CN105907760A - 靶向沉默TKS4的shRNA - Google Patents

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何潇潇
朱筱娟
周雪
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Northeastern University China
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid

Abstract

本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默TKS4的shRNA。首先是根据鼠源的TKS4序列设计出19bp的shRNA片段，所合成片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pLL3.7载体上，形成核心的沉默载体，转化后，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。鉴定正确的载体，进行DNA测序，随后通过免疫印记实验进行沉默效率的检测。能够靶向鼠源TKS4的19bp的shRNA，序列为 GCAAAGAGTCCATCATCAA。

Description

靶向沉默TKS4的shRNA
技术领域
本发明属于生物工程中的DNA重组技术领域，具体涉及特异性靶向沉默TKS4的shRNA。
背景技术
Frank-Ter Haar syndrome (FTHS)，是一种罕见的常染色体隐性遗传病,患者存在许多异常,如短头畸形、前额突出、眼睛突出且眼距较宽、先天性巨大角膜、青光眼、先天性心脏缺损、脊柱后侧凸、骨骼发育不良、发育迟缓等，有人认为患病都还存在轻度的认知缺陷。后经证实，这种疾病是由TKS4基因突变引起的。TKS4包括一个PX结构域和四个SH3结构域。它是Src酪氨酸激酶的底物，有一系列富含脯氨酸的序列。文献中报告TKS4定位在足体，可影响F-actin在足体的定位
自发现以来，TKS4在脑中的作用并未被大量研究，TKS4在胚胎发育阶段的大脑及神经元中大量表达，实验发现，TKS4可能影响了胚胎发育过程中神经元的迁移过程。所以特异性的沉默TKS4对研究其在神经***中的作用至关重要。
发明内容
本发明的目的是合成特定靶向沉默TKS4的shRNA，为更加深入的研究TKS4以及其在细胞信号转导和细胞运动中的作用提供了有效的手段。
本发明中所需要主要构建的是TKS4的沉默载体。核心沉默载体构建分为两个大的步骤，首先是根据鼠源的TKS4序列设计出19bp的shRNA片段，所合成片段两端带有合适的酶切位点，将目的片段连接到pLL3.7载体上，形成核心的沉默载体，转化后，挑取阳性克隆进行PCR鉴定。鉴定正确的载体，进行DNA测序，随后通过免疫印记实验进行沉默效率的检测。
本发明中设计合成了一个能够靶向鼠源TKS4的19bp的shRNA，序列为GCAAAGAGTCCATCATCAA。
能够特异性沉默TKS4的表达载体的构建包括以下步骤：
第一步，shRNA片段序列设计
根据鼠源TKS4基因序列应用相应的软件设计特异性识别TKS4的序列。
第二步，双链shRNA片段的人工合成
将人工合成的两条Sense和Antisense通过变性、退火形成双链DNA。
第三步，沉默载体的构建
将沉默载体pLL3.7双酶切后, 利用回收试剂盒回收线性化载体，将回收片段与退火所得的shRNA片段进行连接、转化、鉴定阳性克隆、测序得到构建成功的沉默载体。
第四步，沉默靶蛋白效率的检测
提取质粒，转染细胞后提取蛋白，利用免疫印迹检测沉默效率。
附图说明：
图1为pLL3.7载体双酶切凝胶电泳图；
图2为TKS4 shRNA菌液PCR结果凝胶电泳图，框中为阳性结果；
图3为外源检测TKS4shRNA沉默效率图。
本发明中设计合成的19bp的shRNA片段，能够特异性的沉默TKS4。经研究表明，TKS4主要分布于细胞足体部位，在细胞运动过程中发挥重要作用。同时个体发育过程中，如缺少TKS4蛋白，将导致严重疾病。因此，TKS4沉默载体的应用能够更为精细的研究其在个体发育及细胞运动过程中的功能，为解释相关机制提供理论基础。
具体实施方式
实施例一: 特异性沉默靶标蛋白TKS4的表达载体构建
1、特异性沉默靶蛋白TKS4的序列设计
（1）根据鼠源TKS4基因特征设计沉默序列，设计的原则：19bp的特异性结合TKS4的序列的GC含量为45%-55%，退火温度45℃-65℃，同时要求序列起始的第一个碱基为G。将选取的片段进行BLAST人基因组比对，选择特异性序列。
（2）以HpaⅠ- GN18-TT-loop- 81NC-XhoⅠ 形式合成一段59bp序列，81NC为N G18的反向互补，5’端为HpaⅠ 酶切位点，3’端为XhoⅠ 酶切位点。设计合成的片段分别靶向TKS4的cDNA序列1574-1592 （TKS4 shRNA1574）
2、靶向沉默TKS4 的shRNA序列的合成与储存
（1）将合成的两段Oligo利用退火buffer溶解至50 µM，各取10µl混合。
（2）95 ℃变性4min，72 ℃退火10min，之后可以放在4℃保存。
（3）取出混匀，放在冰上备用，或者-20 ℃长期保存。
3、 沉默载体pLL3.7- TKS4的构建
（1）取2µg pLL3.7载体，HpaⅠ和XhoⅠ双酶切，电泳，回收线性pLL3.7大片段【图1】
（2）连接和转化。将线性化pLL3.7浓度稀释至100ng/µ，连接反应（Promege公司的T4DNA 连接酶）
4℃过夜连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布在具有Kan抗性的LB平板上。
（3）阳性克隆鉴定。在转化平板上挑取单克隆摇菌，试剂盒提取质粒，通过PCR鉴定阳性克隆【图2】。鉴定引物为pLL3.7 test-F：5’-GCACAGACTTGTGGGAGAAG-3’，pLL3.7 test-R:5’CCTGCTGGAATCTCGTGAA-3’。以U6启动子为测序引物，送北京华大基因测序。
实施例二:
沉默靶蛋白效率的检测
（1） 将control以及 TKS4 shRNAs通过电转染进入神经元中。
（2）提取细胞总蛋白，利用Western blot免疫印迹分析，转入TKS4沉默载体后，TKS4表达量显著降低，α-Tubulin为内参【图3】。
序列表
<110>东北师范大学
<120>靶向沉默TKS4的shRNA
<141> 2015-12-22
<160>19
<210> 2
<211> 19
<212>
<213>人工序列
<220>
<221> misc_RNA
<222> (1)...(19)
<223>
<400> 1
GCAAAGAGTCCATCATCAA。

Claims (1)

1.靶向沉默TKS4的shRNA，其特征是：序列为 GCAAAGAGTCCATCATCAA。
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