KR20090007962A - Methods for decreasing false signals in immunoassay to detect a multimeric form from a monomeric form of multimer-forming polypeptides - Google Patents

Methods for decreasing false signals in immunoassay to detect a multimeric form from a monomeric form of multimer-forming polypeptides

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KR20090007962A
KR20090007962A KR1020070071218A KR20070071218A KR20090007962A KR 20090007962 A KR20090007962 A KR 20090007962A KR 1020070071218 A KR1020070071218 A KR 1020070071218A KR 20070071218 A KR20070071218 A KR 20070071218A KR 20090007962 A KR20090007962 A KR 20090007962A
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multimer
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detection antibody
bound
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오현정
임군택
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주식회사 피플바이오
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Abstract

A method for reducing the error signal of computer in the immunoassay for detecting the multimer type of multimer-forming polypeptide engaging in various diseases is provided to increase the detection speed of the multimer type from the monomer type and detect the scrapie form of prion. The error signal in the immunoassay for detecting the multimer type of multimer-forming polypeptide as antibody is reduced by contacting a fresh sample with NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form)). The method for detecting the multimer type of multimer-forming polypeptide in a fresh sample comprises the steps of: (a) preparing the capture antibody complex by three-dimensionally binding the capture antibody on the surface of solid phase carrier, wherein the capture antibody binds to a certain epitope of the multimer-forming polypeptide; (b) preparing the detection antibody, wherein the epitope recognized by the detection antibody is located in the position capable of causing steric hindrance by the capture antibody bound to the epitope of capture antibody; (c) pre-treating the fresh sample with NADPH; (d) detecting the fresh sample with the carrier-capture antibody complex and detection antibody; and (e) detecting the complex of carrier-capture antibody-multimer type polypeptide-detection antibody.

Description

멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법{Methods for Decreasing False Signals in Immunoassay to Detect a Multimeric Form from a Monomeric Form of Multimer-Forming Polypeptides}Methods for Decreasing False Signals in Immunoassay to Detect a Multimeric Form from a Monomeric Form of Multimer-Forming Polypeptides}

본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법 및 이를 이용한 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법에 관한 것이다. The present invention provides a method for reducing an error signal in an immunoassay for detecting a multimer form of a multimer-forming polypeptide with an antibody, and a method for fractionally detecting a multimer form from monomeric forms of a multimer-forming polypeptide in a raw sample using the same. It is about.

단백질을 구성하는 폴리펩타이드는 멀티머를 형성하여 기능적인 단백질을 이루는 경우도 있지만, 정상적인 상태에서는 모노머로 존재하다가 비정상적인 상태(예컨대, 미스폴딩형으로 전환)가 되면 멀티머를 형성하여 응집되어 질병을 유발하는 경우가 많다. 예를 들어, 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 스폰지폼 뇌질환에 관여하는 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레 인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β2-마이크로글로블린이 미스폴딩형으로 전환되면 응집되어 질병을 유발하게 된다.Polypeptides that make up a protein may form a multimer to form a functional protein, but in a normal state, the monomer is present as a monomer, but when it becomes an abnormal state (for example, it is converted to misfolding type), it forms a multimer and aggregates to prevent disease It is often triggered. For example, Aβ peptides and tau proteins involved in Alzheimer's disease, prions involved in sponge foam brain disease, α-synuclein involved in Parkinson's disease, Ig light chains involved in primary systemic amyloidosis, and secondary systemic amyloidosis Serum amyloid A, tau protein involved in proto-temporal dementia, transthyretin involved in geriatric systemic amyloidosis, transthyretin involved in familial amyloid polyneuropathy, cystatin C involved in hereditary cerebral amyloid vasculitis When β 2 -microglobulin, which is involved in stone-associated amyloidosis, is converted to misfolding, it aggregates and causes disease.

이와 같이, 멀티머-형성 폴리펩타이드는 질병과 관련하여 특히 중요한 위치를 차지하는 데, 이러한 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머 형태를 모노머로부터 분별적으로 검출할 수 있는 방법은 개발되지 않았다.As such, multimer-forming polypeptides occupy a particularly important position in relation to disease, and no method has been developed to detect the multimeric forms of such multimer-forming polypeptides from monomers.

본 발명자들은 특정 병적 상태에 있으면 모노머형에서 멀티머형으로 전환되는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 특이적으로 검출하는 시스템을 개발하였다. 종래 본 발명자들이 개발한 멀티머 검출용 면역분석 프로토콜은 멀티머형에 대한 시그널은 대체적으로 높게 나왔지만, 오류 시그널(즉, 정상 시료에서 나오는 시그널)은 효율적으로 차단하지 못하였다. 이에, 본 발명자들은 이러한 오류 시그널을 최대한 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 생시료를 NADPH와 전처리 한 후에 면역 분석을 하면 이러한 오류 시그널이 크게 감소됨을 확인하였다.We have developed a system that specifically detects the multimer form of a multimer-forming polypeptide that is converted from monomeric to multimer form when in a particular pathological state. In the conventional immunoassay protocol for detecting multimers developed by the present inventors, the signal for the multimer type is generally high, but the error signal (ie, the signal from the normal sample) is not efficiently blocked. Therefore, the present inventors have tried to develop a method that can reduce the error signal as much as possible, and as a result it was confirmed that this error signal is greatly reduced when the immunoassay after pre-treatment with raw samples NADPH.

따라서, 본 발명의 목적은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for reducing error signals in immunoassays for detecting multimer forms of multimer-forming polypeptides with antibodies.

본 발명의 다른 목적은 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a method for fractionally detecting a multimer form from a monomeric form of a multimer-forming polypeptide in a raw sample.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 생시료를 NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a immunoassay for detecting a multimer form of a multimer-forming polypeptide, comprising contacting a raw sample with a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form). Provides a way to reduce error signals.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for fractionally detecting a multimer form from a monomeric form of a multimer-forming polypeptide in a raw sample comprising the following steps:

(a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고; (a) three-dimensionally binding a capture antibody to the surface of a solid phase carrier to prepare a carrier-capture antibody complex, wherein the capture antibody comprises one specific epitope of the multimer-forming polypeptide. Bound to;

(b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며; (b) preparing a detection antibody, wherein the epitope recognized by the detection antibody is in a position that causes steric hindrance by the capture antibody bound to the epitope of the capture antibody when the detection antibody binds to the epitope; Characterized;

(c) 생시료를 NADPH로 전처리하는 단계; (c) pretreatment of the raw sample with NADPH;

(d) 상기 생시료에 상기 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체를 반응시키는 단계; 및 (d) reacting the carrier-captured antibody complex and the detection antibody to the raw sample; And

(e) 상기 단계 (d)에서 형성된 캐리어-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.(e) detecting the carrier-captured antibody-multimeric polypeptide-detecting antibody complex formed in step (d).

일반적으로 특정 항원에 대한 항체를 이용하는 면역분석에서 이론적으로는 특정 항원에 대한 시그널만이 나와야 한다. 그러나 실제적으로 면역분석을 실시하여 보면, 특정 항원이 없는 시료에서도 항원의 존재에 대한 시그널이 나온다. 이러한 오류 시그널은 면역분석의 정확성 및 재현성(reproducibility)에 크게 악형향을 미치게 된다.In general, immunoassays using antibodies to specific antigens should theoretically yield only signals for specific antigens. In practice, however, immunoassays reveal signals for the presence of antigens even in samples without specific antigens. These error signals have a major adverse effect on the accuracy and reproducibility of immunoassays.

