KR101363576B1 - Novel Biomarker Indicative of alzheimer's disease and Their Use - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 마커를 이용하면 신속·정확하게 알츠하이머 질환의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.The present invention relates to novel biomarkers and their use for Alzheimer's disease. By using the marker of the present invention, diagnosis and prognostic analysis of Alzheimer's disease can be performed quickly and accurately.
Description
본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.
The present invention relates to novel biomarkers and their use for Alzheimer's disease.
인류의 평균수명이 늘어나는 추세에 따라 노인성 질환이 국가적 관심사가 되고 있고, 노인성 질환에 따른 국가적 비용 지불도 크게 늘어나고 있다. 노인성 질환 중, 가장 흔하게 나타나고 있는 것이 알츠하이머 질환이다. 알츠하이머 질환은 보통 '치매'라고 부른다. 알츠하이머 질환은 자연발생적으로는 65세 이상의 노인들에게 많이 발생하며, 노인성 퇴행과 과도한 스트레스로 발병된다고만 알려져 있다. 알츠하이머 질환의 증후는 사물인식의 혼돈, 성냄, 널뛰기 기분, 언어장애 또는 기억상실 등으로 나타난다.As the average life expectancy of human beings increases, senile diseases are becoming a national concern, and the payment of national costs for senile diseases is increasing. The most common senile disease is Alzheimer's disease. Alzheimer's disease is commonly called dementia. Alzheimer's disease occurs spontaneously in elderly people 65 years or older and is known to be caused by senile degeneration and excessive stress. Symptoms of Alzheimer's disease include confusion of things, anger, mood swings, speech disorders or memory loss.
아밀로이드-β 펩티드(Aβ)는 알츠하이머 질환의 신경병리에 중추적인 역학을 한다(Roher et al. 1993: "β-Amyloid-(1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer disease" PANS 90: 10836). 상기 질환의 가족형은 아밀로이드 전구 단백질(APP) 및 프레세닐린 유전자의 돌연변이와 관련된다. 이러한 유전자에서의 질환 연관된 돌연변이는 상기 펩티드의 42-아미노산형(Aβ42)의 생성 증가를 초래하는데, 이러한 아미노산형은 알츠하이머 질환의 아밀로이드 플라크에서 발견되는 가장 우세한 형태이다.Amyloid-β peptide (Aβ) plays a pivotal role in the neuropathology of Alzheimer's disease (Roher et al. 1993: "β-Amyloid- (1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits: Implications for the pathology of Alzheimer disease " PANS 90: 10836). Family types of the disease are associated with mutations in the amyloid precursor protein (APP) and the presenilin gene. Disease-associated mutations in these genes result in increased production of the 42-amino acid type (Aβ 42) of the peptide, which is the most dominant form found in amyloid plaques of Alzheimer's disease.
오늘날, 알츠하이머 질환의 궁극적 병리학은 상당히 잘 확립되어 있지만, 해당 질환의 병인학 및 발병에 대한 복잡한 생물학적 기반으로 인해 유효한 진단 방법 및 치료 세부원칙은 요원한 채 남아있다. 알츠하이머 질환에 대한 임상적인 진단 기법은 현재 우울증, 영양결핍, 여타 치매 유발 조건(예를 들어, 치매가 있는 파킨슨씨 질환) 또는 약물 상호작용과 같은 여타 가능성 있는 원인들을 배제함으로써 치매의 개별적인 제시 병후를 스크리닝 하는 것에 의존하고 있다. 그러한 정량적인 비특이적 방법은 종종, 치료가 덜 유효할 수 있는 더 늦은 상태에 이를 때까지 알츠하이머 질환이 오진되거나 또는 인식되지 못하도록 한다. 알츠하이머 질환의 조기 발견 및 이에 따른 치료는 병후를 지연시키고, 환자의 삶의 질을 연장시킬 수 있는 성공적 치료를 위한 최선의 전략이다.Today, the ultimate pathology of Alzheimer's disease is fairly well established, but due to the complex biological basis for the etiology and onset of the disease, effective diagnostic methods and treatment principles remain distant. Clinical diagnostic techniques for Alzheimer's disease currently support the individual presentation of dementia by excluding other possible causes such as depression, malnutrition, other dementia-inducing conditions (eg, Parkinson's disease with dementia) or drug interactions. Rely on screening Such quantitative nonspecific methods often cause Alzheimer's disease to be misdiagnosed or unrecognized until a later state where treatment may be less effective. Early detection and subsequent treatment of Alzheimer's disease is the best strategy for successful treatment that can delay the disease and prolong the quality of life of the patient.
