KR20090053926A - Ｆｙｎ 키나아제의 변형된 ｓｈ３ 도메인을 포함하는 특이적이며 친화력이 높은 결합 단백질 - Google Patents
Ｆｙｎ 키나아제의 변형된 ｓｈ３ 도메인을 포함하는 특이적이며 친화력이 높은 결합 단백질 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 src 루프내 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 및/또는 RT 루프내 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된, FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)의 하나 이상의 유도체를 포함하는 재조합 결합 단백질과 관련이 있다. 더욱이, 본 발명은 약제학적으로 및/또는 진단학적으로 활성있는 성분에 융합된 본 발명에 따른 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 결합 단백질 및/또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 비롯한 상응하는 벡터 및 숙주 세포에 관심이 있다. 끝으로 중요한 것을 하나 더 언급하자면, 본 발명은 약제 또는 진단 수단을 제조하기 위한 본 발명의 결합 단백질 및/또는 융합 단백질의 용도를 비롯한 상기 결합 단백질 및/또는 융합 단백질을 포함하는 약제 조성물 또는 진단 조성물과 관련이 있다.
Description
발명의 분야
본 발명은 src 루프내 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산 및/또는 RT 루프내 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된, FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)의 하나 이상의 유도체를 포함하는 재조합 결합 단백질과 관련이 있다. 더욱이, 본 발명은 약제학적으로 및/또는 진단학적으로 활성있는 성분에 융합된 본 발명에 따른 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 결합 단백질 및/또는 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 비롯한 상응하는 벡터 및 숙주 세포에 관심이 있다. 끝으로 중요한 것을 하나 더 언급하자면, 본 발명은 약제 또는 진단 수단을 제조하기 위한 본 발명의 결합 단백질 및/또는 융합 단백질의 용도를 비롯한 상기 결합 단백질 및/또는 융합 단백질을 포함하는 약제 조성물 또는 진단 조성물과 관련이 있다.
발명의 배경
특이적이며 친화력이 높은 결합제(binders)는 생물학 및 의학 연구에 필수불가결한 도구이며 또한 의학적 진단, 예방 및 치료에 유용성을 갖는다. 현재, 모노클로날 항체는 사실상 임의의 표적에 대해 높은 친화력 및 특이성을 지니면서 빠르게 분리시킬 수 있는 주된 부류의 결합 분자이다. 그러나, 면역글로불린은 주로 이들의 일반적인 생체물리적 특성 및 이들의 다소 복잡한 분자 구조에 기반한 한계점을 지닌다. 따라서, 이미 1990년대의 몇몇 연구진들은 항체에 대한 대체물질로서 작은 구형 단백질을 탐색해 왔다. 이러한 개념의 저변에 깔린 아이디어는 항체 구조로부터의 범용(universal) 결합 부위를 대안적인 단백질 골격부(frameworks), 소위 스캐폴드(scaffolds)로 전달(transfer)하는 것이다. 지금까지 40개 이상의 스캐폴드가 소개되었으며, 이들 중에는 2개의 SH3 도메인, Abl 및 Src 키나아제의 SH3 도메인이 있다(참조: 문헌[Binz et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 10, 1257-1268, 2005]).
SH3 도메인은 세포내 신호전달 및 세포골격(cytoskeletal) 조직화에 관여하는 다수의 상이한 단백질에서 발견된다[Cohen et al., "Modular binding domains in signal transduction proteins." Cell 80(2): 237-48, 1995]. 상기 도메인의 1차 구조의 다양성에도 불구하고, 이러한 SH3 도메인은 매우 유사한 전체적인 구조 및 천연 SH3 결합을 위한 핵심적 결정인자인 최소 컨센서스 서열 PxxP를 공통적으로 지니는 단백질에 대한 결합 양상에서 공통적이다. SH3 도메인의 중요한 기능은 고도로 선택적인 단백질-단백질 상호작용에 참여한다는 것이다.
어펠 등[Erpel et al., "Mutational analysis of the Src SH3 domain: the same residue of the ligand binding surface are important for intra- and intermolecular interactions." Embo J. 14(5): 963-75, 1995]은 Src SH3 도메인의 RT 및 n-Src 루프에서의 돌연변이의 영향에 대해 조사하였으며 소수성 표면에 인접하여 존재하는 상기 두 루프에서의 돌연변이가 분자간- 및 분자내 결합에 참여하는 이 도메인의 활성에 영향을 미칠 수 있다는 것을 입증하였다.
히파카 등[Hiipakka et al., "SH3 domains with high affinity and engineered lignad specificities targeted to HIV-1 Nef." J. MoI. Biol. 293(5): 1097-106, 1999]은 가변적(versatile) 특이성 및 친화력의 결정인자로서 역할하는 Hck SH3 도메인의 RT-루프의 활성에 대해 조사하였다. 저자들은 Hck 도메인의 파지 라이브러리들 구축하였는데, 여기서 상기 RT-루프의 6개 아미노산이 무작위화(randonmization)되었다(RRT-SH3로 명명됨). 이러한 전략을 이용하여, 저자들은 Hck-Sh3 보다 최대 40배까지 더 잘 HIV-1 Nef에 결합할 수 있는 개개의 RRT-SH3 도메인을 확인하였다. 저자들은 요망되는 결합 특성을 지니는 SH3 도메인을 제조하기 위한 일반적인 전략으로서 SH3 리간드 선별에서 RT 루프의 중요성에 대해 지적하고 있다.
이 등[Lee et al., "A single amino acid in the SH3 domain of Hck determines its high affinity and specificity in binding to HIV-1 Nef protein." Embo. J. 14(20): 5006-15, 1995]은 HIV-1 Nef 단백질에 대한 Hck의 상이한 SH3 결합 친화력 및 특이성의 구조적 기반에 대해 조사하였으며 Fyn SH3 도메인의 RT 루프에서 단일 돌연변이로(R96I) Fyn SH3 도메인에 Nef를 지향하는 Hck SH3의 결합 특성을 전달할 수 있었다.
호세 등[Hosse et al., "A new generation of protein display scaffolds for molecular recognition", Protein Science, 15:14-27, 2006]은 치료적 적용에 적합한 결합 단백질에 대한 필요조건에 관심을 가졌다. 저자들은 혈청 안정성, 조직 투과, 혈액 제거(blood clearance), 표적 유지(target retention) 및 면역 반응과 같은 치료학적으로 유용한 결합 단백질의 몇몇 특성들의 중요성을 강조하였다. 면역 반응의 측면에서, 비인간 치료 단백질은 가능한 이들의 인간 대응부와 유사하게 만들어져야 하며 인간 스캐폴드는 개시(start) 바로 직후에 면역원성이 더 적을 수 있다는 것이 강조되었다. 저자들은 다음과 같이 결론짖고 있다:
"그러나, 심지어 완전한 인간 스캐폴드조차도, 특히 단백질이 세포내 단백질이라면, 이 단백질이 인간 면역 반응을 유도시키지 않는다고 보장하지 못한다. 라이브러리 구축이 진행되는 동안 아미노산의 무작위화는 잠재적으로 신규한 T-세포 에피토프를 도입시킬 수 있다. 단일 점 돌연변이 조차도 인간 단백질이 면역원이 되게 만들 수 있다. 더욱이, 대부분의 인간 스캐폴드는 약간의 자가면역 반응을 초래한다."
