JP7231147B2

JP7231147B2 - RNA introduction reagent and its use

Info

Publication number: JP7231147B2
Application number: JP2017128034A
Authority: JP
Inventors: 義仁上野; 航介中本; 泰宏古市
Original assignee: Genecare Research Institute Co Ltd; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Current assignee: Genecare Research Institute Co Ltd; Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2023-03-01
Anticipated expiration: 2037-06-29
Also published as: JP2019010035A

Description

本明細書は、ＲＮＡ導入試薬及びその利用に関する。 The present specification relates to RNA introduction reagents and uses thereof.

がんをはじめ、遺伝子変異や遺伝子発現異常が原因又は関連している遺伝子関連疾患は多数知られている。がん細胞を始めとして各種細胞は、その表面に細胞接着因子を発現している。例えば、がん細胞の表面には細胞接着因子としてインテグリンα_ｖβ₃が強く発現していることが知られている。 A large number of gene-related diseases, including cancer, are known to be caused or associated with gene mutations or gene expression abnormalities. Various cells including cancer cells express cell adhesion factors on their surfaces. For example, it is known that integrin α _v β ₃ is strongly expressed as a cell adhesion factor on the surface of cancer cells.

ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡ医薬は、ｍＲＮＡに直接作用する薬剤であって、細胞へ浸透後は、標的分子に対する特異性が高く、細胞質で働くため核内ゲノムＤＮＡへの影響が少なく、しかも作用メカニズムも明確である。このためＲＮＡ医薬は、遺伝子関連疾患への適用が期待されている。 RNA drugs such as siRNA are drugs that act directly on mRNA. After penetrating into cells, they are highly specific to target molecules, act in the cytoplasm, have little effect on nuclear genomic DNA, and have a clear mechanism of action. is. Therefore, RNA medicine is expected to be applied to gene-related diseases.

一方、ＲＮＡ医薬は、標的選択性は高いものの、標的組織までの選択的輸送及び細胞膜透過が困難であるほか分解されやすいため、リポソームなどのリピッドナノパーティクル（Lipid Nano Particle、LNP）を用いてＲＮＡ複合体を調製し、ＲＮＡ医薬に、細胞選択能、送達機能、細胞膜透過機能及び保護機能を持たせようとする開発や、有効性強化のためリボース環への修飾などがこれまで進められてきている（特許文献１～４）。 On the other hand, although RNA drugs have high target selectivity, they are difficult to selectively transport to the target tissue and permeate the cell membrane, and are easily degraded. To date, efforts have been made to prepare complexes and develop RNA drugs with cell-selective, delivery, cell-membrane permeation, and protective functions, as well as modifications to the ribose ring to enhance efficacy. (Patent Documents 1 to 4).

HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151 The Journal of Organic Chemistry 2012, 77, 3233-3245The Journal of Organic Chemistry 2012, 77, 3233-3245 Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672Bioorganic & Chemistry letters (1999) 2667-2672 The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962

しかしながら、こうした試みにもかかわらず、ＲＮＡ医薬の有効性の一層の向上が求められている。特に、ＲＮＡ医薬の細胞選択性、送達性や細胞膜透過性に関し、ＬＮＰを用いる送達では、リポソームの粒子径の均一化や微小化が課題となっているが、未だ十分な細胞選択性、送達性や細胞膜透過性が達成されていないという問題があった。 However, in spite of these attempts, further improvements in the efficacy of RNA medicines are being sought. In particular, with regard to the cell selectivity, delivery and cell membrane permeability of RNA drugs, uniformity and miniaturization of the particle size of liposomes is an issue in delivery using LNP, but cell selectivity and delivery are still sufficient. and that cell membrane permeability has not been achieved.

本明細書は、ＲＮＡ医薬等の送達性や細胞膜透過性に寄与できるＲＮＡ導入試薬及びその利用を開示する。 The present specification discloses an RNA introduction reagent that can contribute to delivery of RNA medicines and the like and cell membrane permeability, and uses thereof.

本発明者らは、ＲＮＡの送達性や細胞膜透過性の向上に関して、細胞接着性モチーフの利用に着目した。本発明者らが種々検討したところ、こうした細胞接着性モチーフを複数個用いる場合に、複数個の当該モチーフを複数個スペーサーで互いに離間して備える化合物でＲＮＡを修飾することで、ＲＮＡの細胞膜透過性が高まるという知見を得た。本明細書によれば、かかる知見に基づき以下の手段が提供される。 The present inventors focused on the use of cell adhesion motifs for improving RNA delivery and cell membrane permeability. As a result of various investigations by the present inventors, when using a plurality of such cell adhesion motifs, by modifying RNA with a compound having a plurality of such motifs spaced apart from each other by a spacer, it is possible to allow RNA to permeate the cell membrane. I have found that it improves the performance. According to this specification, the following means are provided based on such knowledge.

［１］ＲＮＡ導入試薬であって、
２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、
１個以上のスペーサー単位と、
を備え、
前記１個以上のスペ－サー単位が前記２個以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している、ＲＮＡ導入試薬。
［２］前記細胞性接着モチーフ単位はペプチドを含んでいる、［１］に記載の試薬。
［３］前記細胞接着性モチーフ単位はＲＧＤペプチドを含む、［１］又は［２］に記載の試薬。
［４］前記スペーサー単位は、ポリアルキレンオキシ基を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の試薬。
［５］前記スペーサー単位は、前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位を、少なくとも２ｎｍ以上離間する、［１］～［４］のいずれかに記載の試薬。
［６］ペプチド誘導体であって、
２個以上のペプチド単位と、
１個以上の非ペプチド性単位と、
を備え、
前記ペプチド単位は、任意の２以上のアミノ酸残基を有し、
前記１個以上の非ペプチド単位が、前記２個以上のペプチド単位を互いに離間している、誘導体。
［７］前記ペプチド単位はＲＧＤモチーフを含み、前記非ペプチド単位は、ポリオキシアルキレン基を含む、［５］に記載の誘導体。
［８］オリゴリボヌクレオチド誘導体であって、
オリゴリボヌクレオチドと、
２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、１個以上のスペーサー単位と、を備え、前記１個以上のスペーサー単位が前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域と、を備える、誘導体。
［９］前記オリゴリボヌクレオチドは、以下の式（１）に示すヌクレオシド誘導体を含む、［８］に記載の誘導体。
（式（１）中、Ｒ¹は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ²及びＲ⁴は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は－Ｐ（＝Ｏ）_nＲ⁵Ｒ⁶（nは０又は１を示し、Ｒ⁵及びＲ⁶は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ³は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷（Ｒ⁷は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン－９－イル基、２－オキソ－ピリミジン－１－イル基、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基のいずれかを表す。） [1] An RNA introduction reagent comprising
two or more cellular adhesion motif units;
one or more spacer units;
with
An RNA introduction reagent, wherein said one or more spacer units space said two or more cellular adhesion motif units from each other.
[2] The reagent according to [1], wherein the cellular adhesion motif unit contains a peptide.
[3] The reagent according to [1] or [2], wherein the cell adhesion motif unit contains an RGD peptide.
[4] The reagent according to any one of [1] to [3], wherein the spacer unit contains a polyalkyleneoxy group.
[5] The reagent according to any one of [1] to [4], wherein the spacer unit separates the two or more cell adhesive motif units by at least 2 nm or more.
[6] A peptide derivative,
two or more peptide units;
one or more non-peptidic units;
with
The peptide unit has any two or more amino acid residues,
A derivative wherein said one or more non-peptide units space said two or more peptide units from each other.
[7] The derivative according to [5], wherein the peptide unit comprises an RGD motif and the non-peptide unit comprises a polyoxyalkylene group.
[8] An oligoribonucleotide derivative,
an oligoribonucleotide;
a cell adhesion region comprising two or more cellular adhesion motif units and one or more spacer units, wherein the one or more spacer units separate the two or more cell adhesion motif units from each other; A derivative comprising
[9] The derivative according to [8], wherein the oligoribonucleotide comprises a nucleoside derivative represented by the following formula (1).
(In formula (1), R ¹ represents a hydroxyl group, a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group, or a protected group, and in formula (2), X represents a halogen atom. Formula ( In 1) and formula (2), R ² and R ⁴ may be the same or different, and may be a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group, a phosphate group, a protected phosphate group, or -P(=O). _n R ⁵ R ⁶ (n represents 0 or 1, R ⁵ and R ⁶ may be the same or different, hydrogen atom, hydroxyl group, protected hydroxyl group, mercapto group, protected mercapto group, lower an alkoxy group, a cyano-lower alkoxy group, an amino group, or a substituted amino group, provided that when n is 1, both R ⁵ and R ⁶ are not hydrogen atoms); R ³ represents NHR ⁷ (R ⁷ represents a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, or an amino-protecting group), an azide group, an amidino group, or a guanidino group, each having a linking group; B is a purine; -9-yl group, 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, substituted purin-9-yl group, or substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group.)

ＲＮＡ導入用試薬の構成要素を示す図である。FIG. 2 shows the constituent elements of the reagent for RNA introduction. ＲＮＡ導入用試薬の概要を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an overview of RNA introduction reagents. 細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーに対して細胞接着性モチーフ単位を導入するスキームを示す図である。なお、スキームの最後の化合物には、２個の細胞接着性モチーフ単位と３個のスペーサー単位が導入された状態を示す。FIG. 4 is a diagram showing a scheme for introducing a cell adhesive motif unit into a monomer for introducing a cell adhesive motif unit. The last compound in the scheme shows a state in which two cell adhesive motif units and three spacer units have been introduced. コンジュゲートによる細胞膜透過性の評価結果を示す図である。FIG. 4 shows the evaluation results of cell membrane permeability of conjugates. コンジュゲートによる遺伝子発現抑制の評価結果を示す図である。FIG. 4 shows the results of evaluating gene expression suppression by conjugates.

本明細書の開示は、ＲＮＡ医薬等に好適である、ＲＮＡの細胞への導入試薬及びその利用に関する。図１及び図２に例示するように、本明細書に開示されるＲＮＡ導入試薬（以下、本試薬ともいう。）は、２以上の細胞接着性モチーフ単位が１以上のスペーサー単位で離間した構造を有することができる。推論であって本開示を必ずしも拘束するものではないが、このような離間構造を有するため、２以上の細胞接着性モチーフ単位が、細胞表面において多数かつ流動的に存在すると考えられるインテグリンなどの細胞接着分子との間で相互作用を生じやすくなり、その結果、本試薬と複合体を形成するオリゴリボヌクレオチドが細胞表面と相互作用しやすくなり、その結果、オリゴリボヌクレオチドの細胞内への導入効率が高まるものと考えられる。 The disclosure of the present specification relates to reagents for introducing RNA into cells, which are suitable for RNA medicine and the like, and uses thereof. As exemplified in FIGS. 1 and 2, the RNA transfection reagent disclosed herein (hereinafter also referred to as this reagent) has a structure in which two or more cell adhesion motif units are separated by one or more spacer units. can have Although it is speculative and not necessarily binding to the present disclosure, cells such as integrins are thought to have such spaced-apart structures so that two or more cell-adhesive motif units are present in large numbers and in a fluid manner on the cell surface. Interactions with adhesion molecules are more likely to occur, and as a result, oligoribonucleotides that form complexes with this reagent are more likely to interact with the cell surface, resulting in the introduction efficiency of oligoribonucleotides into cells. is considered to increase.

本試薬は、２以上の細胞接着性モチーフ単位を、１以上のスペーサー単位を介在させるようにしてこれらの単位を直列して連結させた直鎖状構造を有することができる。本発明者らによれば、分岐した骨格の先端部に細胞接着性モチーフ単位を並列的に有する分岐状構造よりも、既述の直鎖状構造を有するようにすることで、離間構造の設計の自由度が高いため、容易にかつ高い自由度で離間構造を設計できるとともに、意外にも細胞表面の細胞接着分子と相互作用する確率を確保又は向上できることを見出している。なお、本試薬は、少なくとも直鎖状構造を有していることが好ましいが、こうした直鎖状構造を複数分岐又は並列して備える分枝状構造を有していてもよい。 This reagent can have a linear structure in which two or more cell adhesion motif units are connected in series with one or more spacer units interposed. According to the present inventors, the separation structure is designed by having the above-mentioned linear structure rather than the branched structure having the cell adhesive motif units in parallel at the tip of the branched skeleton. Since the degree of freedom is high, it is possible to easily design the separation structure with a high degree of freedom, and surprisingly, it is possible to secure or improve the probability of interaction with cell adhesion molecules on the cell surface. The present reagent preferably has at least a linear structure, but may have a branched structure in which a plurality of such linear structures are branched or arranged in parallel.

本試薬のいずれかの末端にオリゴリボヌクレオチドを共有結合により結合して複合体とするか、あるいはかかる直鎖状構造体とオリゴリボヌクレオチドと共有結合以外の相互作用で複合化して複合体とすることで、オリゴリボヌクレオチドの細胞内への導入効率を高めることができる。 An oligoribonucleotide is covalently attached to either end of the reagent to form a complex, or such a linear structure is complexed with an oligoribonucleotide through non-covalent interactions to form a complex. Thus, the efficiency of introducing oligoribonucleotides into cells can be enhanced.

以下、本明細書の開示の各種実施形態について詳細に説明する。 Various embodiments of the present disclosure are described in detail below.

（ＲＮＡ導入試薬）
本試薬は、２以上の細胞性接着モチーフ単位と、１以上のスペーサー単位と、とを備えることができる。 (RNA introduction reagent)
The reagent can comprise two or more cellular adhesion motif units and one or more Spacer units.

（細胞接着性モチーフ単位）
細胞接着性モチーフ単位は、細胞表面に発現する細胞接着分子に対して相互作用して結合することができる分子を有するモチーフであって、細胞接着分子との相互作用に寄与するモチーフ（以下、細胞接着性モチーフともいう。）を含むことができる。 (cell adhesive motif unit)
A cell adhesion motif unit is a motif having a molecule capable of interacting and binding to a cell adhesion molecule expressed on the cell surface, and a motif contributing to interaction with the cell adhesion molecule (hereinafter referred to as a cell Also referred to as adhesive motifs.).

細胞接着性モチーフは、例えば、公知の細胞接着分子に結合するリガンドに由来することができる。例えば、細胞接着分子は、概してタンパク質であり、細胞外タンパク質であってもよいし、細胞膜タンパク質であってもよい。また、細胞接着分子は、細胞－細胞接着を担うものであってもよく、細胞－細胞外マトリックス接着を担うものであってもよい。 Cell adhesion motifs can be derived, for example, from ligands that bind to known cell adhesion molecules. For example, cell adhesion molecules are generally proteins and may be extracellular or cell membrane proteins. Cell adhesion molecules may also be responsible for cell-cell adhesion or cell-extracellular matrix adhesion.

細胞接着分子としては種々知られている。動物細胞において、細胞－細胞接着を担う細胞接着分子としては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、ネクチン等が挙げられる。また、細胞－細胞外マトリックス接着を担う細胞接着分子（細胞側：レセプター、タンパク質）としては、インテグリン、サルコグリカン、βジストログリカンが挙げられ、タンパク質である細胞接着分子（細胞外マトリックス側：リガンド）としては、フィルブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、テネイシン、フィブリノゲン、オステオポンチン、ネトリン、トロンボスポンジン、エンタクチン、αジストログリカン等が挙げられ、プロテオグリカンである細胞接着分子（細胞外マトリックス側：リガンド）としては、アグリン、アグレカン、シンデカン、ニューロカン、バーシカン、ブレビカン等が挙げられる。 Various cell adhesion molecules are known. In animal cells, cell adhesion molecules responsible for cell-cell adhesion include cadherin, immunoglobulin superfamily, nectin and the like. In addition, cell adhesion molecules (cell side: receptor, protein) responsible for cell-extracellular matrix adhesion include integrins, sarcoglycans, and β-dystroglycans, and cell adhesion molecules that are proteins (extracellular matrix side: ligand). Examples thereof include fibronectin, laminin, vitronectin, collagen, tenascin, fibrinogen, osteopontin, netrin, thrombospondin, entactin, α-dystroglycan, etc. As a proteoglycan cell adhesion molecule (extracellular matrix side: ligand) includes agrin, aggrecan, syndecan, neurocan, versican, brevican and the like.

また、動物も、植物も、昆虫も、細胞接着に関して、それぞれ特定のタンパク質や複合多糖類あるいは糖タンパクを細胞間介在物として利用している。それらの構造体中の機能性ペプチドやオリゴ糖をRNA医薬に結合させることにより、動物薬、農薬、殺虫薬として適用させることができる。 In addition, animals, plants, and insects each use specific proteins, complex polysaccharides, or glycoproteins as intercellular mediators for cell adhesion. By binding functional peptides and oligosaccharides in these structures to RNA drugs, they can be applied as veterinary drugs, agricultural chemicals, and insecticides.

これらのうち、本明細書において用いる細胞接着性モチーフが由来する細胞接着分子としては、特に限定するものではないが、ＲＮＡ医薬を導入すべき細胞において多数あるいは特異的に発現している細胞接着分子に対する細胞外マトリックスリガンドである細胞接着部分子とすることができる。また、本明細書において用いる細胞接着性モチーフが由来する細胞接着性の機能性分子としては、タンパク質やペプチドやオリゴ糖であってもよいし、プロテオグリカンなどの糖タンパク質であってもよい。さらに、細胞接着性を有することが知られているビタミン、脂質、コレステロールなどの脂質などであってもよい。 Among these, the cell adhesion molecule derived from the cell adhesion motif used in the present specification is not particularly limited, but is a cell adhesion molecule that is expressed in large numbers or specifically in the cells into which the RNA medicine is to be introduced. cell adhesion molecules that are extracellular matrix ligands for In addition, the cell adhesive functional molecule derived from the cell adhesive motif used herein may be a protein, peptide, oligosaccharide, or glycoprotein such as proteoglycan. Furthermore, vitamins, lipids, and lipids such as cholesterol, which are known to have cell adhesiveness, may also be used.

細胞接着性モチーフとしては、例えば、インテグリン、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）をレセプターとして細胞接着を担う細胞外マトリックスリガンドであるフィブロネクチン、ラミニン、ＩＣＡＭ（Intercellular Adhesion Molecule）等が好適である。ある種のインテグリンやラミニンは、例えば、がん細胞などの細胞表面において多数発現しており、がん細胞をターゲットとするＲＮＡ医薬を適用すべき細胞として有用であるからである。また、ある種のインテグリンやラミニンは、神経細胞等の表面において多数又は特異的に発現しており、神経細胞をターゲットとするＲＮＡ医薬を適用すべき細胞として有用であるからである。このほか、ＲＮＡがターゲットとする細胞表面における細胞接着因子の発現状態や種類に応じて、細胞接着性モチーフが由来する細胞接着因子を適宜選択できる。 Suitable examples of cell adhesion motifs include fibronectin, laminin, and ICAM (Intercellular Adhesion Molecule), which are extracellular matrix ligands responsible for cell adhesion using integrins, cadherins, and immunoglobulin superfamily (IgSF) as receptors. This is because certain types of integrins and laminins are expressed in large numbers on the surface of cancer cells and the like, and are useful as cells to which RNA medicines targeting cancer cells should be applied. Also, certain types of integrins and laminins are expressed in large numbers or specifically on the surface of nerve cells and the like, and are useful as cells to which RNA medicines targeting nerve cells should be applied. In addition, a cell adhesion factor from which a cell adhesion motif is derived can be appropriately selected according to the expression state and type of the cell adhesion factor on the cell surface targeted by the RNA.

細胞接着性モチーフとしては、免疫学的抗原性を減じることができるため、分子量が小さいペプチドであることが好ましい。こうした細胞接着性モチーフとしては、例えば、フィブロネクチン中のＲＧＤ（アルファベットは、アミノ酸の一文字表記を示す。以下、同様である。）配列、ＲＥＤＶ配列、ＬＤＶ配列、ＮＧＲ配列、ＰＲＡＱ配列、ＫＬＤＡＰＴ配列、ＡＧＥＧＩＰ配列、ＫＮＥＥＤＤ配列、ＰＨＳＲＮ配列、ＥＤＧＩＨＥＬ配列、ＰＲＡＲＩ配列、ＩＤＡＰＳ配列等が挙げられる。また、ラミニン中のＹＩＧＳＲ配列等が挙げられる。また、細胞接着性モチーフはターゲットとする細胞において発現している膜タンパク質レセプターに結合する細胞外マトリックスリガンドのアミノ酸配列に基づいて複数のペプチド断片を合成して、スクリーニングすることによっても適宜決定することができる。こうしたスクリーニングは、当業者において周知である。 As the cell adhesion motif, a peptide with a small molecular weight is preferable because it can reduce immunological antigenicity. Such cell adhesive motifs include, for example, the RGD (alphabet indicates a one-letter amino acid code; hereinafter the same) sequence, REDV sequence, LDV sequence, NGR sequence, PRAQ sequence, KLDAPT sequence, and AGEGIP sequence in fibronectin. sequence, KNEEDD sequence, PHSRN sequence, EDGIHEL sequence, PRARI sequence, IDAPS sequence and the like. Also included is the YIGSR sequence in laminin. Alternatively, the cell adhesion motif can be appropriately determined by synthesizing and screening multiple peptide fragments based on the amino acid sequence of the extracellular matrix ligand that binds to the membrane protein receptor expressed in the target cell. can be done. Such screens are well known to those of skill in the art.

また、例えば、細胞接着性モチーフは、当該モチーフがペプチドの外部に露出されるように環状化されていてもよい。例えば、ＲＧＤモチーフについては、Ｆ（フェニルアラニン）やＣ（システイン）などを介して環状化されたペプチドが商業的に入手可能である。 Also, for example, the cell adhesion motif may be circularized such that the motif is exposed to the outside of the peptide. For example, for the RGD motif, peptides cyclized via F (phenylalanine), C (cysteine), etc. are commercially available.

細胞接着性モチーフに含まれるアミノ酸残基数は、特に限定するものではないが、概して、３個～２０個程度であり、上記したアミノ酸配列に対して、上記アミノ酸配列に基づく細胞接着性を完全に損なわない範囲でアミノ酸を付加することができる。 The number of amino acid residues contained in the cell adhesive motif is not particularly limited, but generally about 3 to 20. Amino acids can be added as long as they do not impair the

一つの細胞接着性モチーフ単位は、こうした細胞接着性モチーフを１個又は２個以上を含むことができるが、好ましくは１個～５個程度であり、また例えば１個～４個であり、また例えば１個～３個であり、また例えば１個又は２個であり、また例えば１個である。 One cell adhesion motif unit can contain 1 or 2 or more of such cell adhesion motifs, preferably about 1 to 5, for example, 1 to 4, or For example 1 to 3, also for example 1 or 2, also for example 1.

本試薬は、２個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えることができる。また例えば、本試薬は、３個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えていてもよいし、４個以上の細胞接着性モチーフ単位を備えていてもよい。細胞接着性モチーフ単位の上限は特に限定するものではないが、例えば、１０個以下とすることができる。 The reagent can comprise two or more cell adhesion motif units. Further, for example, the present reagent may comprise 3 or more cell adhesion motif units, or may comprise 4 or more cell adhesion motif units. Although the upper limit of the cell adhesive motif unit is not particularly limited, it can be, for example, 10 or less.

本試薬が備える２個以上の細胞接着性モチーフ単位は、互いに同一であってもよいし、異なっていてもよいが、スペーサー単位を介して隣接する細胞接着性モチーフ単位には、同一の細胞接着性モチーフが含まれていることが好ましい。こうすることで、隣接する細胞接着性モチーフ単位中の同一の細胞接着性モチーフ間の距離が概ねスペーサー単位で規定されることになるからである。 Two or more cell adhesion motif units provided in this reagent may be the same or different, but cell adhesion motif units adjacent via a spacer unit may contain the same cell adhesion motif units. Preferably, a sexual motif is included. This is because the distance between the same cell adhesive motifs in adjacent cell adhesive motif units is generally defined by the spacer unit.

