KR20090069732A

KR20090069732A - 알부틴 베타유도체를 포함하는 피부미백용 조성물

Info

Publication number: KR20090069732A
Application number: KR1020070137502A
Authority: KR
Inventors: 차재호; 전소영; 이상현
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-26
Filing date: 2007-12-26
Publication date: 2009-07-01
Also published as: KR100923141B1

Abstract

본 발명은 피부미백제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 알부틴 베타 유도체를 이용하여 티로시나제(tyrosinase) 활성을 저해하여 멜라닌 과잉합성을 억제함으로써 미백기능 및 피부보호 기능을 갖는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, Thermotoga neapolitana β-글리코시다제의 글리코실전이반응을 통하여 합성된 알부틴 베타 유도체인 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴을 함유하는 멜라닌 생성억제용 또는 피부미백용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 알부틴 베타 유도체는 티로시나제 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제하고, 알부틴보다 세포 독성이 적어 멜라닌 생성 억제 또는 피부 미백에 보다 더 효과적이다.

알부틴, 알부틴-β-글리코시드, 흑색종 세포, 글리코실전이, 티로시나제

Description

알부틴 베타유도체를 포함하는 피부미백용 조성물{skin whitening composition comprising arbutin β-derivative}

일반적으로 자외선에 피부가 노출되면 표피가 검게 되는데, 이는 멜라노사이트 (melanocyte)에서 흑색 색소인 멜라닌이 합성, 방출되기 때문이다. 멜라노사이트의 티로시나제(tyrosinase)는 티로신으로부터 도파퀴논을 합성하고, 도파퀴논은 자발적인 산화 과정을 거쳐 멜라닌을 형성한다. 멜라닌은 생체 내에서 과량의 빛을 흡수하는 역할을 하지만, 특정 부위에 집중적으로 침착되어 기미, 검버섯 등을 만들기도 하고, 임신 차단물이나 피부 병리에 의해 피부의 이상변색증 등을 나타내게도 한다. 또한 미용적인 측면에서도 피부를 희게 하고자 하는 욕구가 강하여 시판되는 많은 화장용 조성물들이 미백제 성분을 함유하고 있기도 하다.

이와 같이, 멜라닌은 인간의 피부색소로서, 광방어 (photoprotection)에 있어 일차적인 역할을 수행하고 (Riley 2003; Ahn et al. 2006), 기저의 진피층을 통하여 분포된 멜라닌세포에 의하여 분비된다 (Spritz et al. 1994). 이러한 멜라닌의 역할 중 하나는 UV-유도 피부손상으로부터 피부 및 피하조직을 보호하는 것이지만, 피부에서 멜라닌의 과잉 생산은 부정적 과색소침착 효과를 가져와 기미, 주근깨 및 검버섯을 유발하고 (Ha et al. 2005; Min et al. 2004; Unver et al. 2006), 또한 표피 및 진피에서 과색소침착은 멜라닌 세포수의 증가 또는 멜라닌생성 효소의 활성의 증가에 의존한다 (Griffiths et al. 1993; Kanwar et al. 1994).

또한, 티로시나아제 (EC 1.14.18.1) 는 멜라닌 합성에 있어 중요한 효소 중 하나로서 (Kubo et al. 2000; Perez-Gilabert and Garcia-Carmona, 2001), 멜라닌 합성에 처음 두 단계인, 도파 (3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanine, DOPA)의 하이드록실화 및 도파의 도파퀴논으로의 산화에 촉매로서 작용한다(Shin et al. 1998). 또한 많은 티로시나아제 억제자는 천연 및 합성에 의해여 얻어지고, 단지 이들 중 몇몇만, 주로 여러가지 안전성의 고려로 인하여, 피부 미백제로서 활용된다. 예를 들면, 리놀레산, 히노키톨, 코직산, 천연적으로 만들어진 하이드로퀴논 및 카테콜은 모두 효소 활성을 억제하는 것으로 보고되어 있으나 해로운 부작용이 입증되었고(Seo et al. 2003), 이 중에서 4-hydroxyphenyl β-D-glucopyranoside (알부틴)는 현저한 티로시나제 억제활성을 보여준다.

