KR20090022569A - Ｄｎａ 염기 서열에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용한ｄｎａ선별 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 DNA 선별 검출방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열 특이적 DNA 결합 단백질인 제한 효소에 형광입자를 결합시키는 단계; 상기 제한 효소를 시료 DNA와 반응시키는 단계; 및 제한 효소가 결합된 DNA를 분석하는 단계를 포함하는, DNA 선별 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 선별 검출방법은 종래의 마이크로 어레이 등에서 DNA 검출을 위해서는 DNA 혼성화가 필요하고, 이때 단일 가닥의 DNA 사용이나 형광표지의 사용없이도 DNA를 선별 검출할 수 있다.

DNA 결합 단백질, DNA 선별 검출, 제한 효소, DNA 절단, 양자점, 형광입자

Description

ＤＮＡ 염기 서열에 특이적으로 결합하는 단백질을 이용한 ＤＮＡ선별 검출방법{DNA Selection and Detection Method Using Proteins Binding Specific DNA Base Sequences}

본 발명은 DNA 선별 검출방법에 관한 것이다.

병원 등에서 질병 검사를 받는 경우에 복잡한 검사 절차와 그 검사 결과가 나올 때까지의 상당한 시간을 필요로 한다. 따라서, 가정이나 응급실과 같이 환자 옆이나 현장에서 상기 검사를 즉시 수행할 수 있는 휴대용 진단 도구의 개발이 크게 요구되고 있다. 이에 착안한 POCT에 기반한 랩온어칩(lap on a chip)이 개발 및 발전되고 있으며, 앞으로의 시장규모 또한 엄청날 것으로 예상되고 있다. 그러나, 현장 현시검사는 실제로 그 결과를 확인하기 위해서는 필요로 되는 장비들이 대단히 많이 요구된다는 점이 제약이 되고 있어서 손쉽게 그 결과를 확인하는 방법을 개발하는 연구가 널리 진행되고 있다. 이러한 연구는 장차 도래할 고령화, 복지 사회를 대비하고 삶의 가치 향상을 추구하는 추세에서 상기 랩온어칩의 시장 규 모를 더욱 크게 할 것이다.

바이오칩은 다루는 생체 분자의 종류에 따라 세포칩, 단백질칩, DNA 칩 등으로 나누어지며, 이중에서 DNA 칩(마이크로 어레이)에 대한 연구가 가장 활발하게 진행되고 있으며 상용화도 가장 많이 이루어지고 있다. DNA 칩은 유전자 변이해석을 단시간에 대량으로 해주는 도구로서 근래에 그 중요성 및 진척도가 날로 증가하고 있다.

DNA 칩은 유전자 발현 현상 등의 연구를 위하여 고형체 위에 수 천 개 의 유전자를 고밀도로 배열해 놓은 것이다. 흔히 DNA 칩은 유전자 검색용으로 이용되는 엄청나게 많은 종류의 DNA를 실리콘이나 유리 등의 작은 기판에 고밀도로 붙여 놓은 것으로 동시에 수백개 이상의 유전자를 빠른 시간 안에 검색할 수 있어서, 인간 게놈프로젝트에서 얻어진 방대한 DNA의 정보로부터 인간의 유전병을 조기에 발견하고 치료할 수 있는 가능성과 그에 따른 기대가 커지고 있다.

구체적으로, DNA 칩은 수 천 개의 유전자를 동시에 분석할 수 있는 좋은 capability를 가지고 있어서, 기존의 서던블럿 이나 노덧브럿 등의 방법에 비하여 빠르고 정확하게 짧은 시간에 대량으로 유전자검색을 할 수 있으며 작은 시료의 양으로도 분석이 가능하며 가격이 저렴하다는 장점이 있다. 이러한 DNA 칩은 염기서열의 분석, 돌연변이 검색, 유전자 진단, 약물유전학, 질병의 진단, 신약개발, 독성연구뿐 아니라 고고학, 법의학 등 아주 다양하게 응용될 수 있다. 현재 이 분야의 추세는 저렴성, 신속성, 정확성, 조작의 간편성, 탐침의 편리성에 대해 연구초 점이 맞춰지고 있다.