한편, 프리온 질환은 정상적인 프리온 단백질(cellular prion protein, PrPc)이 어떠한 이유에 의해 프리온 단백질 구조의 알파-나선(alpha-helix) 구조가 베타-시트(beta-pleated sheet) 구조로 변성되면서 전염성을 지닌 프리온 단백질 (scrapie prion protein, PrPsc)로 전환되어 야기된다. 전염성을 지닌 단백질은 혈액을 통해 전염 가능하며 PrPsc가 PrPc를 PrPsc로 전환되면서 전파된다. 이런 단백질들은 뇌에서 축적되며 전염성해면상뇌병증(transmissible spongiform encephalopathy, TSE)을 야기한다. TSE는 다양한 척추동물에서 일어나는데, 대표적으로 인간이 이 병에 걸릴 경우 인간광우병(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD), 소의 경우 소해면상뇌병증(bovine spongiform encephalopathy, BSE), 양의 경우 스크래피(scrapie)라 한다. PrPsc는 CJD의 바이오마커로서 올리고머(oligomer)를 형성하는 특성을 이용한 CJD 진단법이 개발되어 있다.On the other hand, prion disease is contagious as normal prion protein (PrPc) is denatured by the alpha-helix structure of the prion protein structure to beta-pleated sheet structure for some reason. It is caused by the conversion to scrapie prion protein (PrPsc). Infectious proteins can be transmitted through the blood and spread as PrPsc converts PrPc into PrPsc. These proteins accumulate in the brain and cause transmissible spongiform encephalopathy (TSE). TSE occurs in a variety of vertebrates, most commonly known as Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle, and scrapie in sheep. . PrPsc is a CJD biomarker, and a CJD diagnostic method using an oligomer-forming property has been developed.
그러나, 현재까지 프리온 단백질과 알부민간의 복합체(prion-albumin complex) 형성과 알츠하이머 질환과의 관련성에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.
However, to date, no association between prion-albumin complex formation and Alzheimer's disease is known.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 알츠하이머 질환을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈장 내 프리온-알부민 복합체를 검출하는 것으로, 알츠하이머 질환을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors made diligent research efforts to discover novel biomarkers capable of molecular diagnosis of Alzheimer's disease quickly and accurately. As a result, the present invention was completed by confirming that the prion-albumin complex in plasma can be detected as a biomarker, thereby making it possible to diagnose Alzheimer's disease early and determine prognosis.
따라서, 본 발명의 목적은 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a kit for diagnosing or prognostic analysis of Alzheimer's disease.
본 발명의 다른 목적은 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 알츠하이머 질환 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.
Another object of the present invention is to provide a method for detecting Alzheimer's disease markers in order to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 생물학적 시료 내에 존재하는, 프리온 단백질과 알부민이 형성한 복합체(프리온-알부민 복합체)의 존재여부 또는 양을 측정하기 위한 다음의 제제를 포함하는 알츠하이머 질환 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다:According to one aspect of the present invention, the present invention relates to diagnosing Alzheimer's disease comprising the following agents for determining the presence or amount of a complex formed by a prion protein and albumin (prion-albumin complex) present in a biological sample, or Provide kits for prognostic analysis:
(ⅰ) 프리온-알부민 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는(Iii) an antibody or aptamer that specifically binds to the prion-albumin complex; or
(ⅱ) 프리온에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 및 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머.