이전 연구에서는 4-hydroxyphenyl α-D-glucopyranoside (α-알부틴) 및 α- arbutin-α-glycosides가 효소적으로 합성되었고(Sugimoto et al. 2003; Sugimoto et al. 2005), 멜라닌 형성에 대한 억제 효과가 확인되었으며, 다른 출처에서 얻은 몇몇 티로시나제에 대한 α-알부틴 및 α-arbutin-α-glycosides의 억제활성도 비교되었다. α-알부틴 및 α-arbutin-α-glycosides는 포유류의 티로시나제에 대한 알부틴의 억제활성보다 더 높은 억제활성을 보여주었다 (Sugimoto et al. 2005). 즉, 알부틴 유도체와 함께 티로시나제 억제 연구는 하이드로퀴논-글리코시드에 있어서 α-글리코시드 연관이 인간의 티로시나제 억제에 있어 중요한 기능을 수행할 것으로 보여주고 있다.

상기한 바와 같이, 신체 피부의 멜라닌 세포에서 생성되는 멜라닌 색소는 검은 단백질의 복합체 형태를 갖는 페놀계 고분자 물질로서, 태양으로부터 조사되는 자외선에 의한 피부손상 저해에 중요한 역할을 담당하고, 멜라닌 생합성에는 멜라닌 세포에 존재하는 티로시나제의 작용이 중요하므로, 현재 멜라닌 과생성 및 침착 저해를 통한 피부 미백 및 피부암 예방을 위한 대부분의 연구는 티로시나제의 활성 저해에 초점을 맞추고 있다.

또한 현재까지 개발된 티로시나제 활성 저해제로는 티로시나제 활성자리의 구리이온에 대한 킬레이트 형성물질, 퀴논류를 페놀류로 환원시킨 비타민 C (ascorbic acid) 또는 코지산(kojic acid)등의 환원제, 그리고 티로시나제 자체를 변형시키는 바이설파이트(bisulfite)제제 등이 알려져 있다. 그밖에도 4-히드록시아니솔(4-hydroxyanisole), 하이드로퀴논(hydroquinone), 레티놀(retinol) 또는 하 이드로코르티솔(hydrocortisole) 등이 티로시나제 활성을 저해하여 미백효과를 나타내는 물질로 알려져 있다. 이들 중 코지산과 하이드로퀴논이 미백효과를 갖는 대표적인 물질로 알려져 있다. 코지산은 누룩곰팡이 발효액으로부터 얻어지는 성분으로서 멜라닌 생성을 억제하기 때문에 미백 화장품의 원료로 주로 사용되고 있고, 하이드로퀴논은 현재 생산 판매되는 미백제의 약 80% 이상에서 이용되고 있다 (Ardnt K. A. et al. 1965).

그러나 하이드로퀴논은 티로시나제에 대해 강한 저해효과를 나타내지만, 멜라닌 세포의 변성 또는 치사를 유발하는 등 세포독성으로 인한 피부자극 또는 피부염증을 일으킬 뿐만 아니라 포유 세포에 대한 강력한 돌연변이원 (mutagen)으로 작용하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 세포독성이 낮은 티로시나제 저해제를 찾기 위한 노력의 일환으로 알부틴 등 하이드로퀴논의 대체물질에 대한 연구가 진행되고 있으나, 아직까지는 효과적인 티로시나제 저해제는 개발되지 못한 실정이다. 본 연구의 앞선 연구에서 Thermotoga neapolitana 유래의 베타-글리코시드(β-glycoside)의 당전이(transglycosylation) 반응을 이용해서 알부틴 베타유도체를 생산하였고, 알부틴과 셀로비오즈는 각각 수용체와 공여체로 사용하였다. 알부틴 유도체 생성은 TLC와 HPAEC를 이용하여 확인하였다. 그 결과 화합물 1, 2, 3이 만들어 졌으며, NMR 분석 결과 β-D-글루코실-(1→6)-알부틴 (화합물 1), β-D-글루코실-(1→4)-알부틴 (화합물 2), 그리고 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴 (화합물 3)임을 밝힌 바 있다.

이에 본 발명가들은 상기 알부틴과 알부틴 베타유도체를 이용하여 티로시나제 억제효과에 대한 연구를 수행하여 본 발명에 이르게 되었다.

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본 발명의 목적은 티로시나제 저해 효과를 가지며 피부에 독성이 없는 알부틴 베타유도체의 피부미백제를 제공하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 해결하기 위하여, 티로시나제 활성을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제하고, 피부에 독성이 없는 알부틴 베타 유도체를 제공한다.

보다 구체적으로, 화학식 1로 나타내어지는 하기 화학구조식을 갖는, 알부틴베타 유도체인 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴을 함유하는 피부미백용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물이 화장료인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 조성물이 의약인 것을 특징으로 하는 피부미백용 약학 적 조성물에 관한 것이다.

