KR20090046425A - 천마 추출물을 함유하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는치료용 조성물 - Google Patents
천마 추출물을 함유하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 위 손상 보호 효과를 가지는 천마(天麻, Gastrodia elata Blume) 추출물을 유효성분으로 함유하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 천마 추출물은 침수성 스트레스 유발로 인한 위 점막 세포의 손상을 보호하고, 염증 유발 인자인 산화질소의 합성을 억제하여 위염 또는 위궤양 억제 효과를 나타내므로 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료에 유용하다.
천마, 침수성 스트레스, 산화질소, 산화질소 합성효소, 위염, 위궤양
Description
본 발명은 위 손상 보호 효과를 가지는 천마(天麻, Gastrodia elata Blume) 추출물을 유효성분으로 함유하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증에 관여하는 물질로는 세로토닌(serotonin; hydroxytryptamine, 5-HT), 키닌(kinins), 히스타민(histamine), 프로스타글란딘(prostaglandins), 류코트리엔(leukotrienes, LTs), 혈소판 활성인자(platelet-activation factor, PAF), 사이토카인(cytokine), 산소 대사산물(oxygen metabolites) 및 산화질소(nitric oxide, NO) 등이 있는데, 이들이 자극시 활성화 되어 상호작용을 통해 염증 반응이 일어나게 된다.
산화질소는 신경계의 약리학적 전달자로서 뿐만 아니라, 염증 반응, 면역계 및 세포 독성 이외에도 세포의 분화나 세포내 신호 전달 등의 중요한 조절 물질로 알려져 있다.
산화질소를 합성하는 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)는 구성적 산화질소 합성효소(constitutive nitric oxide synthase, cNOS) 및 유도성 산화 질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 두 가지로 분류된다.
구성적 산화질소 합성효소의 이성체는 내피세포성 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)와 뉴론성 산화질소 합성효소(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)를 포함하는데, 내피세포성 산화질소 합성효소는 내피세포 및 혈소판에서 혈관항상성을 조절하고(Nishida, K. et al ., J. Clin . Invest ., 90:2092, 1992), 뉴론성 산화질소 합성효소는 중추신경체계와 말초신경체계에서 신경전달물질과 같이 작용하는 산화질소를 생성한다 (Moncada, S. et al ., Pharmacol . Rev ., 49:137, 1997). 유도성 산화질소 합성효소의 이성체는 대식세포, 간세포, 활면혈관근육, 호중성 백혈구 및 내피세포에 위치한 칼슘 의존 효소이다 (Anggard, E. et al., Lancet , 343:1199, 1994).
이 중 자극인자에 의해 마크로파지(macropharge)에서 유도되는 유도성 산화질소 합성효소로 인한 다량의 산화질소는 혈관투과성, 부종 등 염증 반응을 야기하거나 COX(cyclooxygenase)의 활성을 촉진시켜 프로스타글란딘 등 염증 매개체의 생합성으로 인한 염증 반응을 심화시키는 작용을 하게 된다. 이와 같은 산화질소 생성 저해는 항염증제의 매커니즘을 규명하는데 의의가 있다.
보통 위벽은 위장에서 생성된 수소이온과 다른 유독한 물질로부터 점막을 보 호하는데, 이러한 위벽의 기능은 위 손상에 의해 방해를 받게 된다 (Konturek, P.C. et al ., J. Physiol . Pharmacol., 48:3, 1997). 위의 미세 환경은 위의 보호 장벽에서 주요한 기능을 담당하고 있는데, 위 점막질 관류 방해는 위궤양이나 위 손상을 유도하고, 급기야는 위 출혈로 발전하게 된다 (Brzozowski, T. et al ., J. Physiol . Pharmacol., 52:583, 2001). 위 출혈은 대표적으로 프로스타글란딘과 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 신호전달물질에 의해 조절된다 (Pawlik, M. et al ., J. Physiol . Pharmacol ., 52:569, 2001).