(Ii) antibodies or aptamers that specifically bind to prions, and antibodies or aptamers that specifically bind to albumin.
본 발명자들은 알츠하이머 질환을 신속하고 정확하게 분자진단 할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 바이오마커로서 혈장 내 프리온-알부민 복합체를 검출하는 것으로, 알츠하이머 질환을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors made diligent research efforts to discover novel biomarkers capable of molecular diagnosis of Alzheimer's disease quickly and accurately. As a result, the present invention was completed by confirming that the prion-albumin complex in plasma can be detected as a biomarker, thereby making it possible to diagnose Alzheimer's disease early and determine prognosis.
본 명세서에서 표현 "알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트"는 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 "알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 키트"는 "알츠하이머 질환의 진단 또는 예후 분석용 조성물"과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.As used herein, the expression "kit for diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease" means a kit including a composition for diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease. Therefore, the expression "kit for diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease" can be used interchangeably or mixed with "composition for diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease".
본 명세서에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 알츠하이머 질환의 단계 결정 또는 치료에 대한 반응성 예측, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.As used herein, the term "diagnosis" refers to determining the susceptibility of an object to a particular disease or condition, to determining whether an object currently has a particular disease or condition, to a particular disease or condition To determine the prognosis (eg, predicting responsiveness to determining or treating stages of Alzheimer's disease, identifying metastatic or metastatic cancer states, determining stages of cancer, or determining responsiveness of cancer to treatment) Or therametrics (eg, monitoring the condition of an object to provide information about treatment efficacy).
본 명세서에서 용어, "알츠하이머 질환"은 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환으로, 1907년 독일의 정신과 의사인 알로이스 알츠하이머(Alois Alzheimer) 박사에 의해 최초로 보고되었다. 알츠하이머 질환은 매우 서서히 발병하여 점진적으로 진행되는 경과에 특징이 있다. 초기에는 주로 최근 일에 대한 기억력에서 문제를 보이다가 진행하면서 언어기능이나 판단력 등 다른 여러 인지기능의 이상을 동반하게 되다가 결국에는 모든 일상생활 기능을 상실하게 된다. 알츠하이머 질환은 그 진행과정에서 인지기능 저하뿐만 아니라 성격변화, 초조행동, 우울증, 망상, 환각, 공격성 증가, 수면 장애 등의 정신행동 증상이 흔히 동반되며, 말기에 이르면 경직, 보행 이상 등의 신경학적 장애 또는 대소변 실금, 감염, 욕창 등 신체적인 합병증까지 나타나게 된다.As used herein, the term "Alzheimer's disease" is the most common degenerative brain disease that causes dementia, first reported in 1907 by Dr. Alois Alzheimer, a German psychiatrist. Alzheimer's disease develops very slowly and is characterized by a progressive course. In the early stages, they usually showed problems in their memory of recent work, accompanied by abnormalities of language and judgment, and other cognitive functions, and eventually lost all daily life functions. Alzheimer's disease is often accompanied by mental behavioral symptoms such as personality changes, nervousness, depression, delusions, hallucinations, increased aggression, sleep disorders, and neurological symptoms such as stiffness and gait abnormalities. Physical complications, such as disability or stool incontinence, infections, and pressure sores, may appear.
본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로부터 채취한 시료로부터 알츠하이머 질환의 발병 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 확인하였다.The present inventors confirmed that using the marker of the present invention, it is possible to quickly and accurately diagnose the onset of Alzheimer's disease from a sample taken from an individual.
본 명세서에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 알츠하이머 질환을 진단할 수 있는 물질로, 정상인에 비하여 알츠하이머 질환이 발병한 개체에서 감소 양상을 보이는 단백질 복합체(protein complex)와 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 알츠하이머 질환 진단 마커는 프리온 단백질과 알부민 단백질이 결합하여 형성한 단백질복합체(프리온-알부민 복합체)이다.As used herein, the term "diagnostic marker, diagnostic marker, or diagnostic marker" is a substance capable of diagnosing Alzheimer's disease, and a protein complex showing a decrease in Alzheimer's disease compared to a normal person. organic biomolecules, and the like. For the purposes of the present invention, the Alzheimer's disease diagnostic marker is a protein complex (prion-albumin complex) formed by combining prion protein and albumin protein.
