KR20090028212A - 동물의 면역능을 증강시키는 지네 추출물, 그 제조방법 및용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동물의 면역능을 증강시키는 지네 추출물, 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지네 분말로부터 증류수로 열탕으로 유효물질을 추출하여 동물의 주요 면역세포인 호중구와 마우스 복강 대식구 및 비장세포의 활성을 증진시키고 병원미생물에 대한 비특이적인 방어능을 증진시키는 데 있다.

본 발명은 동물용 의약품인 면역증강제, 백신보좌제 첨가물 그리고 보조치료제 등으로 광범위하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

동물의 면역능을 증강시키는 지네 추출물, 그 제조방법 및 용도{Extract of Centipede for Strength of Animal's Immunity, preparation Method Thereof and Use}

본 발명은 동물의 면역능을 증강시키는 지네 추출물, 그 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 지네 분말로부터 증류수로 열탕으로 유효물질을 추출하여 동물의 주요 면역세포인 호중구와 마우스 복강 대식구 및 비장세포의 활성을 증진시키고 병원미생물에 대한 비특이적인 방어능을 증진시키는 데 있다.

동물에서 각종 병원미생물 침입에 1차적으로 저항할 수 있는 면역을 담당하는 것은 체내에 있는 주요 탐식세포인 호중구(neutrophil), 대식구(macrophages)이며 2차적으로 특이면역을 이끄는 면역세포는 림프구(lymphocytes, T/B cell) 등이며 이들의 활성이 비정상적일때 병원미생물이 감염, 증식하여 발병하게 된다. 면역증강물질은 이러한 질병방어에 주요 역할을 담당하고 있는 각종 면역세포의 기능을 증강시켜 질병감염에 대한 특이 및 비특이 저항성을 높혀 준다. 이러한 면역증강물질은 동물, 식물, 미생물 등 다양한 생물체에 존재하는 것으로 알려져 있으며 이들로 부터 추출한 많은 물질이 사람 및 동물의 면역증강제로서 개발되어 사용되고 있 다. 지네는 과거부터 한방재료 및 보양강장제로서 민간요법으로 사용되고 있다.

지네(centipede)는 순각강(脣脚綱)에서 그리마류를 제외한 절지동물의 총칭으로 다지류에 속하며 몸길이 0.5∼15cm로 머리와 몸통으로 나뉜다. 전세계적으로 약 3,000종이 있으며 한국, 일본 등지에 분포한다. 한자어로 오공(蜈蚣), 토충(土蟲), 백족(百足)이라고 한다. 1489년 조선조 성종이 허종 등에게 명하여 쉽고 간단하게 약방문(藥方文)을 짓게 한 것으로 구급간이방(救急簡易方)에 지네를 오공이라고 한 기록이 있다. 한방에서 지네를 대나무 막대기에 머리와 꼬리를 묶어서 말린 것을 오공(蜈蚣)이라 하며 거풍(祛風), 진경(鎭痙), 소종(消腫), 청혈(淸血)의 효능이 있어 중풍, 경간(驚癎), 관절염, 림프선염, 암종(癌腫) 등에 처방한다.

한편 지네와 관련된 종래기술은 한국특허공고 10-0200126(지네로부터 추출한 신규한 퀴놀론계 화합물 및 그 유도체)는 지네 분말에 물과 유기용매를 사용하여 얻은 추출물이 알칼로이드 화합물로 우수한 함암 활성을 나타낸다고 하였으나 본 발명과 기술적구성이 다른 것이다.

