KR20090057383A - Targeted polymeric prodrugs containing multifunctional linkers - Google Patents
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Abstract
Description
본 출원은, 본 명세서에 참고로 통합되어 있는 미국 가특허 출원번호 제 60/844,943호의 우선권을 주장한다. This application claims the priority of US Provisional Patent Application No. 60 / 844,943, which is incorporated herein by reference.
많은 저분자량 항암제가 상당한 독성을 가지고 있음이 알려져 있다. 수년 동안, 저분자량 항암제의 독성을 감소시키고 효능을 향상시키기 위한 다양한 시도가 있었다. It is known that many low molecular weight anticancer drugs have significant toxicity. Over the years, various attempts have been made to reduce the toxicity and improve the efficacy of low molecular weight anticancer agents.
저분자량 약물의 독성을 감소시키고 효능을 향상시키기 위한 한가지 시도는 표적화제-유도 약물 전달 시스템(targeting agent-directed drug delivery system)으로 유도하는 것이다. 예를 들어, 단일 사슬 항체(single-chain antibody), RGD 펩티드 또는 폴산(folic acid)과 같은 표적화제는 치료제의 전달 및 상기 치료제의 치료 효능 향상을 유도할 수 있다. 동시에, 많은 효능있는 화학요법의 표적화 전달은 이의 독성을 감소시킬 것이다. 이런 접근은, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia; AML)을 위한 칼리케아미신 세포독소(calicheamicin cytotoxin)에 연결된 CD33에 대한 인간화된 항체인 Wyeth's Mylotarg® 겜쭈쭈맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin)의 FDA 승인에 의해 입증되었다. One attempt to reduce the toxicity and enhance the efficacy of low molecular weight drugs is to induce a targeting agent-directed drug delivery system. For example, targeting agents such as single-chain antibodies, RGD peptides or folic acid may lead to delivery of the therapeutic agent and improved therapeutic efficacy of the therapeutic agent. At the same time, targeted delivery of many potent chemotherapy will reduce its toxicity. This approach is, for example, Wyeth's Mylotarg ® gemtuzumab ozogamicin, a humanized antibody against CD33 linked to calicheamicin cytotoxin for acute myeloid leukemia (AML). Proven by FDA approval.
전형적으로, 면역접합체(immunoconjugate)는 3개의 구성요소인 단클론 항체 유사 표적화제, 세포독소 및 링커(linker)를 포함한다. Typically, immunoconjugates include three components, monoclonal antibody-like targeting agents, cytotoxins and linkers.
그러나, 이런 접근은 항체가 약물에 접합한 후 상기 항체의 항원에 대한 높은 수준의 결합 친화력을 유지하는 것을 요구한다. 게다가, 상기 항체-약물 컨쥬게이트(antibody-drug conjugate)는 완충용액 또는 혈장에서 안정적이고 순환 동안 독서를 조속히 방출되지 않아야 한다. 또한, 이들은 항체가 종양 세포 표면에서 항원을 결합하는 즉시 세포 내로 흡수되어야 한다. 그 후, 상기 약물 분자는 원하는 속도로 표적화된 종양 세포 내에서 직접 방출되어야 한다. However, this approach requires that the antibody maintains a high level of binding affinity for the antigen of the antibody after conjugation to the drug. In addition, the antibody-drug conjugate should be stable in buffer or plasma and not release the reading quickly during circulation. In addition, they must be taken up into the cells as soon as the antibody binds the antigen on the tumor cell surface. The drug molecule must then be released directly in the targeted tumor cell at the desired rate.
단일 사슬 항체(SCA) 또는 단일 사슬 항원 결합 항체는 전장 항체 크기의 단지 1/4을 가지는 전장 항체의 결합 도메인을 포함한다. 그러나, SCA는 항원에 대해 높은 친화력으로 특이적으로 결합할 수 있다. 단일 사슬 항원 결합 단백질의 이론 및 생산의 설명은, 예를 들어 일반적으로 승인된 미국 특허번호 제 4,946,778호, 제 5,260,203호, 제 5,455,030호 및 제 5,518,889호에서 찾을 수 있다. 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 상기 미국 특허에 기술된 공정으로 생산된 단일 사슬 항원 결합 단백질은 상응하는 Fab 단편과 유사한 결합 특이성 및 친화성을 가진다. 보다 최근에는, 일반적으로 승인된 미국 특허번호 제 6,872,393호가 폴리알킬렌 옥시드-변형된 단일 사슬 폴리펩티드(polyalkylene oxide-modified single chain polypeptide)를 밝혀내었다. 이들 일반적으로 승인된 특허의 각 내용은 참조로 본 명세서에 통합된다. Single chain antibodies (SCAs) or single chain antigen binding antibodies comprise the binding domain of full length antibodies having only one quarter of the full length antibody size. However, SCA can specifically bind with high affinity for the antigen. A description of the theory and production of single chain antigen binding proteins can be found, for example, in generally accepted US Pat. Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5,455,030 and 5,518,889. Single chain antigen binding proteins produced by the processes described in the above-mentioned US patents, the contents of which are incorporated herein by reference, have similar binding specificities and affinities as the corresponding Fab fragments. More recently, commonly accepted US Pat. No. 6,872,393 has revealed polyalkylene oxide-modified single chain polypeptides. Each content of these generally accepted patents is incorporated herein by reference.
이런 시도 및 진보에도 불구하고, 원하는 치료 활성 및 거의 없는 독성을 가지는 표적화제 유도 고분자 약물 전달 시스템을 제공하는 것이 계속 요구되고 있다. 본 발명은 이런 요구 및 그 외를 다룬다. Despite these attempts and advances, there is a continuing need to provide targeting agent-induced polymeric drug delivery systems with the desired therapeutic activity and little toxicity. The present invention addresses these needs and others.
본 발명의 요약Summary of the Invention
상기 문제를 해결하고 고분자 약물 전달을 위한 기술을 개선시키기 위해서, 본 발명은 표적화제(targeting agent) 및 페길화(PEGylation) 기술 뿐만 아니라 다른 개선된 치료 기술을 이용하는 새롭고 이로운 화합물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 가지 측면에 따라 하기 화학식(Ⅰ)의 화합물을 제공한다: In order to solve the above problems and to improve the technology for polymer drug delivery, the present invention provides new and beneficial compounds utilizing targeting agents and PEGylation techniques as well as other improved therapeutic techniques. Thus, according to one aspect of the present invention there is provided a compound of formula (I):
여기서:here:
R1은 실질적으로 비항원 수용성 고분자(non-antigenic water-soluble polymer)이고;R 1 is substantially a non-antigenic water-soluble polymer;
A는 캡핑기(capping group) 또는 A is the capping group or
;
각 D1은 독립적으로 표적화 부분(targeting moiety), 작용기(functional group) 및 이탈기(leaving group)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며; Each D 1 is independently selected from the group consisting of a targeting moiety, a functional group and a leaving group;
각 D2는 독립적으로 생물학적 활성 부분(biologically active moiety), 작용기(functional group) 및 이탈기(leaving group)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며; Each D 2 is independently selected from the group consisting of a biologically active moiety, a functional group and a leaving group;
각 L1은 독립적으로 선택되는 영구적인 링커(permanent linker) 또는 해리가능 링커(releasable linker)이며; Each L 1 is an independently selected permanent linker or releasable linker;
L2는 다기능성 링커(multifunctional linker)이며; L 2 is a multifunctional linker;
각 L3는 독립적으로 선택되는 영구적인 링커 또는 해리가능 링커이며; 및 Each L 3 is an independently selected permanent linker or dissociable linker; And
(a) 및 (b)는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0 또는 1이다.(a) and (b) are independently 0 or a positive integer, preferably 0 or 1.
본 발명의 한가지 측면에 있어서, 상기 고분자 잔기는 다기능성 링커에 의해 연결된 해리가능 링커 및 연구적인 링커를 통해 작은 약물 분자 및 단일 사슬 항체(SCA)에 접합될 수 있는 폴리에틸렌 옥시드이다. 이런 식으로, 작은 분자 세포독성 화합물의 표적화 전달을 위한 SCA-PEG-링커-약물 전달 기반을 제공하기 위한 화합물을 제공한다. 또한, 이는 접합 부위(attaching site) 마다 작은 분자 및 SCA의 적재가 전형적인 SCA 약물 컨쥬게이트 보다 높은 이점이 있다. 따라서, 이는 비용 효율적이고, 낮은 비용이며, 표적화된 SCA 전구약물을 제공할 수 있다. 게다가, 본 발명의 상기 전구약물은, 예를 들어 원하는 경우 적절한 링커를 이용함으로써 순환 반감기(circulating half-life)를 증가시키는 등의 순환 반감기를 조절하는 방법을 제공한다. In one aspect of the invention, the polymeric moiety is a polyethylene oxide that can be conjugated to small drug molecules and single chain antibodies (SCA) via dissociable linkers and research linkers linked by multifunctional linkers. In this way, compounds are provided to provide an SCA-PEG-linker-drug delivery basis for targeted delivery of small molecule cytotoxic compounds. In addition, this has the advantage that the loading of small molecules and SCA per attaching site is higher than that of a typical SCA drug conjugate. Thus, it can provide a cost effective, low cost, targeted SCA prodrug. In addition, the prodrugs of the present invention provide a method of controlling circulating half-life, such as increasing circulating half-life, for example by using an appropriate linker, if desired.
본 발명의 한가지 일반적인 측면에서, 하기의 구조로 개략적으로 기재될 수 있으나 이에 한정되지 않는다: In one general aspect of the invention, it may be outlined by the following structure, but not limited to:
여기서 PEG는 중심에 위치한 다기능성 링커를 통해 SCA 및 세포독성제와 같은 약물에 접합되고; 상기 SCA를 가지는 링커는 영구적인 반면에, 세포독성제를 가지는 링커는 해체 가능하며 혈액에서 안정적이 되는 것으로 설계될 수 있으나 부위 특이적 효소(site specific enzyme)의 존재 하에서 용이하게 분해될 수 있다. Wherein PEG is conjugated to drugs such as SCA and cytotoxic agents via a centrally located multifunctional linker; The linker with the SCA is permanent while the linker with the cytotoxic agent can be designed to be disassembleable and stable in the blood, but can be readily degraded in the presence of site specific enzymes.
한가지 바람직한 측면에 있어서, 상기 SCA는 말레이미도기(maleimide group)를 포함하는 것과 같은 영구적인 링커를 통해 접합되고, 상기 세포독성제는 캡세신 B(capthesin B)에 의해 특이적으로 분해될 수 있는 펩티딜 링커(Val-Cit)와 같은 해리가능 링커를 통해 접합된다. 한가지 바람직한 실시예에 있어서, 상기 세포독성제는 SN38이다. In one preferred aspect, the SCA is conjugated via a permanent linker, such as comprising a maleimide group, and the cytotoxic agent can be specifically degraded by capthesin B. It is conjugated via a dissociable linker such as peptidyl linker (Val-Cit). In one preferred embodiment, the cytotoxic agent is SN38.
본 발명의 또 다른 측면은 다기능성 링커를 포함하는 활성화된 고분자를 제조하는 방법, 상기 고분자를 포함하는 컨쥬게이트를 제조하는 방법, 및 유효한 양의 생물학적 활성 부분을 포함하는 컨쥬게이트를 이를 요구하는 환자(포유류)에게 투여하는 것을 근거로 하는 치료 방법을 포함한다. Another aspect of the invention provides a method of making an activated polymer comprising a multifunctional linker, a method of making a conjugate comprising the polymer, and a patient in need thereof a conjugate comprising an effective amount of a biologically active moiety. It includes the method of treatment based on administration to (mammal).
본 발명의 한가지 이점은 본 명세서에 기재된 고분자 전달 시스템이 안정적이고 이에 약물의 생물학적 이용가능성을 증가시킨다. One advantage of the present invention is that the polymer delivery system described herein is stable and thus increases the bioavailability of the drug.
본 발명의 또 다른 이점은 상기 고분자 전달 시스템이 표적화된 종양 세포 내에서 직접 약물을 방출할 수 있는 것이다. Another advantage of the present invention is that the polymer delivery system can release the drug directly in the targeted tumor cells.
본 발명의 또 다른 이점은 상기 약물의 방출 속도가 원하는 속도를 달성하기 위해 변형될 수 있다. Another advantage of the present invention is that the release rate of the drug can be modified to achieve the desired rate.
본 발명에 상응하는 고분자 시스템의 또 다른 이점은, 저분자량 약물 및 안티센스, 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 LNA 화합물과 같은 올리고뉴클레오티드용으로 적절한 것이다. Another advantage of the polymer system corresponding to the present invention is that it is suitable for low molecular weight drugs and oligonucleotides such as antisense, small interfering RNA (siRNA) or LNA compounds.
그 외 추가적인 이점은 하기에 의해 명백해질 수 있을 것이다.Further advantages may be evident by the following.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "잔기(residue)"는 또 다른 화합물과 치환 반응이 진행된 후 남은 화합물의 일부, 즉 세포독소, SN38, 영구적인 링커, 다기능성 링커, 해리가능 링커 등을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.For the purposes of the present invention, the term "residue" means a portion of a compound remaining after a substitution reaction with another compound, i.e., cytotoxin, SN38, permanent linker, multifunctional linker, dissociable linker and the like. It can be understood that.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "고분자 잔기(polymeric residue)" 또는 "PEG 잔기(PEG residue)"는 다른 화합물 또는 부분 등과 반응을 진행한 후 남은 고분자 또는 PEG의 일부를 의미하는 것으로 이해될 수 있다.For the purposes of the present invention, the term "polymeric residue" or "PEG residue" may be understood to mean a portion of the polymer or PEG remaining after reaction with another compound or moiety. .
본 발명의 목적을 위해, 치환된 알킬(substituted alkyl)은 카르복시알킬(carboxyalkyl), 아미노알킬(aminoalkyl), 디알킬아미노(dialkylamino), 하이드록시알킬(hydroxyalkyl) 및 멀캅토알킬(mercaptoalkyl)을 포함하고; 치환된 알케닐(substituted alkenyl)은 카르복시알케닐(carboxyalkenyl), 아미노알케닐(aminoalkenyl), 디알케닐아미노(dialkenylamino), 하이드록시알케닐(hydroxyalkenyl) 및 멀캅토알케닐(mercaptoalkenyl)을 포함하며; 치환된 알키닐(substituted alkynyl)은 카르복시알키닐(carboxyalkynyl), 아미노알키닐(aminoalkynyl), 디알키닐아미노(dialkynylamino), 하이드록시알키닐(hydroxyalkynyl) 및 멀갑토알키닐(mercaptoalkynyl)을 포함하며; 치환된 사이클로알킬(substituted cycloalkyl)은 4-클로로사이클로헥실(4-chlorocyclohexyl)과 같은 부분을 포함하며; 아릴(aryl)은 나프틸(napthyl)과 같은 부분을 포함하며; 치환된 아릴(substituted aryl)은 3-브로모 페닐(3-bromo phenyl)과 같은 부분을 포함하며; 아랄킬(aralkyl)은 톨릴(tolyl)과 같은 부분을 포함하며; 헤테로알킬(heteroalkyl)은 에틸티오펜(ethylthiophene)과 같은 부분을 포함하며; 치환된 헤테로알킬(substituted heteroalkyl)은 3-메톡시-티오펜(3-methoxy-thiophene)을 포함하며; 알콕시(alkoxy)는 메톡시(methoxy)와 같은 부분을 포함하며; 및 페녹시(phenoxy)는 3-니트로페녹시(3-nitrophenoxy)와 같은 부분을 포함한다. 할로(Halo)는 플루오로(fluoro), 클로로(chloro), 아이오도(iodo) 및 브로모(bromo)를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.For the purposes of the present invention, substituted alkyl includes carboxyalkyl, aminoalkyl, dialkylamino, hydroxyalkyl and mercaptoalkyl ; Substituted alkenyls include carboxyalkenyl, aminoalkenyl, dialkenylamino, hydroxyalkenyl and mercaptoalkenyl; Substituted alkynyls include carboxyalkynyl, aminoalkynyl, diallkynylamino, hydroxyalkynyl and mercaptoalkynyl; Substituted cycloalkyls include moieties such as 4-chlorocyclohexyl; Aryl includes moieties such as napthyl; Substituted aryl includes moieties such as 3-bromo phenyl; Aralkyl includes moieties such as tolyl; Heteroalkyl includes moieties such as ethylthiophene; Substituted heteroalkyls include 3-methoxy-thiophene; Alkoxy includes moieties such as methoxy; And phenoxy includes moieties such as 3-nitrophenoxy. Halo can be understood to include fluoro, chloro, iodo and bromo.
본 발명의 목적을 위해, "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 다른 특정이 없다면 단일 가닥 또는 이중 가닥의 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이들의 화학적 변형을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. For the purposes of the present invention, "nucleic acid" or "nucleotide" can be understood to include single or double stranded deoxyribonucleic acid (DNA), ribonucleic acid (RNA) and chemical modifications thereof unless otherwise specified.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "생물학적 활성 부분" 및 "생물학적 활성 부분의 잔기"는 생물학적 활성 화합물이 수송 담체 부분(transport carrier portion)이 접합되는 치환 반응을 진행한 후 남은 생물학적 활성 화합물의 부분을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. For the purposes of the present invention, the terms "biologically active moiety" and "residue of biologically active moiety" refer to the portion of the biologically active compound remaining after the biologically active compound undergoes a substitution reaction in which the transport carrier portion is conjugated. It can be understood as meaning.
본 명세서의 설명의 이해를 위해, 용어 "생물학적 활성 부분"는 "약물", "세포독성제" 또는 "세포독소"로 교환하여 사용할 수 있는 것으로 이해될 것이나, 이에 한정되지 않는다.For the purpose of understanding the description herein, the term “biologically active moiety” will be understood to be interchangeable with “drug”, “cytotoxic agent” or “cytotoxin”, but is not limited thereto.
본 명세서의 설명의 이해를 위해, 용어 "작은 분자"는 "약학적으로 유효한 화합물"로 교환하여 사용할 수 있는 것으로 이해될 것이나, 이에 한정되지 않는다.For the purpose of understanding the description herein, the term “small molecule” will be understood to be interchangeable with “pharmaceutically effective compound”, but is not limited thereto.
다른 정의가 기재되어 있지 않은 경우, 본 발명의 목적을 위해:Unless otherwise defined, for the purposes of the present invention:
용어 "알킬"은 직쇄형, 분지형, 치환된, 예를 들어 할로-, 알콕시 및 니트로- C1-12 알킬, C3-8 사이클로알킬 또는 치환된 사이클로알킬 등을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.The term “alkyl” may be understood to include straight chain, branched, substituted, for example halo-, alkoxy and nitro-C 1-12 alkyl, C 3-8 cycloalkyl or substituted cycloalkyl, and the like. .
용어 "치환된"은 작용기 또는 하나 이상의 다른 원자를 가지는 화합물 내에 포함된 하나 이상의 원자를 부가 또는 대체하는 것으로 이해될 수 있다. The term "substituted" can be understood as adding or replacing one or more atoms included in a compound having a functional group or one or more other atoms.
용어 "치환된 알킬"은 카르복시알킬, 아미노알킬, 디알킬아미노, 하이드록시알킬 및 멀캅토알킬을 포함한다.The term "substituted alkyl" includes carboxyalkyl, aminoalkyl, dialkylamino, hydroxyalkyl and mercaptoalkyl.
용어 "치환된 사이클로알킬"은 4-클로로사이클로헥실(4-chlorocyclohexyl)과 같은 부분을 포함하고; 아릴은 나프틸(napthyl)과 같은 부분을 포함하며; 치환된 아릴은 3-브로모페닐(3-bromophenyl)과 같은 부분을 포함하며; 아랄킬은 톨루일(toluyl)과 같은 부분을 포함하며; 헤테로알킬은 에틸티오펜(ethylthiophene)과 같은 부분을 포함한다. The term “substituted cycloalkyl” includes moieties such as 4-chlorocyclohexyl; Aryl includes moieties such as napthyl; Substituted aryl includes moieties such as 3-bromophenyl; Aralkyl includes moieties such as toluyl; Heteroalkyl includes moieties such as ethylthiophene.
용어 "치환된 헤테로알킬"은 3-메톡시티오펜(3-methoxythiophene)과 같은 부분을 포함하고; 알콕시는 메톡시와 같은 부분을 포함하며; 페녹시는 3-니트로페녹시(3-nitrophenoxy)와 같은 부분을 포함한다. The term “substituted heteroalkyl” includes moieties such as 3-methoxythiophene; Alkoxy includes moieties such as methoxy; Phenoxy includes moieties such as 3-nitrophenoxy.
용어 "할로"는 플루오로, 클로로, 아이오도 및 브로모를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.The term "halo" can be understood to include fluoro, chloro, iodo and bromo.
본 발명의 목적을 위한, 용어 "충분한 양" 및 "유효한 양"은 당업자에 의해 이해될 수 있는 치료 효과를 달성하는 양을 의미하는 것으로 이해될 수 있다.For the purposes of the present invention, the terms “sufficient amount” and “effective amount” may be understood to mean an amount that achieves a therapeutic effect that can be understood by one skilled in the art.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
A. 개요A. Overview
본 발명의 한가지 측면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식(Ⅰ)의 화합물을 제공한다:In one aspect of the invention, the invention provides a compound of formula (I):
여기서:here:
R1은 실질적으로 비항원 수용성 고분자(non-antigenic water-soluble polymer)이고;R 1 is substantially a non-antigenic water-soluble polymer;
A는 캡핑기(capping group) 또는 A is the capping group or
각 D1은 독립적으로 표적화 부분(targeting moiety), 작용기(functional group) 및 이탈기(leaving group)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며; Each D 1 is independently selected from the group consisting of a targeting moiety, a functional group and a leaving group;
각 D2는 독립적으로 생물학적 활성 부분(biologically active moiety), 작용기(functional group) 및 이탈기(leaving group)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며; Each D 2 is independently selected from the group consisting of a biologically active moiety, a functional group and a leaving group;
각 L1은 독립적으로 선택되는 영구적인 링커(permanent linker) 또는 해리가능 링커(releasable linker)이며; Each L 1 is an independently selected permanent linker or releasable linker;
L2는 다기능성 링커(multifunctional linker)이며; L 2 is a multifunctional linker;
각 L3는 독립적으로 선택되는 영구적인 링커 또는 해리가능 링커이며; 및 Each L 3 is an independently selected permanent linker or dissociable linker; And
(a) 및 (b)는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0 또는 1이다.(a) and (b) are independently 0 or a positive integer, preferably 0 or 1.
본 발명의 한가지 바람직한 측면에 있어서, 표적화된 고분자 전달 시스템은 하기 화학식을 가지는 화합물들을 포함한다:In one preferred aspect of the invention, the targeted polymer delivery system comprises compounds having the formula:
여기서,here,
R2 및 R'2는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-19 분지된 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C2-6 치환된 알케닐, C2-6 치환된 알키닐, C3-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1-6 헤테로알킬, 치환된 C1-6 헤테로알킬, C1-6 알콕시, 아릴옥시, C1-6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 알카노일옥시 및 아릴카르보닐옥시로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며; R 2 and R ′ 2 are independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 3-19 branched alkyl, C 3-8 cycloalkyl, C 1-6 Substituted alkyl, C 2-6 substituted alkenyl, C 2-6 substituted alkynyl, C 3-8 substituted cycloalkyl, aryl, substituted aryl, heteroaryl, substituted heteroaryl, C 1-6 hetero Alkyl, substituted C 1-6 heteroalkyl, C 1-6 alkoxy, aryloxy, C 1-6 heteroalkoxy, heteroaryloxy, C 2-6 alkanoyl, arylcarbonyl, C 2-6 alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, C 2-6 alkanoyloxy, arylcarbonyloxy, C 2-6 substituted alkanoyl, substituted arylcarbonyl, C 2-6 substituted alkanoyloxy, substituted aryloxycarbonyl, C 2-6 substituted alkanoyloxy, substituted alkanoyloxy and arylcarbonyloxy;
(c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c''6), (c7) 및 (c8)은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0 또는 약 1 내지 10의 양의 정수이며 더 바람직하게 0, 1 또는 2이며; 및(c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c''6), (c7) and (c8) are independently 0 or positive Is an integer of, preferably 0 or a positive integer of about 1 to 10, more preferably 0, 1 or 2; And
(d1), (d2), (d3), (d4), (d5) 및 (d7)은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0 또는 약 1 내지 10의 양의 정수이며 더 바람직하게 0, 1 또는 2이며; 및(d1), (d2), (d3), (d4), (d5) and (d7) are independently 0 or a positive integer, preferably 0 or a positive integer of about 1 to 10 and more preferably 0 , 1 or 2; And
모든 다른 변수는 이전에 정의된 바와 같다.All other variables are as previously defined.
또 다른 측면에 있어서, 본 명세서에 기재된 고분자 시스템은 CH3 기로 둘 중 하나의 말단에 캡핑(capping)된, 즉 mPEG인 반면에, 또 다른 실시예에 있어서, 두개의 활성화된 PEG(bis-activated PEG)가 하기 화학식에 상응하는 것들과 같이 제공된다:In another aspect, the polymeric system described herein is mPEG capped at one end of the two with a CH 3 group, ie mPEG, while in another embodiment, two activated PEG (bis-activated) PEG) is provided as corresponding to the formula:
다른 선택적인 캡핑기는 H, NH2, OH, CO2H, C1-6 말콕시 및 C1-6 알킬을 포함한다. 바람직한 캡핑기는 메톡시 및 메틸를 포함한다. Other optional capping groups include H, NH 2 , OH, CO 2 H, C 1-6 malcoxyl and C 1-6 alkyl. Preferred capping groups include methoxy and methyl.
본 발명의 대부분의 측면에 있어서, 본 명세서에 포함되는 고분자는 일반적으로 실질적 비항원성 고분자(substantially non-antigenic polymer)로 기재된다. 이런 고분자의 종류로는, 폴리알킬렌 옥시드가 바람직하고 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 더욱 바람직하다. 본 명세서의 설명의 이해를 위해, 본 발명은 때때로 프로토티피칼 고분자(prototypical polymer)와 같은 PEG를 이용하여 기재하고 있으나, 이에 한정되지 않는다. 그러나, 본 발명의 범위는 선형, 실질적인 선형, 분지형 등일 수 있는 다양한 범위의 고분자가 적용될 수 있는 것으로 이해될 수 있다. In most aspects of the invention, the polymers encompassed herein are generally described as substantially non-antigenic polymers. As a kind of such a polymer, polyalkylene oxide is preferable, and polyethylene glycol (PEG) is more preferable. For the purpose of understanding the description herein, the invention is sometimes described using, but not limited to, a PEG such as a prototypical polymer. However, it is to be understood that the scope of the present invention may be applied to a wide range of polymers, which may be linear, substantially linear, branched, and the like.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 생물학적 활성 부분는 -NH2 포함 부분, -OH 포함 부분 및 -SH 포함 부분을 포함한다.In another aspect of the invention, the biologically active moiety comprises a -NH 2 containing moiety, a -OH containing moiety and a -SH containing moiety.