본 발명자들은 특정 병적 상태에 있으면 모노머형에서 멀티머형으로 전환되는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 특이적으로 검출하는 시스템을 개발하였다. 종래 본 발명자들이 개발한 멀티머 검출용 면역분석 프로토콜은 멀티머형에 대한 시그널은 대체적으로 높게 나왔지만, 오류 시그널(즉, 정상 시료에서 나오는 시그널)은 효율적으로 차단하지 못하였다. 이에, 본 발명자들은 이러한 오류 시그널을 최대한 감소시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였고, 그 결과 생시료를 NADPH와 전처리 한 후에 면역 분석을 하면 이러한 오류 시그널이 크게 감소됨을 확인하였다.We have developed a system that specifically detects the multimer form of a multimer-forming polypeptide that is converted from monomeric to multimer form when in a particular pathological state. In the conventional immunoassay protocol for detecting multimers developed by the present inventors, the signal for the multimer type is generally high, but the error signal (ie, the signal from the normal sample) is not efficiently blocked. Therefore, the present inventors have tried to develop a method that can reduce the error signal as much as possible, and as a result it was confirmed that this error signal is greatly reduced when the immunoassay after pre-treatment with raw samples NADPH.

또한, 본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노머형으로부터 분별적으로 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 기본적으로 항원-항체 반응을 이용하며, 에피토프에 결합된 포획항체 및 검출항체가 서로 입체적 방해를 일으켜 경쟁적 관계에 있게 되는 2종의 항체, 즉 포획항체 및 검출항체를 이용하고, 포획항체와 검출항체가 3차원적으로 분석대상의 시료와 접촉하게 되는 환경에서 실시하는 것을 특징으로 한다.The present invention also provides a method of fractionally detecting a multimer form of a multimer-forming polypeptide from a monomeric form. The method of the present invention basically uses an antigen-antibody reaction, and employs two kinds of antibodies, that is, a capture antibody and a detection antibody, in which a capture antibody and a detection antibody bound to an epitope are in a three-dimensional interference with each other, thereby becoming in a competitive relationship, The capture antibody and the detection antibody are characterized in that it is carried out in an environment that comes into contact with the sample to be analyzed in three dimensions.

본 발명자들은 이미 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노머형으로부 터 분별적으로 검출하는 방법을 이미 개발하였고, 이를 멀티머 검출 시스템(Multimer Detection System: MDS)로 명명하고, PCT 출원하였다(PCT/KR2005/004001, 대한민국 특허출원 2005-0013877(2005년 2월 19일 출원)와 PCT/KR2005/000733(2005년 3월 11일 출원)에 대하여 우선권 주장). 본 발명은 본 발명자들의 MDS를 더욱 발전시킨 것으로서, MDS의 검출도 및 분별력을 더욱 향상시켰다. 본 발명의 가장 큰 특징은 포획항체와 검출항체가 3차원적으로 분석대상의 시료와 접촉하는 것이므로, 본 발명에서 제시되는 방법을 “MDS-3D(three dimensional) 시스템”으로 명명한다.The present inventors have already developed a method for the differential detection of a multimer form of a multimer-forming polypeptide from a monomer form, named it a Multimer Detection System (MDS), and applied for a PCT ( PCT / KR2005 / 004001, Republic of Korea Patent Application 2005-0013877 (filed February 19, 2005) and PCT / KR2005 / 000733 (filed March 11, 2005). The present invention further develops the inventors' MDS, further improving the detectability and discernment of the MDS. The biggest feature of the present invention is that the capture antibody and the detection antibody come into contact with the sample to be analyzed three-dimensionally, so that the method proposed in the present invention is called "MDS-3D (three dimensional system)".

본 명세서에서 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 응집형(aggregation form), 특히 컨포메이션의 변화에 의해 응집형을 형성할 수 있는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 응집형 폴리펩타이드는 다양한 질환, 예컨대, 알츠하이머 질환, 스폰지폼 뇌질환, 파킨슨 질환, 일차 전신성 아밀로이드증, 이차 전신성 아밀로이드증, 프론토-일시적 치매, 노인 전신성 아밀로이드증, 가족성 아밀로이드 다발신경병, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병, 혈투석-관련 아밀로이드증, 크로이츠펠드-야곱 증후군, 헌팅톤 질환 및 타입 II 당뇨병을 유발한다. 따라서 용어 “멀티머-형성 폴리펩타이드”는 응집형-형성 폴리펩타이드와 상호 교환적으로 사용된다.As used herein, the term “multimer-forming polypeptide” refers to an aggregation form, particularly a polypeptide capable of forming an aggregate by changing the conformation. Such aggregated polypeptides can be used for various diseases such as Alzheimer's disease, sponge foam brain disease, Parkinson's disease, primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis, proto-temporal dementia, elderly systemic amyloidosis, familial amyloid polyneuropathy, hereditary cerebral amyloid angiopathy , Hemodialysis-related amyloidosis, Creutzfeld-Jacob syndrome, Huntington's disease and type II diabetes. Thus the term “multimer-forming polypeptide” is used interchangeably with aggregate-forming polypeptide.

본 발명은 2종의 항체, 즉 포획항체 및 검출항체를 이용한다. 용어 “포획항체”는 생시료 내의 타깃으로 하는 멀티머-형성 폴리펩타이드에 결합능을 가지는 항체를 의미한다. 용어 “검출항체”는 포획항체에 의해 포획된 멀티머-형성 폴 리펩타이드에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “항체”는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 항체는 전 항체(entire antibody)뿐만 아니라, 에피토프, 항원 또는 항원성 단편에 결합능을 가지는 항체 단편(예컨대, F(ab’)2, Fab’, Fab, Fv)도 포함한다.The present invention utilizes two kinds of antibodies, namely capture antibodies and detection antibodies. The term “capture antibody” means an antibody that has the ability to bind to a multimer-forming polypeptide targeted in a raw sample. The term “detection antibody” refers to an antibody capable of binding to a multimer-forming polypeptide captured by a capture antibody. As used herein, the term “antibody” refers to an immunoglobulin protein capable of binding to an antigen. Antibodies include not only whole antibodies, but also antibody fragments (eg F (ab ') 2, Fab', Fab, Fv) that have the ability to bind epitopes, antigens or antigenic fragments.

본 발명에 따르면, 검출항체와 포획항체의 에피토프들은 여기에 결합된 항체들이 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 놓여 있는 것이다. 바람직하게는, 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열은 동일하거나, 중첩되거나 또는 인접한 아미노산 서열을 가진다. 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열이 동일하거나 중첩된 경우에는 여기에 결합된 포획항체와 검출항체가 서로 입체적 방해, 즉 경쟁적 결합을 하게 되는 것은 쉽게 이해할 수 있다. 또한, 상기 2종의 에피토프가 서로 인접한 아미노산 서열이라는 것은, 상술한 입체적 방해, 즉 경쟁적 결합을 유발할 수 있을 정도의 거리에 있는 아미노산 서열이라는 의미를 가진다.According to the present invention, the epitopes of the detection antibody and the capture antibody are positioned at a position causing steric hindrance. Preferably, the amino acid sequence of the epitope of the capture antibody and the epitope of the detection antibody have the same, overlapping or contiguous amino acid sequence. When the epitope of the capture antibody and the amino acid sequence of the epitope of the detection antibody are the same or overlapping, it is easily understood that the capture antibody and the detection antibody bound thereto are steric hindrance, that is, competitive binding to each other. In addition, the two epitopes are adjacent to each other, the amino acid sequence means that the above-described three-dimensional interference, that is, the amino acid sequence at a distance enough to cause a competitive bond.

