수	진단	AJCC/TNM¹	카테고리
S1	67	M	3	직장암	T3N1M0	ⅢB
S2	40	F	5	직장암	T3N1M0	ⅢB
S3	56	M	4	직장암	T2N0M0	Ｉ
CP1	50	M	7	직장암	T3N0M0	ⅡA
CP2	79	M	5	상행 대장암	T3N0M0	ⅡA
CP3	85	F	5	직장암	T3N1M0	ⅢB
CP4	80	F	5	상행 대장암	T3N0M0	ⅡA
CP5	82	F	6	하행 대장암	T3N1M0	ⅢB
CP6	74	F	5	하행 대장암	T3N1M0	ⅢB
CP7	74	M	2	상행 대장암	T3N0M0	ⅡA
CP8	69	F	4	상행 대장암	T3N1M0	ⅢB
CP9	82	F	2	S상 대장암	T2N0M0	Ｉ
CP10	66	F	3	S상 대장암	T2N0M0	Ｉ
CP11	65	F	4	S상 대장암	T3N1M0	ⅢB
CP12	67	M	1	맹장암	T3N1M0	ⅢB
CP13	72	M	3	상행 대장암	T3N0M0	ⅡA
CP14	63	F	4	직장암	T2N0M0	Ｉ

TNM 시스템으로 알려진, ¹AJCC(American Joint Communittee on Cancer).

<실시예 2> 혈액으로부터 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin)의 정제

상기 <실시예 1>에서 분리한 혈액으로부터 합토글로빈을 분리하기 위해, 래빗 항-인간 합토글로빈 다클론 항체(Rabbit anti-human haptoglobin polyclonal antibody)를 CNBr-활성 세파로즈 4B[(cyanogens bromide)-activated sepharose 4B]를 이용하여 결합시킨 항-합토글로빈 친화성 클로마토그래피(anti-haptoglobin-affinity) 컬럼을 준비한 후, 혈액으로부터 베타-합토글로빈을 정제하였다.

구체적으로, 0.3 g의 CNBr-Sepharose-4B를 100 ml 비커에 넣고 1 mM HCl 상태에서 상온에서 1시간 동안 활성화시킨 후 poly-prep column으로 옮겼다. 그런 다음, 60 ml의 1 mM HCl과 4 ml의 결합 완충용액(coupling buffer)(0.1 M NaHCO3/ 0.5 M NaCl, pH 8.3)을 이용하여 세척한 후, 15 ml 튜브(tube)로 옮겨 500 ug 항-합토글로빈 항체(anti-haptoglobin antibody) / 4 ml 결합 완충용액(coupling buffer) 상태로 4℃에서 17시간 반응시켰다. 그런 다음, 다시 새로운 poly-prep column으로 옮긴 후, 4 ml 결합 완충용액(coupling buffer)과 차단 완충용액(blocking buffer)(0.2 M glycine, pH 8.0)으로 세척하였다. 그런 다음, 차단 완충용액(blocking buffer)으로 상온에서 2시간 동안 차단(blocking)시킨 후, 6.5 ml의 차단 완충용액(blocking buffer), 아세테이트 완충용액(acetate buffer)(0.1 M 아세트산 / 0.5 M NaCl, pH 4.0) 및 결합 완충용액(coupling buffer)으로 세척한 후, 마지막으로 PBS로 세척하여 정제를 준비하였다. 그런 다음, 500 ul의 혈액을 4 ml PBS(10 mM phosphate buffer/ 2.7 mM Potassium chloride/ 137 mM sodium chloride, pH 7.4)로 희석한 후 상기 친화성(affinity) 컬럼과 섞어주었다. 상온에서 2시간 동안 흔들어주어 항체와 혈액내 합토글로빈의 결합이 일어나게 한 후, PBS로 충분히 헹구어 주었다. 결합된 합토글로빈은 용리 완충용액(elution buffer)(0.1 M glycine/ 0.5 M NaCl, pH 2.8)으로 용리(elution)시켜 준 후, 원심필터(centrifugal filter)(MWCO 10,000)를 이용하여 농축시키고 정량한 후, SDS-PAGE와 컴파시 브릴리언트 블루 염색(Coomassie Brilliant Blue staining) 방법을 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 혈액에서 베타-합토글로빈(β-haptoglobin)이 깨끗이 정제가 되었음을 확인하였다. 알파 사슬 서브유닛(α chain subunit)도 보이는데, 알파-합토글로빈(α-haptoglobin)에는 N-연결 당쇄가 존재하지 않기 때문에 따로 분리하는 작업은 수행하지 않았다.

