JP2002507275A - 引き算ライブラリーの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 定義された配列のコレクションを用いる引き算ライブラリーの製造方法を記載する。該方法は、既知核酸配列からなるコレクションを含む表面を用意し、ついで、適当なハイブリダイゼーション条件下で定義されていない配列を含むライブラリーと該表面とを接触させることを含む。ハイブリダイゼーションしないＤＮＡを回収し、配列決定する。配列決定されたハイブリダイゼーションしないＤＮＡは引き算ライブラリーを形成し、引き算ライブラリーは、ライブラリー中に存在した配列であってコレクションの配列とは異なる配列を含む。本発明方法により製造される引き算ライブラリーも記載する。引き算プローブの製造および使用方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 引き算ライブラリーの製造方法 本願は、１９９７年３月２４日出願の米国仮出願第６０／０４１６８８号につ いて優先権を主張するものである。発明の分野 本発明は、一般的には、ｃＤＮＡライブラリーの分野に関し、より詳細には引 き算ライブラリー（subtraction libraries）の製造方法に関する。発明の背景 いわゆる「高密度ＤＮＡアレイ（array）」またはグリッド（grid）を用いて 遺伝子発現および同一性についての情報を得るための方法が記載されている。例 えば、M．Chee et al.，Science，274:610-614(1966)およびそので引用された他 の文献参照。かかるグリッディングアッセイ（gridding assay）は、発現配列タ グ(ＥＳＴ)と呼ばれる特定の新規遺伝子配列の同定のために用いられている(Ada ms et al.，Science，252:1651-1656(1991))。また、遺伝子産物に基づいて特定 の遺伝子配列を同定するための種々の方法も記載されている。例えば、１９９１ 年５月３０日公開の国際特許出願ＷＯ９１／０７０８７参照。さらに、所望配列 の増幅方法も記載されている。例えば、１９９１年１１月１４日公開の国際特許 出願ＷＯ９１／０７２７１参照。 現在利用可能な引き算（subtraction）法は、与えられた配列から望ましくな い配列を除去するものである。１のアプローチにおいて、多数の未知遺伝子を用 いて引き算ライブラリーをドライブして目的ライブラリーから未知遺伝子を除去 する。例えば、J．Love and P．Deininger，BioTechniques，11(1):88-92(1991) 参照。しかしながら、この方法はライブラリーからの多数の遺伝子の除去には有 用であるが、得られる引き算ライブラリー中の遺伝子については、それらの起源 を除いては ほとんどわかっていない。引き算を行うためによく用いられる１つのアプローチ において、少数の既知遺伝子（例えば、１００個未満）を用いて引き算をドライ ブして目的ライブラリーからこれらの遺伝子を除去する。このアプローチは、ど の遺伝子が除去されるのかをコントロールできるが、現在の方法では、このアプ ローチを少数の遺伝子について使用することが可能なだけであり、得られる引き 算ライブラリーはかなりの量の望ましくない遺伝子を含む。 したがって、引き算ライブラリーの製造のための、より効率的な方法に対する 必要性がある。また、新規医薬試薬のスクリーニングのためのより効率的な方法 も必要である。発明の概要 １の態様において、本発明は、既知配列または定義された配列を含むコレクシ ョンを用いて引き算ライブラリーを製造する方法を提供する。該方法は、定義さ れた核酸配列のコレクションを有する表面を用意し、ついで、ハイブリダイゼー ションを可能にする条件下で定義されていない核酸配列を含むライブラリーとこ の表面とを会合させる工程を含む。ハイブリダイゼーションしない核酸配列を回 収し、単離し、ついで引き算ライブラリーを作成する。定義された配列の第１の ライブラリーには存在しない、第２のライブラリー由来の定義されていない配列 を含むことにより、引き算ライブラリーが特徴づけられる。 もう１つの態様において、本発明は、本発明方法により製造される引き算ライ ブラリーを提供する。 さらにもう１つの態様において、本発明は、本明細書記載の方法工程を用い、 既知配列または定義された配列の存在について、定義されていない配列を含むラ イブラリーを迅速にスクリーニングする方法を提供する。 さらにもう１つの態様において、本発明は、本明細書記載の方法工程を用い、 既知配列または定義された配列由来のポリヌクレオチドプローブを用いて、定義 されていない配列を含むライブラリーを迅速にスクリーニングする方法を提供す る。 本発明の他の態様および利点を、以下に記載する、本発明の好ましい具体例に つ いての詳細な説明においてさらに説明する。