위염 및 위궤양은 위 속에 기생하는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 균의 감염에 의하여 생기거나, 위장관을 헐게 만드는 인자인 위산 및 펩신(pepsin)의 영향과 이들로부터 위벽을 보호하는 방어인자인 점막(mucosa)의 기능 간에 평형이 깨어짐으로써 일어난다. 또한, 비스테로이드성 소염 진통제(non steroidal anti-inflammatory drug)를 비롯한 상당수의 약물들은 위장관 출혈 등의 부작용을 일으키기 때문에 위염 및 위궤양 등을 일으키는 주요 요인으로 꼽히고 있다.
따라서, 위염이나 위궤양 치료를 위해서는 그 원인에 따라 헬리코박터 파일로리 균을 억제하는 항생제를 투여하거나 위산 분비를 억제하는 약물을 투여해야 하며, 이 두 가지 요법을 동시에 쓰는 경우도 많다. 지금까지 개발된 위염, 위궤양 치료제는 위에서 분비되는 산을 제거하거나 낮추는 작용을 하며 기작이 매우 다양하다.
이 중 소화기에 감염되는 헬리코박터 파일로리 균을 제균(齊均)하기 위해 항 균제를 중심으로 한 여러 가지 약제가 시도되고 있다. 예를 들면, 콜로이드성 차(次) 구연산 비스무트, 차 살리실산 비스무트 등의 비스무트 제제, 아목시실린, 암피실린, 클라리스로마이신, 오플록사신, 테트라사이클린 등의 항균제, 타티타졸, 메트로니타졸 등의 항원충제를 수소이온 운반체(Proton pump)의 저해제와 단독으로 혹은 둘 내지 세 가지의 약제를 조합하여 투여하는 것이 시도되고 있다.
반면에 위장 장애의 치료에 가장 오래 전부터 이용되어 온 약물은 제산제(antacid)이다. 위에서 분비되는 위산을 직접 중화시켜 위장을 보호하고 속쓰림을 제거하는 역할을 하기 때문에 증상에 대한 효과는 가장 빠르게 나타난다. 가장 대표적인 약물은 수산화알루미늄이나 수산화마그네슘의 혼합물을 현탁액으로 제조한 것이며, 탄산수소나트륨 등을 포함하는 드링크제도 시장에 나와 있다. 하지만 제산제는 위산이 나오는 것을 막지 못하고, 이미 분비된 위산을 잠깐 동안 중화시켜주는 역할을 하기 때문에 소화액이 과다하게 분비되는 시간 동안에는 한밤 중이나 새벽 등 시간대를 막론하고 계속 투여해야 하는 단점이 있고, 변비, 설사, 요로 결석증 등의 부작용을 유발할 수 있다. 따라서, 보다 근본적으로 위산의 분비를 막을 수 있는 약물이 요구되어 이후 아세틸콜린 수용체 억제제 및 프로스타글란딘 수용체 활성 약물 등이 개발되었다. 하지만 이들은 혈액 내 및 말초신경계에 두루 작용할 수 있기 때문에 위장관이 아닌 다른 신경세포에 작용하여 부작용을 나타내어 널리 쓰이지는 못하고 있다.
한편, 소화성 궤양 치료제가 다양한 계열의 약물로 개발되어 있으며, 각각의 약물을 이용한 여러 치료 전략이 제시될 수 있음에도 불구하고 이들이 근본적으로 소화성 궤양의 상처 부분을 아물게 하는 직접적인 치유 효과를 보이는 것은 아니다.
이들 약물은 위산으로부터의 공격을 억제하여 상처를 악화시키지 않게 유지하는 역할만을 담당할 뿐, 궤양의 소멸은 결국 인체의 자연치유력에 의존할 수 밖에 없다.
소화성 궤양의 치료에는 상당히 오랜 시간동안의 약물 투여가 요구되며, 따라서, 약물 투여로 인한 단기적 급성 독성 뿐만 아니라 만성 독성 및 그로 인한 부작용도 고려되어야 좋은 치료제가 될 수 있다.