<실시예 2> 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin)의 당쇄 구조 분석

<2-1> 렉틴블랏팅(Lectin blotting) 분석

상기 <실시예 2>에서 분리한 베타-합토글로빈의 당쇄를 분석하기 위해, 렉틴블랏팅을 수행하였다.

구체적으로, 1 ug의 합토글로빈을 12.5% SDS-PAGE 후 PVDF 막(membrane)에 이동시켰다. 상기 이동된 PVDF 막은 3% BSA/T-TBS[TBS(140 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) / 0.05% Tween 20)]으로 상온에서 2시간 차단(blocking)시켰다. T-TBS로 5분간 3회 씻어준 후 바이오틴(biotin)이 붙어있는 1 : 1,000으로 희석된 AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin)에 17시간 동안 4℃에서 반응시켰다. T-TBS로 5분간 3회 세척한 후, 1 : 2,000으로 희석된 엑스트라 아비딘-퍼록시다아제(ExtrAvidin-peroxidase)를 상온에서 1시간 처리한 다음, T-TBS로 5분간 3회 세척한 후, ECL 반응을 통하여 밴드(band)를 확인하였다.

또한, AAL 렉틴 대신에 HRP(Horse Radish Protein)가 연결된 SNA 렉틴(Sambucus nigra lectin, EY Laboratories 구매)(NeuAc alpha2-6/3Gal/GalNAc을 타겟으로 함), PHA-E 렉틴(Phaseolus vulgaris-E lectin, , EY Laboratories 구매)(GlcNAc beta4 Man beta4 GlcNAc을 타겟으로 함), 또는 바이오틴이 연결된 PHA-L(Phaseolus vulgaris-L lectin, Vector Laboratories에서 구매)(GlcNAc beta6 Man beta6 Man side chain을 타겟으로 함)을 이용하여 상기와 같이 렉틴블랏팅을 수행하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 푸코스(Fucose)를 검출할 수 있는 AAL 렉틴을 이용했을 때, 대장암에서 검출되는 밴드의 세기가 정상인에 비해 현저히 높은 것을 확인하였다(도 2). 또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 다른 렉틴(lectin)을 이용한 실험에서는 정상과 대장암 사이의 차이가 크게 나타나지 않은 것을 확인하였다(도 3).

<2-2> 항-합토글로빈 항체를 이용한 재블랏팅 분석(reblotting)

같은 양의 합토글로빈이 있는가를 확인하기 위하여, 상기 반응시킨 PVDF 막을 제거 완충용액(stripping buffer)(2% SDS, 62.6 mM Tris-HCl, pH 6.7, 0.78% 2-ME)으로 60℃에서 30분간 흔들어 반응시켰다. 그런 다음, 증류수, TBS 및 T-TBS로 각각 5분 5회씩 헹구어 준 후, 5% 탈지분유(skim milk) / T-TBS로 2시간 동안 상온에서 차단시켰다. T-TBS로 5분간 3회 세척한 후, 1 : 50,000으로 희석된 항-합토글로빈 항체(anti-haptoglobin antibody)를 이용하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, T-TBS로 5분간 3회 씻어준 후 1 : 3,000으로 희석된 항-래빗(anti-rabbit) IgG-HRP를 이용하여 상온에서 1시간 반응시킨 다음, ECL 반응을 통하여 밴드(band)를 확인하였다. 블랏팅 지표(Blotting index)는 렉틴 블랏(lectin blot)에서 나온 밴드를 수치화한 값을 재블랏팅(reblotting)하여 얻은 밴드를 수치화한 값으로 나누어 나온 수치로 산출하였다.