発明の詳細な説明 本発明は、既知配列または定義された配列のコレクションを用いて引き算ライ ブラリーを製造する方法を提供する。該方法は、定義された核酸配列または既知 核酸配列からなるコレクションを固定化した表面を提供し、ついで、適当なハイ ブリダイゼーション条件下で、未知配列または定義されていない配列を含むライ ブラリーと該表面とを接触させることを含む。ライブラリーに存在していた配列 であって、コレクションの配列とは異なる配列を含む引き算ライブラリーとして 、ハイブリダイゼーションしないポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡを回収す る。有利には、本発明方法は、多数の定義された配列を用いて引き算をドライブ することを可能にする。よって、この方法は、内容を容易にコントロールできる 引き算ライブラリーの効率的製造を可能にする。 また、本発明方法により製造される引き算ライブラリーも記載する。 Ｉ．定義 本明細書全体において使用されるいくつかの単語および語句を以下のように定 義する。 本明細書の用語「遺伝子」は、ｃＤＮＡ配列が由来するゲノムヌクレオチド配 列をいう。古典的には、用語「遺伝子」はゲノム配列をいい、プロセッシングさ れると異なるＲＮＡを生じうる。 「遺伝子産物」は、遺伝子によりコードされるポリペプチド配列、ペプチドま たは蛋白を意味する。 本明細書の用語「既知配列を含むコレクション」は、ＲＮＡおよびＤＮＡ配列 を包含するヌクレオチド配列の整理されたセットをいい、プラスミド、ｃＤＮＡ ＰＣＲ生成物、遺伝子、遺伝子フラグメント、ＤＮＡフラグメント、オリゴヌク レオチド等の形態であってもよい。好ましくは、コレクション中のかかる既知配 列はすでに配列決定されたものであり、そして／あるいは既知起源のものである 。望ましく は、このコレクションは多数の配列、例えば配列が遺伝子の場合には１００００ ０〜２０００００種を含み、あるいはコレクションのメンバーがオリゴヌクレオ チドの場合には１００００００種を含む。しかしながら、本発明配列の数は所望 により変化させることができ、本発明によっては限定されない。このコレクショ ンは、種々のライブラリーを包含する多くの異なる起源由来の配列を含んでいて もよい。例えば、コレクションは哺乳動物種のメンバー、例えばヒトの１種また はそれ以上の組織起源由来であってもよい。望ましくは、ヒトは健康なものであ る。しかしながら、疾病個体または健康を損ねた個体由来のライブラリーを用い てもよい。さらに、他の目的哺乳動物としては、ヒトでない霊長類、齧歯類、お よびイヌがあるが、これらに限らない。特に好ましいコレクションにおいて、定 義された配列が単一コピーとして存在する。 本発明方法において遺伝子配列を用いる場合、遺伝子の全長配列が知られてい る必要はない。むしろ、本発明方法は、遺伝子配列をユニークなものにしている 部分が知られていることが必要であり、その部分は約１７塩基対である。「既知 核酸配列」は、配列がかなりユニークなものであり、縮重またはリピートを含ま ないことを意味する。 用語「ライブラリー」は、プラスミドライブラリー、ＲＮＡライブラリー、ゲ ノム遺伝子からのＰＣＲ生成物を含むライブラリーのごときＤＮＡライブラリー 、ｃＤＮＡライブラリー、オリゴヌクレオチドライブラリーおよび既知配列を包 含するが、これらに限らない。かかるライブラリーの構築方法は当業者によく知 られている。単一インサート中に存在する完全遺伝子の数を最小化して約１個と なるようにライブラリーを調節してもよい。この調節法は当業者によく知られて いる。 「単離」は、「人の手によって」その天然状態から変化させられていること、 すなわち、天然に存在する場合には、もとの環境から変化または除去されている こと、あるいはそれらの両方が行われていることを意味する。例えば、その天然 状態において生きた動物中に本来的に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプ チドは「単離」されていないが、その天然状態の共存物質から分離された同じポ リヌクレオチドまたはポリペプチドは本明細書の用語である「単離」がされてい る。例えば、ポ リヌクレオチドについては、用語「単離」は、それが本来的に存在する染色体お よび細胞から分離されていることを意味する。 本明細書の用語「固体支持体」は、ライブラリー由来の複数の定義された材料( すなわち配列)を利用可能な方法により固定化するために用いられる基材をいい 、該方法は、試料中の他のポリヌクレオチドと固定化ポリヌクレオチド配列との 検出可能なハイブリダイゼーションを可能にするものである。多くの利用可能な 固体支持体のなかでも、望ましい一例は１９９１年５月３０日に公開された国際 出願ＷＯ９１／０７０８７に記載されたものである。