B. 다기능성 링커(LB. Multifunctional Linker (L 22 ))
본 발명의 구조의 관점에 있어서, 다기능성 링커는 3개 이상의 구성 요소, 즉 표적화제, 고분자 및 SN38 유사 생물학적 활성 세포독성 화합물을 접합시키는 것(해체가능하거나 영구적인)을 허용한다. 당업자는 적어도 3개의 작용기를 포함하는 다른 분자도 이용될 수 있는 것을 고려할 수 있다. 한가지 바람직한 다기능성 링커는 아스파르트산(aspartic acid) 또는 라이신(lysine)의 잔기일 수 있다. In terms of the structure of the present invention, the multifunctional linker allows for conjugation (permanent or permanent) of three or more components, namely targeting agents, polymers and SN38 like biologically active cytotoxic compounds. Those skilled in the art can contemplate that other molecules comprising at least three functional groups can also be used. One preferred multifunctional linker may be a residue of aspartic acid or lysine.
적어도 3개의 기능성 부위를 가지는 L2는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다:L 2 having at least three functional moieties can be selected from the group consisting of:
여기서here
R2 및 R'2는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-19 분지화 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C2-6 치환된 알케닐, C2-6 치환된 알키닐, C3-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1-6 헤테로알킬, 치환된 C1-6 헤테로알킬, C1-6 알콕시, 아릴옥시, C1-6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 알카노일옥시 및 아릴카르보닐옥시로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며; R 2 and R ′ 2 are independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 3-19 branched alkyl, C 3-8 cycloalkyl, C 1-6 Substituted alkyl, C 2-6 substituted alkenyl, C 2-6 substituted alkynyl, C 3-8 substituted cycloalkyl, aryl, substituted aryl, heteroaryl, substituted heteroaryl, C 1-6 hetero Alkyl, substituted C 1-6 heteroalkyl, C 1-6 alkoxy, aryloxy, C 1-6 heteroalkoxy, heteroaryloxy, C 2-6 alkanoyl, arylcarbonyl, C 2-6 alkoxycarbonyl, Aryloxycarbonyl, C 2-6 alkanoyloxy, arylcarbonyloxy, C 2-6 substituted alkanoyl, substituted arylcarbonyl, C 2-6 substituted alkanoyloxy, substituted aryloxycarbonyl, C 2-6 substituted alkanoyloxy, substituted alkanoyloxy and arylcarbonyloxy;
(c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c''6), (c7) 및 (c8)은 이전에 정의된 바와 같고; 및(c1), (c2), (c3), (c4), (c5), (c6), (c'6), (c''6), (c7) and (c8) are as previously defined. Equal to; And
(d1), (d2), (d3), (d4), (d5) 및 (d7)은 이전에 정의된 바와 같다.(d1), (d2), (d3), (d4), (d5) and (d7) are as previously defined.
바람직한 실시예는 하기를 포함한다:Preferred examples include the following:
C. 실질적 비항원성 수용성 고분자(RC. Substantially non-antigenic water soluble polymer (R 1One ))
본 발명의 전구약물은 고분자 잔기 R1, 바람직하게 수용성 및 실질적 비항원성 고분자를 포함한다. 이런 고분자의 적절한 예시는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥시드(PAO)를 포함한다. 특정 바람직한 고분자는 mPEG과 같은 폴리에틸렌 글리콜이다. 이런 고분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥시드 단성중합체(polyalkylene oxide homopolymer), 폴리옥시에틸레네이트 폴리올(polyoxyethylenated polyol), 이들의 혼성중합체(copolymer) 및 이들의 블록혼성중합체(block copolymer)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. Prodrugs of the invention comprise a polymer moiety R 1 , preferably a water soluble and substantially non-antigenic polymer. Suitable examples of such polymers include polyalkylene oxides (PAO) such as polyethylene glycol. Particularly preferred polymers are polyethylene glycols such as mPEG. Such polymers include polyalkylene oxide homopolymers such as polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol, polyoxyethylenated polyols, their copolymers, and block hybrids thereof. Block copolymers include but are not limited to these.
본 명세서에 기재된 화합물의 고분자 부분은 약 2,000 내지 약 100,000 달톤(dalton), 바람직하게 약 5,000 내지 약 60,000 달톤의 평균 분자량을 가진다. 일부 측면에 있어서, 폴리알킬렌 옥시드는 단백질 또는 올리고뉴클레오티드가 첨부되는 경우 약 5,000 내지 25,000 달톤, 바람직하게 약 12,000 내지 약 20,000 달톤이 될 수 있거나, 또는 약학적 활성 화합물(약 1,500 달톤 이하의 평균 분자량을 가지는 작은 분자)이 본 명세서의 화합물에 적용되는 경우 약 20,000 내지 45,000 달톤, 바람직하게 약 30,000 내지 약 40,000 달톤이 될 수 있다. The polymer portion of the compounds described herein has an average molecular weight of about 2,000 to about 100,000 daltons, preferably about 5,000 to about 60,000 daltons. In some aspects, the polyalkylene oxide may be about 5,000 to 25,000 Daltons, preferably about 12,000 to about 20,000 Daltons, when a protein or oligonucleotide is attached, or a pharmaceutically active compound (average molecular weight of about 1,500 Daltons or less) Small molecules) may be from about 20,000 to 45,000 Daltons, preferably from about 30,000 to about 40,000 Daltons when applied to the compounds herein.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)는 일반적으로 하기의 구조로 나타내어진다:Polyethylene glycol (PEG) is generally represented by the following structure:
-O-(CH2CH2O)n--O- (CH 2 CH 2 O) n-
여기서 (n)은 약 10 내지 약 2,300의 양의 정수이고, 이는 다분지 고분자(multi-arm polymer)가 이용되는 경우 고분자 분지(arm)의 수에 의존한다. 수용성 고분자는 링커에 접합하기 위해 기능화될 것으로 이해될 것이다. Wherein (n) is a positive integer from about 10 to about 2,300, which depends on the number of polymer arms when a multi-arm polymer is used. It will be appreciated that the water soluble polymer will be functionalized to conjugate to the linker.
또한, 본 발명의 폴리에킬렌 글리콜 잔기 부분은 하기의 구조로 나타내어질 수 있다: In addition, the polyethylene glycol moiety moiety of the present invention may be represented by the following structure:
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2Y71- , -Y 71 - (CH 2 CH 2 O) n -
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y72)-Y71- , -Y 71 - (CH 2 CH 2 O) n -CH 2 C (= Y 72) -Y 71 -,
-Y71-C(=Y72)-(CH2)a71-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a71-C(=Y72)-Y71- , -Y 71 -C (= Y 72) - (CH 2) a71 -Y 73 - (
-Y71-(CR71R72)a72-Y73-(CH2)b71-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b71-Y73-(CR71R72)a72-Y71- , -Y 71 - (CR 71 R 72 ) a72 -Y 73 - (CH 2) b71 -O- (
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2CH2- , -Y 71 - (CH 2 CH 2 O) n -
-Y71-(CH2CH2O)n-CH2C(=Y72)- , -Y 71 - (CH 2 CH 2 O) n -CH 2 C (= Y 72) -,
-C(=Y72)-(CH2)a71-Y73-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a71-C(=Y72)- , 및 -C (= Y 72) - ( CH 2) a71 -Y 73 - (
-(CR71R72)a72-Y73-(CH2)b71-O-(CH2CH2O)n-(CH2)b71-Y73-(CR71R72)a72- , - (CR 71 R 72) a72 -Y 73 - (CH 2) b71 -O- (
여기서:here:
Y71 및 Y73은 독립적으로 O, S, SO, SO2, NR73 또는 결합(bond)이고;Y 71 and Y 73 are independently O, S, SO, SO 2 , NR 73 or a bond;
Y72는 O, S, 또는 NR74이며;Y 72 is O, S, or NR 74 ;
R71-74는 독립적으로 R2로 사용될 수 있는 부분들와 동일하며; R 71-74 are independently the same as the moieties which can be used as R 2 ;
(a71), (a72), 및 (b71)은 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0 내지 6, 더 바람직하게 1이며; 및(a71), (a72), and (b71) are independently 0 or a positive integer, preferably 0 to 6, more preferably 1; And
(n)은 약 10 내지 약 2,300의 양의 정수이다.(n) is a positive integer from about 10 to about 2,300.
한가지 실시예로서, PEG는 하기의 비제한적인 방식으로 기능화될 수 있다:As an example, PEG can be functionalized in the following non-limiting ways:
-C(=Y74)-(CH2)m-(CH2CH2O)n-,-C (= Y 74 )-(CH 2 ) m- (CH 2 CH 2 O) n- ,
-C(=Y74)-Y-(CH2)m-(CH2CH2O)n-,-C (= Y 74 ) -Y- (CH 2 ) m- (CH 2 CH 2 O) n- ,
-C(=Y74)-NR11-(CH2)m-(CH2CH2O)n- ,-C (= Y 74 ) -NR 11- (CH 2 ) m- (CH 2 CH 2 O) n- ,
-CR75R76-(CH2)m-(CH2CH2O)n- -CR 75 R 76 - (CH 2 ) m - (
여기서here
R75 및 R76은 독립적으로 H, C1-6 알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, 헤테로알킬, 치환된 헤테로알킬 및 치환된 C1-6 알킬로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며; R 75 and R 76 are independently selected from the group consisting of H, C 1-6 alkyl, aryl, substituted aryl, aralkyl, heteroalkyl, substituted heteroalkyl and substituted C 1-6 alkyl;
m은 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 1이며; m is 0 or a positive integer, preferably 1;
Y74는 O 또는 S이며; 및 Y 74 is O or S; And
n은 고분자화의 수준을 나타낸다. n represents the level of polymerisation.
본 발명의 전구약물은 본 명세서에 기재된 실질적 비항원성 고분자를 이용하여 형성될 수 있음에도 불구하고, 일부 바람직한 폴리알킬렌 옥시드는 하기를 포함한다: Although prodrugs of the present invention may be formed using the substantially non-antigenic polymer described herein, some preferred polyalkylene oxides include:
CH3O-PEG-O-(CH2)m-CO2H;CH 3 O-PEG-O- (CH 2 ) m -CO 2 H;
PEG-NHS;PEG-NHS;
CH3O-PEG-O-(CH2)m-NR11R12; andCH 3 O-PEG-O- (CH 2 ) m -NR 11 R 12 ; and
CH3O-PEG-O-(CH2)2 -S-(CH2)m-CO2H; CH 3 O-PEG-O- (CH 2 ) 2 -S- (CH 2 ) m -CO 2 H;
SC-PEG; 또는SC-PEG; or
당업계에 인지되는 활성화된 PEG.Activated PEG as recognized in the art.
특히, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 단일 활성화된, 단일 메틸 말단의 폴리에틸렌 글리콜(mono-methyl-terminated polyethylene glycol; mPEG)과 같은 C1-4 알킬 말단의 PAO는 단일 치환된 고분자가 요구되는 경우 바람직하며; 이중 활성화된 폴리에틸렌 옥시드는 2개의 치환된 전구약물이 요구되는 경우 바람직하다. In particular, C 1-4 alkyl terminated PAOs such as polyethylene glycol (PEG), single activated, single methyl terminated polyethylene glycol (mPEG) are preferred when a single substituted polymer is desired. ; Double activated polyethylene oxides are preferred when two substituted prodrugs are required.
원하는 결합을 제공하기 위해서, PEG 산(acid) 또는 PEG 이산(diacid)과 같은 단일 또는 이산 활성화된 고분자가 이용된다. 적절합 PAO 산은 mPEG-OH를 에틸 에스테르로 전환함으로써 합성될 수 있다. 또한, Gehrhardt, H., et al. Polymer Bulletin 18: 487 (1987) 및 Veronese, F.M., et al., J. Controlled Release 10; 145 (1989)을 참조해라. 또한, PAO 산은 mPEG-OH를 t-부틸 에스테르로 전환함으로써 합성될 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 승인된 미국 특허번호 제 5,605,976호 및 미국 특허번호 제 5,965,566호를 참조해라. 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다. To provide the desired bond, single or diacid activated polymers such as PEG acid or PEG diacid are used. Suitable PAO acids can be synthesized by converting mPEG-OH to ethyl esters. See also Gehrhardt, H., et al. Polymer Bulletin 18: 487 (1987) and Veronese, FM, et al., J. Controlled
분지된 또는 U-PEG 유도체는 미국 특허번호 제 5,643,575호, 제 5,919,455호, 제 6,113,906호 및 제 6,566,506호에 기재되어 있으며, 이들의 내용은 본 명세서에 참조로 통합된다. 이런 고분자는 하기의 구조를 가지는 고분자 시스템(i) - (vii)에 상응하나 이에 한정되지 않는다: Branched or U-PEG derivatives are described in US Pat. Nos. 5,643,575, 5,919,455, 6,113,906 and 6,566,506, the contents of which are incorporated herein by reference. Such polymers correspond to, but are not limited to, polymer systems (i)-(vii) having the structure:
여기서:here:
Y61-62는 독립적으로 O, S 또는 NR61이고;Y 61-62 is independently O, S or NR 61 ;
Y63는 O, NR62, S, SO 또는 SO2이며;Y 63 is O, NR 62 , S, SO or SO 2 ;
(w62), (w63) 및 (w64)는 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게 약 0 또는 약 10이며, 더 바람직하게 약 1 내지 약 6이며;(w62), (w63) and (w64) are independently 0 or a positive integer, preferably about 0 or about 10, more preferably about 1 to about 6;
(w61)는 0 또는 1이며;(w61) is 0 or 1;
mPEG는 메톡시 PEG이며mPEG is methoxy PEG
여기서 PEG는 이전에 정의된 바와 같고, 고분자 부분의 총 분자량은 약 2,000 내지 약 100,000 달톤이며; 및Wherein PEG is as previously defined and the total molecular weight of the polymer portion is about 2,000 to about 100,000 Daltons; And
R61 및 R62는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-19 분지화 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C2-6 치환된 알케닐, C2-6 치환된 알키닐, C3-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C1-6 헤테로알킬, 치환된 C1-6 헤테로알킬, C1-6 알콕시, 아릴옥시, C1-6 헤테로알콕시, 헤테로아릴옥시, C2-6 알카노일, 아릴카르보닐, C2-6 알콕시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, C2-6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, C2-6 치환된 알카노일, 치환된 아릴카르보닐, C2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 아릴옥시카르보닐, C2-6 치환된 알카노일옥시, 치환된 알카노일옥시 및 아릴카르보닐옥시로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.R 61 and R 62 are independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 2-6 alkenyl, C 2-6 alkynyl, C 3-19 branched alkyl, C 3-8 cycloalkyl, C 1-6 substitution Alkyl, C 2-6 substituted alkenyl, C 2-6 substituted alkynyl, C 3-8 substituted cycloalkyl, aryl, substituted aryl, heteroaryl, substituted heteroaryl, C 1-6 heteroalkyl Substituted C 1-6 heteroalkyl, C 1-6 alkoxy, aryloxy, C 1-6 heteroalkoxy, heteroaryloxy, C 2-6 alkanoyl, arylcarbonyl, C 2-6 alkoxycarbonyl, aryl Oxycarbonyl, C 2-6 alkanoyloxy, arylcarbonyloxy, C 2-6 substituted alkanoyl, substituted arylcarbonyl, C 2-6 substituted alkanoyloxy, substituted aryloxycarbonyl, C 2-6 substituted alkanoyloxy, substituted alkanoyloxy and arylcarbonyloxy.
또 다른 측면에 있어서, 상기 고분자는, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 NOF Corp. Drug Delivery System catalog, Ver. 8, April 2006에 기재된 바와 같은 다분지 PEG-OH 또는 "star-PEG" 산물을 포함한다. 다분지 고분자 컨쥬게이트는 4개 또는 그 이상의 고분자 분지를 포함하고 바람직하게 4개 또는 8개의 고분자 분지를 포함한다. In another aspect, the polymer comprises NOF Corp., the contents of which are incorporated herein by reference. Drug Delivery System catalog, Ver. Multi-branched PEG-OH or "star-PEG" products as described in 8, April 2006. Multi-branched polymer conjugates comprise four or more polymer branches and preferably comprise four or eight polymer branches.
본 설명을 위해, 다분지 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 잔기는 하기와 같을 수 있다: For purposes of this description, the multi-branched polyethylene glycol (PEG) residues can be as follows:
여기서:here:
(x)는 0 및 양의 정수, 즉 약 0 내지 약 28이고; 및(x) is 0 and a positive integer, ie from about 0 to about 28; And
(n)은 고분자화의 수준이다. (n) is the level of polymerisation.
본 발명의 한가지 바람직한 실시예에 있어서, 다분지 PEG는 하기의 구조를 가진다:In one preferred embodiment of the invention, the multi-branched PEG has the structure:
여기서 n은 양의 정수이다. 본 발명의 한가지 바람직한 실시예에 있어서, 상기 고분자는 약 5,000 Da 내지 약 60,000 Da, 바람직하게 12,000 Da 내지 40,000 Da의 총 분자량을 가진다. Where n is a positive integer. In one preferred embodiment of the invention, the polymer has a total molecular weight of about 5,000 Da to about 60,000 Da, preferably 12,000 Da to 40,000 Da.
또 다른 특정 실시예에 있어서, 다분지 PEG는 하기의 구조를 가진다:In another specific embodiment, the multibranched PEG has the structure:
여기서 n은 양의 정수이다. 본 발명의 한가지 바람직한 실시예에 있어서, 다분지 고분자에 대한 고분자화의 수준(n)은 약 5,000 Da 내지 약 60,000 Da의 총 분자량을 가지는 고분자를 제공하기 위해 약 28 내지 약 350이고, 바람직하게 약 12,000 Da 내지 45,000 Da의 총 분자량을 가지는 고분자를 제공하기 위해 약 65 내지 약 270(12,000 내지 45,000 달톤)이다. 이는 고분자 사슬에서 반복되는 단위(unit)의 수를 나타내고, 이는 상기 고분자의 분자량에 의존한다. Where n is a positive integer. In one preferred embodiment of the present invention, the level of polymerisation (n) for the multibranched polymer is from about 28 to about 350, preferably from about 28 to provide a polymer having a total molecular weight of about 5,000 Da to about 60,000 Da. About 65 to about 270 (12,000 to 45,000 Daltons) to provide a polymer having a total molecular weight of 12,000 Da to 45,000 Da. This represents the number of units repeating in the polymer chain, which depends on the molecular weight of the polymer.
상기 고분자는 미국 특허번호 제 5,122,614호 또는 제 5,808,096호에 기재된 활성화 기술을 이용하여, 적절하게 활성화된 고분자로 전환될 수 있다. 특히, 이런 PEG는 하기 화학식 중 하나일 수 있다: The polymer can be converted to a suitably activated polymer using the activation techniques described in US Pat. No. 5,122,614 or 5,808,096. In particular, such PEG may be one of the following formulas:
여기서: here:
(u')는 약 4 내지 약 455의 정수이고; 상기 잔기의 3 말단 부분까지는 메틸 또는 다른 더 낮은 알킬로 캡핑되어 있다. (u ') is an integer from about 4 to about 455; Up to the three terminal portion of the residue is capped with methyl or other lower alkyl.
일부 바람직한 실시예에 있어서, 모든 4개의 PEG 분지는 방향족기(aromatic group)에 대한 접합을 촉진시키기 위해, 적절한 활성화기로 전환될 수 있다. 전환 이전의 화합물은 하기를 포함한다: In some preferred embodiments, all four PEG branches can be converted to appropriate activators to facilitate conjugation to aromatic groups. Compounds prior to conversion include:
본 명세서에 포함되는 고분자 물질은 바람직하게 실온에서 수용성이다. 이런 고분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 폴리프로필렌 글리콜 등의 폴리알킬렌 옥시드 단성중합체, 폴리옥시에틸레네이트 폴리올, 이들의 혼성중합체, 및 블락혼성중합체의 수용성이 유지되는 한, 이들의 블록혼성중합체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. The polymeric material included herein is preferably water soluble at room temperature. Such polymers are block interpolymers thereof, so long as the water solubility of polyalkylene oxide homopolymers such as polyethylene glycol (PEG) or polypropylene glycol, polyoxyethylenate polyols, interpolymers thereof, and block interpolymers is maintained. Including but not limited to.
또 다른 실시예에 있어서, PAO 기반 고분자에 대신하여, 덱스트란(dextran), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 탄수화물 기반 고분자(carbohydrate-based polymer), 하이드록시프로필메타크릴아마이드(hydroxypropylmethacrylamide; HPMA), 폴리알킬렌 옥시드 또는 이들의 혼성중합체와 같은 하나 이상의 효율적인 비항원성 물질이 이용될 수 있다. 또한, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 일반적으로 승인된 미국 특허번호 제 6,153,655호를 참조해라. 동일한 유형의 활성화가 PEG와 같은 PAO로서 본 명세서에 기재된 바와 같이 이용되는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다. 당업자는 이전에 열거된 물질이 주요 예시이고, 상기 기재된 특성을 가지는 모든 고분자 물질이 고려될 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, "실질적 또는 효율적 비항원성"은 비독성이고 포유류에서 상당한 면역반응을 유도하지 않는 당업계에서 인지되는 모든 물질을 의미한다. In another embodiment, in place of PAO-based polymers, dextran, polyvinyl alcohol, carbohydrate-based polymer, hydroxypropylmethacrylamide (HPMA), One or more efficient non-antigenic materials can be used, such as polyalkylene oxides or interpolymers thereof. See also generally accepted US Pat. No. 6,153,655, the contents of which are incorporated herein by reference. It will be understood by those skilled in the art that the same type of activation is used as described herein as a PAO such as PEG. Those skilled in the art will appreciate that the previously listed materials are the main examples and all polymeric materials having the properties described above may be considered. For the purposes of the present invention, "substantial or efficient non-antigenic" means any substance known in the art that is nontoxic and does not induce a significant immune response in mammals.
일부 측면에 있어서, 말단 아민기를 가지는 고분자는 본 명세서에 기재된 화합물을 제조하기 위해 이용될 수 있다. 고순도로 말단 아민을 포함하는 고분자를 제조하는 방법은, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 11/508,507호 및 제 11/537,172호에 기재되어 있다. 예를 들어, 아지드화물(azide)을 가지는 고분자는 트리페닐포스핀(triphenylphosphine)과 같은 포스핀 기반 저해제(phosphine-based reducing agent) 또는 NaBH4와 같은 알칼리 금속 수소화붕소 저해제(alkali metal borohydride reducing agent)와 반응한다. 또한, 이탈기를 포함하는 고분자는 메틸-테르트-부틸 이미도디카르보네이트(methyl-tert-butyl imidodicarbonate; KNMeBoc)의 칼륨염 또는 디-테르트-부틸 이미도디카르보네이트(di-tert-butyl imidodicarbonate; KNBoc2)의 칼륨염과 같은 보호된 아민염과 반응하고, 이어서 보호된 아민기를 탈보호(deprotect)시킨다. 이런 공정에 의해 형성된 말단기를 포함하는 고분자의 순도는 약 95% 이상, 바람직하게 99% 이상이다. In some aspects, polymers having terminal amine groups can be used to prepare the compounds described herein. Methods of preparing polymers comprising terminal amines in high purity are described in US Pat. Nos. 11 / 508,507 and 11 / 537,172, the contents of which are incorporated herein by reference. For example, the polymer having azide may be a phosphine-based reducing agent such as triphenylphosphine or an alkali metal borohydride reducing agent such as NaBH 4. React). In addition, the polymer containing a leaving group may be a potassium salt of methyl-tert-butyl imidodicarbonate (KNMeBoc) or di-tert-butyl imidodicarbonate (di-tert-butyl imidodicarbonate; React with a protected amine salt, such as potassium salt of KNBoc 2 ), and then deprotect the protected amine group. The purity of the polymer comprising end groups formed by this process is at least about 95%, preferably at least 99%.
또 다른 측면에 있어서, 말단 카르복실산기를 가지는 고분자는 본 명세서에 기재된 고분자 전달 시스템에 이용될 수 있다. 고순도로 말단 카르복실산을 가지는 고분자를 제조하는 방법은, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 11/328,662호에 기재되어 있다. 상기 방법은, 우선 폴리알킬렌 옥시드의 3차 알킬 에스테르를 제조한 후, 이의 카르복실산 유도체로 전환시킨다. 이런 공정의 PAO 카르복실산 제조의 첫번째 단계는 폴리알킬렌 옥시드 카르복실산의 t-부틸 에스테르와 같은 중간물을 형성하는 것을 포함한다. 이런 중간물은 칼륨 t-부톡사이드(potassium t-butoxide)와 같은 염의 존재 하에서 PAO와 t-부틸 할로아세테이트(t-butyl haloacetate)와 반응시킴으로써 형성된다. 상기 t-부틸 에스테르 중간물이 형성되면, 폴리알킬렌 옥시드의 카르복실산 유도체는 92% 이상의, 바람직하게 97% 이상의, 더 바람직하게 99% 이상의, 가장 바람직하게 99.5% 이상의 순도로 용이하게 제공될 수 있다. In another aspect, polymers having terminal carboxylic acid groups can be used in the polymer delivery systems described herein. Methods for preparing polymers having high purity terminal carboxylic acids are described in US Pat. No. 11 / 328,662, the contents of which are incorporated herein by reference. The process first prepares tertiary alkyl esters of polyalkylene oxides and then converts them to carboxylic acid derivatives thereof. The first step in the preparation of PAO carboxylic acid of this process involves forming an intermediate, such as t-butyl ester of polyalkylene oxide carboxylic acid. This intermediate is formed by reacting PAO with t-butyl haloacetate in the presence of a salt such as potassium t-butoxide. Once the t-butyl ester intermediate is formed, the carboxylic acid derivative of the polyalkylene oxide is readily provided in at least 92%, preferably at least 97%, more preferably at least 99%, most preferably at least 99.5% purity. Can be.
D. 표적화제(DD. Targeting Agent (D 1One ))
표적화제는 본 명세서에 기재된 고분자 화합물이 생체내(in vivo) 표적 부위에 접합하는 것을 유도하기 위해 상기 고분자 화합물에 접합될 수 있다. 상기 표적화제는 약학적 활성 화합물 및 올리고뉴클레오티드과 같은 생물학적 활성 부분을 표적 부위인 종양 부위에서 치료적 효능을 가지게 한다. 생체내 표적화 전달은 치료적 효능을 높히기 위해 상기 분자의 세포 흡수를 증진시킨다. 특정 측면에 있어서, 세포 투과성 펩티드는 종양 부위에 대한 표적 전달을 위한 다양한 표적화 펩티드로 대체될 수 있다. The targeting agent may be conjugated to the polymer compound to induce the conjugate of the polymer compound described herein to a target site in vivo . The targeting agent allows biologically active moieties such as pharmaceutically active compounds and oligonucleotides to have therapeutic efficacy at the tumor site, which is the target site. In vivo targeted delivery enhances cellular uptake of the molecule to increase therapeutic efficacy. In certain aspects, the cell penetrating peptides can be replaced with various targeting peptides for targeted delivery to the tumor site.