그 결과, 하기 표 2 및 표 3에서 보는 바와 같이 대장암 환자의 50%(7/14)가 블랏팅 지표(Blotting index)에서 1.5 이상을 보였고, 64%(9/14)가 1.0 이상을, 그리고 100%(14/14)가 0.5 이상을 보인 반면에, 정상인의 21%(3/14)가 1.5 이상을, 36%(5/14)가 1.0 이상을, 그리고 43%(6/14)가 0.5 이상의 값을 보이는 것을 알 수 있었다(표 2 및 표 3).

	시료	사례 번호	블랏팅 지표
	시료	사례 번호	<0.5	0.5-1.0	1.0-1.5	>1.5
정상인		N1				+
		N2	+
		N3				+
		N4			+
		N5				+
		N6	+
		N7	+
		N8	+
		N9		+
		N10			+
		N11	+
		N12	+
		N13	+
		N14	+
암	상행 대장암	CP2				+
		CP4		+
		CP7				+
		CP8		+
		CP13			+
	맹장암	CP12				+
	하행 대장암	CP5				+
	하행 대장암	CP6		+
	직장암	CP1				+
		CP3
		CP14		+
	S상 대장암	CP9				+
		CP10		+	+
		CP11				+

	(블랏팅 지표, 해당 수/전체 수)	비율
정상인에 대한 양성 사례
	(>1.5, 3/14)	21%
	(>1.0, 5/14)	36%
	(>0.5, 6/14)	43%
암에 대한 양성 사례
	(>1.5, 7/14)	50%
	(>1.0, 9/14)	64%
	(>0.5, 14/14)	100%
상행 대장암
	(>1.5, 2/5)	40%
	(>1.0, 3/5)	60%
맹장암
	(>1.5, 1/2)	100%
	(>1.0, 1/2)	100%
하행 대장암
	(>1.5, 1/3)	50%
	(>1.0, 2/3)	50%
직장암
	(>1.5, 1/3)	33%
	(>1.0, 2/3)	67%
S상 대장암
	(>1.5, 2/3)	67%
	(>1.0, 2/3)	67%

<실시예 3> 혈청으로부터 정제된 베타-합토글로빈의 AAL 반응

AAL이 대장암에 얼마나 특이적으로 반응하는가를 알아보기 위하여, 대장암의 대표적인 만성질환인 대장궤양(UC)과 크론씨병(CD)의 환자에게서 정제한 베타-합토글로빈의 당쇄구조를 같이 비교하는 실험을 진행하였다.

구체적으로, 항-합토글로빈 친화성 컬럼크로마토그래피로 베타-합토글로빈을 정제한 후, 바이오틴화된 AAL로 PVDF 막에서 웨스턴 블랏한 후, 항-합토글로빈 항체로 재블랏팅하였다. 그런 다음, AAL 밴드의 상대적인 강도를 블랏팅 지표인 합토글로빈 밴드로 비교하였다. 정상(n) 3개, 대장암(CP) 3개를 만성질환 9개(UC: 5개, CD: 4개)와 비교해 보았다.

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이 레인(lane) 4의 대장궤양(CD) #1을 제외하고는 모두 정상과 비슷하며, 대장암 보다는 낮은 신호를 보이는 것을 알 수 있었다(도 4).