바람직하게는 본 발명은 상기 알부틴 베타 유도체 이외의 미백성분을 더 함유하는 피부미백용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 피부 미백용 조성물은 멜라노사이트에 있어서의 멜라닌 생성을 억제하여, 자외선 조사후의 햇볕에 탄 피부의 미백, 또, 햇볕에 타서 생긴 검버섯, 주근깨, 기미 등의 피부의 색소침착을 예방, 개선 및 처치할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 경구용(내용) 또는 비경구용(외용)의 양 형태를 취할 수 있다. 경구용의 경우는, 본 발명의 조성물을, 예를 들면 의약 또는 식품 등의 형태로 조제할 수 있다. 또한, 비경구용의 경우에는, 화장료, 의약부외품, 의약, 피부외용제 등의 형태로 조제할 수 있다.

본 발명에 있어서의 상기 알부틴 베타 유도체를 함유하는 조성물, 즉 미백용 조성물, 미백용 의약, 미백용 피부외용제 등의 조성물에는, 상기 알부틴 베타 유도체 이외의 미백제 성분(이하, 간단히 미백제 성분이라고도 한다)을 더 함유할 수 있어, 상기 알부틴 베타 유도체와 미백제 성분의 병용 배합에 의해, 멜라닌 생성억제효과 및 이에 따른 미백효과를 상승적으로 향상시킬 수 있다.

상기 미백제 성분으로서는, 특별히 한정되는 것은 아니고, 예를 들면, 아스코르빈산 및 그 유도체 및 이들의 염(예를들면, 아스코르빈산, 아스코르빈산-2-글루코시드, 아스코르빈산 인산 에스테르마그네슘염, 아스코르빈산 나트륨, 스테아린산 아스코르빌, 팔미트산 아스코르빌, 디팔미트산 아스코르빌, 테트라이소팔미트산 아스코르빌, 아스코르빈산마그네슘, 키토산아스코르베이트, 아스코르빌메틸실라놀펙티네이트, 아스코르빈산 폴리펩티드, 디아젤라인산 아스코르빌, 아스코르빈산 폴리인산 에스테르, 아스코르빈산 폴리옥시에틸렌 유도체, 리시놀산 아스코르빌, 아스코르빈산-2-황산 에스테르나트륨염 등), 하이드로퀴논 및 그 유도체 및 이들의 염(예를 들면, 알부틴 등), 시스테인 및 그 유도체 및 이들의 염(예를 들면, L-시스테인, N,N'-디아세틸시스틴디메틸 등), 플라센타 엑기스, 코지산 및 그 유도체, 루시놀, 에라그산 및 그 유도체, 글루코사민 및 그 유도체, 아젤라인 및 그 유도체, 히드록시신남산 및 그 유도체, 글루타티온, 식물 추출물(카밀레 추출물, 아르니카 추출물, 오우곤 추출물, 천궁이 추출물, 뽕잎 추출물, 사이코 추출물, 방풍나 물 추출물, 갯방풍 추출물, 김네마(Gymnema) 추출물, 참피나무 추출물, 복숭아잎 추출물, 고삼 추출물, 츄 추출물,토우키 추출물, 율무쌀 추출물, 감잎 추출물, 대황 추출물, 모란피 추출물, 하마메리스 추출물, 마로니에 추출물, 고추나물 추출물, 광대수염 추출물, 감초 추출물, 선복화 추출물, 계혈등 추출물, 산편두 추출물, 이부키토라노오(학명:Polygonum bistorta Linn) 추출물, 고삼 추출물, 산자시 추출물, 백합 추출물, 홉 추출물, 찔레나무 추출물 등), 글라브리딘, 그라브렌, 리크이리틴, 이소리크이리틴, 감초 소수성 후라보노이드, 리코칼콘A, 태반 추출물 등을 들 수 있다. 미백제 성분은, 1종 또는 2종 이상이 임의로 선택되어서 배합할 수 있다. 미백제 성분을 배합할 경우의 미백제 성분의 배합량(함유량)은 상기 조성물 전량 중 0.0001∼10중량%가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.001∼5중량%이다. 또, 추출물의 경우는 추출액에서 용매를 제거한 건조물 중량으로 환산한 양이다.

이하, 알부틴 베타 유도체를 함유한 본 발명의 구체적인 조성물을 용도별로 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명의 알부틴 제1용도인 화장료는, 예를 들면, 연고제, 용액, 크림, 유액, 화장수, 로션, 젤, 에센스(미용액), 파운데이션, 팩마스크, 루즈, 스틱, 입욕제 등의 피부외용제 등으로서 의약부외품을 포함하는 넓은 범위에서 적용가능하다.