천마(Gastrodia elata Blume, GEB)는 난초과(Orcbidaceae)에 속하는 다년생 초본으로 적근(赤根), 귀독우(鬼督郵), 난모(難母), 신초(神草), 정풍초(定風草) 등의 다른 명칭으로 부르기도 한다. 신농본초경에는 천마가 중품으로 분류되어 있으며, 약성이 평무독한 약재로 알려져 있다. 천마의 임상적 효능은 본초강목, 동의보감을 비롯한 여러 본초 문헌들에 널리 기록되어 있는데, 주로 고혈압, 두통, 마비, 신경성 질환, 당뇨병 등의 성인병, 스트레스, 피로 등의 증상에 대하여 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 천마에 함유되어 있는 성분은 대부분 페놀성 화합물로서 가스트로딘(gastrodin), 페놀성 배당체, 유황 함유 페놀성 화합물, 유기산, 당 및 베타-시토스테롤(β-sitosterol) 등이 분리되어 보고되었으며, 그 이외에도 스테롤(sterol)류, 콜레스테롤(cholesterol), p-하이드로벤질 알콜(p-hydroxybenzyl alcohol)과 바닐린(vanillin) 등의 성분에 대해서도 알려져 있다. 생천마의 수분 함량은 81.2%이며, 동결건조 시료의 일반 성분은 조단백질 61.2%, 조지방 1.50%, 조회분 2.55%, 탄수화물 89.74%이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다 (대한민국 특허 제10-0625609).
천마와 관련된 종래기술을 보면, 천마에 밤, 검정콩, 대추 및 감초를 특정 비율로 배합하여 추출한 추출액을 함유함으로써 혈중 콜레스테롤치를 감소시킬 수 있는 기능성 음료 조성물(대한민국 특허 제10-0207605), 백화사설초, 대황, 황기, 적작약, 오미자, 계내금, 석창포, 감초, 하별갑, 산사자, 강황, 울금, 백삼, 구기자, 삼칠, 천마, 자충, 천갑산, 우황, 내복자, 흑지마 및 자근을 함유하는 간질환 예방 및 치료용 생약조성물(대한민국 특허 제10-0310979), 삼백초, 오미자, 돌미나리, 당귀, 산수유, 선복화, 측백엽, 갈근, 천마 및 구기자로 이루어진 군에서 선택되는 2 종 이상의 생약의 알콜 추출물을 포함하는 뇌기능 및 인지 기능 개선용 조성물(대한민국 특허 제10-0569089), 인삼 30~80, 남성 6~24, 천마 6~24, 석창포 5~15, 강황 5~15, 죽여 5~15, 백강잠 5~15, 지실 5~15, 백봉령 5~15, 반하 5~15, 진피 3~9, 감초 3~9부를 혼합하고 열수 또는 알콜로 추출하여 제조된 추출물 및 그 추출물을 유효성분으로 하는 치매병 예방 및 치료용 조성물(대한민국 특허 제10-0382564), 하수오 10~50 중량부에 천마 1~15 중량부, 석창포 1~10 중량부, 강황 또는 울금 1~15 중량부, 죽여 또는 죽엽 1~8 중량부, 누에분말 1~8 중량부, 지실 또는 탱자열매 1~8 중량부, 복령 5~20 중량부, 진피 2~20 중량부, 감초 1~5 중량부 및 생강 1~10 중량부가 혼합된 혼합물을 통상의 방법으로 추출한 것을 특징으로 하는 치매 예방 및 치료제 조성물(대한민국 특허 제10-0360674), 반지련 3~13 중량%, 백화사설초 3~13 중량%, 인삼 3~13 중량%, 황기 3~13 중량%, 지유탄 1~10 중량%, 백작약 1~10 중량%, 해표초 1~10 중량%, 모려 1~10 중량%, 백복신 1~10 중량%, 용안육 1~10 중량%, 백복령 1~10 중량%, 반하 0.5~8 중량%, 진피 0.5~8 중량%, 맥아 0.5~8 중량%, 창출 0.5~8 중량%, 천마 0.5~8 중량%, 백출 0.1~6 중량%, 신국 0.1~6 중량%, 택사 0.1~6 중량%, 오령지 0.1~6 중량%, 유향 0.1~6 중량%, 몰약 0.1~6 중량%, 현호색 0.1~6 중량%, 초과 0.1~6 중량%, 삼능 0.1~6 중량%, 봉출 0.1~6 중량%, 건강 0.1~6 중량%, 황백 