본 발명의 한가지 측면에 있어서, 단일 사슬 항체(SCA) 또는 단일 사슬 결합 항체와 같은 표적화 부분(targeting moiety), 단클론 항체, RGD 펩티드 및 셀렉틴(Selectin)과 같은 세포 부착 펩티드, TAT, 페네트라틴(Penetratin) 및 (Arg)9과 같은 세포 투과성 펩티드(CPP), 수용체 리간드, 표적화 탄수화물 분자 또는 렉틴(lectin), 올리고뉴클레오티드, 잠금핵산(LNA) 및 앱타머(aptamer)와 같은 올리고뉴클레오티드 유도체 등은 세포독성 약물을 표적 부위에 특이적으로 유도한다. 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는, Curr Opin Pharmacol. 2006 Oct;6(5):509-14, Cell-penetrating peptides as vectors for peptide, protein and oligonucleotide delivery; 및 J Pharm Sci. 2006 Sep;95(9):1856-72 Cell adhesion molecules for targeted drug delivery를 참조해라.In one aspect of the invention, targeting moieties such as single chain antibodies (SCA) or single chain binding antibodies, monoclonal antibodies, RGD peptides and cell attachment peptides such as selectin (Tin), TAT, phenuratin ( Penetratin) and (Arg) 9 cell-permeable peptide (CPP), such as, receptor ligands, targeting carbohydrate molecules or lectins (lectin), oligonucleotides, such as nucleotides, locked nucleic acid (LNA) and aptamers (aptamer) a nucleotide derivative, such as the cell Toxic drugs are specifically induced at the target site. Curr Opin Pharmacol. , The contents of which are incorporated herein by reference . 2006 Oct; 6 (5): 509-14, Cell-penetrating peptides as vectors for peptide, protein and oligonucleotide delivery; And J Pharm Sci. See 2006 Sep; 95 (9): 1856-72 Cell adhesion molecules for targeted drug delivery.
표적화 부분는 비오틴화된 화합물, 형광성 화합물 또는 방사성 동위원소로 표지된 화합물 등으로 표지화될 수 있다. 절절한 태그는, 외과적 시술 동안 종양 조직을 이미지화하기 위해, 아미노산 잔기 등의 적절한 부분을 당업계 표준 방출 동위원소(art-standard emitting isotope), 방사선 저투과성 라벨(radio-opaque label), 자기 공명 라벨(magnetic resonance label), 자기 공명 이미지용으로 적절한 그 외 비-방사성 동위원소 라벨, 형광성 유형 라벨(fluorescence-type label), 가시색(visible color)을 나태내는 라벨, 또는 자외선, 적외선 또는 전기화학적 자극 하에서 형광성을 나타내는 라벨에 연결시킴으로써 제조된다. 또한, 진단 태그는 접합된 치료적 부분 내로 통합되거나 접합된 치료적 부분에 연결되어, 동물 또는 인간 환자 내에서 치료적 생물학적 활성 물질의 분배의 모니터링을 할 수 있게 한다.The targeting moiety can be labeled with a biotinylated compound, a fluorescent compound, a compound labeled with a radioisotope, or the like. Proper tags are used in the art-standard emitting isotope, radio-opaque label, magnetic resonance label, as appropriate to image tumor tissue during surgical procedures. (magnetic resonance label), other non-radioactive isotopic labels suitable for magnetic resonance imaging, fluorescence-type labels, labels showing visible colors, or ultraviolet, infrared or electrochemical stimulation It is prepared by linking to a label exhibiting fluorescence under. In addition, the diagnostic tag can be integrated into or linked to the conjugated therapeutic moiety, allowing monitoring of the distribution of the therapeutic biologically active substance within the animal or human patient.
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명의 태그된 컨쥬게이트는 방사성 동위원소 표지 등을 포함하는 적절한 표지로 당업계의 공지된 방법에 의해 용이하게 제조된다. 단지 예시적인 방법으로서, 상기 방사성 동위원소로는 생체내 종양세포 내로 선택적인 흡수를 위한 방사성면역신티그라피제(radioimmunoscintigraphic agent)를 생산하기 위해 131요오드(Iodine), 125요오드, 99m테크네튬(Technetium) 또는 111인듐(Indium)을 포함한다. 예를 들어, 펩티드를 Tc-99m에 연결시키는 방법으로는, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 5,328,679호; 제 5,888,474호; 제 5,997,844호;및 제 5,997,845호에 기재된 방법을 포함하여 많은 당업계에 공지된 방법이 있다. In another aspect of the invention, the tagged conjugates of the present invention are readily prepared by methods known in the art with appropriate labels including radioisotope labels and the like. By way of example only, the radioisotope may comprise 131 iodine, 125 iodine, 99m Technetium or 111 to produce a radioimmunoscintigraphic agent for selective absorption into tumor cells in vivo. Indium (Indium). For example, methods for linking peptides to Tc-99m include US Pat. No. 5,328,679, the contents of which are incorporated herein by reference; No. 5,888,474; There are many methods known in the art, including those described in US Pat. No. 5,997,844; and 5,997,845.
바람직한 표적 부분는 단일 사슬 항체(SCA) 또는 항체의 단일 사슬 가변 단편(sFv)이 있다. 상기 SCA는 표적 종양 세포의 특이적 분자를 결합하고 인지할 수 있는 항체의 도메인을 포함한다. 링커를 통한 페길화된 SCA는 항원 결합 부위를 유지시킬 뿐 아니라, 혈류에서 항원성을 감소시키고 SCA의 반감기를 증가시킬 수 있다. Preferred target moieties are a single chain antibody (SCA) or a single chain variable fragment (sFv) of the antibody. The SCA comprises domains of antibodies capable of binding and recognizing specific molecules of target tumor cells. PEGylated SCA through the linker can not only maintain the antigen binding site, but also reduce antigenicity and increase the half-life of SCA in the bloodstream.
용어 "단일 사슬 항체(SCA)", "단일 사슬 항원 결합 분자 또는 항체" 또는 "단일 사슬 Fv(sFv)"는 상호교환적으로 사용된다. 상기 단일 사슬 항체는 항원에 대한 결합 친화성을 가진다. 단일 사슬 항체(SCA) 또는 단일 사슬 sFv는 다양한 방법으로 설계될 수 있고 설계되어 왔다. 단일 사슬 항원 결합 단백질의 이론 및 생산의 설명은, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 일반적으로 승인된 미국 특허번호 제 10/915,069호 및 미국 특허번호 제 6,824,782호에서 찾을 수 있다. The terms "single chain antibody (SCA)", "single chain antigen binding molecule or antibody" or "single chain Fv (sFv)" are used interchangeably. The single chain antibody has a binding affinity for the antigen. Single chain antibodies (SCA) or single chain sFv can be designed and designed in various ways. A description of the theory and production of single chain antigen binding proteins can be found in generally accepted US Pat. No. 10 / 915,069 and US Pat. No. 6,824,782, the contents of which are incorporated herein by reference.
전형적으로, SCA 또는 Fv 도메인은 26-10, MOPC 315, 741F8, 520C9, McPC 603, D1.3, 쥐 phOx, 인간 phOx, RFL3.8 sTCR, 1A6, Se155-4,18-2-3,4-4-20,7A4-1, B6.2, CC49,3C2,2c, MA-15C5/K12GO, Ox 등의 약자 문자로 공지된 단클론 항체들로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다[Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Huston, J. S. et al., SIM News 38(4) (Supp):11 (1988); McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10:114 (1990); McCartney, J. E. et al., unpublished results (1990); Nedelman, M. A. et al., J. Nuclear Med. 32 (Supp.):1005 (1991); Huston, J. S. et al., In: Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B, edited by J. J. Langone, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Huston, J. S. et al., In: Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology, Epenetos, A. A. (Ed.), London, Chapman & Hall (1993); Bird, R. E. et al., Science 242:423-426 (1988); Bedzyk, W. D. et al., J. Biol. Chem. 265:18615-18620 (1990); Colcher, D. et al., J. Nat. Cancer Inst. 82:1191-1197 (1990); Gibbs, R. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4001-4004 (1991); Milenic, D. E. et al., Cancer Research 51:6363-6371 (1991); Pantoliano, M. W. et al., Biochemistry 30:10117-10125 (1991); Chaudhary, V. K. et al., Nature 339:394-397 (1989); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1066-1070 (1990); Batra, J. K. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171:1-6 (1990); Batra, J. K. et al., J. Biol. Chem. 265:15198-15202 (1990); Chaudhary, V. K. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 87:9491-9494 (1990); Batra, J. K. et al., Mol. Cell. Biol. 11:2200-2205 (1991); Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8616-8620 (1991); Seetharam, S. et al., J. Biol. Chem. 266:17376-17381 (1991); Brinkmann, U. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 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Acad. Sci. USA 88:8646-8650 (1991); Traunecker, A. et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991); Hoo, W. F. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4759-4763 (1993)를 참조]. 이들 각 문헌의 내용은 참조로 본 명세서에 통합된다. Typically, the SCA or Fv domain is 26-10, MOPC 315, 741F8, 520C9, McPC 603, D1.3, rat phOx, human phOx, RFL3.8 sTCR, 1A6, Se155-4,18-2-3,4 -4-20,7A4-1, B6.2, CC49,3C2,2c, MA-15C5 / K 12 G O , Ox, etc. may be selected from the group consisting of monoclonal antibodies known by the abbreviated letters [Huston , JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988); Huston, JS et al., SIM News 38 (4) (Supp): 11 (1988); McCartney, J. et al., ICSU Short Reports 10: 114 (1990); McCartney, JE et al., Unpublished results (1990); Nedelman, MA et al., J. Nuclear Med. 32 (Supp.): 1005 (1991); Huston, JS et al., In: Molecular Design and Modeling: Concepts and Applications, Part B, edited by JJ Langone, Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Huston, JS et al., In: Advances in the Applications of Monoclonal Antibodies in Clinical Oncology, Epenetos, AA (Ed.), London, Chapman & Hall (1993); Bird, RE et al., Science 242: 423-426 (1988); Bedzyk, WD et al., J. Biol. Chem. 265: 18615-18620 (1990); Colcher, D. et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1191-1197 (1990); Gibbs, RA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4001-4004 (1991); Milenic, DE et al., Cancer Research 51: 6363-6371 (1991); Pantoliano, MW et al., Biochemistry 30: 10117-10125 (1991); Chaudhary, VK et al., Nature 339: 394-397 (1989); Chaudhary, VK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066-1070 (1990); Batra, JK et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 171: 1-6 (1990); Batra, JK et al., J. Biol. Chem. 265: 15198-15202 (1990); Chaudhary, VK et al., Proc. Natl. Acad Sci. 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또한, 표적 부분는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유도체일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드(유사체)는 한 종류의 올리고뉴클레오티드에 한정되는 것이 아니고, 대신에 매우 다양한 부분로 작동하기 위해 설계되며, 이는 링커가 하나 이상의 3'- 또는 5'- 말단, 일반적으로 뉴클레오티드의 PO4 또는 SO4기에 접합할 수 있는 것으로 이해되는 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 안테센스 또는 상보적인 올리고뉴클레오티드, 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA ; siRNA), 잠금 핵산(locked nucleic acid; LNA), 마이크로 RNA(miRNA), 펩티드 핵산(PNA), 포스포로디아미데이트 몰폴리노 올리고(phosphorodiamidate morpholino oligo; PMO) 및 앱타머(aptamer) 등을 포함한다. In addition, the target moiety can be an oligonucleotide or oligonucleotide derivative. The oligonucleotides (analogs) are not limited to one type of oligonucleotide, but instead are designed to operate in a wide variety of parts, whereby the linker has one or more 3'- or 5'-terminus, generally PO 4 of the nucleotide Or an SO 4 group. The oligonucleotide is an oligonucleotide or complementary oligonucleotide, short interfering RNA (siRNA), locked nucleic acid (LNA), micro RNA (miRNA), peptide nucleic acid (PNA), phosphorodiamidate Phosphorodiamidate morpholino oligo (PMO), aptamers and the like.
예를 들어, 표적화기(targeting group)는 혈관내피성장인자(vascular endothelial cell growth factor), FGF2, 소마토스타틴(somatostatin) 및 소마토스타틴 유사체, 트랜스페린(transferrin), 멜라노트로핀(melanotropin), ApoE 및 ApoE 펩티드, 폰 빌레브란트 인자(von Willebrand's Factor) 및 폰 빌레브란트 인자 펩티드, 아데노바이러스 섬유 단백질(adenoviral fiber protein) 및 아데노바이러스 섬유 단백질 펩티드, PD1 및 PD1 펩티드, EGF 및 EGF 펩티드, RGD 펩티드, 엽산(folate) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 그 외 당업자에 고려되는 표적화제는 본 명세서에 기재된 상기 화합물로 이용될 수 있다.For example, targeting groups include vascular endothelial cell growth factor, FGF2, somatostatin and somatostatin analogs, transferrin, melanotropin, ApoE and ApoE peptides. , Von Willebrand's Factor and von Willebrand factor peptides, adenovirus fiber protein and adenovirus fiber protein peptides, PD1 and PD1 peptides, EGF and EGF peptides, RGD peptides, folate And the like, and the like. In addition, other targeting agents contemplated by those skilled in the art can be used with the compounds described herein.
바람직하게, 표적화제는 단일 사슬 항체(SCA), RGD 펩티드, 셀렉틴, TAT, 페네트라틴, 올리고(Arg)를 포함하고, 바람직하게 (Arg)9, 폴산 등을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "TAT"는 예를 들어 YGRKKRRQRRR의 펩티드 서열을 포함하는 전사 활성 단백질의 전사 활성제(trans-activator)의 부분을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서 및 실시예에 사용되는 펩티드의 서열 및 구조의 열거는 하기를 포함한다: Preferably, the targeting agent comprises a single chain antibody (SCA), RGD peptide, selectin, TAT, penetratin, oligo (Arg), preferably (Arg) 9 , folic acid and the like. For the purposes of the present invention, the term "TAT" may be understood to mean the portion of a transcriptional activator of a transcriptionally active protein comprising, for example, the peptide sequence of YGRKKRRQRRR. Enumerations of the sequences and structures of the peptides used in the specification and examples include:
C-TAT: (서열번호: 1) CYGRKKRRQRRR ;C-TAT: (SEQ ID NO: 1) CYGRKKRRQRRR;
C-(Arg)9: (서열번호: 2) CRRRRRRRRR ;C- (Arg) 9 : (SEQ ID NO: 2) CRRRRRRRRR;
RGD 는 선형 또는 고리형일 수 있으며:RGD can be linear or cyclic:
(Arg)9는 CRRRRRRRRR와 같은 접합을 위한 시스테인(cysteine)을 포함할 수 있으며, TAT는 CYGRKKRRQRRRC와 같은 펩티드의 말단에 추가적인 시스테인을 부가할 수 있다. (Arg) 9 may include cysteine for conjugation such as CRRRRRRRRR, and TAT may add additional cysteine to the end of the peptide such as CYGRKKRRQRRRC.
E. 생물학적 활성 부분(DE. Biologically active moiety (D 22 ) )
다양한 생물학적 활성 부분는 본 명세서에 기재된 활성화된 고분자에 접합될 수 있다. 상기 생물학적 활성 부분는 약학적 활성 화합물, 효소, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 항체, 단클론 항체, 단일 사슬 항체 및 펩티드를 포함한다. Various biologically active moieties can be conjugated to the activated polymers described herein. Such biologically active moieties include pharmaceutically active compounds, enzymes, proteins, oligonucleotides, antibodies, monoclonal antibodies, single chain antibodies and peptides.
세포독성 또는 화학요법의 약물, 즉 폴산 등은 고분자에 접합될 수 있으며, 이들은 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 일반적으로 승인된 미국 특허번호 제 5,965,566호에 기재된 생물학적 활성 부분을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. Cytotoxic or chemotherapy drugs, ie, folic acid, may be conjugated to a polymer, which may include, but are not limited to, the biologically active moieties described in generally accepted US Pat. No. 5,965,566, the contents of which are incorporated herein by reference. It is not limited.
본 발명의 한가지 측면에 있어서, 상기 생물학적 활성 화합물은 치료가 요구되는 상태를 가진 인간을 포함하는 포유류 등의 동물의 치료에서 약학적 또는 진단적 용도로 적절하다. In one aspect of the invention, the biologically active compound is suitable for pharmaceutical or diagnostic use in the treatment of animals, such as mammals, including humans with conditions in need of treatment.
또 다른 측면에 있어서, 아민- 하이드록시- 또는 티올-을 포함하는 생물학적 활성 부분는 본 발명의 범위 내에 있다. 본 명세서에 포함되는 생물학적 활성 부분의 종류는 담체 부분과 반응하고 연결될 수 있는 적어도 하나의 하이드록시- 또는 티올-기를 이용할 수 있는 것이고, 본 명세서에 기재된 고분자 전달 시스템에 접합되는 형태에서 상당한 생물 활성의 손실이 없는 것이나, 이에 한정되지 않는다. In another aspect, a biologically active moiety comprising an amine-hydroxy- or thiol- is within the scope of the present invention. The type of biologically active moiety encompassed herein is capable of utilizing at least one hydroxy- or thiol-group capable of reacting and linking with the carrier moiety and of substantial biological activity in the form of conjugation to the polymeric delivery systems described herein. There is no loss, but it is not limited to this.
또한, 본 발명의 고분자 수송 컨쥬게이트 화합물 내로 통합되기에 적절한 모체 화합물(parent compound)은 연결된 화합물로부터 가수분해적 방출 후 활성을 가지거나, 가수분해적 방출 후 활성을 가지지 않으나 추가적인 화학적 공정 또는 반응이 진행된 후 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 고분자 수송 시스템에 의해 혈류에 전달되는 항암제는 암 또는 종양 세포에 들어갈 때 까지 비활성 상태로 유지되고, 그 후 암 또는 종양 세포에 특이적인 효소 반응에 의한 것과 같은 상기 암 또는 종양 세포의 화학 작용에 의해 활성화된다. In addition, parent compounds suitable for incorporation into the polymer transport conjugate compounds of the present invention have activity after hydrolytic release from the linked compounds, or do not have activity after hydrolytic release, but do not have additional chemical processes or reactions. It can be active after it has progressed. For example, an anticancer agent delivered to the bloodstream by a polymer transport system remains inactive until it enters the cancer or tumor cells, and thereafter, of the cancer or tumor cells such as by enzymatic reactions specific to the cancer or tumor cells. Activated by chemical action.
한가지 바람직한 실시예에 있어서, 본 명세서에 기재된 고분자 수송 시스템은 약학적으로 유효한 화합물을 포함한다. In one preferred embodiment, the polymeric transport system described herein comprises a pharmaceutically effective compound.
본 발명의 목적을 위해, 약학적으로 유효한 화합물은 작은 분자량의 분자를 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 전형적으로, 상기 약학적으로 유효한 화합물은 약 1,500 달톤 이하의 분자량을 가진다. 이런 화합물은 캄토테신(camptothecin) 및 이의 유사체과 같은 DNA 토포이소머라제 Ⅰ억제제(DNA topoisomerase I inhibitor), 탁산(taxane) 및 파클리탁셀(paclitaxel) 유도체, AZT 및 아시클로비어(acyclovir)를 포함하는 뉴클레오시드, 다우노루비신(daunorubicin) 및 독소루비신(doxorubicin)을 포함하는 안트라사이클린(anthracycline) 화합물, 사이토신 아라비노사이드(cytosine arabinoside; Ara-C)를 포함하는 관련된 항-대사 화합물(related anti-metabolite compound) 및 젬시타빈(Gemcitabine) 등을 포함한다. For the purposes of the present invention, a pharmaceutically effective compound can be understood to mean including molecules of small molecular weight. Typically, the pharmaceutically effective compound has a molecular weight of about 1,500 Daltons or less. Such compounds include DNA topoisomerase I inhibitors such as camptothecin and analogues thereof, nucleosides including taxane and paclitaxel derivatives, AZT and acyclovir Anthracycline compounds, including seeds, daunorubicin and doxorubicin, related anti-metabolite compounds, including cytosine arabinoside (Ara-C) ) And gemcitabine and the like.
1. 탁산 및 탁산 유도체1. Taxanes and Taxane Derivatives
본 발명의 전구약물 조성물에 포함되는 화합물의 한가지 종류는 탁산이다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "탁산(taxane)"은 테르펜(terpene)의 탁산 계열 내에 있는 모든 화합물을 포함한다. 게다가, 탁솔®(파클리탁셀), 3'-치환된 테르트-부톡시-카르보닐-아민(tert-butoxy-carbonyl-amine) 유도체[택소티어(taxotere)®], 및 이들로부터 이용가능한 다른 유사체, 예를 들어 St. Louis, Missouri의 Sigma Chemical 등은 본 발명의 범위 내에 포함된다. One class of compounds included in the prodrug compositions of the invention is taxane. For the purposes of the present invention, the term "taxane" includes all compounds within the taxane family of terpenes. In addition, Taxol ® (paclitaxel), 3'-substituted tert- butoxy-carbonyl-amine derivatives (taxotere ® ), and other analogs available therefrom, For example, St. Louis, Missouri's Sigma Chemical and the like are included within the scope of the present invention.
이런 화합물들은 효과적인 항암제가 되는 것이 규명되어 왔다. 다양한 연구는 상기 약물이 다양한 악성 종양에 대항하는 활성을 가지는 것을 나타낸다. 지금까지, 이들의 용도는 이들의 적은 공급, 결핍된 수용성 또는 과민성 등에 의해 매우 한정되었다. 또한, 일반적으로 승인된 미국 특허번호 제 5,622,986호 및 제 5,547,981호에 기재된 7-아릴-카르바메이트(7-aryl-carbamate) 및 7-카르바제이트(7-carbazate)를 포함하는 다른 탁산이 본 발명의 전구약물에 포함될 수 있음을 이해할 수 있다. 상기 미국 특허의 내용은 참조로 본 명세서에 통합된다. These compounds have been found to be effective anticancer agents. Various studies indicate that the drug has activity against various malignancies. To date, their use has been very limited by their low supply, lack of water solubility or irritability and the like. In addition, other taxanes, including 7-aryl-carbamate and 7-carbazate, described generally in US Pat. Nos. 5,622,986 and 5,547,981 It can be understood that it can be included in the prodrug of the present invention. The contents of this U.S. patent are incorporated herein by reference.
상기 예들은 본 발명의 목적을 위해 특히 파클리탁셀을 기재하고 있음에도 불구하고, 본 명세서에 기재된 방법이 모든 탁산 및 관련된 분자에 적절한 것임을 이해할 수 있다. Although the above examples describe paclitaxel in particular for the purposes of the present invention, it is to be understood that the methods described herein are suitable for all taxanes and related molecules.
2. 캄토테신 및 관련된 토포이소머라제 Ⅰ 억제제2. Camptothecins and related topoisomerase I inhibitors
캄토테신(Camptothecin)은 중국 자생의 캄토테카 아쿠미나타(camptoteca accuminata) 나무 및 인도 자생의 노타포디테스 포에티다(nothapodytes foetida) 나무에 의해 생산되는 수용성 세포독성 알카로이드이다. 또한, 캄토테신 및 관련된 화합물 및 유사체는 항암 또는 항종양제가 될 수 있음이 알려져 있고, 생체외 및 생체내에서 이들의 활성이 나타나는 것이 보여진 바 있다. 또한, 캄토테신 및 관련된 화합물은 본 발명의 전구약물에 대한 전환을 위한 후보물질이다. 예를 들어, 미국 특허번호 제 5,004,758호 및 Hawkins, Oncology, December 1992, pages 17-23를 참조해라. 캄토테신 및 관련된 유도체는, 예를 들어 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan)(CPT-11) 또는 SN38 등이다. Camptothecin is a water soluble cytotoxic alkaloid produced by the Chinese native camptoteca accuminata tree and the Indian native nothapodytes foetida tree. It is also known that camptothecins and related compounds and analogs can be anticancer or antitumor agents, and their activity has been shown to be ex vivo and in vivo. In addition, camptothecins and related compounds are candidates for conversion to the prodrugs of the present invention. See, for example, US Pat. No. 5,004,758 and Hawkins, Oncology , December 1992, pages 17-23. Camptothecins and related derivatives are, for example, Topotecan, Irinotecan (CPT-11), SN38, and the like.
또한, 캄토테신 유사체는 10-하이드록시캄포테신(10-hydroxycamptothecin), 11-하이드록시캄포테신(11-hydroxycamptothecin) 또는 10,11-디하이드록시캄포테신(10,11-dihydroxycamptothecin), 7- 또는 9- 알킬, 치환된 알킬, 사이클로알킬, 알콕시, 알케닐, 아미노알킬 등을 포함하는 문헌에 보고된 것들을 포함한다. 캄토테신, 10,11-알킬렌디옥시캄토테신(10,11-alkylenedioxycamptothecin)과 같은 A-고리 치환된 캄토테신(A-ring substituted camptothecin) 등은, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 5,646,159호에 기재되어 있다. In addition, the camptothecin analogues are 10-hydroxycamptothecin, 11-hydroxycamptothecin or 10,11-dihydroxycamptothecin, 7- or And those reported in the literature including 9-alkyl, substituted alkyl, cycloalkyl, alkoxy, alkenyl, aminoalkyl and the like. A-ring substituted camptothecin, such as camptothecin, 10,11-alkylenedioxycamptothecin, and the like are described in US Pat. 5,646,159.
본 발명의 한가지 바람직한 실시예에 있어서, 세포독성제는 SN38이다. In one preferred embodiment of the invention, the cytotoxic agent is SN38.
3. 올리고뉴클레오티드3. Oligonucleotides
본 발명의 범위를 보다 완전히 인식하기 위해, 하기 용어를 정의한다. 당업자는 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 다른 특정이 없으면 단일 가닥 또는 이중 가닥의 "디옥시리보핵산(DNA)", "리보핵산(RNA)" 및 이들의 화학적 변형을 적용하는 것으로 고려할 것이다. "올리고뉴클레오티드"는, 일반적으로 예를 들어 길이가 약 2 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 바람직하게 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드 크기 범위의 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 다른 특정이 없으면 일반적으로 합성 핵산이고 단일 가닥이다. 또한, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "폴리핵산"은 본 명세서에서 동의어로 사용될 수 있다. In order to more fully recognize the scope of the present invention, the following terms are defined. Those skilled in the art will consider the term "nucleic acid" or "nucleotide" to apply single or double stranded "deoxyribonucleic acid (DNA)", "ribonucleic acid (RNA)" and chemical modifications thereof unless otherwise specified. An "oligonucleotide" is generally a relatively short polynucleotide, eg, in the range of about 2 to about 200 nucleotides in length, preferably about 10 to about 30 nucleotides in size. Oligonucleotides according to the invention are generally synthetic nucleic acids and single stranded unless otherwise specified. In addition, the terms "polynucleotide" and "polynucleic acid" may be used synonymously herein.