지금까지 Nef 단백질과 같은 공지된 리간드 또는 합성 펩티드를 지향하는 결합제만이 확인되었지만, 오늘날, Abl 및 Hck 키나아제의 SH3 도메인은 규정된(prescribed) 특이성으로 단백질 결합제를 생성하기 위한 단백질 스캐폴드로서 인식되고 있다(참조: Binz et al. 전게서).
Fyn 키나아제의 SH3 도메인(Fyn SH3)은 63개의 잔기(셈바 등[Semba et al., "yes-related protooncogene, syn, belongs to the protein-tyrosine kinase family." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 83(15): 5459-63, 1986] 및 카와카미 등[Kawakami et al., "Isolation and oncogenic potential of a novel human src-like gene." Mol Cell Biol. 6(12): 4195-201, 1986]에 의해 보고된 아미노산 83-145의 서열)를 포함한다. Fyn은 59 kDa의 티로신 키나아제 Src 패밀리의 일원이다. 대안적인 스플라이싱의 결과로, Fyn 단백질은 이들의 키나아제 도메인에서 서로 다른 2개의 상이한 이소형(isoforms)으로 존재한다: 한 형태는 흉선세포, 비장세포(splenocytes) 및 몇몇 혈구림프구(hematolymphoid) 세포주에서 발견되며, 한편 제 2 형태는 주로 뇌에 집중되어 있다[Cooke and Perlmutter, "Expression of a novel form of the Fyn proto-oncogene in hematopoietic cells." New Biol. 1(1): 66-74, 1989]. Fyn의 생물학적 역할은 다양하며 T 세포 수용체를 통한 신호전달, 뇌 기능 조절을 비롯한 부착 매개 신호전달[Resh, M. D. "Fyn, a Src family tyrosine kinase." Int. J. Biochem. Cell Biol. 30(11): 1159-62, 1998]을 포함한다. Fyn은 세포내 단백질이다. 서열번호:1은 Fyn SH3 서열을 보여준다(1986년의 카와카미 등의 문헌[Kawakami et al., 전게서] 및 셈바 등의 문헌[Semba et al., 전게서]에 보고된, Fyn 키나아제의 아미노산 83-145):
RT-Src 및 n-Src 루프의 서열은, 각각, 밑줄 및 이중-밑줄로 표시되어 있다.
Fyn SH3의 아미노산 서열은 인간, 마우스, 래트 및 원숭이(긴팔원숭이)에서 완전히 보존되어 있다. 닭 Fyn SH3는 상응하는 인간 도메인과 하나의 아미노산 위치에서 상이하고, 제노푸스 래비스(Xenopus laevis)의 Fyn SH3는 2개의 아미노산 위치에서 상이하다. 다른 SH3 도메인과 마찬가지로, Fyn SH3는 2개의 역평행(antiparallel) β-시트로 구성되어 있고 다른 단백질과 상호작용하기 위한 2개의 가요성(flexible) 루프(RT-Src 및 n-Src-루프로 칭해짐)를 포함한다.
요약하자면, 종래 기술은 확립된 항체 구조에 대한 대안으로, 단백질 골격부, 소위 스캐폴드에 대해 교시한다. Src 상동성 3 도메인(SH3)은 이러한 약 40개 이상의 스캐폴드 중 하나이다. 수많은 상이한 SH3 도메인(인간 게놈에서 약 300개 및 현재까지 천연 상태로 소개된 수천개) 중에서, Fyn SH3는 일반적으로 SH3 결합 특이성 및 친화력을 밝히기 위해 종래 이용된 도메인이다. 통상의 기술자는 또한 세포내 단백질이 특히 면역 반응을 생성하기 쉽고, 따라서, 전형적으로 치료 및 진단과 같은 생체내 적용에 있어 덜 유용하거나 심지어 쓸모 없다는 것을 인식하고 있다.
본 발명의 근원적인 목적은 연구, 특히, 진단 제제 및 의약적 제제로서 적합한 개선된 표적 특이적 및 높은 친화력을 갖는 결합 단백질을 제공하는 것이다. 더욱이, 이러한 결합 단백질은 생리학적 조건하에서 안정하고 용해가능하여야 하며, 이러한 단백질을 투여받은 인간에서 면역 효과를 거의 또는 전혀 유도시키지 않아야 하며, 또한 거대한 표적 구조에 의해 접근가능한, 즉, 입체 장애로 은폐(masking)되지 않은, 결합 구조를 제공하여야 한다.
놀랍게도 Src 패밀리의 Fyn 키나아제의 SH3 도메인이 선별된 표적에 대한 특이성 및 고 친화력을 지닌 재조합 결합 도메인을 디자인하기 위한 우수한 특성을 제공한다는 것이 밝혀졌다. 특히, 표적 특이성은 RT 루프 및/또는 src 루프를 돌연변이시킴으로써 디자인될 수 있고 그 결과 수많은 표적에 대한 더 높은 다양성 및 개선된 결합 특성이 초래될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
더욱이, 천연 Fyn SH3 결합 단백질 뿐만 아니라 돌연변이된 Fyn SH3-유래 결합 단백질이 생체내에서 면역원성을 나타내지 않는다는 것은 예상치 못한 발견이었다. 따라서, 재조합 돌연변이체 Fyn SH3 결합 단백질은 특히 비면역원성 단백질 치료제 및/또는 진단제의 개발에 유용하다.
상기의 결과로서, 본 발명의 제 1 양상은 FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)의 하나 이상의 유도체를 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 여기서
(a) src 루프 내의 하나 이상의 아미노산 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산, 및/또는
(b) RT 루프 내의 하나 이상의 아미노산 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산이
치환, 결실 또는 부가되며, 상기 SH3 도메인 유도체가 서열번호:1의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 지니는, 재조합 결합 단백질과 관련이 있는데,
바람직하게는, 상기 재조합 결합 단백질은 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 하며,
바람직하게는 상기 재조합 단백질은 천연 상태에 존재하는 천연 SH3 도메인 함유 단백질이 아님을 조건으로 한다.
서열번호:2의 아미노산 서열(이 등의 문헌[Lee et al., 전게서]의 Fyn SH3 변이체 R96I)은 아래에 제공된다.
본 발명의 문맥상, Fyn 키나아제의 RT 루프(때때로 RT-Src-루프로도 지칭됨)는 서열번호:1의 위치 12 내지 17에 존재하는 아미노산 E A R T E D으로 이루어진다. 상기 RT 루프내의 또는 이 루프에 인접된, 치환, 결실 및/또는 부가, 즉, 돌연변이되는, 위치들은 아미노산 10 내지 19, 바람직하게는 11 내지 18, 더 바람직하게는 12 내지 17이다.
본 발명의 문맥상, FYN 키나아제의 src 루프(때때로 n-Src-루프로도 지칭됨)는 서열번호:1의 위치 31 내지 34에 존재하는 아미노산 N S S E로 이루어진다. 상기 src 루프내의 또는 이 루프에 인접된, 치환, 결실 및/또는 부가, 즉, 돌연변이되는, 위치들은 아미노산 29 내지 36, 바람직하게는 30 내지 35, 더 바람직하게는 31 내지 34이다.