図２に示すように、細胞接着性モチーフ単位は、例えば、固相合成法で使用できる例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＧＮＡ、ＰＮＡなどの骨格に対して、ペプチド性のリンカーや非ペプチド性の領域等を用いて、ＧＮＡ骨格に対する側鎖などとして備えられることができる。 As shown in FIG. 2, the cell adhesion motif unit can be used in solid-phase synthesis, for example, with respect to backbones such as DNA, RNA, GNA, and PNA, peptide linkers, non-peptide regions, etc. can be provided as side chains to the GNA backbone, etc., using

（スペーサー単位）
本試薬は、２以上の細胞接着性モチーフ単位を離間するように１以上のスペーサー単位を備えることができる。すなわち、スペーサー単位は、２個の細胞接着性モチーフ単位間に介在して当該モチーフ単位が備える細胞接着性モチーフを、概ねスペーサー単位の長さに基づいて離間することができる。 (spacer unit)
The reagent can comprise one or more spacer units to separate two or more cell adhesion motif units. That is, the spacer unit can be interposed between two cell adhesive motif units to separate the cell adhesive motifs included in the motif unit approximately based on the length of the spacer unit.

スペーサー単位の長さは、本試薬における細胞接着性モチーフ単位あるいは細胞接着性モチーフを離間しようとする距離等に応じて適宜決定される。例えば、ターゲットとする細胞において発現する細胞膜レセプター間距離情報が取得できる場合には、当該距離を参考にしてスペーサー単位の長さを決定することができる。また、例えば、スペーサー単位の長さは、あるターゲットレセプターに対して接着することがわかっている細胞接着性モチーフに種々の長さのスペーサー単位を付与して、好適なスペーサー単位を選択するスクリーニングによっても決定できる。 The length of the spacer unit is appropriately determined according to the cell adhesion motif unit in the present reagent or the distance to separate the cell adhesion motifs. For example, when information on the distance between cell membrane receptors expressed in target cells can be obtained, the length of the spacer unit can be determined with reference to the distance. Alternatively, for example, the length of the spacer unit can be determined by screening to select suitable spacer units by adding spacer units of various lengths to cell adhesion motifs known to adhere to a certain target receptor. can also be determined.

スペーサー単位で離間する細胞接着性モチーフ単位の距離は、特に限定するものではないが、例えば、少なくとも２ｎｍ以上離間することができる。また例えば、３ｎｍ以上とすることができ、また例えば４ｎｍ以上とすることができ、また例えば５ｎｍ以上とすることができる。なお、スペーサー単位によって離間する細胞接着性モチーフ単位間距離、あるいはスペーサー単位の長さは、当業者であれば、スペーサー単位を構成する分子構造に基づいて取得することができる。 The distance between the cell adhesive motif units separated by the spacer unit is not particularly limited, but can be, for example, at least 2 nm or more. Further, for example, the thickness can be 3 nm or more, for example, 4 nm or more, or for example, 5 nm or more. The distance between the cell adhesive motif units separated by the spacer unit or the length of the spacer unit can be obtained by those skilled in the art based on the molecular structure constituting the spacer unit.

スペーサー単位を構成する構造や物質については特に限定するものではないが、一般的なリンカーほか、各種公知のタンパク質とタンパク質とを連結するリンカー、タンパク質とヌクレオチド（ヌクレオシド）とを連結するリンカー、ヌクレオシドとヌクレオシドとを連結するリンカー等を適宜用いることができる。 The structure and substance constituting the spacer unit are not particularly limited, but in addition to general linkers, various known linkers that connect proteins and proteins, linkers that connect proteins and nucleotides (nucleosides), nucleosides and A linker or the like that connects with a nucleoside can be used as appropriate.

スペーサー単位としては、特に限定するものではないが、非ペプチド性であることが好ましい。細胞接着レセプターはタンパク質であるため、スペーサー単位がペプチドを含むことにより、意図しない接着が生じる可能性もあるからである。プロテアーゼなどタンパク分解酵素により分解されることを防ぐためにも非ペプチド性であることが望ましい。
また、スペーサーは、例えば、ポリエチレングリコール鎖などタンパク質や脂肪など細胞表面に存在する物質と無差別に結合しない素材よりなるものが好ましい。 Although the spacer unit is not particularly limited, it is preferably non-peptidic. This is because cell adhesion receptors are proteins, and the inclusion of a peptide in the spacer unit may result in unintended adhesion. In order to prevent degradation by proteolytic enzymes such as protease, it is preferably non-peptidic.
The spacer is preferably made of a material such as a polyethylene glycol chain that does not indiscriminately bind to substances present on the cell surface such as proteins and fats.

スペーサー単位は、特に限定するものではないが、自由回転可能な連結基を備えることも好適である。例えば、スペーサー単位は、一重結合を含む直鎖状構造を有することが好ましい。一重結合としては、例えば、炭素－炭素一重結合、炭素－酸素一重結合、炭素－窒素一重結合、Ｓ－Ｓ一重結合などが挙げられる。スペーサー単位は、こうした一重結合を主体とすることが好ましい。なお、スペーサー単位は、一重結合を含む限り一部に芳香環あるいはシクロアルカンを含んでいてもよい。 Although the spacer unit is not particularly limited, it is also suitable to have a freely rotatable linking group. For example, the Spacer unit preferably has a linear structure containing single bonds. Single bonds include, for example, carbon-carbon single bonds, carbon-oxygen single bonds, carbon-nitrogen single bonds, SS single bonds and the like. It is preferred that the spacer unit is mainly composed of such single bonds. The spacer unit may partially contain an aromatic ring or cycloalkane as long as it contains a single bond.

スペーサー単位としては、置換されていてもよいアルキレン鎖又はポリオキシアルキレン鎖を含むことが好ましい。こうした鎖状の連結構造は、細胞接着性モチーフ単位間距離の設計が容易であり、かつ全体として回転運動が可能であるからである。 The spacer unit preferably contains an optionally substituted alkylene chain or polyoxyalkylene chain. This is because such a chain-like linking structure facilitates the design of the distance between cell adhesive motif units, and allows rotational movement as a whole.

こうしたスペーサー単位としては、例えば、以下の式（１）で表されるスペーサー単位が挙げられる。なお、以下の式（１）及び（２）においては、一例として、リン酸ジエステル結合を介してスペーサー単位が連結されている態様として示す。
５’－Ｏ－Ｃ_mＨ_2m－Ｏ－３’ 式（１）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｍは２以上の整数を表す。） Examples of such spacer units include spacer units represented by the following formula (1). In addition, in the following formulas (1) and (2), as an example, an embodiment in which spacer units are linked via a phosphodiester bond is shown.
5'-O- _CmH2m -O-3' Formula (1 ₎
(In the formula, 5′ represents the oxygen atom of the 5′-side phosphodiester bond, 3′ represents the phosphoric acid atom of the 3′-side phosphodiester bond, and m represents an integer of 2 or more. )

式（１）においてｍは、好ましくは２以上４０以下であり、より好ましくは３以上２０以下である。式（１）中のＨの置換基は、典型的には、アルキル基、アルコキシ基、水酸基等が挙げられる。アルキル基及びアルコキシ基の炭素数は１～８であることが好ましく、より好ましくは１～４である。また、２以上の置換基を有する場合には、置換基は同一であっても異なっていてもよい。さらに、置換基を有していないことも好ましい。 In formula (1), m is preferably 2 or more and 40 or less, more preferably 3 or more and 20 or less. Substituents for H in formula (1) typically include an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, and the like. The number of carbon atoms in the alkyl group and alkoxy group is preferably 1-8, more preferably 1-4. Moreover, when it has two or more substituents, the substituents may be the same or different. Furthermore, it is also preferable not to have a substituent.

また、他のスペーサー単位としては、以下の式（２）で表される単位が挙げられる。
５’－（ＯＣ_nＨ_2n）_l－３’ 式（２）
（式中、５’は、５’側のリン酸ジエステル結合の酸素原子を表し、３’は、３’側のリン酸ジエステル結合のリン酸原子を表し、ｎは２以上４以下の整数を表し、ｌは、２以上の整数を表す。） Other spacer units include units represented by the following formula (2).
5'-(OC _n H _2n ) _l -3' Formula (2)
(Wherein, 5′ represents the oxygen atom of the 5′-side phosphodiester bond, 3′ represents the phosphoric acid atom of the 3′-side phosphodiester bond, and n is an integer of 2 or more and 4 or less. and l represents an integer of 2 or more.)

式（２）において（ｎ＋１）×ｌは、好ましくは２以上４０以下であり、より好ましくは３以上２０以下である。式（２）中のＨの置換基は、式（１）中の置換基と同様の態様が適用される。 In formula (2), (n+1)×l is preferably 2 or more and 40 or less, more preferably 3 or more and 20 or less. The same aspect as the substituent in formula (1) is applied to the substituent of H in formula (2).

スペーサー単位は、２以上の細胞接着性モチーフ単位を離間するのに必要な個数を細胞接着性モチーフ単位間に備えることができる。したがって、本試薬が備える細胞接着性モチーフ単位の数に応じ必要なスペーサー単位を備えることができる。例えば、本試薬が細胞接着性モチーフ単位を３個備える場合には、スペーサー単位は、これらを離間するために少なくとも２個必要であり、同様に、細胞接着性モチーフ単位を４個備える場合には、これらの離間のために少なくとも３個必要であり、細胞接着性モチーフ単位を５個備える場合には、これらを離間するために少なくとも４個必要である。 Spacer units can be provided between cell adhesive motif units in the number required to separate two or more cell adhesive motif units. Therefore, the necessary spacer units can be provided according to the number of cell adhesion motif units provided in the present reagent. For example, when the present reagent comprises three cell adhesion motif units, at least two spacer units are required to separate them. , at least three are required to separate them, and when five cell adhesive motif units are provided, at least four are required to separate them.

図２に示すように、スペーサー単位は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等の固相合成法を利用して、側鎖というよりもむしろ骨格として備えられることができる。 As shown in FIG. 2, Spacer units can be provided as backbones rather than as side chains, eg, using solid phase synthesis of DNA, RNA, and the like.

図１及び図２に示すように、本試薬は、１以上のスペーサー単位が前記２以上の細胞性接着モチーフ単位を互いに離間している。例えば、本試薬は、２個の細胞接着性モチーフ単位を、１個のスペーサー単位を介在させるようした構造単位を直列して連結させた直鎖状構造を有することができる。 As shown in Figures 1 and 2, the reagent has one or more spacer units separating said two or more cellular adhesion motif units from each other. For example, the present reagent can have a linear structure in which two cell adhesion motif units are linked in series with structural units interposed with one spacer unit.

本試薬は、特に限定するものではないが、例えば、細胞接着性モチーフ単位を３個以上備えることが好ましく、また例えば、同単位を４個以上備えることが好ましく、同単位を５個以上備えることが好ましく、また例えば、同単位を６個以上備えることが好ましい。これらのいずれもが、スペーサー単位で離間されていることが好ましい。多数個の細胞接着性モチーフ単位をスペーサー単位で離間して備えることで、細胞表面のレセプターとの相互作用確率を向上させることができ、細胞内への取り込みが向上する。 Although the present reagent is not particularly limited, for example, it preferably comprises 3 or more cell adhesion motif units, preferably comprises 4 or more of the same units, and preferably comprises 5 or more of the same units. is preferable, and for example, it is preferable to have 6 or more of the same units. Any of these are preferably spaced apart by spacer units. By providing a large number of cell adhesive motif units spaced apart by spacer units, the probability of interaction with cell surface receptors can be improved, and cellular uptake is improved.

本試薬は、こうした直鎖状構造部分を１つのみ有していてもよいし、２以上有していてもよい。例えば、分岐するリンカーを用いて各リンカーに対してこうした直鎖状構造部分を連結してもよい。本試薬の直鎖状構造部分の末端や非末端以外の細胞接着性を損なわない個所にリンカーの枝を架橋反応等によって連結することができる。こうした分岐するリンカー化合物は、種々の化合物が当業者に周知である。かかる分岐リンカーとしては、例えば、公知の種々の２官能性又は３官能性以上の架橋剤等が挙げられる。 The present reagent may have only one such linear structural portion, or may have two or more. For example, branching linkers may be used to link such linear structural moieties to each linker. A branch of the linker can be linked by a cross-linking reaction or the like to a site other than the end or non-end of the linear structure portion of the present reagent that does not impair the cell adhesiveness. A variety of such branching linker compounds are well known to those skilled in the art. Such branched linkers include, for example, various known bifunctional or trifunctional or higher cross-linking agents.

このような構造を有する本試薬を合成するためには、特に限定されないで公知の種々の方法で合成することができるが、例えば、細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位との選択の自由度や連結形態の自由度を考慮すると、オリゴリボヌクレオチドの固相合成方法を用いることができる。なお、本試薬の製造方法については、後段で詳述するが、医薬品製造などにおいて産業応用が容易な方法が望ましい。 In order to synthesize the present reagent having such a structure, it can be synthesized by various known methods without particular limitation. Considering the freedom of morphology, solid-phase synthesis of oligoribonucleotides can be used. The method for producing this reagent will be described in detail later, but a method that can be easily applied to industries such as pharmaceutical production is desirable.

（本試薬の製造）
本試薬は、細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位の種類と配列とに応じて適宜製造することができる。特に限定するものではないが、本試薬は、例えば、ＤＮＡやＲＮＡの固相合成法を利用して合成することができる。具体的には、細胞接着性モチーフ単位及びスペーサー単位等を、固相合成のための誘導体、例えば、ホスホロアミダイト誘導体として準備することなどにより、任意の組合せで本試薬を製造することができる。 (Manufacturing of this reagent)
This reagent can be produced appropriately according to the types and sequences of the cell adhesive motif unit and the spacer unit. Although not particularly limited, this reagent can be synthesized, for example, using a solid-phase synthesis method for DNA or RNA. Specifically, the present reagent can be produced in any combination by preparing a cell adhesive motif unit, a spacer unit, etc. as a derivative for solid-phase synthesis, such as a phosphoramidite derivative.

一般的なオリゴリボヌクレオチドの固相合成法は、概して、オリゴリボヌクレオチドの３’末端側のリボヌクレオチド単位であって塩基、リン酸基及び水酸基等が適宜保護されたリボヌクレオチド単位がリンカー等を介してビーズなどの固相担体を準備し（固相担体準備工程（Ａ））、その後、５’末端水酸基を脱保護し（脱保護工程（Ｂ））、その後、適宜保護された所望のリボヌクレオチドのアミダイト誘導体を供給して、５'末端水酸基に所望のリボヌクレオチドをカップリング（カップリング工程（Ｃ））していくというものである。工程（Ａ）後に、（Ｂ）及び（Ｃ）を繰り返していき、最終的に塩基部分の脱保護と固相担体からの分離によって所望のオリゴリボヌクレオチドを得ることができる。本試薬は、この固相合成方法の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を利用し、リボヌクレオチドに替えて、種々の公知の核酸アナログ（グリコール核酸（ＧＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、架橋型核酸（ＢＮＡ）等）にその他の類似骨格に細胞接着性モチーフ単位やスペーサー単位を任意の配列で連結することで得ることができる。 In a general solid-phase synthesis method for oligoribonucleotides, generally, a ribonucleotide unit on the 3′ end side of an oligoribonucleotide, in which a base, a phosphate group, a hydroxyl group, etc. are appropriately protected, is attached to a linker or the like. (Solid phase support preparation step (A)), followed by deprotection of the 5′ terminal hydroxyl group (Deprotection step (B)). An amidite derivative of a nucleotide is supplied, and a desired ribonucleotide is coupled to the 5'-terminal hydroxyl group (coupling step (C)). After step (A), (B) and (C) are repeated, and finally the desired oligoribonucleotide can be obtained by deprotecting the base moiety and separating it from the solid support. This reagent utilizes steps (A), (B) and (C) of this solid-phase synthesis method, and uses various known nucleic acid analogues (glycol nucleic acid (GNA), locked nucleic acid (LNA)) in place of ribonucleotides. , bridging-type nucleic acid (BNA), etc.) and other similar scaffolds can be obtained by linking a cell adhesive motif unit or a spacer unit in an arbitrary sequence.

また、本試薬の製造に適用するホスホロアミダイトなどを用いるアミダイト法等においては、適宜、例えば、リン酸ジエステル部分の酸素原子の一つを硫黄原子、メチル基などの低級アルキル基、ボラノ基で置換するほか、モルホリノホスホロジアミデート修飾、３’位の酸素原子を窒素原子に替えたＮ３’－Ｐ５ホスホロアミデート型修飾など、公知の修飾態様を適用することができる。 In addition, in the amidite method using a phosphoramidite or the like applied to the production of this reagent, for example, one of the oxygen atoms in the phosphoric acid diester moiety may be replaced by a sulfur atom, a lower alkyl group such as a methyl group, or a borano group. In addition to substitution, known modification modes such as morpholinophosphorodiamidate modification and N3'-P5 phosphoramidate type modification in which the oxygen atom at the 3' position is replaced with a nitrogen atom can be applied.

以下、オリゴリボヌクレオチドの３’末端側に導入する本試薬の合成例について例示する。例えば、３’末端側から、細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位／細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位という配列を有する本試薬を得る場合には、各単位の前駆体となる以下の３種のモノマーを準備する。 An example of synthesizing this reagent to be introduced into the 3' end of an oligoribonucleotide is described below. For example, when obtaining the present reagent having a sequence cell adhesive motif unit/spacer unit/cell adhesive motif unit/spacer unit from the 3′ end side, the following three types of monomers serving as precursors of each unit are used. prepare.

（細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー）
まず、以下のスキーム１に示す方法で、末端にトリフルオロアセチル基を有するホスホロアミダイト誘導体モノマーを準備する。このモノマーは、末端のトリフルオロアセチル基を介した共有結合により細胞接着性モチーフ単位を導入することができる。以下のスキームに示すように、アミノヘキサン酸［２］のアミノ基に、トリフルオロアセチル基を導入し（化合物［３］）、次いで、カルボキシル基の水酸基を保護するために、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）を導入し（化合物［４］）、２－シアノエチルＮ，Ｎ-ジイソプロピルアミノクロロホスホロアミダイトを添加して、細胞接着性モチーフ単位導入用のモノマーとして化合物［５］を得ることができる。 (Monomer for introducing cell adhesion motif unit)
First, a phosphoramidite derivative monomer having a trifluoroacetyl group at its end is prepared by the method shown in Scheme 1 below. This monomer can introduce a cell adhesion motif unit by covalent bonding via a terminal trifluoroacetyl group. As shown in the scheme below, a trifluoroacetyl group was introduced into the amino group of aminohexanoic acid [2] (compound [3]), and then a dimethoxytrityl group (DMTr group) is introduced (compound [4]), and 2-cyanoethyl N,N-diisopropylaminochlorophosphoramidite is added to obtain compound [5] as a monomer for introducing a cell adhesion motif unit.

後述するように、トリフルオロアセチル基に対して二官能性架橋剤によりマレイミド基が導入され、当該マレイミド基を介して細胞接着性モチーフ単位が導入されるが、必要に応じて、上記のように、固相合成法における骨格部分となるＧＮＡから細胞接着性モチーフ単位がある程度離間されるようにすることができる。 As described later, a maleimide group is introduced into the trifluoroacetyl group with a bifunctional cross-linking agent, and a cell adhesion motif unit is introduced via the maleimide group. , the cell adhesive motif unit can be spaced to some extent from the GNA that serves as the skeleton portion in the solid-phase synthesis method.

（細胞接着性モチーフ単位導入用固相担体）
次に、以下に示すスキーム２で、オリゴリボヌクレオチドの３’末端に細胞接着性モチーフ単位を導入するための固相担体を得る。スキーム１で得た化合物［４］と無水コハク酸とＮ，Ｎ-ジメチル－４－アミノピリジン（ＤＭＡＰ）とをピリジンに溶解して室温で撹拌後、酢酸エチルと水で抽出後、有機層を脱水し、最終的にスクシニル体を取得し、このスクシニル体に、不活性雰囲気下で、［1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）とＣＰＧ樹脂とを加えて静置し、ＤＭＴｒ基で保護された水産基と、トリフルオロアセチル基と、ＣＰＧと、を備える、３’末端に細胞接着性モチーフ単位導入するための細胞接着性モチーフ単位導入用固相担体を得ることができる。 (Solid Phase Carrier for Introducing Cell Adhesive Motif Units)
Next, in Scheme 2 shown below, a solid phase carrier for introducing a cell adhesion motif unit to the 3' end of the oligoribonucleotide is obtained. Compound [4] obtained in Scheme 1, succinic anhydride and N,N-dimethyl-4-aminopyridine (DMAP) are dissolved in pyridine and stirred at room temperature, extracted with ethyl acetate and water, and the organic layer is After dehydration to finally obtain the succinyl derivative, the succinyl derivative was treated with [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC/HCl) and CPG resin under an inert atmosphere. In addition, a solid phase for introducing a cell adhesive motif unit to the 3′ end, which is left still and comprises a DMTr group-protected marine group, a trifluoroacetyl group, and CPG, for introducing a cell adhesive motif unit. A carrier can be obtained.

（スペーサー単位導入用モノマー）
さらに、以下のスキーム３で、スペーサー単位導入用のホスホロアミダイト誘導体モノマーを準備する。このモノマーは、スペーサー単位を予め含有することができる。以下に示すスキーム３では、ヘキサエチレングリコール鎖をスペーサー単位としている。不活性雰囲気下で、ヘキサエチレングリコール酸をピリジンに溶解後、ＤＭＴｒＣｌを加えて室温で撹拌後、酢酸エチルと水で抽出した有機層を脱水し、減圧濃縮することで、スペーサー単位と、ＤＭＴｒ基で保護した水酸基と、ホスホロアミダイト基とを備えるスペーサー単位導入用モノマーを得ることができる。 (Monomer for introducing spacer units)
Furthermore, in Scheme 3 below, a phosphoramidite derivative monomer for introducing a spacer unit is prepared. This monomer can already contain spacer units. In Scheme 3 shown below, a hexaethylene glycol chain is used as a spacer unit. Under an inert atmosphere, after dissolving hexaethylene glycol acid in pyridine, adding DMTrCl and stirring at room temperature, the organic layer extracted with ethyl acetate and water was dehydrated and concentrated under reduced pressure to obtain spacer units and DMTr groups. A spacer unit-introducing monomer having a hydroxyl group protected with and a phosphoramidite group can be obtained.

なお、細胞接着性モチーフ単位は、例えば、図３に示すように、トリフルオロアセチル基等を介してマレイミド基を導入し、当該マレイミド基と、細胞接着性モチーフ単位に付与したチオール基との間で反応を生じさせてモノマーや固相担体に導入される。こうした細胞接着性モチーフ単位は、カップリング工程前のモノマーや固相担体に予め導入されていてもよいし、すべてのモノマーをカップリング後に一括して導入されてもよい。同一の細胞接着性モチーフ単位を導入する場合には、後修飾で一括して導入することが好都合である。 The cell adhesion motif unit is formed by, for example, introducing a maleimide group via a trifluoroacetyl group or the like as shown in FIG. is introduced into the monomer or the solid-phase carrier by causing a reaction at . Such a cell adhesive motif unit may be previously introduced into the monomer or solid phase carrier before the coupling step, or may be introduced at once after coupling all the monomers. When introducing the same cell adhesion motif unit, it is convenient to introduce them collectively by post-modification.