본 발명에서 고려되는 올리고뉴클레오티드에 대한 변형은, 예를 들어 요구되는 고분자에 올리고뉴클레오티드의 공유결합을 허용하는 작용기 또는 부분을 가지는 선별된 뉴클레오티드의 부가 또는 치환, 또는 올리고뉴클레오티드에 추가적인 전하, 극성, 수소결합, 전기적 상호작용 및 기능성을 통합하는 기능성 부분의 부가 또는 치환을 포함한다. 이런 변형은, 2'-위치 당 변형(2'-position sugar modification), 5-위치 피리미딘 변형(5-position pyrimidine modification), 8-위치 푸린 변형(8-position purine modification), 외향고리 아민(exocyclic amine)에서 변형, 4-티오우리딘(4-thiouridine)의 치환, 5-bromo 또는 5-iodouracil의 치환, 골격 변형(backbone modification), 메틸화(methylation), 이소염 이소시티딘(isobases isocytidine) 및 이소구아니딘(isoguanidine)과 같은 염기쌍 조합, 및 유사한 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 올리고뉴클레오티드 변형은 캡핑과 같은 3' 및 5' 변형을 포함한다. 뉴클레오시드 유사체는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다:Modifications to oligonucleotides contemplated by the present invention include, for example, the addition or substitution of selected nucleotides having functional groups or moieties that allow covalent linkages of the oligonucleotides to the desired polymer, or additional charge, polarity, hydrogen to the oligonucleotides. Addition or substitution of functional moieties that incorporate bonding, electrical interactions, and functionality. Such modifications include 2'-position sugar modifications, 5-position pyrimidine modifications, 8-position purine modifications, extroverted ring amines ( modification in exocyclic amines, substitution of 4-thiouridine, substitution of 5-bromo or 5-iodouracil, backbone modification, methylation, isobases isocytidine And base pair combinations such as isoguanidine, and similar combinations. Oligonucleotide modifications also include 3 'and 5' modifications such as capping. Nucleoside analogs include, but are not limited to:
내용이 참조로 본 명세서에 통합되는, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 및 Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213에 기재되어 있는 뉴클레오시드 유사체의 더 많은 예를 참조해라.Freier &Altmann; the content of which is incorporated herein by reference. Nucl. Acid Res. , 1997, 25, 4429-4443 and Uhlmann; Curr. See more examples of nucleoside analogs described in Opinion in Drug Development , 2000, 3 (2), 293-213.
본 명세서에 사용되는, 용어 "안티센스"는 유전자 산물을 암호화하거나 조절 서열을 암호화하는 특정 DNA 또는 RNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 용어 "안티센스 가닥"은 "센스 가닥"에 상보적인 핵산 가닥에 관하여 사용된다. 세포 대사의 정상적인 작동에 있어서, DNA 분자의 센스 가닥은 폴리펩티드 또는 다른 유전자 산물을 암호화하는 가닥이다. 상기 센스 가닥은, 메신저 RNA("mRNA") 전사물(안티센스 가닥)의 합성을 위한 주형으로서 제공하고, 그 결과 암호화되는 유전자 산물의 합성을 유도한다. 안티센스 핵산 분자는 원하는 유전자를 상보적인 가닥의 합성을 허용하는 바이러스 프로모터에 역방향으로 결찰시킴(ligation)에 의한 합성을 포함하는, 당업계에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 세포내로 도입되는 경우, 상기 전사된 가닥은 복합체를 형성하기 위해 세포에 의해 생산되는 천연 서열과 결합한다. 그런 다음, 상기 복합체는 추가적인 전사 또는 번역 중 어느 하나를 방해한다. 이런 방법으로, 돌연변이 표현형이 유발될 수 있다. 또한, 표시 "음성의" 또는 (-)는 안티센스 가닥을 나타내는 것으로 당업계 알려져 있으며, "양성의 " 또는 (+)는 센스 가닥을 나타내는 것으로 당업계 알려져 있다. As used herein, the term “antisense” refers to a nucleotide sequence that is complementary to a particular DNA or RNA sequence that encodes a gene product or encodes a regulatory sequence. The term "antisense strand" is used with reference to a nucleic acid strand that is complementary to a "sense strand". In normal operation of cell metabolism, the sense strand of a DNA molecule is the strand that encodes a polypeptide or other gene product. The sense strand serves as a template for the synthesis of messenger RNA (“mRNA”) transcripts (antisense strands), resulting in the synthesis of the encoded gene product. Antisense nucleic acid molecules can be produced by methods known in the art, including synthesis by ligation of the desired gene into a viral promoter that allows the synthesis of complementary strands. When introduced into a cell, the transcribed strand binds to the native sequence produced by the cell to form a complex. The complex then interferes with either further transcription or translation. In this way, mutant phenotypes can be induced. In addition, the indication "negative" or (-) is known in the art to indicate an antisense strand, and "positive" or (+) is known in the art to represent a sense strand.
한가지 바람직한 실시예에 있어서, 접합을 위한 선택은 올리고뉴클레오티드(또는 폴리뉴클레오티드)이고, 접합 후, 표적은 올리고뉴클레오티드의 잔기로 알려져 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 공지된 포스포로디에스테르 골격 또는 포스포로티오에이트 골격을 가지는 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. In one preferred embodiment, the choice for conjugation is an oligonucleotide (or polynucleotide), and after conjugation, the target is known as the residue of the oligonucleotide. The oligonucleotide may be any one selected from the group consisting of oligonucleotides and oligodeoxynucleotides having a known phosphorodiester backbone or phosphorothioate backbone.
상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유도체는 길이가 약 10 내지 약 1000개의 핵산, 바람직하게 예를 들어 약 2 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 더 바람직하게 약 10 내지 약 30개의 뉴클레오티드 크기 범위의 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. The oligonucleotide or oligonucleotide derivative may comprise a relatively short polynucleotide in the range of about 10 to about 1000 nucleic acids, preferably for example about 2 to about 200 nucleotides, more preferably about 10 to about 30 nucleotides in size. It may include.
또한, 본 발명에 따른 유용한 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드는 하기를 포함하나 이에 한정되지 않는다: In addition, useful oligonucleotides and oligodeoxynucleotides according to the present invention include, but are not limited to:
천연의 포스포로디에스테르 골격 또는 포스포로티오에이트 골격을 가지는 올리고뉴클레오티드 및 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 다른 변형된 골격 유사체;Oligonucleotides and oligodeoxynucleotides, or other modified skeletal analogs, having a natural phosphorodiester backbone or phosphorothioate backbone;
LNA(잠금 핵산); LNA (locked nucleic acid);
PNA(펩티드 골격을 가지는 핵산);PNA (nucleic acid having a peptide backbone);
짧은 간섭 RNA(siRNA); Short interfering RNA (siRNA);
마이크로 RNA(miRNA);Micro RNA (miRNA);
펩티드 골격을 가지는 핵산(PNA);Nucleic acids having a peptide backbone (PNA);
포스포로디아미데이트 몰폴리노 올리고뉴클레오티드(PMO);Phosphorodiamidate morpholino oligonucleotides (PMO);
트리사이클로-DNA; Tricyclo-DNA;
데코이(decoy) ODN (이중 가닥의 올리고뉴클레오티드); Decoy ODN (double stranded oligonucleotide);
촉매 RNA 서열(RNAi); Catalytic RNA sequence (RNAi);
리보자임(ribozyme); Ribozyme;
앱타머(aptamers);Aptamers;
스피에겔머(Spiegelmer)(L-배좌 올리고뉴클레오티드);Spiegelmer (L-configuration oligonucleotide);
CpG 올리고머(oligomer) 등,CpG oligomers, etc.
이들은, 내용이 본 명세서에 참조로 통합되어 있는, Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV 및 Oligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November 2003, Hamburg, Germany에 기재되어 있다. 또한, 본 발명에 다른 올리고뉴클레오티드는 하기 표 1에 기재된 것들을 포함하는 적절한 당업계에 알려진 뉴클레오티드 유사체 및 유도체를 선택적으로 포함할 수 있다:These are described in Tides 2002, Oligonucleotide and Peptide Technology Conferences, May 6-8, 2002, Las Vegas, NV and Oligonucleotide & Peptide Technologies, 18th & 19th November 2003, Hamburg, Germany, the contents of which are hereby incorporated by reference. It is. In addition, other oligonucleotides in the present invention may optionally include nucleotide analogues and derivatives known in the art, including those listed in Table 1 below:
바람직하게, 상기 올리고뉴클레오티드는 표적화된 종양 세포 또는 항암 치료학에 대한 종양 세포의 저항과 관련된 단백질을 발현 감소시키는 것과 연관된다. 예를 들어, 암 치료를 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 발현이 감소하는 BCL-2와 같은 당업계에 알려진 단백질이 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는, 미국 특허출원번호 제 10/822,205호를 참조해라. 바람직한 치료적 올리고뉴클레오티드는 안티센스 HIF-1α 올리고뉴클레오티드 및 안티센스 설비빈(Survivin) 올리고뉴클레오티드를 포함하나 이에 한정되지 않는다.Preferably, the oligonucleotides are associated with reducing expression of a protein associated with tumor cell resistance or tumor cell resistance to anticancer therapy. For example, proteins known in the art, such as BCL-2, whose expression is reduced by antisense oligonucleotides for cancer treatment can be used for the present invention. See US Patent Application No. 10 / 822,205, the contents of which are incorporated herein by reference. Preferred therapeutic oligonucleotides include, but are not limited to, antisense HIF-1α oligonucleotides and antisense Survivin oligonucleotides.
한가지 바람직한 실시예에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 제나센스(Genasense)[Genta Inc., Berkeley Heights, NJ에 의해 생산된 a/k/a 오블리머센 나트륨(oblimersen sodium)]와 동일하거나 실질적으로 유사한 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 제나센스는, TCTCCCAGCGTGCGCCAT(서열번호: 6)인 18-머(mer) 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드이며, 이는 인간 bcl-2 mRNA(인간 bcl-2 mRNA는 당업계에 알려진 것이고, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 6,414,134호에서의 서열번호: 19로 기재되어 있다)의 개시 서열 중 처음 6개의 코돈에 상보적인 것이다. 미국 식품의약품안전청(FDA)은 제나센스를 2000년 8월에 희귀 의약품(Orphan Drug) 신분으로 지정하였다: 바람직한 실시예는 하기를 포함한다:In one preferred embodiment, the oligonucleotide is the same as, for example, Genasense (a / k / a oblimersen sodium produced by Genta Inc., Berkeley Heights, NJ) or Substantially similar oligonucleotides. Xenasense is an 18-mer phosphorothioate antisense oligonucleotide, TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO: 6), which is a human bcl-2 mRNA (human bcl-2 mRNA is known in the art, the contents of which are incorporated by reference. Complementary to the first six codons of the starting sequence of US Pat. No. 6,414,134, set forth in SEQ ID NO: 19, incorporated herein by reference. The U.S. Food and Drug Administration (FDA) designated Genasense as an Orphan Drug status in August 2000. Preferred examples include:
(i) 안티센스 설비빈(Survivin) LNA(서열번호: 3)(i) Antisense Survivin LNA (SEQ ID NO: 3)
mCs-Ts-mCs-As-as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c; m C s -T s - m C s -A s -a s -t s -c s -c s -a s -t s -g s -g s - m C s -A s -G s -c;
여기서 상기 위첨자는 LNA를 나타내고, "S"는 포스포티오에이트 골격을 나타내며; Wherein the superscript represents LNA and “ S ” represents a phosphothioate backbone;
(ii) 안티센스 Bcl2 siRNA:(ii) antisense Bcl2 siRNA:
센스 5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3' (서열번호: 4)Sense 5'-GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3 '(SEQ ID NO .: 4)
안티센스 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5' (서열번호: 5)Antisense 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5 '(SEQ ID NO .: 5)
여기서 dT는 DNA를 나타내며; Where dT represents DNA;
(iii) 제나센스(포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드) (서열번호: 6)(iii) Genasense (phosphothioate antisense oligonucleotide) (SEQ ID NO .: 6)
ts-cs-ts-cs-cs-cs-as-gs-cs-gs-ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-tt s -c s -t s -c s -c s -c s -a s -g s -c s -g s -t s -g s -c s -g s -c s -c s -c s -a s -t
여기서 아래첨자는 DNA를 나타내고, "S"는 포스포티오에이트 골격을 나타낸다; The subscript here represents DNA and " S " represents phosphothioate backbone;
(iv) 안티센스 HIF1a LNA(서열번호: 7)(iv) antisense HIF1a LNA (SEQ ID NO: 7)
5'-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3'(서열번호: 7)5'- s T s G s G s c s a s a s g s c s a s t s c s c s T s G s T s a-3 '(SEQ ID NO: 7)
여기서 위첨자는 LNA를 나타내고, 포스포티오에이트 골격을 나타낸다.The superscript here represents LNA and represents the phosphothioate skeleton.
LNA는 하기에 보여지는 바와 같이 2'-O-,4'-C-메틸렌 바이사이클로뉴클레오티드(2'-O,4'-C methylene bicyclonucleotide)를 포함한다:LNAs include 2'-0-, 4'-C-methylene bicyclonucleotides as shown below:
설비빈 LNA의 상세한 설명은, 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는, 미국 특허출원번호 제 11/272,124호, 발명의 명칭 "LNA Oligonucleotides and the Treatmemt of Cancer"; 및 미국 특허출원번호 제 10/776,934호, 발명의 명칭 "Oligomeric Compounds for the Modulation Survivin Expression"을 참조해라. 또한, 내용이 참조로서 본 명세서에 통합되는, 미국 특허출원번호 제 10/407,807호, 발명의 명칭 "Oligomeric Compounds for the Modulation HIF-1 Alpha Expression"; 및 미국 특허출원번호 제 11/271,686호, 발명의 명칭 "Potent LNA Oligonucleotides for Inhibition of HIF-1A Expression"를 참조해라. A detailed description of a bovine bin LNA is described in US Patent Application No. 11 / 272,124, entitled "LNA Oligonucleotides and the Treatmemt of Cancer," the contents of which are incorporated herein by reference; And US Patent Application No. 10 / 776,934, entitled "Oligomeric Compounds for the Modulation Survivin Expression". See also, US Patent Application No. 10 / 407,807, entitled "Oligomeric Compounds for the Modulation HIF-1 Alpha Expression", the contents of which are incorporated herein by reference; And US patent application Ser. No. 11 / 271,686, entitled "Potent LNA Oligonucleotides for Inhibition of HIF-1A Expression."
본 명세서에 기재된 화합물에 이용되는 올리고뉴클레오티드는 각 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 (CH2)w 아미노 링커를 가지고, 여기서 (w)는 약 1 내지 10, 바람직하게 6인 양의 정수인 것으로 변형될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물로 고려되는 변형된 올리고뉴클레오티드는 NH-(CH2)w-올리고뉴클레오티드일 수 있다.Oligonucleotides used in the compounds described herein have a (CH 2 ) w amino linker at the 5 'or 3' end of each oligonucleotide, wherein (w) is a positive integer of about 1 to 10, preferably 6 It can be modified. Modified oligonucleotides contemplated as compounds described herein can be NH- (CH 2 ) w -oligonucleotides.
본 발명의 한가지 바람직한 실시예에 있어서, siRNA의 센스 가닥의 5' 말단은 변형된다. 예를 들어, 고분자 컨쥬게이트에서 이용되는 siRNA는 5'-C6-NH2으로 변형된다. 본 발명의 한가지 특정 실시예는 In one preferred embodiment of the invention, the 5 'end of the sense strand of the siRNA is modified. For example, siRNAs used in polymer conjugates are modified with 5′-C 6 -NH 2 . One particular embodiment of the invention
센스 5'-(NH2-C6)GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3'Sense 5 '-(NH 2 -C 6 ) GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3'
안티센스 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5'의 서열을 가지는 Bcl2-siRNA를 이용한다.Antisense Bcl2-siRNA having the sequence of 3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5 'is used.
또 다른 한가지 실시예에 있어서, 본 명세서에서 기재된 화합물은 가리움 에스테르(hindered ester)를 포함하는 (CH2)W 아미노 링커로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 내용이 참조로서 통합되는, "Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers" 라는 명칭의 미국 가특허출원번호 60/844942를 참조해라. 상기 고분자 화합물은 아미노 말단(tail) 없이 올리고뉴클레오티드를 방출할 수 있다. 예를 들어, 상기 올리고뉴클레오티드는 하기의 구조를 가질 수 있다: In another embodiment, the compounds described herein can include oligonucleotides modified with (CH2) W amino linkers, including hindered esters. See US Provisional Patent Application No. 60/844942, entitled "Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers," the contents of which are incorporated by reference. The polymeric compound can release oligonucleotides without an amino tail. For example, the oligonucleotide can have the following structure:
여기서 w는 약 1 내지 약 10, 바람직하게 약 6의 양의 정수이다. Wherein w is a positive integer from about 1 to about 10, preferably about 6.
또 다른 바람직한 실시예에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 (CH2)w 설프하이드릴 링커(sulfhydryl linkers)로 변형될 수 있다[티오 올리고뉴클레오티드(thio oligonucleotides)]. 상기 티오 뉴클레오티드는 양전하 펩티드의 시스테인에 직접적으로, 또는 말레이미딜기(maleimidyl group)를 매개로 결합시켜 사용될 수 있다. 상기 티오 뉴클레오티드는 SH-(CH2)W-올리고뉴클레오티드 구조를 가질 수 있다. 또한, 상기 티오 뉴클레오티드는 하기의 구조를 가지는 가리움 에스테르(hindered ester)를 포함할 수 있다:In another preferred embodiment, the oligonucleotides can be modified with (CH2) w sulfhydryl linkers (thio oligonucleotides). The thio nucleotides can be used either directly to the cysteine of the positively charged peptide or by binding to a maleimidyl group. The thio nucleotide may have an SH— (CH 2) W —oligonucleotide structure. In addition, the thio nucleotide may include a hindered ester having the following structure:
변형된 올리고뉴클레오티드의 예로는 하기를 포함한다:Examples of modified oligonucleotides include:
(i) C6-NH2 말단(tail)으로 변형된 제나센스(Genasense): (i) Genasense modified with C 6 -NH 2 tail:
5'-NH2-C6-stscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast-3'5'-NH 2 -C 6 - s t s c s t s c s c s c s a s g s c s g s t s g s c s g s c s c s a s t-3 '
(ii) C6-NH2 말단으로 변형된 안티센스 HIF1α LNA:(ii) antisense HIF1α LNA modified with C 6 -NH 2 termini:
5'-NH2-C6-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3'5'-NH 2 -C 6 - s T s G s G s c s a s a s g s c s a s t s c s c s T s G s T s a-3 '
(iii) C6-NH2 말단으로 변형된 안티센스 설비빈 LNA: (iii) antisense sorbin LNA modified with C 6 -NH 2 termini:
5'-NH2-C6-s mCsTs mCsAsastscscsastsgsgs mCsAsGsc-3'5'-NH 2 -C 6 - s m C s T s m C s A s a s t s c s c s a s t s g s g s m C s A s G s c-3 '
(iv) C6-SH 꼬리로 변형된 안티센스 설비빈 LNA (iv) antisense septic bin LNA modified with C 6 -SH tail
5'-HS-C6-s mCsTs mCsAsastscscsastsgsgs mCsAsGsc-3'5'-HS-C 6 - s m C s T s m C s A s a s t s c s c s a s t s g s g s m C s A s G s c-3 '
(v) 가리움 에스테르 말단으로 변형된 제나센스 (v) xenasense modified with a covering ester end
4. 추가적인 생물학적 활성 부분4. Additional biologically active moieties
상기 분자 이외에, 본 발명의 화합물은 많은 다른 화합물을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, OH 기, 플록스우리딘(floxuridine), 포도필로톡신(podophyllotoxin) 및 관련 화합물을 포함하는 시스-플라틴(cis-platin) 유도체와 같은 생물학적 활성 화합물이 포함될 수 있다. In addition to the above molecules, the compounds of the present invention can be prepared using many other compounds. For example, biologically active compounds such as cis-platin derivatives can be included, including OH groups, floxuridine, podophyllotoxin and related compounds.
다른 유용한 모체 화합물은, 예를 들어 펩티도 글리칸(peptido glycan)을 포함하는 저분자량 생물학적 활성 단백질, 효소 및 펩티드, 및 다른 항종양제, 포르스콜린(forskolin)과 같은 심장혈관제, 콤브레타스타틴(combretastatin), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 독소루비신(doxorubicin), AraC, 마이탄신(maytansine)과 같은 항신생물제(anti-neoplastics), 바노마이신(vancomycin)과 같은 항감염제, nystatin 또는 amphoteracin B과 같은 항진균제, 항염증제, 스테로이드제 등을 포함한다. Other useful parent compounds include, for example, low molecular weight biologically active proteins, enzymes and peptides, including peptido glycan, and other anti-tumor agents, cardiovascular agents such as forskolin, combres. Anti-neoplastics such as combretastatin, vinblastine, vincristine, doxorubicin, AraC, maytansine, anti-neoplastics, and vancomycin Infectious agents, antifungal agents such as nystatin or amphoteracin B, anti-inflammatory agents, steroids and the like.
이들은 본 발명의 전구약물용으로 적절한 생물학적 활성 부분을 나타낸 것이다.These represent biologically active moieties suitable for the prodrugs of the present invention.
F. 영구적인 링커 및 해리가능 링커: (LF. Permanent Linkers and Dissociable Linkers: (L 1One 및 L And L 33 ))
L1 및 L3 링커는 이중기능성 링커(bifunctional linker)를 포함한다. 상기 이중기능성 링커는 영구적이거나 해리가능 링커일 수 있다. 상기 이중기능성 링커는 아미노산 또는 아미노산 유도체를 포함한다. 상기 아미노산은 자연적으로 발생하는 아미노산이거나 비자연적으로 발생하는 아미노산일 수 있다. 자연적으로 발생하는 아미노산의 유도체 및 유사체 뿐만 아니라, 다양한 당업계에 알려진 소수성 또는 비소수성의 비자연적으로 발생하는 아미노산(D 또는 L)이 본 발명의 범위 내인 것으로 고려된다. 비자연적으로 발생하는 아미노산은 2-아미노아디픽산(2-aminoadipic acid), 3-아미노아디픽산, 베타-알라닌(beta-alanine), 베타-아미노프로피온산(beta-aminopropionic acid), 2-아미노부티르산(2-aminobutyric acid), 4- 아미노부티르산, 피페리딘산(piperidinic acid), 6-아미노카프론산(6-aminocaproic acid), 2-아미노헵타논산(2-aminoheptanoic acid), 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid), 3-아미노이소부티르산(3-aminoisobutyric acid), 2-아미노피멜릭산(2-aminopimelic acid), 2,4-아미노부티르산, 데스모신(desmosine), 2,2-디아미노피멜릭산(2,2-diaminopimelic acid), 2,3-디아미노프로피온산(2,3-diaminopropionic acid), N-에틸글라이신(N-ethylglycine), N-에틸아스파라긴(N-ethylasparagine), 3-하이드록시프롤린(3-hydroxyproline), 4-하이드록시프롤린, 이소데스모신(isodesmosine), 알로-이소류신(allo-isoleucine), N-메틸글라이신(N-methylglycine), 사르코신(sarcosine), N-메틸-이소류신(N-methyl-isoleucine), 6-N-메틸-라이신(6-N-methyl-lysine), N-메틸발린(N-methylvaline), 노르발린(norvaline), 노르류신(norleucine) 및 오르니틴(ornithine)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 아미노산 잔기는 글라이신, 알라닌, 메티오닌 및 사르코신으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 글라이신인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. L 1 and L 3 linkers include bifunctional linkers. The bifunctional linker may be a permanent or dissociable linker. The bifunctional linker comprises an amino acid or an amino acid derivative. The amino acid may be a naturally occurring amino acid or an unnaturally occurring amino acid. As well as derivatives and analogs of naturally occurring amino acids, it is contemplated that various hydrophobic or nonhydrophobic, non-naturally occurring amino acids (D or L) are within the scope of the present invention. Non-naturally occurring amino acids include 2-aminoadipic acid, 3-aminoadipic acid, beta-alanine, beta-aminopropionic acid, 2-aminobutyric acid ( 2-aminobutyric acid, 4-aminobutyric acid, piperidinic acid, 6-aminocaproic acid, 2-aminoheptanoic acid, 2-aminoisobutyric acid (2 -aminoisobutyric acid, 3-aminoisobutyric acid, 2-aminopimelic acid, 2,4-aminobutyric acid, desmosine, 2,2-diaminopimelic acid (2,2-diaminopimelic acid), 2,3-diaminopropionic acid, N-ethylglycine, N-ethylasparagine, 3-hydroxyproline (3-hydroxyproline), 4-hydroxyproline, isodesmosine, allo-isoleucine, N-methylglycine, Sarcosine, N-methyl-isoleucine, 6-N-methyl-lysine, N-methylvaline, norvaline ), Norleucine and ornithine. The amino acid residue is preferably selected from the group consisting of glycine, alanine, methionine and sarcosine, more preferably glycine, but is not limited thereto.
또한, 상기 L1 및 L3는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:In addition, the L 1 and L 3 may be selected from the group consisting of:
-[C(=O)]v(CR22R23)t[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]v(CR22R23)t-O[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t -O [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]v(CR22R23)t-NR26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t -NR 26 [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vO(CR22R23)t[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tO[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t O [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tNR26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t NR 26 [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)t[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tO[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t O [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tNR26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t NR 26 [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t O- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t NR 26- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t S- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t O- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t NR 26- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t S- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t O- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t NR 26- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t S- (CR 28 R 29 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(=O)]v'-,-[C (= 0)] v (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t NR 26 [C (= 0)] v ' -,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)t[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t NR 26 [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)t[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)tNR26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t NR 26 [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t [C (= O)] v ' -,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t (CR 24 R 25 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t (CR 24 R 25 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t (CR 24 R 25 ) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]v(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t (CR 24 R 25 ) t ' [C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t (CR 24 R 25 CR 28 R 29 O) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'R26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v (CR 22 R 23 ) t (CR 24 R 25 CR 28 R 29 O) t ' R 26 [C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vO(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t (CR 24 R 25 ) t ' [C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t (CR 24 R 25 CR 28 R 29 O) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R29O)t'R26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v O (CR 22 R 23 ) t (CR 24 CR 25 CR 28 R 29 O) t ' R 26 [C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23CR28R29O)t(CR24R25)t'[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 CR 28 R 29 O) t (CR 24 R 25 ) t ' [C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t (CR 24 R 25 CR 28 R 29 O) t ' C (= O)] v'- ,
-[C(=O)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R29O)t'R26[C(=O)]v'-,-[C (= O)] v NR 21 (CR 22 R 23 ) t (CR 24 R 25 CR 28 R 29 O) t ' R 26 [C (= O)] v'- ,
여기서here
R21-29는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C3-12 분지된 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C3-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C1-6 헤테로알킬, 치환된 C1-6 헤테로알킬, C1-6 알콕시, 페녹시 및 C1-6 헤테로알콕시로 구성된 군으로부터 선택되고;R 21-29 is independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 3-12 branched alkyl, C 3-8 cycloalkyl, C 1-6 substituted alkyl, C 3-8 substituted cycloalkyl, aryl, substituted Aryl, aralkyl, C 1-6 heteroalkyl, substituted C 1-6 heteroalkyl, C 1-6 alkoxy, phenoxy and C 1-6 heteroalkoxy;
(t) 및 (t')는 독립적으로 0 또는 양의 정수이고, 바람직하게 0 또는 1 내지 12의 정수이며, 더욱 바람직하게는 1 내지 8의 정수, 가장 바람직하게 1 또는 2이며; 및 (t) and (t ') are independently 0 or a positive integer, preferably 0 or an integer from 1 to 12, more preferably an integer from 1 to 8, most preferably 1 or 2; And
(v) 및 (v')는 독립적으로 0 또는 1이다. (v) and (v ') are independently 0 or 1.