본 발명의 재조합 단백질은 바람직하게는 천연에 존재하거나 천연에서 분리된 천연 SH3 도메인 함유 단백질이 아니다. 즉, 본 발명의 영역은 바람직하게는 야생형 SH3 도메인 함유 단백질을 배제한다. 천연에 SH3 도메인 함유 단백질은 풍부하게 존재한다. 이러한 천연 SH3 단백질은 이들의 천연 리간드에 대해 결합 친화력을 갖는다. 전부는 아니지만 대부분의 이러한 천연 SH3 리간드는 PxxP 모티프를 지닌다. 그러나, 본 발명의 재조합 단백질은, 천연(야생형) SH3 리간드를 배제한, 비천연 표적에 대한 친화력을 갖도록 디자인된 유전공학적으로 제조된(engineered) 단백질인데, 즉, 상기 비천연 표적은, 예를 들어, 천연에서의, 바람직하게는 포유동물에서의, 더 바람직하게는 인간에서의, 임의의 표적일 수 있다. 더 바람직하게는, 본 발명의 재조합 단백질은 본질적으로 임의의 천연 SH3 결합 리간드, 가장 바람직하게는 PxxP 모티프를 지니는 임의의 천연 SH3 결합 리간드에 대한 결합 친화력을 갖지 않는다.
바람직하게는, 한 루프 및/또는 두 루프에 부가되는 아미노산의 수는 1 내지 20개, 더 바람직하게는 1 내지 10개 또는 1 내지 5개이고, 가장 바람직하게는 아미노산이 상기 루프에 부가되지 않는다.
또 다른 바람직한 구체예에서, RT 및 src 루프의 바깥쪽에 위치한 SH3 도메인 유도체의 부분은 면역원성 모티프가 도입되지 않도록 하기 위해 가능한 많이 보존된다.
본 발명의 재조합 단백질은 포유동물, 바람직하게는, 마우스, 래트 및/또는 인간, 가장 바람직하게는 인간에서 면역원성 반응을 본질적으로 유도시키지 않는 것이 바람직하다. 물론, 본 발명의 완전한 재조합 단백질의 면역원성은 SH3 도메인 유도체 부분에 좌우될 뿐만 아니라 전체 단백질의 다른 부분에 의해서 영향받을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 적어도 재조합 단백질의 SH3 도메인 유도체 부분은 포유동물, 바람직하게는 마우스, 래트 및/또는 인간, 가장 바람직하게는 인간에서 본질적으로 비면역원성이다.
예를 들어, 당업계의 통상의 기술자는 표준 기술 및 관용 기술, 예를 들어, 관심있는 재조합 단백질 또는 이의 SH3 도메인 유도체를 마우스와 같은 포유동물에 투여(즉, 정맥내로(i.v.) 주입)하고, 면역반응이 일어나기 위한 적절한 시간이 경과된 후, 면역원성 혈액 세포 및/또는 인자(예를 들어, 인터루킨)의 반응을 분석함으로써, 재조합 단백질 또는 이의 SH3 도메인 유도체 부분의 면역원성 반응을 측정할 수 있다.
더 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 src 및 RT 루프 바깥쪽에서(outside) FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)에 대해 70% 이상 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 내지 100%의 동일성을 갖는 SH3 도메인 유도체이다.
바람직한 구체예에서, 돌연변이는 RT 루프 및 src 루프 둘 모두에 도입된다.
추가의 더 바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 단백질은 상기 SH3 도메인 유도체의 위치 37 및/또는 50에 하나 또는 바람직하게는 2개의 변형된 잔기, 바람직하게는 2개의 변형된 소수성 잔기, 더 바람직하게는 Trp37 및/또는 Tyr50, 가장 바람직하게는 Trp37 및 Tyr50을 포함한다. 하기 도 3b에서 설명된 바와 같이, 이들의 무작위화는 친화력을 증가시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)의 유도체"는 서열번호:1의 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다는 의미이다. src 및 RT 루프를 형성하는 아미노산이 서열 동일성을 결정할 때 배제된다는 것을 제외하면, 동일한 의미가 src 및 RT 루프 바깥쪽에서 FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)에 대해 70% 이상 또는 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 SH3 도메인 유도체에 대해서도 유효한 사실이다.
서열번호:1의 아미노산 서열에 대한 Fyn SH3 도메인의 유도체의 서열 동일성 정도를 결절하기 위하여, 예를 들어, SIM 국소 유사도 프로그램이 사용될 수 있는데[Xiaoquin Huang and Webb Miller, "A Time-Efficient, Linear-Space Local Similarity Algorithm." Advances in Applied Mathematics, vol. 12: 337- 357, 1991.], 상기 프로그램은 상기 문헌의 저자들 및 이들의 기관으로부터 무료로 입수할 수 있으며(http://www.expasy.org/tools/sim-prot.html을 참조바람); 다수의 정렬 분석을 위해 ClustalW가 사용될 수 있다[Thompson et al., "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.", Nucleic Acids Res., 22(22): 4673-4680, 1994.]. 바람직하게는, 서열번호:1에 대한 유도체의 서열 동일성 정도는 서열번호:1의 완전한 서열과 대비하여 결정된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 결합 단백질은 Fyn SH3 도메인의 2개 이상의 유도체를 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 2가(bivalent) 결합 단백질이다. SH3 도메인의 2개 이상의 유도체는 동일하거나 상이할 수 있다. 바람직하게는, 상기 유도체들은 동일하다.
본 발명의 결합 단백질은 해당 표적에 대하여 임의의 특이적 결합 친화력을 지니도록 디자인될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표적은 아미노산-기반 표적, 예컨대, 펩티드 또는 단백질, 더 바람직하게는 PxxP 모티프을 포함하는 표적이다. 물론, 단지 소수의 천연 및 생리학적으로 적절한 표적 단백질만이 PxxP 모티프를 함유한다. 하기 실시예는 PxxP 이외의 모티프를 지니는 표적(예를 들어, 피브로넥틴의 ED-B 도메인)에 대한 본 발명에 따른 결합 단백질이 가용하다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 결합 단백질은 결코 PxxP 모티프에만 국한되지 아니하며 임의의 주어진 표적, 예를 들어, 당, 폴리펩티드 등에 대하여 특이적 결합 친화력을 지닐 수 있다.
더 바람직하게는, 본 발명에 따른 결합 단백질은 표적, 바람직하게는 치료학적으로 및/또는 진단학적으로 적절한 표적, 더 바람직하게는 PxxP 모티프를 포함하는 아미노산-기반 표적에 대하여 10-7 내지 10-12M, 바람직하게는 10-8 내지 10-12M의 특이적 결합 친화력을 갖는다.