こうした２種のモノマーと１種類の固相担体を用いることで、本試薬の前駆体ポリマー及び本試薬を得ることができる。 By using these two types of monomers and one type of solid phase carrier, the precursor polymer of the present reagent and the present reagent can be obtained.

以下、後修飾により細胞接着性モチーフ単位を備える本試薬の合成例について説明する。まず、スキーム２で得た固相担体のＤＭＴｒ基を除去して、５’－ＯＨ基を活性化後、スキーム３で得たスペーサー単位導入用モノマーのホスホロアミダイト基をカップリングさせて、当該モノマーを、固相担体の５’－ＯＨ基に連結させる。 An example of synthesizing the present reagent provided with a cell adhesion motif unit by post-modification will be described below. First, the DMTr group of the solid-phase carrier obtained in Scheme 2 is removed to activate the 5′-OH group, and then the phosphoramidite group of the spacer unit-introducing monomer obtained in Scheme 3 is coupled to obtain the A monomer is linked to the 5'-OH group of the solid support.

次いで、残存する５’－ＯＨ基をキャッピングし、３価のリンから５価のリンによるホスホジエステル結合を形成するように酸化する。 The remaining 5'-OH groups are then capped and oxidized to form a phosphodiester bond from a trivalent phosphorus to a pentavalent phosphorus.

引き続き、カップリングしたスペーサー単位導入用モノマーのＤＭＴｒ基を除去し、スキーム１で合成した細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーのカップリング等を行う。さらに、導入したモノマーのＤＭＴｒ基を除去に、スキーム３で合成したスペーサー単位導入用モノマーのカップリングを行った後は、酸化してＤＭＴｒ基を除去後は、固相担体から細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー／スペーサー単位導入用モノマー／細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー／スペーサー単位が重合したポリマーであって、細胞接着性モチーフ単位が導入されていない本試薬の前駆体を分離精製する。 Subsequently, the DMTr group of the coupled spacer unit-introducing monomer is removed, and the cell adhesion motif unit-introducing monomer synthesized in Scheme 1 is coupled. Furthermore, after removing the DMTr group of the introduced monomer, the spacer unit-introducing monomer synthesized in Scheme 3 was coupled, and after removing the DMTr group by oxidation, the cell adhesive motif unit was removed from the solid phase carrier. A precursor of the present reagent, which is a polymer obtained by polymerizing a monomer for introduction/a monomer for introducing a spacer unit/a monomer for introducing a cell adhesive motif unit/a spacer unit and into which no cell adhesion motif unit is introduced, is separated and purified.

次いで、例えば、図３に示すように、こうして得られたポリマーに対して、Ｎ―（６－マレイミドカプロキシオキシ）スクシンミド（ＥＭＣＳ）などを適用して、トリフルオロアセチル基を介して細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーの末端にマレイミド基を導入する。このマレイミド化したポリマーに、チオール基を備えた、例えば、商業的に入手可能である環状ＲＧＤペプチドなどの細胞接着性モチーフ単位を含む化合物を反応させることで、細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位／細胞接着性モチーフ単位／スペーサー単位からなる本試薬を得ることができる。 Then, for example, as shown in FIG. 3, N-(6-maleimidocaproxioxy)succinimide (EMCS) or the like is applied to the polymer thus obtained to increase cell adhesion via trifluoroacetyl groups. A maleimide group is introduced at the end of the motif unit-introducing monomer. By reacting this maleimidated polymer with a compound containing a cell adhesive motif unit such as a commercially available cyclic RGD peptide having a thiol group, a cell adhesive motif unit/spacer unit/ This reagent consisting of cell adhesive motif units/spacer units can be obtained.

なお、以上の説明においては、本試薬の前駆体を固相担体から分離後に、細胞接着性モチーフ単位を導入したが、固相担体に本試薬前駆体が分離されていない状態で細胞接着性モチーフ単位を導入することも可能である。 In the above description, the cell adhesion motif unit was introduced after the precursor of this reagent was separated from the solid phase carrier, but the cell adhesion motif was introduced before the precursor of this reagent was separated from the solid phase carrier. It is also possible to introduce units.

また、以上の説明においては、予め細胞接着性モチーフ単位を備える細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーを用いる場合には、細胞接着性モチーフ単位による後修飾を要しない。また、２種類以上の細胞接着性モチーフ単位を用いる場合には、予め細胞接着性モチーフ単位を備えるモノマーを用いた前導入形態を採用することが好適であるが、前導入と後修飾とを組み合わせることもできる。 Further, in the above description, post-modification with a cell adhesive motif unit is not required when a cell adhesive motif unit-introducing monomer having a cell adhesive motif unit in advance is used. When two or more types of cell adhesive motif units are used, it is preferable to adopt a pre-introduction form using a monomer having a cell adhesive motif unit in advance, but pre-introduction and post-modification are combined. can also

さらに、以上の説明においては、オリゴリボヌクレオチドの３’末端側に本試薬を備えるようにすることを想定して説明したが、オリゴリボヌクレオチドの５’末端側に本試薬を備えるように本試薬を合成することも当業者であれば適宜実施可能である。 Furthermore, in the above explanation, it is assumed that the present reagent is provided on the 3' end side of the oligoribonucleotide, but the present reagent is provided on the 5' end side of the oligoribonucleotide. A person skilled in the art can also synthesize the as appropriate.

さらにまた、以上の説明においては、各モノマーは、リン酸ジエステル結合により連結されているが、モノマーの連結形態は、これに限定するものではなく、既述のように公知の技術に基づいて、種々の連結形態を適宜選択することができる。 Furthermore, in the above description, each monomer is linked by a phosphodiester bond, but the linked form of the monomers is not limited to this. Various connection forms can be selected as appropriate.

このように、アミダイト法などの固相合成法を用いることで、任意の細胞接着性モチーフ単位とスペーサー単位とを備える本試薬を容易に合成することができる。しかも、本試薬を適用するオリゴリボヌクレオチドの合成と同時に本試薬も合成することができる。 Thus, by using a solid-phase synthesis method such as the amidite method, the present reagent comprising arbitrary cell-adhesive motif units and spacer units can be easily synthesized. Moreover, the present reagent can be synthesized simultaneously with the synthesis of the oligoribonucleotide to which the present reagent is applied.

本試薬は、上記のようにＤＮＡやＲＮＡの合成に広く用いられているアミダイト固相合成法ほか、当業者であれば、公知のＤＮＡやＲＮＡの合成手法を適宜適用して合成することができる。細胞接着性モチーフ単位を導入用モノマーに導入する方法は、上記したほか、種々の公知の二価性試薬を用いて、モノマーと細胞接着性モチーフ単位とを連結することができる。また、当業者は、適宜、かかる二価性試薬を導入可能な官能基をモノマーに付与することができる。さらにまた、当業者は、スペーサー単位導入用モノマーにおけるスペーサーを公知のスペーサーから適宜選択することができる。 This reagent can be synthesized by appropriately applying known DNA and RNA synthesis methods to those skilled in the art, in addition to the amidite solid-phase synthesis method widely used for the synthesis of DNA and RNA as described above. . In addition to the method described above, various known bifunctional reagents can be used to link the cell adhesion motif unit to the cell adhesion motif unit. Moreover, those skilled in the art can appropriately impart to the monomer a functional group capable of introducing such a bifunctional reagent. Furthermore, those skilled in the art can appropriately select the spacer in the spacer unit-introducing monomer from known spacers.

本試薬によれば、細胞接着性モチーフ単位を、スペーサー単位を介在させて任意の距離離間させることができる。細胞接着性モチーフ単位は、スペーサー単位によって予め所定距離を離間しているため、細胞表面に離間して存在している細胞接着レセプターに対して、効果的に結合できる。すなわち、個々の相互作用が弱くても全体として、すなわち、複数の細胞接着性モチーフが複数のレセプターに結合可能であるため、より強く相互作用して細胞表面に接着することができる。しかも、細胞接着性モチーフ単位間距離を、例えば、細胞表面における、細胞接着性モチーフが結合するレセプター間距離に対応させることができる。さらに、細胞接着性モチーフ単位の離間距離は、スペーサー単位が介在されることによって付与されるため、確実にかつ容易に付与されているとともに、スペーサー単位を介して直列的に細胞接着性モチーフ単位が離間されているために、細胞接着性モチーフ単位のレセプターに対するアクセス自由度も高くなっている。したがって、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、簡易にかつ効果的に本試薬はターゲット細胞の表面に接着することができる。また、直列に並んだスペーサー単位と細胞接着性モチーフ単位は細胞膜上を浮遊するレセプターを捜索し、複数個を結合し、抱き込み、クラスター化することができると考えられる。 According to this reagent, the cell adhesion motif units can be spaced apart by an arbitrary distance via the spacer unit. Since the cell adhesion motif units are spaced apart in advance by the spacer unit, they can effectively bind to the cell adhesion receptor present at a distance on the cell surface. That is, even if the individual interactions are weak, as a whole, ie, multiple cell adhesion motifs can bind to multiple receptors, they can interact more strongly to adhere to the cell surface. Moreover, the distance between cell adhesion motif units can correspond to, for example, the distance between receptors on the cell surface to which the cell adhesion motif binds. Furthermore, since the spaced distance between the cell adhesive motif units is provided by interposing the spacer unit, it is reliably and easily provided, and the cell adhesive motif units are arranged in series via the spacer unit. Due to the separation, the freedom of access of the cell adhesion motif units to the receptors is also high. Therefore, the present reagent can adhere to the surface of the target cell more easily and effectively than when the cell adhesive motif unit is provided in a branched form. In addition, it is thought that the spacer unit and the cell adhesion motif unit arranged in series can search for receptors floating on the cell membrane, bind, entrap and cluster a plurality of them.

また、本試薬は、スペーサー単位を介して直列的に、例えば、好ましくはリンカーを介してスペーサー単位が連続する方向及び／又はオリゴリボヌクレオチドにおける鎖長方向に対して側鎖状に細胞接着性モチーフ単位を備えることができる。このため、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、比較的嵩高い細胞接着性モチーフ単位であっても、ターゲットとなる細胞表面に対して近接しやすくなっている。この点においても、分岐状に細胞接着性モチーフ単位を備える場合に比較して、簡易にかつ効果的に本試薬はターゲット細胞の表面に接着することができる。 In addition, the present reagent is arranged in series via a spacer unit, for example, preferably in the direction in which the spacer units are continuous via a linker and/or in the side chain direction in the chain length direction of the oligoribonucleotide. Units can be provided. Therefore, even a relatively bulky cell adhesive motif unit can easily approach the surface of a target cell as compared with the case where the cell adhesive motif unit is provided in a branched form. In this respect as well, the present reagent can adhere to the surface of target cells more easily and effectively than when the cell adhesive motif unit is provided in a branched form.

本試薬は、上記例示において用いられたポリエチレングリコール鎖などのスペーサー単位と、細胞接着性モチーフ単位と、を、タンデム（交互に）等で並んだ状態を採ることができ、これらの単位をそれぞれ任意の数繰り返すことができる構造になっている。したがって、本試薬は、一定の距離を離間できるスペーサー単位で細胞接着性モチーフ単位を離間する繰り返し構造を有するものであってもよいし、２以上の異なる距離を離間するように２種類以上のスペーサー単位又は複数のスペーサー単位によって細胞接着性モチーフ単位を離間する構造を有するものとしてもよい。このように、本試薬は、細胞接着性モチーフ単位の配置を容易に最適化することができる。 In this reagent, spacer units such as polyethylene glycol chains and cell adhesive motif units used in the above examples can be arranged in tandem (alternately) or the like. It has a structure that can be repeated the number of times. Therefore, the present reagent may have a repeating structure in which cell adhesive motif units are separated by spacer units that can be spaced apart at a certain distance, or two or more types of spacers that are spaced apart by two or more different distances. It may have a structure in which cell adhesive motif units are separated by a unit or a plurality of spacer units. Thus, this reagent can easily optimize the arrangement of cell adhesion motif units.

さらに、本試薬は、スペーサー単位として、ポリエチレングリコール鎖などのある種の細胞選択性を発揮する化合物単位を細胞接着性モチーフ単位を離間する直鎖部分として備えることができる。このため、かかるスペーサー単位に、細胞選択性等の機能など、本試薬によるターゲティングを補助することができる。 Furthermore, the present reagent can comprise, as a spacer unit, a compound unit that exerts certain cell-selectivity, such as a polyethylene glycol chain, as a linear portion separating the cell adhesion motif units. As such, such Spacer units can assist in targeting by the present reagents, including functions such as cell selectivity.

以上説明したように、本試薬は、よりしなやかに細胞接着性モチーフ単位を保持し、しかも、細胞接着性モチーフ単位の嵩高さに係わらず独立して細胞表面のレセプターと相互作用可能であるために、本試薬と複合化されたオリゴリボヌクレオチドを細胞表面に効率的に近接させることができ、オリゴリボヌクレオチドの細胞内導入を促進することができる。 As described above, this reagent retains the cell adhesion motif unit more flexibly and can interact independently with cell surface receptors regardless of the bulkiness of the cell adhesion motif unit. , the oligoribonucleotide complexed with the present reagent can be effectively brought close to the cell surface, and can promote intracellular introduction of the oligoribonucleotide.

本試薬の細胞接着性モチーフ単位が細胞接着性モチーフとしてペプチド性のモチーフを有する場合、本試薬は、２個のペプチド性モチーフ単位が、少なくとも１個の非ペプチド性のスペーサー単位で離間されたペプチド誘導体と理解することができる。かかるペプチド誘導体は、新規化合物である。 When the cell adhesive motif unit of the present reagent has a peptidic motif as the cell adhesive motif, the reagent is composed of peptides in which two peptidic motif units are separated by at least one non-peptidic spacer unit. can be understood as derivatives. Such peptide derivatives are novel compounds.

（細胞導入コンジュゲート）
本明細書に開示される細胞導入コンジュゲート（以下、単に、本コンジュゲートともいう。）は、２個以上の細胞性接着モチーフ単位と、１以上のスペーサー単位と、を備え、前記１以上のスペーサー単位が前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位を互いに離間する、細胞接着領域（以上、本試薬に相当する。）と、オリゴリボヌクレオチドと、を備え、共有結合によって本試薬とオリゴリボヌクレオチドとが複合化されているコンジュゲートである。本コンジュゲートによれば、本試薬によって、オリゴリボヌクレオチドが非特定の血中タンパク質からのトラップを回避して細胞表面に近接され相互作用しやすくなる。このため、オリゴリボヌクレオチドが細胞内に導入されやすくなる。 (cell introduction conjugate)
The cell introduction conjugate disclosed herein (hereinafter also simply referred to as the present conjugate) comprises two or more cellular adhesion motif units and one or more spacer units, and the one or more The spacer unit comprises a cell adhesion region (the above corresponds to the present reagent) in which the two or more cell adhesion motif units are separated from each other, and an oligoribonucleotide, and the present reagent and the oligoribonucleotide are covalently bonded to each other. is a conjugate in which is combined with According to the conjugate, the reagent allows the oligoribonucleotides to avoid trapping from non-specific blood proteins and to approach the cell surface to facilitate interaction. This facilitates the introduction of oligoribonucleotides into cells.

本コンジュゲートは、細胞接着領域、すなわち、本試薬とオリゴリボヌクレオチドとを共有結合によって複合化されていてもよい。なお、かかる形態の本コンジュゲートは、オリゴリボヌクレオチド誘導体であるといえる。本試薬とオリゴリボヌクレオチドとの共有結合は、オリゴリボヌクレオチドの５’末端及び／又は３’末端に対して本試薬を結合することが好ましい。例えば、ｓｉＲＮＡとして用いる場合には、細胞質内でＲＩＳＣ複合体を形成してＲＮＡ干渉に作用するのはアンチセンス鎖であるため、例えば、センス鎖の３’末端及び／又は５’末端に対して本試薬を備えることが好ましい。 The conjugate may be covalently complexed with a cell adhesion region, ie, the agent and an oligoribonucleotide. The present conjugate in such a form can be said to be an oligoribonucleotide derivative. Covalent attachment of the reagent to the oligoribonucleotide preferably links the reagent to the 5' and/or 3' end of the oligoribonucleotide. For example, when used as siRNA, it is the antisense strand that forms a RISC complex in the cytoplasm and acts on RNA interference. It is preferable to have this reagent.

本試薬とオリゴリボヌクレオチドとの結合は、別々に準備したオリゴリボヌクレオチドと本試薬とを、いわゆるバイオコンジュゲートなどを用いて共有結合させることができる。例えば、一方に反応性の高い架橋反応基を導入して、他方にかかる架橋性官能チオールを導入することで、両者を連結することができる。このような結合形態としては、この他、バイオコンジュゲーションとして知られている、本試薬中に備えることができる第１級アミノ基、カルボキシ基、スルフヒドリル基、カルボニル基と、カルボジイミド基、マレイミド、ＮＨＳエステル、イミドエステルなどとの間による架橋反応を利用できる。 The reagent and the oligoribonucleotide can be covalently bonded to the separately prepared oligoribonucleotide using a so-called bioconjugate or the like. For example, by introducing a highly reactive cross-linking reaction group to one side and introducing a cross-linkable functional thiol to the other side, the two can be linked. Such binding forms also include primary amino groups, carboxyl groups, sulfhydryl groups, carbonyl groups, carbodiimide groups, maleimide groups, NHS Cross-linking reactions with esters, imidoesters, etc. can be used.

また、既に説明したように、本試薬をオリゴリボヌクレオチドの固相合成法に準じて合成する場合には、固相合成法を用いて、本試薬の前駆体となる細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーとスペーサー単位導入用モノマーとを含むポリマー鎖の合成を伴ってオリゴリボヌクレオチドを合成することで、本コンジュゲートを合成することができる。固相合成による場合においても、本試薬をオリゴリボヌクレオチドの３’末端に付与することもできるし、５’末端に付与することもできる。 In addition, as already explained, when synthesizing this reagent according to the solid-phase synthesis method of oligoribonucleotides, the solid-phase synthesis method is used to synthesize The present conjugate can be synthesized by synthesizing an oligoribonucleotide accompanied by synthesis of a polymer chain containing a monomer and a spacer unit-introducing monomer. Even when solid-phase synthesis is used, the present reagent can be attached to the 3'-end or 5'-end of the oligoribonucleotide.

本コンジュゲートに用いるオリゴリボヌクレオチドは、以下の式（１）又は（２）で表されるヌクレオシド誘導体（以下、単に、本ヌクレオシド誘導体ともいう。）又はその塩を含むことができる。本ヌクレオシド誘導体は、当業者の周知の方法で、オリゴヌクレオチドの部分構造に含めることができる。 The oligoribonucleotide used in this conjugate can contain a nucleoside derivative represented by the following formula (1) or (2) (hereinafter also simply referred to as this nucleoside derivative) or a salt thereof. This nucleoside derivative can be incorporated into the partial structure of an oligonucleotide by methods well known to those skilled in the art.

（式（１）中、Ｒ¹は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ²及びＲ⁴は互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は－Ｐ（＝Ｏ）_nＲ⁵Ｒ⁶（nは０又は１を示し、Ｒ⁵及びＲ⁶は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ³は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷（Ｒ⁷は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン－９－イル基、２－オキソ－ピリミジン－１－イル基、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基のいずれかを表す。）

(In formula (1), R ¹ represents a hydroxyl group, a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group, or a protected group, and in formula (2), X represents a halogen atom. Formula ( In 1) and formula (2), R ² and R ⁴ may be the same or different, and may be a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group, a phosphate group, a protected phosphate group, or -P(=O). _n R ⁵ R ⁶ (n represents 0 or 1, R ⁵ and R ⁶ may be the same or different, hydrogen atom, hydroxyl group, protected hydroxyl group, mercapto group, protected mercapto group, lower an alkoxy group, a cyano-lower alkoxy group, an amino group, or a substituted amino group, provided that when n is 1, both R ⁵ and R ⁶ are not hydrogen atoms); R ³ represents NHR ⁷ (R ⁷ represents a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, or an amino-protecting group), an azide group, an amidino group, or a guanidino group, each having a linking group; B is a purine; -9-yl group, 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, substituted purin-9-yl group, or substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group.)

本ヌクレオシド誘導体は、リボースの第４’位に塩基性を有する置換基を備えることで、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドにおいて、オリゴリボヌクレオチドが有するリン酸基などに起因する負電荷の少なくとも一部を中和することができるという電荷調節能を備えることができる。 The present nucleoside derivative has a basic substituent at the 4'-position of ribose, so that in an oligoribonucleotide having a partial structure derived from the present nucleoside derivative, the phosphate group and the like of the oligoribonucleotide It can be provided with charge-modulating capability that can neutralize at least a portion of the negative charge.

また、本ヌクレオシド誘導体は、当該部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドの細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、本ヌクレオシド誘導体に由来する部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドにおいて、リボヌクレアーゼ耐性を向上することができる。 In addition, the present nucleoside derivative can improve the cell membrane permeability of the oligoribonucleotide having the partial structure. Furthermore, oligoribonucleotides having a partial structure derived from the present nucleoside derivative can have improved ribonuclease resistance.

このようなオリゴリボヌクレオチドと本試薬とのコンジュゲートによれば、オリゴリボヌクレオチドは、本試薬によって細胞表面に近接しやすくなり、しかも、ヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性が向上されているため、一層細胞内に導入されやすくなっている。 According to such a conjugate of an oligoribonucleotide and this reagent, the oligoribonucleotide can easily approach the cell surface by this reagent, and furthermore, the nuclease resistance and cell membrane permeability are improved, so that the cell It is easy to be introduced inside.

本明細書中、構造式等で表される化合物における置換基における「低級」の意は、該置換基を構成する炭素数が、最大１０個までであることを意味している。例えば、通常は炭素数１～６個、又は炭素数１～５個が例示され、さらには炭素数１～４個、又は炭素数１～３個であることが好ましい例として挙げられる。 In the present specification, the meaning of "lower" in a substituent in a compound represented by a structural formula or the like means that the number of carbon atoms constituting the substituent is up to 10. For example, it usually has 1 to 6 carbon atoms, or 1 to 5 carbon atoms, and more preferably 1 to 4 carbon atoms or 1 to 3 carbon atoms.

以下、本ヌクレオシド誘導体又はその塩及びこれらの利用について説明する。 The present nucleoside derivatives or salts thereof and their uses will be described below.

（ヌクレオシド誘導体及びその塩）
本ヌクレオシド誘導体又はその塩の一つの態様は、以下の式（１）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。 (Nucleoside derivatives and salts thereof)
One embodiment of the present nucleoside derivative or salt thereof is a nucleoside derivative represented by the following formula (1) or a salt thereof.

また、本ヌクレオシド誘導体又はその塩の他の一つの態様は、以下の式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩である。 Another aspect of the present nucleoside derivative or salt thereof is a nucleoside derivative represented by the following formula (2) or a salt thereof.

[Ｒ¹について]
式（１）中、Ｒ¹は水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された水酸基を表す。 [About ^R1 ]
In formula (1), R ¹ represents a hydroxyl group, a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group, or a protected hydroxyl group.

[Ｘについて]
式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。ハロゲン原子としては、特に限定するものではないが、塩素原子、ヨウ素原子、フッ素原子及び臭素原子等が挙げられる。Ｒ¹がハロゲン原子のとき、本ヌクレオシド誘導体は、デオキシリボヌクレオシド誘導体である。なお、ハロゲン原子は、式（２）からも明らかなように、リボースの２’位の炭素原子に対する結合方向は特に限定するものではないが、天然のリボースの水酸基に相当するようにハロゲン原子が結合することが好適である。 [About X]
In Formula (2), X represents a halogen atom. Halogen atoms include, but are not particularly limited to, chlorine, iodine, fluorine, and bromine atoms. When R ¹ is a halogen atom, the present nucleoside derivative is a deoxyribonucleoside derivative. As is clear from formula (2), the halogen atom is not particularly limited in the bonding direction with respect to the carbon atom at the 2'-position of ribose, but the halogen atom is such that it corresponds to the hydroxyl group of natural ribose. It is preferred to combine.