0.1~6 중량% 및 생강 0.5~8 중량%를 포함하는 항암 및 암 전이 억제 효과를 갖는 조성물(대한민국 특허 제10-0425978), 모과, 우슬, 오가피, 속단, 진교, 위령선, 당귀, 천궁, 천마, 홍화, 계피 및 방풍을 유효성분으로 함유하는 급성 류마티스, 만성 류마티스, 만성염증성 관절염 및 퇴행성 골관절염 치료 및 예방용 약학조성물(대한민국 특허 제10-0540033) 및 반하, 백출, 천마, 진피, 복령, 산사, 희렴 및 황련의 추출물을 유효성분으로 포함하는 고혈압 치료 또는 예방용 약제학적 조성물(대한민국 특허 제10-0577674)이 특허등록 받은 바 있다.
그러나, 상기한 연구 보고들에서 천마 추출물이 위염 및 위궤양 질환에 대한 치료 효과는 전혀 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 기존의 위염, 위궤양 치료제들의 한계를 극복하고자 이미 안전성이 입증된 다양한 전통 한약재들의 성분을 분석하고 위염 및 위궤양 치료 효과를 검색한 결과, 천마 추출물이 침수성 스트레스 유발로 인한 위 점막 세포의손상을 보호하고, 염증 유발 인자인 산화질소의 합성을 억제하여 위염 또는 위궤양 억제 효과를 갖는다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 천마 추출물을 유효 성분으로 함유하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 천마 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 개선용 건강기능성식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천마 추출물을 유효 성분으로 함유하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 천마 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 개선용 건강기능성식품을 제공한다.
본 발명에 따른 천마 추출물은 (a) 천마를 파쇄한 다음, C3 -6의 저급 알코올, 물, C3 -6의 저급 유기산, C3 -6의 저급 알코올에스테르, C3 -6의 저급 케톤 및 C3 -6의 할로겐화 탄화수소로 구성된 군에서 선택되는 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 추출액을 회수하는 단계에 의해 제조되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
C3 -6의 저급 알코올로는 에탄올(ethanol) 또는 메탄올(methanol)을 사용하는 것이 바람직하고, C3 -6의 저급 유기산으로는 부티르산(butyric acid) 또는 캅로인산(caproic acid)를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, C3 -6의 저급 알코올에스테르로는 디메틸에테르(dimethyl ether), 에틸메틸에테르(ethyl methyl ether) 및 디에틸에테르(diethyl ether)로 구성된 군에서 선택할 수 있고, C3 -6의 저급 케톤으로는 디메틸케톤(dimethyl ketone), 에틸메틸케톤(ethyl methyl ketone) 및 디에틸케톤(diethyl ketone)로 구성된 군에서 선택할 수 있으며, C3 -6의 할로겐화 탄화수소로는 사염화탄소(carbon tetrachloride) 또는 삼염화에틸렌(trichlorethylene)을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서는 천마를 분말화한 후, 천마에 메탄올을 가하여 열수추출, 냉침추출, 환류냉각추출 또는 초음파추출 등의 추출방법을 사용하여 추출한 다음, 원심분리하여 천마 추출물을 수득하였다.
본 발명의 천마 추출물은 천연물질이므로 독성이 전혀 없어서 의약품으로 지속적으로 다량 사용할 수 있다.