他の有用な支持体の例は、 ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、シリカおよびPall BI0DYNE膜を包含する が、これらに限らない。従来の固体支持体の改良物を本発明に使用してもよいと 考えられる。 用語「グリッド」は、一般的には、固体支持体上の２次元構造を意味し、これ にライブラリーの定義された材料が付けられ、あるいは固定化される。 本明細書の用語「前以て決められた領域」は、１コピーまたは複数コピーの増 幅された遺伝子領域として固体支持体表面に固定化され局在化している領域であ って、そのクローンの試料ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを行う 場合、その位置でそのクローンのハイブリダイゼーションを可能にする領域をい う。 「固定化」は、遺伝子または他の核酸の固体支持体への取り付けをいう。固定 化手段は当業者に知られており、慣用的なものであり、使用支持体のタイプに依 存することがある。 本明細書の用語「標識」は、ＲＮＡまたはＤＮＡ上に容易に取り付けることの できる慣用的な分子であって、検出可能なシグナルを生じうる分子をいい、その シグナル強度はグリッド上のＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドへの ＲＮＡのハイブリダイゼーションの相対量を示す。好ましい標識は蛍光分子また は放射活性分子である。よく知られた種々の標識を用いることができる。 本明細書の用語「引き算ライブラリー」は、新規ヌクレオチド配列が非常に豊 富化されたライブラリーをいい、とりわけ、新規遺伝子および遺伝子フラグメン トを含む。 ＩＩ．既知配列のコレクション この方法の実施に際しては、表面に固定化された定義された配列のコレクショ ン由来のヌクレオチド配列を各グリッドが固体表面上に担持するように、１個ま たはそれ以上のグリッドを調製する。望ましくは、このコレクションは上記定義 のものであり、これらのヌクレオチド配列は、例えば遺伝子、遺伝子フラグメン ト、他のＤＮＡフラグメント、またはオリゴヌクレオチド配列である。 選択されたコレクション由来のヌクレオチド配列を固体支持体表面上のグリッ ドとする。望ましくは、ヌクレオチドはＤＮＡの形態であるが、それ以外であっ てもよく、ヌクレオチドは基材にもよるが１スポットあたり約１００ｐｇないし 約１０００ｎｇの量で表面上に置かれる。さらなる好ましい具体例において、使 用ポリヌクレオチド量は１スポットあたり約１０ｎｇないし約１００ｎｇである 。しかしながら、同様の量のＲＮＡを用いてもよい。必然的ではないが、遺伝子 または他のヌクレオチド配列を２重または多重の区域として表面上に適用するこ とが望ましいかもしれない。ヌクレオチド配列は、固体支持体表面上にスポット され増殖させられた個々のクローン;あるいは上記ライブラリーから単離された プラスミドクローン、プラスミドクローン由来のＰＣＲ生成物、またはプラスミ ドクローンの配列決定により得られたオリゴヌクレオチドを包含し（これらに限 らない）、それらは固体支持体表面上に固定化される。 これらのヌクレオチド配列を種々の固体支持体表面上に固定化するために多く の慣用的方法が用いられる。例えば、Affinity Techniques，Enzyme Purificati on:PartP，Methods in Enzymology，Vol．34，ed．W．B．Jakoby，M．Wilcheck ，Acad．Press，NY(1971)；Immobilized Biochemicals and Affinity Chromatog raphy，Advances in Experimental Medicine and Biology，Vol．42，ed．R．Du nlap，Plenum Press，NY(1974)；米国特許第４７６２８８１号；米国特許第４５ ４２１０２号；欧州特許出願公開第３９１６０８号（１９９０年１０月１０日） ；または米国特許第４９９２１２７号（１９８９年１１月２１日）参照。 必然的ではないが、遺伝子または他の核酸配列を隊列として固定化して、配列 が表面上の前以て決められた位置または領域に置かれるようにすることが望まし い。 いかにして配列が隊列とされるのかを理解することは、先行技術の方法を用いた 場合に得られる効率よりも高いレベルの効率を本発明方法に与える。このことは 本発明の重要な特徴であり、所望配列へのアクセスを容易にし、好ましくはスク リーニング後の関連クローンおよび関連データへのアクセスを容易にする。これ らの材料を固体支持体に取り付けるための１の望ましい方法は国際特許出願ＰＣ Ｔ／ＵＳ９０／０６６０７（１９９１年５月３０日公開）に記載されている。