또한, 화장료의 제형도, 용액계, 가용화계, 유화계, 분말계, 분말분산계, 유액계, 겔계, 연고계, 에어졸계, 물-오일 2층계, 물-오일-분말 3층계 등, 폭넓은 제형을 채용할 수 있다. 본 발명의 화장료에의 알부틴 베타 유도체의 배합량은, 화장료 전량중 0.001∼20 중량%가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.01∼16중량%, 더욱 바람직하게는 0.1∼12중량%이다. 1∼10중량%가 가장 바람직하다. 본 발명의 화장료는, 멜라닌 생성억제작용 및 미백작용을 가지므로, 멜라닌 생성억제용 화장료 및 미백용 화장료로서 사용된다. 또한, 본 발명의 화장료는, 특히 피부외용제로서의 용도에 바람직하게 응용할 수 있으므로, 멜라닌 생성억제용 피부외용제 및 미백용 피부외용제로서 사용된다.

본 발명의 제2용도인 의약은, 경구투여, 비경구투여, 어느 투여방법이나 채용할 수 있으며, 각각에 적합한 의약제제의 형태로 할 수 있다. 의약제제로서는, 예를 들면, 액제, 시럽제, 주사제, 흡입제, 유제(乳劑) 등의 액상제, 정제, 분말제, 과립제, 캡슐제, 흡입제 등의 고형제, 연고 등의 피부외용제, 좌제 등의 외용제 등을 들 수 있다.

의약제제에의 알부틴 베타 유도체의 배합량은 의약제제 전량 중 0.001∼30 중량%가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 0.01∼20 중량%, 가장 바람직하게는 0.1∼10 중량%이다. 투여량은, 환자의 연령 및 체중, 적용경로, 질병의 진행도 및 병행해서 행해지고 있는 처치에 기초하여 적절히 변경되어지는 것이며, 특별히 정해지는 것은 아니지만, 일반적으로는 1일당 4∼10 ㎖정도이며, 1일에 1회 또는 2∼3회에 나누어서 투여할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 의약은, 멜라닌 생성억제 작용 및 미백작용을 가지므로, 멜라닌 생성억제용 의약 및 미백용 의약으로서 사용된다. 또한, 본 발명의 의약은, 특히 피부외용제로서의 용도에 바람직하게 응용할 수 있으므로, 멜라닌 생성억제용 피부외용제 및 미백용 피부외용제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 화장료, 의약 등의 조성물에는, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위에서 상기한 알부틴 베타 유도체 이외에 통상 화장료, 의약, 피부외용제 등에 이용되는 다른 성분을 배합할 수 있다.

예를 들면, 화장료로서는, 유분, 분말, 계면활성제, 보습제, 증점제, 저급 알콜, 피막제, 자외선 흡수제, 금속이온 봉쇄제, 유기 아민류, pH 조정제, 약효성분, 당류, 방부제, 비타민류, 산화 방지제, 향료, 물 등을 들 수 있다.

유분의 예로서는, 호호바유, 올리브유, 아보가도유, 피마자유, 야자유, 우지, 경화유, 액상 라놀린 등의 천연유지 및 그 유도체, 카르나우바납, 밀랍, 라놀린 등의 납류, 유동 파라핀, 마이크로 크리스탈링 왁스, 스쿠알린, 바셀린 등의 탄화수소류, 스테아린산 등의 고급 지방산류, 세틸알콜, 스테아릴알콜 등의 고급 알 콜류, 글리세린모노스테아린산 에스테르, 트리옥탄산 글리세릴, 글리세린모노올레이트, 미리스틴산 이소프로필, 사과산 디이소스테아릴, 디2-헵틸운데칸산 글리세린, 트리2-에틸헥실산 트리메티롤프로판, 트리옥탄산 트리메티롤프로판, 세바신산 디2-에틸헥실 등의 에스테르류, 박하유, 장미유, 시트로네랄 등의 정유류, 디메틸폴리실록산, 데카메틸시클로펜타실록산 등의 실리콘유류 등을 들 수 있다. 유분의 화장료중의 배합량은, 화장료의 형태, 제형 등에 따라서 적당히 선정되지만, 통상, 화장료 전량중 0.1∼95중량%로 할 수 있다.

분말의 예로서는, 탤크, 마이카, 카올린, 실리카, 아연화, 운모티타늄, 산화 티탄늄, 산화철, 나일론분말 등을 들 수 있다.

계면활성제의 예로서는, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄지방산 에스테르, 글리세린지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유, 폴리옥시에틸렌소르비톨지방산 에스테르,폴리옥시알킬렌 변성 폴리실록산 등의 비이온 계면활성제, 팔미트산 나트륨 등의 음이온 계면활성제, 염화스테아릴트리메틸암모늄 등의 양이온 계면활성제, 베타인, 아미드베타인, 술포베타인, 이미다졸리늄 등의 양성 계면활성화제를 들 수 있다.