본 발명은 약용 및 식용으로 사용되고 있는 지네 열탕 추출물로부터 동물의 면역능을 증강시키는 신규한 물질 개발하여 효과가 우수한 동물용 백신, 면역증강제 생산 및 보조 치료제를 개발하여 실용화 및 산업화하는데 있다. 동물의 면역능을 증강시키는 물질은 각종 동물, 식물 및 미생물 등 자연계에 널리 분포하고 있으며 인삼, 버섯 등 다양한 식물로 부터 추출하여 활용되고 있다. 그러나 지네 열탕 추출물에서 면역증강물질을 추출하여 주요 면역세포인 호중구, 대식구 및 림프구(비장세포)에서의 면역활성 증강효능과 병원균에 대한 비특이적 방어능 향상에 관한 기술개발 등이 보고된 바 없다.

본 발명은 첫째, 지네 열탕추출물로 부터 면역증강 효능이 있는 물질을 추출하는 것이며, 둘째, 추출물의 동물의 주요 면역세포인 호중구 유주능 및 과산화물 산생, 비장세포 증생 및 병원균에 대한 비특이적인 방어능 향상효과를 확인하여 추출물질의 면역 증강 물질로서의 효능을 입증하는 것이다.

본 발명은 지네 분말로부터 증류수를 섞어 열탕으로 추출하여 신규한 유용물질을 추출하여 추출물의 각종 면역세포 활성 증강효능을 시험하여 추출물의 면역증강활성을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 지네 분말로부터 열수를 이용하여 면역증강 효능이 있는 물질을 추출하며, 이 추출물을 동물의 병원균에 대한 비특이적인 방어능 향상효과를 확인하여 면역 증강 물질로서의 효능을 입증하는 것이다.

본 발명은 동물의 질병을 효율적으로 치료, 예방할 수 있는 면역증강제, 백신의 효능을 향상시킬 수 있는 보좌제(adjuvants) 첨가물 및 치료효능을 증강시킬 수 있는 보조치료제로서 활용효과가 높을 것으로 기대되며 이에따른 양축농가의 가축질병으로 인한 경제적 피해를 크게 감소시킬 수 있을 뿐만아니라 수입대체 효과 를 거둘 수도 있을 것이다.

본 발명은 지네 분말을 증류수에 넣고 가열하여 추출액을 얻은 후 상기 추출액을 여과지로 1차 여과한 다음, 세균여과지로 2차 여과하여 멸균시켜 동물의 면역능을 증강시킬 수 있는 지네 추출물의 제조방법을 나타낸다.

상기에서 지네 분말은 건조된 지네를 분쇄기로 분쇄하여 50∼100메쉬(mesh)의 지네 분말을 사용할 수 있다.

상기에서 지네 분말을 지네 분말 중량 대비 3배∼10배량의 증류수에 넣고 80∼120℃의 온도에서 증류수의 최초 부피가 30∼50％가 될 때까지 추출한 후 이를 여과지로 1차 여과한 후 세균여과지로 2차 여과하여 지네 추출물을 얻을 수 있다.

상기 세균여과지는 0.1∼1.0㎛의 세균여과지를 사용할 수 있다.

본 발명은 상기에서 얻급한 방법에 의해 얻은 지네 추출물을 유효성분으로 하는 병원성세균에 대한 면역활성 증가용 약제학적 조성물을 나타낸다.

본 발명은 상기에서 얻급한 방법에 의해 얻은 지네 추출물을 동물용약품의 면역증강제, 백신의 효능을 향상시킬 수 있는 보좌제 첨가물, 보조치료제, 사료첨가제 중에서 선택된 어느 하나로 사용할 수 있다.

본 발명은 천연물질을 이용한 면역증강물질 개발연구의 일환으로 동물의 면역능을 증강시키는 지네 열탕추출물에 대한 병원성미생물 감염시 1차방어의 중추적 역할을 하는 혈중 호중구 및 대식구의 각종 활성에 미치는 효과와 림프구(마우스 비장세포) 증생 활성 및 병원성미생물 공격접종에 대한 비특이적인 방어능을 시험하여 면역증강 활성이 우수한 신규한 물질을 개발하였다. 금후 비특이적인 면역활성 증강능이 우수한 본 발명을 이용하여 동물용 면역증강제, 백신보좌제 및 보조치료제 등을 개발하는데 광범위하게 활용될 수 있을 것이다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>; 지네로부터 유효물질의 추출