본 발명의 특징 중 하나는, 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 것이다. 예컨대, 입체적 비드에 포획항체를 결합시키는 것이 이에 해당한다. 그러나 플레이트 표면 상에 포획항체를 결합시키는 것은 2차원적인 결합이므로 본 발명에서 제외된다. 이렇게 입체적으로 캐리어에 결합된 포획항체는 3차원 방식으로 생시료와 접촉하게 되며, 이는 생시료와 접촉할 수 있는 기회를 더 많이 갖도록 한다.One of the features of the present invention is to prepare a carrier-capture antibody complex by three-dimensionally binding the capture antibody to the surface of a solid phase carrier. For example, binding capture antibodies to steric beads. However, binding the capture antibody on the plate surface is excluded in the present invention because it is a two-dimensional binding. Such three-dimensionally bound carriers are brought into contact with the raw sample in a three-dimensional manner, which provides more opportunities for contact with the raw sample.

포획항체가 결합되는 고상의 캐리어는 입체적 구조를 가지는 어떠한 물질도 가능하며, 바람직하게는, 무게(gravity), 전하 또는 자기에 의해 쉽게 분리 또는 회수도리 수 있는 물질이다. 가장 바람직하게는, 고상의 캐리어는 자성 비드이다.The solid carrier to which the capture antibody is bound may be any material having a three-dimensional structure, and is preferably a material that can be easily separated or recovered by gravity, charge or magnetism. Most preferably, the solid carrier is magnetic beads.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 검출항체에는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있거나 친화성 물질이 결합되어 있다. 상기 레이블은 효소(예컨대, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제, β-글루코시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질((예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent), OLED(organic light emitting diode) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출을 용이하게 하기 위하여, 검출항체에 결합될 수 있는 친화성 물질은 바이오틴을 포함한다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the detection antibody is bound to a label that generates a detectable signal or to an affinity substance. The label may include enzymes (eg alkaline phosphatase, β-galactosidase, horseradish peroxidase, β-glucosidase and cytochrome P 450 ), radioactive substances (eg, C 14 , I 125 , P 32 And S 35 ), fluorescent materials (eg, fluorescein), luminescent materials, chemiluminescent, organic light emitting diodes (OLEDs), and fluorescence resonance energy transfer (FRET). In order to facilitate detection, affinity substances that can be bound to the detection antibody include biotin. Various labels and labeling methods are described in Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.

검출항체에 결합하는 레이블로서 방사능동위원소가 이용되는 경우에는, 본 발명의 최종 과정에서 형성된 항원-항체 복합체를 방사능을 측정함으로써 검출할 수 있다. 검출항체에 결합하는 레이블로서 발색반응을 촉매하는 효소가 이용되는 경우에는, 효소반응에 이용되는 기질을 본 발명의 측정 시스템에 첨가하여 반응 생성물을 측정하여, 항원-항체 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 레이블로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용될 수 있고, 호스래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다.When a radioisotope is used as a label binding to a detection antibody, the antigen-antibody complex formed in the final process of the present invention can be detected by measuring radioactivity. When an enzyme catalyzing a color reaction is used as a label binding to a detection antibody, the substrate used for the enzymatic reaction can be added to the measurement system of the present invention to measure the reaction product to detect the antigen-antibody complex. For example, when alkaline phosphatase is used as a label, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-AS-B1-phosphate (naphthol-AS-B1) as substrates chromogenic reaction substrates such as -phosphate) and enhanced chemifluorescence (ECF) can be used, and chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis) when horseradish peroxidase is used -N-methylacridinium nitrate), resorupin benzyl ether, luminol, Amflex Red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), TMB (3,3,5,5-tetramethylbenzidine) Substrates such as ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) and o -phenylenediamine (OPD) can be used.

검출항체에 친화성 물질이 결합되는 경우에는, 이 친화성 물질에 결합하는 파트너에 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블(예컨대, 발색 반응-촉매 효소)이 결합된 물질을 이용하여 항원-항체 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 바이오틴이 결합된 검출항체를 이용하는 경우에는, 스트렙타비딘이 결합된 발색 반응-촉매 효소(예컨대, 호스래디쉬 퍼옥시다아제)를 항원-항체 복합체에 처리한 다음, 발색 반응 기질을 반응시켜 나오는 시그널을 검출함으로써, 항원-항체 복합체를 검출하게 된다.When an affinity substance is bound to a detection antibody, the antigen-antibody complex is detected using a substance bound to a label (eg, a color reaction-catalyst) that generates a detectable signal to a partner that binds the affinity substance. can do. For example, in the case of using a biotin-coupled detection antibody, a streptavidin-coupled color reaction-catalyst (eg, horseradish peroxidase) is treated to the antigen-antibody complex, and then the color reaction substrate is reacted. By detecting the resulting signal, the antigen-antibody complex is detected.

이러한 표지는 상기 단계 (e)에서 멀티머형 항원-항체 복합체의 검출을 용이하게 할 뿐만 아니라 정량적 분석도 가능하게 한다. 검출항체에 표지가 결합된 경우, 단계 (e)는 폴리펩타이드의 멀티머형에 결합된 검출항체의 표지로부터 나오는 신호를 측정하여 실시된다.This label not only facilitates the detection of the multimeric antigen-antibody complexes in step (e) but also enables quantitative analysis. When the label is bound to the detection antibody, step (e) is performed by measuring a signal from the label of the detection antibody bound to the multimer of the polypeptide.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 캐리어-포획항체와 검출항체를 시료에 동시에 처리하는 것이다. 만일, 두 항체를 동시에 처리하지 않고, 포획항체를 먼저 처리한 다음 검출항체를 처리하게 되면, 유리 상태(free form)의 캐리어-포획항체는 플레이트의 표면에 고정되어 있는 항체와는 달리 멀티머형에 존재하는 다수의 에피토프에 결합함으로써, 나중에 검출항체가 에피토프(상기 포획항체에 대한 에피토프와 동일, 중첩 또는 인접한 에피토프)에 결합하는 것을 입체적으로 방해하는 문제점이 있다. 따라서 별도 처리를 하게 되면, 검출항체에 의한 시그널이 매우 미약하게 나온다. 그러나 두 항체를 동시에 처리하면, 포획항체와 검출항체가 에피토프에 서로 경쟁적인 상태에 놓이게 되며, 농도-의존적으로 두 항체가 에피토프에 결합하게 된다.According to a preferred embodiment of the present invention, the carrier-trapping antibody and the detection antibody are simultaneously treated with the sample. If the two antibodies are not treated simultaneously and the capture antibody is treated first and then the detection antibody is processed, the free form carrier-captured antibody is multimerized unlike the antibody immobilized on the surface of the plate. By binding to a number of epitopes present, there is a problem that laterly prevents the detection antibody from binding to the epitope (the same, overlapping or adjacent epitope as the epitope for the capture antibody). Therefore, when the treatment is performed separately, the signal generated by the detection antibody is very weak. However, if two antibodies are treated simultaneously, the capture antibody and the detection antibody are in competition with each other for the epitope, and both antibodies bind to the epitope in a concentration-dependent manner.

본 명세서에서 캐리어-포획항체와 검출항체를 언급하면서 사용되는 용어 “동시 처리”는 (i) 캐리어-포획항체와 검출항체 각각을 시료에 동시에 처리하는 것 또는 (ii) 캐리어-포획항체와 검출항체의 혼합 칵테일을 시료에 처리하는 것을 의미한다.The term “simultaneous treatment” as used herein referring to a carrier-capturing antibody and a detection antibody refers to (i) simultaneously treating each of the carrier-capturing antibody and a detection antibody to a sample, or (ii) the carrier-capturing antibody and a detection antibody Means that the mixed cocktail is treated in the sample.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 포획항체와 검출항체는 몰비 5:1-1:5로 동시에 첨가된다.According to a preferred embodiment of the invention, in step (c) the capture antibody and the detection antibody are added simultaneously in a molar ratio of 5: 1-1: 5.