일반적으로 DNA 칩의 기본원리는 특정 염기서열을 가지는 매우 많은 종류의 캡쳐 DNA(capture DNA)를 칩의 기판 위에 다양한 방법으로 집적하고 이러한 집적된 다양한 캡쳐 DNA 중 어떤 캡쳐 DNA가 시료내의 타겟 DNA(target DNA) 또는 RNA와 상보적으로 결합하였는지를 검출하는 것이다. 시료중의 타겟 DNA와 칩 내에 집적된 캡쳐 DNA와의 결합(이하, '혼성화(hybridization)'라 칭한다) 여부는 방사선 동위원소를 사용하여 방사선을 검출하거나, 고가의 형광물질을 표지하여 이를 스캐너 장비를 사용하여 탐침함으로써 검출하거나, 질량분석기를 이용하는 방법이 있다.

방사능 표지법은 대단히 민감하고 널리 활용가능한 부분이 있으나, 최근에는 환경 문제가 있어서 형광물질로 표지하는 방식으로 대체되고 있는 추세이다. 형광물질로 표지하는 방식은 민감하고 위험하지 않고 비파괴적이며 저렴하다는 장점이 있어 가장 널리 쓰이고 있지만, DNA 칩에서 신호를 검출하기 위해서는 형광을 검출하여야 하므로 반드시 표지가 필요로 되며, 레이저나 고출력 램프가 설치된 고가의 형광 스캐너를 필요로 한다. 이것이 DNA 칩 검사의 상업적 시장을 크게 활성화시키지 못하는 주요한 요인으로 작용하고 있다. DNA 칩은 탐침(Probe) DNA가 집적(spotting)되어 있는 DNA 칩에 형광으로 표지시킨 타겟 DNA를 넣고 3시간 정도 혼성화시키면 탐침 DNA와 혼성화되어 칩 위에 고정된다. 이후 레이저 등의 칩 스캐너를 이용하여 형광 이미지를 얻어 혼성화 여부를 분석한다. 이외에도 질량분석기를 사용하는 방법은 표지가 필요 없고 구조에 관한 정보를 제공한다는 장점이 있 지만, 그 장비가 고가이고 복잡하다는 단점이 있다.

DNA 칩의 대표적 기술인 마이크로 어레이(microarray)는 이미 널리 사용되고 있는데, 이것은 특정 유전자와 병원균을 검출하기 위해서 이에 해당하는 염기 서열(base sequence)에 상보적으로 DNA를 결합시키는 혼성화(hybridization) 방법을 많이 이용한다. 마이크로 어레이의 제작 및 이용은 통상 합성된 프로브를 이용한 올리고뉴클레오티디(Oligonucleotide)를 합성하는 단계, 상기 올리고뉴클레오티를 슬라이드에 고정하는 단계, 상기 고정된 올리고뉴클레오티드 마이크로 어레이를 이용하여 시료 DNA(이때, 시료내의 DNA를 PCR 등으로 증폭한다)와 혼성화(Hybridization)를 유도하는 단계; 및 상기 혼성화로 반응이 일어난 것을 형광신호 등을 스캐너 등으로 분석하는 단계로 이루어진다. 하지만, 이러한 DNA의 혼성화에 의한 기술은 DNA가 단일 사슬로 변형되고 그 상태가 유지되어야 한다.

특히, mRNA의 발현 양상을 관찰하고자 할 때, 역전사(reverse transcription)를 이용해서 mRNA에서 cDNA를 만드는 과정이 필요하다. 보통 이 cDNA를 형광물질 등으로 표지해야 검출이 가능하다.