簡 単に説明すると、この方法は、固体支持体の表面上に、材料を固定化できる前以 て決められた領域を形成することを含む。該方法は前以て決められた領域の選択 的活性化を可能にする、表面に取り付けられた結合基材を使用する。活性化され ると、これらの基材は定義された配列のコレクション由来の材料を結合し固定化 できるようになる。 ハイブリダイゼーション用にヌクレオチド配列を表面上に結合するのに適した 固体基材、および基材へのヌクレオチド配列の取り付け方法は、本発明に従って 当業者が用いることができる。しかしながら、現在、好ましい表面はガラスであ る。他の固体基材については、ガラス表面へのヌクレオチドの沈着および結合方 法が当業者によく知られている。例えば、L．A．Crisey，et al.，"Covalent At tachment of Synthetic DNA to Self-Assembled Monolayer Films"，Nucleic Ac ids Res.，24:3031-3039（1996）;Silicon Compounds:Register and Review(Uni ted Chemical Technologies，Inc.，Bristol，Pennsylvania，1993)参照。本発 明の別の具体例において、表面はビーズであってもよい。表面は必ずしも平らで なくてもよいので、垂直な表面も本発明の範囲内であると考えられる。かかる表 面は階段、尾根、ねじれ、段丘等を有していてもよい。 ＩＩＩ．定義されていない配列を含むライブラリー コレクション由来の固定化配列を含むグリッド表面を調製したならば、適当な ハイブリダイゼーション条件下で、定義されていない配列を含むライブラリー由 来の配列と会合させることができる。かかるライブラリーは、未知起源の配列お よび／または既知ヌクレオチド配列を含んでいてもよい。 未知または定義されていない遺伝子、遺伝子フラグメント、または他の核酸配 列 の源を提供するライブラリーは、既知方法を用いて得られるランダムｃＤＮＡラ イブラリーであってもよい。あるいは、選択された器官または組織由来の遺伝子 ライブラリー、またはＲＮＡの混合セットが配列の源であってもよい。適当には 、本発明方法に使用するには、Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING，A LABORA RTORY MANUAL，2nd Ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring H arbor，NY 1989により開示されたような分子生物学のための標準的方法を用いて ＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡに逆転写する。次いで、Fleischmann et al.，Scienc e，269:496-512（1995）により記載された方法に従ってｃＤＮＡライブラリーを 構築する。本発明の目的からすると、定義されていない配列を含むライブラリー は上記のようなライブラリーであってもよい。最も望ましくは、ライブラリーは プラスミドライブラリーである。 好ましい具体例において、未知または定義されていない配列の源は、ヒトＤＮ Ａ、好ましくはヒトｃＤＮＡからなるファージミドライブラリーである。この具 体例は、本発明方法により製造される引き算ライブラリーを構成するハイブリダ イゼーションしない配列の単離に特に有利である。慣用的方法を用いてかかるフ ァージミドライブラリーを調製することができる。例えば、上記Sambrookらの文 献参照。このシステムに使用する適当なベクターはpBluescript［Stratagene，L a Jolla，CA］およびpUC118［J．Vieiraand J．Messing，Methods in Enzymolog y，153:3(1987)］を包含する。他の適当なベクターは当業者によく知られており 、容易に選択されうる。 しかしながら、上記のごとく、他の適当な方法およびベクターを用いて定義さ れていないライブラリーを調製してもよい。例えば、Ｍ１３のごときベクターを 用いてファージライブラリーを製造してもよい。他の適当なベクターは当該分野 において知られている。 これらの定義されていない配列を標識して、固定化配列にハイブリダイゼーシ ョンするＤＮＡの検出を可能にしてもよい。配列を標識するための既知の慣用的 方法を用いてもよい。例えば、蛍光、放射活性、光活性化、ビオチン化、エネル ギー転移、ソリッドステート回路等を本発明に用いてもよい。 望ましくは、慣用的方法を用いて、定義されていない配列を含むライブラリー か ら１本鎖標準ＤＮＡを単離する。