본 발명은 어떠한 멀티머-형성 폴리펩타이드도 멀티머형을 모노머형으로부터 분별적으로 검출할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 검출할 수 있는 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 스폰지폼 뇌질환에 관여하는 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클 레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β2-마이크로글로블린이다.The present invention can detect any multimer-forming polypeptide from the monomeric form separately. Preferably, the multimer-forming polypeptide detectable by the method of the present invention is an Αβ peptide involved in Alzheimer's disease, a tau protein, a prion involved in sponge foam brain disease, and an α-synucule involved in Parkinson's disease. Lane, Ig light chain involved in primary systemic amyloidosis, serum amyloid A involved in secondary systemic amyloidosis, tau protein involved in proto-temporal dementia, transthyretin involved in elderly systemic amyloidosis, and involved in familial amyloid polyneuropathy Transtiretin, cystatin C involved in hereditary cerebral amyloid vasculature or β 2 -microglobulin involved in hemodialysis-related amyloidosis.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질이다.According to the most preferred embodiment of the invention, the multimer-forming polypeptide of interest is a prion protein.

사람에 있어서 산재성 및 가족성 크로이츠펠드-야곱 증후군, 쿠루 및 게르스트만-샤잉커 증후군, 염소와 양에서의 이질, 그리고 소의 스폼지폼 뇌증은 치명적인 퇴행성 신경질환으로서, 이들은 전염성 스폰지폼 뇌질환(transmissible spongiform encephalopathies: TSE)에 기인한다(Prusiner S.B. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:13363-13383(1998); and Hope J. Curr . Opin . Genet. Dev . 10, 568-57(2000)). 프라이온 단백질의 비정상적 동형체 및 이질형(scrapie form)(PrPsc) 및 이의 축적은 TSE의 주 요인으로 강력하게 제안되고 있다(Caughey B. Trends Biochem . Sci . 26:235-42(2001)). In humans, disseminated and familial Creutzfeldt-Jakob syndrome, Kuru and Gerstmann-Schainker syndrome, dysentery in goats and sheep, and bovine sporefoam encephalopathy are fatal degenerative neurological diseases, which are infectious sponge-foam brain diseases (transmissible spongiform encephalopathies (TSE)) (Prusiner SB Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95: 13363-13383 (1998); and Hope J. Curr . Opin . Genet. Dev . 10, 568-57 (2000). )). Abnormal isoforms and scrapie forms of prion proteins (PrP sc ) and their accumulation have been strongly suggested as major factors of TSE (Caughey B. Trends Biochem . Sci . 26: 235-42 (2001)). .

프라이온 단백질의 정상형(PrPc)은 α-사슬 및 유연하게 비정돈된 부위를 포함하며(Zahn, R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97:145-150(2000)), 이질형(PrPsc)은 많은 β-쉬트 구조를 갖고 있다(Caughey, B., et al., J. Biol . Chem. 273:32230-35(1998)). 질병 진행 과정에서 α-사슬 구조는 β-쉬트 구조로 변화되며, 이와 같은 구조의 변화는 그의 신경질환 병리에 관련이 있는 것으로 추측되며, PrPsc는 고분자 응집체(즉, 멀티머)를 형성하는 경향이 있다(Bolton D. C. Lancet, 358:164-5 (2001)).The normal form of prion protein (PrP c ) contains α-chains and flexibly unordered sites (Zahn, R., et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97: 145-150 (2000) ), Heterologous (PrP sc ) has many β-sheet structures (Caughey, B., et al., J. Biol . Chem . 273: 32230-35 (1998)). As the disease progresses, the α-chain structure is changed to β-sheet structure, which is believed to be related to the pathology of neurological diseases, and PrP sc tends to form polymer aggregates (ie, multimers). (Bolton DC Lancet , 358: 164-5 (2001)).

본 발명의 방법은 이러한 프라이온 단백질의 구조적 변화(conformation change)에 따른 멀티머형 프라이온, 즉 PrPsc으로 형성된 멀티머의 검출에 매우 유용하다.The method of the present invention is very useful for the detection of multimeric prions, ie, multimers formed with PrP sc according to the conformation change of the prion protein.

본 발명의 방법이 PrPsc에 의해 형성되는 멀티머의 검출에 이용되는 경우에는, 상기 폴리펩타이드의 모노머형은 PrPc(cellular form of prion)이고, 멀티머형은 PrPsc으로 형성된 멀티머이다.When the method of the present invention is used for detection of a multimer formed by PrP sc , the monomer type of the polypeptide is PrP c (cellular form of prion), and the multimer type is a multimer formed of PrP sc .

본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는, 반복되지 않는 서열(non-repeated sequence)을 에피토프로 가지는 항체를 이용하는 것이다. 만일, 항체가 인식하는 에피토프가 반복서열인 경우에는 본 발명의 방법은 모노머형으로부터 멀티머형을 효과적으로 분별하여 검출할 수 없다.One of the greatest features of the present invention is the use of antibodies having epitopes of non-repeated sequences. If the epitope recognized by the antibody is a repetitive sequence, the method of the present invention cannot effectively detect and detect a multimer type from the monomer type.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 포획항체 및/또는 검출항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열이다.According to a preferred embodiment of the invention, the epitope of the polypeptide recognized by the capture antibody and / or the detection antibody is a sequence which is not repeated in the polypeptide.

본 발명에 이용되는 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511- 519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991); 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 효소 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.Antibodies used in the present invention may be prepared by methods commonly practiced in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US Pat. 4,816,56) or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature , 352: 624-628 (1991); and Marks et al, J. Mol . Biol . , 222: 58, 1-597 (1991)). Can be prepared by General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY , Wiley / Greene, NY, 1991, which are incorporated herein by reference. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing immortalized cell lines with antibody-producing lymphocytes, and the techniques required for this process are well known to those skilled in the art and can be readily implemented. Polyclonal antibodies can be obtained by injecting an enzyme antigen into a suitable animal, collecting antisera from the animal, and then isolating the antibody from the antisera using known affinity techniques.

본 명세서에서 용어 “생시료(biosample)"는 검사 대상의 유기체-유래 시료를 의미한다. 생시료는 세포, 조직 또는 생체액을 포함한다. 바람직하게는, 생시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 밀크, 오줌, 분변, 침, 뇌추출액(예컨대, 뇌 균질액), 척수액을 포함하는 생체액이다. 보다 바람직하게는, 생시료는 뇌균질액, 혈액, 혈장이며, 가장 바람직하게는 혈장이다.As used herein, the term “biosample” refers to an organism-derived sample to be tested. The live sample includes cells, tissues or biological fluids. Preferably, the live sample is blood, serum, plasma, lymph. , Milk, urine, feces, saliva, brain extracts (e.g., brain homogenates), spinal fluid, more preferably, raw samples are brain homogenates, blood, plasma, and most preferably plasma .

생시료가 뇌 균질액인 경우 본 발명의 방법은 생시료를 프로테아제 K 또는 트립신으로 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다. 한편, 생 시료가 혈액 또는 혈장인 경우, 사코실(sarkosyl) 또는 Triton 계열(예컨대, Triton X-100) 디터젼트로 생시료를 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.If the raw sample is a brain homogenate, the method of the present invention preferably further comprises the step of pretreating the raw sample with protease K or trypsin. On the other hand, if the live sample is blood or plasma, it is preferable to further include the step of pre-processing the raw sample with sarkosyl or Triton series (eg, Triton X-100) detergent.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다: According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for fractionally detecting a multimer form from a monomeric form of a multimer-forming polypeptide comprising the following steps:

(a) 자성 비드의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 자성 비드-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고; (a) three-dimensionally binding the capture antibody to the surface of the magnetic beads to prepare a magnetic bead-capture antibody complex, wherein the capture antibody binds to one specific epitope of the multimer-forming polypeptide;

(b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며; (b) preparing a detection antibody, wherein the epitope recognized by the detection antibody is in a position that causes steric hindrance by the capture antibody bound to the epitope of the capture antibody when the detection antibody binds to the epitope; Characterized;

(c) 생시료를 NADPH로 전처리하는 단계; (c) pretreatment of the raw sample with NADPH;

(d) 생시료에 상기 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 반응시키는 단계; (d) simultaneously reacting the magnetic bead-captured antibody complex and the detection antibody with a raw sample;

(e) 상기 단계 (d)의 결과물에 자기장을 적용하는 단계; 및 (e) applying a magnetic field to the product of step (d); And

(e) 상기 단계 (d)에서 형성된 자성비드-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.(e) detecting the magnetic bead-trapping antibody-multimeric polypeptide-detecting antibody complex formed in step (d).