<실시예 4> 혈청으로부터 정제된 베타-합토글로빈의 N-연결 글리칸(N-linked glycan) 구조 분석

<4-1> 렉틴 블랏팅으로 이용한 베타-합토글로빈의 N-연결 글리칸의 구조 분석

베타-합토글로빈이 AAL에 크게 반응하는 이유는 Fucα1-3/4/6GlcNAc에 반응하기 때문이다. 이에, 푸코시다제(fucosidase)를 이용하여 Fucα1-3/4/6GlcNAc를 제거한 후, AAL 렉틴 블랏(lectin blot)을 수행하여 결과를 비교하였다. 구체적으로, 2 ug의 합토글로빈을 1 mU 소 신장 알파-푸코시다제(bovine kidney α-fucosidase)를 포함한 50 mM 아세트산나트륨 완충용액(sodium acetate buffer)(pH 5.5, 37℃)에서 하루 반응시킨 후, SDS-PAGE와 렉틴 블랏(Lectin blot)을 수행하였다.

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 푸코시다제로 처리한 후 수행한 AAL 렉틴 블랏에서는 정상과 같은 신호를 보였다(도 5). 이를 통해 AAL이 반응하는 것은 Fucα1-3/4/6GlcNAc 때문인 것을 알 수 있었다.

<4-2> HPLC를 이용한 N-연결 글리칸의 구조 분석

상기 SDS-PAGE를 이용하여 베타-합토글로빈을 확인한 후, 베타-합토글로빈의 밴드를 겔내 절단(in gel digestion)을 수행하였다. 구체적으로, 겔(Gel) 조각은 아세토니트릴(acetonitrile)과 PNGaseF 완충용액(20 mM NaHCO₃, pH 7.0)으로 2회 헹구어 준 후, PNGase F를 37℃에서 17시간 처리하여 N-연결 글리칸(N-linked glycan)을 절단하였다. 절단된 N-연결 글리칸에 GlyKo Signal 2-AB labeling kit를 이용하여 형광물질을 결합시키고, GlyKo GlycoClean S Cartridges를 이용하여 2-AB가 붙은 글리칸만을 분리하였다. 그런 다음, 2-AB가 붙은 글리칸은 TSK 겔 아마이드(gel Amide)-80 4.6 X 250 mm 컬럼과 HPLC를 이용하여 분석하였다. 모든 반응은 30℃에서 이루어 졌으며, 이동상은 Sol A[20%, v/v, 50 mM 포름산 암모늄(ammonium formate), pH 4.4]와 Sol B(80%, v/v, 아세토니트릴)로 시작하여, 152분까지 SolA를 58%로 변화시켰다. 이동률(Flow rate)은 0.4 ml/min이며, N-글리칸의 유지시간(retention time)을 2-AB 글루코즈 호모폴리머 표준(glucose homopolymer standard)에서 나온 글루코즈 유닛(Glucose Unit)과 비교하여 당쇄구조를 예측하였다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 피크(peak) h, k, m에 있어 대장암이 정상에 비해 큰 것을 알 수 있었다.

또한, 상기 피크 h, k, m이 푸코스(fucose)와 관련이 있는가를 알아보기 위하여, 다양한 푸코시다제[아몬드 가루 알파-푸코시다제(Almond meal alpha-fucosidase, prozyme 사)(Fucα1-3,4를 특이적으로 잘라냄), 소 신장 알파-푸코시다제(Bovine kidney α-fucosidase, sigma 사)(Fucα1-6>2,3,4를 특이적으로 잘라냄)] 및 다른 효소[아스로박터 우레아파시엔 시알리다제(Arthrobacter ureafaciens sialidase, prozyme 사)(시알린산α2-6>3>8,9를 특이적으로 잘라냄), S. 폐렴 N-아세틸헥소사미다제(S. pneumonia N-acetylhexosamidase, prozyme 사)(GlcNAcβ1-2>3,4,6를 특이적으로 잘라냄) 및 베타-갈락토시다제(β-galactosidase, sigma 사)(Galβ1-3,4>6)]를 이용하여 확인하였다.