（アルキル基）
本明細書中、アルキル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１～６個の低級アルキル基、又は炭素数１～５個の低級アルキル基がより好ましい例として挙げられ、さらに炭素数１～４個又は炭素数１～３個の低級アルキル基が特に好ましい例として挙げられる。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、又ｎ－ブチル基等が好適な例として挙げられ、このうち、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基が好ましく、また例えばメチル基、エチル基が好ましく、また例えばメチル基が好ましい。また分枝状の炭素数１から４までのアルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｓ－ブチル基、ｔ－ブチル基等が挙げられ、このうち、イソプロピル基が特に好ましい例として挙げられる。又、環状の炭素数１から４までのアルキル基としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、又はシクロプロピルメチル基等が挙げられる。 (alkyl group)
As used herein, alkyl groups include saturated hydrocarbon groups that are linear, branched, cyclic, or combinations thereof. Usually, a lower alkyl group is preferred, for example, a lower alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, or a lower alkyl group having 1 to 5 carbon atoms is more preferred, and furthermore, a lower alkyl group having 1 to 4 carbon atoms or Particularly preferred examples include 1 to 3 lower alkyl groups. Preferred examples of the straight-chain alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group and the like. Among them, methyl group, ethyl group, An n-propyl group is preferred, and for example a methyl group, an ethyl group are preferred, and for example a methyl group is preferred. Examples of the branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms include isopropyl group, isobutyl group, s-butyl group, t-butyl group and the like, among which isopropyl group is particularly preferred. Moreover, the cyclic alkyl group having 1 to 4 carbon atoms includes a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopropylmethyl group, and the like.

（アルケニル基）
本明細書中、アルケニル基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和炭化水素基が挙げられる。通常は、低級アルケニル基が好ましく、低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基などが挙げられる。 (alkenyl group)
As used herein, alkenyl groups include saturated hydrocarbon groups that are linear, branched, cyclic, or combinations thereof. Generally, lower alkenyl groups are preferred, and examples of lower alkenyl groups include ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-methyl-2-propenyl, 1-methyl-1-propenyl, 2-methyl -1-propenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group and the like.

（水酸基の保護基又は保護された水酸基）
本明細書において、水酸基の保護基としては、当業者に周知であって、例えばＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、２００７年版）を参考にすることができる。水酸基の保護基としては、代表的な例を挙げると、例えば、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、低級アルコキシメチル基、適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基、適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但し前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン原子、又はシアノ基を意味する。）、又はシリル基、等が例示される。 (Hydroxyl protecting group or protected hydroxyl group)
In the present specification, the hydroxyl-protecting group is well known to those skilled in the art, and for example, Protective Groups in Organic Synthesis (John Wiley and Sons, 2007 edition) can be referred to. Representative examples of hydroxyl-protecting groups include aliphatic acyl groups, aromatic acyl groups, lower alkoxymethyl groups, oxycarbonyl groups which may have appropriate substituents, and appropriate substituents. An optional tetrahydropyranyl group, an optionally substituted tetrathiopyranyl group, and a methyl group substituted with a total of 1 to 3 substituted or unsubstituted aryl groups (provided that Examples of substituents on aryl include lower alkyl, lower alkoxy, a halogen atom, or a cyano group), a silyl group, and the like.

なお、本明細書中、アルコキシ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルエーテル基が挙げられる。低級アルコキシ基が好ましく、低級アルコキシ基としては、例えば炭素数１～６個の低級アルコシキ基、又は炭素数１～５個の低級アルコシキ基が挙げられ、さらには炭素数１～４個、又は炭素数１～３個のアルコキシ基が好ましく、炭素数１～４個のアルコキシ基が特に好ましい。炭素数１～４個のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、又はｎ－ブトキシ基等が好ましい例として挙げられる。また、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、又はｔ－ブトキシ基等も好ましい例として挙げられる。また、シクロプロポキシ基、シクロブトキシ基も好ましく、シクロプロピルメトキシ基も好ましい例として挙げられる。 As used herein, the alkoxy group includes saturated alkyl ether groups that are linear, branched, cyclic, or a combination thereof. A lower alkoxy group is preferred, and the lower alkoxy group includes, for example, a lower alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms, a lower alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and further a lower alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, or a An alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms is preferred, and an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms is particularly preferred. Preferred examples of the alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, an n-butoxy group and the like. In addition, an isopropoxy group, an isobutoxy group, a s-butoxy group, a t-butoxy group, and the like are also preferable examples. A cyclopropoxy group and a cyclobutoxy group are also preferred, and a cyclopropylmethoxy group is also preferred.

本明細書中、アルキルチオ基としては、直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである飽和アルキルチオ基が挙げられる。低級アルキルチオ基が好ましく、低級アルキルチオ基としては、例えば炭素数１～６個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１～５個の低級アルキルチオ基が好ましく、さらには炭素数１～４個の低級アルキルチオ基、又は炭素数１～３個までのアルキルチオ基が特に好ましい例として挙げられる。炭素数１～４個の飽和アルキルチオ基としては、例えば、メチルチオ基、エチオルチオ基、ｎ－プロピルチオ基、ｎ－ブチルチオ基等が好ましい例として例示される。またイソプロピルチオ基、イソブチルチオ基、ｓ－ブチルチオ基、又はｔ－ブチルチオ基等も好ましい例として例示される。またシクロプロピルチオ基、又はシクロブチルチオ基が好ましい例として挙げられ、さらにシクロプロピルメチルチオ基がさらに好ましい例として例示される。
る。） As used herein, alkylthio groups include saturated alkylthio groups that are linear, branched, cyclic, or combinations thereof. A lower alkylthio group is preferred, and the lower alkylthio group is, for example, a lower alkylthio group having 1 to 6 carbon atoms, or a lower alkylthio group having 1 to 5 carbon atoms, or a lower alkylthio group having 1 to 4 carbon atoms. , or an alkylthio group having 1 to 3 carbon atoms is particularly preferred. Preferred examples of saturated alkylthio groups having 1 to 4 carbon atoms include methylthio, ethylthio, n-propylthio, n-butylthio and the like. Preferable examples include an isopropylthio group, an isobutylthio group, a s-butylthio group, a t-butylthio group, and the like. Preferable examples include a cyclopropylthio group and a cyclobutylthio group, and a more preferable example is a cyclopropylmethylthio group.
be. )

これらのうち、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、シリル基が特に好ましい例として挙げられる。また、合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基（但しその置換アリールにおける置換基は、前述の通り）も好ましい例として挙げられる。 Among these, particularly preferred examples include aliphatic acyl groups, aromatic acyl groups, and silyl groups. Further, a methyl group substituted with a total of 1 to 3 substituted or unsubstituted aryl groups (wherein the substituents for the substituted aryl are as described above) are also included as preferred examples.

上記の脂肪族アシル基としては、例えば、アルキルカルボニル基、カルボキシアルキルカルボニル基、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基、又は低級アルコキシ低級アルキルカルボニルが挙げられる。 Examples of the above aliphatic acyl groups include alkylcarbonyl groups, carboxyalkylcarbonyl groups, halogeno-lower alkylcarbonyl groups, and lower alkoxy-lower alkylcarbonyl groups.

なお、前記アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。すなわち、アルキルカルボニル基としては、例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３－メチルノナノイル基、８－メチルノナノイル基、３－エチルオクタノイル基、３，７－ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１－メチルペンタデカノイル基、１４－メチルペンタデカノイル基、１３，１３－ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５－メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１－メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基、又はヘナイコサイル基が挙げられる。このうち、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基が好ましい例として挙げられ、さらにはアセチル基が特に好ましい例として挙げられる。また前記カルボキシ化アルキルカルボニル基におけるアルキルは前述の説明の通りである。カルボキシ化の置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、カルボキシ化アルキルカルボニル基としては、例えばスクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基が挙げられる。 The alkyl in the alkylcarbonyl group is as described above. That is, the alkylcarbonyl group includes, for example, formyl group, acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, pentanoyl group, pivaloyl group, valeryl group, isovaleryl group, octanoyl group, nonanoyl group, decanoyl group, 3-methylnonanoyl group, 8-methylnonanoyl group, 3-ethyloctanoyl group, 3,7-dimethyloctanoyl group, undecanoyl group, dodecanoyl group, tridecanoyl group, tetradecanoyl group, pentadecanoyl group, hexadecanoyl group, 1-methylpentadecanyl group noyl group, 14-methylpentadecanoyl group, 13,13-dimethyltetradecanoyl group, heptadecanoyl group, 15-methylhexadecanoyl group, octadecanoyl group, 1-methylheptadecanoyl group, nonadecanoyl group, eicosanoyl group , or a henaicosyl group. Among them, preferred examples include acetyl group, propionyl group, butyryl group, isobutyryl group, pentanoyl group, and pivaloyl group, and particularly preferred example is acetyl group. The alkyl in the carboxylated alkylcarbonyl group is as described above. Substitution positions for carboxylation and the like can also be selected as appropriate. Examples of carboxylated alkylcarbonyl groups include succinoyl, glutaroyl and adipoyl groups.

前記ハロゲノ低級アルキルカルボニル基における、ハロゲン、低級、及びアルキルについては前述の説明の通りである。ハロゲンの置換位置などについても適宜選択できる。すなわち、ハロゲノ低級アルキルカルボニル基としては、例えばクロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基が挙げられる。 Halogen, lower and alkyl in the halogeno-lower alkylcarbonyl group are as described above. The substitution position of halogen and the like can also be selected as appropriate. That is, the halogeno-lower alkylcarbonyl group includes, for example, a chloroacetyl group, a dichloroacetyl group, a trichloroacetyl group and a trifluoroacetyl group.

前記低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基における、アルコキシ及びアルキル、さらに低級については前述の説明の通りである。低級アルコキシが置換する位置などについても適宜選択できる。すなわち、低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基として、例えばメトキシアセチル基が挙げられる。 Alkoxy, alkyl, and lower in the lower alkoxy-lower alkylcarbonyl group are as described above. The position to be substituted with lower alkoxy can also be selected as appropriate. That is, examples of lower alkoxy-lower alkylcarbonyl groups include methoxyacetyl groups.

上記の芳香族アシル基としては、例えば、アリールカルボニル基、ハロゲノアリールカルボニル基、低級アルキル化アリールカルボニル基、低級アルコキシ化アリールカルボニル基、カルボキシ化アリールカルボニル基、ニトロ化アリールカルボニル基、又はアリール化アリールカルボニル基が挙げられる。 Examples of the aromatic acyl group include an arylcarbonyl group, a halogenoarylcarbonyl group, a lower alkylated arylcarbonyl group, a lower alkoxylated arylcarbonyl group, a carboxylated arylcarbonyl group, a nitrated arylcarbonyl group, or an arylated aryl A carbonyl group is mentioned.

前記アリールカルボニル基としては、例えばベンゾイル基、α－ナフトイル基、β－ナフトイル基が挙げられ、さらに好ましくはベンゾイル基が挙げられる。前記ハロゲノアリールカルボニル基としては、例えば、２－ブロモベンゾイル基、４－クロロベンゾイル基が挙げられる。前記低級アルキル化アリールカルボニル基としては、２，４，６－トリメチルベンゾイル基、４－トルオイル基、３－トルオイル基、２－トルオイル基が挙げられる。前記低級アルコキシ化アリールカルボニル基としては、例えば４－アニソイル基、３－アニソイル基、２－アニソイル基が挙げられる。 Examples of the arylcarbonyl group include benzoyl group, α-naphthoyl group and β-naphthoyl group, and more preferably benzoyl group. Examples of the halogenoarylcarbonyl group include 2-bromobenzoyl group and 4-chlorobenzoyl group. Examples of the lower alkylated arylcarbonyl groups include 2,4,6-trimethylbenzoyl, 4-toluoyl, 3-toluoyl and 2-toluoyl groups. Examples of the lower alkoxylated arylcarbonyl group include 4-anisoyl group, 3-anisoyl group and 2-anisoyl group.

前記カルボキシル化アリールカルボニル基としては、例えば２－カルボキシベンゾイル基、３－カルボキシベンゾイル基、４－カルボキシベンゾイル基が挙げられる。前記ニトロ化アリールカルボニル基としては、例えば、４－ニトロベンゾイル基、３－ニトロベンゾイル基、２－ニトロベンゾイル基が挙げられる。前記アリール化アリールカルボニル基としては、例えば、４－フェニルベンゾイル基が挙げられる。 Examples of the carboxylated arylcarbonyl group include 2-carboxybenzoyl group, 3-carboxybenzoyl group and 4-carboxybenzoyl group. Examples of the nitrated arylcarbonyl group include 4-nitrobenzoyl group, 3-nitrobenzoyl group and 2-nitrobenzoyl group. Examples of the arylated arylcarbonyl group include a 4-phenylbenzoyl group.

低級アルコキシメチル基としては、例えばメトキシメチル基、１，１－ジメチル－１－メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ－ブトキシメチル基が挙げられる。特に好ましくはメトキシメチル基が挙げられる。 Examples of lower alkoxymethyl groups include methoxymethyl, 1,1-dimethyl-1-methoxymethyl, ethoxymethyl, propoxymethyl, isopropoxymethyl, butoxymethyl and t-butoxymethyl groups. A methoxymethyl group is particularly preferred.

適宜の置換基があってもよいオキシカルボニル基としては、低級アルコキシカルボニル基、ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基、又はアルケニルオキシカルボニル基が挙げられる。 The oxycarbonyl group which may be optionally substituted includes a lower alkoxycarbonyl group, a lower alkoxycarbonyl group substituted with a halogen or a silyl group, or an alkenyloxycarbonyl group.

前記低級アルコキシカルボニル基としては、例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニルイソブトキシカルボニル基が挙げられる。前記ハロゲン又はシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基としては、２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、２－（トリメチルシリル）エトキシカルボニル基が挙げられる。 Examples of the lower alkoxycarbonyl groups include methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl and t-butoxycarbonylisobutoxycarbonyl groups. The halogen- or silyl-substituted lower alkoxycarbonyl group includes a 2,2-trichloroethoxycarbonyl group and a 2-(trimethylsilyl)ethoxycarbonyl group.

前記アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基が挙げられる。上記の、適宜の置換基があってもよいテトラヒドロピラニル基としては、例えばテトラヒドロピラン－２－イル基、又は、３－ブロモテトラヒドロピラン－２－イル基が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはテトラヒドロピラン－２－イル基が挙げられる。 A vinyloxycarbonyl group is mentioned as said alkenyloxycarbonyl group. Preferred examples of the above-mentioned tetrahydropyranyl group which may have an appropriate substituent include tetrahydropyran-2-yl group and 3-bromotetrahydropyran-2-yl group, particularly preferably A tetrahydropyran-2-yl group can be mentioned.

適宜の置換基があってもよいテトラチオピラニル基としては、例えばテトラヒドロチオピラン－２－イル基、４－メトキシテトラヒドロチオピラン－４－イル基が挙げられ、さらに好ましくはテトラヒドロチオピラン－２－イル基が挙げられる。合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基、においては、前述の置換アリールにおける置換基としては、低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、又はシアノ基を意味する。 The tetrathiopyranyl group which may have an appropriate substituent includes, for example, a tetrahydrothiopyran-2-yl group and a 4-methoxytetrahydrothiopyran-4-yl group, more preferably tetrahydrothiopyran-2. -yl group. In the methyl group substituted by a total of 1 to 3 substituted or unsubstituted aryl groups, the substituents in the above-mentioned substituted aryl means lower alkyl, lower alkoxy, halogen, or cyano group.

合わせて１から３個の置換又は無置換のアリール基にて置換されたメチル基としては、例えばベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α－ナフチルジフェニルメチル基が挙げられ、好ましくはベンジル基、トリフェニルメチル基が挙げられる。その他に、例えば９－アンスリルメチル４－メチルベンジル基、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基が挙げられ、好ましくは、２，４，６－トリメチルベンジル基、３，４，５－トリメチルベンジル基が挙げられる。その他の種類として、例えば４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられ、好ましくは４－メトキシベンジル基、４－メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基が挙げられる。さらには、例えば４－クロロベンジル基、４－ブロモベンジル基が挙げられる。またその他に、例えば４－シアノベンジル基も好ましい例として挙げられる。 Examples of the methyl group substituted with a total of 1 to 3 substituted or unsubstituted aryl groups include a benzyl group, α-naphthylmethyl group, β-naphthylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, α -Naphthyldiphenylmethyl group, preferably benzyl group and triphenylmethyl group. Other examples include 9-anthrylmethyl 4-methylbenzyl group, 2,4,6-trimethylbenzyl group and 3,4,5-trimethylbenzyl group, preferably 2,4,6-trimethylbenzyl group. , 3,4,5-trimethylbenzyl groups. Other types include, for example, 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group and 4,4′-dimethoxytriphenylmethyl group, preferably 4-methoxybenzyl group, 4-methoxyphenyldiphenylmethyl group, A 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group can be mentioned. Further examples include 4-chlorobenzyl group and 4-bromobenzyl group. In addition, a 4-cyanobenzyl group is also a preferred example.

本明細書中、シリル基としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ－ｔ－ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基、ジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリルフェニルジイソプロピルシリル基が挙げられる。このなかでさらに好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられ、特に好ましくは、トリメチルシリル基、ｔ－ブチルジメチルシリル基、ジフェニルメチルシリル基が挙げられる。 In the present specification, the silyl group includes a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, an isopropyldimethylsilyl group, a t-butyldimethylsilyl group, a methyldiisopropylsilyl group, a methyldi-t-butylsilyl group, a triisopropylsilyl group, and a diphenylmethylsilyl group. , diphenylbutylsilyl group and diphenylisopropylsilylphenyldiisopropylsilyl group. Among these, trimethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group, triisopropylsilyl group and diphenylmethylsilyl group are more preferred, and trimethylsilyl group, t-butyldimethylsilyl group and diphenylmethylsilyl group are particularly preferred. be done.

本明細書における水酸基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。水酸基の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。なお、保護された水酸基は、かかる保護基で水素原子が置換された水酸基ということができる。 As a hydroxyl-protecting group herein, a chemical method (for example, hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, photolysis, etc.) or a biological method (for example, hydrolysis in the human body, etc.) can be used. In some cases, it means a substituent that is cleaved and eliminated by any of the methods of induction with microorganisms, etc.). Preferred examples of hydroxyl-protecting groups include substituents that are eliminated by hydrogenolysis or hydrolysis. A protected hydroxyl group can be said to be a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with such a protecting group.

[Ｒ²及びＲ⁴について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ²及びＲ⁴は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶を表す。水酸基の保護基は既に説明したとおりである。 [Regarding R ² and R ⁴ ]
In formulas (1) and (2), R ² and R ⁴ may be the same or different, and may be a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group, a phosphate group, a protected phosphate group, or -P ( =O) _n ( ^R5 ) ^R6 . The hydroxyl-protecting group is as already explained.

（保護されたリン酸基）
保護されたリン酸基における保護基は当業者公知であり、上述の参考文献や説明を参考にすることができる。 (protected phosphate group)
Protecting groups for protected phosphate groups are known to those skilled in the art and can be consulted in the above references and explanations.

リン酸基の保護基としては、例えば、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、シリル基で置換されたエチル基、ハロゲンで置換された低級アルキル基、低級アルケニル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、シクロアルキル基、シアノ基で置換された低級アルケニル基、アラルキル基、ニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基、ハロゲンでアリール環が置換されたアラルキル基、低級アルキル基で置換されたアリール基、ハロゲンで置換されたアリール基、又はニトロ基で置換されたアリール基が挙げられる。 Examples of protective groups for phosphate groups include lower alkyl groups, lower alkyl groups substituted with cyano groups, ethyl groups substituted with silyl groups, lower alkyl groups substituted with halogen groups, lower alkenyl groups, and cyano groups. Substituted lower alkenyl group, cycloalkyl group, lower alkenyl group substituted with cyano group, aralkyl group, aralkyl group having aryl ring substituted with nitro group, aralkyl group having aryl ring substituted with halogen, lower alkyl group an aryl group substituted with , an aryl group substituted with a halogen, or an aryl group substituted with a nitro group.

前記の低級アルキル基としては、前述したとおりである。前記のシアノ基で置換された低級アルキル基としては、例えば２－シアノエチル基、２－シアノ－１、１－ジメチルエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２－シアノエチル基が挙げられる。前記のシリル基で置換されたエチル基としては、例えば２－メチルジフェニルシリルエチル基、２－トリメチルシリルエチル基、２－トリフェニルシリルエチル基が挙げられる。 The lower alkyl group is as described above. Examples of the lower alkyl group substituted with a cyano group include a 2-cyanoethyl group and a 2-cyano-1,1-dimethylethyl group, and particularly preferably a 2-cyanoethyl group. Examples of the ethyl group substituted with the silyl group include a 2-methyldiphenylsilylethyl group, a 2-trimethylsilylethyl group and a 2-triphenylsilylethyl group.

前記のハロゲンで置換された低級アルキル基としては、例えば２，２，２－トリクロロエチル基、２，２，２－トリブロモエチル基、２，２，２－トリフルオロエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基が挙げられ、特に好ましくは、２，２，２－トリクロロエチル基が挙げられる。前記の低級アルケニル基としては、例えばエテニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基、１－メチル－２－プロペニル基、１－メチル－１－プロペニル基、２－メチル－１－プロペニル基、１－ブテニル基、２－ブテニル基などが挙げられる。 Examples of the halogen-substituted lower alkyl groups include 2,2,2-trichloroethyl group, 2,2,2-tribromoethyl group, 2,2,2-trifluoroethyl group, 2,2, A 2-trichloroethyl group is included, and a 2,2,2-trichloroethyl group is particularly preferred. Examples of the lower alkenyl groups include ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-methyl-2-propenyl, 1-methyl-1-propenyl, 2-methyl-1-propenyl, 1 -butenyl group, 2-butenyl group and the like.

前記のシアノ基で置換された低級アルケニル基としては、例えば２－シアノエチル基、２－シアノプロピル基、２－シアノブテニル基が挙げられる。前記のアラルキル基としては、例えばベンジル基、α－ナフチルメチル基、β－ナフチルメチル基、インデニルメチル基、フェナンスレニルメチル基、アントラセニルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１－フェネチル基、２－フェネチル基、１－ナフチルエチル基、２－ナフチルエチル基、１－フェニルプロピル基、２－フェニルプロピル基、３－フェニルプロピル基、１－ナフチルプロピル、２－ナフチルプロピル、３－ナフチルプロピル、１－フェニルブチル基、２－フェニルブチル基、３－フェニルブチル基、４－フェニルブチル基が挙げられ、さらに好ましくは、ベンジル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、１－フェネチル基、２－フェネチル基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基が挙げられる。 Examples of the cyano-substituted lower alkenyl groups include 2-cyanoethyl, 2-cyanopropyl and 2-cyanobutenyl groups. Examples of the aralkyl group include benzyl group, α-naphthylmethyl group, β-naphthylmethyl group, indenylmethyl group, phenanthrenylmethyl group, anthracenylmethyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, 1-phenethyl group, 2-phenethyl group, 1-naphthylethyl group, 2-naphthylethyl group, 1-phenylpropyl group, 2-phenylpropyl group, 3-phenylpropyl group, 1-naphthylpropyl, 2-naphthylpropyl, 3-naphthylpropyl, 1-phenylbutyl group, 2-phenylbutyl group, 3-phenylbutyl group, 4-phenylbutyl group, more preferably benzyl group, diphenylmethyl group, triphenylmethyl group, 1- A phenethyl group and a 2-phenethyl group can be mentioned, and a benzyl group is particularly preferred.