보습제의 예로서는, 글리세린, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등을 들 수 있다.

증점제의 예로서는, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐알콜 등의 수용성 고분자, 벤토나이트 등의 점토광물을 들 수 있다.

자외선 흡수제의 예로서는, 파라아미노 안식향산(이하 PABA로 약기함), 글리 세릴 PABA, 에틸디히드록시프로필 PABA, 옥틸메톡시신나메이트, 2-에톡시에틸-p-메톡시신나메이트, 2,4-디히드록시벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시-4-메틸벤조페논, 2-히드록시-4-메톡시-4-메틸벤조페논술폰산염, 우로카닌산 에틸에스테르, 2-페닐-5-메틸벤조키사졸, 4-메톡시-4-t-부틸디벤조일메탄, 파라메톡시신남산 에틸헥실 등을 들 수 있다.

다음에, 의약으로서는, 부형제, 안정제, 보습제, 유화제, 흡수촉진제, pH 조정제, 계면활성제, 희석제, 담체 등의 여러가지 첨가성분을 배합할 수 있다. 이들 첨가성분의 구체예로서는, 예를 들면, 전분, 유당과 같은 당류, 황산마그네슘, 탤크, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로스와 같은 셀룰로스 유도체, 대두유, 참깨유와 같은 식물유, 동물유 또는 합성유,고무, 생리식염수 등과 같은 물, 에탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리알킬렌글리콜 등과 같은 알콜류 등을 들 수 있다. 그외, 상기 화장료 및 후기하는 식품에 배합할 수 있는 성분 중에서 선택되어 배합할 수도 있다.

본 발명의 상기 조성물은, 본 발명의 필수성분과 상기 임의 배합성분의 1종 또는 2종 이상을 혼합해서, 상법에 의해 임의의 형태, 제형으로 조제할 수 있다.

본 발명에 의하여 새롭게 합성된 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴는 새로운 피부미백제이며, 멜라닌형성 억제 활성을 가지며, 멜라닌형성 억제제인 알부틴보다 미백에 더 효과적이며, 세포 독성도 알부틴보다 적어 피부 보호에도 효과가 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명에 대하여 자세히 설명하나, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한하는 것은 아니다.

<실시예 1>

1-1 재료

α-멜라닌세포 자극 호르몬(MSH), 알부틴, 셀로비오스, 버섯 추출 티로시나제 및 L-티로신을 Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA)로부터 구입하였다. α-D-글루코실-(1→4)-알부틴은 경희대학교 박천석교수로부터 공급받았다.

1-2 알부틴 β-글리코시드의 준비 및 정제

알부틴 β-글리코시드는 Park et al.(Reference 9)에 서술된 방법으로 준비하였다.Thermotoga neapolitana β-글루코시다제 17.5 ㎍ 및 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)의 15% 셀로비스와 15% 알부틴을 포함하는 5 ml 반응 혼합물을 12시간동안 80℃에서 배양하였다. 당전이된 산물은 반복 준비 고성능 액체 크로마토그래피 (recycling preparative high-performance liquid chromatography)를 통하여 분리되었다. 당전이 산물의 약 3 ml가 JAIGEL W-251 (JAI Korea) 칼럼 (2× 50 cm)에 적용되었고, 3 ml/min 의 유속으로 탈염수로 용출시켰다.

알부틴 β-글리코시드를 포함하는 분획을 수집하고 동결건조시켰다. 분리된 알부틴 β-글리코시드 각각의 순도는 박막 크로마토그래피 (TLC) 및 고성능 음이온 교환 크로마토그래피 (HPAEC)를 통하여 확인하였다.

<실시예 2>

티로시나제의 효소성 측정 (Enzymatic assay of tyrosinase)

티로시나제 활성은 Miyazawa et al.(Reference 8)에 개시된 방법을 약간 수정한 방법에 따라 분석되었다. 즉, 0.03% L-티로신 100 ㎕ 와 67 mM 포스페이트 버퍼 (pH 7.0) 640 ㎕, 및 테스트 시료 용액 50 ㎕를 포함하는 반응혼합물을 37℃에서 10분간 미리배양하였다. 그리고나서, 67 mM 포스페이트 버퍼에서 용해시킨 60 U 버섯 티로시나제 용액 10 ml를 첨가하고, 96-웰 플레이트에서 반응 혼합물을 37℃에서 30분 동안 배양하였다.

티로시나제 활성은 다음의 식을 통하여 결정되었다.