상기 방법의 단점을 극복하고 보다 간편한 방법을 개발할 필요성이 있다. 즉, 상기 DNA 칩　또는 마이크로 어레이에서 혼성화를 위해 합성되는 올리고뉴클 레오티드가 단일 사슬로 변형될 필요가 없는 새로운 대안방법이 요구된다.

자연에 존재하는 많은 단백질들이 DNA의 특정 염기에 선택적으로 결합할 수 있다. 특히, 박테리아에서 발견되는 제한 효소(restriction endonucleases)라 불리는 효소들은 6개에서 8개 정도의 연속된, 특정 DNA 염기를 인식하여 결합하고 절단한다. 또한, 적절한 조건 하에서 상기 반응은 선택성이 탁월하여 긍정오류(false positive)가 매우 적고 부정오류(false negative)도 무시할 수준이다.

이에, 본 발명자들은 형광입자를 제한 효소에 결합시키고, 상기 제한 효소를 원하는 시료 DNA와 반응시킴을 통하여, 상기 제한 효소 단백질이 시료내 DNA와 결합되는지 여부를 확인하여 특정 DNA를 선별하고 검출할 수 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 종래의 DNA 칩 등에서 DNA 검출시에 이용되는 DNA 혼성화를 위해서, 단일 가닥의 DNA의 사용이나 형광표지가 요구되지 않는 신규 DNA 선별 검출방법을 제공하는 것이다.

제한 효소를 포함한 다양한 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 양자점(quantum dot)과 같은 형광입자를 결합시킨 후, 원하는 시료 DNA와 반응시키면 상기 단백질이 대상 DNA 염기서열에 가서 결합할 것이고, 통상의 실험방법을 통하여 상기 형광을 손쉽게 검출할 수 있다.

본 발명의 DNA 선별 검출방법은 종래의 마이크로 어레이 등에서 사용한 DNA 혼성화시에 단일 가닥의 사용 및 형광표지의 사용없이도 DNA를 선별 검출할 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 서열 특이적 DNA 결합 단백질인 제한 효소에 형광입자를 결합시키는 단계; ⅱ) 상기 제한 효소를 시료 DNA와 반응시키는 단계; 및 ⅲ) 제한 효소가 결합된 DNA를 분석하는 단계를 포함하는, DNA 선별 검출방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 DNA 선별 검출방법에 있어서, 상기 형광입자는 양자점(quantum dot), 자발형광입자 및 나노 크기의 형광입자로 이루어진 군중에서 선택되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 DNA 선별 검출방법에 있어서, 상기 시료 DNA는 기판(matrix) 바닥에 결합되어 있는 것이 바람직하고, 상기 시료 DNA의 말단은 바이오틴화(biotinylation)된 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 DNA 선별 검출방법에 있어서, 상기 제한 효소는 ApeK-I, Bcl-I, Pho-I, PspG-I, Tse-I 및 Tli-Ⅰ로 이루어진 군중에서 선택된 것이 바람직 하고, 상기 제한효소는 DNA 절단기능이 억제 또는 제거되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 DNA 선별 검출방법에 있어서, 상기 DNA 절단기능의 억제 또는 제거는 제한효소의 활성에 중요한 Mg²⁺ 농도를 0.1 μM 수준 이하로 억제시키는 것이 바람직하고, 상기 DNA 절단기능의 억제 또는 제거는 제한효소의 DNA 절단 활성에 중요한 활성부위 아미노산의 결실 또는 치환에 의하여 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 Mg²⁺ 농도는 정제된 물과 순수한 화학물질을 사용하므로, 실질적으로 반응 용액내 Mg의 양이 없다고 봐도 무방하다.

또한, 본 발명의 DNA 선별 검출방법에 있어서, 상기 제한 효소는 25℃ 이상의 열에서도 안정적인 것이 바람직하다.