前記のニトロ基でアリール環が置換されたアラルキル基としては、２－（４－ニトロフェニル）エチル基、０－ニトロベンジル基、４－ニトロベンジル基、２，４－ジニトロベンジル基、４－クロロ－２－ニトロベンジル基などが挙げられる。 Examples of the aralkyl group in which the aryl ring is substituted with a nitro group include 2-(4-nitrophenyl)ethyl group, 0-nitrobenzyl group, 4-nitrobenzyl group, 2,4-dinitrobenzyl group, 4-chloro -2-nitrobenzyl group and the like.

本明細書においてリン酸の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。リン酸の保護基としては、特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基が好ましい例として挙げられる。 As used herein, protecting groups for phosphate include chemical methods (e.g., hydrolysis, hydrolysis, electrolysis, photolysis, etc.) or biological methods (e.g., hydrolysis in the human body, etc.). In some cases, it means a substituent that is cleaved and eliminated by any of the following methods: induction with microorganisms, etc.). Preferred examples of the protective group for phosphoric acid include a substituent group that is eliminated by hydrogenolysis or hydrolysis.

（－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶）
本発明のヌクレオシド類縁体のＲ²及びＲ⁴は、－Ｐ(＝Ｏ)_ｎ(Ｒ⁵)Ｒ⁶となる場合がある。ｎは０又は１を示し、Ｒ⁵及びＲ⁶は、互いに同一又は異なっていてもよく、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に水素原子となることはない。保護された水酸基及び低級アルコキシ基については、既に説明したとおりである。 (-P(=O) _n ( ^R5 ) ^R6 )
R ² and R ⁴ in the nucleoside analogues of the invention may be -P(=O) _n (R ⁵ )R ⁶ . n represents 0 or 1, R ⁵ and R ⁶ may be the same or different, and are hydrogen atom, hydroxyl group, protected hydroxyl group, mercapto group, protected mercapto group, lower alkoxy group, cyano-lower alkoxy It denotes either a radical, an amino group, or a substituted amino group. However, when n is 1, both R ⁵ and R ⁶ are not hydrogen atoms. The protected hydroxyl group and lower alkoxy group are as already explained.

（保護されたメルカプト基）
保護されたメルカプト基は、当業者において周知である。保護されたメルカプト基としては、例えば上記水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばアルキルチオ基、アリールチオ基、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられる。好ましくは、脂肪族アシル基、芳香族アシル基が挙げられ、特に好ましくは、芳香族アシル基が挙げられる。アルキルチオ基としては、低級アルキルチオ気が好ましく、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｔ－ブチルチオ基が好ましい例として挙げられる。アリールチオ基としては、例えばベンジルチオが挙げられる。また芳香族アシル基としてはベンゾイル基が挙げられる。 (protected mercapto group)
Protected mercapto groups are well known to those skilled in the art. The protected mercapto group includes, for example, alkylthio groups, arylthio groups, aliphatic acyl groups, and aromatic acyl groups, in addition to those mentioned above as hydroxyl-protecting groups. Aliphatic acyl groups and aromatic acyl groups are preferred, and aromatic acyl groups are particularly preferred. The alkylthio group is preferably a lower alkylthio group, such as methylthio, ethylthio and t-butylthio groups. Arylthio groups include, for example, benzylthio. Moreover, a benzoyl group is mentioned as an aromatic acyl group.

前記のシアノ低級アルコキシ基としては、例えば、シアノ基が置換した直鎖状、分枝状、環状、又はそれらの組み合わせである炭素数１～５個のアルコキシ基（なお、シアノ基中の炭素の数を含めずに数えた場合）が好ましい例として挙げられ、具体的には例えば、シアノメトキシ、２－シアノエトキシ、３－シアノプロポキシ、４－シアノブトキシ、３－シアノ―２－メチルプロポキシ、又は１－シアノメチル－１，１－ジメチルメトキシ等が挙げられ、特に好ましくは、２－シアノエトキシ基が挙げられる。 Examples of the cyano lower alkoxy group include, for example, a cyano group-substituted linear, branched, cyclic, or a combination thereof having 1 to 5 carbon atoms (wherein the number of carbon atoms in the cyano group is When counting without including the number) is mentioned as a preferable example, specifically, for example, cyanomethoxy, 2-cyanoethoxy, 3-cyanopropoxy, 4-cyanobutoxy, 3-cyano-2-methylpropoxy, or Examples include 1-cyanomethyl-1,1-dimethylmethoxy, and particularly preferred is 2-cyanoethoxy.

Ｒ⁵及びＲ⁶として、置換されたアミノ基が選択できる。そのアミノ基の置換基は、低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、又は低級アルキル基のいずれかを示す。なお前記Ｒ⁵及びＲ⁶が共に、置換されたアミノ基である場合では、該置換されたアミノ基として互いに異なった置換されたアミノ基であってもよい。前記の低級アルコキシ基、低級アルキルチオ基、シアノ低級アルコキシ基、及び低級アルキル基は、前述に説明された通りである。 Substituted amino groups can be selected as R ⁵ and R ⁶ . A substituent of the amino group is either a lower alkoxy group, a lower alkylthio group, a cyano lower alkoxy group, or a lower alkyl group. When both R ⁵ and R ⁶ are substituted amino groups, the substituted amino groups may be different substituted amino groups. The lower alkoxy group, lower alkylthio group, cyano lower alkoxy group and lower alkyl group are as described above.

－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶としては、より具体的には、ホスホロアミダイド基、H－ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられ、ホスホロアミダイド基が特に好ましい例として挙げられる。 —P(=O) _n (R ⁵ )R ⁶ is more specifically preferably a phosphoramidite group, an H-phosphonate group or a phosphonyl group, and a phosphoramidite group is particularly Preferred examples include:

－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶において、ｎが０であり、Ｒ⁵及びＲ⁶の少なくとも一方が置換されたアミノ基であり、他方は何であってもよい場合には、ホスホロアミダイド基となる。ホスホロアミダイド基としては、Ｒ⁵及びＲ⁶の一方が置換されたアミノ基であり、他方が低級アルコキシ基、又はシアノ低級アルコキシ基であるホスホロアミダイド基が、縮合反応の反応効率が良好であり、特に好ましい。その置換されたアミノ基としては、例えば、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基等が好ましい例として挙げられ、特に好ましくはジイソプロピルアミノ基が例示される。また、Ｒ⁵及びＲ⁶の他方の置換基における低級アルコキシ基としては、メトキシキ基が好ましい例として挙げられる。また、シアノ低級アルコキシ基としては、２－シアノエチル基が好ましい例として挙げられる。ホスホロアミダイド基としては、具体的には、－Ｐ（ＯＣ₂Ｈ₄ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）、又は－Ｐ（ＯＣＨ₃）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）が好ましい例として挙げられる。 —P(═O) _n (R ⁵ )R ⁶ where n is 0, at least one of R ⁵ and R ⁶ is a substituted amino group, and the other can be any; It becomes a loamidide group. As the phosphoramidite group, one of R ⁵ and R ⁶ is a substituted amino group and the other is a lower alkoxy group or a cyano lower alkoxy group. good and particularly preferred. Preferred examples of the substituted amino group include diethylamino group, diisopropylamino group, dimethylamino group and the like, with diisopropylamino group being particularly preferred. A preferred example of the lower alkoxy group in the other substituent of R ⁵ and R ⁶ is a methoxy group. A preferred example of the cyano-lower alkoxy group is a 2-cyanoethyl group. Specific examples of the phosphoramidite group include -P(OC ₂ H ₄ CN)(N(CH(CH ₃ ) ₂ ) or -P(OCH ₃ )(N(CH(CH ₃ ) ₂ ) is mentioned as a preferable example.

－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶において、ｎが１であり、Ｒ⁵及びＲ⁶の少なくとも一方が水素原子であり、他方は水素原子以外であれば何であってもよい場合には、H－ホスホネート基となる。その、水素以外の置換基としては、例えば、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、チオール基等が挙げられ、特に好ましくはヒドロキシル基が例示される。 -P(=O) _n (R ⁵ )R ⁶ when n is 1, at least one of R ⁵ and R ⁶ is a hydrogen atom, and the other is anything other than a hydrogen atom; becomes an H-phosphonate group. Substituents other than hydrogen include, for example, a hydroxyl group, a methyl group, a methoxy group, a thiol group, and the like, and a hydroxyl group is particularly preferred.

また、－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶において、ｎが１であり、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に低級アルコキシ基である場合には、ホスホニル基となる。なお、Ｒ⁵及びＲ⁶における低級アルコキシ基は互いに同一でも相違していてもよい。その低級アルコキシ基としては、例えば、メトキシ基、エトキシ基等が好ましい例として挙げられる。ホスホニル基としては、具体的には、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣＨ₃）₂が挙げられる。 Also, in -P(=O) _n (R ⁵ )R ⁶ , when n is 1 and both R ⁵ and R ⁶ are lower alkoxy groups, it is a phosphonyl group. The lower alkoxy groups in R ⁵ and R ⁶ may be the same or different. Preferred examples of the lower alkoxy group include a methoxy group and an ethoxy group. Specific examples of phosphonyl groups include -P(=O)(OCH ₃ ) ₂ .

本ヌクレオシド誘導体におけるＲ²としては、例えば、－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶であることが特に好ましい。－Ｐ（＝Ｏ）_ｎ（Ｒ⁵）Ｒ⁶としては、ホスホロアミダイド基、Ｈ－ホスホネート基、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。Ｒ²としては、その他にリン酸基、又は保護されたリン酸基であることも好ましい。さらにＲ²としては、水素原子、又は水酸基の保護基であることも好ましい。 R ² in the present nucleoside derivative is particularly preferably, for example, -P(=O) _n (R ⁵ )R ⁶ . Preferable examples of -P(=O) _n (R ⁵ )R ⁶ include a phosphoramidide group, an H-phosphonate group and a phosphonyl group. R ² is also preferably a phosphate group or a protected phosphate group. Furthermore, R ² is preferably a hydrogen atom or a hydroxyl-protecting group.

Ｒ²の具体的な他の例示としては、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、トリメチルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基、－Ｐ（ＯＣ₂Ｈ₄ＣＮ）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）、－Ｐ（ＯＣＨ₃）（Ｎ（ＣＨ（ＣＨ₃）₂）、又はホスホニル基が好ましい例として挙げられる。 Other specific examples of R ² include hydrogen atom, acetyl group, benzoyl group, benzyl group, p-methoxybenzyl group, trimethylsilyl group, tert-butyldiphenylsilyl group, —P(OC ₂ H ₄ CN) ( Preferred examples include N(CH(CH ₃ ) ₂ ), —P(OCH ₃ )(N(CH(CH ₃ ) ₂ ), or phosphonyl groups.

本ヌクレオシド誘導体におけるＲ⁴としては、例えば、水素原子又は水酸基の保護基が好ましい。また例えば、リン酸基、保護されたリン酸基、又は－Ｐ（＝Ｏ）_n（Ｒ⁵）Ｒ⁶であることも好ましい。Ｒ⁴としての具体的な例示を挙げると、水素原子、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ－メトキシベンジル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基、又はトリメチルシリル基が好ましい例として挙げられる。 R ⁴ in the present nucleoside derivative is preferably, for example, a hydrogen atom or a hydroxyl-protecting group. Also preferred are, for example, a phosphate group, a protected phosphate group, or -P(=O) _n (R ⁵ )R ⁶ . Specific examples of R ⁴ include a hydrogen atom, an acetyl group, a benzoyl group, a benzyl group, a p-methoxybenzyl group, a dimethoxytrityl group, a monomethoxytrityl group, a tert-butyldiphenylsilyl group, or a trimethylsilyl group. Preferred examples include:

[Ｒ³について]
式（１）及び式（２）中、Ｒ³は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表すことができる。すなわち、ＮＨＲ⁷、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基は、それぞれが連結基を介して４’位の炭素原子に結合している。 [About ^R3 ]
In formulas (1) and (2), R ³ can represent NHR ⁷ , an azide group, an amidino group, or a guanidino group each having a linking group. That is, NHR ⁷ , an azide group, an amidino group, or a guanidino group are each bonded to the carbon atom at the 4'-position via a linking group.

連結基としては、例えば、炭素数１個以上の２価炭化水素基を表すことができる。すなわち、２価の炭化水素基としては、炭素数１～８個以下のアルキレン基、炭素数２～８個以下のアルケニレン基などが挙げられる。 As the linking group, for example, a divalent hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms can be represented. That is, the divalent hydrocarbon group includes an alkylene group having 1 to 8 or less carbon atoms, an alkenylene group having 2 to 8 or less carbon atoms, and the like.

連結基としてのアルキレン基としては、直鎖状、分枝状であってもよいが、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルキル基が好ましく、例えば炭素数１～６個の低級アルキル基、また例えば、炭素数２～６個の低級アルキル基が好ましく、また例えば、炭素数２～４個又は炭素数２～３個の低級アルキル基が好ましい。直鎖状の炭素数１から４までのアルキル基としては、メチレン基、エチレン基、プロパンー１、３－ジイル基、ｎ－ブタン－１，１－ジイル基、ｎ－ペンチル－１－５，－ジイル基、ｎ－ヘキシル－１，６－ジイル基等が挙げられる。また、例えば、ブタン－１，２－ジイル基等が挙げられる。また例えば、エチレン基、プロパンー１、３－ジイル基、ｎ－ブタン－１，１－ジイル基が特に好ましい例として挙げられる。 The alkylene group as the linking group may be linear or branched, preferably linear. For example, lower alkyl groups are preferred, such as lower alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, and lower alkyl groups having, for example, 2 to 6 carbon atoms are preferred, and for example, lower alkyl groups having 2 to 4 carbon atoms or 2 to 4 carbon atoms are preferred. Three lower alkyl groups are preferred. Examples of linear alkyl groups having 1 to 4 carbon atoms include methylene group, ethylene group, propane-1,3-diyl group, n-butane-1,1-diyl group, n-pentyl-1-5,- diyl group, n-hexyl-1,6-diyl group and the like. Also, for example, a butane-1,2-diyl group and the like are included. Further, particularly preferred examples include an ethylene group, a propane-1,3-diyl group, and an n-butane-1,1-diyl group.

連結基としてのアルケニレン基としては、直鎖状、分枝状であり、好ましくは直鎖状である。例えば、低級アルケニレン基が好ましく、低級アルケニレン基としては、例えば、エテン－１，２－ジイル基、プロペンー１，３－ジイル基、ブテン－１，４－ジイル基等が挙げられる。 The alkenylene group as the linking group may be linear or branched, preferably linear. For example, a lower alkenylene group is preferred, and examples of the lower alkenylene group include ethene-1,2-diyl group, propene-1,3-diyl group, butene-1,4-diyl group and the like.

式（１）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数２以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であることがオリゴヌクレオチド誘導体のヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。また、式（２）で表されるヌクレオシド誘導体においては、例えばエチレン基などの炭素数１以上のアルキレン基などの２価炭化水素基であってもヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の観点から好適である。 In the nucleoside derivative represented by formula (1), a divalent hydrocarbon group such as an alkylene group having 2 or more carbon atoms such as an ethylene group is preferable from the viewpoint of nuclease resistance and cell membrane permeability of the oligonucleotide derivative. is. In the nucleoside derivative represented by formula (2), even a divalent hydrocarbon group such as an alkylene group having 1 or more carbon atoms such as an ethylene group is suitable from the viewpoint of nuclease resistance and cell membrane permeability. .

Ｒ⁷としては、水素原子、アルキル基又はアルケニル基又はアミノ基の保護基が挙げられる。アルキル基は、既に説明したアルキル基のほか、低級アルキル基が好ましく挙げられる。アルケニル基としては、既に説明したアルケニル基のほか、低級アルケニル基が好ましく挙げられる。Ｒ⁷が水素原子などこれらの基であるとき、連結基は、炭素数２以上、また例えば３以上、また例えば４以上で、例えば６以下、また例えば５以下、また例えば４以下のアルキレン基であることが好適である。 ^R7 includes a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, or an amino-protecting group. The alkyl group is preferably a lower alkyl group in addition to the alkyl groups already described. As the alkenyl group, in addition to the alkenyl groups already described, lower alkenyl groups are preferred. When R ⁷ is one of these groups such as a hydrogen atom, the linking group is an alkylene group having 2 or more carbon atoms, such as 3 or more carbon atoms, or such as 4 or more carbon atoms, such as 6 or less, such as 5 or less, or such as 4 or less. It is preferable to have

また、Ｒ⁷が水素原子のとき、Ｒ³は、連結基を有するＮＨ₂（アミノ基）、すなわち、連結基がアルキレン基やアルケニレン基のときには、アミノアルキル基やアミノアルケニル基などとなる。式（１）及び式（２）中、Ｒ³がアミノアルキル基などであることにより、本ヌクレオシド誘導体及び本ヌクレオシド誘導体に由来するモノマーユニットを備えるオリゴヌクレオチド誘導体は、周囲のｐＨ環境において電荷が変化するという特徴を伴う電荷付与性を発揮することができる。例えば、酸性下ではカチオニックであり、生理的条件下の中性ではプラス電荷が減少して電荷ゼロとなりうる。すなわち、かかる電荷調節能によれば、ｐＨ環境を変化させることで、必要時にヌクレオシド誘導体の電荷をダイナミックに変化させたり、所望の電荷を付与したりすることができる。したがって、このような本ヌクレオシド誘導体によれば、オリゴヌクレオチドの電荷を従来とは異なる態様であるいは従来よりも一層高い自由度で調整できるようになる。以上のことから、Ｒ³がかかるアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体は、オリゴヌクレオチド等に対する電荷（正電荷）付与剤又は電荷調節剤として有用である。 When R ⁷ is a hydrogen atom, R ³ is NH ₂ (amino group) having a linking group, that is, when the linking group is an alkylene group or alkenylene group, it is an aminoalkyl group or aminoalkenyl group. In the formulas (1) and (2), since R ³ is an aminoalkyl group or the like, the present nucleoside derivative and the oligonucleotide derivative comprising a monomer unit derived from the present nucleoside derivative change their charge in the surrounding pH environment. It is possible to exhibit the charge imparting property accompanied by the feature of For example, it can be cationic under acidic conditions and lose its positive charge to zero under neutral physiological conditions. That is, according to such charge control ability, by changing the pH environment, it is possible to dynamically change the charge of the nucleoside derivative when necessary, or to impart a desired charge. Therefore, according to the present nucleoside derivative, it becomes possible to adjust the charge of the oligonucleotide in a manner different from conventional or with a higher degree of freedom than conventional. Based on the above, the present nucleoside derivative in which R ³ is such an aminoalkyl group is useful as a charge (positive charge) imparting agent or charge control agent for oligonucleotides and the like.

Ｒ³としては、それぞれ連結基を有する、アジド基、アミジノ基、すなわち、ＣＨ₃（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）－（アミジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）、グアニジノ基、すなわち、ＮＨ₂（ＮＨ）Ｃ（ＮＨ）－（グアニジンのアミノ基から水素原子1個を除いたもの）が挙げられる。なかでも、グアニジノ基が挙げられる。Ｒ³が、これらの基を有するとき、連結基は、炭素数１以上、また例えば２以上などのアルキレン基又はアルケニレン基などとすることができる。なお、Ｒ³が、連結基を有するアミジノ基、グアニジノ基のときには、既述のアミノアルキル基などのときとは異なり、常にカチオニックとなる。かかる本ヌクレオシド誘導体は、Ｒ³がアミノアルキル基などである本ヌクレオシド誘導体と組み合わせて用いるのに有用である。 R ³ is an azide group, an amidino group, ie, CH ₃ (NH)C(NH)—(amidine amino group with one hydrogen atom removed), a guanidino group, ie, NH ₂ (NH)C(NH)— (a guanidine amino group with one hydrogen atom removed) can be mentioned. Among them, a guanidino group is mentioned. When R ³ has these groups, the linking group can be an alkylene or alkenylene group having 1 or more carbon atoms, such as 2 or more carbon atoms. When R ³ is an amidino group or a guanidino group having a linking group, it is always cationic unlike the above-mentioned aminoalkyl group. Such nucleoside derivatives are useful in combination with nucleoside derivatives in which R ³ is an aminoalkyl group or the like.

アミノ基に対する保護基は、当業者に周知されており、前述の参考文献を参照することができる。具体的には、上記にて水酸基の保護基として挙げたものの他、例えばベンジル基、メチルベンジル基、クロロベンジル基、ジクロロベンジル基、フルオロベンジル基、トリフルオロメチルベンジル基、ニトロベンジル基、メトキシフェニル基、メトキシメチル（ＭＯＭ）基、Ｎ－メチルアミノベンジル基、Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノベンジル基、フェナシル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、フタルイミド基、アリルオキシカルボニル基、２，２，２－トリクロロエトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１－メチル－１－（４－ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２－（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基などが挙げられる。さらに好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、トリフルオロアセチル（ＴＦＡ）基、ピバロイル基、ベンゾイル基、ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、１－メチル－１－（４－ビフェニル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）基、９－フルオレニルメトキシカルボニル基、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）基、又は２－（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）基が挙げられ、特に好ましくは、ベンジル基、メトキシフェニル基、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジルオキシメチル基が挙げられる。 Protecting groups for amino groups are well known to those skilled in the art and reference may be made to the aforementioned references. Specifically, in addition to those listed above as hydroxyl-protecting groups, for example, benzyl group, methylbenzyl group, chlorobenzyl group, dichlorobenzyl group, fluorobenzyl group, trifluoromethylbenzyl group, nitrobenzyl group, methoxyphenyl group, methoxymethyl (MOM) group, N-methylaminobenzyl group, N,N-dimethylaminobenzyl group, phenacyl group, acetyl group, trifluoroacetyl group, pivaloyl group, benzoyl group, phthalimido group, allyloxycarbonyl group, 2,2,2-trichloroethoxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group, t-butoxycarbonyl (Boc) group, 1-methyl-1-(4-biphenyl)ethoxycarbonyl (Bpoc) group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl benzyloxymethyl (BOM) group, or 2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM) group. More preferably, benzyl group, methoxyphenyl group, acetyl group, trifluoroacetyl (TFA) group, pivaloyl group, benzoyl group, t-butoxycarbonyl (Boc) group, 1-methyl-1-(4-biphenyl)ethoxycarbonyl (Bpoc) group, 9-fluorenylmethoxycarbonyl group, benzyloxymethyl (BOM) group, or 2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl (SEM) group, particularly preferably benzyl group, methoxyphenyl group, acetyl group, benzoyl group, and benzyloxymethyl group.

本発明においてアミノ基の保護基としては、化学的方法（例えば、加水素分解、加水分解、電気分解、又は光分解など）、又は生物学的方法（例えば、人体内で加水分解等。想像するに微生物等での誘導など）、のいずれかの方法により開裂し、脱離する置換基を意味する場合もある。特に、加水素分解、又は加水分解により脱離する置換基がアミノ基の保護基として好ましい。 In the present invention, amino-protecting groups include chemical methods (e.g., hydrogenolysis, hydrolysis, electrolysis, photolysis, etc.) or biological methods (e.g., hydrolysis in the human body, etc.). In some cases, it means a substituent that is cleaved and eliminated by any of the methods of induction with microorganisms, etc.). In particular, a substituent that is eliminated by hydrogenolysis or hydrolysis is preferable as the amino-protecting group.