티로시나제 활성 (%) = [(A-B)/(Cp-Cn)] ×100

(여기서, A는 테스트 시료 (67 mM 포스페이트 버퍼, L-티로신, 시료 용액 및 티로시나제)의 흡광도이고, B는 미지시료 (67 mM 포스페이트 버퍼, 증류수, 시료용액 및 티로시나제)의 흡광도이다. Cp는 양성 대조군 (67 mM 포스페이트 버퍼, L-티로신 및 티로시나제)의 흡광도이고, Cn은 음성대조군 (67 mM 포스페이트 버퍼, L-티로신 및 티로시나제)의 흡광도이다.

실험결과, 도2에서 나타낸 바와 같이, 알부틴 유도체 중에서 β-D- 글루코실-(1→3)-알부틴이 가장 높은 억제효과를 나타내었다. β-D-글루코실-(1→3)-알부틴의 IC₅₀값은 5 mM인 반면, 알부틴의 IC₅₀값은 6 mM로 나타났다 (표1). 여기서 IC(Inhibitory concentration)₅₀은 물질의 저해농도를 평가하는 기준으로 그 저해물질이 없을 때 100%저해한다고 한다면, 저해활성의 50%정도를 저해하는 데 해당하는 농도의 값을 나타내는 것이다. 따라서, β-D-글루코실-(1→3)-알부틴과 α-D-글루코실-(1→4)-알부틴의 티로신 억제 활성이 유사하게 나타남을 확인할 수 있다. 이로써 알부틴 글리코시드의 글리코시드 결합의 위치선택성이 티로시나제 억제에 관여하는 것으로 추정된다.

버섯에서 추출한 티로시나제에 대한 알부틴의 IC₅₀의 값

Compound	Inhibition at 10mM(%)	IC₅₀(mM)
Arbutin	66	6
β-D-glucopyranosyl-(1→3)-arbutin	74	5
β-D-glucopyranosyl-(1→4)-arbutin	69	5

<실시예 3>

B16F10 흑색종 세포에서 멜라닌 생산 억제 (Inhibition of melanin production in B16F10 melanoma cells)

B16F10 생쥐 흑색종 세포주는 한국 세포주 은행(KCLB, 서울, 대한민국)으로부터 입수하였고, 10% fetal bovine serum (FBS) (BioWhittaker)이 보충된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)배지 (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA), 5% CO₂를 포함하는 대기에서, 37℃로 배양하였다.

B16F10 세포는 60 mm 조직 배양 디쉬(Iwaki, Japan)에서 배양되었고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 2 ml를 유지하였다. 48 시간 후에 세포를 phosphate-buffered saline (PBS) (BioWhittaker)로 두번 세척한 뒤, 신선한 배지 2 ml를 공급하고, 200 nM 의 최종 농도에서 α-MSH와 처리하였다. 시료는 a dilution series (final concentrations: 1, 5, 10, 20 mM)로 디쉬에 분배하였다. 세포는 48 시간 후에 수확되었고, PBS 2 ml로 두번 세척하였다. 세포는 4℃에서 원심분리(1700× g)를 5분간 하여 수집되었고, 상등액을 제거하였다. 1 N NaOH (10% DMSO) 200 ㎕를 세포에 첨가하여 1시간동안 80℃에서 배양하였다. 소용돌이에 의하여 멜라닌이 용해된 후, 멜라닌 함량은 Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (Biotek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA)로 405 nm에서 결정되었다.

실험결과 도3에서 나타난 바와 같이, B16F10 흑색종 세포와 반응시킨 후 멜라닌 합성의 결과로서 B16F10 흑색종 세포 색소의 억제 정도는, β-D-글루코실-(1→3)-알부틴이 1-20 mM의 범위에서 가장 높은 억제효과를 나타내었고, 특히 멜라닌 합성은 5 mM에서 상당히 억제가 되며, 처리되지 않은 대조군 세포보다 약 70%가 감소되었다. 이는, β-D-글루코실-(1→3)-알부틴이 효과적으로 멜라닌 생산을 억제함을 입증하는 것이다.

<실시예 4>

독성 분석

B16F10 세포는 96-웰 조직 배양 플레이트(Nunc, USA)에서 배양되었고, 10% FBS를 포함하는 DMEM 200 ㎕에서 유지되었다. 48시간 후 세포를 PBS로 두 번 세척한 뒤, 신선한 배지 200 ㎕를 공급하고, 최종농도 200 nm로 α-MSH를 처리하였다. 시료는 PBS로 용해한 뒤, dilution series (final concentrations: 1, 5, 10, 20 mM)로 플레이트에 분배하였다. 48시간 후에 세포를 PBS로 두 번 세척한 뒤, 신선한 배지로 교체하였다. 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 용액 (5 mg/ml in PBS) 20 ㎕를 각각의 웰에 첨가한 다음, 12시간동안 37℃에서 추가적으로 배양하였다. 배지 제거 후, 세포를 DMSO 100 ㎕로 용해시키고, Synergy HT Multi-Detection Microplate Reader (Biotek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 570 nm에서 흡광도 측정을 통하여 MTT의 포마잔으로 변환을 정량화하였다.