바람직하게는, 상기 이중기능성 링커는 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: Preferably, the bifunctional linker may be selected from the group consisting of:
-[C(=O)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=O)-(CH2)2- , — [C (═O)] r NH (CH 2 ) 2 CH═N—NHC (═O) — (CH 2 ) 2 −,
-[C(=O)]rNH(CH2)2(CH2CH2O)2(CH2)2NH[C(=O)]r'- ,— [C (═O)] r NH (CH 2 ) 2 (CH 2 CH 2 O) 2 (CH 2 ) 2 NH [C (═O)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)2NH[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 ) (CH 2 CH 2 O) 2 NH [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s'C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 ) s NH (CH 2 CH 2 ) s ' C (= 0)] r'- ,
-[C(=O)]r NH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s'C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 ) s S (CH 2 CH 2 ) s ' C (= 0)] r'- ,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)(CH2CH2O)[C(=O)]r'-, [C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 ) (CH 2 CH 2 O) [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s'C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 ) s O (CH 2 CH 2 ) s ' C (= 0)] r'- ,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)(CH2)NH[C(=O)]r'-, [C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 0) (CH 2 ) NH [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)2(CH2)[C(=O)]r'-, [C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 0) 2 (CH 2 ) [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)s(CH2)s'C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 0) s (CH 2 ) s ' C (= 0)] r'- ,
-[C(=O)]rNHCH2CH2NH[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NHCH 2 CH 2 NH [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2)2O[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r NH (CH 2 CH 2 ) 2 O [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 0) [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2CH2O)2[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 CH 2 0) 2 [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rNH(CH2)3[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r NH (CH 2 ) 3 [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2CH2O)2(CH2)[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r O (CH 2 CH 2 0) 2 (CH 2 ) [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r O (CH 2 ) 2 NH (CH 2 ) 2 [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2CH2O)2NH[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r O (CH 2 CH 2 0) 2 NH [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2)2O(CH2)2[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r O (CH 2 ) 2 O (CH 2 ) 2 [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r O (CH 2 ) 2 S (CH 2 ) 2 [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2CH2)NH[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r O (CH 2 CH 2 ) NH [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2CH2)O[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r O (CH 2 CH 2 ) O [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2)3NH[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r O (CH 2 ) 3 NH [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2)3O[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r O (CH 2 ) 3 O [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rO(CH2)3[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r O (CH 2 ) 3 [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rCH2NHCH2[C(=O)]r'-, -[C (= 0)] r CH 2 NHCH 2 [C (= 0)] r ' -,
-[C(=O)]rCH2OCH2[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r CH 2 OCH 2 [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rCH2SCH2[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r CH 2 SCH 2 [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]rS(CH2)3[C(=O)]r'-, -[C (= O)] r S (CH 2 ) 3 [C (= O)] r ' -,
-[C(=O)]r(CH2)3[C(=O)]r-,-[C (= O)] r (CH 2 ) 3 [C (= O)] r- ,
여기서 (r) 및 (r')는 독립적으로 0 또는 1이고, (r) 및 (r')가 동시에 0는 아니다. Wherein (r) and (r ') are independently 0 or 1, and (r) and (r') are not zero at the same time.
1. 해리가능 링커1. Dissociable Linker
본 발명의 한가지 바람직한 실시예에 있어서, 본 명세서에서 기재된 화합물은 헤체가능한 링커가 접합된 생물학적 활성 부분을 포함한다. 본 발명의 한가지 이점은 상기 생물학적 활성 부분이 조절되는 방법에 의해 해체될 수 있는 것이다. In one preferred embodiment of the invention, the compounds described herein comprise a biologically active moiety to which a hessable linker is conjugated. One advantage of the present invention is that it can be disassembled by the method in which the biologically active moiety is regulated.
상기 해리가능 링커는 벤질 제거 기반 링커(benzyl elimination-based linker), 트리알킬 잠금 기반 링커(trialkyl lock-based linker)[또는 트리알킬 잠금 락톤화 기반(trialkyl lock lactonization based)], 바이신 기반 링커(bicine-based linker), 산 불안정 링커(acid labile linker), 리소좀 절개가능 펩티드(lysosomally cleavable peptide) 및 캅텝신 D 절개가능 펩티드(capthepsin B cleavable peptide)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기, 산 불안정 링커는 이황화 결합(disulfide bond), 하이드로존 포함 링커(hydrozone- containing linker) 및 티오프로피온 산 포함 링커(thiopropionate-containing linker)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. The dissociable linker may be a benzyl elimination-based linker, a trialkyl lock-based linker (or trialkyl lock lactonization based), a bicine-based linker ( bicine-based linker, acid labile linker, lysosomally cleavable peptide, and capthepsin B cleavable peptide. The acid labile linker may be selected from the group consisting of disulfide bonds, hydrozone-containing linkers, and thiopropionate-containing linkers.
또한, 상기 해리가능 링커는 세포내 불안정 링커(intracellular labile linker), 세포외 링커(extracellular linker) 및 산 불안정 링커이다. 하이드라존 연쇄(hydrazone linkage)와 같은 산성 불안정 링커는, 산성 리소좀 환경하에서 가수분해 될 수 있다. 일부 적절한 해리가능 링커는 Val-Cit, Ala-Leu-Ala-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly 및 Phe-Lys 등을 포함하는 올리고펩타이드이다. 한가지 바람직한 링커는 캅텝신 B에 의해 특이적으로 분해될 수 있는 펩티딜 링커(Val-Cit)이다. 바람직하게, L3은 해리가능 링커를 포함한다. The dissociable linkers are also intracellular labile linkers, extracellular linkers and acid labile linkers. Acid labile linkers, such as hydrazone linkages, can be hydrolyzed under acidic lysosomal environments. Some suitable dissociable linkers are oligopeptides including Val-Cit, Ala-Leu-Ala-Leu, Gly-Phe-Leu-Gly, Phe-Lys, and the like. One preferred linker is a peptidyl linker (Val-Cit) that can be specifically cleaved by captapsin B. Preferably, L 3 comprises a dissociable linker.
바람직한 해리가능 링커는 하기를 포함한다: Preferred dissociable linkers include:
-Val-Cit-, -Val-Cit-,
-Gly-Phe-Leu-Gly-,-Gly-Phe-Leu-Gly-,
-Ala-Leu-Ala-Leu-,-Ala-Leu-Ala-Leu-,
-Phe-Lys-,-Phe-Lys-,
-Val-Cit-C(=O)-CH2OCH2-C(=O)-, -Val-Cit-C (= O) -CH 2 OCH 2 -C (= O)-,
-Val-Cit-C(=O)-CH2SCH2-C(=O)-, 및-Val-Cit-C (= 0) -CH 2 SCH 2 -C (= 0)-, and
-NHCH(CH3)-C(=O)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=O)--NHCH (CH 3 ) -C (= O) -NH (CH 2 ) 6 -C (CH 3 ) 2 -C (= O)-
여기서here
Y11-19는 독립적으로 O, S 또는 NR48이며;Y 11-19 is independently O, S or NR 48 ;
R31-48, R50, R100 및 A51은 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C3-12 분지된 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C3-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C1-6 헤테로알킬, 치환된 C1-6 헤테로알킬, C1-6 알콕시, 페녹시 및 C1-6 헤테로알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며;R 31-48 , R 50 , R 100 and A 51 are independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 3-12 branched alkyl, C 3-8 cycloalkyl, C 1-6 substituted alkyl, C 3- From the group consisting of 8 substituted cycloalkyl, aryl, substituted aryl, aralkyl, C 1-6 heteroalkyl, substituted C 1-6 heteroalkyl, C 1-6 alkoxy, phenoxy and C 1-6 heteroalkoxy Is chosen;
Ar은 아릴 또는 헤테로아릴 부분이며;Ar is an aryl or heteroaryl moiety;
L11-15는 독립적으로 선택되는 이중기능성 스페이서(bifunctional spacer)이며;L 11-15 is an independently selected bifunctional spacer;
J 및 J'는 독립적으로 표적세포내로 활성적으로 이동되는 부분, 소수성 부분, 이중기능성 연결 부분, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며;J and J 'are independently selected from the group consisting of moieties, hydrophobic moieties, bifunctional linking moieties, and combinations thereof, which are actively migrated into target cells;
(c11), (h11), (k11), (l11), (m11) 및 (n11)은 독립적으로 선택되는 양의 정수, 바람직하게 1이며;(c11), (h11), (k11), (11), (m11) and (n11) are independently selected positive integers, preferably 1;
(a11), (e11), (g11), (j11), (o11) 및 (q11)은 독립적으로 0 또는 양의 정수, 바람직하게 1이며;(a11), (e11), (g11), (j11), (o11) and (q11) are independently 0 or a positive integer, preferably 1;
(b11), (x11), (x'12), (f11), (i11) 및 (p11)은 독립적으로 0 또는 1이다.(b11), (x11), (x'12), (f11), (i11) and (p11) are each independently 0 or 1.
다양한 해리가능 링커인 벤젠 제거 기반 또는 트리알킬 잠금 기반 링커는, 예를 들어 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 6,180,095호, 제 6,720,306호, 제 5,965,119호, 제 6624,142호 및 제 6,303,569호에 기재되어 있다. 또한, 바이신 기반 링커는, 내용이 참조로 본 명세서에 통합되는 미국 특허번호 제 7,122,189호 및 제 7,087,229호, 및 미국 특허출원번호 제 10/557,522호, 제 11/502,108호, 및 제 11/011,818호에 기재되어 있다. Various dissociable linkers, benzene removal based or trialkyl lock based linkers, are described, for example, in US Pat. Nos. 6,180,095, 6,720,306, 5,965,119, 6624,142 and 6, the contents of which are incorporated herein by reference. 6,303,569. In addition, bicine-based linkers are described in U.S. Pat.Nos. 7,122,189 and 7,087,229, and U.S. Pat. It is described in the issue.
바람직하게, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 생물학적 활성 화합물은 산성 불안정 링커를 매개로 본 명세서에 기재된 화합물의 고분자 부분에 연결된다. 특정 이론에 의해 한정되는 것 없이, 산성 불안정 링커는 세포내 모체 고분자 화합물로부터 올리고뉴클레오티드의 방출을 촉진시키고 이는 리소좀(lysosome), 엔도좀(endosome) 또는 마크로피노좀(macropinosome)에서 특이적으로 작용한다. Preferably, the biologically active compound comprising an oligonucleotide is linked to the polymer portion of the compound described herein via an acid labile linker. Without being bound by a particular theory, acid labile linkers promote the release of oligonucleotides from intracellular parent polymer compounds, which act specifically on lysosomes, endosomes or macropinosomes. .
2. 영구적인 링커2. Permanent linker
본 발명의 바람직한 측면에 있어서, SCA와 같은 표적 부분는 영구적인 링커를 통해 다기능성 링커에 접합된다. 상기 영구적인 링커는 표적 부분 및 다기능성 링커를 접합시킬 수 있다. 한가지 바람직한 링커는 티오-에테르 결합(thio-ether bon)을 제공할 수 있는 말레이미딜 포함 분자(maleimidyl-containing molecule) 등의 분자일 수 있다. In a preferred aspect of the invention, the target moiety, such as SCA, is conjugated to the multifunctional linker via a permanent linker. The permanent linker may join the target moiety and the multifunctional linker. One preferred linker may be a molecule such as a maleimidyl-containing molecule capable of providing a thio-ether bon.
말레이미딜기를 포함하는 영구적인 링커는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있다: The permanent linker comprising a maleimidyl group may be selected from the group consisting of:
또 다른 실시예에 있어서, 영구적인 링커는 상기 보여주는 것들에 상응하는 구조를 포함하나, 말레이미딜기 대신에 비닐(vinyl), 술폰(sulfone)의 잔기, 아미노(amino), 카르복시(carboxy), 멀캅토(mercapto), 하이드라지드(hydrazide), 카르바메이트(carbamate) 및 말레이미딜을 대신하는 유사한 것을 가진다. In another embodiment, the permanent linker comprises a structure corresponding to those shown above, but instead of the maleimidyl group, residues of vinyl, sulfone, amino, carboxy, mullite. Mercapto, hydrazide, carbamate and the like instead of maleimidyl.
G. 이탈기 및 작용기G. leaving groups and functional groups
일부 측면에 있어서, 적절한 이탈기(leaving group)는 할로겐(Br, Cl), 활성화된 카르보네이트(activated carbonate), 카르보닐 이미다졸(carbonyl imidazole), 사이클 이미드 티온(cyclic imide thione), 이소시아네이트(isocyanate), N-하이드록시숙신이미딜(N-hydroxysuccinimidyl), 파라-니트로페녹시(para-nitrophenoxy), N-하이드록시프탈리이미드(N-hydroxyphtalimide), N-하이들록시벤조트리아졸일(N-hydroxybenzotriazolyl), 이미다졸(imidazole), 토실레이트(tosylate), 메실레이트(mesylate), 트레실레이트(tresylate), 노실레이트(nosylate), C1-C6 알킬옥시, C1-C6 알카노일옥시, 아릴카르보닐옥시, 올쏘-니트로페녹시(ortho-nitrophenoxy), N-하이드록시벤조트리아졸일(N-hydroxybenzotriazolyl), 이미다졸(imidazole), 펜타플루오로페녹시(pentafluorophenoxy), 1,3,5-트리콜로페녹시(1,3,5-trichlorophenoxy), 및 1,3,5-트리플루오로페녹시(1,3,5-trifluorophenoxy), 또는 그 외 당업자에게 명백한 적절한 이탈기를 포함하나 이에 한정되지 않는다.In some aspects, suitable leaving groups include halogen (Br, Cl), activated carbonate, carbonyl imidazole, cyclic imide thiones, isocyanates (isocyanate), N-hydroxysuccinimidyl, para-nitrophenoxy, N-hydroxyphtalimide, N-hydroxyhydroxytriazolyl N-hydroxybenzotriazolyl), imidazole, tosylate, mesylate, mesylate, tresylate, nosylate, C 1 -C 6 alkyloxy, C 1 -C 6 alka Noyloxy, arylcarbonyloxy, ortho-nitrophenoxy, N-hydroxybenzotriazolyl, imidazole, pentafluorophenoxy, 1,3 , 5-tricolophenoxy (1,3,5-trichlorophenoxy), and 1,3,5-trifluorophenoxy (1,3,5-triflu orophenoxy), or other suitable leaving groups apparent to those skilled in the art.
본 발명의 바람직한 목적을 위해, 이탈기는 원하는 표적, 즉 생물학적 활성 부분 및 표적 부분에서 발견되는 친핵체(nucleophile)와 반응할 수 있는 기로 이해되는 것이다. For preferred purposes of the present invention, leaving groups are understood to be groups capable of reacting with desired targets, ie biologically active moieties and nucleophiles found in the target moieties.
일부 바람직한 실시예에 있어서, 생물학적 활성 부분에 고분자 수송 시스템을 연결하는 작용기는 말레이미딜, 비닐, 술폰의 잔기, 아미노, 카르복시, 멀캅토(mercapto), 하이드라지드(hydrazide), 카르바제이트(carbazate), 및 추가적으로 생물학적 활성기 또는 표적기에 접합될 수 있는 것을 포함한다.In some preferred embodiments, the functional group linking the polymer transport system to the biologically active moiety is maleimidyl, vinyl, residues of sulfone, amino, carboxy, mercapto, hydrazide, carbazate carbazate, and additionally those that can be conjugated to biologically active or target groups.
본 발명의 목적을 위해, D1 또는 D2 가 작용기인 경우, L1 및 L3 기는 기능성 부분이 아니다.For the purposes of the present invention, D 1 or D 2 is a functional group In this case, the L 1 and L 3 groups are not functional parts.
한가지 바람직한 실시예에 있어서, 작용기는 말레이미딜일 수 있고, 이탈기는 OH, 메톡시, 테르트-부톡시(tert-butoxy), 파라-니트로페녹시(para-nitrophenoxy) 및 N-하이드록시숙신이미딜(N-hydroxysuccinimidyl)로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. In one preferred embodiment, the functional group can be maleimidyl and the leaving group is OH, methoxy, tert-butoxy, para-nitrophenoxy and N-hydroxysuccinimi It may be selected from the group consisting of dill (N-hydroxysuccinimidyl).
H. 화학식(Ⅰ)에 상응하는 바람직한 실시예H. Preferred Examples Corresponding to Formula (I)
본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조되는 일부 특정 예시는 하기를 포함한다:Some specific examples prepared by the methods described herein include the following:
제 1항에 있어서, 상기 화합물은The compound of
여기서here
mPEG는 화학식: CH3-O(CH2CH2O)n-를 가지며;mPEG has the formula: CH 3 —O (CH 2 CH 2 O) n −;
PEG는 화학식: -O(CH2CH2O)n-를 가지며;PEG has the formula: -O (CH 2 CH 2 O) n- ;
(n)은 약 10 내지 약 2,300의 양의 정수이며;(n) is a positive integer from about 10 to about 2,300;
R51 및 R52는 독립적으로 수소, C1-6 알킬, C3-12 분지된 알킬, C3-8 사이클로알킬, C1-6 치환된 알킬, C3-8 치환된 사이클로알킬, 아릴, 치환된 아릴, 아랄킬, C1-6 헤테로알킬, 치환된 C1-6 헤테로알킬, C1-6 알콕시, C1-6 알킬옥시카르보닐, 아릴옥시카르보닐, 페녹시 및 C1-6 헤테로알콕시로 구성된 군으로부터 선택되는 것이며;R 51 and R 52 are independently hydrogen, C 1-6 alkyl, C 3-12 branched alkyl, C 3-8 cycloalkyl, C 1-6 substituted alkyl, C 3-8 substituted cycloalkyl, aryl, Substituted aryl, aralkyl, C 1-6 heteroalkyl, substituted C 1-6 heteroalkyl, C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, phenoxy and C 1-6 One selected from the group consisting of heteroalkoxy;
D1은 표적화 부분, 작용기 또는 이탈기이며; 및D 1 is a targeting moiety, a functional group or a leaving group; And
D2는 생물학적 활성 부분, 작용기 또는 이탈기이다.D 2 is a biologically active moiety, functional group or leaving group.
본 발명에 따른 바람직한 고분자 화합물은 하기를 포함한다:Preferred polymeric compounds according to the present invention include:
{여기서{here
S-SCA는 단일 사슬 항체이며; S-SCA is a single chain antibody;
RGD는 RGD is
LNA는 잠금 핵산이며; LNA is a locked nucleic acid;
폴산은 Folic acid
mPEG는 화학식: CH3-O(CH2CH2O)n-를 가지며;mPEG has the formula: CH 3 —O (CH 2 CH 2 O) n −;
PEG는 화학식: -O(CH2CH2O)n-를 가지며; 및PEG has the formula: -O (CH 2 CH 2 O) n- ; And
(n)은 약 10 내지 약 2,300의 양의 정수이다.(n) is a positive integer from about 10 to about 2,300.
I. 컨쥬게이트를 제조하는 방법I. Methods of Making Conjugates
일반적으로, 컨쥬게이트는 다기능성 링커에 고분자, 세폭독성제 및 표적 부분을 순차적으로 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 상기 부가의 정확한 순서가 상기 순서에 한정되지 않는 것은 당업자에게 자명한 것이며, 한가지 측면은 우선 PEG가 다기능성 링커에 접합되고, 이어서 세포독성 약물이 해체가능하게 접합되며, 이어서 단클론 항체 등의 표적화제가 접합할 수 있다. 이런 예시의 바람직한 측면을 고려하는 상세한 설명은 하기 실시예에 제공된다. In general, conjugates can be prepared by sequentially conjugating a polymer, a toxic agent and a target moiety to a multifunctional linker. It will be apparent to those skilled in the art that the exact order of addition is not limited to this order, and one aspect is that PEG is first conjugated to a multifunctional linker, and then cytotoxic drugs are releasably conjugated, followed by targeting agents such as monoclonal antibodies and the like. Can be bonded. Detailed descriptions that consider preferred aspects of this example are provided in the Examples below.
본 발명의 한가지 측면에 있어서, 다기능성 링커를 가지는 고분자 화합물은 OH 또는 이탈기 말단을 가지는 고분자 화합물과 최적의 링커를 통해 접합된 세포독성제를 포함하는 친핵체를 접합시킴으로써 제조될 수 있다. 당업자는 세포독성제 및 이탈기를 포함하는 고분자 붕간물을 형성하기 위해 이탈기의 수에 비해 적은 양의 친핵체를 시용할 수 있다. 이런 중간물은 세포독성제 및 표적화제로 다중 치환된 고분자 컨쥬게이트를 형성하기 위해 추가적으로 표적 부분와 반응될 수 있다. 또한, 상기 고분자는 다양한 친핵체 부분에 다양한 화학적 반응을 제공하기 위해 다양한 기(grou)로 활성화될 수 있다. 예를 들어, 카르복실 말단의 테르트-부 에스테르(tert-Bu ester) 및 메틸 에스테르와 같은 보호기는 세포독성제 및 표적화제와 같은 다른 생물학적 활성제와 접합될 수 있는 다양한 정도의 활성기를 제공하기 위해 선택적이고 단계적으로 탈보호될 수 있다. 도 1에서 보여진 바와 같이, 말레이미딜기(maleimidyl group) 및 숙신이미딜 에스테르(succinimidyl ester)는 각각 SH 또는 NH2를 포함하는 부분와 선택적으로 반응할 수 있다. In one aspect of the invention, the polymer compound having a multifunctional linker may be prepared by conjugating a polymer compound having an OH or leaving group end with a nucleophile comprising a cytotoxic agent conjugated via an optimal linker. One skilled in the art can apply a small amount of nucleophile relative to the number of leaving groups to form polymeric intercalates comprising cytotoxic agents and leaving groups. Such intermediates may be further reacted with the target moiety to form polymer conjugates that are multiply substituted with cytotoxic and targeting agents. In addition, the polymer can be activated with various groups to provide various chemical reactions to various nucleophilic moieties. For example, protecting groups such as tert-Bu esters and methyl esters at the carboxyl terminus are provided to provide varying degrees of activity that can be conjugated with other biologically active agents such as cytotoxic and targeting agents. It can be selectively and stepwise deprotected. As shown in FIG. 1, maleimidyl groups and succinimidyl esters can selectively react with moieties comprising SH or NH 2 , respectively.
본 명세서에서 기재된 모든 반응은 당업자에게 알려진 필수적인 단계 및 조건을 포함하는 표준적인 화학 반응이다. 그러므로 본 명세서에서 기재된 합성 반응은 과도한 실험을 요구하지 않는다. All reactions described herein are standard chemical reactions including the essential steps and conditions known to those skilled in the art. Therefore, the synthetic reactions described herein do not require excessive experimentation.
다기능성 링커를 포함하는 고분자를 제조하는 방법은 하기를 포함한다: Methods for preparing polymers comprising multifunctional linkers include the following:
하기 화학식(Ⅲc)의 화합물:A compound of formula (IIIc)
(Ⅲc)을 형성하기에 충분한 조건하에서, Under conditions sufficient to form (IIIc),
하기 화학식(Ⅲa)의 화합물:A compound of formula IIIa:
하기 화학식(Ⅲb)의 화합물:A compound of formula IIIb:
여기서here
R1은 실질적으로 비항원 수용성 고분자이며;R 1 is substantially a non-antigenic water soluble polymer;
A21은 캡핑기 또는A 21 is the capping machine or
A22는 캡핑기 또는A 22 is the capping machine or
M1은 작용기이며; M 1 is a functional group;
D22는 생물학적 활성 부분이며; D 22 is a biologically active moiety;
M2는 OH 또는 이탈기이며;M 2 is OH or a leaving group;
M3는 OH, NH2, 또는 SH이며;M 3 is OH, NH 2 , or SH;
L1은 영구적인 링커 또는 해리가능 링커이며; L 1 is a permanent linker or dissociable linker;
L2는 다기능성 링커이며;L 2 is a multifunctional linker;
L3는 영구적인 링커 또는 해리가능 링커이며; 및L 3 is a permanent linker or dissociable linker; And
(a) 및 (b)는 독립적으로 0 또는 양의 정수이다.(a) and (b) are independently 0 or a positive integer.
상기 방법은 추가적으로 하기를 포함한다:The method further includes:
하기 화학식(Ⅲe)의 화합물:A compound of formula (IIIe)
하기 화학식(Ⅲc)의 화합물:A compound of formula (IIIc)
하기 화학식(Ⅲd)의 화합물:A compound of formula (IIId)
여기서:here:
A23은 캡핑기 또는A 23 is the capping machine or
M1은 작용기이며;M 1 is a functional group;
D21은 표적화 부분이며; 및D 21 is a targeting moiety; And
M4는 OH, NH2, 또는 SH이다.M 4 is OH, NH 2 , or SH.
PEG 또는 다른 고분자에 대한 화학식(Ⅲb)와 같은 친핵체 화합물의 접합은 당업자에게 잘 알려진 표준적인 화학 합성 기술을 이용하여 수행될 수 있다. SC-PEG, PEG-아민, PEG 산 등과 같은 활성화된 고분자 부분은 상업적 공급 또는 과도한 실험 없이 당업자에 의해 합성되는 것으로부터 획득될 수 있다.Conjugation of nucleophilic compounds such as formula (IIIb) to PEG or other polymers can be carried out using standard chemical synthesis techniques well known to those skilled in the art. Activated polymer moieties such as SC-PEG, PEG-amines, PEG acids and the like can be obtained from those synthesized by those skilled in the art without commercial supply or undue experimentation.