더 바람직한 양상에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 암태아성 피브로넥틴의 세포외 도메인(extracellular domain of oncofetal fibronectin; ED-B)에 대하여 10-7 내지 10-12M, 바람직하게는 10-8 내지 10-12M의 특이적(생체내 및/또는 생체외) 결합 친화력을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)의 하나 이상의 유도체를 포함하는 재조합 결합 단백질로서, 여기서
(a) src 루프 내의 하나 이상의 아미노산 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산, 및/또는
(b) RT 루프 내의 하나 이상의 아미노산 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산이,
치환, 결실 또는 부가되며,
상기 SH3 도메인 유도체가 서열번호:1의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 지니며,
상기 결합 단백질은 암태아성 피브로넥틴의 세포외 도메인(ED-B)에 대하여 바람직하게는 10-7 내지 10-12M, 더 바람직하게는 10-8 내지 10-12M의 특이적(생체내 및/또는 생체외) 결합 친화력을 갖는, 재조합 단백질과 관련이 있는데,
바람직하게는, 상기 재조합 결합 단백질은 서열번호:2의 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 조건으로 하며,
바람직하게는 상기 재조합 단백질은 천연 상태에 존재하는 천연 SH3 도메인 함유 단백질이 아님을 조건으로 한다.
더 바람직한 구체예에서, 상기 SH3 도메인 유도체는 src 루프 및 RT 루프 바깥쪽의 FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)에 대해 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 내지 100%의 동일성을 갖는다.
또 다른 더 바람직한 구체예에서, 상기 ED-B-특이적 결합 단백질은 SH3 도메인의 2개 이상의 유도체를 포함하는데, 바람직하게는 상기 단백질은 2가 결합 단백질이다.
바람직하게는, 상기 ED-B-특이적 결합 단백질은 SH3 도메인 유도체의 위치 37 및/또는 50에 하나 이상의, 바람직하게는 2개의, 변형된, 바람직하게는 소수성인 잔기, 특히 Trp37 및/또는 Tyr50, 가장 바람직하게는 Trp37 및 Tyr50을 지닌다.
폴리펩티드 및 단백질 표적에 대한 특이적 결합 친화력과 더불어, 본 발명의 결합 단백질은 또한 작은 유기 화합물 또는 비아미노산 기반 화합물, 예를 들어, 당, 올리고당류 또는 다당류, 지방산 등에 대한 특이적 결합 친화력을 지닐 수 있다.
다수의 항체-사이토카인 융합 단백질은 예를 들어, 관절염 또는 암 치료에 있어서 적용에 관하여 조사되었는데, 종종 인상적인 결과를 보여주었다. 예를 들어, 피브로넥틴의 ED-B 도메인(혈관신생에 대한 마커)에 특이적인 인간 항체 L19를 이용하여 향염증성(pro-inflammatory) 사이토카인(예컨대, IL-2, IL-12 또는 TNF)을 고형 종양에 전달하였는데, 이것은 때때로 놀라운 치료적 이점을 제공하였다[검토 및 상응하는 참고문헌으로서, 문헌[Neri & Bicknell, Nat. Rev. Cancer (2005) 5: 436-446]과 또한 WO 01/62298호를 참조바람].
본 발명의 결합 단백질은 이제 종래 융합 단백질에서 항체를 대체가능케 하며, 생체내 및 생체외 약제학적 적용 및 진단학적 적용을 위한 신규하고 면역원성이 더 적은 융합 단백질에 대한 디자인을 가능케한다.
제 2 양상에서, 본 발명은 약제학적으로 및/또는 진단학적으로 활성있는 성분에 융합된 본 발명의 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질과 관련이 있다.
본 발명의 융합 단백질은 예를 들어, 치료학적으로 또는 진단학적으로 적절한 라디오뉴클라이드(radionuclides)를 위한, 비-폴리펩티드 성분, 예를 들어, 비-펩티드 링커, 비-펩티드 리간드를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 활성있는 성분은 사이토카인, 바람직하게는 IL-2, IL-12, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF 베타, LT-베타, CD-40 리간드, Fas-리간드, TGF-베타, IL-1 알파 및 IL-1베타로 이루어진 군에서 선택된 사이토카인이다.
더 바람직하게는, 상기 활성있는 성분은 독성 화합물, 바람직하게는 작은 유기 화합물 또는 폴리펩티드, 바람직하게는 칼리케아미신(calicheamicin), 네오카지노스타틴(neocarzinostatin), 에스페라미신(esperamicin), 다이네미신(dynemicin), 케다르시딘(kedarcidin), 마두로펩틴(maduropeptin), 독소루비신, 다우노루비신, 아우리스타틴(auristatin), 리신-A 쇄, 모데신(modeccin), 절단된 슈도모나스 엑소톡신 A, 디프테리아 독소 및 재조합 겔로닌(gelonin)으로 이루어진 군에서 선택된 독성 화합물이다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 융합 단백질은, 상기 활성있는 성분이 케모카인, 바람직하게는 IL-8, GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MCP-1-5, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포탁틴(Lymphotactin) 및 트랙탈킨(Fractalkine)으로 이루어진 군에서 선택된 케모카인임을 특징으로 하는, 융합 단백질이다.
추가의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 결합 단백질은 인공 아미노산을 함유한다.
본 발명의 융합 단백질의 추가의 바람직한 구체예에서, 상기 활성있는 성분은 형광 염료(fluorescent dyes), 바람직하게는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 또는 Cy 염료로 이루어진 군에서 선택된 성분[Berlier et al., "Quantitative Comparison of Long-wavelength Alexa Fluor Dyes to Cy Dyes: Fluorescence of the Dyes and Their Bioconjugates", J Histochem Cytochem. 51 (12): 1699-1712, 2003.]; 광감제(photosensitizer), 바람직하게는 비스(트리에탄올아민)Sn(IV) 클로린6(SnChe6); 향응고 인자(pro-coagulant factor), 바람직하게는 조직 인자; 전구약물 활성화를 위한 효소, 바람직하게는 카르복시-펩티다아제, 글루쿠로니다아제 및 글루코시다아제로 이루어진 군에서 선택된 효소; 감마-방출 동위원소군(바람직하게는 99mTc, 123I, 111In)에서 선택되거나, 양전자 방출체(positron emitters)군(바람직하게는 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I)에서 선택되거나, 베타-방출체군(바람직하게는 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu)에서 선택되거나, 알파-방출체군(바람직하게는 213Bi, 211At)에서 선택된, 라디오뉴클라이드(radionuclide); 및/또는 기능성 Fc 도메인, 바람직하게는 인간 기능성 Fc 도메인이다.
위에서 언급된 기능성 Fc 도메인은, 예를 들어, 치료적, 예방적 및/또는 진단적 적용에 있어서, 융합 단백질의 결합 단백질 성분의 특이적 표적 결합 부위에 대한 포유동물의 면역 반응 유도를 가능하게 할 것이다.
추가의 바람직한 구체예는 혈청 반감기 조절 성분, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 면역글로불린 및 알부민-결합 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 성분을 추가로 포함하는, 위에서 언급한 것과 같은 본 발명에 따른 융합 단백질과 관련이 있다.
가장 바람직한 구체예에서, 위에서 언급한 것과 같은 본 발명의 융합 단백질은 암태아성 피브로넥틴 잉여 도메인(ED-B)에 대해 10-7 내지 10-12M, 바람직하게는 10-8 내지 10-12M의 특이적(생체내 및/또는 생체외) 결합 친화력을 지니는 본 발명의 결합 단백질을 포함한다. 바람직하게는, 상기 ED-B-특이적 결합 단백질은 SH3 도메인 유도체의 위치 37 및/또는 50에 하나 이상의, 바람직하게는 2개의 소수성 잔기, 특히, Trp37 및/또는 Tyr50, 가장 바람직하게는 Trp37 및 Tyr50을 지닌다.