상기에서 수득된 본 발명의 천마 추출물을 처리한 마우스를 이용하여 침수성 스트레스를 유발하여 위 점막 세포의 손상을 육안으로 확인한 결과, 점막 손상 및 혈액 응괴덩어리가 발견되지 않았으므로 천마 추출물의 위 손상 보호 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 천마 추출물이 염증 유발 인자인 산화질소의 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 산화질소 생성량 및 산화질소 합성효소의 전령 RNA 발현을 측정한 결과, 산화질소 생성이 억제되고, 산화질소 합성효소의 전령 RNA 발현이 억제되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 천마 추출물을 포함하는 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된 다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 경구 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 추출물을 함유하는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염은 다양한 기능성 식품 및 건강기능성식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.
본 발명에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명의 추출물을 첨가함으로써 일반 식품의 기능성을 향상시킨 식품을 의미한다. 기능성은 물성 및 생리기능성으로 대별될 수 있는데, 본 발명의 추출물을 일반식품에 첨가할 경우, 일반 식품의 물성 및 생리기능성이 향상될 것이고, 본 발명은 이러한 향상된 기능의 식품을 포괄적으로 '기능성 식품'이라 정의한다.
상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제,안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0.01~20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 천마 추출물은 침수성 스트레스 유발로 인한 위 점막 세포의 손상을 보호하고, 염증유발인자인 산화질소의 합성을 억제하여 위염 또는 위궤양 억제 효과를 나타내므로 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강 기능성식품으로 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1:
천마 추출물의 제조
3년 된 천마(Gastrodia elata Blume, GEB)의 근경은 경상북도 영양에서 구입하여 수세하고 절편하였으며, -70˚C에서 급속냉동하여 동결건조시킨 후, 사용하였다.
상기 천마에 메탄올을 가하여 추출한 후, 30% 메탄올에 재현탁시킨 다음, 원심 분리하여 얻은 상등액을 회전식 증발 농축기로 건조시켜 진갈색의 분말을 최종적으로 수득하였다.
실시예 2:
위 점막 손상 유도에서 천마 추출물의 위 보호 효과 확인
실험 동물로는 체중이 22~25g의 8주된 수컷 BALB/c 계통의 마우스(Samtaco, Korea)를 시판되는 사료(Samtaco, Korea) 및 물은 충분히 공급하면서, 1주간 실험실 환경에 적응시켜 사용하였다.
실험실 환경은 22±1°C, 습도 50±5%를 유지하면서 12시간 주기로 낮과 밤이 반복되도록 하였다.
L-알기닌 처리군(n = 6)의 마우스들에게는 등장의 식염수에 용해시킨 L-알기닌(300mg/kg)을 복강 투여(i.p.)하였고, 천마 추출물 처리군(n = 6)에서는 상기 실시예 1에서 수득한 천마 추출물(0.02ml/g)을 경구 투여(p.o.)하였다. 또한, 음성 대조군은 각각 등장의 식염수를 복강 투여(n = 6) 또는 경구 투여(n = 6)하였다. 투여 후, 마우스들은 약물이 충분히 흡수될 수 있도록 각각 독립적인 감금 우리에서 수직상태로 1 시간 동안 보관하였다.
상기 마우스들을 20~23˚C로 유지되는 수조에 6시간 동안 침수(Takagi, K.Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 12:465, 1964)시킨 후, 상기 마우스를 에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 다음, 위는 큰 굴곡을 따라 절개시키고, 위 점막은 작은 가위를 사용하여 떼어냈다. 혈액은 각각의 마우스에서 위를 떼어낸 뒤, 바로 정맥하부에서 채취하였으며, 혈청은 원심 분리하여 수득하였다.