[Ｂ：塩基について]
本ヌクレオシド誘導体におけるＢ：塩基としては、公知の天然塩基ほか、人工塩基が挙げられる。例えば、Ｂとしては、プリン－９－イル基、２－オキソ－ピリミジン－１－イル基、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基が選択できる。 [B: About bases]
Examples of B: base in the present nucleoside derivative include known natural bases and artificial bases. For example, B can be selected from a purin-9-yl group, a 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, a substituted purin-9-yl group, or a substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group.

すなわち、Ｂとしては、プリン－９－イル基、又は２－オキソ－ピリミジン－１－イル基が挙げられるほか、２，６－ジクロロプリン－９－イル、又は２－オキソ－ピリミジン－１－イルが挙げられる。さらに、２－オキソ－４－メトキシ－ピリミジン－１－イル、４－（１H－１，２，４－トリアゾール‐１－イル）－ピリミジン－１－イル、又は２，６－ジメトキシプリン－９－イルが挙げられる。 That is, B includes a purin-9-yl group or a 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, as well as a 2,6-dichloropurin-9-yl or 2-oxo-pyrimidin-1-yl group. is mentioned. Furthermore, 2-oxo-4-methoxy-pyrimidin-1-yl, 4-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-pyrimidin-1-yl, or 2,6-dimethoxypurine-9- ile is mentioned.

さらに、アミノ基が保護された２－オキソ－４－アミノ－ピリミジン－１－イル、アミノ基が保護された２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル、アミノ基が保護された２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル、アミノ基及び／又は水酸基が保護された２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル、アミノ基が保護された２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル、アミノ基が保護された６－アミノプリン－９－イル、又はアミノ基が保護された４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－１－イル基が挙げられる。なお、水酸基及びアミノ基の各保護基については、既に説明したとおりである。 Furthermore, 2-oxo-4-amino-pyrimidin-1-yl with protected amino group, 2-amino-6-bromopurin-9-yl with protected amino group, 2-amino with protected amino group -6-hydroxypurin-9-yl, amino- and/or hydroxyl-protected 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl, amino-protected 2-amino-6-chloropurine-9- 6-aminopurin-9-yl with protected amino group, or 4-amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin-1-yl with protected amino group. In addition, each protective group for a hydroxyl group and an amino group is as already explained.

さらに、６－アミノプリン－９－イル（アデニン）、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル（グアニジン）、２－オキソ－４－アミノ－ピリミジン－１－イル（シトシン）、２－オキソ－４－ヒドロキシ－ピリミジン－1－イル（ウラシル）、又は２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル（チミン）が挙げられる。 In addition, 6-aminopurin-9-yl (adenine), 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl (guanidine), 2-oxo-4-amino-pyrimidin-1-yl (cytosine), 2-oxo -4-hydroxy-pyrimidin-1-yl (uracil) or 2-oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl (thymine).

さらにまた、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－１－イル（メチルシトシン）、２，６－ジアミノプリン－９－イル、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル、６－メルカプトプリン－９－イル、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－ピリミジン－１－イル、又は２－オキソ－４－メルカプト－ピリミジン－１－イルが挙げられる。 Furthermore, 4-amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin-1-yl (methylcytosine), 2,6-diaminopurin-9-yl, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl, 6 -mercaptopurin-9-yl, 4-amino-2-oxo-5-chloro-pyrimidin-1-yl, or 2-oxo-4-mercapto-pyrimidin-1-yl.

また、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル、又は２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イルが挙げられる。 6-amino-2-methoxypurin-9-yl, 6-amino-2-chloropurin-9-yl, 2-amino-6-chloropurin-9-yl, or 2-amino-6-bromopurin-9-yl -9-yl.

置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基それぞれにおける置換基は、水酸基、保護された水酸基、低級アルコキシ基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルキルチオ基、アミノ基、保護されたアミノ基、低級アルキル基で置換されたアミノ基、低級アルキル基、低級アルコキシメチル基、又はハロゲン原子のいずれか一つ、又はそれらの複数の組み合わせのいずれかである。これらの置換基は、既に説明したとおりである。 Substituents in the substituted purin-9-yl group or substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, respectively, include a hydroxyl group, a protected hydroxyl group, a lower alkoxy group, a mercapto group, a protected mercapto group, a lower alkylthio group, It is any one of an amino group, a protected amino group, an amino group substituted with a lower alkyl group, a lower alkyl group, a lower alkoxymethyl group, or a halogen atom, or a combination of a plurality thereof. These substituents are as already explained.

本ヌクレオシド誘導体におけるＢとしては、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基における置換基が既述の各置換基が好ましいが、これに加えてさらに、トリアゾール基、低級アルコキシメチル基が加わることも好ましい。 B in the present nucleoside derivative is preferably a substituted purin-9-yl group or a substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, each of the substituents described above, and in addition thereto, a triazole group , the addition of a lower alkoxymethyl group is also preferred.

置換プリン－９－イル基の好ましい例としては、例えば、６－アミノプリン－９－イル、２，６－ジアミノプリン－９－イル、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル、６－アミノ－２－メトキシプリン－９－イル、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル、２，６－ジメトキシプリン－９－イル、２，６－ジクロロプリン－９－イル、又は６－メルカプトプリン－９－イル等が挙げられる。上述の置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基及び／又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。 Preferred examples of substituted purin-9-yl groups include 6-aminopurin-9-yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, 2-amino-6-chloropurin-9-yl, 2- amino-6-bromopurin-9-yl, 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl, 6-amino-2-methoxypurin-9-yl, 6-amino-2-chloropurin-9-yl, 6-amino-2-fluoropurin-9-yl, 2,6-dimethoxypurin-9-yl, 2,6-dichloropurin-9-yl, 6-mercaptopurin-9-yl and the like. If the above-mentioned substituents include an amino group or a hydroxyl group, preferred examples thereof include those substituents in which the amino group and/or the hydroxyl group are protected.

置換２－オキソ－ピリミジン－１－イルとしては、例えば２－オキソ－４－アミノ－ピリミジン－１－イル、１Ｈ－（１，２，４－トリアゾール－１－イル）－ピリミジン－１－イル、４－１Ｈ－１，４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－ピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－メトキシ－ピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－メルカプト－ピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－ヒドロキシ－ピリミジン－1－イル、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチルピリミジン－１－イル、又は４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－ピリミジン－１－イル等が挙げられる。
また、２－オキソ－４－メトキシ－ピリミジン－１－イル、又は４－（１Ｈ－１，２，４－トリアゾール‐１－イル）－ピリミジン－１－イルが好ましい例として挙げられる。 Substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yls include, for example, 2-oxo-4-amino-pyrimidin-1-yl, 1H-(1,2,4-triazol-1-yl)-pyrimidin-1-yl, 4-1H-1,4-amino-2-oxo-5-chloro-pyrimidin-1-yl, 2-oxo-4-methoxy-pyrimidin-1-yl, 2-oxo-4-mercapto-pyrimidine-1- yl, 2-oxo-4-hydroxy-pyrimidin-1-yl, 2-oxo-4-hydroxy-5-methylpyrimidin-1-yl, or 4-amino-5-methyl-2-oxo-pyrimidin-1-yl and the like.
Preferable examples include 2-oxo-4-methoxy-pyrimidin-1-yl and 4-(1H-1,2,4-triazol-1-yl)-pyrimidin-1-yl.

こうしたＢのうち、置換基中にアミノ基や水酸基があれば、それらのアミノ基又は水酸基が保護化された置換基が好ましい例として挙げられる。 Among such B, if the substituent contains an amino group or a hydroxyl group, a preferable example thereof is a substituent in which the amino group or the hydroxyl group is protected.

本ヌクレオシド誘導体は、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、一般的には酸付加塩が例示され、分子内対イオンの形態をとっていてもよい。又は置換基の種類によっては塩基付加塩が形成される場合もある。塩としては、薬学的に許容される塩が好ましい。薬学的に許容しうる塩を形成する酸及び塩基の種類は当業者には周知であり、例えばＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１－１９（１９７７）に記載しているものなどを参考にすることができる。例えば、酸付加塩としては、鉱酸塩、有機酸塩が挙げられる。また、一個以上の置換基が酸性部分を含有する場合、塩基付加塩も好ましい例として挙げられる。 The nucleoside derivative may be a salt. The salt form is not particularly limited, but acid addition salts are generally exemplified, and may take the form of an intramolecular counterion. Alternatively, a base addition salt may be formed depending on the type of substituent. Preferred salts are pharmaceutically acceptable salts. The types of acids and bases that form pharmaceutically acceptable salts are well known to those of skill in the art and are described, for example, in J. Am. Pharm. Sci. , 1-19 (1977) can be referred to. For example, acid addition salts include mineral acid salts and organic acid salts. Base addition salts are also preferred examples when one or more substituents contain an acidic moiety.

鉱酸塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素酸塩、リン酸塩、リン酸水素酸塩などが挙げられる。通常は、塩酸塩、リン酸塩、が好ましい例として挙げられる。有機酸塩としては、例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、又はｐ－トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。通常は、酢酸塩等が好ましい例として挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ金属の塩、アルカリ土類金属の塩、有機アミン塩、アミノ酸の付加塩が挙げられる。 Mineral acid salts include, for example, hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, nitrate, sulfate, hydrosulfate, phosphate, hydrophosphate and the like. Hydrochlorides and phosphates are usually preferred examples. Examples of organic acid salts include acetate, trifluoroacetate, gluconate, lactate, salicylate, citrate, tartrate, ascorbate, succinate, maleate, fumarate, and formic acid. salts, benzoates, methanesulfonates, ethanesulfonates, p-toluenesulfonates, and the like. Acetate and the like are usually preferred examples. Base addition salts include alkali metal salts, alkaline earth metal salts, organic amine salts, and amino acid addition salts.

前記のアルカリ金属の塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などが挙げられる。また、アルカリ土類金属の塩としては、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩などが挙げられる。有機アミン塩としては、例えば、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、プロカイン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等が例示される。また、アミノ酸の付加塩としては、例えば、アルギニン塩、リジン塩、オルニチン塩、セリン塩、グリシン塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩などが挙げられる。 Examples of the alkali metal salts include sodium salts and potassium salts. Examples of alkaline earth metal salts include magnesium salts and calcium salts. Examples of organic amine salts include triethylamine salts, pyridine salts, procaine salts, picoline salts, dicyclohexylamine salts, diethanolamine salts, triethanolamine salts, tris(hydroxymethyl)aminomethane salts and the like. Addition salts of amino acids include, for example, arginine salts, lysine salts, ornithine salts, serine salts, glycine salts, aspartates, glutamates, and the like.

本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあり、これらの物質も本明細書の開示の範囲に含まれる。本ヌクレオシド誘導体又はその塩は、後述の合成例や公知の方法に準じて、当業者は容易に製造することができる。 The present nucleoside derivatives or salts thereof may exist as hydrates or solvates, and these substances are also included within the scope of the present disclosure. The present nucleoside derivative or salt thereof can be easily produced by those skilled in the art according to the synthesis examples described later or known methods.

本ヌクレオシド誘導体は、オリゴリボヌクレオチドの少なくとも一部としてオリゴリボヌクレオチドに導入することで、一本鎖としてのオリゴリボヌクレオチド、二本鎖オリゴリボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させうることができるほか、哺乳動物細胞等の細胞膜透過性を向上させることができる。すなわち、本ヌクレオシド誘導体は、それ自体は、ヌクレアーゼ耐性向上剤及び／又は細胞膜透過性付与剤として有用である。また、本ヌクレオシド誘導体は、４’に塩基性の置換基を備えることができる。これにより、オリゴリボヌクレオチド等におけるリン酸基などに由来する負電荷を調整することができるという電荷調節剤又は正電荷付与剤として機能することができる。 By introducing the present nucleoside derivative into an oligoribonucleotide as at least a part of the oligoribonucleotide, the nuclease resistance of the single-stranded oligoribonucleotide and the double-stranded oligoribonucleotide can be improved. It can improve the cell membrane permeability of animal cells and the like. That is, the present nucleoside derivative itself is useful as a nuclease resistance improver and/or a cell membrane permeabilizer. In addition, the present nucleoside derivative can have a basic substituent at 4'. As a result, it can function as a charge control agent or a positive charge imparting agent that can adjust the negative charge derived from the phosphate group or the like in the oligoribonucleotide or the like.

なお、本明細書に開示されるオリゴリボヌクレオチドは、式（３）及び式（４）で表される部分構造を少なくとも１個含有することができる。式（３）及び式（４）で表される部分構造は、それぞれ、式（１）及び式（２）で表されるヌクレオシド誘導体又はその塩に基づいて取得されうる。 The oligoribonucleotide disclosed herein can contain at least one partial structure represented by formula (3) and formula (4). The partial structures represented by formulas (3) and (4) can be obtained based on the nucleoside derivatives represented by formulas (1) and (2) or salts thereof, respectively.

式（３）及び式（４）で表される部分構造におけるＲ¹、Ｘ，Ｒ³及びＢについては、式（１）及び式（２）におけるのとそれぞれ同義である。 R ¹ , X, R ³ and B in the partial structures represented by formulas (3) and (4) have the same meanings as in formulas (1) and (2).

式（３）及び式（４）で表される部分構造は、オリゴリボヌクレオチド中において２個以上含んでいてもよい。その場合、これらの部分構造は、互いに同一であっても異なっていてもよい。また、オリゴリボヌクレオチドに含まれる部分構造の全体は、式（３）で表される部分構造のみから構成されていてもよいし、式（４）で表される部分構造のみから構成されていてもよい。また、式（３）で表される部分構造１又は２以上有し、かつ式（４）で表される部分構造を１又は２以上有していてもよい。 Two or more partial structures represented by formulas (3) and (4) may be included in the oligoribonucleotide. In that case, these partial structures may be the same or different. Further, the entire partial structure contained in the oligoribonucleotide may be composed only of the partial structure represented by formula (3), or composed only of the partial structure represented by formula (4). good too. Further, it may have 1 or 2 or more partial structures represented by formula (3) and 1 or 2 or more partial structures represented by formula (4).

また、式（３）及び式（４）で表される部分構造の配置としては、互いに隣り合ってもよいし、離れて存在してもよい。例えば、オリゴリボヌクレオチドは、前記部分構造を少なくとも３個備えることができる。この場合、各部分構造を、オリゴリボヌクレオチドの５’末端側、中央部及び３’末端側に略均等に備えることができる。部分構造をオリゴリボヌクレオチドのこれら各部に略均等に備える、とは、これらの各部において、同数個を必ずしも部分構造を備えることを限定するものではなく、これら各部に少なくとも１個をそれぞれ備えることを少なくとも充足すれば足りる。例えば、各部に１～３個程度の部分構造を備える場合には、略均等ということができる。部分構造は、オリゴリボヌクレオチドにおいて、少なくとも６個備えることができる。 In addition, the partial structures represented by formulas (3) and (4) may be arranged adjacent to each other or may be separated from each other. For example, an oligoribonucleotide can have at least three of said substructures. In this case, each partial structure can be provided substantially evenly on the 5'-terminal side, central part and 3'-terminal side of the oligoribonucleotide. "Equipped with partial structures substantially evenly in each of these parts of the oligoribonucleotide" does not necessarily mean that the same number of partial structures are provided in each of these parts, but it means that each of these parts is provided with at least one. At least it should be enough. For example, when each part has 1 to 3 partial structures, it can be said that the parts are substantially equal. At least six partial structures can be provided in an oligoribonucleotide.

式（３）で表される部分構造は、糖鎖部分がリボース又はデオキシリボースに由来していることから、オリゴリボヌクレオチドは、オリゴリボヌクレオチドであってもよいし、オリゴデオキシリボヌクレオチドであってもよい。また、オリゴリボヌクレオチドは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとのキメラであってもよい。 Since the sugar chain portion of the partial structure represented by formula (3) is derived from ribose or deoxyribose, the oligoribonucleotide may be an oligoribonucleotide or an oligodeoxyribonucleotide. good. Oligoribonucleotides may also be chimeras of ribonucleotides and deoxyribonucleotides.

オリゴリボヌクレオチドは、それ自体一本鎖であるが、オリゴリボヌクレオチド、及びオリゴデオキシリボ／リボヌクレオチド（キメラ鎖）とのハイブリッド、すなわち、二本鎖の形態を採ることもできる。 Oligoribonucleotides are themselves single-stranded, but can also take the form of hybrids with oligoribonucleotides and oligodeoxyribo/ribonucleotides (chimeric strands), ie double-stranded.

オリゴリボヌクレオチドは、式（３）及び式（４）で表される部分構造以外の部分構造としては、その他の天然のヌクレオチド、又は公知のヌクレオシド誘導体及び／又はヌクレオチド誘導体などに該当する部分構造を備えることができる。本明細書において規定する部分構造及びその他の部分構造は、互いに、例えば、リン酸ジエステル結合、リン酸モノエステル結合、チオリン酸エステル結合等によって結合されうる。 The oligoribonucleotide has partial structures corresponding to other natural nucleotides, known nucleoside derivatives and/or nucleotide derivatives, etc. as partial structures other than the partial structures represented by formulas (3) and (4). be prepared. The partial structures defined herein and other partial structures can be linked to each other by, for example, a phosphodiester bond, a phosphate monoester bond, a thiophosphate bond, and the like.

オリゴリボヌクレオチドは、部分構造及びその他のヌクレオシド誘導体の個数を単位として、少なくとも２個以上、さらには８個以上であることが好ましく、特に好ましくは１５個以上であることが挙げられる。上限としては特に限定されないが、例えば１００個以下であり、また例えば、８０個以下であり、また例えば、６０個以下であり、また例えば、５０個以下であり、また例えば、４０個以下であり、また例えば、３０個以下であり、また例えば、２０個以下であってもよい。 The number of oligoribonucleotides is at least 2 or more, preferably 8 or more, and particularly preferably 15 or more, in terms of the number of partial structures and other nucleoside derivatives. Although the upper limit is not particularly limited, it is, for example, 100 or less, or, for example, 80 or less, or, for example, 60 or less, or, for example, 50 or less, or, for example, 40 or less. , and may be, for example, 30 or less, or may be, for example, 20 or less.

オリゴリボヌクレオチドは、式（３）及び式（４）で表される部分構造ほか、その他の部分構造において、一個以上の不斉中心を有する場合があり、立体異性体が存在する場合も同様であって、立体異性体の任意の混合物、又はラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。また互変異性体として存在しうる場合もある。 Oligoribonucleotides may have one or more asymmetric centers in the partial structures represented by formulas (3) and (4) as well as in other partial structures, and the same applies when stereoisomers are present. Any mixtures of stereoisomers, racemates, etc., are included within the scope of the present invention. They may also exist as tautomers.

オリゴリボヌクレオチドは、塩であってもよい。塩の形態は特に限定されないが、薬学的に許容される塩が好ましい例として挙げられる。塩については、既述の本ヌクレオシド誘導体における塩の態様を適用することができる。オリゴリボヌクレオチド又はその塩としては、水和物や溶媒和物であってもよく、これらも本発明の範囲に含まれる。 Oligoribonucleotides may be salts. The form of the salt is not particularly limited, but pharmaceutically acceptable salts are preferred examples. As for the salt, the aspect of the salt in the present nucleoside derivative described above can be applied. Oligoribonucleotides or salts thereof may be hydrates or solvates, and these are also included in the scope of the present invention.

（本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドの製造）
本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドは、当業者であれば、後段の具体的な合成例のほか、本願出願時において公知のヌクレオシド及びオリゴヌクレオチドについての合成技術に基づいて、容易に合成されうる。 (Production of present nucleoside derivatives and oligoribonucleotides)
The present nucleoside derivatives and oligoribonucleotides can be easily synthesized by those skilled in the art based on the synthesis techniques for nucleosides and oligonucleotides known at the time of filing of the present application, in addition to the specific synthesis examples described later.

本ヌクレオシド誘導体及びオリゴリボヌクレオチドは、例えば下記の方法により製造できるが、本発明のヌクレオシド類縁体又はオリゴリボヌクレオチドの製造方法は下記の方法に限定されるものではない。 The nucleoside derivatives and oligoribonucleotides of the present invention can be produced, for example, by the methods described below, but the method of producing the nucleoside analogues or oligoribonucleotides of the present invention is not limited to the methods described below.

それぞれの反応において、反応時間は特に限定されないが、後述の分析手段により反応の進行状態を容易に追跡できるため、目的物の収量が最大となる時点で終了すればよい。また、それぞれの反応は必要により、例えば、窒素気流下又はアルゴン気流下などの不活性ガス雰囲気下で行うことができる。それぞれの反応において、保護基による保護及びその後の脱保護が必要な場合は、後述の方法を利用することにより適宜反応を行うことができる。 In each reaction, the reaction time is not particularly limited, but since the progress of the reaction can be easily tracked by the analytical means described later, the reaction may be terminated when the yield of the desired product is maximized. Moreover, each reaction can be carried out under an inert gas atmosphere such as a nitrogen stream or an argon stream, if necessary. In each reaction, when protection with a protecting group and subsequent deprotection are required, the reaction can be appropriately carried out by utilizing the methods described below.

なお、本明細書においては、Ｂｎはベンジル基を示し、Ａｃはアセチル基を示し、Ｂｚはベンゾイル基を示し、ＰＭＢはｐ－メトキシベンジル基を示し、Ｔｒはトリフェニルメチル基を示し、ＴＨＡは、トリフルオロアセチル基を示し、ＴｓＯは、トシルオキシ基を示し、ＭＭＴｒは４－メトキシトリフェニルメチル基を示し、ＤＭＴｒは４，４’－ジメトキシトリフェニルメチル基を示し、ＴＭＳはトリメチルシリル基を示し、ＴＢＤＭＳはｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基を示し、ＴＢＤＰＳはｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基を示し、ＭＯＭはメトキシメチル基を示し、ＢＯＭはベンジルオキシメチル基を示し、ＳＥＭは２－（トリメチルシリル）エトキシメチル基を示す。 In the present specification, Bn represents a benzyl group, Ac represents an acetyl group, Bz represents a benzoyl group, PMB represents a p-methoxybenzyl group, Tr represents a triphenylmethyl group, and THA , represents a trifluoroacetyl group, TsO represents a tosyloxy group, MMTr represents a 4-methoxytriphenylmethyl group, DMTr represents a 4,4′-dimethoxytriphenylmethyl group, TMS represents a trimethylsilyl group, TBDMS represents a tert-butyldimethylsilyl group, TBDPS represents a tert-butyldiphenylsilyl group, MOM represents a methoxymethyl group, BOM represents a benzyloxymethyl group, and SEM represents a 2-(trimethylsilyl)ethoxymethyl group. show.

例えば、本ヌクレオシド誘導体の一例は、以下のスキームに従い合成することができる。なお、以下のスキームは、グルコースを出発物質として、チミンリボヌクレオシド誘導体を合成し、オリゴリボヌクレオチドの合成のためのホスホロアミダイト剤を合成するまでのスキームの一例である。 For example, one example of this nucleoside derivative can be synthesized according to the following scheme. The following scheme is an example of a scheme from synthesizing a thymine ribonucleoside derivative using glucose as a starting material to synthesizing a phosphoramidite agent for synthesizing an oligoribonucleotide.

常法に従い、グルコース１から、上記化合物２を取得した。化合物２から、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672, The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962, HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128-151等のほか、Bioorganic & Medical Chemistry 11(2003)211-2226, Bioorganic & Chemistry letters(1999)2667-2672の記載に基づいて化合物３ないし化合物２０を得ることができる。 Compound 2 was obtained from glucose 1 according to a conventional method. From compound 2, Bioorganic & Medical Chemistry 11 (2003) 211-2226, Bioorganic & Chemistry letters (1999) 2667-2672, The Journal of Organic Chemistry 2013, 78, 9956-9962, HELVATICA CHIMICA ACTA Vol. 83 (2000) 128 -151 and the like, compounds 3 to 20 can be obtained based on the descriptions in Bioorganic & Medical Chemistry 11 (2003) 211-2226, Bioorganic & Chemistry letters (1999) 2667-2672.