건조된 지네(경동시장 약재상에서 구입)를 믹서기로 분쇄하여 75±25mesh의 분말을 만들었다. 이 분말 50g을 증류수 200ml에 넣어 초자 약탕기에서 열탕하면서 액체의 양이 100ml가 되도록 농축하였다. 이 추출액을 여과지로 1차 여과후 0.45㎛ 세균여과지로 여과멸균후에 공병에 분주하여 냉동보관하면서 시험에 사용하였다.

<실시예 2>; 지네 열탕추출물의 산양혈중 호중구(neutrophil)의 무작위유주능(Random migration) 증강효과

2-1) 산양혈중 호중구 분리 및 분비 추출물로 혼합처리

산양의 경정맥으로부터 혈액을 채혈하여 항응고제인 에이시디액(ACD, sodium citrate, citric acid, dextrose)과 혼합하고 2,500×g, 20분 원심분리하여 연 막(buffy coat)을 제거후 적혈구를 용혈시켜 1500×g, 5분 원심분리하여 호중구를 수집후 알피엠아이(RPMI1640)배지에 호중구수가 1×10⁷/ml 되도록 부유하여 시험에 사용하였다. 지네 열탕 추출물로 호중구를 혼합처리하기 위하여 냉동보관중인 추출물 원액을 알피엠아이배지로 10배, 100배, 1000배로 희석하고 같은 양(30㎕)의 호중구부유액(1×10⁷/ml)과 혼합하여 탄산가스배양기(CO₂ incubator)에서 37℃, 1시간 혼합처리하였다.

2-2) 무작위유주능(Directional migration) 증강효과

지네 열탕추출액과 혼합처리한 호중구 10㎕씩을 아가로즈 프레이트(agarose plate)에 직경 3mm되게 만든 홀(hole)에 넣고 탄산가스배양기에서 37℃, 18시간 적용후 8％ 구루타알데하이드액으로 고정하고 겔을 제거후에 세척, 건조하였다. 건조시킨 프레이트를 스타트염색액(Stat stain, Volu-Sol, Inc.)으로 염색하여 호중구가 유주한 거리를 현미경(MC-50T, MEIJI/Japan)으로 측정하고 호중구의 유주면적을 다음과 같이 계산하였다.

즉, 유주면적 = πr²-π(홀 반지름)²

지네 열탕추출물로 희석 배수별로 처리한 산양 혈중 호중구의 무작위유주능에 미치는 영향은 표 1과 같다. 지네 추출물을 10배, 100배, 1000배로 처리한 호중구의 유주면적이 각 171.43mm², 162.87mm², 147.27mm²로 대조군의 105.87mm²에 비하여 전반적으로 호중구의 무작위유주능이 증가하였다.

<표 1> 지네 열탕추출물로 처리한 산양혈중 호중구의 무작위유주능에 미치는 영향

<실시예 3>; 지향성유주능(Directional migration) 증강효과 조사

무작위유주능에서와 같은 방법으로 지네 열탕추출물과 희석배수별로 혼합처리한 호중구 10㎕를 아가로즈 프레이트(agarose plate)에 직경 3mm되게 일열로 만든 3개의 홀(hole)중 가운데 홀에 넣고 나머지 두 홀에는 10㎕의 인산완충식염수액(PBS, pH 7.2)과 자이모산(Zymosan A, Sigma Z-4250)으로 옵소닌(opsonization) 처리한 염소보체를 각기 넣고 탄산가스배양기에서 37℃, 3-5시간 적용후 8％ 구루타알데하이드액으로 고정하고 겔을 제거후에 세척, 건조하였다. 건조시킨 프레이트를 스타트염색액(Stat stain, Volu-Sol, Inc.)으로 염색하여 인산완충식염수액과 옵소닌 처리 염소보체쪽으로 호중구가 유주한 거리를 각각 현미경(MC-50T, MEIJI/Japan)으로 측정하고 호중구의 유주거리 차이를 다음과 같이 계산하였다.