위 점막의 표면에 발생한 점, 선형으로 된 손상 및 부식을 육안으로 관찰한 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 식염수를 복강 투여 및 경구 투여한 음성 대조군의 시료(A 및 B)에서는 1~2mm 크기의 많은 점막 손상과 큰 혈액 응괴덩어리가 발견되었는데 비하여, 양성 대조군인 L-알기닌을 처리한 시료(C)에서는 극소량의 점막 손상 및 중간 크기의 혈액 응괴덩어리만 발견되었다. 반면, 천마 추출물을 처리한 마우스의 시료(D)에서는 점막 손상과 혈액 응괴덩어리를 모두 발견할 수 없었다.
한편, 궤양 지표의 측정은 점막 손상의 정도에 따라 점수를 매겨 환산하였다 (Nie, S.N. et al ., World J. Gastroenterol ., 9:1772, 2003). 미미할 정도의 원모양의 출혈 부식에는 1점, 1mm 보다 작은 길이의 출혈 부식에는 2점, 1~2mm 정도의 길이의 출혈 부식에는 3점, 2~3mm 정도의 길이의 출혈 부식에는 4점, 4mm보다 긴 길이는 5점을 매겼다. 또한, 상처가 1mm 이상의 폭을 가질 때는 2배의 점수를 매겼다. 상기 실험값은 평균±표준편차로 나타내었고, Dunnett’s 테스트에 따른 ANOVA(one-way analysis of variance)로 수행하여 p값이 0.05보다 미만일 경우, 통계적학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
음성 대조군의 궤양 지표는 각각 23.0±4.1 및 23.3±7.8이었는데 반해, 양성 대조군의 궤양 지표는 8.0±5.5, 천마 추출물 처리군의 궤양 지표는 2.5±3.3이였다(표 1 참조).
상기 결과로부터, 천마 추출물이 침수성 구속 스트레스로 인한 위 손상을 예방하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
전처리 | 궤양 색인 (Ulcer index, points) |
대조구 (i.p.; 복강투여) | 23.0 ± 4.1 |
대조구 (p.o.; 경구투여) | 23.3 ± 7.8 |
L-알기닌 (300 mg/kg, i.p.;복강투여) | 8.0 ± 5.5*† |
천마 추출물 (0.02 ml/g, p.o.:경구투여) | 2.5 ± 3.3*† |
상기에서 수득한 혈청 및 위 조직을 대상으로 산화질소 생성량을 하기와 같이 측정하였다. 또한, 혈청 속의 산화질소 생성량은 Griess assay을 응용하여 측정하였다 (Dirsch, V.M. et al ., A.M. Planta Med ., 64:423, 1998).
상기 혈청들을 활성제(LPS 10ng/well)가 든 96-웰 플레이트에 첨가하고, 상기 실시예 1에서 수득한 천마 추출물을 최종 농도 30mg/ml가 되도록 첨가하였다. 24 시간 후, 상등액 100ml에 동량의 그리스 시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylene diamine dihydrochloride 및 5% phosphoric acid)을 첨가하여 상온에서 10분 동안 방치하였다. 각 시료의 광학적 농도는 마이크로플레이트 자동측정기 VICTOR3(Wallac co., Finland)를 사용하여 550nm에서 측정하였다. 측정 곡선은 표준 sodium nitrite을 사용하여 작성하였다. 상기 실험값은 3반복 실험한 결과로서, 평균±표준편차로 나타내었고, Dunnett’s 테스트에 따른 ANOVA(one-way analysis of variance)로 수행하여 p값이 0.05보다 미만일 경우, 통계적학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 혈청 및 위 조직에서의 산화질소 생성량은 L-알기닌 처리군과 천마 추출물 처리군 모두 음성 대조군의 생성량의 20~50% 수준에 미치는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 천마 추출물이 혈청과 위 조직에서 산화질소의 생성을 감소시키는 것을 알 수 있었다.
실시예 3:
천마 추출물의 산화질소 생성 저해 활성 검색
혈청 및 위 조직에서의 산화질소 생성량 변화가 내피성 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase, eNOS), 뉴론성 산화질소 합성효소(neuronal nitric oxide synthase, nNOS) 및 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)의 발현 수준의 변화에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상기 효소들을 암호화하는 전령 RNA 전사 수준을 하기 표 2에 기재된 프라이머를 이용한 RT-PCR을 통하여 측정하였다.