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 피크 h, k, m은 Fucα1-6GlcNAc가 아닌 Fucα1-3/4GlcNAc와 연관이 있는 피크임을 확인할 수 있었다(도 6).

따라서, 베타-합토글로빈에 Fucα1-6GlcNAc에 대한 특이적인 효소를 처리한 후, AAL을 수행함으로써 Fucα1-3/4GlcNAc에 의하여 나오는 신호만을 쉽게 확인할 수 있으며, 이를 통해 대장암을 진단할 수 있음을 알 수 있다.

상기에서 보는 바와 같이, 본 발명은 대장암 진단용 조성물 및 진단 키트 개발, 및 대장암 진단 방법 및 대장암 치료제 개발에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 항-합토글로빈 친화성 크로마토그래피(anti-haptoglobin-affinity) 컬럼, SDS-PAGE 및 컴파시 브릴리언트 블루 염색(Coomassie Brilliant Blue staining) 방법을 이용하여 베타-합토글로빈의 정제를 보여주는 그림이다:

레인(lane) 1: 크기 마커;

레인 2: 1/100으로 희석된 혈액; 및

레인 3: 항-합토글로빈 친화성 크로마토그래피로부터 유래된 용리액(eluent).

도 2는 대장암 환자 및 정상인 혈액 유래 베타-합토글로빈을 HRP-결합된 AAL 렉틴으로 블랏팅을 이용하여 베타-합토글로빈의 당쇄구조를 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 3은 대장암 환자 및 정상인 혈액 유래 베타-합토글로빈을 HRP-결합된 AAL 렉틴 이외의 다른 렉틴(SNA 렉틴, PHA-L 렉틴, PHA-E 렉틴)으로 블랏팅을 이용하여 베타-합토글로빈의 당쇄구조를 비교한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4는 대장암 만성질환인 대장궤양(UC)과 크론씨병(CD)의 환자에게서 정제한 베타-합토글로빈을, 바이오틴화된 AAL로 PVDF 막에서 웨스턴 블랏한 후, 항-합토글로빈 항체로 재블랏팅한 다음, AAL 밴드의 상대적인 강도를 블랏팅 지표인 합토글로빈 밴드로 비교한 결과를 보여주는 그래프이다:

N: 정상인 유래의 경우(3 case);

UC: 대장궤양 환자 유래의 경우(4 case);

CD: 크론씨병 환자 유래의 경우(5 case); 및

CP: 대장암 환자 유래의 경우(3 case).

도 5는 베타-합토글로빈에 푸코시다제(fucosidase)를 처리하거나 처리하지 않은 경우, 각각 AAL 렉틴을 이용하여 SDS-PAGE와 렉틴 블랏(Lectin blot)을 수행한 후 비교한 결과를 보여주는 그림이다.

도 6은 베타-합토글로빈의 밴드를 다양한 푸코시다제[시알리다제; 시알리다제 및 알파-푸코시다제; 알파-푸코시다제 및 베타-갈락토시다제; 시알리다제, 알파-푸코시다제(Bovine), 알파-푸코시다제(Almond) 및 베타-갈락토시다제; 시알리다제, 알파-푸코시다제(Bovine), 알파-푸코시다제(Almond), 베타-갈락토시다제 및 N-아세틸헥소사미다제]를 이용하여 겔내 절단(in gel digestion)을 수행한 후, 2-AB로 표지한 후, 2-AB가 붙은 글리칸만을 분리한 다음, 2-AB가 붙은 글리칸을 TSK 겔 아마이드(gel Amide)-80 4.6 X 250 mm 컬럼과 HPLC를 이용하여 분석한 결과를 보여주는 그림이다.