본 발명에 따른 결합 단백질 및 융합 단백질은 수많은 관용기술 및 널리 공지된 기술, 예컨대 간단한 유기 합성 전략, 고체상-보조 합성 기술 또는 시중에서 구매가능한 자동화된 합성기에 의해 제조될 수 있다. 반면, 상기 결합 단백질 및 융합 단백질은 또한 관용적인 재조합 기술 단독 또는 관용적인 합성 기술과 조합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 추가 양상은 (i) 본 발명에 따른 결합 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (ii) 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, (iii) 상기 폴리뉴클레오티드 및/또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, PNA 및 이의 임의의 다른 유사체(analogues)일 수 있다. 벡터 및 숙주 세포는 본 발명의 목적, 예를 들어, 유전자 치료를 위한, 본 발명의 결합 단백질 및 융합 단백질, 치료학적으로 유용한 벡터 및 숙주 세포의 생산에 적합한 임의의 관용적인 형태일 수 있다. 통상의 기술자는 풍부한 종래 기술로부터 그러한 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포를 선별하고 정규 방법에 의해 과도한 시행착오 없이 요망되는 목적을 위한 이들의 특별한 적합성을 확인할 수 있을 것이다.
본 발명의 결합 단백질 및 융합 단백질은 포유동물에서, 특히 인간 및 마우스에서 강한 면역 반응을 유도하지 아니하며 바람직하게는 본질적으로 면역 반응을 나타내지 아니할 것인데, 이는 마우스에서 입증되었고, Fyn SH3가 상기 두 포유동물 종에서 동일하기 때문에 인간의 경우에도 유사하게 들어맞을 것으로 예상된다. 놀랍게도 천연 Fyn SH3 또는 돌연변이된 Fyn SH3 둘 모두는 상기 둘 중 어느 하나가 정맥내로(i.v.) 주입된 마우스에서 면역 반응을 초래하지 않는다는 것이 밝혀졌다. 이것은 Fyn 키나아제가 세포내 단백질이고 신생아 B 세포 선별에 참여하지 않기 때문에 예기치 못한 것이었다. 따라서, 디자인된 표적 특이성 및 친화력을 지니는 Fyn SH3-유래 결합 단백질 및 융합 단백질은 특히 생체내 치료적, 예방적 및/또는 진단적 적용에 아주 적합하다.
그러므로, 본 발명의 매우 적절한 양상은 약제 제조를 위한 본 발명에 따른 결합 단백질 또는 융합 단백질의 용도와 관련이 있다.
추가 양상에서, 본 발명의 결합 단백질 또는 융합 단백질은 진단 수단, 특히 생체내 적용을 위한 진단 수단을 제조하는데 사용된다.
바람직하게는, 위에 기재된 것과 같은 ED-B 특이적 결합 단백질 또는 융합 단백질은 암의 치료 또는 진단을 위한 약제 또는 진단 수단을 제조하는데 사용된다.
본 발명의 또 다른 양상은 본 발명의 결합 단백질 또는 융합 단백질 및 선택적으로 선택적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물과 관련이 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 진단 조성물, 바람직하게는 본 발명의 결합 단백질 또는 융합 단백질 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 진단 조성물, 바람직하게는 생체내 적용을 위한 진단 조성물과 관련이 있다.
바람직하게는, 약제 조성물 또는 진단 조성물은 본 발명의 ED-B 특이적 결합 단백질 또는 융합 단백질 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
본 발명의 생체내 적용을 위한 약제 조성물 및 진단 수단은 전형적으로 치료학적으로 또는 진단학적으로 유효한 양의 본 발명의 결합 단백질 및/또는 융합 단백질 및 선택적으로 보조 물질, 예컨대, 약제학적으로 허용되는 부형제(들)을 포함한다. 상기 약제 조성물은 약제학 분야에 널리 공지된 방식으로 제조된다. 담체 또는 부형제는 활성 성분을 위한 비히클(vehicle) 또는 매질(medium)로 역할할 수 있는 액체 물질일 수 있다. 적합한 담체 또는 부형제는 당업계에 널리 알려져 있고, 예를 들어, 안정화제, 항산화제, pH-조절 물질, 조절-방출 부형제를 포함한다. 본 발명의 약제 제조물(preparation)은, 예를 들어, 비경구용으로 적합화될 것이며 용액 또는 이와 유사한 형태로 환자에 투여될 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 또 다른 양상은 치료 또는 진단 방법에 관심이 있는데, 여기서 유효한 양의 상기 약제 조성물 또는 진단 조성물은 이러한 조성물의 투여가 필요한 환자, 바람직하게는 암 및/또는 염증성 질환을 앓고 있거나 상기 암 및/또는 염증성 질환을 앓고 있는 것으로 의심이 되는 환자에게 투여된다.
질병을 앓고 있는 피검체의 치료 또는 진단을 실행함에 있어서, 본 발명의 결합 단백질 또는 융합 단백질은, 경구 또는 비경구 경로를 포함하여, 치료 또는 진단 화합물을 유효한 양으로 생체에서 가용하게 만드는 임의의 형태 또는 양상으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 피하로, 근내로, 정맥내로, 기타 경로로 투여될 수 있다. 제형을 제조하는 분야에서 당업계의 통상의 기술자는 선택된 생성물의 특별한 특성, 치료 또는 진단된 질병 또는 병태, 질병 또는 병태의 단계 및 기타 적절한 환경에 따라 적절한 투여 형태 및 양상을 용이하게 선택할 수 있다(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)]을 참조바람). 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 조합하여 약제 제조물 또는 진단 제조물 형태로 또는 단독으로 투여될 수 있는데, 상기 조성물의 비율 및 특성은 선택된 생성물의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여 경로 및 표준 약제 및 진단 관행에 의해 결정된다. 본 발명의 생성물은, 그 자체로 효과적이나, 안정성, 결정화의 편이성, 증가된 용해성 등의 목적을 위해, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 예컨대, 산 부가 염 또는 염기 부가 염의 형태로 제형화되고 투여될 수 있다.
도 1은 도트 블랏 분석을 도시한다. 검출가능한 양의 가용성 Fyn SH3 돌연변이체를 발현하는 클론의 백분율을 검출 시약으로서 항-HIS-HRP 항체 컨주게이트(Sigma)를 사용하여 박테리아 세포 용해물(lysates)에 대한 도트 블랏 분석으로 결정하였다. 퍼옥시다아제 활성을 ECL + 웨스턴 블랏팅 검출 시스템(Amersham)을 사용하여 검출하였다.
A) 무작위화된 RT-Src-루프를 지닌 FynSH3 돌연변이체.
B) 신장(4->6) 및 무작위화된 n-Src-루프를 지닌 FynSH3 돌연변이체.
C) RT- 및 n-Src 무작위화된 루프를 지닌 FynSH3.