본 발명의 방법을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다: 만일, 검체에 PrP 의 다양한 형태, 즉 PrPc 및 PrPsc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, HRP-검출항체는 자성비드-포획항체에 결합된 PrPc에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrPsc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프 로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrPc에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrPsc에 의해 형성된 멀티머형에는 동일 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, HRP의 기질로 발색, 형광 또는 발광반응을 유도한다. 최종적으로, 상기 발색, 형광 또는 발광반응을 측정하여, PrPsc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다. The method of the present invention will be described in more detail as follows: If the sample has various forms of PrP, that is, PrP c and PrP sc , the sample may be applied simultaneously to the magnetic beads coated with the capture antibody and the detection antibody. However, HRP-detecting antibodies cannot bind to PrP c bound to magnetic bead-capturing antibodies, but only to PrP sc bound to magnetic bead-capturing antibodies. The capture and detection antibodies used are those that recognize sequences that are not repeated in the prion protein as epitopes. In addition, the capture and detection antibodies recognize identical, overlapping or contiguous epitopes in the prion protein. Since the epitope recognized by the detection antibody is already bound to the capture antibody, the detection antibody does not bind to PrP c having only one epitope. However, since the same epitope is present in the multimer form formed by PrP sc , the detection antibody binds. After the antigen-antibody reaction, a magnetic field is assigned to collect the magnetic beads, followed by washing, followed by induction of color, fluorescence or luminescence with the substrate of HRP. Finally, the color, fluorescence or luminescence reaction is measured to analyze the presence or amount of multimer-antibody complex consisting of PrP sc .

본 발명의 키트의 바람직한 구현예에 따르면, 캐리어-포획항체 및 검출항체는 몰비 5:1-1:5로 칵테일 형태로 포함된다. 본 발명의 키트는, 자기장 플레이트, 완충용액, 발색효소, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the kit of the invention, the carrier-trapping antibody and the detecting antibody are included in a cocktail form at a molar ratio of 5: 1-1: 5. The kit of the present invention may include a magnetic field plate, a buffer solution, a color enzyme, a color substrate, and the like.

본 발명의 MDS-3D 시스템은 MDS-3D Single Bead 시스템 및 MDS-3D Dual Bead 시스템을 포함한다.The MDS-3D system of the present invention includes an MDS-3D Single Bead system and an MDS-3D Dual Bead system.

MDS-3D Single Bead 시스템은 상술한 바와 같이, 비드에 결합된 포획항체를 이용하는 것이며, MDS-3D Dual Bead 시스템은 포획항체 및 검출항체 모두 비드에 결합된 것을 이용하는 것이다. 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 데 있어서, MDS-3D Single Bead 시스템 보다 MDS-3D Dual Bead 시스템이 시그널의 세기의 측면에서 유리하다.As described above, the MDS-3D Single Bead system uses a capture antibody bound to beads, and the MDS-3D Dual Bead system uses a capture antibody and a detection antibody bound to beads. In the detection of multimer forms from monomeric forms, the MDS-3D Dual Bead system is advantageous in terms of signal strength over the MDS-3D Single Bead system.

MDS-3D Dual Bead 시스템에 따르면, 상기 검출항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적(즉, 입체적)으로 결합되어 있다. 이렇게 입체적으로 캐리어에 결합된 검출항체는 3차원 방식으로 그리고 보다 집중된 방식(concentrated manner)으로 멀티머형 폴리펩타이드와 접촉하게 되며, 이는 멀티머형과 접촉할 수 있는 기회를 더 많이 갖도록 한다. MDS-3D Dual Bead 시스템은 MDS-3D Single Bead 시스템 보다 요구하는 시료의 양과 항체의 양이 작은 이점이 있다.According to the MDS-3D Dual Bead system, the detection antibody is bound three-dimensionally (ie, three-dimensionally) to the surface of the solid carrier. This three-dimensionally bound detection antibody is brought into contact with the multimeric polypeptide in a three-dimensional manner and in a more concentrated manner, which gives more opportunity for contact with the multimeric form. The MDS-3D Dual Bead system has the advantage of requiring a smaller amount of sample and antibody than the MDS-3D Single Bead system.

검출항체가 결합되는 고상의 캐리어는 입체적 구조를 가지는 어떠한 물질도 가능하며, 바람직하게는, 무게, 전하 또는 자기에 의해 쉽게 분리 또는 회수될 수 있는 물질이다. 가장 바람직하게는, 고상의 캐리어는 라텍스 비드이다. 검출항체가 결합되는 캐리어에는 표지물질이 결합될 수 있다. 이와 같이 캐리어에 표지물질이 결합된 경우, 예컨대 형광물질이 있는 라텍스 비드를 이용하는 경우, 검출항체에 표지(예컨대, HRP)를 결합시키지 않아도 캐리어로부터 나오는 안정된 최종 검출 시그널(멀티머형 존재를 가리키는 시그널)을 얻을 수 있다.The solid phase carrier to which the detection antibody is bound may be any material having a three-dimensional structure, and is preferably a material that can be easily separated or recovered by weight, charge or magnetism. Most preferably, the solid carrier is latex beads. The labeling substance may be bound to a carrier to which the detection antibody is bound. As such, when a label is bound to a carrier, for example, when using latex beads with fluorescent material, a stable final detection signal (a signal indicating a multimer type) from the carrier without binding a label (eg, HRP) to a detection antibody is used. Can be obtained.

MDS-3D Dual Bead 시스템은, MDS-3D Dual Bead 시스템 with Single Label 및 MDS-3D Dual Bead 시스템 with Double Label을 포함한다.MDS-3D Dual Bead System includes MDS-3D Dual Bead System with Single Label and MDS-3D Dual Bead System with Double Label.

MDS-3D Dual Bead 시스템 with Single Label에 따르면, 검출항체 또는 캐리어에 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있다. MDS-3D Dual Bead 시스템 with Double Label에 따르면, 캐리어와 검출항체 둘 모두에 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있다. 이러한 이중적인 레이블링은, 캐리어로부터 나오는 시그널 및 검출항체로부터 나오는 시그널을 상호 체크가 가능하다는 이점이 있다.According to the MDS-3D Dual Bead System with Single Label, a label that generates a detectable signal is coupled to a detection antibody or carrier. According to the MDS-3D Dual Bead System with Double Label, both the carrier and the detection antibody incorporate a label that produces a detectable signal. This dual labeling has the advantage that the signal coming from the carrier and the signal coming from the detection antibody can be mutually checked.