式（３）及び（４）で表される部分構造を備えるオリゴリボヌクレオチドは、式（１）又は（２）で表される各種の本ヌクレオシド誘導体を、アミダイト剤等として利用することで容易に製造できる。すなわち、こうしたヌクレオシド誘導体を用いることで、公知のＤＮＡ合成機を用いて合成することができ、得られるオリゴヌクレオチド誘導体は、カラムを用いて精製し、生成物の純度を逆相ＨＰＬＣやＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳで分析することにより、精製されたオリゴリボヌクレオチドを得ることができる。なお、オリゴリボヌクレオチドを酸付加塩とする方法は、当業者に周知である。 Oligoribonucleotides having partial structures represented by formulas (3) and (4) can be easily produced by using various present nucleoside derivatives represented by formula (1) or (2) as amidite agents, etc. can be manufactured. That is, by using such a nucleoside derivative, it can be synthesized using a known DNA synthesizer, the resulting oligonucleotide derivative is purified using a column, and the purity of the product is determined by reverse-phase HPLC or MALDI-TOF. Purified oligoribonucleotides can be obtained by -MS analysis. A method of converting an oligoribonucleotide into an acid addition salt is well known to those skilled in the art.

オリゴリボヌクレオチドによれば、リボース４’位に連結基を介して所定のＮ含有基を備えることで、ＲＮＡ干渉能等の生体におけるＲＮＡ機能を維持しつつ、ＲＮＡの実質電荷量を調節でき、脂溶性（ファンデルワールス分子間力）を増強し、ｄｓＲＮＡ溶融温度をさげることを実現できる。これにより、リボヌクレアーゼ耐性を向上させることができるほか、細胞膜透過性を向上させることができる。さらに、リン酸基等によるマイナス電荷を中和し、全体としての電荷を調節することもできる。 According to the oligoribonucleotide, by providing a predetermined N-containing group at the 4'-position of ribose via a linking group, it is possible to adjust the substantial charge amount of RNA while maintaining RNA functions in vivo such as RNA interference ability, Enhanced lipid solubility (van der Waals intermolecular forces) and lower dsRNA melting temperature can be achieved. Thereby, ribonuclease resistance can be improved, and also cell membrane permeability can be improved. Furthermore, it is also possible to neutralize negative charges due to phosphate groups or the like and adjust the overall charge.

オリゴリボヌクレオチドにおいては、本部分構造を少なくとも２個備えることができる。本部分構造を複数個備えることで、細胞膜透過性、リボヌクレアーゼ耐性等を確実に向上させ、また調整することができる。また、オリゴリボヌクレオチドは、本部分構造を少なくとも３個備えることもできる。 An oligoribonucleotide can have at least two of these partial structures. By providing a plurality of this partial structure, cell membrane permeability, ribonuclease resistance, etc. can be reliably improved and adjusted. An oligoribonucleotide can also have at least three of this partial structure.

オリゴリボヌクレオチドにおいては、１個又は２個以上の本部分構造の備える部位は特に限定するものではないが、例えば、５’末端側及び３’末端側のいずれか及び双方に備えることができる。５’末端側及び３’末端側とは、それぞれ、本オリゴヌクレオチドのポリマー鎖の各末端から適数個の範囲の領域をいい、それぞれ、ポリマー鎖の全構成単位の、例えば３０％を超えない構成単位からなる領域をいう。上記末端からの範囲の割合は、ポリマー鎖の全長によっても異なるが、例えば２５％以下、また例えば２０％以下、また例えば１０％以下、また例えば５％以下などとすることができる。より具体的には、５’末端側及び３’末端側とは、例えば各末端から１個～３０個、また例えば例えば１個～２５個、また例えば１個～２０個、また例えば１個～１５個、また例えば１個～１０個、また例えば１個～８個、また例えば１個～６個、また例えば１個～５個、また例えば１個～４個、また例えば１～３個、また例えば例えば１～２個のヌクレオシド誘導体由来の構成単位の領域とすることができる。オリゴリボヌクレオチドは、こうした末端領域のいずれかに１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。好ましくは、２個以上備えることができる。また、オリゴリボヌクレオチドは、５’末端及び３’末端（すなわち、各末端から１個目の構成単位）のいずれか又は双方に本部分構造を備えることもできる。 In oligoribonucleotides, one or two or more sites provided with this partial structure are not particularly limited, but can be provided, for example, on either or both of the 5'-terminal side and the 3'-terminal side. The 5' terminal side and 3' terminal side respectively refer to a range of a suitable number of regions from each end of the polymer chain of the present oligonucleotide, each of which does not exceed, for example, 30% of the total structural units of the polymer chain. A region consisting of structural units. Although the proportion of the range from the end differs depending on the total length of the polymer chain, it can be, for example, 25% or less, 20% or less, 10% or less, or 5% or less. More specifically, the 5′-terminal side and 3′-terminal side are, for example, 1 to 30, for example, 1 to 25, for example, 1 to 20, or for example, 1 to 30 from each end. 15, also such as from 1 to 10, also such as from 1 to 8, also such as from 1 to 6, also such as from 1 to 5, also such as from 1 to 4, also such as from 1 to 3, Alternatively, for example, it may be a region of constitutional units derived from 1 to 2 nucleoside derivatives. An oligoribonucleotide can have one or more of this substructure on any of these terminal regions. Preferably, two or more can be provided. An oligoribonucleotide can also have this partial structure at either or both of the 5' end and the 3' end (that is, the first structural unit from each end).

オリゴリボヌクレオチドにおいては、１個又は２個以上の本部分構造を、５’末端側及び３’末端側以外の部分である中央部に備えることもできる。オリゴリボヌクレオチドが、中央部に本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性の向上や調整が一層容易になる。また、オリゴヌクレオチド全体の電荷の調整もより容易になる。 In an oligoribonucleotide, one or two or more of this partial structure can also be provided in the central portion, which is a portion other than the 5'-end side and the 3'-end side. Having this partial structure in the central part of the oligoribonucleotide makes it easier to improve and adjust ribonuclease resistance and cell membrane permeability. It also makes it easier to control the overall charge of the oligonucleotide.

オリゴリボヌクレオチドは、５’末端側及び３’末端側のいずれか又は双方と中央部に本部分構造を備えることもできる。好ましくは５’末端側、３’末端側及び中央部の各部に１個又は２個以上の本部分構造を備えることができる。このように、全体として、おおよそ均等にあるいは分散して本部分構造を備えることで、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性を向上させることができる。オリゴリボヌクレオチドの中央部には、本部分構造を２個以上備えることが、特性向上の観点から有用である。 An oligoribonucleotide can also have this partial structure at either or both of the 5'-end side and the 3'-end side and the central portion. Preferably, each of the 5' terminal side, the 3' terminal side and the central part can be provided with one or more of this partial structure. In this way, by providing this partial structure approximately evenly or dispersedly as a whole, ribonuclease resistance, cell membrane permeability, and charge controllability can be improved. Having two or more of this partial structure in the central part of the oligoribonucleotide is useful from the viewpoint of improving the properties.

オリゴリボヌクレオチドにおける本部分構造としては、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体由来する部分構造、式（４）で表されるデオキシリボヌクレオチド誘導体に由来する部分構造を用いることができる。なお、式（３）で表されるリボヌクレオシド誘導体及び式（４）の部分構造は、Ｂの塩基として、ＲＮＡにおける塩基であるウラシル（Ｕ）他を備えることで、リボヌクレオシド誘導体の代替物として用いることができる。 As this partial structure in the oligoribonucleotide, a partial structure derived from the ribonucleoside derivative represented by formula (3) and a partial structure derived from the deoxyribonucleotide derivative represented by formula (4) can be used. In addition, the ribonucleoside derivative represented by formula (3) and the partial structure of formula (4) are provided with uracil (U), which is a base in RNA, etc. as a base of B, so that they can be used as substitutes for ribonucleoside derivatives can be used.

また、本部分構造は、式（３）及び（４）におけるＲ³が、炭素数１又は２以上のアルキレン基を連結基として、ＮＨＲ⁷を有することが、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性さらには電荷調節性の観点から好適である。この場合、Ｒ⁷は、水素原子であってもよいし、炭素数１～６程度のアルキル基を有するアシル基であってもよい。当該アルキレン基は、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基、ペンチレン基、ヘキシレン基などとすることができる。また、例えばエチレン基、プロピレン基、ブチレン基などとすることができる。また例えば例えばエチレン基、プロピレン基などとすることができる。エチレン基、プロピレン基を連結基とすることで、メチレン基を用いた場合に比較して高いリボヌクレアーゼ耐性と細胞膜透過性さらには電荷調節性とを得ることができる。 In addition, in this partial structure, R ³ in formulas (3) and (4) has an alkylene group having 1 or 2 or more carbon atoms as a linking group, and has NHR ⁷ . It is suitable from the viewpoint of adjustability. In this case, R ⁷ may be a hydrogen atom or an acyl group having an alkyl group with about 1 to 6 carbon atoms. The alkylene group can be an ethylene group, a propylene group, a butylene group, a pentylene group, a hexylene group, and the like. Also, for example, it can be an ethylene group, a propylene group, a butylene group, or the like. Alternatively, for example, it may be an ethylene group, a propylene group, or the like. By using an ethylene group or a propylene group as a linking group, it is possible to obtain higher ribonuclease resistance, cell membrane permeability and charge controllability than when a methylene group is used.

また、本部分構造は、連結基を備えるアミジノ基、アジド基及びグアニジノ基であってもよい。かかる官能基を備えることでも、高いリボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性を得ることができる。この場合、連結基は、炭素数１以上のアルキレン基であってもよい。 Further, the partial structure may be an amidino group, an azide group and a guanidino group having a linking group. Having such a functional group can also provide high ribonuclease resistance and cell membrane permeability. In this case, the linking group may be an alkylene group having 1 or more carbon atoms.

また、本部分構造は、式（３）及び式（４）のＲ³の連結基が炭素数１～６程度のアルキル基、さらに、例えば、炭素数の下限が２以上、また例えば３以上であることが好適である。かかる構造は、リボヌクレアーゼ耐性及び細胞膜透過性に有効である。 Further, in this partial structure, the linking group of R ³ in formulas (3) and (4) is an alkyl group having about 1 to 6 carbon atoms, and further, the lower limit of the carbon number is, for example, 2 or more, or, for example, 3 or more. It is preferable to have Such structures are effective for ribonuclease resistance and cell membrane permeability.

オリゴリボヌクレオチドは、少なくとも本部分構造を少なくとも６個備えることが好適である。６個以上備えることで、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性、さらには電荷調節性に有利である。 The oligoribonucleotide preferably comprises at least 6 of this partial structure. Providing 6 or more is advantageous for ribonuclease resistance, cell membrane permeability, and charge controllability.

本コンジュゲートにおけるオリゴリボヌクレオチドにおいては、細胞質内において実質的に機能するＲＮＡ鎖ではないＲＮＡ鎖やその部分において、本部分構造を備えることが好適である。例えば、本コンジュゲートが、オリゴリボヌクレオチドの二重鎖を備えるｓｉＲＮＡを意図する場合には、センス鎖に本部分構造を備えることで、本コンジュゲートの細胞透過性とヌクレアーゼ耐性とを期待することができる。また、ｓｉＲＮＡ以外の短鎖ＲＮＡへの導入に関しては、ＲＮＡの立体構造上表面に位置する箇所へは本部分構造を備えるようにし、５’末端及び／又は３‘末端へは、本試薬を備えるようにすることが好ましい。 In the oligoribonucleotide in the present conjugate, it is preferable that the RNA chain or part thereof, which is not the RNA chain substantially functioning in the cytoplasm, has this partial structure. For example, when the conjugate is intended to be an siRNA comprising an oligoribonucleotide double strand, the provision of this partial structure in the sense strand is expected to make the conjugate cell-permeable and nuclease resistant. can be done. In addition, for introduction into short-chain RNAs other than siRNA, this partial structure is provided at the site located on the surface of the three-dimensional structure of RNA, and this reagent is provided at the 5' end and/or 3' end. It is preferable to

本コンジュゲートは、例えば、ｓｉＲＮＡとして利用できる。すなわち、オリゴリボヌクレオチド二重鎖を備える本コンジュゲートは、生体内成分（ＲＩＳＣタンパク質）と複合体を形成して、配列特異的にｍＲＮＡを切断することにより、ｍＲＮＡ上の情報がリボソームにより特定のタンパク質へ翻訳されることをできなくする。また、ｍｉＲＮＡを構成する構成物として、あるいはまたアプタマーＲＮＡの構成物としても取り込まれて、リボヌクレアーゼ耐性や細胞膜透過性向上の特徴を生かしつつ、利用できると考えられる。さらに、他の化合物と連結してコンジュゲートを構成することもできる。さらにまた、本コンジュゲートは、リボザイムの構成物としても利用できる。 The conjugate can be used, for example, as siRNA. That is, the present conjugate comprising an oligoribonucleotide double chain forms a complex with an in vivo component (RISC protein) and cleaves mRNA in a sequence-specific manner, so that the information on the mRNA is transferred to the ribosome in a specific manner. prevent it from being translated into protein. In addition, it is thought that they can be incorporated as a component that constitutes miRNA or as a component of aptamer RNA, and can be used while taking advantage of the characteristics of ribonuclease resistance and improved cell membrane permeability. Furthermore, it can be linked to other compounds to form a conjugate. Furthermore, the conjugates can also be used as components of ribozymes.

これらのことから本コンジュゲートは、天然ヌクレオチドにはない特徴を生かして、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとする遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する種々のＲＮＡ医薬品の構成物として、天然ヌクレオチドに優る有用性が期待される。すなわち、本コンジュゲートは、こうしたＲＮＡ医薬のほか、その原料又は中間体試薬として有用である。 Based on these facts, the present conjugate can be used as a component of various RNA medicines, such as antitumor agents and antiviral agents, which treat diseases by inhibiting the action of genes, making use of the characteristics not found in natural nucleotides. It is expected to be more useful than natural nucleotides. That is, the present conjugates are useful as raw materials or intermediate reagents for such RNA medicines.

本コンジュゲートにおけるオリゴリボヌクレオチドの電荷調節性、リボヌクレアーゼ耐性、細胞膜透過性、電荷調節能ならびにオリゴリボヌクレオチドを含む種々のＲＮＡの生物活性については、当業者であれば、適宜、後述する実施例や本願出願時における当業者の周知の手法を参照することで容易に評価することができる。 A person skilled in the art will know the charge-regulatory property, ribonuclease resistance, cell membrane permeability, charge-regulatory property, and biological activity of various RNAs containing oligoribonucleotides of the oligoribonucleotide in this conjugate, as appropriate, in Examples and It can be easily evaluated by referring to methods well known to those skilled in the art at the time of filing the application.

以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。 Examples are given below as specific examples in order to more specifically describe the disclosure of the present specification. The following examples are intended to illustrate the disclosure herein, but not to limit its scope.

（アミノ修飾アミダイトの合成）
本実施例では、以下のスキームに従い、細胞接着性モチーフ（ＲＧＤモチーフ）単位導入用モノマーとして以下の化合物５を合成した。 (Synthesis of amino-modified amidite)
In this example, the following compound 5 was synthesized as a monomer for introducing a cell adhesive motif (RGD motif) unit according to the following scheme.

6-trifluoroacetamido-hexanoic acid (3)
アルゴン雰囲気下、６－ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃａｃｉｄ（２）（０．６０ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５ｍＬ）に溶解させた。続いてＴＥＡ（１．０ｍＬ、６．８６ｍｍｏｌ）、ＣＦ_３ＣＯＯＥｔ（０．８ｍＬ，６．８６ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。得られた反応液を減圧濃縮し、化合物３（０．４５ｇ，１．９８ｍｍｏｌ，４３％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.36 (s, 1H), 3.39 (dd, 2H, J = 6.9), 2.39 (t, 2H, J = 7.3), 1.70-1.60 (m, 4H), 1.16-1.09 (m, 2H). 6-trifluoroacetamido-hexanoic acid (3)
Under an argon atmosphere, 6-aminohexanoic acid (2) (0.60 g, 4.57 mmol) was dissolved in MeOH (15 mL). Subsequently, TEA (1.0 mL, 6.86 mmol) and CF ₃ COOEt (0.8 mL, 6.86 mmol) were added and stirred overnight at room temperature. The resulting reaction solution was concentrated under reduced pressure to obtain compound 3 (0.45 g, 1.98 mmol, 43%).
¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.36 (s, 1H), 3.39 (dd, 2H, J = 6.9), 2.39 (t, 2H, J = 7.3), 1.70-1.60 (m, 4H), 1.16 -1.09 (m, 2H).

(S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)-2-propanol (4)
アルゴン雰囲気下、化合物３（０．４５ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させた。続けてＴＥＡ（０．４ｍＬ，１．９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させた化合物１^１，２（０．６５ｇ，１．６５ｍｍｏｌ）、ＥＤＣｌ（０．３８ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．２４ｇ，１．９８ｍｍｏｌ）を加え室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとＨ_２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレータにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝３０：１）にて精製することで、化合物４（０．７８ｇ，１．２８ｍｍｏｌ，７８％）を得た。 (S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4'-dimethoxytrityloxy)-2-propanol (4)
Compound 3 (0.45 g, 1.98 mmol) was dissolved in DMF (5 mL) under an argon atmosphere. Subsequently TEA (0.4 mL, 1.98 mmol), compound 1 ^1,2 (0.65 g, 1.65 mmol) dissolved in DMF (5 mL), EDCl (0.38 g, 1.98 mmol), DMAP (0 .24 g, 1.98 mmol) was added and stirred overnight at room temperature. The product was extracted with ethyl acetate and H ₂ O, and the organic layer was washed with saturated aqueous sodium bicarbonate solution, saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate. The volatile solvent was concentrated under reduced pressure using an evaporator, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform:methanol=30:1) to obtain compound 4 (0.78 g, 1.28 mmol, 78%).

(S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4’-dimethoxytrityloxy)propyl-2-O-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (5)
アルゴン雰囲気下、化合物４（０．６４ｇ，１．０６ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させた。続けてＤＩＰＥＡ（０．７ｍＬ，４．２４ｍｍｏｌ）、２－ＣｙａｎｏｅｔｈｙｌＮ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（０．５ｍＬ，２．１２ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌した。生成物をクロロホルムとＨ_２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）にて精製し、化合物５（０．４３ｇ，０．５４ｍｍｏｌ，５１％）を得た。
³¹P NMR (242 MHz, CDCl₃) δ 149.7, 149.0. (S)-3-[(6-trifluoroacetamido)hexanamido]-1-(4,4'-dimethoxytrityloxy)propyl-2-O-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (5)
Compound 4 (0.64 g, 1.06 mmol) was dissolved in _CH2Cl2 under _an argon atmosphere. Subsequently, DIPEA (0.7 mL, 4.24 mmol) and 2-CyanoethylN,N-diisopropylchlorophosphoramidite (0.5 mL, 2.12 mmol) were added and stirred at room temperature for 1 hour. The product was extracted with chloroform and H ₂ O, and the organic layer was washed with saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The volatile solvent was concentrated under reduced pressure using an evaporator, and the residue was purified by silica gel column chromatography (hexane:ethyl acetate=1:2) to obtain compound 5 (0.43 g, 0.54 mmol, 51%).
^31P NMR (242 MHz, _CDCl3 ) δ 149.7, 149.0.

（固相担体の合成）
本実施例では、以下のスキームに従い、細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーが結合された固相担体として以下の化合物を合成した。 (Synthesis of solid-phase carrier)
In this example, the following compound was synthesized as a solid-phase carrier to which a monomer for introducing a cell adhesion motif unit was bound according to the following scheme.

実施例１で合成した化合物４（０．１０ｇ，０．１７ｍｍｏｌ）、ｓｕｃｃｉｎｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ（０．１０ｇ，１．００ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（６１ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）をｐｙｒｉｄｉｎｅ（２ｍＬ）に溶解し、室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとＨ_２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレーターで減圧濃縮し、スクシニル体を得た。続けて、Ａｒ雰囲気下でスクシニル体をＤＭＦ（１．７ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ（３２ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）、ＣＰＧ樹脂（０．２６ｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を加えて室温で３日間静置した。ＣＰＧ樹脂をフィルターに移し、Ｐｙｒｉｄｉｎｅで洗浄した後、Ａｒ雰囲気下でｐｙｒｉｄｉｎｅ（５ｍＬ）、ＤＭＡＰ（０．１８ｇ，１．４７ｍｍｏｌ）、Ａｃｅｔｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ（１．５ｍＬ，１５．８７ｍｍｏｌ）を加え一晩静置した。ＣＰＧ樹脂をフィルターに移し、Ｐｙｒｉｄｉｎｅ、ＥｔＯＨ、ＭｅＣＮで洗浄後、樹脂を乾燥し目的の固相担体を導入効率２５．８μｍｏｌ／ｇで得た。 Compound 4 synthesized in Example 1 (0.10 g, 0.17 mmol), succinicanhydride (0.10 g, 1.00 mmol) and DMAP (61 mg, 0.50 mmol) were dissolved in pyridine (2 mL) and allowed to stand overnight at room temperature. Stirred. The product was extracted with ethyl acetate and H ₂ O, and the organic layer was washed with saturated aqueous sodium bicarbonate solution, saturated brine and dried over anhydrous sodium sulfate. The volatile solvent was concentrated under reduced pressure using an evaporator to obtain a succinyl derivative. Subsequently, the succinyl derivative was dissolved in DMF (1.7 mL) under an Ar atmosphere, EDC (32 mg, 0.17 mmol) and CPG resin (0.26 g, 0.04 mmol) were added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 days. . The CPG resin was transferred to a filter and washed with pyridine, then pyridine (5 mL), DMAP (0.18 g, 1.47 mmol) and aceticanhydride (1.5 mL, 15.87 mmol) were added under an Ar atmosphere and allowed to stand overnight. . The CPG resin was transferred to a filter, washed with Pyridine, EtOH and MeCN, and then dried to obtain the desired solid phase carrier with an introduction efficiency of 25.8 μmol/g.

（スペーサーアミダイトの合成）
本実施例では、以下のスキームに従い、スペーサー単位導入用モノマーとして、以下の化合物８を合成した。 (Synthesis of spacer amidite)
In this example, the following compound 8 was synthesized as a spacer unit-introducing monomer according to the following scheme.

18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol (7)
Ａｒ雰囲気下、Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ（６）（１．７ｍＬ，５．３１ｍｍｏｌ）をｐｙｒｉｄｉｎｅ（３０ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴｒＣｌ（１．３６ｇ，４．００ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチルとＨ_２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性溶媒をエバポレーターで減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝２０：１）で精製し、化合物７（１．４９ｇ，２．５５ｍｍｏｌ，４８％）で得た。
¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.46 (d, 2H, J = 7.56), 7.35-7.33 (m, 4H), 7.28 (d, 2H, J = 7.56), 7.20 (t, 1H, J= 7.56), 6.83-6.80 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.70 (m, 2H,), 3.69-3.63 (m, 17H), 3.59 (t, 2H, J = 4.80), 3.22 (t, 2H, J= 5.46), 1.99 (s, 1H). 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol (7)
Hexaethylene glycol (6) (1.7 mL, 5.31 mmol) was dissolved in pyridine (30 mL) under an Ar atmosphere, DMTrCl (1.36 g, 4.00 mmol) was added, and the mixture was stirred overnight at room temperature. The product was extracted with ethyl acetate and H ₂ O, and the organic layer was washed with saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The volatile solvent was concentrated under reduced pressure using an evaporator, and the residue was purified by silica gel column chromatography (chloroform:methanol=20:1) to obtain compound 7 (1.49 g, 2.55 mmol, 48%).
¹ H NMR (600 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.46 (d, 2H, J = 7.56), 7.35-7.33 (m, 4H), 7.28 (d, 2H, J = 7.56), 7.20 (t, 1H, J= 7.56), 6.83-6.80 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), 3.70 (m, 2H,), 3.69-3.63 (m, 17H), 3.59 (t, 2H, J = 4.80), 3.22 (t , 2H, J = 5.46), 1.99 (s, 1H).

