본 발명은 피부 진정 효과를 갖는 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항산화 효과를 기대하고자 하는 주요 천연물로서 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물과 이들 천연물의 항산화 효과를 도와주는 비타민으로서 비오틴을 함유하도록 하여 발효 공정을 거치어 저온 초음파 추출하여 이 추출물을 함유한 피부 진정 효과를 가지며, 비흡광도가 크며, 화장료용의 각종 기제 및 첨가제, 유기용제 등에 대한 용해성, 친화성 및 안정성이 좋고, 특히 기존의 자외선 차단제와 병용하였을 때 자외선 차단 지수를 현저히 높이는 상승 작용을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르는 천연물 발효 추출물에서 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕을 함유하여 이들의 유효 성분을 발효 공정을 통해 활성화하여 이를 저온 초음파 추출하여 건조중량을 기준으로 하여 0.1 내지 20 중량% 함량으로 화장료에 배합하여 사용한다.
본 발명에 사용된 비타민으로서 비오틴은 세포 성장, 포도당의 항상성, DNA 합성에 대하여 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 본 발명에서는 주요 천연물로서 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물의 추출시 산화안정성을 제공하는 역할을 하도록 사용하였다.
본 발명은 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 각각의 원료에 대하여 0.009 내지 30 중량%로 각각의 원료를 혼합하여 80 내지 100에서 30분 내지 1시간 동안 습식 열처리를 하여 미생물 오염도를 낮추고 수용성 비타민으로서 비오틴을 0.001 내지 1 중량% 함유하도록 하여 30 내지 60 온도와 pH 5.5 내지 8.5 및 24 내지 48시간의 통성 혐기적인 발효 조건에서 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물을 건식 배양 조건하에서 바실러스속 미생물을 이용하여 접종하여 발효하여 고분자 물질을 생성하도록 한 후 정제수 또는 유기용매로서 저급 알코올로서 메탄올, 에탄올, 부틸렌 글리콜 중의 하나 내지 이들을 혼합하여 고형분의 질량 기준 1:1 내지 5로서 유기용매를 사용하여 약 4 내지 50 범위의 저온의 초음파 추출 방법을 사용하여 추출액을 회수하고 이를 농축하여 1차 정제하는 것을 특징으로 한다. 더욱 정제하고자 할 때는 4에서 분자량 10kD의 막 필터를 이용한 투석을 통해 저분자량의 물질을 제거할 수 있다. 분리된 용액의 부피와 동일한 부피의 증류수를 첨가하여 추출물의 점도를 낮춘 후 동결건조하여 건조중량을 측정하여 생산성을 결정한다.
이렇게 제조된 천연물 발효 추출물을 화장료 제조시 첨가한다.
본 발명의 바실러스속 균주의 특성은 그람 양성균으로서 내생 포자 형성능이 있으며, 장간균의 형태를 가지고 있다. 또한 호기성 또는 통성혐기성 조건에서 생장이 가능하지만 혐기적인 조건에서는 생장이 불가능하며 카탈라아제 생산 및 카제인과 젤라틴, 전분 분해능의 특징을 가진다. 생장 조건으로서는 7% 식염수 조건에서 생장이 가능하며 발효 조건인 약 45에서 생장이 가능하며 약 pH 5.0 내지 7.5에서 생 장이 활발하다. 또한 글루코오스, 아라비노오스, 크실로오스, 만니톨을 이용하여 산을 생성할 수 있는 특징을 가진다.
본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유하여 제조한 피부 진정 효과를 가지는 화장료 조성물은 통상의 제형을 가질 수 있으며, 예를 들어 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 바디로션, 바디오일, 바디에센스 등으로 제형으로 제조될 수 있다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다. 이하에 아토피성 피부에 대해 피부 진정 효과를 갖는 화장료 조성물의 대표적인 크림 조성물을 예를 들어 설명한다.
또한 본 발명에 따른 피부 진정 효과를 가지는 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명의 피부 진정 효과를 가지는 화장료 조성물을 더욱 상세하게 설명하지만 본 발명이 이들 실시예에만 국한되는 것은 아니다.
실시예 1 : 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물과 비타민으로서 비오틴을 함유하는 천연물 발효 추출물의 제조
레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되어진 혼합물을 각각 19.99 중량%로 혼합하여 80 내지 100에서 30분 동안 습식 열처리를 하여 미생물 오염도를 낮추고 비타민으로서 비오틴을 0.05 중량% 함유하도록 하여 40 온도와 pH 6.5에서 24시간의 통성 혐기적인 발효 조건에서 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물을 건식 배양 조건하에서 바실러스속 미생물을 이용하여 접종하여 발효하여 고분자 물질을 생성하도록 한 후 정제수 또는 유기용매로서 저급 알코올로서 에탄올을 고형분으로서 질량 기준 1:1 로서 유기용매를 사용하여 약 4 내지 50 범위의 저온의 초음파 추출 방법을 사용하여 추출액을 회수하고 이를 농축하여 1차 정제하여 천연물 발효 추출물을 얻었다.