본 명세서에서 용어, "프리온 단백질과 알부민이 결합하여 형성한 단백질 복합체" 또는 "프리온-알부민 복합체"는 프리온 단백질과 알부민 단백질이 결합하여 혈액 내에 존재하는 단백질 복합체를 의미한다. 상기 두 단백질은 강한 결합력(소수성 상호작용, 수소결합, 반 데르 발스 결합 등)으로 결합하고 있어 서로 분리해내기 어려움이 있는 단백질 복합체이다. 알부민 단백질은 프리온 단백질의 N-말단에 결합하고 있는 것으로 추측되고 있다. 프리온 단백질은 다양한 단백질과 결합을 할 수 있는 것으로 보고되었는데, 그 예로 β-amyloid1-42, synapsin Ib, GASP, 14-3-3, Bcl-2, GFAP, DNA, RNA, Hsp60, Laminin, NCAM, β-dystroglycan 등이 보고되었다(Linden R, Martins VR, Prado MA, Cammarota M, Izquierdo I, Brentani RR.;88(2):673-728. Review). 본 발명에서는 프리온 단백질이 알부민 단백질과 결합한 단백질 복합체를 알츠하이머 질환 마커로서 이용하는 것이다.As used herein, the term "protein complex formed by combining prion protein and albumin" or "prion-albumin complex" refers to a protein complex in which prion protein and albumin protein bind and exist in blood. The two proteins are bound to a strong binding force (hydrophobic interaction, hydrogen bond, van der Waals bond, etc.) is a protein complex that is difficult to separate from each other. Albumin protein is presumably bound to the N-terminus of the prion protein. Prion proteins have been reported to be able to bind a variety of proteins, such as β-amyloid 1-42 , synapsin Ib, GASP, 14-3-3, Bcl-2, GFAP, DNA, RNA, Hsp60, Laminin, NCAM , β-dystroglycan and others (Linden R, Martins VR, Prado MA, Cammarota M, Izquierdo I, Brentani RR .; 88 (2): 673-728.Review). In the present invention, the protein complex in which the prion protein binds to albumin protein is used as an Alzheimer's disease marker.
상기 프리온 단백질은 1982년 Stanley B. Prusiner 박사에 의해서 명명된 것으로 단백질 같은 전염성 물질(proteinaceous infectious particle)을 간추려 prion이란 단어를 합성하였다. 프리온 단백질은 전염성 단백질과 비 전염성 단백질로 구분되는데 PrPc는 비 전염성, PrPsc는 전염성 단백질을 나타낸다. PrPc는 모든 인간에 존재하고 아직 그 기능이 완전히 밝혀지진 않았지만, 각 개체에서 특정한 역할을 하고 있는 것으로 여겨진다. PrPc 단백질이 PrPsc에 노출되면 PrPsc로 전환된다. PrPsc의 단백질은 잘못 접힌 구조(mis-folded protein)로서, 바이러스와 비슷하게 전파되지만, 그 전파 물질이 핵산이 아닌 단백질에 있다. 전염성의 PrPsc는 뇌에서 축적되며 전염성해면상뇌병증(transmissible spongiform encephalopathy, TSE)을 야기하는데, 그 예로 인간의 경우에는 인간광우병 (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)을 유발한다. 본 발명의 목적상 상기 프리온 단백질은 PrPc를 의미한다. 프리온 단백질의 아미노산 서열은 GenBank에 BAA00011 등으로 개시되어 있다.The prion protein was named by Stanley B. Prusiner in 1982 and synthesized the word prion by capturing proteinaceous infectious particles such as proteins. Prion proteins are divided into infectious and non-infectious proteins. PrPc is non-infectious and PrPsc is infectious. PrPc is present in all humans and its function is not yet fully understood, but it is believed to play a specific role in each individual. Exposure of PrPc protein to PrPsc converts it to PrPsc. PrPsc proteins are mis-folded proteins that propagate similarly to viruses, but their propagation material is in proteins, not nucleic acids. Infectious PrPsc accumulates in the brain and causes transmissible spongiform encephalopathy (TSE), for example in humans, causing Creutzfeldt-Jakob disease (CJD). For the purpose of the present invention, the prion protein means PrPc. The amino acid sequence of the prion protein is disclosed in GenBank as BAA00011 and the like.