전령 RNA 발현은 글리세르 알데히드 인산가수분해 효소(GAPDH)를 기준으로 두었고, Quantity One Version 4.6.1(Bio-Rad, Philadelphia, PA)을 사용하여 실험하였다.
동결된 위 조직(약 100 mg)을 1㎖ 트리졸(TRIZOL®) 시약을 사용하여 균질화하였고, 총 RNA(Roos-van Groningen et al ., J.A. Kidney Int., 65:97, 2004)는 분광광도계(spectrophotometer; Perkin Elmer社, US)로 260nm에서 측정하였다.
상기 RNA를 1% 포름알데하이드-아가로스 전기영동한 후,에티디움브로마이드(EtBr)으로 염색하여 조사하였다. RNA는 사용하기 전까지 -80˚C에서 저장하였고, RT-PCR은 Maxime RT-PCR PreMix 및 하기 표 2의 프라이머(Bioneer Co., Korea)를 사용하여 수행하였다. 상기 프라이머는 NCBI GenBank 데이터베이스에 저장되어 있는 염기서열을 분석하기 위하여 Primer3 software(Whitehead Institute, MIT Center for Genome Research, US)를 사용하였다.
대상 유전자 | 프라이머 서열 (센스/안티센스) | 서열번호 | 산물크기(bp) |
eNOS | 5’-TACGCACCCAGAGCTTTTCT-3’ | 1 | 307 |
5’-GCAGGATGCCCTAACTACCA-3’ | 2 | ||
nNOS | 5’-CCATCAGCTCCTCTCCAGAC-3’ | 3 | 511 |
5’-ATATGGCCTCCTTGCTCCTT-3’ | 4 | ||
iNOS | 5’-AGACCTCAACAGAGCCCTCA-3’ | 5 | 305 |
5’-GCAGCCTCTTGTCTTTGACC-3’ | 6 | ||
GAPDH | 5’-ATGTTCCAGTATGACTCCAC-3’ | 7 | 371 |
5’-GCCAAAGTTGTCATCTGATGA-3’ | 8 |
500 ng의 총 RNA를 45˚C에서 30분, 95˚C에서 5 분 동안 반응시켜 한가닥 cDNA를 합성시켰다.
PCR 조건은 95°C에서 45초 동안 반응시킨 다음, 내피성 산화질소 합성효소, 뉴론성 산화질소 합성효소 및 유도성 산화질소 합성효소는 각각 54°C/55°C/53°C 에서 32사이클, 글리세르 알데히드 인산가수분해효소는 54°C에서 27사이클 수행한 후, 72°C에서 60초 동안 재회복시켰다. PCR 과정 후, 생성물의 각 시료 20 ㎖를 1.5% 아가로스 젤 전기영동법에 의해 분석하였다.
예측된 생성물의 위치는 1kb DNA ladder(Solgent社, Korea)와 비교하여 확인할 수 있었다. 대략적인 정량분석을 위하여 글리세르 알데히드 인산가수분해 효소 유전자 발현을 기준으로 삼아, 각각의 시료는 그에 걸맞은 cDNA 상대적인 양을 분자 이미지 Gel Doc XR 시스템(Bio-Rad Co., Italy) 및 Quantity One 1-D 분석 소프트(Bio-Rad Co., US)를 사용하여 측정하였다.