본 발명의 제한효소를 이용한 DNA 선별 및 검출방법의 원리는 다음과 같다. 제한 효소를 포함한 다양한 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 양자점(quantum dot)과 같은 형광입자를 결합시킨 후, 원하는 시료 DNA에 반응시키면 상기 단백질이 대상 DNA 염기서열에 결합할 것이고, 통상의 실험방법을 통하여 상기 형광을 손쉽게 검출할 수 있다. 또한, 상기 단백질에 형광입자가 결합되지 않는 경우에도 DNA에 단백질이 결합되어 있는지 여부는 전기영동 등으로 검출가능하다.

예를 들어, 마이크로 어레이의 제작에서와 같이, DNA의 한쪽 끝을 기판에 고정시킨다. 대상 DNA에 따라서 DNA에 돌출부위(overhang)가 있다면 이 부위를 이중나선으로 만들며 바오이틴화된 뉴클레오티드를 사용해서 표지하거나, PCR 산물이라 면 사용하는 올리고뉴클레오티드를 바이오틴화된 것을 이용한다. 그 후, 형광입자로 표지된 DNA 서열 특이적 결합단백질(예; 제한 효소)을 반응시킨 후, 형광을 검출한다.

본 발명자들은 제한 효소 Tli-I를 이용한 형광입자 결합시의 효소활성 유지의 확인하였다. 제한 효소 Tli-I에 대하여 하나의 절단 부위를 갖는 4.13 kb 플라스미드 DNA를 사용하여 자석구슬에 코팅한 제한 효소 Tli-I의 효소활성을 확인하였다(도 1 참조). 그 결과, Tli-I 코팅된 자석구슬은 온도에 상관없이 DNA를 절단할 수 있는 반면에 코팅되지 않은 구슬과는 반응이 없다.

양자점에 표지하는 단백질(제한 효소)은 보통 열에 약하므로 코팅과정에 문제가 있거나 언폴딩(unfolding)되어 활성이 감소할 수 있으므로, 고온에서 유래한 제한 효소(예: TliI from NEB)를 사용하며 효과적이다. 이는 열에 안정적이라서 양자점에 표지하는 과정에서도 활성을 잃지 않는다.

제한 효소는 기본적으로 특이적으로 인식한 DNA 부위를 절단하는 기능을 하는데, 본 발명에서는 이를 억제할 필요가 있다. 이를 방지하는 방법은 대부분의 제한 효소가 DNA 절단을 위해서 Mg²⁺를 필요로 하므로, 이를 반응버퍼 내에서 제거하는 것이다. 따라서, Mg²⁺와 유사한 2가 양이온(divalent ion)인 Ca²⁺나 Mn²⁺를 첨가하여 제한 효소의 DNA 절단 활성을 억제한다(도 2 참조). 또한, 다른 방법으로 는 유전자 재조합에 의해서 제한 효소에 돌연변이를 유도하여 제한 효소의 DNA 절단 활성의 활성부위(cleavage site)의 중요 아미노산을 치환하여 DNA 절단 기능을 제거할 수도 있다. 이러한 돌연변이 제한 효소는 특이적 서열의 DNA에 결합은 가능하되 DNA를 절단시키지는 못하므로 목표 DNA에 안정적으로 결합할 수 있다.

그 결과, 40 bp의 짧은 DNA의 중앙 부분에 Tli-I 절단서열이 있는 경우, 절단하는 효소작용에 필수적인 Mg²⁺ 대신 Ca²⁺을 넣었더니 DNA가 잘리는 대신에 Tli-I과 결합하여 뒤로 많이 끌리는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 제한 효소 Tli-I가 DNA 절단 기능을 상실하면서도 DNA에 장시간 결합할 수 있음을 나타낸다(도 2 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 제한효소를 이용한 DNA 선별 및 검출방법의 원리

제한 효소를 포함한 다양한 서열 특이적 DNA 결합 단백질에 양자점(quantum dot)과 같은 형광입자를 결합시킨 후, 원하는 시료 DNA에 반응시키면 상기 단백질이 대상 DNA 염기서열과 결합할 것이고, 통상의 실험방법을 통하여 상기 형광을 손쉽게 검출할 수 있다. 실제로는 상기 단백질에 형광입자가 결합되지 않는 경우에 도 전기영동 등으로 검출가능하다.