실시예 2 : 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유하는 화장료 조성물의 제조
하기 표 1에 나타난 바와 같은 조성비율로 화장료를 제조하였다. A 부분은 스테아레스 21, 스테아레스 2, 글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트, 세토스테아릴알콜, 멀티왁스, 하이드로제네이티드 디데센, 유동파라핀, 디메치톤, 스쿠알란, 호호바오일로 구성하여 제조하였고, B 부분은 멸균 처리된 정제수에 1,3-부틸렌글리콜, 레시친, 글리세린, EDTA-2NA, 산탄검을 용해시켜 제조한 다음 상기 실시예 1에서 제조한 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물과 비타민으로서 비오틴을 함유하는 천연물 발효 추출물과 혼합하여 화장료를 제조하였다.
성 분 |
함량 (중량%) |
본 발명의 천연물 발효 추출물 |
10.0 |
A |
스테아레스 21 |
2 |
스테아레스 2 |
1.5 |
글리세릴스테아레이트/피이지-100 스테아레이트 |
0.5 |
글리세릴스테아레이트 |
2 |
세토스테아릴알콜 |
1.7 |
멀티왁스 |
1 |
하이드로제네이티드 디데센 |
3 |
유동파라핀 |
3 |
디메치톤 |
3 |
스쿠알란 |
2 |
호호바오일 |
1 |
B |
1,3 부틸렌글리콜 |
5 |
레시친 |
1 |
글리세린 |
3 |
EDTA-2NA |
0.03 |
산탄검 |
0.1 |
정제수 |
To 100 |
|
방부제 |
적 량 |
실험예 1 : 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유한 화장료의 피부 자극성 및 피부 진정 효과 확인
현재 피부병 내지 피부 알레르기 증상이 없는 20 내지 30대 남녀 12명을 대상으로 하완의 안쪽 부위에 테입 스트리핑 법(Tape Stripping Method)을 통한 피부자극을 유발한 후 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유한 화장료와 함유되지 않는 화장료를 도포하여 유발된 자극이 진정되는 정도를 상대평가 하였다.
먼저 하완의 안쪽부위 두 곳에 일반 스카치 테잎으로 20회 내지 30회 (자원자의 피부 민감정도에 따라 회수를 조정함) 테이핑을 하여 피부 홍반을 유발하였다. 홍반 유발된 후, 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유한 화장료를 도포하였으며, 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유하지 않은 화장료를 도포하였다. 도포 후 2시간 후 피부진정 정도를 평가하였다.
<피부자극정도 (홍반) 평가>
0 (무반응)
1 (매우 경미한 홍반흔적)
2 (희미한 또는 가벼운 홍반)
3 (경계가 뚜렷하나 약한 홍반)
4 (뚜렸한 홍반)
5 (심한 홍반)
Subject |
피부자극 정도 |
실험물질 도포 2시간 후 피부자극정도 |
좌 |
우 |
실시예(좌) |
자극완화율(%) |
대조예 (우) |
자극완화율(%) |
1 |
4 |
4 |
1 |
60 |
3 |
20 |
2 |
3 |
3 |
1 |
40 |
2 |
20 |
3 |
2 |
2 |
0 |
40 |
1 |
20 |
4 |
3 |
3 |
0 |
60 |
2 |
20 |
5 |
3 |
3 |
0 |
60 |
2 |
20 |
6 |
2 |
2 |
1 |
20 |
1 |
20 |
7 |
3 |
3 |
0 |
60 |
2 |
20 |
8 |
3 |
3 |
0 |
60 |
1 |
40 |
9 |
2 |
2 |
0 |
40 |
2 |
0 |
10 |
4 |
4 |
2 |
40 |
3 |
20 |
11 |
2 |
2 |
1 |
20 |
1 |
20 |
상기 표 2에서 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유한 화장료를 도포한 부위가 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유하지 않은 화장료를 도포한 경우보다 높은 자극완화율을 나타내었다.