실험값은 평균±표준편차로 나타내었고, Dunnett’s 테스트에 따른 ANOVA(one-way analysis of variance)로 수행하여 p값이 0.05보다 미만일 경우, 통계적학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 침수성 구속 스트레스를 유발시킨 마우스의 위 조직에서 유도성 산화질소 합성효소의 전령 RNA는 발현이 현저히 감소하였고, 내피성 산화질소 합성효소 및 뉴론성 산화질소 합성효소는 처리와 관계없이 모든 실험군에서 유사하였으며, 하우스키핑유전자인 글리세르 알데히드 인산가수분해효소는 발현의 정도가 유의한 차이를 보이지 않았다. 이는 곧 침수성 구속스트레스에 의해 유발된 상기 3종의 산화질소 합성효소의 발현 중 유도성 산화질소 합성효소의 발현이 감소됨으로 인해 위 점막의 손상이 감소함을 의미하고, 실시예 2와 비교하였을 때, 유도성 산화질소가 위 점막 손상에 중요한 분자 마커임을 나타낸다. 결론적으로, 천마 추출물의 처리에 의해 유도성 산화질소의 합성이 억제되어 위 점막 손상이 감소된 것임을 알 수 있었다.
본 발명의 천마 추출물을 포함하는 약학 조성물의 제제 예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예
1:
산제의
제조
천마 추출물 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예
2: 정제의 제조
천마 추출물 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예
3: 캅셀제의 제조
천마 추출물 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예
4: 주사제의 제조
천마 추출물 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ·12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조 방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
제제예
5:
액제의
제조
천마 추출물 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조 방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 침수성 스트레스를 유발시킨 마우스의 위 조직에서 점막 손상 상태를 나타낸 것이다.
도 2는 침수성 스트레스에 노출시킨 마우스의 혈청과 위 조직에서 산화질소의 양을 나타낸 것이다.
도 3은 침수성 스트레스에 노출시킨 마우스의 위 조직에서 내피성 산화질소 합성효소, 뉴론성 산화질소 합성효소 및 유도성 산화질소 합성효소의 전령 RNA 발현을 나타낸 것이다(마커:합성효소연쇄반응의 크기 마커; 1열:복강 투여한 대조군; 2열:경구 투여한 음성 대조군; 3열:L-알기닌 처리 양성 대조군; 4열:천마 추출물 처리군).
도 4는 침수성 스트레스에 노출시킨 마우스의 위 조직에서 내피성 산화질소 합성효소, 뉴론성 산화질소 합성효소 및 유도성 산화질소 합성효소의 전령 RNA 발현 비율을 나타낸 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Composition Comprising the Extract of Gastrodia elata Blume for
the Prevention or Treatment of Gastritis or Gastric ulcer
<130> P07-B213
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense for eNOS primer
<400> 1
tacgcaccca gagcttttct 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense for eNOS primer
<400> 2
gcaggatgcc ctaactacca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense for nNOS primer
<400> 3
ccatcagctc ctctccagac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense for nNOS primer
<400> 4
atatggcctc cttgctcctt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense for iNOS primer
<400> 5
agacctcaac agagccctca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense for iNOS primer
<400> 6
gcagcctctt gtctttgacc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense for GAPDH primer
<400> 7
atgttccagt atgactccac 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> antisense for GAPDH primer
<400> 8
gccaaagttg tcatctgatg a 21
Claims (5)
- 천마 추출물을 유효 성분으로 함유하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 천마 추출물은 유도성 산화질소 합성효소의 발현을 선택적으로 억제하는 것을 특징으로 하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 천마 추출물은 다음의 단계에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 약학 조성물:(a) 천마를 파쇄한 다음, C3 -6의 저급알콜, 물, 저급유기산, 저급알콜에스테르, 저급케톤 및 할로겐화탄화수소로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계; 및(b) 상기 추출액을 회수하는 단계.
- 천마 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 위염 또는 위궤양의 예방 또는 개선용 건강기능성식품.
- 제3항에 있어서, 상기 천마 추출물은 다음의 단계에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 건강기능성식품:(a) 천마를 파쇄한 다음, C3 -6의 저급알콜, 물, 저급유기산, 저급알콜에스테르, 저급케톤 및 할로겐화탄화수소로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계; 및(b) 상기 추출액을 회수하는 단계.
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-
2007
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