고분자 부분에 대한 화학식(Ⅲb)와 같은 친핵체 화합물의 접합은 결합제(coupling agent)의 존재 하에 수행되는 것이 바람직하다. 적절한 결합제로는, 예를 들어 시그마-알드리치 화학(Sigma-Aldrich Chemical)과 같은 상업적 공급 또는 당업자에 의해 합성되는, 1,3-다이이소프로필카보다이이미드(1,3-diisopropylcarbodiimide; DIPC), 어떤 적합한 다이알킬 카보다이이미드(dialkyl carbodiimides), 2-할로-1-알킬-피리디니움 할라이드[2-halo-1-alkyl-pyridinium halides(Mukaiyama reagents)], 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸 카보다이이미드[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide; EDC], 프로판 포스폰산 사이클리칸하이드리드(propane phosphonic acid cyclicanhydride; PPACA) 및 페닐 다이클로로포스포산(phenyl dichlorophosphates) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.Conjugation of the nucleophile compound, such as formula (IIIb) to the polymer moiety, is preferably carried out in the presence of a coupling agent. Suitable binders include, for example, 1,3-diisopropylcarbodiimide (DIPC), which are synthesized by commercial suppliers such as Sigma-Aldrich Chemical or by one skilled in the art. Suitable dialkyl carbodiimides, 2-halo-1-alkyl-pyridinium halides [2-halo-1-alkyl-pyridinium halides (Mukaiyama reagents)], 1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl carbodiimide [1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl carbodiimide; EDC], propane phosphonic acid cyclicanhydride (PPACA) and phenyl dichlorophosphates, and the like.
바람직하게, 상기 반응은 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 클로로포름(chloroform), DMF 또는 이들의 혼합물 같은 불활성 용매에서 수행된다. 상기 반응은, 바람직하게 생성된 산을 중화시키는 다이메틸아미노피리딘(dimethylaminopyridine; DMAP), 다이이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine), 피리딘(pyridine), 타리에틸아민(triethylamine) 등과 같은 염기의 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 반응은 약 0℃ 내지 약 22℃(실혼)의 온도에서 수행될 수 있다. 본 명세서의 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다.Preferably, the reaction is carried out in an inert solvent such as methylene chloride, chloroform, DMF or mixtures thereof. The reaction is preferably carried out in the presence of a base such as dimethylaminopyridine (DMAP), diisopropylethylamine, pyridine, triethylamine, etc., which neutralizes the acid produced. Can be. The reaction may be carried out at a temperature of about 0 ° C to about 22 ° C (room mixing). It may be prepared by the method described herein.
H. 치료 방법H. Treatment Methods
본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 유효한 양의 화학식(I)의 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유류를 치료하는 방법을 제공한다.In another aspect of the invention, the invention provides a method of treating a mammal comprising administering to a patient in need thereof a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a compound of formula (I) of the invention. to provide.
본 발명의 한가지 바람직한 실시에 있어서, 유효한 양의 화학식(I)의 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 악성 종양 또는 암에 걸린 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에 있어서, 상기 치료되는 암은 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다: 고형암, 임파종(lymphoma), 소세포 폐암(small cell lung cancer), 급성 림프구성 백혈병(acute lymphocytic leukemia; ALL), 췌장암, 교모세포종(glioblastoma), 자궁암 및 식도암 등. 상기 조성물은 종양 질환 치료, 종괴 크기의 감소, 종양의 전이 예방, 및 종양 재발 및 포유류에서 종양 성장의 예방에 유용하다.In one preferred embodiment of the present invention, there is provided a method of treating a patient with a malignant tumor or cancer comprising administering to a patient in need thereof an effective amount of a pharmaceutical composition comprising an effective amount of a compound of formula (I) Provide a method. In some aspects, the cancer to be treated may be one or more selected from the group consisting of: solid cancer, lymphoma, small cell lung cancer, acute lymphocytic leukemia (ALL), Pancreatic cancer, glioblastoma, uterine cancer and esophageal cancer. The composition is useful for treating tumor disease, reducing tumor size, preventing tumor metastasis, and preventing tumor recurrence and tumor growth in mammals.
본 발명의 또 다른 측면은 포유류의 다양한 의학적 조건에 관한 치료 방법을 제공한다. 간략히 기재하면, PEG 고분자에 접합될 수 있는 생물학적 활성 부분는 이런 치료를 필요로하는 포유류에게 투여될 수 있다. 비접합 상태에서 치료 효과를 가지는 올리고뉴클레오티드 등은 본 명세서에서 기제된 바와 같이 제조된, 접합된 형태로 사용될 수 있다. Another aspect of the invention provides a method of treatment for various medical conditions in a mammal. Briefly, biologically active moieties that can be conjugated to PEG polymers can be administered to mammals in need of such treatment. Oligonucleotides and the like having therapeutic effects in the unconjugated state can be used in conjugated form, prepared as described herein.
투여되는 상기 조성물의 양은 이에 포함되는 모체 분자에 의존할 것이다. 일반적으로, 상기 치료 방법에 사용되는 전구약물의 양은 포유류에서 요구되는 치료 결과를 효과적으로 달성할 수 있는 양이다. 자연적으로, 다양한 전구약물 화학물의 투여량은 모체 화합물, 생체내 가수분해 속도, 고분자의 분자량 등에 매우 의존적할 것이다. 당업자는 임상적 경험과 치료 지표를 근거로 선택되는 고분자 수송 컨쥬게이트의 최적의 투여량을 결정할 것이다. 실제 투여량은 과도한 실험 없이 당업자에게 분명할 것이다.The amount of the composition administered will depend on the parent molecule contained therein. In general, the amount of prodrug used in the method of treatment is that amount which can effectively achieve the desired therapeutic result in the mammal. Naturally, the dosage of the various prodrug chemicals will be highly dependent on the parent compound, the rate of hydrolysis in vivo, the molecular weight of the polymer, and the like. Those skilled in the art will determine the optimal dosage of the polymer transport conjugate selected based on clinical experience and therapeutic indicators. Actual dosages will be apparent to those skilled in the art without undue experimentation.
본 발명의 화합물은 포유류에 투여하기 위해 하나 이상의 적절한 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 용액, 현탁액, 알약, 갭슐 등의 제형이 될 수 있다. 또한, 상기 조성물의 투여는 당업자의 필요에 따라 경구 또는 비경구에 의해 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 상기 조성물의 용액 또는 현탁액은, 예를 들어 정맥 주사, 근육내 주사, 복강 주사, 피하 주사 등의 당업계에 알려진 방법에 의한 조성물의 주입 또는 침윤을 위한 운송 담체(carrier vehicle)로서 이용될 수 있다. 또한, 이런 투여는 체공간 또는 체강 내로 주입 뿐만 아니라 흡입(inhalation) 또는 비강내(intranasal) 루트에 의해 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 측면에 있어서, 상기 고분자 컨쥬게이트는 이를 필요로하는 포유류에 비경구로 투여된다. The compounds of the present invention may be included in one or more suitable pharmaceutical compositions for administration to a mammal. The pharmaceutical composition may be in the form of a solution, a suspension, a pill, a capsule, or the like. It is also contemplated that administration of the composition may be carried out orally or parenterally as needed by those skilled in the art. The solution or suspension of the composition may be used as a carrier vehicle for infusion or infiltration of the composition by methods known in the art, for example, by intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like. . Such administration can also be performed by inhalation or intranasal route as well as infusion into body space or body cavity. However, in a preferred aspect of the invention, the polymer conjugate is administered parenterally to a mammal in need thereof.
또한, 본 발명의 측면에 있어서, 포유동물 세포에 폴리뉴클레오티드(올리고뉴클레오티드), 바람직하게 안티센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 양의 본 명세서에서 기재된 바와 같이 제조된 컨쥬게이트를 치료되는 조건에 대한 폴리뉴클레오티드 효능에 의존할 것인 상기 치료되는 조건에 전달하는 것을 포함한다. 예를 들어, 비접합된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 안티센스 BCL3 올리고뉴클레오티드, 안티센스 설비빈 올리고뉴클레오티드)가 암 또는 종양 세포에 대한 효능을 가지는 경우, 상기 방법은 원래의 올리고뉴클레오티드의 민감도를 가지는 세포에 상기 올리고티드를 포함하는 고분자 컨쥬게이트를의 전달하는 것을 포함할 것이다. 상기 전달은 족졸한 약학적 조성물의 부분으로서 생체내에서 만들어지거나 또는 생체외 환경에서 세포에 직접적으로 수행될 수 있다. 한가지 특정 치료에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 고분자 컨쥬게이트(서열번호 1, 서열번호 2 및 3, 및 서열번호 4)가 사용될 수 있다.In addition, in an aspect of the present invention, there is provided a method of administering a polynucleotide (oligonucleotide), preferably an antisense oligonucleotide, to a mammalian cell. The method comprises delivering an effective amount of a conjugate prepared as described herein to the condition being treated which will depend on the polynucleotide potency for the condition being treated. For example, if an unconjugated oligonucleotide (eg, an antisense BCL3 oligonucleotide, an antisense sorbin oligonucleotide) has efficacy on cancer or tumor cells, the method may be directed to cells having the sensitivity of the original oligonucleotide. It will include delivering a polymer conjugate comprising said oligotides. The delivery may be made in vivo as part of a dissolving pharmaceutical composition or may be performed directly to the cell in an ex vivo environment. In one particular treatment, polymer conjugates comprising oligonucleotides (SEQ ID NOs: 1, SEQ ID NOs: 2 and 3, and SEQ ID NO: 4) can be used.
도 1은 실시예 1 내지 5에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이 다.1 is a schematic diagram illustrating the synthesis method described in Examples 1 to 5. FIG.
도 2는 실시예 6 내지 7에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.2 is a schematic diagram schematically showing the synthesis method described in Examples 6 to 7. FIG.
도 3은 실시예 8 내지 9에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.3 is a schematic diagram illustrating the synthesis method described in Examples 8-9.
도 4는 실시예 10 내지 14에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.4 is a schematic diagram schematically illustrating the synthesis method described in Examples 10 to 14. FIG.
도 5는 실시예 15 내지 17에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.FIG. 5 is a schematic diagram illustrating the synthesis method described in Examples 15 to 17. FIG.
도 6은 실시예 18 내지 19에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.6 is a schematic diagram schematically illustrating the synthesis method described in Examples 18 to 19. FIG.
도 7은 실시예 20 내지 23에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.FIG. 7 is a schematic diagram schematically showing the synthesis method described in Examples 20 to 23. FIG.
도 8은 실시예 24 내지 25에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.8 is a schematic diagram schematically illustrating the synthesis method described in Examples 24 to 25.
도 9는 실시예 26 내지 28에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.9 is a schematic diagram schematically showing the synthesis method described in Examples 26 to 28. FIG.
도 10은 실시예 29 내지 32에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.10 is a schematic diagram schematically showing the synthesis method described in Examples 29 to 32.
도 11은 실시예 33 내지 35에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림 이다.FIG. 11 is a schematic diagram schematically showing the synthesis method described in Examples 33 to 35. FIG.
도 12는 실시예 36 내지 38에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.12 is a schematic diagram schematically illustrating the synthesis method described in Examples 36 to 38. FIG.
도 13은 실시예 39 내지 40에 기재된 합성 방법을 개략적으로 도식화한 그림이다.FIG. 13 is a schematic diagram schematically showing the synthesis method described in Examples 39 to 40. FIG.
하기의 실시예는 본 발명의 추가적인 이해를 돕기 위해 제공되는 것이나, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다. 실시예에 기재된 볼드체의 숫자는 도 1에서 나타내는 것에 상응하는 것이다. 디사이클로헥실카르보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide; DCC), 디클로로메탄(dichloromethane; DCM), 디사이클로헥실우레아(Dicyclohexylurea; DCU), 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine; DIEA), 디이소프로필카르보디이미드(diisopropylcarbodiimide; DIPC), 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP), N,N'-디메틸포름아미드(N,N'-dimethylformamide; DMF), 디숙시니이미딜 카르보네이트(disuccinimidyl carbonate; DSC), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸 카르보디이미드[1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide; EDC], 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline; EEDQ), 이소프로파놀(isopropanol; IPA), N-하이드록시숙시니이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), N-메틸모르폴린(N- methylmorpholine; NMM), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG), 단일 사슬 항체(single-chain antibody; SCA-SH), 7-에틸-10-하이들록시캄포테신(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin; SN38), 테르트-부틸-디프로필실일(tert-butyl-dipropylsilyl; TBDPS), 및 트리에틸아민(triethylamine; TEA)과 같은 약어들을 실시예 전반에 걸쳐 사용된다. The following examples are provided to aid further understanding of the present invention, but the content of the present invention is not limited thereto. The bold numerals described in the examples correspond to those shown in FIG. 1. Dicyclohexylcarbodiimide (DCC), dichloromethane (DCM), dicyclohexylurea (DCU), diisopropylethylamine (DIEA), diisopropylcarbodiimide (diisopropylcarbodiimide; DIPC), 4-dimethylaminopyridine (DMAP), N, N'-dimethylformamide (DMF), disuccinimidyl carbonate (DSC), 1 -(3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl carbodiimide [1- (3-dimethylaminopropyl) -3-ethyl carbodiimide; EDC], 2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline (2-ethoxy-1-ethoxycarbonyl-1,2-dihydroquinoline (EEDQ), isopropanol (IPA), N -N-hydroxysuccinimide (NHS), N-methylmorpholine (NMM), polyethylene glycol (PEG), single-chain antibody (SCA-SH), 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin (SN38), tert-butyl-dipropylsilyl (TBDPS), and triethylamine (TEA) Abbreviations such as are used throughout the Examples.
일반적 절차. 모든 반응은 건조한 질소 또는 아르곤 환경 하에서 수행하였다. 상용화된 약제는 추가적인 정제없이 사용하였다. 모든 PEG 화합물은 진공 상태 또는 사용 전에 톨루엔 유래 공비증류(azeotropic distillation)로 건조하였다. 다른 특정이 없는 한 바리안 머큐리 300NMR 스펙트로미터(Varian Mercury 300 NMR spectrometer) 및 용매로서 중수소화된 클로로포름을 사용하여 1H NMR 스펙트럼은 300 MHz에서, 13C NMR 스펙트럼은 75.46 MHz에서 각각 획득하였다. 화학적 이동(Chemical shift)(δ)은 테트라메틸실란(tetramethylsilane; TMS)으로부터 유래된 다운필드(간섭)된 100만분율(parts per million; ppm)로 나타낸다. General procedure . All reactions were performed under dry nitrogen or argon environment. Commercially available agents were used without further purification. All PEG compounds were dried in toluene-derived azeotropic distillation in vacuo or prior to use. Unless otherwise specified, the Varian Mercury 300 NMR Spectrometer 300 NMR spectrometer) and 1 H NMR spectra were obtained at 300 MHz and 13 C NMR spectra at 75.46 MHz using deuterated chloroform as a solvent. Chemical shifts (δ) are expressed in downfield (interference) parts per million (ppm) derived from tetramethylsilane (TMS).
HPLC 방법. 반응 혼합물 및 중간물 및 최종 생산물의 순도는 Beckman Coulter System Gold®HPLC 기계에 의해 모니터링하였다. 이는, 1 mL/min의 유속으로 0.05% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid; TFA)에 대한 10 ~ 90%의 아세토니트 릴(acetonitrile)의 농도구배를 이용하여, 168 다이오드 배열 UV 탐지기(168 Diode Array UV Detector)를 포함하는 ZORBAX®300SB C8 역상 컬럼(150 × 4.6 mm) 또는 Phenomenex Jupiter 300A C18 역상 컬럼(150 × 4.6 mm)을 이용하였다. HPLC method . The purity of the reaction mixture and intermediates and final product was monitored by a Beckman Coulter System Gold ® HPLC machine. This is accomplished by using a concentration gradient of 10 to 90% acetonitrile with respect to 0.05% trifluoroacetic acid (TFA) at a flow rate of 1 mL / min. the UV Detector) ZORBAX ® 300SB C8 reversed phase column (150 × 4.6 mm) or a Phenomenex Jupiter 300A C18 reversed phase column (150 × 4.6 mm) was used comprising a.
실시예 1. N-(메톡시카르보닐)말레이미드[N-(Methoxycarbonyl)maleimide] (화합물 1). Example 1. N- (methoxycarbonyl) maleimide [N- (Methoxycarbonyl) maleimide] (Compound 1).
0℃에서 말레이미드(5.5 g, 56.7 mmol, 1 eq) 및 NMM(6.2 mL, 56.7 mmol, 1 eq)을 포함하는 200 mL의 EtOAc 용액에 메틸클로로포르메이트(Methylchloroformate)(4.4 mL, 56.7 mmol, 1 eq)을 첨가하였다. 상기 현탁액을 0℃에서 30분 동안 교반한 후, 여과한 다음, EtOAc로 세척하였다. 여과 및 세척을 겸한 후, 냉수로 세척한 다음, 무수 Na2SO4를 통해 건조하였다. 여과 및 진공 하에서 증발시킨 후, 분홍색 고체를 획득하였다. 실리카겔 상에서 컬럼 클로마토그래피(Hexane-EtOAc, 1:1, v/v)에 의한 정제를 통해 산물을 수득하였다(4.8 g, 55%). Methylchloroformate (4.4 mL, 56.7 mmol, in 200 mL of EtOAc solution containing maleimide (5.5 g, 56.7 mmol, 1 eq) and NMM (6.2 mL, 56.7 mmol, 1 eq) at 0 ° C. 1 eq) was added. The suspension was stirred at 0 ° C. for 30 minutes, then filtered and washed with EtOAc. After filtration and washing, the mixture was washed with cold water and then dried over anhydrous Na 2 SO 4 . After filtration and evaporation in vacuo, a pink solid was obtained. The product was obtained via purification by column chromatography on silica gel (Hexane-EtOAc, 1: 1, v / v) (4.8 g, 55%).
실시예 2. NExample 2. N εε -말레오일-α-(Boc)-L-라이신[N-Maleoyl-α- (Boc) -L-lysine [N εε -Maleoyl-α-(Boc)-L-lysine] (화합물 2). -Maleoyl-α- (Boc) -L-lysine] (Compound 2).
0℃에서 Boc-L-라이신(500 mg, 2.03 mmol, 1 eq)을 포함하는 10 mL의 포화된 액체 NaHCO3에 N-(메틸카르보닐)말레이미드[N-(Methoxycarbonyl)maleimide](315 mg, 2.03 mmol, 1 eq)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 40분 동안 강하게 교반시킨 후, 실온에서 1시간 동안 강하게 교반시켰다. 0℃에서 냉각시킨 후, 상기 용액을 농축된 H2SO4로 pH 3.0으로 산성화시킨 후, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층(organic layer)을 결합시킨 후, 무수 MgSO4를 통해 건조시켰다. 진공 하에서 용매를 제거한 후, 잔여물을 CHCl3-MeOH(5:1, v/v) 혼합물을 이용한 실리카겔 상에서 컬럼 클로마토그래피에 의한 정제를 통해 산물을 수득하였다(458 mg, 69%): 1H NMR δ 1.39-1.87 (6 H, m, (CH2)3), 1.44 (9H, s, Boc), 3.52 (2H, t, J = 7.2 Hz, NCH2), 4.25-4.30 (1H, m, CH), 5.15 (1H, d, NH), 6.70 (2H, s, maleimide). N- (methylcarbonyl) maleimide [N- (Methoxycarbonyl) maleimide] (315 mg) in 10 mL of saturated liquid NaHCO 3 containing Boc-L-lysine (500 mg, 2.03 mmol, 1 eq) at 0 ° C. , 2.03 mmol, 1 eq) was added. The mixture was stirred vigorously at 0 ° C. for 40 minutes and then vigorously stirred at room temperature for 1 hour. After cooling at 0 ° C., the solution was acidified to pH 3.0 with concentrated H 2 SO 4 and then extracted with ethyl acetate. The organic layer was combined and then dried over anhydrous MgSO 4 . After removal of the solvent under vacuum, the residue was obtained by column chromatography on silica gel using CHCl 3 -MeOH (5: 1, v / v) mixture (458 mg, 69%): 1 H NMR δ 1.39-1.87 (6 H, m, (CH 2 ) 3 ), 1.44 (9H, s, Boc), 3.52 (2H, t, J = 7.2 Hz, NCH 2 ), 4.25-4.30 (1H, m , CH), 5.15 (1H, d, NH), 6.70 (2H, s, maleimide).
실시예 3. NExample 3. N εε -말레오일-α-L-라이신 (화합물 3). -Maleoyl-α-L-lysine (compound 3).
실온에서 1시간 동안, Nε-말레오일-α-(Boc)-L-라이신(172 mg, 0.53 mmol)을 포함하는 5 mL의 무수 DCM에 2N HCl을 포함하는 10 mL의 에틸 에테르로 처리한 후, 10 mL의 무수 에틸 에테르를 첨가하였다. 상기 결과물인 고체를 여과하여 Nε-말레오일-α-L-라이신의 HCl 염을 82 mg(59%) 수득하였다: 1H NMR (CD3OD) δ 1.36-1.54 (2 H, m, CH2), 1.65 (2 H, q, J = 7.2 Hz, CH2), 1.83-2.02 (2 H, m, CH2), 1.44 (9H, s, Boc), 3.53 (2H, t, J = 6.9 Hz, NCH2), 3.95 (1H, t, 6.2 Hz, CH), 6.82 (2H, s, maleimide); 13C NMR (CD3OD) δ 23.17, 29.03, 31.01, 37.96, 135.26, 172.34, 175.20.For 1 hour at room temperature, 5 mL of anhydrous DCM containing N ε -maleoyl-α- (Boc) -L-lysine (172 mg, 0.53 mmol) was treated with 10 mL of ethyl ether containing 2N HCl. Then 10 mL of anhydrous ethyl ether was added. The resulting solid was filtered to give 82 mg (59%) of HCl salt of N ε -maleoyl-α-L-lysine: 1 H NMR (CD 3 OD) δ 1.36-1.54 (2 H, m, CH 2 ), 1.65 (2H, q, J = 7.2 Hz, CH 2 ), 1.83-2.02 (2H, m, CH 2 ), 1.44 (9H, s, Boc), 3.53 (2H, t, J = 6.9 Hz, NCH 2 ), 3.95 (1H, t, 6.2 Hz, CH), 6.82 (2H, s, maleimide); 13 C NMR (CD 3 OD) δ 23.17, 29.03, 31.01, 37.96, 135.26, 172.34, 175.20.
실시예 4. Example 4. 5K5K mPEG-아미드-Lys(NmPEG-amide-Lys (N εε -말레오일)-COOH (화합물 4). -Maleoyl) -COOH (Compound 4).
5KmPEGCOONHS(805 mg, 0.16 mmol, 1 eq)를 포함하는 8 mL의 무수 DCM에 Nε-말레오일-α-L-라이신(3, 82 mg, 0.31 mmol, 2 eq)를 포함하는 2 mL의 DMF를 첨가한 후, DIEA(109 uL, 0.62 mmol, 4 eq)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 우선 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켰다. 13C NMR (CDCl3): δ 22.53, 28.02, 31.69, 37.32, 51.18, 58.86, 70.11-71.73 (PEG), 133.84, 169.51, 170.38, 172.41.2 mL of N ε -maleoyl-α-L-lysine ( 3 , 82 mg, 0.31 mmol, 2 eq) in 8 mL of anhydrous DCM containing 5K mPEGCOONHS (805 mg, 0.16 mmol, 1 eq) After addition of DMF, DIEA (109 uL, 0.62 mmol, 4 eq) was added. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature and then evaporated under vacuum. The residue was first precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA. 13 C NMR (CDCl 3 ): δ 22.53, 28.02, 31.69, 37.32, 51.18, 58.86, 70.11-71.73 (PEG), 133.84, 169.51, 170.38, 172.41.
실시예 5. Example 5. 5K5K mPEG-아미드-Lys(NmPEG-amide-Lys (N εε -말레오일)-NHS (화합물 5). -Maleoyl) -NHS (Compound 5).
0℃에서 5KmPEG-Lys(Nε-maleoyl)-COOH(4) 및 NHS을 포함하는 DCM에 DCC를 처리하였다. 상기 혼합물을 밤세 실온에서 교반시켰다. 상기 용액을 진공 하에서 증발시킨 후, 남은 잔여물을 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켰다.From 0 ℃ in DCM containing 5K mPEG-Lys (N ε -maleoyl ) -COOH (4) and NHS were treated with DCC. The mixture was stirred overnight at room temperature. After evaporation of the solution under vacuum, the remaining residue was precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA.
실시예 6. Example 6. 5K5K mPEG-카르바메이트-Lys(NmPEG-carbamate-Lys (N εε -말레오일)-COOH (화합물 6). -Maleoyl) -COOH (Compound 6).
5KmPEGCOONHS(5 g, 0.98 mmol, 1 eq)을 포함하는 45 mL의 무수 DCM에 Nε-말레오일-α-L-라이신 (3, 514 mg, 1.95 mmol, 2 eq)을 포함하는 5 mL의 DMF을 첨가한 후, DIEA(0.7 mL, 3.92 mmol, 4 eq)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 우선 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 화합물 6을 수득하였다: 13C NMR δ 22.30, 28.01, 31.89, 37.29, 53.26, 58.89, 64.06, 69.31-71.77 (PEG), 133.87, 155.60, 170.42, 172.82. 5 mL of N ε -maleoyl-α-L-lysine ( 3 , 514 mg, 1.95 mmol, 2 eq) in 45 mL of anhydrous DCM containing 5K mPEGCOONHS (5 g, 0.98 mmol, 1 eq) After addition of DMF, DIEA (0.7 mL, 3.92 mmol, 4 eq) was added. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature and then evaporated under vacuum. The residue was first precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give compound 6 : 13 C NMR δ 22.30, 28.01, 31.89, 37.29, 53.26, 58.89, 64.06, 69.31-71.77 ( PEG), 133.87, 155.60, 170.42, 172.82.
실시예 7. Example 7. 5K5K mPEG-카르바메이트-Lys(NmPEG-carbamate-Lys (N εε -말레오일)-NHS (화합물 7). -Maleoyl) -NHS (Compound 7).
0℃에서 5KmPEG-카르바메이트-Lys(Nε-말레오일)-COOH(6, 1 g, 0.19 mmol, 1 eq) 및 NHS(88 mg, 0.76 mmol, 4 eq)을 포함하는 10 mL의 DCM 용액에 DIPC(118 uL, 0.76 mmol, 4 eq)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 상기 용액을 진공 하에서 증발시킨 후, 잔여물을 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 화합물 7을 수득하였다: 13C NMR δ 22.31, 25.90, 28.25, 32.39, 37.44, 52.42, 59.30, 64.92, 69.64-72.18 (PEG), 134.25, 155.59, 167.75, 168.55, 170.91.10 mL of 5K mPEG-carbamate-Lys (N ε -maleoyl) -COOH ( 6 , 1 g, 0.19 mmol, 1 eq) and NHS (88 mg, 0.76 mmol, 4 eq) at 0 ° C. To the DCM solution was added DIPC (118 uL, 0.76 mmol, 4 eq). The mixture was stirred at rt overnight. After evaporation of the solution under vacuum, the residue was precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give
실시예 8. 화합물 8.Example 8.