즉, 옵소닌 처리한 염소보체로 유주한 거리 - 인산완충식염수액으로 유주한 거리, 희석 배수별 지네 추출물로 처리한 산양 혈중 호중구의 지향성 유주능에 미치는 영향은 표 2에서와 같다. 추출 원액을 10배, 100배, 1000배로 희석한 지네 추출물로 처리한 호중구의 지향성 유주거리가 각 0.58mm, 1.46mm 그리고 0.61mm로서 대조군의 유주거리 1.11mm에 비하여 100배로 처리한 호중구의 지향성 유주능이 현저히(p<0.01) 향상되었으나 10배 희석처리군에서는 다소 억제 경향을 보였다(표 2 참조).

<표 2> 지네 열탕추출물로 처리한 산양혈중 호중구의 지향성유주능에 미치는 영향

<실시예 4>; 지네 열탕추출물의 산양혈중 호중구(neutrophil) 항미생물성 과산화물(superoxide, O₂ ^-) 산생능 조사

침입 병원체를 탐식한 호중구가 이들을 살균하기 위하여 폭발적 산소호흡(respiratory burst)에 이은 살미생물성 산소대사산물인 과산화물(superoxide, O₂ ^-) 산생능을 엔비티(NBT)법으로 시험하였다.

4-1) 산양혈중 호중구의 지네 추출물로 혼합처리

추출물로 호중구를 혼합처리하기 위하여 냉동보관중인 추출물 원액을 알피엠아이배지로 10배, 100배, 1000배가 되도록 희석하고 같은 양(30㎕)의 호중구부유액(1×10⁷/ml)과 혼합하여 탄산가스 배양기(CO₂ incubator)에서 37℃, 1시간 혼합처 리하였다.

4-2) 과산화물 산생능 조사

희석배수별 지네 추출물과 혼합처리한 호중구(2×10⁶/ml) 50㎕와 얼스액(Earls balanced salt solution, EBSS)과 염소보체로 옵소닌 처리한 자이모산 부유액 각 25㎕를 조배양용 마이크로플레이트(Costar, 96 well)의 홀에 3반복으로 넣고 탄산가스배양기에서 37℃, 1시간 작용시킨 후에 각 홀에 엔비티시액(NBT, nitroblue tetrazolium)을 100㎕(4mg/ml)씩 가하고 탄산가스배양기에서 3시간 반응시킨 후에 과산화물(superoxide) 생성양에 비례하여 형성된 자주색의 포르마잔(formazan) 입자를 디엠에스오(DMSO) 100㎕를 가하여 녹인후 흡수파장 560nm에서 흡광도를 엘라이자 판독기(ELISA reader, Titertec multiscan)로 판독하여 과산화물 생성양을 측정하였다.

지네 추출물의 희석 배수별로 처리한 산양 혈중 호중구의 과산화물 산생능에 미치는 영향은 표 3에서와 같다. 지네 추출물로 10배, 100배, 1000배 농도로 처리한 호중구의 과산화물 산생양에 따른 광학적밀도(O.D) 수치는 각 0.4217, 0.3480 및 0.3347로 대조군의 0.2913에 비하여 전반적으로 높았으며 10배로 처리한 것이 가장 현저한(p<0.01) 반응을 보였다.

<표 3> 지네 열탕추출물로 처리한 산양혈중 호중구의 과산화물 산생능

<실시예 5>; 지네 열탕추출물의 마우스 복강대식구(peritoneal macrophages) 산화질소(nitric oxide, NO) 산생

체내의 특이 및 비특이 면역반응에 중추적인 역할을 하는 대식구(macrophages)의 활성능 척도로 사용하는 산화질소(nitric oxide, NO) 산생능을 마우스 복강대식구를 공시하여 시험하였다.