구체적으로, 마이크로 어레이의 제작에서와 같이, DNA의 한쪽 끝을 기판에 고정시킨다. 또한, 대상 DNA를 어떻게 얻는지에 따라, DNA에 약간의 돌출부위(overhang)가 있다면 Klenow 효소로 돌출부위 부분을 이중나선으로 만들어 줄 때 바이오틴화된(biotinylated) 뉴클레오티드를 사용하여 표지해주거나, PCR 산물이라면 사용하는 올리고뉴클레오티드를 바이오틴화된 것을 이용하면 된다. 그 후, 형광입자로 표지된 DNA 서열 특이적 결합단백질(예; 제한 효소)을 반응시킨 후, 형광을 검출한다.

<실시예 2> 제한 효소 Tli-I를 이용한 형광입자 결합시의 효소활성 유지의 확인

토실(Tosyl)기가 있는 자석구슬(Dynal beads, Invitrogen, USA)에 Tli-I(New England Biolabs, USA)를 코팅하여 제한 효소 Tli-I의 효소활성을 확인하였다. 본 실시예는 제한 효소에 양자점을 결합시켰을 때, 제한 효소의 활성이 유지되는지 여부를 확인하는 테스트이다. 제한 효소 Tli-I에 대하여 하나의 절단 부위를 갖는 4.13 kb 플라스미드 DNA(pSCREEN, Novagen)를 사용하여 상기 자석구슬에 코팅한 제한 효소 Tli-I의 효소활성을 확인하였다(도 1). 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 100 V로 30분 동안 전기영동하였다. 그 결과, 도 1의 6,7번 레인(DNA & Tli-I 코팅된 구슬)에서 나타나듯이, Tli-I 코팅된 자석구슬은 온도에 상관없이 DNA를 절단할 수 있는 반면에 코팅되지 않은 구슬과는 반응이 없음을 확인하였다.

양자점에 표지하는 단백질(제한 효소)은 보통 열에 약하므로 코팅과정에 문제가 있을 수 있고, 시간이 얼마 흐르지 않아도 언폴딩(unfolding)되어 활성이 감소할 수 있다. 이를 극복하기 위해서, 온천에서 활동하는 미생물에서 유래한 제한 효소(예: TliI from NEB)를 사용할 수 있다(마치 PCR에서 Taq 중합효소를 사용하는 것처럼). 이는 열에 안정적이라서 양자점에 표지하는 과정에서도 활성을 잃지 않을 것이다.