例えば、ライブラリーがファージミドライブラ リーである場合、適当なヘルパーファージを用いてライブラリーの１本鎖コピー を粒子中にパッケージする。次いで、得られたファージ粒子を慣用的方法により 単離するのであるが、典型的には慣用的方法は遠心分離および沈殿法を包含する 。１本鎖ＤＮＡの単離のためのかかる方法は当業者によく知られており、本発明 に対する制限要因とはならない。あまり望ましくはないが、２本鎖ＤＮＡを本発 明方法に用いてもよい。 ＩＶ．グリッドへのハイブリダイゼーション 定義されていないライブラリーから得た単離ポリヌクレオチド、好ましくはＤ ＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、定 義されたドライバーライブラリー由来の固定化配列と会合できるようにする。 好ましくは、ハイブリダイゼーションは厳密な条件下、例えば、約９０％以上 同一の配列のみが工程全体にわたってハイブリダイゼーションしたままであるよ うな条件で起こる。しかしながら、所望ならば、他のあまり厳密でない条件を選 択してもよい。例えば、あまり厳密でない条件はハイブリダイゼーションを促進 するには望ましく、それにより引き算ライブラリーのサイズが小さくなる。よっ て、最初のハイブリダイゼーションを非常に低い厳密性において行って相当量の ハイブリダイゼーションを可能にし、非常に小さい引き算ライブラリーを得ても よい。厳密性を増大させた、あるいは増大させるその後の洗浄を用いて引き算ラ イブラリーのサイズおよび内容をコントロールしてもよい。 選択された厳密性におけるハイブリダイゼーションのための方法および条件、 例えば本明細書記載の条件は、当該分野においてよく知られている。例えば、Sa mbrook et al.，MOLECULAR CLONING，A LABORARTORY MANUAL，2nd Ed，Cold Spr ing Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989参照。 好ましくは本明細書のいずれかに場所に記載した条件を用いて複数ラウンドの ハイブリダイゼーションを行うのが好ましい。ハイブリダイゼーションのラウン ド数が約３ないし６であるのが最も好ましい。 Ｖ．ハイブリダイゼーションしないＤＮＡの単離 ハイブリダイゼーション完了後、グリッド表面上の固定化配列にハイブリダイ ゼーションしなかった「定義されていない」配列を標準的方法を用いてハイブリダ イゼーション溶液から回収し、精製する。例えば、上記Sambrookらの文献参照。 ファージミドシステムを用いてＤＮＡが製造される好ましい具体例において、 ハイブリダイゼーションしないＤＮＡの第２鎖を合成することによりハイブリダ イゼーションしないＤＮＡを２本鎖プラスミドに変換する。適当な細胞中の適当 な条件下で、得られたプラスミドを増殖させる。当業者は、使用プラスミドのタ イプを考慮して、適当な宿主細胞を容易に決定できる。しかしながら、望ましく は、細菌細胞から宿主細胞を選択する。現在、好ましい細菌細胞はイー・コリ（ E．coli）株である。細胞培養後、慣用的方法を用いて、生じたコロニーからＤ ＮＡを単離する。 もう１つの具体例において、標識配列を用いることにより、ライブラリーが有 するコレクション由来の固定化配列に共通した配列を本発明方法により迅速に同 定することができる。詳細には、本発明によれば、ハイブリダイゼーションによ り標識配列を容易に直接検出することができ、そのことにより、ライブラリーか ら除去されて引き算ライブラリー中に含まれないであろう配列を同定することが できる。検出される配列は、定義されていないライブラリーおよび定義された配 列のコレクションに共通した配列である。 コロニーから単離されたＤＮＡのコレクションは本発明の引き算ライブラリー を形成する。この引き算ライブラリーは、定義されていない配列を含むライブラ リー中に存在するＤＮＡ配列を含むことにより特徴づけられるが、グリッド表面 上に固定化された定義された配列のコレクション中に存在した配列は除外される 。これらの引き算ライブラリーを維持する方法は当業者によく知られている。 得られた引き算ライブラリー中のＤＮＡを、標準的プロトコール［上記Sambro okらの文献またはABI Prizm配列決定キット,Foster City，CA］を用いて配列決 定してもよく、あるいは他の種々の目的に使用してもよい。 ＶＩ．引き算ライブラリー よって、本発明は、本発明方法により製造される引き算ライブラリーを提供す る。この引き算ライブラリーは、とりわけ、新規遺伝子および遺伝子フラグメン トを包含する新規ヌクレオチド配列の源を提供する。これらの配列、詳細には遺 伝子および遺伝子フラグメントは薬剤候補のスクリーニングに有用でありうる。 それにより得られた情報を医薬産業において利用して新薬を同定することができ る。 