도 2는 모노클로날 파지-ELISA를 도시한다. Fyn SH3 돌연변이체를 디스플레이하는 파지를 함유한 MSA 모노클로날 박테리아 상청액에 대한 3 라운드의 패닝(panning)후, MSA(100 μg/ml, 밤새, 웰당 100 μl)로 코팅된 MaxiSorp 플레이 트(Nunc)를 사용한 ELISA로 시험하였다. 결합된 파지를 항-M-13-HRP 항체 컨주게이트(Amersham)를 사용하여 검출하였다.
도 3은 MSA(100 μg/ml, 밤새, 웰당 100 μl)로 코팅된 MaxiSorp 플레이트(Nunc)를 사용한 1 라운드의 친화력 성숙 선별후 (MSA에 대한) 모노클로날 파지-ELISA를 도시한다.
A) G4의 제 1 서브라이브러리(무작위화된 n-Src 루프 및 Trp37 및 Tyr50)에 대한 파지 ELISA. 모(Parental) 클론 G4는 화살표로 표시되어 있다.
B) G4의 제 2 서브라이브러리(무작위화 및 신장된 n-Src 루프)에 대한 파지 ELISA. 모 클론 G4는 화살표로 표시되어 있다.
C) 긴 koff를 지니는 결합제를 선호하는 조건하에서 수행된, 1 라운드의 패닝후 제 1 및 제 2 서브라이브러리에 대한 파지 ELISA. 모 클론 G4는 화살표로 표시되어 있다.
도 4는 제조업자의 사용설명서(Qiagen, 천연 조건)에 따라서, 가용성 단백질의 클로닝(pQE-12 벡터), 발현 및 정제후, 수개의 MSA 결합 클론에 대한 가용성(soluble) ELISA[MSA(100 μg/ml 밤새, 웰당 100 μl)로 코팅된 MaxiSorp 플레이트(Nunc)를 사용함]를 보여준다. 항-HIS-HRP 항체 컨주게이트를 검출 시약으로 사용하였다. 대조군으로서, 동일한 결합 단백질을 4% MPBS 만으로 블록킹된 웰에 첨가하였다.
도 5는 가용성 단백질의 특이성 ELISA를 보여준다. 선별된 MSA 결합 Fyn SH3 돌연변이체를 상이한 알부민(각각 100 μg/ml 밤새, 웰당 100 μl)으로 코팅시킨 MaxiSorp 플레이트(Nunc)를 사용하여 인간 혈청 알부민(HSA), 래트 혈청 알부민(RSA), 우 혈청 알부민(BSA) 및 오발부민(ovalbumin)에 대한 결합에 대해 시험하였다.
도 6은 D3에 대한 BIACore 분석을 보여준다. 사용된 농도: 4, 2, 1, 및 0,5 μM(위에서부터).
도 7은 뮤린 항체 존재하에서 혈액 샘플에 대한 ELISA 분석을 보여준다.
A) MaxiSorp 플레이트(Nunc)를 Fyn SH3(20 μg/ml 밤새, 웰당 100 μl)로 코팅시켰다. 5마리 마우스 각각의 혈액 샘플(75-200 μl의 범위)을 희석액 시리즈에 적용하였다(1:4에서 1:100까지). 항체 검출을 항-마우스-IgG-HRP 항체 컨주게이트(Sigma)를 사용하여 실행하였다. 코팅 효율에 대한 대조군으로서 항-HIS-HRP-컨주게이트(Sigma)를 사용하였다.
B) MaxiSorp 플레이트(Nunc)를 Fyn SH3 D3(20 μg/ml 밤새, 웰당 100 μl)로 코팅시켰다. 5마리 마우스 각각의 혈액 샘플(75-200 μl의 범위)을 희석액 시리즈에 적용하였다(1:4에서 1:100까지). 항체 검출을 항-마우스-IgG-HRP 항체 컨주게이트(Sigma)를 사용하여 실행하였다. 코팅 효율에 대한 대조군으로서 항-HIS-HRP-컨주게이트(Sigma)를 사용하였다.
C) MaxiSorp 플레이트(Nunc)를 scFv(60 μg/ml 밤새, 웰당 100 μl)로 코팅시켰다. 4마리 마우스 각각의 혈액 샘플(75-200 μl의 범위)을 희석액 시리즈에 적용하였다(1:4에서 1:100까지). 항체 검출을 항-마우스-IgG-HRP 항체 컨주게이 트(Sigma)를 사용하여 실행하였다. 코팅 효율에 대한 대조군으로서 항-myc-HRP-컨주게이트(Roche)를 사용하였다.
도 8은 F9 뮤린 기형암종(teratocarcinoma) 조직 절편에 대한 D3(도 8a), 대응되는 음성 대조군(도 8b), 항-CD31 염색(도 8c) 및 대응하는 음성 대조군(도 8d)의 면역형광을 보여준다.
도 9는 Fyn SH3-D3의 종양 유지(도 9a)를 보여주며, 한편 Fyn SH3wt의 경우 축적은 관찰할 수 없었다(도 9b). 표적화 결과는 조직 g당 유지된 125I-표지 단백질의 주입된 투여량 비율(%)[%ID/g]로 표현된다.
하기에서, 본 발명의 주제가, 본 발명의 범위를 제한하려는 것으로 해석되도록 의도된 것이 아닌, 특정 구체예를 참조하여 더 상세히 기술될 것이다.
실시예 1: Fyn SH3 돌연변이체의 발현
Fyn SH3의 돌연변이체의 발현을 평가하기 위한 목적으로, 3개의 상이한 Fyn SH3 서브라이브러리에 대한 도트 블랏 분석을 실행하였다(도 1): 제 1 라이브러리에서 RT-루프만이 무작위화되었고, 제 2 라이브러리에서 Src 루프가 무작위화되고 6개의 잔기까지 신장되었으며, 제 3 라이브러리에서 RT 루프 및 Src 루프가 동시에 무작위화되었는데, Src 루프는 잔기 4개에서 6개까지 신장되었다. 발현된 Fyn SH3 돌연변이체의 비율은 59 내지 90%이었다.
실시예 2: 마우스 혈청 알부민에 대한 파지 디스플레이 선별
107개의 상이한 Fyn SH3의 라이브러리를 제조하고(단지 RT-루프만 무작위화시켰음) 파지미드 벡터 pHEN1에 클로닝하였다[Hoogenboom et al. "Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains", Nucleic Acids Res, 19(15):4133-7, 1991]. 라이브러리를 파지에 디스플레이하고 3라운드의 패닝을 마우스 혈청 알부민(MSA)에 대하여 실행하였다. 제 3라운드 실행후, 모노클로날 파지-ELISA에 의한 결합 단백질에 대한 스크리닝을 실행하였다; 13개의 양성 클론이 검출되었다(도 2). 상기 13개의 클론에 대한 서열분석은, G4와 C4로 명명된, 2개의 상이한 서열이 풍부하게 존재함을 밝혀내었다.