5-1) 마우스 복강대식구 분리

25g의 수컷 아이시알(ICR) 마우스를 경추탈골법으로 처리하고 복강으로 5ml의 인산완충식염수(PBS, pH 7.2)를 주입하여 복강내 대식구를 수집하고 인산완충식염수로 2회 세척하여 세포수를 2×10⁶/ml되도록 알피엠아이 배지에 부유하고 조배양용 마이크로플레이트에 200㎕씩 분주하여 탄산가스배양기에서 37℃, 2시간 배양하였다. 배양후 프레이트를 따뜻한 알피엠아이 배지로 3회 세척하여 프레이트에 부착하지 않은 세포를 제거하고 바닥에 부착한 대식구를 시험에 사용하였다.

5-2) 산화질소(NO) 산생능 조사

대식구가 있는 마이크로플레이트 각 홀에 알피엠아이배지로 지네 추출물을 10배, 100배, 1000배로 희석하여 농도별로 각 50㎕씩 홀에 분주하고 탄산가스배양기(CO₂ incubator)에서 37℃, 48시간 배양하였다. 각 홀의 상층액 100㎕와 그리스 시약(Griess reagent) 50㎕를 혼합하고 흡수파장 540nm에서 흡광도를 엘라이자 판독기(ELISA reader, Titertec multiscan)로 판독하여 표준액으로 사용한 아질산나트륨(sodium nitrite)의 표준곡선을 이용하여 산화질소 생성양을 측정하였다.

희석 배수별 지네 추출물로 처리한 마우스 복강 대식구의 산화질소 산생능에 미치는 영향은 표 4에서와 같다. 지네 추출물 10배, 100배, 1000배로 희석처리한 마우스 복강 대식구 배양물중에서 10배로 처리한 것에서 0.78 마이크로몰(micro-M)의 산화질소가 검출되어 대조군의 0.19 마이크로몰(micro-M)보다 많은 산화질소 산생을 보였다.

<표 4> 지네 열탕추출물로 처리한 마우스 복강 대식구의 산화질소 산생능

<실시예 6>; 지네 열탕추출물의 마우스 비장세포(spleen cell) 증생능(proliferation)

체내에서 체액 및 세포면역반응같은 특이면역반응의 주 면역세포인 림프구의 활성을 마우스 비장세포를 공시하여 엠티티(MTT)법으로 시험하였다.

6-1) 비장세포 분리

25g의 수컷 아이시알 마우스(ICR mouse)를 경추탈골법으로 처리하고 복벽을 절개하여 비장을 분리하고 동망마쇠법으로 비장세포를 수집하였다. 비장세포에 혼재하여 있는 적혈구를 용혈시켜 제거하고 인산완충식염수로 2회 세척하여 세포수를 2×10⁶/ml되도록 알피엠아이(RPM) 배지에 부유하고 조배양용 마이크로플레이트 각 홀에 100㎕씩 분주하였다.

6-2) 증생능 조사

마우스 비장세포가 들어 있는 각 홀에 알피엠아이배지로 10배, 100배, 1000배로 희석한 지네 추출물과 콘에이(Con A, 15㎍/ml)를 각 홀에 50㎕씩 첨가하고 탄산가스배양기에서 37℃, 48시간 배양하였다. 배양이 끝난 프레이트 각 홀에 엠티티시약(MTT, 4mg/ml) 50㎕씩을 가하고 탄산가스배양기에서 37℃, 4시간 반응시킨 후에 상층액을 제거하고 200㎕의 디엠에스오액(DMSO : EtOH=1:1) 200㎕와 소렌손 시액(Sorenson`s buffer) 50㎕씩을 가하여 반응으로 생성된 자주색의 포르마잔 입자를 용해시켰다. 이것을 흡수파장 560nm에서 흡광도를 엘라이자 판독기(ELISA reader, Titertec multiscan)로 판독하여 분아능을 측정하였다.