MDS-3D Dual Bead 시스템 with Single Label을 설명하면 다음과 같다. 만일, 검체에 PrP의 다양한 형태, 즉 PrPc 및 PrPsc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, Fluor-검출항체(형광물질이 결합되어 있는 라텍스 비드에 결합된 검출항체)는 자성비드-포획항체에 결합된 PrPc에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrPsc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrPc에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrPsc에 의해 형성된 멀티머형 에는 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, 형광을 측정하여, PrPsc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.The MDS-3D Dual Bead System with Single Label is described as follows. If the sample contains various forms of PrP, that is, PrP c and PrP sc , the sample can be applied to magnetic beads coated with the capture antibody and the detection antibody at the same time. The detection antibody bound to) cannot bind to PrP c bound to the magnetic bead-capturing antibody, but only to PrP sc bound to the magnetic bead-capturing antibody. The capture and detection antibodies used are those that recognize sequences that are not repeated in the prion protein as epitopes. In addition, the capture and detection antibodies recognize identical, overlapping or contiguous epitopes in the prion protein. Since the epitope recognized by the detection antibody is already bound to the capture antibody, the detection antibody does not bind to PrP c having only one epitope. However, the detection antibody binds to the multimer type formed by PrP sc because there are many epitopes. After the antigen-antibody reaction, a magnetic field is assigned to collect the magnetic beads, followed by washing, and then the fluorescence is measured to analyze the presence or amount of the multimer-antibody complex consisting of PrP sc .

MDS-3D Dual Bead 시스템 with Double Label을 설명하면 다음과 같다. 만일, 검체에 PrP의 다양한 형태, 즉 PrPc 및 PrPsc가 있는 경우, 이 검체를 포획항체가 코팅된 자성 비드와 검출항체에 동시에 적용시키면, Fluor-HRP-검출항체(형광물질이 결합되어 있는 라텍스 비드에 결합된 검출항체로서 검출항체에는 HRP가 결합되어 있다)는 자성비드-포획항체에 결합된 PrPc에는 결합할 수 없고, 자성비드-포획항체에 결합된 PrPsc에만 결합하게 된다. 이용된 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 반복되지 않는 서열을 에피토프로 인식하는 것이다. 또한, 포획항체 및 검출항체는 프라이온 단백질에서 동일한, 중첩된 또는 인접한 에피토프를 인식한다. 검출항체에 의해 인식되는 에피토프는 포획항체와 이미 결합되어 있기 때문에, 이러한 에피토프를 하나만 가지고 있는 PrPc에는 검출항체가 결합하지 않는다. 그러나, PrPsc에 의해 형성된 멀티머형에는 에피토프가 다수 존재하기 때문에 검출항체가 결합하게 된다. 항원-항체 반응 후, 자기장을 부여하여, 자성비드를 수집하고 이어 세척을 한 다음, HRP에 의한 반응 산물 및/또는 형광을 측정하여, PrPsc로 구성된 멀티머-항체 복합체의 존재 또는 양을 분석한다.The MDS-3D Dual Bead System with Double Label is described as follows. If the sample contains various forms of PrP, that is, PrP c and PrP sc , the sample can be applied to the magnetic beads coated with the capture antibody and the detection antibody at the same time. As a detection antibody bound to latex beads, HRP is bound to the detection antibody), but not to PrP c bound to the magnetic bead-capturing antibody, but only to PrP sc bound to the magnetic bead-capturing antibody. The capture and detection antibodies used are those that recognize sequences that are not repeated in the prion protein as epitopes. In addition, the capture and detection antibodies recognize identical, overlapping or contiguous epitopes in the prion protein. Since the epitope recognized by the detection antibody is already bound to the capture antibody, the detection antibody does not bind to PrP c having only one epitope. However, the detection antibody binds to the multimer type formed by PrP sc because there are many epitopes. After antigen-antibody reaction, a magnetic field is assigned to collect magnetic beads, followed by washing, followed by reaction product and / or fluorescence measurement by HRP to analyze the presence or amount of multimer-antibody complex consisting of PrP sc do.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (c)에서 생시료는 (ⅰ) NADPH 및 (ⅱ) 구리 이온, 아연 이온, 니켈 이온 및 망간 이온으로부터 선택되는 금속 이온과 접촉시킨다. 보다 바람직하게는, 상기 금속 이온은 구리 이온이다.According to a preferred embodiment of the present invention, in step (c) the raw sample is contacted with metal ions selected from (i) NADPH and (ii) copper ions, zinc ions, nickel ions and manganese ions. More preferably, the metal ions are copper ions.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 NADPH의 처리 양은 0.4-2 mM, 보다 바람직하게는 0.8-1.2 mM이다.According to a preferred embodiment of the invention, the treated amount of NADPH is 0.4-2 mM, more preferably 0.8-1.2 mM.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 구리 이온의 처리 양은 30-100 μM, 보다 바람직하게는 70-90 μM이다.According to a preferred embodiment of the invention, the treatment amount of copper ions is 30-100 μM, more preferably 70-90 μM.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법 및 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명은 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 모노모형으로부터 고속으로 용이하게 분별 검출할 수 있도록 한다. 본 발명은 다양한 질환에 관여하는 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 고속으로 검출할 수 있고, 특히 프라이온의 이질형 검출에 매우 유용하다.As described in detail above, the present invention provides a method for reducing an error signal in immunoassay for detecting a multimer form of a multimer-forming polypeptide and the detection of a multimer form from the monomeric form of the multimer-forming polypeptide. Provide a way to. The present invention allows for the easy and rapid detection of multimer forms of multimer-forming polypeptides from the monomodel at high speed. The present invention is capable of detecting multimer forms of multimer-forming polypeptides involved in various diseases at high speed, and is particularly useful for detecting heterotypes of prions.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention more specifically, and the scope of the present invention is not limited to these examples according to the gist of the present invention.

실시예Example : MDS-3D-Single Bead 시스템에 따른 혈장 내 : In plasma by MDS-3D-Single Bead System 멀티머형Multimer type PrPPrP 검출  detection

CuCl2(Sigma)를 TBST 완충액에 용해하여 8 mM CuCl2 용액을 제조하였다. NADPH(Sigma)를 TBST 완충액에 용해하여 100 mM NADPH 용액을 제조하였다. 멀티머형 PrP가 함유되어 있는 혈장 시료, 8 mM CuCl2 (in TBST) 및 100 mM NADPH (in TBST)를 혼합하여 프라이온 시료를 준비하였다. 이어, 시료를 간단히 볼텍싱하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 7000 x g로 1분 동안 원심분리하고 TX-100(Triton X-100) 160 ㎕를 첨가하였다. 이어, 반응용액을 간단히 볼텍싱하고, 7000 x g에서 1분 동안 원심분리하였다.CuCl 2 (Sigma) was dissolved in TBST buffer to prepare an 8 mM CuCl 2 solution. NADPH (Sigma) was dissolved in TBST buffer to prepare a 100 mM NADPH solution. Plasma sample containing multimer PrP, 8 mM CuCl 2 (in TBST) and 100 mM NADPH (in TBST) were mixed to prepare prion samples. The sample was then vortexed briefly, reacted at 37 ° C. for 1 hour, then centrifuged at 7000 × g for 1 minute and 160 μl of TX-100 (Triton X-100) was added. The reaction solution was then simply vortexed and centrifuged at 7000 × g for 1 minute.

한편, 자성 비드에 포획항체를 결합시키되, 자성 비드 2.5 ㎕에 포획항체가 1 ㎍이 결합되도록 결합시켰다. 자성 비드에 결합시킨 포획항체는 3E7 단일클론항체이다. 3E7 단일클론 항체는 PrPc의 아미노산 140-160(소 프라이온 기준)을 에피토프로 인식하는 것으로서, 상기 에피토프 서열은 PrPc에서 반복되지 않는다.Meanwhile, the capture antibody was bound to the magnetic beads, but the capture antibody was bound to 2.5 µl of the magnetic beads such that 1 µg of the capture antibody was bound. The capture antibody bound to the magnetic beads is a 3E7 monoclonal antibody. 3E7 as the monoclonal antibodies recognizing the amino acids 140-160 (bovine prions basis) of PrP c to an epitope, the epitope sequence is not repeated in PrP c.