그러나, pQE-12 벡터(Qiagen)로 서브클로닝 및 G4를 발현시킨 후(천연 조건하에서 제조업자의 핸드북에 따라 발현 및 정제), MSA에 대한 상기 단백질의 결합은 낮은 친화력으로 인해(파지 ELISA는 가용성 단백질의 ELISA 보다 더 민감함) ELISA로 검출불가능하였다(도 4). 따라서, 2개의 상이한 친화력 성숙 라이브러리를 위해 G4의 서열을 사용하였다(크기: 각 라이브리리에 대해 107개 클론). 제 1 라이브러리에서, n-Src 루프의 4개의 잔기 및 잔기 Trp37(서열번호:1) 및 Tyr50(서열번호:1)를 무작위화시켰고, 제 2 라이브러리에서, n-Src 루프는 4개에서 6개의 무작위화된 잔기로 신장되었다. 1라운드의 패닝후, 두 서브라이브러리의 수개의 클론은 모 클론 G4보다 파지 ELISA에서 더 강한 신호를 나타내었다(도 3). 수개의 클론의 서브클로닝 및 상기 클론의 발현후, ELISA로 가용성 단백질의 결합을 확인하였다(도 4). 겉보기 해리 상수(Apparent dissociation constants)가 100 nM의 범위로 존재하였다(BIAcore로 측정됨). 클론 중 일부는 다른 혈청 알부민과 교차반응하였다(시험된 혈청 알부민: 인간 혈청 알부민 (HSA), 래트 혈청 알부민 (RSA), 우 혈청 알부민 (BSA) 및 오발부민), 반면 다른 클론들은 MSA에 매우 특이적이었는데, 이는 고 특이적 결합 단백질을 분리할 수 있다는 것을 제시한다(도 5).
실시예 3: 피브로넥틴의 잉여 도메인 B(ED-B)에 대한 파지 디스플레이 선별
ED-B를 약제학적으로 적절한 단백질에 대한 Fyn SH3 유래 결합제를 선별할 수 있는 활성을 입증하기 위해 표적 단백질로서 선택하였다. ED-B는 조직 리모델링이 일어날 때마다 1차 전사체 수준에서 선택적인 스플라이싱 메카니즘에 의해 피브로넥틴 분자내로 삽입되는 91개의 아미노산으로 구성된 타입 III 상동성 도메인이다[Zardi et al., "Transformed human cells produce a new fibronectin isoform by preferential alternative splicing of a previously unobserved exon." Embo J. 6(8): 2337-42, 1987]. ED-B는 다양한 고형 종양(예를 들어, 신세포 암종, 결장직장 암종, 간세포 암종, 악성성상세포종(High-grade astrocytoma), 뇌 및 목 종 양, 방광암 등)에서 과발현되나, 사실상 정상 성인 조직(증식기의 자궁내막(endometrium) 및 난소에서의 일부 혈관은 배제됨)에서는 검출불가능한 혈관신생에 관한 양호한 품질의 마커이다. (표적으로서 ED-B에 관한 보다 상세한 내용에 대해서는, 문헌[Menrad and Menssen, "ED-B fibronectin as a target for antibody-based cancer treatments." Expert Opin. Ther. Targets 9(3): 491-500, 2005]을 참조하라).
10억개 이상의 Fyn SH3 돌연변이체의 라이브러리를 제조하고 파지에 디스플레이시켰다(RT-Src 및 n-Src 루프의 동시 무작위화). ED-B에 대한 3라운드의 패닝후, 3개의 결합 클론은 파지 ELISA로 확인하였다. 서열분석은 2개의 상이한 서열을 드러내었다(B11 및 D3로 명명된 클론). D3의 해리 상수를 BIAcore3000 장치를 이용하여 표면 플라스몬 공명 실시간 상호작용 분석으로 결정하였고 값은 8.5 x 10-8M으로 나타났다(도 6).
D3(서열번호: 3)
실시예 4: 면역원성
단백질의 면역원성은 단백질-관련 치료에서, 특히 약물의 반복 투여를 포함하는 치료의 경우에 주요한 결점 중의 하나이다. 마우스 및 인간에서 Fyn SH3 서열의 보존으로 인해, FynSH3 야생형 단백질(Fyn SH3wt) 및 Fyn SH3 돌연변이체(Fyn SH3D3, ED-B에 대한 결합제)의 면역원성 잠재능(potential)을 2개의 단백질을 반복 적으로 5마리의 마우스에 주입함으로써 생체내에서 조사하였다. 마우스에게 20μg 의 단백질을 4회 주입하였다(매 3일 마다). 4회째 주입후 1일째에, 마우스를 희생시키고 뮤린 항-Fyn SH3wt 및 항-Fyn SH3D3 항체의 존재 또는 부재를 시험하기 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 양성 대조군으로써, 4마리의 마우스에서 단일 쇄 Fv 형태(scFv)의 인간 항체를 주입하였다(동일한 주입 시점 및 동일한 투여량(= 60 μg)). 그러나, scFv 군의 마우스 1마리는 3번째 주입후 20분 경과시 죽었고 나머지 3마리는 거의 죽음에 이르렀으며, 그래서 혈액 샘플을 상기 3회째 주입 후 미리 채취하였다. 도 7a 및 b는 Fyn SH3wt 및 Fyn SH3D3에 대한 검출가능한 항체가 존재하지 않으며, 반면 강한 신호가 대조군에서 관찰되었음을 입증한다(도 7c).
실시예 5: 면역조직형광
Fyn SH3-D3(D3, ED-B에 대한 결합제)가 조직내에서 천연 형태의 이의 표적을 인지하는지 여부를 조사하기 위해, F9 기형종 절편에 대한 면역형광을 실행하였다. 도 8은 D3가 혈관 주위의 종양 기질(stroma)에 결합함을 보여준다(도 8a). 검출을 항-His-Alexa488 항체 컨주게이트로 실행하였다. 음성 대조군에서, D3 단백질은 첨가되지 않았다(도 8b). 혈관을 가시화시키기 위해, 동일한 절편을 래트 항-마우스-CD31 항체로 동시-염색하고, 2차 항체로 당나귀 항-래트 Alexa594 컨주게이트를 사용하였다(도 8c). 1차 항체 없이 2차 항체를 사용하여 음성 대조를 실시하였다(도 8d).
실시예 6: 생체내 정량적 생체분포(biodistribution)
Fyn SH3-D3 (ED-B에 대한 결합제) 및 Fyn SH3 야생형(ED-B에 대한 비결합제) 의 생체내 표적화 성능을 피하로(s.c.) 이식된 F9 뮤린 기형종을 지니는 마우스에서 생체분포 실험으로 평가하였다. 마우스와 인간에서 ED-B는 동일하기 때문에, 종양 표적화 연구의 결과는 인간에서의 D3 성능을 예견할 수 있게 한다. 125I-표지된 D3 및 SH3wt를 정맥내(i.v.)로 주입하고 24시간 경과후, 동물을 희생시키고, 기관을 적출하고, 계량하고, 방사능(radioactivity)을 계수하였다. 도 9a는 D3가 선택적으로 종양내에 축적되며(종양:기관의 비는 3:1 내지 10:1임), 한편, Fyn SH3 야생형 단백질의 경우 농축(enrichment)을 관찰할 수 없었음을 보여준다(도 9b).