그 결과 도4에서 나타난 바와 같이, B16F10 흑색종 세포와 반응시킨 후 멜라닌 합성의 결과로서 B16F10 흑색종 세포 색소의 독성효과와 관련하여, β-D-글루코실-(1→3)-알부틴은 20 mM 농도까지는 세포 생활력 (cell viability)이 거의 변화가 없음을 확인할 수 있었다.

<결과 및 토론>

Thermotoga neapolitana 로부터 β-글리코시다제의 글리코실전이반응은 본 연구에서 알부틴 β-글리코시드의 생산에 성공적으로 사용되었고, 알부틴 및 셀로비오스는 각각 수용체 및 공여체 분자로서 사용되었다. 알부틴 β-글리코시드의 합성은 TLC 와 HPAEC을 사용하여 확인하였다. 반복 준비 HPLC를 통한 정제는 백색 결정의 화합물 1, 2 및 3 (8.1 mg, 8.0 mg, 및 5.3 mg)을 첨가된 공여체에 기초해서 총 2.84%의 실수확률로 산출시켰다. 세 개의 정제된 알부틴 β-글리코시드의 NMR 분석은 세 화합물의 구조가 각각 β-D-글루코실-(1→6)-알부틴 (화합물 1), β-D-글루코실-(1→4)-알부틴 (화합물 2), 및 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴 (화합물 3)임을 보여준다 (Park et al. 2005) (도 1).

본 발명의 정제된 알부틴 β-글리코시드의 티로신 억제 효과를 조사하기 위하여, 버섯에서 추출한 티로시나제에 대한 세 개의 알부틴 β-글리코시드의 IC₅₀값을 기질로서 L-티로신을 사용하여 평가하였다. 평가된 알부틴 글리코시드와 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴사이에 버섯 티로시나제 상에서 가장 높은 억제효과가 입증되었다 (도2 참고). β-D-글루코실-(1→3)-알부틴의 IC₅₀ 값은 5 mM 이고, 반면에 알부틴의 값은 6 mM이었다 (표1). β-D-글루코실-(1→4)-알부틴 (β-D-글루코실-(1→4)-알부틴) 및 β-D-글루코실-(1→6)-알부틴의 IC₅₀ 값은 대조군으로 사용된 알부틴 및 α-D-글루코실-(1→4)-알부틴과 비교했을 때, 알부틴 및 α-D-글루코실-(1→4)-알부틴에서 관찰된 것보다, 버섯에서 추출한 티로시나제 상의 억제효과가 덜한 것으로 입증되었다.

인간의 티로시나제에 대한 α-알부틴 및 알부틴 α-글리코시드의 억제효과는 이미 연구되었다 (Sugimoto et al. 2003; Sugimoto et al. 2005). 이전 연구에서는 히드로퀴논-글리코시드의 α-글리코시드 연관은 사람의 티로시나제에 대한 억제효과에 필수적임을 보여, α-알부틴 및 알부틴 α-글리코시드는 알부틴과 비교하여 더 강한 억제활성을 입증함을 보여주었다. 분자 크기 및 억제자의 벤젠고리 주변의 정전기적 전위는 티로시나제 억제자의 억제효과 미치는 영향에 대한 알부틴 유도체의 농도 기능적 이론 계산 역시 제안되었다 (Sugimoto et al. 2005).

본 발명에 의한 티로시나제 억제 분석의 결과 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴이 α-글루코시드 연관을 갖고있는 α-D-글루코실-(1→4)-알부틴의 억제활성과 매우 유사한 억제활성을 가짐을 입증하였다. 반면에 다른 두 개의 알부틴 β-글리코시드인 β-D-글루코실-(1→4)-알부틴 및 β-D-글루코실-(1→6)-알부틴은 더 약한 억제 활성을 가짐을 입증하였다. 따라서 알부틴 글리코시드의 글리코시드 연관의 영역선택성이 티로시나제 억제자의 억제효과에 또한 연관되어 있다고 추정된다.