지네 추출물의 희석 배수별로 처리한 마우스 비장세포의 증생능에 미치는 영향은 표 5와 같다. 100배로 희석한 지네 추출물로 처리한 비장세포의 광학적 밀도는 0.1937로 대조군의 0.1558보다 높은 광학적밀도를 나타내었다. 그러나 10배 농 도로 처리한 경우는 반응이 다소 억제되는 경향을 나타내었다.

<표 5> 지네 열탕추출물로 처리한 마우스 비장세포의 증생능에 미치는 영향

<실시예 7>; 지네 열탕추출물의 병원성포도상구균 및 파스튜렐라균 공격접종에 대한 방어능

지네 열탕추출물의 병원미생물에 대한 비특이적인 방어능을 시험하기 위하여 병원성 포도상구균(Staphylocococus aureus)과 파스튜렐라균(Pasteurella multocida)을 공격접종하고 그에 대한 마우스의 방어능으로 시험하였다.

7-1) 지네 열탕추출물의 마우스접종 및 공격접종

지네 열탕추출물 원액을 각기 25g의 수컷 아이시알 마우스(ICR mouse) 복강으로 0.2ml를 4수씩에 접종하고 3일후에 병원성 포도상구균(S. aureus, strain 289)과 파스튜렐라균(P. multocida 4D)으로 최소치사량의 10배(10MLD/0.2ml)양을 복강으로 공격접종한 후 7일간의 생존율로 방어효과를 조사하였다. 지네 추출물을 접종한 마우스는 병원성 포도상구균 공격접종에서 4수중 2수가 생존하여 50％의 방어율을 나타내었고 파스튜렐라균 공격접종에서는 4수 모두가 생존하여 100％의 방어율을 나타낸 반면 대조군 마우스는 모두 폐사하여 지네 열탕추출물의 우수한 비특이적 방어능을 확인할 수 있었다(표 6 참조).

<표 6> 지네 열탕추출물의 병원성포도상구균 공격접종에 대한 방어능

* 폐사 마리수/공격접종 마우스 수 × 100

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명의 지네 추출물은 산양혈중 호중구의 무작위유주능 증강효과와, 산양혈중 호중구의 지향성유주능 증강효과와, 산양혈중 호중구 항미생물성 과산화물 산생능과, 마우스 복강 대식구의 산화질소 산생능과, 마우스 비장세포 증생 효과와, 병원성 포도상구균 및 파스튜렐라균 공격접종에 대한 마우스 방어효과를 나타내고 있으므로 병원성세균에 대한 방어능이 우수하여 산업적으로 활용될 수 있다.

Claims (4)

1. 지네 분말을 증류수에 넣고 가열하여 추출액을 얻은 후 상기 추출액을 여과지로 1차 여과한 다음, 세균여과지로 2차 여과하여 멸균시켜 동물의 면역능을 증강시킬 수 있는 지네 추출물의 제조방법
2. 제1항에 있어서, 지네 분말을 지네 분말 중량 대비 3배∼10배량의 증류수에 넣고 80∼120℃의 온도에서 증류수의 최초 부피가 30∼50％가 될 때까지 추출한 후 이를 여과지로 1차 여과한 다음, 세균여과지로 2차 여과하는 것을 특징으로 하는 동물의 면역능을 증강시킬 수 있는 지네 추출물의 제조방법
3. 제 1항의 방법으로 얻은 지네 추출물을 유효성분으로 하는 병원성세균에 대한 면역활성 증가용 약제학적 조성물
4. 제 1항의 방법으로 얻은 지네 추출물을 동물용약품의 면역증강제, 백신의 효능을 향상시킬 수 있는 보좌제 첨가물, 보조치료제, 사료첨가제 중에서 선택된 어느 하나로 사용하는 방법