18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol-1-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (8)
アルゴン雰囲気下、化合物７（１．４９ｇ，２．５５ｍｍｏｌ）をＣＨ_２Ｃｌ_２に溶解させた。続けてＤＩＰＥＡ（１．８ｍＬ，１０．２０ｍｍｏｌ）、２－ＣｙａｎｏｅｔｈｙｌＮ，Ｎ－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ（１．１ｍＬ，５．１０ｍｍｏｌ）を加え室温で１時間撹拌した。生成物をクロロホルムとＨ_２Ｏで抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。揮発性の溶媒をエバポレーターにより減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：２）にて精製し、化合物８（１．０８ｇ，１．３８ｍｍｏｌ，５４％）を得た。
³¹P NMR (242 MHz, CDCl₃) δ 149.9, 148.9. 18-O-Dimethoxytritylhexaethyleneglycol-1-[(2-cyanoethyl)(N,N-diisopropylamino)]phosphoramidite (8)
Compound 7 (1.49 g, 2.55 mmol) was dissolved in _CH2Cl2 under _an argon atmosphere. Subsequently, DIPEA (1.8 mL, 10.20 mmol) and 2-CyanoethylN,N-diisopropylchlorophosphoramidite (1.1 mL, 5.10 mmol) were added and stirred at room temperature for 1 hour. The product was extracted with chloroform and H ₂ O, and the organic layer was washed with saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution and saturated brine, and dried over anhydrous sodium sulfate. The volatile solvent was concentrated under reduced pressure using an evaporator, and the residue was purified by silica gel column chromatography (hexane:ethyl acetate=1:2) to obtain compound 8 (1.08 g, 1.38 mmol, 54%).
^31P NMR (242 MHz, _CDCl3 ) δ 149.9, 148.9.

（オリゴヌクレオチド誘導体の合成）
核酸自動合成機を用いてホスホロアミダイト法に従い、実施例１～３で合成した細胞接着性モチーフ単位導入用モノマー、固相担体及びスペーサー単位導入用モノマー及び各種ヌクレオチドを用いて、０．２μｍｏｌスケールでオリゴヌクレオチド誘導体を合成した。塩基の脱保護と樹脂からの切り出しは、ＮＨ_４ＯＨ：ＥｔＯＨ＝３：１溶液１ｍＬ中で５５°Ｃ、４時間インキュベートにより行った。糖部２’－位のＴＢＤＭＳ基の脱保護は、ＤＭＳＯ１００μＬ、ＴＥＡ・３ＨＦ１２５μＬ溶液中で６５°Ｃ、１．５時間インキュベートにより行った。更に、７Ｍｕｒｅａを含む２０％ＰＡＧＥを用いて精製を行い、目的の配列のオリゴヌクレオチドを合成した。 (Synthesis of oligonucleotide derivative)
According to the phosphoramidite method using an automatic nucleic acid synthesizer, using the cell adhesive motif unit introduction monomer synthesized in Examples 1 to 3, the solid phase carrier and the spacer unit introduction monomer and various nucleotides, 0.2 μmol scale synthesized oligonucleotide derivatives. Base deprotection and cleavage from the resin were carried out by incubating in 1 mL of NH ₄ OH:EtOH=3:1 solution at 55° C. for 4 hours. The TBDMS group at the 2'-position of the sugar portion was deprotected by incubating in a solution of 100 µL of DMSO and 125 µL of TEA.3HF at 65°C for 1.5 hours. Further purification was performed using 20% PAGE containing 7M urea to synthesize an oligonucleotide of the desired sequence.

以下の表中、０Ｎ１、３及び７がＲｅｃＱＬ１ＲＮＡの化学修飾したガイド鎖であり、ＯＮ２、４、５及び６が、ＲｅｃＱＬ１ＲＮＡの天然及び化学修飾したパッセンジャー鎖であり、ＯＮ８がルシフェラーゼＲＮＡの天然ガイド鎖であり、ＯＮ９がルシフェラーゼのＲＧＤ修飾したパッセンジャー鎖である。 In the table below, 0N1, 3 and 7 are the chemically modified guide strands of RecQL1 RNA, ON2, 4, 5 and 6 are the native and chemically modified passenger strands of RecQL1 RNA, and ON8 is the native guide strand of luciferase RNA. and ON9 is the RGD-modified passenger strand of luciferase.

なお、表中、小文字の塩基は２’－ＯＭｅヌクレオチドを表し、アンダーバーの塩基はリボースの２’－Ｆヌクレオチドを表し、ｐは、ＰＥＧスペーサー単位導入用モノマーを表し、Ｘは細胞接着性モチーフ単位としてｃＲＧＤを有する細胞接着性モチーフ単位導入用モノマーを表し、「・」は、ホスホロチオエート結合を表す。 In the table, lower case bases represent 2'-OMe nucleotides, underscored bases represent 2'-F nucleotides of ribose, p represents a monomer for introducing a PEG spacer unit, and X represents a cell adhesion motif unit. represents a monomer for introducing a cell adhesion motif unit having cRGD, and "•" represents a phosphorothioate bond.

（cRGDコンジュゲートオリゴヌクレオチドの合成）
実施例４で合成したオリゴヌクレオチド誘導体（２０ｎｍｏｌ）を３２０μＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）に溶解し、５０ｍＭ６－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃａｃｉｄＮ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅｅｓｔｅｒ（ＥＭＣＳ）／ＤＭＳＯ溶液を８０μＬ（４００ｎｍｏｌ）加え、室温で一晩インキュベートした。マレイミド化したオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで分取し、回収した溶液に、５０ｍＭｃＲＧＤ（フナコシ株式会社製、構造式を以下に示す。）／ＤＭＳＯ溶液１６μＬ（８０ｎｍｏｌ）を直接加えた。室温で一晩インキュベートして、マイケル付加反応により、オリゴリボヌクレオチド誘導体のマレイミド基と、ｃＲＧＤのチオール基とを連結させた後、反応液をＨＰＬＣで精製し、目的のｃＲＧＤオリゴヌクレオチドコンジュゲートを得た。 (Synthesis of cRGD conjugated oligonucleotides)
The oligonucleotide derivative (20 nmol) synthesized in Example 4 was dissolved in 320 μL of 0.1 M phosphate buffer (pH=7.4), and 80 μL (400 nmol) of 50 mM 6-maleimidohexanoicacid N-hydroxysuccinimide ester (EMCS)/DMSO solution was added. and incubated overnight at room temperature. The maleimidated oligonucleotide was fractionated by HPLC, and 16 μL (80 nmol) of 50 mM cRGD (manufactured by Funakoshi Co., Ltd., structural formula shown below)/DMSO solution was directly added to the recovered solution. After incubating overnight at room temperature, the maleimide group of the oligoribonucleotide derivative and the thiol group of cRGD are linked by Michael addition reaction, and then the reaction solution is purified by HPLC to obtain the desired cRGD oligonucleotide conjugate. rice field.

（蛍光顕微鏡による観察）
メラノーマ細胞Ａ２０５８を０．３×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬで３５ｍｍガラスボトムディッディッシュに播種し、ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。培地を除去した後、ディッシュをＯＰＴＩ－ＭＥＭで洗浄し、実施例４及び５で調製したオリゴリボヌクレオチド誘導体２５０ｎＭを用いてｓｉＲＮＡコンジュゲートＭ／ＯＰＴＩ－ＭＥＭ溶液を添加した。なお、用いたｓｉＲＮＡは、以下の組合せとした。 (Observation with a fluorescence microscope)
Melanoma cells A2058 were seeded at 0.3×10 ⁵ cells/mL in a 35 mm glass bottom dish and cultured in a CO ₂ incubator for 24 hours. After removing the medium, the dish was washed with OPTI-MEM, and 250 nM of the oligoribonucleotide derivative prepared in Examples 4 and 5 was used to add the siRNA conjugate M/OPTI-MEM solution. The siRNAs used were the following combinations.

ｓｉＲＮＡ（１）：ＯＮ３／ＯＮ２：ｃＲＧＤモチーフ単位及びスペーサー単位を備えない
ｓｉＲＮＡ（２）：ＯＮ３／ＯＮ４：ｃＲＧＤモチーフ３個を備えスペーサー単位を備えない
ｓｉＲＮＡ（３）：ＯＮ３／ＯＮ５：ｃＲＧＤモチーフ３個を備えスペーサー単位１個を備える
ｓｉＲＮＡ（４）：ＯＮ３／ＯＮ６：ｃＲＧＤモチーフ３個とスペーサー単位３個を交互に備える siRNA (1): ON3/ON2: siRNA without cRGD motif unit and spacer unit (2): ON3/ON4: siRNA with 3 cRGD motifs and no spacer unit (3): ON3/ON5: 3 cRGD motifs siRNA (4) with 1 Spacer Unit with : ON3/ON6: with 3 cRGD motifs alternating with 3 Spacer Units

ディッシュにｓｉＲＮＡを添加後、ＣＯ_２インキュベーターで１８時間培養し、その後Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２を終濃度２５μｇ／ｍＬとなるように添加した。ＣＯ_２インキュベーターで１０分間培養した後、染色試薬を除去し、ディッシュをＰＢＳで洗浄した。ディッシュにＰＢＳを添加し、蛍光顕微鏡で細胞を観察した。結果を図４に示す。 After adding siRNA to the dish, the dish was cultured in a CO ₂ incubator for 18 hours, and then Hoechst 33342 was added to a final concentration of 25 μg/mL. After 10 minutes of incubation in a _CO2 incubator, the staining reagent was removed and the dishes were washed with PBS. PBS was added to the dish and the cells were observed under a fluorescence microscope. The results are shown in FIG.

図４に示すように、ｃＲＧＤモチーフとスペーサー単位とを組み合わせることによって、細胞内取り込みが向上していることがわかった。特に、ｃＲＧＤモチーフとスペーサー単位とを交互に３個備えて、ｃＲＧＤモチーフ間がスペーサー単位で離間された構造を備えるｓｉＲＮＡ（４）は、高い細胞内取り込み率を示した。 As shown in FIG. 4, it was found that the intracellular uptake was improved by combining the cRGD motif and the spacer unit. In particular, siRNA (4), which has a structure in which three cRGD motifs and three spacer units are alternately provided and the cRGD motifs are separated by spacer units, showed a high intracellular uptake rate.

（ウェスタンブロッティング）
メラノーマ細胞Ａ２０５８を０．３×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬで６ｗｅｌｌプレートに播種し、ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。培地を除去した後、６ｗｅｌｌプレートをＯＰＴＩ－ＭＥＭで洗浄し、実施例４及び５で合成したオリゴリボヌクレオチド誘導体を用いた５０ｎＭまたは２５０ｎＭのｓｉＲＮＡコンジュゲート／ＯＰＴＩ－ＭＥＭ溶液を添加した。ＣＯ_２インキュベーターで１８時間培養した後、全細胞を回収し、ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１％ＮＰ－４０，０．１％ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ，０．１％ＳＤＳ，１５０ｍＭＮａＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ，１％ＰｒｏｔｅａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒＣｏｃｋｔａｉｌ）を加えて２０分間氷上に静置した。 (Western blotting)
Melanoma cells A2058 were seeded in a 6-well plate at 0.3×10 ⁵ cells/mL and cultured in a CO ₂ incubator for 24 hours. After removing the medium, the 6-well plate was washed with OPTI-MEM, and a 50 nM or 250 nM siRNA conjugate/OPTI-MEM solution using the oligoribonucleotide derivatives synthesized in Examples 4 and 5 was added. After culturing for 18 hours in a CO ₂ incubator, all cells were collected and added to a lysis buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% NP-40, 0.1% deoxycholic acid, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Protease Inhibitor Cocktail) was added and allowed to stand on ice for 20 minutes.

ｓｉＲＮＡ（４）：ＯＮ７／ＯＮ２：ｃＲＧＤモチーフ単位及びスペーサー単位を備えない
ｓｉＲＮＡ（５）：ＯＮ８／ＯＮ９：ｃＲＧＤモチーフ３個とスペーサー単位３個を交互に備える
ｓｉＲＮＡ（６）：ＯＮ７／ＯＮ６：ｃＲＧＤモチーフ３個とスペーサー単位３個を交互に備える siRNA (4): ON7/ON2: siRNA without cRGD motif unit and spacer unit (5): ON8/ON9: siRNA with alternating 3 cRGD motifs and 3 spacer units (6): ON7/ON6: cRGD Equipped with 3 motifs and 3 spacer units alternately

得られた細胞懸濁液を４°Ｃ、１３０００ｒｐｍ、２０分間遠心し、上清をタンパク溶液として回収した。溶液中の濃度はＤＣｐｒｏｔｅｉｎａｓｓａｙｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）で測定した。１０μｇのタンパク溶液を１２．５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦメンブレン上にブロッティングした。メンブレンを５％スキムミルク溶液でブロッキング処理し、ＲｅｃＱＬ１抗体溶液中、４°Ｃで一晩静置した。メンブレンを洗浄し、ＨＲＰ結合２次抗体を加えて１時間浸透した後、ＡｍｍｅｒｓｈａｍＥＣＬＰｌｕｓＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇＤｅｔｅｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）をメンブレン上に直接添加し、ＲｅｃＱＬ１タンパクを検出した。結果を図５に示す。 The obtained cell suspension was centrifuged at 4° C. and 13000 rpm for 20 minutes, and the supernatant was collected as a protein solution. Concentrations in solutions were determined with a DC protein assay kit (Biorad, Hercules). 10 μg of protein solution was separated by 12.5% SDS-PAGE and blotted onto PVDF membrane. The membrane was blocked with a 5% skimmed milk solution and allowed to stand overnight at 4°C in the RecQL1 antibody solution. After the membrane was washed and HRP-conjugated secondary antibody was added and permeabilized for 1 hour, Ammersham ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare) were added directly onto the membrane to detect RecQL1 protein. The results are shown in FIG.

図５に示すように、ｓｉＲＮＡ（４）（ｓｉ－ＲｅｃＱＬ１）とｓｉＲＮＡ（６）（ｓｉ－ＲｅｃＱＬ１＋ＲＧＤ）を比較すると、＋ＲＧＤでのみタンパク質の発現量の減少が見られた。これはＲＧＤ修飾がなければｓｉＲＮＡが細胞内に取り込めないのに対し、本試薬によるＲＧＤ修飾によってｓｉＲＮＡが効率的に細胞内に取り込まれたことを示している。さらに、ｓｉＲＮＡ（５）（ｓｉ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋ｃＲＧＤ）とｓｉＲＮＡ（６）（ｓｉ－ＲｅｃＱＬ１＋ＲＧＤ）とを比較すると、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの方ではタンパク質の発現量に変化が見られていない。このことから、ｓｉ－ＲｅｃＱＬ１＋ＲＧＤはＲｅｃＱＬ１ｍＲＮＡに対して選択的に働き、ｓｉ－ＲｅｃＱＬ１のＲＮＡｉ活性によってタンパク質の発現が抑制されたことが明らかとなった。以上のことから、本試薬によるＲＧＤ修飾様式によってｓｉＲＮＡの効率的な細胞内取り込み及びＲＩＳＣ形成を介したＲＮＡｉ活性による標的遺伝子の発現抑制を可能にすることが示された。 As shown in FIG. 5, when siRNA(4) (si-RecQL1) and siRNA(6) (si-RecQL1+RGD) were compared, a decrease in protein expression was observed only with +RGD. This indicates that siRNA could not be taken up into cells without RGD modification, whereas siRNA was efficiently taken up into cells by RGD modification with this reagent. Furthermore, when siRNA (5) (si-Luciferase+cRGD) and siRNA (6) (si-RecQL1+RGD) are compared, no change in protein expression level is observed for Luciferase. This demonstrated that si-RecQL1+RGD selectively acted on RecQL1 mRNA, and protein expression was suppressed by the RNAi activity of si-RecQL1. From the above, it was shown that the RGD modification mode of this reagent enables efficient intracellular uptake of siRNA and suppression of target gene expression by RNAi activity mediated by RISC formation.

Claims

ＲＮＡ導入試薬であって、
２個以上の細胞接着性モチーフ単位と、
１個以上のスペーサー単位と、
を備え、
前記２個以上の細胞接着性モチーフ単位と前記１個以上のスペーサー単位とは、２個の前記細胞接着性モチーフ単位を１個の前記スペーサー単位を介在させて相互に離間するとともに、直鎖状構造を構成するように結合しており、
前記細胞接着性モチーフ単位はＲＧＤペプチドを含み、
前記スペーサー単位はポリオキシアルキレン基を含む、試薬。 An RNA introduction reagent,
two or more cell adhesive motif units;
one or more spacer units;
with
The two or more cell adhesion motif units and the one or more spacer units are arranged such that the two cell adhesion motif units are spaced apart from each other with one of the spacer units interposed therebetween, and are linear. combined to form a structure,
the cell adhesion motif unit comprises an RGD peptide;
The reagent, wherein said Spacer unit comprises a polyoxyalkylene group.

前記細胞接着性モチーフ単位は、前記細胞接着性モチーフ単位のうち前記スペーサー単位と結合して前記直鎖状構造を構成する部分に結合するリンカーを介して前記直鎖状構造の側鎖となるように前記ＲＧＤペプチドを備える、請求項１に記載の試薬。 The cell adhesion motif unit is bound to the spacer unit of the cell adhesion motif unit so as to form a side chain of the linear structure via a linker that binds to the portion constituting the linear structure. 2. The reagent of claim 1, comprising said RGD peptide in a.

１個の前記スペーサー単位は、２個の前記細胞接着性モチーフ単位を、少なくとも２ｎｍ以上離間する、請求項１又は２に記載の試薬。 3. The reagent according to claim 1 or 2, wherein one said spacer unit separates two said cell adhesion motif units by at least 2 nm or more.

ペプチド誘導体であって、
２個以上のペプチド単位と、
１個以上の非ペプチド単位と、
を備え、
前記２個以上のペプチド単位と前記１個以上の非ペプチド単位とは、２個の前記ペプチド単位を１個の前記非ペプチド単位を介在させて相互に離間するとともに、直鎖状構造を構成するように結合し、
前記ペプチド単位はＲＧＤペプチドを含み、
前記非ペプチド単位は、ポリオキシアルキレン基を含む、誘導体。 a peptide derivative,
two or more peptide units;
one or more non-peptide units;
with
The two or more peptide units and the one or more non-peptide units are separated from each other with one of the non-peptide units interposed between the two peptide units and form a linear structure. and combine like
said peptide unit comprises an RGD peptide;
The derivative, wherein the non-peptide unit comprises a polyoxyalkylene group.

オリゴリボヌクレオチド誘導体であって、
天然のヌクレオチド及び／又はヌクレオシド誘導体を構成単位として含有するオリゴリボヌクレオチドと、
前記オリゴリボヌクレオチドの３’末端及び／又は５’末端に連結された構造部分であって、
２個以上のペプチド単位と、
１個以上の非ペプチド単位と、
を備え、
前記２個以上のペプチド単位と前記１個以上の非ペプチド単位とは、２個の前記ペプチド単位を１個の前記非ペプチド単位を介在させて相互に離間するとともに、直鎖状構造を構成するように結合し、
前記ペプチド単位はＲＧＤペプチドを含み、
前記非ペプチド単位はポリオキシアルキレン基を含む、構造部分と、
を含む、誘導体。 An oligoribonucleotide derivative,
an oligoribonucleotide containing natural nucleotides and/or nucleoside derivatives as structural units;
A structural moiety linked to the 3′ end and/or the 5′ end of the oligoribonucleotide,
two or more peptide units;
one or more non-peptide units;
with
The two or more peptide units and the one or more non-peptide units are separated from each other with one of the non-peptide units interposed between the two peptide units and form a linear structure. and combine like
said peptide unit comprises an RGD peptide;
a structural moiety, wherein said non-peptide unit comprises a polyoxyalkylene group;
derivatives , including

前記ヌクレオシド誘導体は、以下の式（１）又は（２）に示すヌクレオシド誘導体である、請求項５に記載の誘導体。

（式（１）中、Ｒ¹は、水酸基、水素原子がアルキル基又はアルケニル基で置換された水酸基又は保護された基を表し、式（２）中、Ｘは、ハロゲン原子を表す。式（１）及び式（２）中、Ｒ²及びＲ⁴は互いに同一又は異なり、水素原子、水酸基の保護基、リン酸基、保護されたリン酸基、又は－Ｐ（＝Ｏ）_nＲ⁵Ｒ⁶（nは０又は１を示し、Ｒ⁵及びＲ⁶は、互いに同一又は異なり、水素原子、水酸基、保護された水酸基、メルカプト基、保護されたメルカプト基、低級アルコキシ基、シアノ低級アルコキシ基、アミノ基、又は置換されたアミノ基のいずれかを示す。ただし、ｎが１のときには、Ｒ⁵及びＲ⁶が共に水素原子となることはない。）を示し、Ｒ³は、それぞれ連結基を有するＮＨＲ⁷（Ｒ⁷は、水素原子、アルキル基、アルケニル基又はアミノ基の保護基を表す。）、アジド基、アミジノ基又はグアニジノ基を表し、Ｂは、プリン－９－イル基、２－オキソ－ピリミジン－１－イル基、置換プリン－９－イル基、又は置換２－オキソ－ピリミジン－１－イル基のいずれかを表す。） 6. The derivative according to claim 5, wherein the nucleoside derivative is a nucleoside derivative represented by the following formula (1) or (2).

(In formula (1), R ¹ represents a hydroxyl group, a hydroxyl group in which a hydrogen atom is substituted with an alkyl group or an alkenyl group, or a protected group, and in formula (2), X represents a halogen atom. Formula ( 1) and formula (2), R ² and R ⁴ are the same or different from each other, and are a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group, a phosphate group, a protected phosphate group, or -P(=O) _n R ⁵ R ⁶ (n represents 0 or 1, R ⁵ and R ⁶ are the same or different, hydrogen atom, hydroxyl group, protected hydroxyl group, mercapto group, protected mercapto group, lower alkoxy group, cyano-lower alkoxy group, represents either an amino group or a substituted amino group, provided that when n is 1, both R ⁵ and R ⁶ are not hydrogen atoms), and R ³ each represents a linking group; NHR ⁷ (R ⁷ represents a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group or an amino-protecting group), an azide group, an amidino group or a guanidino group, B represents a purine-9-yl group, a 2- represents either an oxo-pyrimidin-1-yl group, a substituted purin-9-yl group, or a substituted 2-oxo-pyrimidin-1-yl group.)

請求項５又は６に記載のオリゴリボヌクレオチド誘導体を含む、ＲＮＡ医薬。 An RNA medicine comprising the oligoribonucleotide derivative according to claim 5 or 6.

前記オリゴリボヌクレオチド誘導体は、ｓｉＲＮＡである、請求項７に記載のＲＮＡ医薬。 The RNA medicine according to claim 7, wherein said oligoribonucleotide derivative is siRNA.