상기 알부민은 인간의 혈청에서 가장 많은 비율을 차지하는 혈청 알부민 (serum albumin)을 의미한다. 알부민은 분자량이 약 65,000으로 구형 단백질이며 당이 붙어있지 않다. 포유동물의 혈액에서 알부민은 혈액 내 콜로이드성 분자의 삼투압(colloid osmotic pressure)을 조절하고, 혈액 내 스테로이드, 지방산, 부신호르몬 등을 운반하는 역할과 세포 외액의 부피를 안정화 하는 역할을 한다. 알부민의 아미노산 서열은 GenBank에 AAA98797 등으로 개시되어 있다.The albumin means serum albumin (serum albumin) which occupies the largest proportion in human serum. Albumin is a globular protein with a molecular weight of about 65,000 and no sugar attached. In mammalian blood, albumin regulates the osmotic pressure of colloidal molecules in the blood, transports steroids, fatty acids, and minor signaling hormones, and stabilizes the volume of extracellular fluid. The amino acid sequence of albumin is disclosed in GenBank as AAA98797 and the like.
하기 실시예에서 입증된 바와 같이, 알츠하이머 질환 환자로부터 채취한 생물학적 시료(혈장)를 이용하여 상기 프리온-알부민 복합체의 양을 측정한 결과, 정상 대조군과 비교할 때 매우 적은 양이 검출되었다(도 2 참조).As demonstrated in the following examples, the amount of the prion-albumin complex was measured using a biological sample (plasma) taken from an Alzheimer's disease patient, and a very small amount was detected when compared to the normal control (see FIG. 2). ).
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명은 면역분석 방식, 즉 항원-항체 반응 방식으로 실시될 수 있다. 이 경우, 프리온-알부민 복합체의 존재여부 또는 양의 측정은, (ⅰ) 프리온에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 및 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는 (ⅱ) 프리온-알부민 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시된다.According to one preferred embodiment of the invention, the invention can be carried out in an immunoassay mode, ie, antigen-antibody response mode. In this case, the determination of the presence or amount of the prion-albumin complex includes (i) an antibody or aptamer specifically binding to prion, and an antibody or aptamer specifically binding to albumin; Or (ii) an antibody or aptamer that specifically binds to the prion-albumin complex.
본 발명에서 용어, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 또는 상기 마커 의 구성 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서는 프리온에 특이적으로 결합하는 두 종 이상의 항체를 조합하여 사용할 수도 있다.As used herein, the term "antibody" refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody means an antibody that specifically binds to a marker of the present invention or a constituent protein of the marker, and includes all polyclonal antibodies, monoclonal antibodies and recombinant antibodies. In the present invention, it is also possible to use a combination of two or more kinds of antibodies that specifically bind to prions.
상기한 바와 같이 새로운 알츠하이머 질환 마커가 규명되었으므로, 프리온 단백질, 알부민 단백질 또는 이들의 단백질 복합체(이들을 "마커 단백질 항원"이라 함)를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.As new Alzheimer's disease markers have been identified as described above, the production of antibodies using prion proteins, albumin proteins or protein complexes thereof (these are referred to as “marker protein antigens”) can be accomplished using techniques well known in the art. It can be manufactured easily.