さらに、これらの配列を慣用的方法において用いて単離蛋白またはそれにより コードされるペプチドを製造してもよい。本発明の蛋白またはペプチドを製造す るために、本発明方法を用いることにより同定された本発明所望遺伝子のポリヌ クレオチド配列、好ましくはＤＮＡまたはそれらの部分を適当な発現系に挿入す る。好ましい具体例において、蛋白またはペプチドをコードしているポリヌクレ オチド配列がヒト蛋白の発現を可能にする異種発現制御配列に作動可能に連結さ れている組み換え分子またはベクターを構築する。哺乳動物（ヒトを含む）、昆 虫、酵母、真菌および細菌の発現に関して、多くのタイプの適当な発現ベクター および宿主細胞系が当該分野において知られている。 哺乳動物、細菌、真菌または昆虫などの適当な宿主細胞中、あるいは適当なウ イルス中へのこれらのベクターのトランスフェクションは発現蛋白を生じる。ト ランスフェクションに適する宿主細胞、細胞系およびウイルス、ならびにかかる 宿主細胞およびウイルスの構築およびトランスフェクション方法は良く知られて いる。トランスフェクション、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物の製造 および精製のための適当な方法も当該分野において知られている。 １の具体例において、本発明により同定されたヌクレオチドおよびそれにより コードされる蛋白またはペプチドを、慣用的な診断アッセイによる疾病または感 染の診断に有用な診断用組成物として用いることができる。例えば、動物の生物 学的試料中の本発明ヌクレオチド配列または蛋白を検出可能に標的とする診断試 薬を開発することができる。かかる試薬は相捕的ヌクレオチド配列、抗体（モノ クローナル、組み換えまたはポリクローナル）、または化学的に誘導されたアゴ ニストまたはア ンタゴニストであってもよい。別法として、本発明ヌクレオチドおよびそれによ りコードされる蛋白またはペプチド、それらのフラグメント、またはそれらに相 捕的な配列自体を診断試薬として用いてもよい。これらの試薬は、例えば、放射 性同位元素または比色測定酵素で標識されていてもよい。適当な診断アッセイフ ォーマットおよび検出系の選択は当業者の技量の範囲内であり、さらに説明を要 することなく容易に選定できる。 さらに、本発明により同定された遺伝子および蛋白または他の配列を治療的に 使用してもよい。例えば、本発明引き算ライブラリーを用いて同定されたヌクレ オチド、蛋白またはペプチドを、治療薬として有用な天然または合成化合物のス クリーニングおよび開発のための標的として役立ててもよい。遺伝子発現または 蛋白を阻害する化合物も治療上有用と考えられる。さらに、生物に必須の遺伝子 の発現を促進する化合物を用いてもよい。 慣用的アッセイおよび方法をかかる薬剤のスクリーニングに使用してもよい。 例えば、これらのヌクレオチド配列によりコードされる蛋白に特異的に結合また は阻害する化合物の同定方法は、簡単には、選択蛋白または遺伝子産物を試験化 合物と接触させて試験化合物を化合物に結合させ、ついで、蛋白に結合している 試験化合物（存在すれば）の量を測定することを含むものであってもよい。かか る方法は、試験化合物および固体支持体上に固定化された蛋白をインキュベーシ ョンすることを含むものであってもよい。さらに他の慣用的薬剤スクリーニング 方法は、適当なコンピュータープログラムを用いて遺伝子産物またはその部分の 構造と類似または相捕的構造を有する化合物を決定し、蛋白への競争的結合につ いてこれらの化合物をスクリーニングすることを含むものであってもよい。同一 化合物を単独で、あるいは他の有効成分と一緒に適当な治療処方中に含有させて もよい。治療組成物の処方方法ならびに適当な医薬担体等は当業者によく知られ ている。 したがって、かかる方法の使用により、本発明は、これらの遺伝子（または他 のヌクレオチド配列）、またはそれらによりコードされる蛋白もしくはその部分 と相互作用し、所望により生物学的活性を促進または低下させることのできる化 合物を提供すると考えられる。よって、これらの化合物も本発明の範囲内である 。 ＶＩＩ．引き算プローブ さらに、本発明は、本発明方法による引き算によって得られるプローブを提供 する。下記方法ならびに本明細書のいずれかの場所に記載の方法を用いてこれら のプローブを得てもよい。未知ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡの混合物か ら既知遺伝子を引き算することによって、引き算プローブを作成してもよい。本 発明による引き算ラウンドの後、残ったポリヌクレオチドは、例えば本発明ハイ ブリダイゼーション方法により未知ポリヌクレオチドをプローブするためのプロ ーブである。よく知られた方法、例えば比色標識または放射性標識を用いてこれ らのプローブを標識してもよい。