SEQUENCE LISTING
<110> Eidgenoessische Technische Hochschule Zuerich
<120> Specific and high affinity binding proteins comprising modified
SH3 domains of FYN kinase
<130> 50027PCT
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 63
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Arg Thr Glu
1 5 10 15
Asp Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Glu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr
35 40 45
Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210> 2
<211> 63
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<233> Variant of SH3 domain of Fyn kinase with high affinity to HIV-1 Nef protein
<400> 2
Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr Glu Ala Ile Thr Glu
1 5 10 15
Asp Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Glu Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly Glu Thr
35 40 45
Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile Gln
50 55 60
<210> 3
<211> 65
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant of SH3 domain of Fyn kinase with high affinity to ED-B
domain of fibronectin
<400> 3
Gly Val Thr Leu Phe Val Ala Leu Tyr Asp Tyr His Ala Gln Ser Gly
1 5 10 15
Ala Asp Leu Ser Phe His Lys Gly Glu Lys Phe Gln Ile Leu Lys Phe
20 25 30
Gly Arg Gly Lys Gly Asp Trp Trp Glu Ala Arg Ser Leu Thr Thr Gly
35 40 45
Glu Thr Gly Tyr Ile Pro Ser Asn Tyr Val Ala Pro Val Asp Ser Ile
50 55 60
Gln
65
Claims (16)
- FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)의 하나 이상의 유도체를 포함하는, 재조합 결합 단백질로서,(a) src 루프 내의 하나 이상의 아미노산 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산, 및/또는(b) RT 루프 내의 하나 이상의 아미노산 또는 상기 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산이,치환, 결실 또는 부가되며,상기 SH3 도메인 유도체가 상기 src 및 RT 루프 바깥쪽에서(outside) 상기 FYN 키나아제의 Src 상동성 3 도메인(SH3)과 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 내지 100%의 서열 동일성을 가지며, 바람직하게는 상기 재조합 단백질이 천연 상태에 존재하는 천연 SH3 도메인 함유 단백질이 아님을 조건으로 하는, 재조합 결합 단백질.
- 제 1항에 있어서, 상기 SH3 도메인의 2개 이상의 유도체, 바람직하게는 2가(bivalent) 결합 단백질을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 SH3 도메인 유도체의 위치 37 및/또는 50에 하나 또는 바람직하게는 2개의 변형된 잔기, 바람직하게는 2개의 변형된 소수 성 잔기, 더 바람직하게는 Trp37 및/또는 Tyr50, 가장 바람직하게는 Trp37 및 Tyr50을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 암태아성 피브로넥틴의 세포외 도메인(extracellular domain of oncofetal fibronectin; ED-B)에 대해 10-7 내지 10-12M, 바람직하게는 10-8 내지 10-12M의 특이적 결합 친화력을 갖는, 재조합 결합 단백질.
- 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호:3의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
- 약제학적으로 및/또는 진단학적으로 활성있는 성분에 융합된 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질.
- 제 6항에 있어서, 상기 성분이 하기 물질들로 이루어진 군에서 선택되는, 융합 단백질:(i) 사이토카인, 바람직하게는 IL-2, IL-12, TNF-알파, IFN 알파, IFN 베타, IFN 감마, IL-10, IL-15, IL-24, GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, LIF, CD80, B70, TNF 베타, LT-베타, CD-40 리간드, Fas-리간드, TGF-베타, IL-1 알파 및 IL-1베타로 이루어진 군에서 선택된 사이토카인;(ii) 독성 화합물, 바람직하게는 작은 유기 화합물 또는 폴리펩티드, 바람직하게는 칼리케아미신(calicheamicin), 네오카지노스타틴(neocarzinostatin), 에스페라미신(esperamicin), 다이네미신(dynemicin), 케다르시딘(kedarcidin), 마두로펩틴(maduropeptin), 독소루비신, 다우노루비신, 아우리스타틴(auristatin), 리신-A 쇄, 모데신(modeccin), 절단된 슈도모나스(Pseudomonas) 엑소톡신 A, 디프테리아 독소 및 재조합 겔로닌(gelonin)으로 이루어진 군에서 선택된 독성 화합물;(iii) 케모카인, 바람직하게는 IL-8, GRO 알파, GRO 베타, GRO 감마, ENA-78, LDGF-PBP, GCP-2, PF4, Mig, IP-10, SDF-1 알파/베타, BUNZO/STRC33, I-TAC, BLC/BCA-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, MDC, TECK, TARC, RANTES, HCC-1, HCC-4, DC-CK1, MIP-3 알파, MIP-3 베타, MCP-1-5, 에오탁신(Eotaxin), 에오탁신-2, I-309, MPIF-1, 6Ckine, CTACK, MEC, 림포탁틴(Lymphotactin) 및 트랙탈킨(Fractalkine)으로 이루어진 군에서 선택된 케모카인;(iv) 형광 염료(fluorescent dyes), 바람직하게는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 또는 Cy 염료 중에서 선택된 성분;(v) 광감제(photosensitizer), 바람직하게는 비스(트리에탄올아민)Sn(IV) 클로린6(SnChe6);(vi) 향응고 인자(pro-coagulant factor), 바람직하게는 조직 인자;(vii) 전구약물 활성화를 위한 효소, 바람직하게는 카르복시-펩티다아제, 글 루쿠로니다아제 및 글루코시다아제로 이루어진 군에서 선택된 효소;(vii) 감마-방출 동위원소군(바람직하게는 99mTc, 123I, 111In)에서 선택되거나, 양전자 방출체(positron emitters)군(바람직하게는 18F, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I)에서 선택되거나, 베타-방출체군(바람직하게는 131I, 90Y, 177Lu, 67Cu)에서 선택되거나, 알파-방출체군(바람직하게는 213Bi, 211At)에서 선택된, 라디오뉴클라이드(radionuclide); 및(viii) 기능성 Fc 도메인, 바람직하게는 인간 기능성 Fc 도메인.
- 제 6항 내지 제 7항에 있어서, 혈청 반감기 조절 성분, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 면역글로불린 및 알부민-결합 펩티드로 이루어진 군에서 선택된 성분을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
- 제 6항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 제 5항 또는 제 6항에 따른 결합 단백질을 포함하는, 융합 단백질.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 10항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제 10항에 따른 폴리뉴클레오티드 및/또는 제 11항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
- 약제 또는 진단 수단, 바람직하게는 암 치료를 위한 약제 또는 암 진단을 위한 진단 수단을 제조하기 위한 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질 또는 융합 단백질의 용도.
- 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질 또는 융합 단백질 및 임의로 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물 또는 진단 조성물.
- (i) 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 단계로서, 바람직하게는 src 루프내 또는 이 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 동시 무작위화(simultaneous randomization) 및 RT 루프내 또는 이 루프에 인접한 아미노산 2개까지의 위치에 존재하는 하나 이상의 아미노산의 무작위 치환, 결실 또는 부가에 의해, 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 단계,(ii) 상기 결합 단백질을 발현하는, 라이브러리, 바람직하게는 파지 디스플 레이 라이브러리를 생성시키는 단계,(iii) 임의로 상기 라이브러리에 대해 선별 스크리닝(selection screening)을 실행하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 따른 결합 단백질을 포함하는, 라이브러리 생산 방법.
- 제 17항의 방법에 의해 획득된, 바람직하게는 10억개가 넘는 결합 단백질을 포함하는 라이브러리.
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