본 발명에 따르면, 프리온-알부민 복합체는 인체 내에서 생성되며, 본 발명은 이러한 단백질 복합체를 검출하여 알츠하이머 질환을 진단한다. 상기 단백질 복합체의 검출은 이에 특이적으로 결합하는 항체, 예컨대 프리온 단백질의 일부 서열 및 알부민 단백질의 일부 서열 모두를 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 실시할 수 있다.According to the present invention, prion-albumin complexes are produced in the human body, and the present invention detects such protein complexes to diagnose Alzheimer's disease. Detection of the protein complex can be carried out using an antibody that specifically binds to an epitope comprising both an antibody that specifically binds to it, such as some sequences of prion proteins and some sequences of albumin proteins.
상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.The polyclonal antibody can be produced by methods well known in the art for injecting the marker protein antigen described above into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum comprising the antibody. Such polyclonal antibodies can be prepared from any animal species host, such as goats, rabbits, sheep, monkeys, horses, pigs, small dogs, and the like.
상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein, European Jounral of Immunology 6:511-519, 1976 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.Such monoclonal antibodies are known in the art by the hybridoma method (Kohler and Milstein, European Jounral of Immunology 6: 511-519, 1976) or phage antibody libraries (Clackson et al. Nature, 352: 624). -628, 1991; Marks et al. J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597, 1991).
상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.Antibodies prepared by the above method can be isolated and purified using methods such as gel electrophoresis, dialysis, salt precipitation, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and the like. In addition, antibodies of the invention include functional fragments of antibody molecules, as well as complete forms having two full length light chains and two full length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least antigen binding function, and includes Fab, F (ab '), F (ab') 2 and Fv.
본 발명의 방법을 항체 또는 앱타머를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 알츠하이머 질환을 진단하는데 이용될 수 있다.When the method of the present invention is carried out using antibodies or aptamers, the present invention can be used to diagnose Alzheimer's disease by performing according to conventional immunoassay methods.
이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시하여 알츠하이머 질환을 진단하는데 이용될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 캡처-엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.Such an immunoassay can be used to diagnose Alzheimer's disease by performing according to various conventionally developed quantitative or qualitative immunoassay methods. The immunoassay format may include Western blot, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), capture ELISA, radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, Rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, fluorescence activated cell sorter (FACS), protein chip, etc. By the above examples, the analysis method of the present invention is not limited. The immunoassay or method of immunostaining is described in Enzyme Immunoassay, ET Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) , in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, JM ed., Humana Press, NJ, 1984; And Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999, which is incorporated herein by reference.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 본 발명의 마커 분자를 검출하는 데 이용될 수 있다.For example, if the method of the present invention is carried out according to the method radioactive immunoassay, radioactive isotope is an antibody labeled (e.g., C 14, I 125, P 32 and S 35) of detecting the marker molecules of the present invention .
본 발명의 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 미지의 시료(예컨대, 혈액, 혈장 또는 혈청)를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서의 마커에 대한 항체와 상기 세포 분해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the present invention is carried out in an ELISA mode, certain embodiments of the present invention comprise the steps of: (i) coating an unknown sample (eg blood, plasma or serum) to be analyzed on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting said cell lysate with an antibody against a marker as a primary antibody; (Iii) reacting the result of step (ii) with an enzyme-conjugated secondary antibody; And (iv) measuring the activity of the enzyme.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.Suitable as said solid substrate are hydrocarbon polymers (e.g., polystyrene and polypropylene), glass, metal or gel, and most preferably microtiter plates.