これらの引き算プローブは、とりわけ、新規遺 伝子および遺伝子フラグメントを包含する新規ヌクレオチド配列の源を提供し、 それらは未知ポリヌクレオチド配列、特に混合物およびライブラリー中の、グリ ッドになった、あるいは溶液中の未知のポリヌクレオチド配列の検出に特に有用 である。これらのプローブ配列、ならびに特に遺伝子および遺伝子フラグメント は、薬剤スクリーニングのための標的候補をスクリーニングすることにおいて有 用でありうる。それにより得られる情報を医薬産業において用いて新薬を同定す ることができる。 引き算プローブを用いてＰＣＲのごときポリヌクレオチド増幅反応を開始させ てもよい。これを行うために、分子の少なくとも一方の末端にプライミング部位 を含む縮重ポリヌクレオチド配列を用いて引き算プローブを作成することができ る。各末端に１つずつ、２つのプライミング部位を分子に付加してもよく、これ らは同じ配列であってもよく、異なる配列であってもよい。例えば、長さ約５な いし４０ヌクレオチドの既知配列であるプライミング部位を、リガーゼを用いて 引き算プローブに付加してもよい。これらの引き算プローブを、溶液中または固 体支持体上での増幅のためのプライマーとして用いてもよい。好ましい方法にお いて、これらのプライマーを固体支持体上のポリヌクレオチドのコレクションと ハイブリダイゼーションさせる。ハイブリダイゼーション後、増幅により、好ま しくはＰＣＲにより、２本鎖ＤＮＡのごとき２本鎖ポリヌクレオチドを製造する ことができる。増幅に有用なポリヌクレオチドプライマーは、プライミング部位 （複数も可）に相捕的な配列 を含み、１種よりも多く、それらは異なったものである。例えば既知方法または 本明細書記載の方法、例えばIn Vitrogen(Carlsbad，CA)のゼロ平滑末端キット を用いて、増幅されたフラグメントをクローン化してもよい。 さらに、これらのプローブ配列を慣用的方法に使用して、ハイブリダイゼーシ ョンにより遺伝子を得てもよく、それらの遺伝子を用いてそれらによりコードさ れている単離蛋白またはペプチドを製造してもよい。本明細書のいずれかの場所 に記載した方法を用いて本発明蛋白またはペプチドを製造してもよい。 １の具体例において、本発明により同定されたプローブヌクレオチドを、本明 細書のいずれかの場所に記載した方法または当該分野で知られた方法による疾病 または感染の診断において有用な診断組成物として用いることができる。 これらの実施例は本発明の好ましい方法を説明する。これらの実施例は説明だ けが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１−引き算ライブラリーの製造 Ａ．既知ｃＤＮＡ配列のコレクションの固定化 定義されたＤＮＡを含むドライバーコレクションを下記のごとく固体ガラス表 面上にグリッド化する。コレクションをpBluescriptベクター(Stratagene，La J olla，CA)中に組み込み、ベクター特異的プラマーを用いるＰＣＲによりインサ ートを回収する。ｃＤＮＡを含むインサートを毛細管によりガラス表面上に沈着 させ、標準法を用いて取り付ける[Silicon Compounds:Register and Review(Uni ted Chemical Technologies，Inc.，Bristol，Pennsylvania，(1993)]。 Ｂ．定義されていないｃＤＮＡライブラリーの形成 所望の源からの定義されていないｃＤＮＡライブラリーを、修飾ベクターを代 用すること以外は製造者の指示に従ってSuperScriptシステム（Life Technologi es，Gaithersburg，MD）を用いて構築する。簡単に説明すると、所望クローニン グ部位を含むように、かつpBluescriptの多重クローニング部位を除去して偽ハ イブリダイゼーションを回避するように、pUC118［J．Vieira and Messing，Met hods in Enzymology，153:3(1987)］を修飾する。望ましくない配列の欠失を、 製造者のプ ロトコールまたは別の慣用的方法によりQuick Change Mutagenesis kit(Stratag ene，La Jolla，CA)を用いて行ってもよい。バクテリオファージとして、例えば ファージミドベクターとしてパッケージされた１本鎖ＤＮＡの単離を可能にする 配列を含むように、ベクターをあらかじめ処理しておく。 Ｃ．引き算 Sambrookらの上記文献に記載の方法に従ってヘルパーファージを用いて、引き 算すべきライブラリー（Ｂで述べたｃＤＮＡライブラリー）から１本鎖ＤＮＡを 単離する。４ｘＳＳＣ、４２℃、１６〜１８時間、２０μｌの条件を用いて１本 鎖ライブラリーをＡで述べたグリッド化ライブラリーとハイブリダイゼーション させる。