실험예 2 : 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유한 화장료의 피부 자극 성 확인을 위한 첩포 시험
과거력상 피부자극에 과민반응을 보이지 않으며, 현재 피부병 내지 알러지 증상이 없는 20 내지 30대 여성 13명을 대상으로 인체피부 첩포시험을 통하여 자극완화 효과를 확인하였다. 피부 자극 물질인 락틱산 5 %와 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 5% 함유한 화장료를 실시예로 하고, 락틱산과 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유하지 않는 화장료를 대조예로 하고, 락틱산만 첨가하고 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 정제수로 대체한 화장료를 비교예 1로 하고, 실시예의 화장료에서 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 5 % 마치현추출물로 대체한 화장료를 비교예 2로 하여 피부첩포시험을 실시하였다. 우선 시험부위를 70% 에탄올로 닦아낸 뒤 건조시켰다. 준비된 시험물질을 30㎍씩 핀챔버 (200 Finn Chambers On Scanpor. Large (11mm), 핀란드) 내에 적하시킨 후 시험 대상자의 전완(Forearm) 안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24시간 동안 첩포하고 첩포를 제거한 후 마킹펜으로 시험부위를 표시하였다. 표시 후 각각 1시간 및 24시간 후에 확대경(Digital Scope, Bomtech, 한국)을 이용하여 시험부위를 관찰하여 홍반 및 부종 유무를 확인하였다. 피부반응은 국제접촉피부염연구회 (ICDRG, International Contact Dermatitis Research Group)의 규정에 따라 판정하고, 수학식 5에 따라 평균피부반응도 (mean response rate)를 구하였다.
* 피부반응의 평가 기준 및 점수
기호 |
점수 |
평가기준 |
-
|
0 |
무반응 |
±
|
0.5 |
희미한 또는 가벼운 홍반 |
+
|
1 |
경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진 |
++
|
2 |
뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포 |
+++
|
3 |
심한 홍반 및 대수포, 가피형성 |
수학식 5
평균피부반응도 = (점수×반응 수×100×1/2)/[3(최대점수)×총피검자수(n)]
시험물질 |
24시간 |
48시간 |
반응도 (%) (n=20) |
± + ++ |
± + ++ |
실시예 |
4 - - |
3 - - |
4.49 |
비교예1 |
5 3 - |
7 - - |
7.54 |
비교예2 |
7 1 - |
6 - - |
9.28 |
대조예 |
5 1 - |
5 - - |
7.68 |
상기 표 3에서 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 천연물 발효 추출물을 함유한 화장료 조성물의 실시예가 비교예 1, 2 및 대조예를 함유하는 화장료 조성물과 비교하였을 때 피부자극 완화 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 3 : 본 발명의 천연물 발효 추출물의 농도에 따른 리폭시게나아제 활성 저해 효과
리폭시게나제(5-LO, 5-lipoxygenase)는 리놀산, 리놀렌산, 아라키돈산과 같이 분자 내에 1,4-cis,cis-pentadiene(1,4-pentadiene) 구조를 갖는 불포화 지방산에 분자상 산소를첨가하여 1,3-cis, trans-diene 5-hydroperoxide를 생성하는 산화효소로 아라키돈산으로부터 각종 염증 및 알러지성 질환에 관여하는 로이코트리엔 (leucotriene) 생합성의 첫번째 반응에 관여하는 효소이다. 따라서 구조적, 메커니즘적으로5-LO와 유사한 SLO(soybean lipoxygenase)를 이용하여 리폭시게나제의 저해활성을 측정하여 항염효과를 확인하였다. 즉, 0.1M Tris 완충용액 200 ul에 2 ul의 시료를 첨가하고, 여기에 500 unit의 15-lipoxygenase를 넣어서 25에서 5분간 반응시켰다. 반응 후, 에탄올에 녹인 linolenic acid를 최종농도 110 uM이 되도록 첨가하여 섞은 후 234 nm에서 5분간 흡광도를 측정하여 추출물의 lipoxygenase 저해활성(%)을 계산하였다. 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 실시예 1의 천연물 발효 추출물의 농도에 따라 리폭시게나아제 활성 저해능이 비례적으로 증가하여 항염 작용에 의한 피부 진정 효과가 우수함을 확인하였다.
실험예 4 : 본 발명의 천연물 발효 추출물의 농도에 따른 DPPH 소거능에 의한 항산화 효과
활성 산소에 의한 피부 노화 과정은 지질 과산화, DNA 산화, 멜라닌 생성, 결합조직의 절단 및 비정상적인 교차 결합들을 포함한다. 이들 반응들은 거의 대부분 라디칼 반응으로서 자동산화반응 과정이 포함된다. 생체 내에서 자동산화반응을 차단시키는 역할은 항산화제가 담당하고 있다. 전자를 주는 능력으로서 환원력이 클수록 강한 항산화제가 된다.