<실시예 3> 제한 효소의 DNA 절단 활성의 억제

제한 효소는 기본적으로 특이적으로 인식한 DNA 부위를 절단하는 기능을 하는데, 본 발명에서는 이를 억제할 필요가 있다. 이를 방지하는 방법은 대부분의 제한 효소가 DNA 절단을 위해서 Mg²⁺를 필요로 하므로, 이를 반응버퍼 내에서 제거하는 것이다. 따라서, Mg²⁺와 유사한 2가 양이온(divalent ion)인 Ca²⁺나 Mn²⁺를 첨가하여 제한 효소의 DNA 절단 활성을 억제할 수 있다(도 2 참조). 또한, 다른 방법으로는 유전자 재조합에 의해서 제한 효소에 돌연변이를 유도하여 제한 효소의 DNA 절단 활성의 활성부위(cleavage site)의 중요 아미노산을 치환하여 DNA 절단 기능을 제거할 수도 있다. 이러한 돌연변이 제한 효소는 특이적 서열의 DNA에 결합은 가능하되 DNA를 절단시키지는 못하므로 목표 DNA에 안정적으로 결합할 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 제한 효소는 DNA를 절단하는 효소이므로, 표지(labeling) 하기 위해서는 절단하는 기능을 차단할 필요가 있다. 이에, 본 발명자들은 상기 제한 효소의 절단 기능을 제어할 수 있는 조건을 확인하였으며, 상기 조건 하에서는 제한 효소가 DNA의 절단 활성 없이 장시간 DNA에 결합할 수 있음을 확인하였다(도 2). 40 bp의 짧은 DNA의 중앙 부분에 Tli-I 절단서열이 있고, 3.5% 아가로스 겔에 100V로 25분 동안 전기영동을 하였다. 그 결과, 두번째 레인에서 보듯이 절단하는 효소작용에 필수적인 Mg²⁺을 배제하고 대신 Ca²⁺을 넣었더니 DNA가 잘리는 대신에 Tli-I과 결합하여 뒤로 많이 끌리는 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 제한 효소 Tli-I가 DNA 절단 기능을 상실하면서도 DNA에 장시간 결합할 있음을 확인시켜 준다.

도 1은 제한 효소 Tli-I의 효소활성을 확인한 전기영동 결과를 나타낸 사진이고(이때, 레인 1: 1 kbp ladder; 레인 2: 대조군 DNA; 레인 3: DNA & Tli-I(25℃); 레인 4: DNA & Tli-I(60℃); 레인 5: DNA & 표지안한 자석구슬(25℃, 대조군); 레인 6: DNA & Tli-I 코팅된 구슬(60℃); 레인 7: DNA & Tli-I 코팅된 구슬(25℃); 레인 8: DNA & 표지안한 자석구슬(60℃, 대조군),

도 2는 제한 효소 Tli-I의 DNA 절단 활성의 억제를 확인한 전기영동 결과를 나타낸 사진이다(이때, 레인 1: Tli-I의 절단 서열 있는 DNA(DNA_Tli) 대조군; 레인 2: Mg²⁺대신에 Ca²⁺이 첨가된 DNA_Tli & Tli-I DNA; 레인 3: Mg²⁺이 첨가된 DNA_Tli & Tli-I with Mg2+; 레인 4: Mg²⁺대신에 Ca²⁺이 첨가된 절단 서열 없는 비특이적 DNA & Tli-I; 레인 5: Mg²⁺이 첨가된 절단 서열 없는 비특이적 DNA & Tli-I).

Claims (9)

1. ⅰ) 서열 특이적 DNA 결합 단백질인 제한 효소에 형광입자를 결합시키는 단계;

   ⅱ) 상기 제한 효소를 시료 DNA와 반응시키는 단계; 및

   ⅲ) 제한 효소가 결합된 DNA를 분석하는 단계를 포함하는, DNA 선별 검출방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 형광입자는 양자점(quantum dot), 자발형광입자 및 나노 크기의 형광입자로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 시료 DNA는 기판(matrix) 바닥에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 시료 DNA의 말단은 바이오틴화(biotinylation)된 것을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 제한 효소는 ApeK-I, Bcl-I, Pho-I, PspG-I, Tse-I 및 Tli-Ⅰ로 이루어진 군중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 제한효소는 DNA 절단기능이 억제 또는 제거되는 것을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 DNA 절단기능의 억제 또는 제거는 제한효소의 활성에 중요한 Mg²⁺ 농도를 0.1 μM 수준 이하로 억제시키는 것을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.
8. 제 6항에 있어서, 상기 DNA 절단기능의 억제 또는 제거는 제한효소의 DNA 절단 활성에 중요한 활성부위 아미노산의 결실 또는 치환에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.
9. 제 1항에 있어서, 상기 제한 효소는 25℃ 이상의 열에서도 안정적인 것을 특징으로 하는 DNA 선별 검출방법.

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