상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-ASB1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.The enzyme bound to the secondary antibody may include an enzyme catalyzing a chromogenic reaction, a fluorescence reaction, a luminescent reaction, or an infrared reaction, but is not limited thereto. For example, an alkaline phosphatase,? -Galactosidase, Radish peroxidase, luciferase, and cytochrome P450. When alkaline phosphatase is used as the enzyme binding to the secondary antibody, bromochloroindolyl phosphate (BCIP), nitro blue tetrazolium (NBT), naphthol-ASB1-phosphate (naphthol-AS-B1) as a substrate chloronaphthol, aminoethylcarbazole, diaminobenzidine, D-luciferin, lucigenin (bis-N) when colorimetric substrates such as -phosphate) and enhanced chemifluorescence (ECF) are used, and horse radish peroxidase is used. -Methylacridinium nitrate), resorupin benzyl ether, luminol, amplex red reagent (10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol (HYR), tetramethylbenzidine ), ABTS (2,2'-Azine-di [3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-phenylenediamine (OPD) and naphthol / pyronine, glucose oxidase and t-NBT (nitroblue tetrazolium) and m-PMS (phenzaine) substrates such as methosulfate can be used. .
본 발명의 방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 프리온 단백질(또는 알부민)에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 시료를 반응 시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있고, 알부민(또는 프리온 단백질)에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.When the method of the invention is carried out in a capture-ELISA mode, certain embodiments of the invention comprise (i) coating an antibody against prion protein (or albumin) as a capturing antibody on the surface of a solid substrate; (Ii) reacting the capture antibody with the sample; (Iii) reacting the product of step (ii) with a detecting antibody that has a label that generates a signal and that specifically reacts with albumin (or prion protein); And (iv) measuring a signal originating from said label.
상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질, 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.The detection antibody has a label that generates a detectable signal. The label may include chemicals (eg, biotin), enzymes (alkaline phosphatase, β-galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome P450), radioactive materials, fluorescent materials (eg fluorescein), Light emitting materials, chemiluminescent (chemiluminescent) and fluorescence resonance energy transfer (FRET) include, but are not limited to these. Various labels and labeling methods are described in Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press,
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 본 발명의 마커의 정성적 또는 정량적 분석을 가능하게 한다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.Measurement of the final enzyme activity or signal in the ELISA method and the capture-ELISA method can be carried out according to various methods known in the art. Detection of these signals allows for qualitative or quantitative analysis of the markers of the invention. If biotin is used as a label, it can be easily detected by streptavidin. When luciferase is used, luciferin can easily detect a signal.
본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 프리온 단백질, 알부민 또는 이들의 단백질 복합체에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자, 바람직하게는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al. Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.According to another variant of the invention, aptamers that specifically bind to prion proteins, albumin or protein complexes thereof may be used instead of the antibodies. Aptamers are oligonucleic acid or peptide molecules, preferably peptide molecules, and the general content of aptamers is described in Bock LC et al. Nature 355 (6360): 5646 (1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78 (8): 42630 (2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95 (24): 142727 (1998).
상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 알츠하이머 질환을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 알츠하이머 질환으로 진단된다.By analyzing the intensity of the final signal by the above-described immunoassay process, Alzheimer's disease can be diagnosed. That is, if the signal for the marker of the present invention in the sample is weaker than the normal sample, it is diagnosed as Alzheimer's disease.
상술한 바와 같이, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 바람직하게는 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이고, 보다 바람직하게는 ELISA 키트이다.As described above, the kit of the present invention is an immunoassay kit, preferably the immunoassay kit is a luminex assay kit, a protein microarray kit or an ELISA kit, and more preferably an ELISA kit.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 마커 단백질 항원에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트 됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.According to one preferred embodiment of the present invention, the kit of the present invention may additionally include necessary elements necessary for performing an ELISA. ELISA kits may comprise antibodies specific for marker protein antigens. Antibodies are antibodies that have high specificity and affinity for marker protein antigens and have little cross-reactivity to other proteins. They are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, or recombinant antibodies. Other ELISA kits can be used to detect antibodies that can bind a reagent capable of detecting the bound antibody, such as a labeled secondary antibody, chromophores, an enzyme (e. G., Conjugated to an antibody) Other materials, and the like.