이어, 상기 시료에 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 반응시켜 멀티머형 양 PrP를 검출할 수 있는 지 여부를 조사하였다. 검출항체로 이용한 것은, T2-HRP 이다. T2 단일클론 항체는 Hiroko Hayashi, et al., J. Vet. Med . Sci ., 66(6):515(2004)에 개시되어 있으며, PrP135 -140 에피토프에 특이적으로 반응하 는 항체이다. Subsequently, the magnetic bead-captured antibody complex and the detection antibody were simultaneously reacted with the sample to determine whether the multimer type PrP could be detected. T2-HRP was used as a detection antibody. T2 monoclonal antibodies are described in Hiroko Hayashi, et al., J. Vet. Med . Sci, 66 (6):. 515 is disclosed in (2004), the antibodies react specifically to PrP 135 -140 epitope.

상기 시료에 자성비드-포획항체 복합체 및 검출항체를 동시에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이어, 자기장을 반응 혼합물에 부여하여 자성비드를 분리하고 자성비드를 TBST로 3회 세척한 다음, ECL(enhanced chemiluminescence) 검출을 실시하였다. 실험 결과는 도 2 및 도 3에 나타나 있다.The magnetic bead-captured antibody complex and the detection antibody were simultaneously added to the sample and reacted at 37 ° C. for 1 hour. Subsequently, the magnetic field was added to the reaction mixture to separate the magnetic beads, and the magnetic beads were washed three times with TBST, and then subjected to enhanced chemiluminescence (ECL) detection. The experimental results are shown in FIGS. 2 and 3.

도 2에서 볼 수 있듯이, 혈장 시료를 항체와 반응시키기 전에, CuCl2 및 NADPH와 전반응시킨 경우, PrPSc에 대한 시그널은 증가하면서도 정상적인 혈장에 대한 시그널은 감소하였다. 따라서, CuCl2 및 NADPH의 전처리는 본 발명의 MDS-3D-Single bead system의 멀티머형 프라이온에 대한 분별력을 매우 크게 향상시킨다는 것을 알 수 있다. 또한, 혈장 시료를 전처리하기 위한 CuCl2 및 NADPH의 적합한 농도는 각각 80 μM 및 1 mM임을 알 수 있다.As can be seen in Figure 2, prior to the reaction of the plasma sample with the antibody, when pre-reacted with CuCl 2 and NADPH, the signal for normal plasma was decreased while the signal for PrP Sc increased. Therefore, it can be seen that the pretreatment of CuCl 2 and NADPH greatly improves the discrimination ability of the multimer prion of the MDS-3D-Single bead system of the present invention. It can also be seen that suitable concentrations of CuCl 2 and NADPH for pretreatment of plasma samples are 80 μM and 1 mM, respectively.

도 3은 혈장 전처리에 있어서 NADPH의 영향을 보여주는 그래프이다. 도 3에서 볼 수 있듯이, NADPH는 혈장 내의 PrPSc에 대한 시그널의 세기에는 영향이 거의 없지만, 정상 혈청에서 나오는 시그널을 감소시키는 데 크게 기여를 한다.3 is a graph showing the effect of NADPH on plasma pretreatment. As can be seen in Figure 3, NADPH has little effect on the intensity of the signal for PrP Sc in plasma, but contributes significantly to reducing the signal from normal serum.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이 며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that such a specific technology is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

도 1a는 본 발명자들에 의해 개발된 MDS-3D-Single Bead(Multimer Detection System-3 Dimensional-Single Bead) 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.Figure 1a is a conceptual diagram showing the operating principle of the MDS-3D-Single Bead (Multimer Detection System-3 Dimensional-Single Bead) system developed by the present inventors.

도 1b는 본 발명자들에 의해 개발된 MDS-3D-Dual Bead 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.Figure 1b is a conceptual diagram showing the operating principle of the MDS-3D-Dual Bead system developed by the inventors.

도 1c는 본 발명자들에 의해 개발된 MDS-3D-Dual Bead 시스템의 작동원리를 보여주는 개념도이다.Figure 1c is a conceptual diagram showing the operating principle of the MDS-3D-Dual Bead system developed by the present inventors.

도 2는 혈장 시료를 CuCl2 및 NADPH로 전처리한 후 MDS-3D-Single Bead 시스템에 따라 PrPSc를 검출한 결과를 보여 준다.Figure 2 shows the results of PrP Sc detection according to the MDS-3D-Single Bead system after pretreatment of plasma samples with CuCl 2 and NADPH.

도 3은 혈장 시료의 전처리에 있어서, NADPH의 영향을 보여주는 그래프이다.3 is a graph showing the effect of NADPH on pretreatment of plasma samples.

Claims (40)