5' extGS(5 mg, 0.85 mmol)를 포함하는 PBS 완충용액(2.5 mL, pH 7.8)에 화합물 7(92 mg, 17 mmol, 20 eq)을 첨가한 후, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 반응 혼합물을 10 mL의 물로 희석시킨 후, 여과시킨 다음, 20 mM Tris-HCl 완충용액, pH 7.0(완충용액 A)로 사전에 평형화된 강한 음이온 교환 컬럼(strong anion exchange column)인 Poros HQ에 적재시켰다. 컬럼에 반응하지 않은 PEG 링커를 제거하기 위해, 상기 컬럼을 3 ~ 4 컬럼 부피의 완충용액 A로 세척하였다. 그런 다음, 상기 산물을 20 mM Tris-HCl 완충용액, pH 7.0(완충용액 B)에서 0 내지 100%의 1 M NaCl의 농도구배하여 10분에 용출시킨 다음, 10 mL/min의 유속으로 10분 동안 100% 완충용액 B에 의해 용출시켰다. 상기 용출된 산물을 HiPrep 탈염화 컬럼(50 mL)을 이용하여 탈염시킨 후, 감압 하 동결건조하여 화합물 8을 수득하였다[1 mg 올리고 당량(oligo equivalent), 수득률: 40%]. Compound 7 (92 mg, 17 mmol, 20 eq) was added to PBS buffer (2.5 mL, pH 7.8) containing 5 'extGS (5 mg, 0.85 mmol), and then the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. I was. The reaction mixture was diluted with 10 mL of water, filtered and then placed in Poros HQ, a strong anion exchange column previously equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0 (buffer A). Loaded. To remove PEG linkers that did not react to the column, the column was washed with 3-4 column volumes of Buffer A. The product was then eluted at 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0 (buffer B) at a concentration of 0-100% 1 M NaCl for 10 minutes and then at 10 mL / min flow rate for 10 minutes. Eluted by 100% Buffer B. The eluted product was desalted using a HiPrep desalting column (50 mL) and then lyophilized under reduced pressure to give compound 8 (1 mg oligo equivalent, yield: 40%).
실시예 9. 화합물 9.Example 9.
화합물 8(1 mg 올리고 당량)을 포함하는 PBS 완충용액(1 mL, pH 7.0)에 펩티드 cRGDfC(1 mg , 1.7 mmol)을 첨가한 후, 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반시켰다. 상기 반응 혼합물을 20 mL의 물로 희석시킨 후, 20 mM Tris-HCl 완충용액, pH 7.0(완충용액 A)로 사전에 평형화된 강한 음이온 교환 컬럼[10 mm x 1.5 mm, 베 드 볼륨(bed volume) ~ 16 mL]인 Poros HQ에 적재시켰다. 컬럼에 반응하지 않은 PEG 링커를 제거하기 위해, 상기 컬럼을 3 ~ 4 컬럼 부피의 완충용액 A로 세척하였다. 그런 다음, 상기 산물을 20 mM Tris-HCl 완충용액, pH 7.0(완충용액 B)에서 0 내지 100%의 1 M NaCl의 농도구배하여 10분에 용출시킨 다음, 10 mL/min의 유속으로 10분 동안 100% 완충용액 B에 의해 용출시켰다. 상기 용출된 산물을 HiPrep 탈염화 컬럼(50 mL)을 이용하여 탈염시킨 후, 감압 하 동결건조하여 화합물 9를 수득하였다(0.78 mg 올리고 당량, 수득률: 78%).Peptide cRGDfC (1 mg, 1.7 mmol) was added to PBS buffer (1 mL, pH 7.0) containing compound 8 (1 mg oligo equivalent), and then the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After diluting the reaction mixture with 20 mL of water, a strong anion exchange column [10 mm x 1.5 mm, bed volume) previously equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0 (buffer A) 16 mL] in Poros HQ. To remove PEG linkers that did not react to the column, the column was washed with 3-4 column volumes of Buffer A. The product was then eluted at 20 mM Tris-HCl buffer, pH 7.0 (buffer B) at a concentration of 0-100% 1 M NaCl for 10 minutes and then at 10 mL / min flow rate for 10 minutes. Eluted by 100% Buffer B. The eluted product was desalted using a HiPrep desalting column (50 mL) and then lyophilized under reduced pressure to give compound 9 (0.78 mg oligo equivalent, yield: 78%).
실시예 10. 화합물 10. Example 10.
p-아미노-벤질알코올(p-amino-benzylalcohol)(1 g, 8.12 mmol, 1 eq)을 포함하는 80 mL의 무수 THF 용액에 DIEA(1.4 mL, 8.12 mmol, 1 eq) 및 Boc2O(1.9 mL, 8.12 mmol, 1 eq)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 밤새 환류로 가열한 후, 냉각시킨 다음, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 EtOAc에서 용해하였다. 유기층을 0.1 N HCl 용액으로 세척하고, MgSO4을 통해 건조시킨 후, 여과한 다음, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 조산물(crude product)을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Hex-EtOAc, 1:1, v/v)에 의해 정제하여 1.85 g의 산물을 수득하였다(수득량): 1H NMR δ 0.1.49 (9H, s), 2.17 (1H, s), 4.53 (2H, s), 6.83 (1H, s), 7.19 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.28 (2H, d, J = 8.2 Hz); 13 C NMR δ 28.28, 64.54, 80.37, 118.49, 127.59, 135.31, 137.46, 152.72.DIEA (1.4 mL, 8.12 mmol, 1 eq) and Boc 2 O (1.9) in 80 mL of anhydrous THF solution containing p-amino-benzylalcohol (1 g, 8.12 mmol, 1 eq) mL, 8.12 mmol, 1 eq) was added. The mixture was heated to reflux overnight, then cooled and then evaporated in vacuo. The residue was dissolved in EtOAc. The organic layer was washed with 0.1 N HCl solution, dried over MgSO 4 , filtered and then evaporated in vacuo. The crude product was purified by silica gel column chromatography (Hex-EtOAc, 1: 1, v / v) to give 1.85 g of product (yield): 1 H NMR δ 0.1.49 (9H , s), 2.17 (1H, s), 4.53 (2H, s), 6.83 (1H, s), 7.19 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.28 (2H, d, J = 8.2 Hz); 13 C NMR δ 28.28, 64.54, 80.37, 118.49, 127.59, 135.31, 137.46, 152.72.
실시예 11. 화합물 11.
-20℃에서 화합물 10(220 mg, 0.98 mmol, 1 eq) 및 DIEA(188 uL, 1.08 mmol, 1.1 eq)를 포함하는 8 mL의 무수 DCM 용액에 MsCl(84 uL, 1.08 mmol, 1.1 eq)을 포함하는 2 mL의 무수 DCM를 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 상기 혼합물을 환류로 가열한 후 1시간 동안 교반시켰다. 상기 반응 혼합물을 포화된 NaHCO3 용액, 포화된 NH4Cl 용액 및 식염수로 세척한 후, MgSO4을 통해 건조시킨 다음, 여과 후, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 조화합물을 추가적인 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. MsCl (84 uL, 1.08 mmol, 1.1 eq) was added to 8 mL of anhydrous DCM solution containing compound 10 (220 mg, 0.98 mmol, 1 eq) and DIEA (188 uL, 1.08 mmol, 1.1 eq) at -20 ° C. 2 mL of anhydrous DCM was added dropwise. The mixture was heated to reflux and stirred for 1 hour. The reaction mixture was washed with saturated NaHCO 3 solution, saturated NH 4 Cl solution and brine, dried over MgSO 4 , then filtered and evaporated under vacuum. The crude compound was used for next step without further purification.
실시예 12. 화합물 12. Example 12.
화합물 11(0.98 mmol, 2 eq)이 용해된 15 mL의 무수 DMF에 SN38(192 mg, 0.49 mmol, 1 eq) 및 K2CO3(68 mg, 0.49 mmol, 1 eq)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 사전-가열된 내유성 시험기(Oil Bath)를 이용하여 60℃가지 가열시켰다. 2시간 후, HPLC를 통해 SN38의 완전한 제거 및 주요 산물의 형성을 확인하였다. 상기 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시킨 후, 잔여물을 EtOAc에 재용해시킨 다음, 물, 포화된 NH4Cl 및 식염수로 세척한 후, MgSO4을 통해 건조시킨 다음, 여과 후, 진공 하 에서 증발시켰다. 상기 조산물을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2-EtOAc, 1:1, v/v)를 통한 정제에 의해 140 mg의 산물을 수득하였다(수득률: 48%): 1H NMR (DMSO-d 6 ) δ 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.47 (9H, s), 1.85-1.88 (2H, m), 3.15-3.17 (2H, m), 5.25 (2H, s), 5.26 (2H, s), 5.42 (2H, s), 6.49 (1H, s), 7.26 (1H, s), 7.41-7.56 (6H, m), 8.05 (1H, d, J = 9.1 Hz), 9.39 (1H, s); 13C NMR (DMSO-d 6 ) δ 7.65, 13.31, 22.09, 27.96, 30.11, 49.31, 65.05, 69.47, 72.17, 78.84, 95.74, 103.39, 117.71, 117.92, 122.35, 127.44, 127.99, 128.43, 129.59, 131.07, 139.07, 143.46, 144.06, 145.92, 149.21, 149.69, 152.37, 156.46, 156.82, 172.11.To 38 mL of anhydrous DMF in which compound 11 (0.98 mmol, 2 eq) was dissolved was added SN38 (192 mg, 0.49 mmol, 1 eq) and K 2 CO 3 (68 mg, 0.49 mmol, 1 eq). The reaction mixture was heated to 60 ° C. using a pre-heated oil bath. After 2 hours, HPLC confirmed complete removal of SN38 and formation of main product. After evaporation of the reaction mixture under vacuum, the residue was redissolved in EtOAc and then washed with water, saturated NH 4 Cl and brine, dried over MgSO 4 , filtered and then evaporated in vacuo. . The crude product was purified by column chromatography on silica gel (CH 2 Cl 2 -EtOAc, 1: 1, v / v) to give 140 mg of product (yield: 48%): 1 H NMR (DMSO- d 6 ) δ 0.88 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.47 (9H, s), 1.85-1.88 (2H, m), 3.15-3.17 (2H, m), 5.25 (2H, s), 5.26 (2H, s), 5.42 (2H, s), 6.49 (1H, s), 7.26 (1H, s), 7.41-7.56 (6H, m), 8.05 (1H , d, J = 9.1 Hz), 9.39 (1H, s); 13 C NMR (DMSO- d 6) δ 7.65, 13.31, 22.09, 27.96, 30.11, 49.31, 65.05, 69.47, 72.17, 78.84, 95.74, 103.39, 117.71, 117.92, 122.35, 127.44, 127.99, 128.43, 129.59, 131.07, 139.07, 143.46, 144.06, 145.92, 149.21, 149.69, 152.37, 156.46, 156.82, 172.11.
실시예 13. 화합물 13.
15%(v/v) TFA를 포함하는 DCM 용액을 화합물 12(535 mg)에 첨가한 후, 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 또는 HPLC에 의해 개시 물질의 완전한 소멸이 보여질때 까지 교반하였다. 에틸 에테르(200 mL)를 첨가한 후, 결과물인 고체를 여과한 다음, 에테르로 세척하였다(307 mg, 수득률: 58%).After adding a DCM solution containing 15% (v / v) TFA to Compound 12 (535 mg), the mixture was stirred for 1 hour at room temperature or until HPLC showed complete disappearance of the starting material. After addition of ethyl ether (200 mL), the resulting solid was filtered and then washed with ether (307 mg, yield: 58%).
실시예 14. 화합물 14.
화합물 13(48 mg, 0.1 mmol, 1 eq) 및 화합물 15(36 mg, 0.1 mmol, 1 eq)에 EEDQ(48 mg, 0.2 mmol, 2 eq)를 처리하였다. 상기 혼합물을 암실에서 실온으로 밤새 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 제거한 후, 결과물인 고체 잔여물을 10 mL의 에틸 에테르로 분말화시켰다. 상기 고체를 여과한 후, 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(CHCl3:MeOH, 15 : 1 내지 9.1)를 통한 정제에 의해 산물을 수득하였다(8 mg, 수득률: 9%): 13 C NMR (DMSO-d 6 ) δ 7.8, 13.49, 18.11, 18.17, 18.58, 19.13, 19.25, 22.25, 26.51, 26.72, 28.19, 29.59, 30.26, 30.41, 30.50, 49.49, 51.67, 51.80, 52.90, 55.98, 59.26, 59.67, 63.03, 65.21, 69.54, 72.33, 77.91, 78.01, 95.92, 103.63, 118.10, 118.95, 122.52, 127.63, 128.21, 128.58, 131.17, 131.27, 138.53, 143.69, 144.25, 146.10, 149.43, 149.86, 155.15, 155.26, 156.63, 156.97, 158.48, 158.66, 170.39, 171.15, 171.33, 172.15, 172.29.Compound 13 (48 mg, 0.1 mmol, 1 eq) and compound 15 (36 mg, 0.1 mmol, 1 eq) were treated with EEDQ (48 mg, 0.2 mmol, 2 eq). The mixture was stirred overnight at room temperature in the dark. After the solvent was removed in vacuo, the resulting solid residue was triturated with 10 mL of ethyl ether. After filtration of the solid, the product was obtained by purification via column chromatography on silica gel (CHCl 3 : MeOH, 15: 1 to 9.1) (8 mg, yield: 9%): 13 C NMR (DMSO- d 6 ) δ 7.8, 13.49, 18.11, 18.17, 18.58, 19.13, 19.25, 22.25, 26.51, 26.72, 28.19, 29.59, 30.26, 30.41, 30.50, 49.49, 51.67, 51.80, 52.90, 55.98, 59.26, 59.67, 63.03, 65.21 , 69.54, 72.33, 77.91, 78.01, 95.92, 103.63, 118.10, 118.95, 122.52, 127.63, 128.21, 128.58, 131.17, 131.27, 138.53, 143.69, 144.25, 146.10, 149.43, 149.86, 155.15, 149.15, 149.15. , 158.66, 170.39, 171.15, 171.33, 172.15, 172.29.
실시예 15. Boc-Val-Cit-OH (화합물 15). Example 15 Boc-Val-Cit-OH (Compound 15).
Boc-Val-NHS(10 g, 31.81 mmol, 1 eq)을 포함하는 80 mL의 DME을 L-시트룰린(L-citrulline)(5.85 g, 33.40 mmol, 1.05 eq)을 포함하는 20 mL의 THF 및 NaHCO3(2.8g, 33.40 mmol, 1.05 eq)을 포함하는 80 mL의 물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 액상 시트르산(citric acid)(물에 대해 15%의 용액, 200 mL)을 첨가한 후, 상기 혼합물을 10% IPA/EtOAc(2 x 200 mL)으로 추출하였다. 상기 현탁액을 물(2 x 200 mL)로 세척한 후, 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 결과물인 고체를 200 mL의 에틸 에테르로 분말화시킨 후, 여과하여 산물을 획 득하였다(6.08 g, 수득률: 51%): 1H NMR (CD3OD) δ 0.92 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.97 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.44 (9H, s), 1.51-2.06 (5H, m), 3.12 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.90 (1H, d, J = 7.0 Hz), 4.37-4.41 (1H, m). 13C NMR (CD3OD): δ 18.58, 19.83, 27.58, 28.75, 30.03, 32.09, 40.48, 53.33, 61.38, 80.49, 157.75, 162.05, 174.30, 174.69.80 mL of DME containing Boc-Val-NHS (10 g, 31.81 mmol, 1 eq) was added to 20 mL of THF and NaHCO containing L-citrulline (5.85 g, 33.40 mmol, 1.05 eq) To 80 mL of water containing 3 (2.8 g, 33.40 mmol, 1.05 eq) was added. The mixture was stirred at rt overnight. After addition of citric acid (15% solution against water, 200 mL), the mixture was extracted with 10% IPA / EtOAc (2 × 200 mL). The suspension was washed with water (2 x 200 mL) and then the solvent was evaporated under vacuum. The resulting solid was triturated with 200 mL of ethyl ether and then filtered to afford the product (6.08 g, yield: 51%): 1 H NMR (CD 3 OD) δ 0.92 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.97 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.44 (9H, s), 1.51-2.06 (5H, m), 3.12 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.90 (1H, d, J = 7.0 Hz), 4.37-4.41 (1H, m). 13 C NMR (CD 3 OD): δ 18.58, 19.83, 27.58, 28.75, 30.03, 32.09, 40.48, 53.33, 61.38, 80.49, 157.75, 162.05, 174.30, 174.69.
실시예 16. 화합물 16 (Boc-Val-Cit-PAB). Example 16. Compound 16 (Boc-Val-Cit-PAB).
Boc-Val-Cit(1 g. 2.67 mmol, 1eq) 및 p-아미노벤질 알코올(p-aminobenzyl alcohol)(362 mg, 2.94 mmol, 1.1 eq)을 포함하는 2 : 1 DCM/MeOH(26 mL/13 mL)에 EEDQ(1.32 g, 5.34 mmol, 2 eq)을 처리하였다. 상기 혼합물을 암실에서 실온으로 밤새 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 제거한 후, 결과물인 고체 잔여물을 10 mL의 에틸 에테르로 분말화시켰다. 상기 고체를 여과하여 채취한 후, 에틸 에테르로 세척하여 산물을 수득하였다(900 mg, 수득률: 70%): 1H NMR (CD3OD) δ 0.93 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.97 (3H, d, J = 7.0 Hz), 1.44 (9H, s), 1.49-2.06 (5H, m), 3.07-3.29 (2H, m), 3.91 (1H, d, J = 6.7 Hz), 4.50-4.55 (3H, m), 7.29 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.22 (1H, d, J = 7.3 Hz); 13C NMR (CD3OD) δ 18.64, 19.85, 27.84, 28.75, 30.61, 31.92, 40.28, 54.90, 54.99, 61.73, 64.78, 80.62, 121.09, 128.44, 138.47, 138.55, 158.01, 162.11, 172.00, 174.42, 174.52.2: 1 DCM / MeOH (26 mL / 13) containing Boc-Val-Cit (1 g. 2.67 mmol, 1eq) and p-aminobenzyl alcohol (362 mg, 2.94 mmol, 1.1 eq) mL) was treated with EEDQ (1.32 g, 5.34 mmol, 2 eq). The mixture was stirred overnight at room temperature in the dark. After the solvent was removed in vacuo, the resulting solid residue was triturated with 10 mL of ethyl ether. The solid was collected by filtration and washed with ethyl ether to give the product (900 mg, yield: 70%): 1 H NMR (CD 3 OD) δ 0.93 (3H, d, J = 7.0 Hz), 0.97 (3H, d, J = 7.0 Hz), 1.44 (9H, s), 1.49-2.06 (5H, m), 3.07-3.29 (2H, m), 3.91 (1H, d, J = 6.7 Hz), 4.50- 4.55 (3H, m), 7.29 (2H, doublet, J = 8.5 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.22 (1H, d, J = 7.3 Hz); 13 C NMR (CD 3 OD) δ 18.64, 19.85, 27.84, 28.75, 30.61, 31.92, 40.28, 54.90, 54.99, 61.73, 64.78, 80.62, 121.09, 128.44, 138.47, 138.55, 158.01, 162.11, 172.00, 174.42 .
실시예 17. 화합물 14 (Boc-Val-Cit-PABE-SN38). Example 17. Compound 14 (Boc-Val-Cit-PABE-SN38).
Boc-Val-Cit-PAB(214 mg, 0.45 mmol, 1 eq)을 포함하는 3 mL의 CH3CN에 DIEA(0.23 mL, 1.35 mmol, 3 eq)을 첨가한 현탁액에, MsCl(0.1 mL, 1.35 mmol, 3 eq)을 포함하는 1 mL CH3CN 용액을 한 방울씩 떨어뜨려 첨가하였다. 1시간 후, TLC를 통해 남은 개시 물질이 없는 것을 확인하였다(CHCl3-MeOH, 5:1, v/v). 상기 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시킨 후, 결과물인 잔여물을 EtOAc에 용해시켰다. 유기상(organic phase)을 포화된 NH4Cl, 포화된 NaHCO3 및 식염수로 세척한 후, MgSO4을 통해 건조시킨 다음, 여과 후 진공 하에서 증발시켰다. 용해된 조잔여물을 포함하는 5 mL의 DMF를 SN38(88 mg, 0.22 mmol, 0.5 eq) 및 K2CO3(31 mg, 0.22 eq, 0.5 eq)에 첨가한 후, 혼합물을 60℃에서 3시간 동안 가열시켰다. HPLC에 의해 상기 산물 형성을 모니터하고 실시예 14에서 제조된 산물에 비교하였다. To a suspension containing DIEA (0.23 mL, 1.35 mmol, 3 eq) in 3 mL of CH 3 CN containing Boc-Val-Cit-PAB (214 mg, 0.45 mmol, 1 eq), MsCl (0.1 mL, 1.35 1 mL CH 3 CN solution containing mmol, 3 eq) was added dropwise. After 1 hour, TLC confirmed no residual starting material (CHCl 3 -MeOH, 5: 1, v / v). After evaporation of the reaction mixture under vacuum, the resulting residue was dissolved in EtOAc. The organic phase was washed with saturated NH 4 Cl, saturated NaHCO 3 and brine, dried over MgSO 4 , then filtered and evaporated under vacuum. 5 mL of DMF containing dissolved crude residue was added to SN38 (88 mg, 0.22 mmol, 0.5 eq) and K 2 CO 3 (31 mg, 0.22 eq, 0.5 eq), and the mixture was then stirred at 60 ° C. for 3 hours. Heated during. The product formation was monitored by HPLC and compared to the product prepared in Example 14.
실시예 18. 화합물 17. Example 18.
화합물 14를 포함하는 DCM에 2N HCl을 포함하는 에테르을 처리하였다. 반응이 완료된 후에 추가적으로 에테르를 첨가한 다음, 결과물인 고체를 여과한 후, 에테르 로 세척하여 Val-Cit-PABE-SN38를 수득하였다. 화합물 5를 포함하는 무수 DCM 용액에 HCl-Val-Cit-PABE-SN38을 포함하는 무수 DMF를 첨가한 후, DIEA를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 용매를 진공 하에서 제거한 후, 결과물인 고체를 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다.
실시예 19. 화합물 18. Example 19.
화합물 17(1eq)을 포함하는 DCM/DMF 혼합물 용액에 RGDC(2 eq)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 잔여물을 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 후, DMF/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다. RGDC (2 eq) was added to a DCM / DMF mixture solution containing compound 17 (1 eq). The reaction mixture was stirred overnight at room temperature, then the solvent was evaporated in vacuo. The residue was precipitated with DCM / ethyl ether and then recrystallized with DMF / IPA to give the product.
실시예 20. 화합물 19. Example 20.
20k4armPEGSC(7 g, 0.35 mmol, 1 eq)을 포함하는 60 mL의 무수 DCM 용액에 Lys(Boc)-OH(690 mg, 2.8 mmol, 2 eq)을 포함하는 15 mL의 DMF에 첨가한 후, DIEA(1 mL, 5.6 mmol, 4 eq)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 후, 여과한 다음, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 우선 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 후, CH3CN/IPA로 재경화시켜 화합물 19를 수득하였다: 13C NMR δ 21.88, 27.97, 29.04, 31.57, 39.60, 44.98, 53.00, 63.44, 68.86-70.37 (PEG), 78.04, 155.26, 172.89. To 60 mL of anhydrous DCM solution containing 20k 4armPEGSC (7 g, 0.35 mmol, 1 eq) was added to 15 mL of DMF containing Lys (Boc) -OH (690 mg, 2.8 mmol, 2 eq), DIEA (1 mL, 5.6 mmol, 4 eq) was added. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature, filtered and then evaporated in vacuo. The residue was first precipitated with DCM / ethyl ether and then recured with CH 3 CN / IPA to give compound 19 : 13 C NMR δ 21.88, 27.97, 29.04, 31.57, 39.60, 44.98, 53.00, 63.44, 68.86 -70.37 (PEG), 78.04, 155.26, 172.89.
실시예 21. 화합물 20. Example 21.
4arm-PEG-Lys(Boc)-OH를 포함하는 25 mL의 무수 DCM 용액에 4N HCl 용액을 포함하는 디옥산(dioxane)(25 mL)을 첨가하였다. 상기 반응물을 4시간 동안 실온에서 교반시킨 다음, 진공 하에서 증발시켰다. 잔여물을 에틸 에테르의 첨가에 의해 침전시켰다. 상기 고체를 여과한 후, 에테르로 세척하여 4arm-PEG-Lys-OH(1.77 g)를 수득하였다: 13C NMR δ 21.97, 26.54, 31.22, 39.63, 45.11, 53.16, 63.66, 69.88-70.51 (PEG), 78.04, 155.59, 172.78.To 25 mL of anhydrous DCM solution containing 4arm-PEG-Lys (Boc) -OH was added dioxane (25 mL) with 4N HCl solution. The reaction was stirred at rt for 4 h and then evaporated in vacuo. The residue was precipitated by the addition of ethyl ether. The solid was filtered and washed with ether to give 4arm-PEG-Lys-OH (1.77 g): 13 C NMR δ 21.97, 26.54, 31.22, 39.63, 45.11, 53.16, 63.66, 69.88-70.51 (PEG) , 78.04, 155.59, 172.78.
실시예 22. 화합물 21. Example 22.
0℃에서 BocCys(NPys)-OH(300 mg, 0.80 mmol, 1 eq) 및 NHS(97 mg, 0.84 mmol, 1.05 eq)을 포함하는 10 mL의 무수 DCM 용액에 DCC(173 mg, 0.84 mmol, 1.05 eq)를 처리하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 가열시키며 교반시켰다. 고체 DCU 부산물(byproduct)을 여과시켰다. 상기 여과물에 화합물 20(1.7 g, 0.082 mmol, 1 eq)을 첨가시킨 후, DIEA(114 uL, 0.66 mmol, 8 eq)을 첨가시켰다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 후, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 화합물 21을 수득하였다(1.5 g): 13C NMR δ 22.32, 25.52, 28.27, 28.83, 31.90, 39.03, 42.45, 45.38, 53.41, 53.58, 63.91, 64.37, 69.30-72.38 (PEG), 80.11, 120.98, 133.94, 142.54, 153.34, 155.51, 155.71, 157.28, 169.98, 173.32.DCC (173 mg, 0.84 mmol, 1.05) in 10 mL of anhydrous DCM solution containing BocCys (NPys) -OH (300 mg, 0.80 mmol, 1 eq) and NHS (97 mg, 0.84 mmol, 1.05 eq) at 0 ° C. eq). The mixture was stirred while heating at room temperature overnight. Solid DCU byproduct was filtered. To the filtrate was added compound 20 (1.7 g, 0.082 mmol, 1 eq) followed by DIEA (114 uL, 0.66 mmol, 8 eq). The reaction mixture was stirred overnight at room temperature and then evaporated in vacuo. The residue was precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give compound 21 (1.5 g): 13 C NMR δ 22.32, 25.52, 28.27, 28.83, 31.90, 39.03, 42.45, 45.38 , 53.41, 53.58, 63.91, 64.37, 69.30-72.38 (PEG), 80.11, 120.98, 133.94, 142.54, 153.34, 155.51, 155.71, 157.28, 169.98, 173.32.