Claims

항 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin) 항체, AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin) 및 알파 1-6 푸코시다제(α1-6-fucosidase)를 함유하는 대장암 진단용 키트.
제 1항에 있어서, 상기 AAL 렉틴은 리간드에 결합된 것을 특징으로 하는 키트.
제 2항에 있어서, 상기 리간드는 바이오틴인 것을 특징으로 하는 키트.
제 2항에 있어서, 리간드 특이적 결합분자에 결합된 발색효소 또는 형광분자가 결합된 시각화 컨쥬게이트를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 4항에 있어서, 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 키트.
제 4항에 있어서, 형광분자는 콜로이드 골드(colloid gold), 폴리-L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; poly L-lysine-FITC) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 키트.
1) 접착성 지지체;

2) 상기 접착성 플라스틱 지지체의 상부 표면에 부착되어 있는, 분석하고자 하는 피검 시료를 수용하는 검체 패드;

3) 상기 검체 패드와 연동되어 있고, 발색제-결합 AAL 렉틴을 함유하는 컨쥬게이트 패드;

4) 상기 검체 패드에 연결되어, 항 베타-합토글로빈 항체가 선형으로 고정된 검출라인(test line), 및 상기 검출라인의 다운스트림에 위치하고 항 AAL 렉틴 항체 또는 AAL 렉틴에 결합하는 당단백질이 선형으로 고정된 대조라인(control line)을 포함하는, 상기 컨쥬게이트 패드와 연동된 신호검출 패드;

5) 신호검출반응이 종료된 피검 시료를 흡수하는, 상기 신호검출 패드의 다운스트림에 위치하는 흡수 패드로 구성된, 대장암 진단용 면역크로마토그래피 스트립.
제 7항에 있어서, 단계 3)의 발색제는 콜로이드성 골드 파티클(gold particle)인 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 7항에 있어서, 단계 4)의 신호검출 패드는 니트로셀룰로오스, 셀룰로오즈, 폴리에틸렌, 폴리에테르설폰 및 나일론으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 이루어진 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 7항에 있어서, 단계 5)의 흡수 패드는 다공성 지지체, 및 상기 다공성 지지체의 공동(pore)에 분산되거나 다공성 지지체의 섬유사에 흡착 또는 코팅되어 있는 흡수제를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
제 7항에 있어서, 면역크로마토그래피 스트립 상의 대조라인 및 검출라인에 착색선이 나타나면, 피검 시료를 대장암의 양성 시료로 판정하는 것을 특징으로 하는 면역크로마토그래피 스트립.
1) 피검체 유래 혈액에 알파 1-6 푸코시다제(α1-6-fucosidase)를 전처리하는 단계;

2) 상기 혈액을 항 베타-합토글로빈(beta-haptoglobin) 항체가 부착된 고체기판에 처리한 후 세척하는 단계;

3) 상기 기판에 AAL 렉틴(Aleuria aurantia agglutinin lectin)을 처리한 후 세척하는 단계; 및

4) 상기 기판 위에 AAL 렉틴의 부착 정도가 정상인에 비해 증가한 피검체를 대장암에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 대장암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
제 12항에 있어서, 단계 2)의 고체기판은 NC(nitrocellulose) 막, PVDF(polyvinylidene fluoride) 막, 마이크로플레이트, 유리기판, 폴리스티렌, 실리콘기판 및 금속판으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 단계 3)의 AAL 렉틴은 리간드에 결합된 것을 특징으로 하 는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 리간드는 바이오틴인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 단계 3)은 리간드가 결합된 AAL 렉틴을 부착시킨 후, 상기 리간드에 특이적으로 결합하는 결합분자가 부착된 발색효소 또는 형광분자를 결합시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 발색효소는 HRP(horseradish peroxidase) 또는 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 형광분자는 콜로이드 골드(colloid gold), 폴리-L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate; poly L-lysine-FITC) 및 RITC(rhodamine-B-isothiocyanate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 단계 4)의 결합 정도는 웨스턴블랏팅(Western blotting)법, 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나로 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.