適当なハイブリダイゼーション時間後、ハイブリダイゼーション溶液を 除去し、標準法（上記Sambrookら）を用いて沈殿させる。好ましい具体例におい て、好ましくは実施例１Ｃの条件を用いて複数ラウンドのハイブリダイゼーショ ンを行う。ハイブリダイゼーションラウンド数が約４であるのが最も好ましい。 別法として、より低温、例えば３７℃でハイブリダイゼーションを行ってもよ い。ハイブリダイゼーション後、まず、ハイブリダイゼーション溶液を集め、つ いで、下記のごとく処理する。グリッドを３７℃において２Ｘ ＳＳＣで洗浄し 、洗液を集め、ついで、沈殿させる。ＤＮＡを下記のごとく回収する。ついで、 より高温で、例えば６５℃でこれらの工程を繰り返し、その後、両方の温度にお いて０.２ＸＳＳＣで洗浄する。 ハイブリダイゼーション後、沈殿したＤＮＡを標準的手順（Sambrookらの上記 文献）を用いて２本鎖ＤＮＡに変換する。簡単に説明すると、ベクター−特異的 オリゴヌクレオチドをライブラリーとハイブリダイゼーションさせ、ついで、Ｔ ４リガーゼの存在下でイー・コリのＤＮＡポリメラーゼにより第２鎖を合成して 反応を完了する。 得られた２本鎖ＤＮＡを適当なイー・コリ宿主株(例えば、DH5alpha，Life Sci ences Technology，Gaithersburg，MD)中にエレクトロポレーションで導入し、 得られたコロニーを集め、引き算ライブラリーを得る。 特許および特許出願に限らず、本明細書に引用したすべての刊行物および文献 を、 参照によりそれぞれの全体が本明細書に記載されているものとみなす。本願が優 先権を主張する特許出願もまた、上記刊行物および文献と同様に参照により全体 が本明細書に記載されているものとみなす。 上記説明は、本発明の好ましい具体例を含めて本発明を十分に開示する。特別 に本明細書に開示した具体例の修飾および改良は下記請求の範囲の範囲内である 。さらなる努力をすることなく、上記説明を用いて本発明を最大限に利用できる と確信する。それゆえ、本明細書記載の実施例は単に説明的なものであって、本 発明の範囲を何ら限定しないと解すべきである。独占排他権が請求されている本 発明の具体例を以下に定義する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記工程： （ａ）既知核酸配列を含むコレクションを固定化した表面を用意し、 （ｂ）定義されていない配列を含む核酸配列のライブラリーを表面とハイブリ ダイゼーションさせ、ついで （ｃ）ハイブリダイゼーションしない核酸を単離する ことを含む、核酸引き算ライブラリーの製造方法。 ２．表面がガラスである請求項１記載の方法。 ３．ライブラリーから単離される核酸がＤＮＡである請求項１記載の方法。 ４．ＤＮＡが１本鎖である請求項３記載の方法。 ５．コレクションの核酸がＤＮＡである請求項１記載の方法。 ６．ＤＮＡがｃＤＮＡである請求項５記載の方法。 ７．ファージミドベクターを用いてライブラリーが製造される請求項２記載の 方法。 ８．ｐＵＣ１１８ベクターを用いてライブラリーが製造される請求項７記載の 方法。 ９．（ａ）ハイブリダイゼーションしないＤＮＡの第２鎖を合成して活性ファ ージミドＤＮＡを得て、 （ｂ）ファージミドを増殖させ、ついで （ｃ）少なくとも１つのクローンを単離する ことを含む工程によりハイブリダイゼーションしないＤＮＡが単離される、請求 項７記載の方法。 １０．ファージミドを細菌細胞において増殖させる請求項９記載の方法。 １１．ファージベクターを用いてライブラリーが製造される請求項２記載の方 法。 １２．ハイブリダイゼーションしないＤＮＡの第２鎖を合成して活性ファージ ＤＮＡを得て、ファージを増殖させ、ついで、プラークを単離することを含む工 程により、ハイブリダイゼーションしないＤＮＡが単離される請求項１１記載の 方法。 １３．ＲＮＡの混合セットからライブラリーが製造される請求項１記載の方法 。 １４．ライブラリーがヒトｃＤＮＡライブラリーである請求項１記載の方法。 １５．請求項１の方法に従って製造される引き算ライブラリー。 １６．請求項１の方法に従って製造される引き算ライブラリーから単離される 配列。 １７．請求項１５の配列の発現により製造される単離蛋白。 １８．定義された配列の存在について、定義されていない配列を含むライブラ リーを迅速にスクリーニングする方法であって、下記工程： （ａ）既知核酸配列を含むコレクションを有する表面を用意し、 （ｂ）定義されていない配列を含むライブラリーから単離された核酸配列を表 面とハイブリダイゼーションさせ（該配列は標識されている）、ついで （ｃ）ハイブリダイゼーションした核酸配列を検出する を含む方法。 １９．ライブラリーから単離された核酸配列がＤＮＡである請求項１８記載の 方法。