실시예 23. 화합물 22. Example 23.
0℃에서 화합물 21(1.5 g, 0.07 mmol, 1 eq) 및 NHS(125 mg, 1.09 mmol, 16 eq)을 포함하는 15 mL의 DCM 용액에 DIPC(168 uL, 1.09 mmol, 16 eq)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시킨 후, 잔여물을 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다(1.3 g): 13C NMR δ 22.05, 25.76, 25.93, 28.68, 28.92, 32.01, 38.89, 42.49, 45.79, 52.40, 53.97, 64.78, 69.57-71.77 (PEG), 80.47, 121.32, 134.29, 142.93, 153.75, 155.71, 157.60, 168.18, 169.14, 169.71, 170.56.DIPC (168 uL, 1.09 mmol, 16 eq) was added to 15 mL of a DCM solution containing Compound 21 (1.5 g, 0.07 mmol, 1 eq) and NHS (125 mg, 1.09 mmol, 16 eq) at 0 ° C. . The mixture was stirred at rt overnight. After evaporation of the solvent under vacuum, the residue was precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give the product (1.3 g): 13 C NMR δ 22.05, 25.76, 25.93, 28.68, 28.92 , 32.01, 38.89, 42.49, 45.79, 52.40, 53.97, 64.78, 69.57-71.77 (PEG), 80.47, 121.32, 134.29, 142.93, 153.75, 155.71, 157.60, 168.18, 169.14, 169.71, 170.56.
실시예 24. 화합물 23.Example 24.
(BocPheLys(Fmoc)-OH). BocPheOSu(1.5g, 4.14mmol, 1eq)을 포함하는 DCM(10.3 mL) 및 DMF(10.3 mL) 용액에 H-Lys(Fmoc)-OH(1.84g, 4.55 mmol, 1.1eq)을 첨가한 후, DIEA(2.9 mL, 16.56 mmol, 4eq)을 첨가하였다. 상기 결과물인 반응 혼합물을 밤새 교반한 후, 에틸 아세테이트로 희석하였다. 상기 용액을 물(30 mL x 2)로 세촉한 후, 식염수(30 mL x 2)로 세척하였다. 유기층을 결합시킨 후, MgSO4을 통해 건조시킨 다음, 진공 하(in vacuo)에서 농축하여 노란색 잔여물을 수득하였다. 상기 조잔여물을 CHCl3-MeOH(3:1, v/v)을 이용한 실리카겔을 통한 크로마토그래피에 의해 산물을 수득하였다. MS. [M+1]+ 616.(BocPheLys (Fmoc) -OH). To the DCM (10.3 mL) and DMF (10.3 mL) solution containing BocPheOSu (1.5 g, 4.14 mmol, 1eq) was added H-Lys (Fmoc) -OH (1.84 g, 4.55 mmol, 1.1eq), followed by DIEA (2.9 mL, 16.56 mmol, 4eq) was added. The resulting reaction mixture was stirred overnight and then diluted with ethyl acetate. The solution was washed with water (30 mL x 2) and then washed with brine (30 mL x 2). The organic layers were combined, dried over MgSO 4 and then concentrated in vacuo to give a yellow residue. The crude residue was obtained by chromatography over silica gel using CHCl 3 -MeOH (3: 1, v / v). MS. [M + 1] + 616.
실시예 25. 화합물 24. Example 25.
화합물 13(111 mg, 0.22 mmol, 1 eq) 및 화합물 16(208 mg, 0.34 mmol, 1.5 eq)에 EEDQ(167 mg, 0.67 mmol, 3 eq)를 처리하였다. 상기 반응물을 암실에서 실온으로 밤새 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 제거한 후, 결과물인 고체 잔여물을 10 mL의 에틸 에테르로 분말화시켰다. 상기 고체를 여과시킨 후, 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피(CH2Cl2-EtOAc, 1 : 1 내지 1 : 2, v/v)로 정제하여 원하는 산물을 수득하였다(20 mg, 수득률: 8%). MS. [M+1]+ 1095.Compound 13 (111 mg, 0.22 mmol, 1 eq) and compound 16 (208 mg, 0.34 mmol, 1.5 eq) were treated with EEDQ (167 mg, 0.67 mmol, 3 eq). The reaction was stirred overnight at room temperature in the dark. After the solvent was removed in vacuo, the resulting solid residue was triturated with 10 mL of ethyl ether. The solid was filtered and then purified by column chromatography on silica gel (CH 2 Cl 2 -EtOAc, 1: 1 to 1: 2, v / v) to give the desired product (20 mg, yield: 8%). MS. [M + 1] + 1095.
실시예 26. 화합물 25. Example 26.
화합물 24(8 eq)에 4N HCl을 포함하는 디옥산(dioxane)을 처리하였다. 상기 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반시켰다. 에틸 에테르를 첨가한 후, 고체를 여과하였다. 상기 고체를 DMF에 용해시킨 후 화합물 22(1eq)를 포함하는 DCM 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물에 DIEA(16 eq)를 첨가한 후, 반응물을 실온에서 밤새 교반 시켰다. 용매를 진공 하에서 제거한 후 결과물인 고체를 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, DMF/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다. Compound 24 (8 eq) was treated with dioxane containing 4N HCl. The reaction was stirred at rt for 4 h. After adding ethyl ether, the solid was filtered off. The solid was dissolved in DMF and then added to a DCM solution containing compound 22 (1 eq). After adding DIEA (16 eq) to the mixture, the reaction was stirred overnight at room temperature. The solvent was removed under vacuum and the resulting solid was precipitated with DCM / ethyl ether and then recrystallized with DMF / IPA to give the product.
실시예 27. 화합물 26. Example 27.
화합물 25를 포함하는 DCM 용액에 피페리딘(piperidine)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 4시간 동안 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 제거한 후, 결과물인 고체를 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, DMF/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다.Piperidine was added to a DCM
실시예 28. 화합물 27. Example 28.
화합물 26(1eq)를 포함하는 DCM/DMF 혼합물 용액에 RGDC(2 eq)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 다음, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물을 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, DMF/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다. RGDC (2 eq) was added to a DCM / DMF mixture solution containing compound 26 (1 eq). The reaction mixture was stirred at rt overnight, then the solvent was removed in vacuo. The residue was precipitated with DCM / ethyl ether and then recrystallized with DMF / IPA to give the product.
실시예 29. FmocVal-Cit-OH (화합물 28). Example 29. FmocVal-Cit-OH (Compound 28).
Fmoc-Val-NHS(2.5 g, 5.73 mmol, 1 eq)을 포함하는 15 mL의 DME를 L-시트룰린(L-citrulline)(1.05 g, 6.01 mmol, 1.05 eq)을 포함하는 8 mL의 THF와 NaHCO3(505 mg, 6.01 mmol, 1.05 eq)을 포함하는 15 mL의 물에 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반시켰다. 액상 시트르산(물에 대해 15% 농도, 75 mL)을 첨가한 후, 상 기 혼합물을 10% IPA/EtOAc(2 x 100 mL)로 추출하였다. 유기층을 물(3 x 100 mL)로 세척한 후, 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 상기 결과물인 고체를 100 mL의 에틸에테르로 분말화시킨 후 여과하여 산물을 수득하였다(1.98 g, 수득률: 70%): 1H NMR (DMSO-d 6 ) δ 0.86 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.90 (3H, d, J = 7.0 Hz), 1.40-1.48 (2H, m), 1.51-1.75 (2H, m), 1.98 (1H, sext, J = 6.8 Hz), 2.95 (2H, q, J = 6.2 Hz), 3.93 (1H, dd, J = 7.3, 8.8 Hz), 4.14-4.29 (4 H, m), 5.40 (2H, brs), 5.96 (1H, t, J = 5.6 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.39-7.44 (3H, m), 7.75 (2H, t, J = 6.3 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.3 Hz), 8.19 (1H, d, J = 7.3 Hz); 13 C NMR (DMSO-d 6 ) δ 18.31, 19.25, 26.75, 28.40, 30.59, 46.68, 51.91, 59.81, 64.92, 65.65, 119.98, 125.30, 126.94, 127.52, 140.55, 143.61, 143.76, 155.88, 158.58, 171.12, 173.25.15 mL of DME containing Fmoc-Val-NHS (2.5 g, 5.73 mmol, 1 eq) was added to 8 mL THF and NaHCO containing L-citrulline (1.05 g, 6.01 mmol, 1.05 eq) To 15 mL of water containing 3 (505 mg, 6.01 mmol, 1.05 eq) was added. The mixture was stirred at rt overnight. After addition of liquid citric acid (15% concentration for water, 75 mL), the mixture was extracted with 10% IPA / EtOAc (2 × 100 mL). The organic layer was washed with water (3 x 100 mL) and then the solvent was evaporated in vacuo. After pulverization of the resulting solid with ethyl ether in 100 mL and filtered to yield the product (1.98 g, yield: 70%): 1 H NMR (DMSO- d 6) δ 0.86 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.90 (3H, d, J = 7.0 Hz), 1.40-1.48 (2H, m), 1.51-1.75 (2H, m), 1.98 (1H, sext, J = 6.8 Hz), 2.95 (2H, q , J = 6.2 Hz), 3.93 (1H, dd, J = 7.3, 8.8 Hz), 4.14-4.29 (4 H, m), 5.40 (2H, brs), 5.96 (1H, t, J = 5.6 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.39-7.44 (3H, m), 7.75 (2H, t, J = 6.3 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.3 Hz), 8.19 (1H, d , J = 7.3 Hz); 13 C NMR (DMSO- d 6) δ 18.31, 19.25, 26.75, 28.40, 30.59, 46.68, 51.91, 59.81, 64.92, 65.65, 119.98, 125.30, 126.94, 127.52, 140.55, 143.61, 143.76, 155.88, 158.58, 171.12, 173.25.
실시예 30. FmocVal-Cit-PAB (화합물 29). Example 30. FmocVal-Cit-PAB (Compound 29).
화합물 28(1 g, 2.01 mmol, 1eq) 및 p-아미노벤질 알코올(p-aminobenzyl alcohol)(273 mg, 2.21 mmol, 1.1 eq)을 포함하는 DCM/MeOH(20 mL/10 mL) 용액에 EEDQ(996 mg, 4.03 mmol, 2 eq)을 처리하였다. 상기 혼합물을 암실에서 실온으로 밤새 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 제거한 후, 상기 결과물인 고체 잔여물을 10 mL의 에틸 에테르로 분말화시켰다. 상기 고체를 여과하여 채취한 후, 에틸 에 테르로 세척하여 산물을 수득하였다(925 mg, 수득률: 76%): 1H NMR (DMSO-d 6 ) δ 0.87 (6H, d, t = 7.5 Hz), 1.36-1.47 (2H, m), 1.51-1.75 (2H, m), 1.99 (1H, sext, J = 6.7 Hz), 2.90-3.04 (3H, m), 3.93 (1H, dd, J = 7.3, 8.8 Hz), 4.23-4.38 (4 H, m), 4.43 (2H, d, J = 5.3 Hz), 5.13 (1H, t, J = 5.6 Hz), 5.43 (2H, brs), 5.99 (1H, t, J = 5.6 Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.39-7.48 (3H, m), 7.54 (2H, d, J =8.5 Hz), 7.74 (2H, t, J = 6.7 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.12 (1H, d, J = 7.3 Hz); 13 C NMR (DMSO-d 6 ) δ 18.34, 19.28, 26.84, 29.56, 30.47, 46.67, 53.05, 60.05, 62.55, 65.65, 118.71, 119.98, 125.23, 126.79, 126.94, 127.51, 137.27, 137.36, 140.55, 143.60, 143.73, 155.93, 158.69, 170.17, 171.06.EEDQ in aminobenzyl alcohol (p -aminobenzyl alcohol) DCM / MeOH (20 mL / 10 mL) containing (273 mg, 2.21 mmol, 1.1 eq) solution of (- Compound 28 (1 g, 2.01 mmol, 1eq) and p 996 mg, 4.03 mmol, 2 eq). The mixture was stirred overnight at room temperature in the dark. After the solvent was removed in vacuo, the resulting solid residue was triturated with 10 mL of ethyl ether. The solid was collected by filtration and washed with ethyl ether to give the product (925 mg, yield: 76%): 1 H NMR (DMSO- d 6 ) δ 0.87 (6H, d, t = 7.5 Hz) , 1.36-1.47 (2H, m), 1.51-1.75 (2H, m), 1.99 (1H, sext, J = 6.7 Hz), 2.90-3.04 (3H, m), 3.93 (1H, dd, J = 7.3, 8.8 Hz), 4.23-4.38 (4 H, m), 4.43 (2H, d, J = 5.3 Hz), 5.13 (1H, t, J = 5.6 Hz), 5.43 (2H, brs), 5.99 (1H, t , J = 5.6 Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.32 (2H, t, J = 7.3 Hz), 7.39-7.48 (3H, m), 7.54 (2H, d, J = 8.5 Hz ), 7.74 (2H, t, J = 6.7 Hz), 7.89 (2H, d, J = 7.6 Hz), 8.12 (1H, d, J = 7.3 Hz); 13 C NMR (DMSO- d 6) δ 18.34, 19.28, 26.84, 29.56, 30.47, 46.67, 53.05, 60.05, 62.55, 65.65, 118.71, 119.98, 125.23, 126.79, 126.94, 127.51, 137.27, 137.36, 140.55, 143.60, 143.73, 155.93, 158.69, 170.17, 171.06.
실시예 31. Val-Cit-PAB (화합물 30). Example 31. Val-Cit-PAB (Compound 30).
화합물 29(622 mg, 1.03 mmol)을 포함하는 10 mL의 무수 DMF 용액에 피페리딘(2 mL)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 다음, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 잔여물을 DCM으로 분말화시킨 후, 결과물인 고체를 여과한 다음, DCM으로 세척하여 산물을 수득하였다(283 mg, 수득률: 72%): 1H NMR (DMSO-d 6 ) δ 0.79 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.89 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.38-1.42 (2H, m), 1.52-1.68 (2H, m), 1.94 (1H, sext, J = 6.3 Hz), 2.89-3.01 (2H, m), 3.05 (1H, d, J = 4.7 Hz), 4.46 (2H, s), 5.09 (1H, brs), 5.40 (2H, s), 5.98 (1H, t, J = 5.3 Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.14 (1H, brs), 10.03 (1H, s); 13 C NMR (DMSO-d 6 ) δ 16.80, 19.33, 26.53, 29.95, 31.10, 52.31, 59.33, 62.35, 118.61, 126.59, 137.06, 137.14, 158.44, 170.06, 173.69.Piperidine (2 mL) was added to 10 mL of anhydrous DMF solution containing compound 29 (622 mg, 1.03 mmol). The mixture was stirred at rt overnight, then the solvent was removed in vacuo. After the residue was pulverized with DCM, filtered, and then the resulting solid to give the product washed with DCM (283 mg, yield: 72%): 1 H NMR (DMSO- d 6) δ 0.79 (3H, d, J = 6.7 Hz), 0.89 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.38-1.42 (2H, m), 1.52-1.68 (2H, m), 1.94 (1H, sext, J = 6.3 Hz), 2.89-3.01 (2H, m), 3.05 (1H, d, J = 4.7 Hz), 4.46 (2H, s), 5.09 (1H, brs), 5.40 (2H, s), 5.98 (1H, t, J = 5.3 Hz), 7.23 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.54 (2H, d, J = 8.5 Hz), 8.14 (1H, brs), 10.03 (1H, s); 13 C NMR (DMSO- d 6) δ 16.80, 19.33, 26.53, 29.95, 31.10, 52.31, 59.33, 62.35, 118.61, 126.59, 137.06, 137.14, 158.44, 170.06, 173.69.
실시예 32. 화합물 31. Example 32.
화합물 22(1.3 g, 0.06 mmol, 1 eq)를 포함하는 15 mL의 무수 DCM 및 3 mL의 무수 DMF 용액에 화합물 30(175 mg, 0.46 mmol, 8 eq)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 다음, 용매를 진공 하에서 제거하였다. 상기 잔여물을 우선 DCM/에테르로 침전시킨 후, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다(1.1 g): 13C NMR (CDCl3/CD3OD) δ 18.48, 19.46, 22.85, 26.74, 28.54, 28.94, 29.50, 30.47, 31.81, 39.21, 42.04, 45.79, 53.51, 54.06, 55.32, 59.67, 64.32, 65.04, 69.54-70.99 (PEG), 80.70, 120.23, 121.44, 127.64, 134.31, 137.16, 142.94, 153.86, 155.86, 156.85, 160.44, 170.45, 171.02, 171.87, 173.19.To 30 mL of anhydrous DCM and 3 mL of anhydrous DMF solution containing compound 22 (1.3 g, 0.06 mmol, 1 eq) was added compound 30 (175 mg, 0.46 mmol, 8 eq). The reaction mixture was stirred at rt overnight, then the solvent was removed in vacuo. The residue was first precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give the product (1.1 g): 13 C NMR (CDCl 3 / CD 3 OD) δ 18.48, 19.46, 22.85, 26.74 , 28.54, 28.94, 29.50, 30.47, 31.81, 39.21, 42.04, 45.79, 53.51, 54.06, 55.32, 59.67, 64.32, 65.04, 69.54-70.99 (PEG), 80.70, 120.23, 121.44, 127.64, 134.31, 137.16,142. 153.86, 155.86, 156.85, 160.44, 170.45, 171.02, 171.87, 173.19.
실시예 33. 화합물 32. Example 33.
화합물 31(1 eq)을 포함하는 DCM/DMF(4/1, v/v) 혼합물 용액에 DSC(16 eq)를 첨가한 후, 상기 반응물을 0℃에 냉각시켰다. 그런 다음, 피리딘(pyridine)(16 eq)을 첨가한 후, 상기 혼합물을 실온까지 점점 가열하면서 밤새 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시킨 후 잔여물을 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다. After adding DSC (16 eq) to a DCM / DMF (4/1, v / v) mixture solution containing compound 31 (1 eq), the reaction was cooled to 0 ° C. Then, pyridine (16 eq) was added and the mixture was stirred overnight while gradually heating to room temperature. After evaporation of the solvent under vacuum the residue was precipitated with DCM / ethyl ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give the product.
실시예 34. 화합물 33. Example 34.
화합물 32의 용액에 독소루비신(doxorubicin)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 밤새 환류에서 교반시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시킨 후, 잔여물을 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, DMF/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다. To the solution of
실시예 35. 화합물 34.Example 35.
화합물 33(1eq)을 포함하는 DCM/DMF 혼합물 용액에 RGDC(2 eq)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 다음, 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, DMF/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다. RGDC (2 eq) was added to a DCM / DMF mixture solution containing compound 33 (1 eq). The reaction mixture was stirred at rt overnight, then the solvent was evaporated in vacuo. The residue was precipitated with DCM / ethyl ether and then recrystallized with DMF / IPA to give the product.
실시예 36. 화합물 35. Example 36.
0℃에서 화합물 19(6.14 g, 0.307 mmol, 1 eq) 및 NHS(283 mg, 2.456 mmol, 8 eq)을 포함하는 31 mL의 무수 DCM 용액에 DCC(507 mg, 2.456 mmol, 2eq)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반시킨 다음, 셀리트(celite®) 패드를 통해 여과시킨 후, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 우선 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다(5.69 g, 수득률: 86%): 13C NMR δ 21.59, 25.21, 28.11, 29.03, 31.42, 39.36, 45.13, 51.80, 64.07, 68.90-70.53 (PEG), 155.15, 155.58, 168.17, 168.54.DCC (507 mg, 2.456 mmol, 2eq) was added to 31 mL of anhydrous DCM solution containing compound 19 (6.14 g, 0.307 mmol, 1 eq) and NHS (283 mg, 2.456 mmol, 8 eq) at 0 ° C. . The reaction mixture was stirred overnight at room temperature, then filtered through a pad of celite ® and then evaporated under vacuum. The residue was first precipitated with DCM / ethyl ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give the product (5.69 g, yield: 86%): 13 C NMR δ 21.59, 25.21, 28.11, 29.03, 31.42 , 39.36, 45.13, 51.80, 64.07, 68.90-70.53 (PEG), 155.15, 155.58, 168.17, 168.54.
실시예 37. 화합물 36 Example 37.
화합물 35(5.0g, 0.232mmol, 1eq)를 포함하는 각 23 mL의 무수 DCM 및 무수 DMF 용액에 HCl.NH2Cys(NPys)-OH(0.77g, 2.78mmol, 12eq)를 첨가한 후, DIEA(0.65 mL, 3.71 mmol, 16 eq)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 셀리트(celite®) 패드를 통해 여과시킨 다음, 진공 하에서 증발시켰다. 상기 잔여물을 우선 DCM/에틸 에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다(4.88 g, 수득률: 95%yield): 13C NMR δ 22.17, 28.22, 29.27, 31.85, 39.92, 45.22, 51.85, 54.49, 63.98, 69.06-70.62 (PEG), 78.56, 120.87, 132.88, 142.27, 153.44, 155.67, 156.47, 162.14, 170.74, 171.20.HCl.NH 2 Cys (NPys) -OH (0.77 g, 2.78 mmol, 12 eq) was added to each of 23 mL of anhydrous DCM and anhydrous DMF solution containing compound 35 (5.0 g, 0.232 mmol, 1 eq) followed by DIEA (0.65 mL, 3.71 mmol, 16 eq) was added. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature, then filtered through a pad of celite ® and then evaporated under vacuum. The residue was first precipitated with DCM / ethyl ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give the product (4.88 g, yield: 95% yield): 13 C NMR δ 22.17, 28.22, 29.27, 31.85, 39.92, 45.22, 51.85, 54.49, 63.98, 69.06-70.62 (PEG), 78.56, 120.87, 132.88, 142.27, 153.44, 155.67, 156.47, 162.14, 170.74, 171.20.
실시예 38. 화합물 37. Example 38.
화합물 36(4.38g, 0.197 mmol, 1 eq)을 포함하는 DCM(44 mL) 용액에 8.8 mL의 TFA를 첨가한 후, 상기 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 20시간 후, 상기 반응 혼합물을 진공 하에서 증발시킨 다음, 잔여물을 DCM/에테르로 침전시킨 다음, CH3CN/IPA로 재결정화시켜 산물을 수득하였다(2.1 g, 수득률: 49%): 13C NMR δ 21.47, 26.41, 31.64, 39.47, 45.25, 52.32, 54.11, 63.75, 69.12-70.65 (PEG), 120.85, 133.46, 142.25, 153.67, 155.64, 156.39, 171.53, 171.79.To the DCM (44 mL) solution containing compound 36 (4.38 g, 0.197 mmol, 1 eq) was added 8.8 mL of TFA and the reaction mixture was stirred at rt overnight. After 20 hours, the reaction mixture was evaporated under vacuum, then the residue was precipitated with DCM / ether and then recrystallized with CH 3 CN / IPA to give the product (2.1 g, yield: 49%): 13 C NMR δ 21.47, 26.41, 31.64, 39.47, 45.25, 52.32, 54.11, 63.75, 69.12-70.65 (PEG), 120.85, 133.46, 142.25, 153.67, 155.64, 156.39, 171.53, 171.79.
실시예 39. 화합물 38. Example 39. Compound 38.
실온에서 폴산(folic acid)(124 mg, 0.28 mmol, 1eq)을 포함하는 3.1 mL의 DMSO에 NHS(71 mg, 0.616 mmol, 2.2 eq)를 첨가한 후, DCC(64mg, 0.308 mmol, 1.1 eq) 및 63 uL의 트리에틸아민(triethylamine)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 암실에서 밤새 교반한 후, 셀리트(celite®) 패드를 통해 여과하여 다음의 링커로 결합하는 단계를 위해 사용되는 노란색 용액의 FA-NHS을 수득하였다. H2N-Lys(4arm-PEG)CysNPys(37, 381 mg, 0.0175mmol, 1eq)을 포함하는 각 4 mL의 무수 DCM 및 무수 DMF 용액에 FA-NHS의 DMSO 용액(상기 기재된 바와 같이 제조된)을 첨가한 후, DIEA (49 uL, 0.28 mmol, 16eq)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 암실에서 실온으로 밤새 교반하였다. 그런 다음, 희석된 물로 4일 동안 투석하였다. 그런다음, 상기 노란색 용액을 감압하에 동결건조하여 197 mg의 최종 산물을 수득하였다. NHS (71 mg, 0.616 mmol, 2.2 eq) was added to 3.1 mL of DMSO containing folic acid (124 mg, 0.28 mmol, 1eq) at room temperature, followed by DCC (64 mg, 0.308 mmol, 1.1 eq). And 63 uL of triethylamine. The reaction mixture was stirred overnight in the dark, then filtered through a pad of celite ® to give FA-NHS of a yellow solution which was used for binding to the next linker. DMSO solution of FA-NHS (prepared as described above) in 4 mL of anhydrous DCM and anhydrous DMF solution containing H 2 N-Lys (4arm-PEG) CysNPys ( 37 , 381 mg, 0.0175 mmol, 1eq) After addition, DIEA (49 uL, 0.28 mmol, 16eq) was added. The reaction mixture was stirred overnight at room temperature in the dark. It was then dialyzed with diluted water for 4 days. The yellow solution was then lyophilized under reduced pressure to yield 197 mg of the final product.
실시예 40. 화합물 39. Example 40.
C6-티오-LAN-설비빈(C6-thio-LNA-survivin)(올리고SH)를 포함하는 pH 6.5 인산 완충용액에 화합물 38을 첨가한 후, 상기 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응의 진행은 음이온 교환 HPLC를 통해 확인하였다. 상기 반응 혼합물을 0.2 마이클론(micron) 여과기를 통해 여과한 후, 포로스(Poros) 음이온 교환 컬럼에 적재하였다. pH 7.0에서 완충용액 시스템 20 mM Tris. HCl 2M NaCl를 이용하여 농도구배로 용출하여 산물을 수득하였다. 산기 산물을 탈염시킨 후 감압하에 동결건조하였다. Compound 38 was added to pH 6.5 phosphate buffer containing C6-thio-LNA-survivin (oligoSH), and then the solution was stirred at room temperature for 1 hour. The progress of the reaction was confirmed by anion exchange HPLC. The reaction mixture was filtered through a 0.2 micron filter and then loaded onto a Poros anion exchange column. Buffer system at pH 7.0 20 mM Tris. Elution with a gradient of concentration using HCl 2M NaCl to give the product. The acid product was desalted and then lyophilized under reduced pressure.
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