항산화제의 환원력을 측정하는 시약으로 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl radical (DPPH)가 있다. DPPH는 화합물 내 질소 중심의 안정화된 구조의 라디칼로 존재한다. 517nm에서 최대 흡수를 나타내며 환원되면 517nm에서 흡수가 없어진다. 본 발명의 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물과 비타민으로서 비오틴을 함유하여 구성된 천연물 발효 추출물의 환원력의 크기는 라디칼 소거활성 (Scavenging activity, SC50)으로 표시하며 SC50은 DPPH의 농도가 50% 감소하는데 필요한 농도를 나타내며, 도 2는 본 발명에 의해 제조된 천연물 발효 추출물의 DPPH 소거능에 의한 항산화 효과를 나타내는 그래프로서, 이를 더욱 상세하게 설명하면, 레몬밤, 석류, 무화과, 모과, 더덕으로 구성되는 혼합물과 비타민으로서 비오틴을 함유하여 만들어진 천연물 발효 추출물에 대하여 농도를 각각 0.2, 0.4, 0.8 (%, V/V)에서 테스트하였을 때 농도에 비례하게 DPPH 소거능력이 증가하여 항산화 작용이 우수하여 피부 진정 효과가 우수함을 알 수 있었다.
실험예 5 : 본 발명의 천연물 발효 추출물의 농도에 따른 하이드록실 라디칼 소거 활성에 의한 항산화 효과
하이드록실 라디칼은 세포에 손상을 주는 가장 강력한 free radical로서 피부 세포막의 지질의 과산화반응을 일으키고 특히 DNA 및 결합조직 기질 손상에 참여하는 주원인 활성 산소종으로 알려져 있다. 특히 자외선 흡수로 시작되는 광증감 반응에 의해 슈퍼록사이드와 과산화수소가 생성되고 이들은 생체내에서 보다 위험한 하이드록실 라디칼 생성에 참여한다. 즉 슈퍼록사이드는 철 이온과 구리 이온을 환원시킬 수 있고 환원된 철과 구리는 과산화수소를 환원시키면서 결과적으로 하이드록실 라디칼을 생성시킨다.
본 발명의 천연물 발효 추출물은 in vitro에서 Fenton 반응에 의해 생성시킨 하이드록실 라디칼을 소거하는 능력을 측정하여 도 3에 나타내었다. 즉 도 3에서 보여주듯이 본 발명의 천연물 발효 추출물은 각각 0.5, 1.0, 5.0 (%, V/V) 농도에 따라 하이드록실 라디칼을 비례적으로 소거하는 것을 보여주어 하이드록실 라디칼 소거활성이 우수하여 피부 진정 효과가 우수함을 나타내었다.
실험예 6 : 본 발명의 천연물 발효 추출물의 농도에 따른 콜라게나아제 활성 저해에 의한 항주름 효과
피부 주름의 발생 원인 중 하나로 피부교원질 즉 콜라겐의 결핍을 들 수 있다. 콜라겐은 피부 진피를 구성하는 주요 단백질로서, 피부 구조와 탄력을 유지하는 역할을 하고 있다. 콜라겐은 나이가 들면서 생성은 감소되며, 분해도는 증가되어 피부 진피층의 함몰을 유도하여 피부의 주름을 생성하는 것으로 알려져 있다. 또한 광노화의 원인인 자외선에 의해 콜라게나아제와 같은 MMP (matrix metalloproteinase)가 발현되고, 이에 의해 콜라겐의 분해가 증가되어 주름이 생성된다. 따라서 본 발명의 감초, 승마, 하수오, 흑임자, 상황버섯으로 구성된 식물 추출물이 콜라게나아제 활성을 저해하는지 여부를 확인하여, 피부 주름 개선의 효과를 보고자 하였다. 반응구로서 0.05M tricine buffer(pH7.5) 0.8에, 0.2mM 농도의 FALGPA을 녹인 기질액 0.05 및 시료용액을 농도별로 0.05 첨가하고, 여기에 콜라게나아제(3mg/ml) 0.05을 첨가하여 20 에서 18시간 방치하였다. 그 후, 1N 아세테이트 10를 넣어 반응을 정지시킨 후, 흡광도324nm에서 저해 활성을 측정하여 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의한 천연물 발효 추출물의 0.5, 1.0, 2.5 (%, V/V) 농도에 따라 콜라게나아제 활성 저해능이 비례적으로 증가하여 항주름 효과가 우수함을 확인하였다.
본 발명은 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명됐지만, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 범위는 이하의 특허청구범위에 의하여 정하여지는 것으로 본 발명과 균등 범위에 속하는 다양한 수정 및 변형을 포함할 것이다.