바람직한 피부 미백 조성물은 특히 티로시나제의 합성 또는 활성을 감소시킴으로써 멜라닌소체에서 멜라닌 합성을 억제하고, 낮은 세포독성을 보여주며, 비돌연변이원성이어야 한다. 멜라닌 합성 및 세포 독성의 억제를 평가하기 위해서 흑색종 세포를 사용하였고, 본 발명에서는 알부틴과 알부틴 β-글리코시드를 배양된 B16F10 흑색종 세포에 2일간 공급하였다. 멜라닌 합성의 결과로서 배양된 B16F10 흑색종 세포의 색소침착의 억제정도가 평가되었고 세포독성효과와 비교하였다. 이에 따른 멜라닌합성 억제는 도3에 나타내었다. 멜라닌의 세포 함량은 β-D-글루코실-(1→4)-알부틴의 경우를 제외하고, 알부틴 β-글리코시드를 배지에 용량 의존적 방식으로 첨가함을 통하여 감소되었다.

네 개의 시험된 알부틴 유도체 중, β-D-글루코실-(1→3)-알부틴은 1-20 mM의 범위 농도에서 가장 뛰어난 억제효과를 보였다. 멜라닌 합성은 특히 5 mM에서 억제되었다. 이 농도에서 아무처리도 하지 않은 세포에서 관찰할 때보다 멜라닌 함량이 70% 감소되었다. 멜라닌 형성에 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴의 상기 억제효과가 세포 성장의 저해의 결과로서 생길 수 있는 가능성을 배제하기 위하여, 이러한 화합물의 세포성장의 수를 비교하였다. 도4에 나타낸 바와 같이 이러한 화합물은 20mM 농도까지 세포생활력이 억제됨을 보이지 않았다. 반면에 β-D-글루코실-(1D→6)-알부틴은 상기 5 mM농도에서 높은 세포독성을 보였다. 본 연구에서 버섯에서 추출한 티로시나제의 억제활성의 결과와 흑색종 세포주에서 멜라닌 생산의 억제의 결과를 비교하여, β-D-글루코실-(1→3)-알부틴은 가장 효과적인 멜라닌형성 억제자임이 결정되었다.

또한 비록 알부틴 α-글리코시드 유도체를 사용한 티로시나제 억제활성 및 흑색종세포에서 멜라닌 합성의 억제에 관한 본 연구가 이미 수행되었다고 하더라도 (Sugimoto et al. 2004), 알부틴 β-글리코시드를 사용한 흑색종 세포에서 멜라닌 합성의 연구는 이전에 수행된 바 없으므로, 알부틴 β-글리코시드는 알부틴 α-글리코시드와 함께 유력한 멜라닌 합성 억제자로서 가치가 있다고 할 것이다. 효소반응을 통하여 단지 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴을 발생시키는 이러한 효소의 개발은 탈색 조성물로서 이 화합물의 산업화 가능성을 촉진시키기 위해 필요하다. 우리는 최근 특히 site-유도 돌연변이를 통하여 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴을 생성하는 돌연변이체를 생산하는데 성공했다. 돌연변이체는 야생형 효소와 비교해서 3-접힘에 의하여 이 화합물의 생산을 증가시켰다. 연구는 이 화합물의 최대산출을 위한 효소반응조건의 최적화를 목표로 한 연구가 현재 진행 중에 있다.

도1은 탄수화물효소인 베타-글루코사다아제를 이용하여 합성된 알부틴베타유도체인 β-D-글루코실-(1→6)-알부틴 (화합물 1), β-D-글루코실-(1→4)-알부틴 (화합물 2), 및 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴 (화합물 3)의 화학구조식이다.

도2는 L-티로신 기질에 대한 알부틴유도체의 티로시나제 활성에 대한 저해 효과를 강력한 티로시나제 저해제로 알려진 알부틴의 저해 효과와 비교하여 나타낸 그래프이다.

도3은 멜라닌생성세포를 이용하여 멜라닌 생성저해효과를 멜라닌 생성저해제로 알려진 알부틴의 멜라닌 생성 저해 효과와 비교하여 나타낸 그래프이다.

도4는 알부틴유도체의 세포독성 효과를 알부틴과 비교하여 나타낸 그래프이다.

단, 도2 내지 도4에서, (●) arbutin, (○) β-D-glucopyranosyl-(1→3)-arbutin, (▼) α-D-glucopyranosyl-(1→4)-arbutin 이다.

Claims

하기 화학식 1로 나타내어지는 알부틴베타 유도체인 β-D-글루코실-(1→3)-알부틴을 함유하는 피부미백용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 화장료인 것을 특징으로 하는 피부미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 의약인 것을 특징으로 하는 피부미백용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,

상기 알부틴베타 유도체 이외의 미백성분을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.