생시료를 NADPH(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form))와 접촉시키는 단계를 포함하는, 멀티머-형성 폴리펩타이드의 멀티머형을 항체로 검출하기 위한 면역분석에서 오류 시그널을 감소시키는 방법.A method of reducing error signals in an immunoassay for detecting a multimer of a multimer-forming polypeptide with an antibody, comprising contacting the raw sample with a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (reduced form). 제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 (ⅰ) NADPH 및 (ⅱ) 구리 이온, 아연 이온, 니켈 이온 및 망간 이온으로부터 선택되는 금속 이온과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the raw sample is contacted with a metal ion selected from (i) NADPH and (ii) copper ions, zinc ions, nickel ions and manganese ions. 제 2 항에 있어서, 상기 금속 이온은 구리 이온인 것을 특징으로 하는 방법.3. The method of claim 2 wherein the metal ions are copper ions. 제 1 항에서 있어서, 상기 항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적으로 결합된 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the antibody is three-dimensionally bound to the surface of the solid carrier. 제 1 항에 있어서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β2-마이크로글로블린인 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1, wherein the multimer-forming polypeptides are Aβ peptides involved in Alzheimer's disease, tau protein, prion, α-synuclein involved in Parkinson's disease, Ig light chain involved in primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis Serum amyloid A involved in tau protein, tau protein involved in proto-temporal dementia, transthyretin involved in geriatric systemic amyloidosis, transthyretin involved in familial amyloid polyneuropathy, cystatin C involved in hereditary cerebral amyloid angiopathy Or β 2 -microglobulin involved in hemodialysis-related amyloidosis. 제 5 항에 있어서, 상기 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 5, wherein the multimer-forming polypeptide of interest is a prion protein. 제 5 항에 있어서, 상기 멀티머형은 PrPSc인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 5, wherein the multimer is PrP Sc . 제 1 항에 있어서, 상기 면역분석은 검출항체 및 포획항체를 이용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the immunoassay is performed using a detection antibody and a capture antibody. 제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the raw sample is brain homogenate or blood. 제 9 항에 있어서, 상기 생시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.10. The method of claim 9, wherein the raw sample is blood. 제 10 항에 있어서, 상기 혈액 시료는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein said blood sample is plasma. 제 1 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.4-2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the amount of NADPH treated is 0.4-2 mM. 제 12 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.8-1.2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.13. The method of claim 12, wherein the amount of NADPH treated is 0.8-1.2 mM. 제 3 항에 있어서, 상기 구리 이온의 처리 양은 30-100 μM인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 3 wherein the amount of copper ions treated is 30-100 μM. 다음의 단계를 포함하는 생시료 내의 멀티머-형성 폴리펩타이드의 모노머형으로부터 멀티머형을 분별 검출하는 방법:A method of fractionally detecting a multimer form from a monomeric form of a multimer-forming polypeptide in a raw sample comprising the following steps: (a) 고상의 캐리어(solid phase carrier)의 표면에 포획항체를 3차원적으로 결합시켜 캐리어-포획항체 복합체를 준비하는 단계로서, 상기 포획항체는 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드의 하나의 특정 에피토프에 결합하고; (a) three-dimensionally binding a capture antibody to the surface of a solid phase carrier to prepare a carrier-capture antibody complex, wherein the capture antibody comprises one specific epitope of the multimer-forming polypeptide. Bound to; (b) 검출항체를 준비하는 단계로서, 상기 검출항체가 인식하는 에피토프는 검출항체가 에피토프에 결합한 경우 상기 포획항체의 에피토프에 결합된 포획항체에 의해 입체적 방해(steric hindrance)를 일으키는 위치에 있는 것을 특징으로 하며; (b) preparing a detection antibody, wherein the epitope recognized by the detection antibody is in a position that causes steric hindrance by the capture antibody bound to the epitope of the capture antibody when the detection antibody binds to the epitope; Characterized; (c) 생시료를 NADPH로 전처리하는 단계; (c) pretreatment of the raw sample with NADPH; (d) 상기 생시료에 상기 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체를 반응시키는 단계; 및 (d) reacting the carrier-captured antibody complex and the detection antibody to the raw sample; And (e) 상기 단계 (d)에서 형성된 캐리어-포획항체-멀티머형 폴리펩타이드-검출항체 복합체를 검출하는 단계.(e) detecting the carrier-captured antibody-multimeric polypeptide-detecting antibody complex formed in step (d). 제 15 항에서 있어서, 상기 검출항체는 고상의 캐리어의 표면에 3차원적으로 결합된 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the detection antibody is three-dimensionally bound to the surface of the solid carrier. 제 15 항에 있어서, 상기 멀티머-형성 폴리펩타이드는 알츠하이머 질환에 관여하는 Aβ 펩타이드과 tau 단백질, 프라이온, 파킨슨 질환에 관여하는 α-시누클레인, 일차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 Ig 경사슬, 이차 전신성 아밀로이드증에 관여하는 혈청 아밀로이드 A, 프론토-일시적 치매에 관여하는 tau 단백질, 노인 전신성 아밀로이드증에 관여하는 트랜스티레틴, 가족성 아밀로이드 다발신경병에 관여하는 트랜스티레틴, 유전성 대뇌 아밀로이드 맥관병에 관여하는 시스타틴 C 또는 혈투석-관련 아밀로이드증에 관여하는 β2-마이크로글로블린인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the multimer-forming polypeptides are Aβ peptides involved in Alzheimer's disease, tau protein, prion, α-synuclein involved in Parkinson's disease, Ig light chain involved in primary systemic amyloidosis, secondary systemic amyloidosis Serum amyloid A involved in tau protein, tau protein involved in proto-temporal dementia, transthyretin involved in geriatric systemic amyloidosis, transthyretin involved in familial amyloid polyneuropathy, cystatin C involved in hereditary cerebral amyloid angiopathy Or β 2 -microglobulin involved in hemodialysis-related amyloidosis. 제 17 항에 있어서, 상기 검출 대상의 멀티머-형성 폴리펩타이드는 프라이온 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.18. The method of claim 17, wherein the multimer-forming polypeptide of interest is a prion protein. 제 18 항에 있어서, 상기 모노머형은 PrPc이고, 멀티머형은 PrPSc인 것을 특징으로 하는 방법.19. The method of claim 18, wherein the monomer type is PrP c and the multimer type is PrP Sc . 제 15 항에 있어서, 상기 포획항체의 에피토프와 검출항체의 에피토프의 아미노산 서열은 동일하거나, 중첩되거나 또는 인접한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the amino acid sequence of the epitope of the capture antibody and the epitope of the detection antibody has the same, overlapping or contiguous amino acid sequence. 제 15 항에 있어서, 상기 포획항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the epitope of the polypeptide recognized by the capture antibody is a sequence that is not repeated in the polypeptide. 제 15 항에 있어서, 상기 검출항체가 인식하는 폴리펩타이드의 에피토프는 폴리펩타이드에서 반복되지 않는 서열인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the epitope of the polypeptide recognized by the detection antibody is a sequence that is not repeated in the polypeptide. 제 15 항에 있어서, 상기 포획항체가 결합된 고상의 캐리어는 자성 비드인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the solid carrier to which the capture antibody is bound is magnetic beads. 제 16 항에 있어서, 상기 검출항체가 결합된 고상의 캐리어는 라텍스 비드인 것을 특징으로 하는 방법.17. The method of claim 16, wherein the solid phase carrier to which the detection antibody is bound is a latex bead. 제 15 항에 있어서, 상기 검출항체에는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the detection antibody is bound to a label for generating a detectable signal. 제 16 항에 있어서, 상기 검출항체 및/또는 검출항체가 결합된 고상의 캐리어에는 검출 가능한 신호를 생성시키는 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.17. The method according to claim 16, wherein a label for generating a detectable signal is coupled to the solid phase carrier to which the detection antibody and / or detection antibody are bound. 제 26 항에 있어서, 상기 단계 (e)는 상기 폴리펩타이드의 멀티머형에 결합된 검출항체의 표지로부터 나오는 신호를 측정하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.27. The method of claim 26, wherein step (e) is performed by measuring a signal from a label of a detection antibody bound to the multimeric form of the polypeptide. 제 26 항에 있어서, 상기 단계 (e)는 상기 폴리펩타이드의 멀티머형에 결합된 검출항체-캐리어의 표지로부터 나오는 신호를 측정하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.27. The method of claim 26, wherein step (e) is performed by measuring a signal from a label of a detection antibody-carrier bound to the multimer of the polypeptide. 제 25 항 또는 제 27 항에 있어서, 상기 검출항체에 결합된 표지는 화학물질, 효소, 방사능물질, 형광물질, 발광물질, 화학발광물질 또는 FRET 표지인 것을 특징으로 하는 방법.28. The method of claim 25 or 27, wherein the label bound to the detection antibody is a chemical, enzyme, radioactive, fluorescent, luminescent, chemiluminescent or FRET label. 제 15 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌 균질액 또는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.16. The method of claim 15, wherein the raw sample is brain homogenate or blood. 제 15 항에 있어서, 상기 생시료는 혈액인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the raw sample is blood. 제 31 항에 있어서, 상기 혈액 시료는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.32. The method of claim 31, wherein said blood sample is plasma. 제 30 항에 있어서, 상기 생시료가 뇌 균질액인 경우 상기 방법은 생시료를 프로테아제 K 또는 트립신으로 전처리하는 과정을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.31. The method of claim 30, wherein the method further comprises pretreating the raw sample with protease K or trypsin if the raw sample is brain homogenate. 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 포획항체와 검출항체는 몰비 5:1-1:5로 첨가되는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 15, wherein the capture antibody and the detection antibody in step (d) is added in a molar ratio of 5: 1-1: 5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 생시료는 (ⅰ) NADPH 및 (ⅱ) 구리 이온, 아연 이온, 니켈 이온 및 망간 이온으로부터 선택되는 금속 이온과 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein in step (c) the raw sample is contacted with a metal ion selected from (i) NADPH and (ii) copper ions, zinc ions, nickel ions and manganese ions. 제 35 항에 있어서, 상기 금속 이온은 구리 이온인 것을 특징으로 하는 방법.36. The method of claim 35, wherein the metal ions are copper ions. 제 15 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.4-2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.16. The method of claim 15, wherein the amount of NADPH treated is 0.4-2 mM. 제 37 항에 있어서, 상기 NADPH의 처리 양은 0.8-1.2 mM인 것을 특징으로 하는 방법.38. The method of claim 37, wherein the amount of NADPH treated is 0.8-1.2 mM. 제 36 항에 있어서, 상기 구리 이온의 처리 양은 30-100 μM인 것을 특징으로 하는 방법.37. The method of claim 36, wherein the amount of copper ions treated is 30-100 μΜ. 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (d)에서 캐리어-포획항체 복합체 및 검출항체는 생시료에 동시에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.16. The method of claim 15, wherein in step (d) the carrier-capturing antibody complex and the detection antibody are brought into contact with the raw sample simultaneously.
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