본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 복합 마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화 시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 양을 확인하여, 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the kit of the present invention may additionally include necessary elements necessary for performing protein microarrays to simultaneously analyze complex markers. The microarray kit may comprise antibodies specific for the marker protein antigen bound to the solid phase. Other protein microarray kits include reagents that can detect bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (such as fused with antibodies), and substrates thereof or other materials that can bind to antibodies. And the like. The method of analyzing a sample using a protein microarray, separates the protein from the sample, hybridizes the separated protein with a protein chip to form an antigen-antibody complex, and reads the same to determine the presence or amount of the protein, Information necessary for the diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease can be provided.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다. 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg 단위), 빠른 시간 내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다.According to another preferred embodiment of the present invention, the Luminex kit capable of carrying out the Luminex assay of the present invention may comprise an antibody specific for the marker protein antigen. Other luminex kits may also include reagents capable of detecting bound antibodies, such as labeled secondary antibodies, chromophores, enzymes (e.g., conjugated to antibodies) and other substrates capable of binding to the substrate or antibody . ≪ / RTI > The antibody may be a conjugated antibody conjugated with microparticles, and the microparticles may be colored latex or colloidal gold particles. Luminex Assay is a high-throughput quantitative method that can simultaneously measure up to 100 different analytes without pretreatment of small (10-20 μl) patient samples As a result, it has good sensitivity (pg unit) and can be quantified in a short time (3-4 hours), and it is an analysis method that can replace ELISA or ELISPOT.
본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.Kits of the invention can be produced in a number of separate packaging or compartments containing the above components.
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 포함하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈장을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈장을 의미한다.
According to one preferred embodiment of the invention, the biological sample of the invention comprises tissue, cells, blood, serum, plasma, saliva, cerebrospinal fluid or urine, preferably blood or plasma, most preferably Means plasma.
본 발명의 다른 하나의 양태에 따르면, 본 발명은 알츠하이머 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 프리온 단백질과 알부민이 형성한 복합체(프리온-알부민 복합체)의 존재여부 또는 양을 측정하는 단계를 통하여 알츠하이머 질환 마커를 검출하는 방법을 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides the presence or absence of a complex (prion-albumin complex) formed by prion protein and albumin in a biological sample of human to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease or A method of detecting Alzheimer's disease marker is provided by measuring the amount.
상기 알츠하이머 질환 마커를 검출하는 방법과 상기 알츠하이머 질환 분석용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.Since the method for detecting the Alzheimer's disease marker and the kit for analyzing the Alzheimer's disease use the same marker, the common content between the two is omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
본 발명은 알츠하이머 질환을 의사의 소견에 의한 판단이 아니라, 분자 진단 방법으로 판단한다. 본 발명의 마커는 알츠하이머 질환에서 저농도로 존재하는 생체 분자이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "저농도"는 조사 대상의 시료에서의 대상이 되는 마커의 양이 정상 시료와 비교하여 적은 경우를 의미한다. 예를 들어, 상술한 분석 방법에 따라 분석한 결과, 본 발명의 마커가 정상인과 비교하여 10-100배 정도 적은 양이 검출되는 경우, 본 발명에서의 "저농도"로 판정하고 알츠하이머 질환으로 판정한다.In the present invention, Alzheimer's disease is judged not by the doctor's opinion, but by a molecular diagnostic method. The marker of the present invention is a biomolecule present at low concentration in Alzheimer's disease. As used herein, the term "low concentration" means a case where the amount of the target marker in the sample to be investigated is small compared to the normal sample. For example, as a result of analysis according to the above-described analytical method, when the marker of the present invention is detected in an amount of about 10-100 times smaller than that of a normal person, it is determined as "low concentration" in the present invention and as Alzheimer's disease. .
본 발명의 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다.According to one preferred embodiment of the invention, the method of the invention may be carried out in an antigen-antibody reaction mode.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 (a) 프리온 단백질에 대해 결합능이 있고 고상의 매트릭스에 고정화된 포획항체(capturing antibody)에 생물학적 시료를 접촉 시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 알부민에 대해 결합능이 있는 검출항체(detecting antibody)를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함한다.Preferably, the method of the present invention comprises the steps of: (a) contacting a biological sample with a capturing antibody that is capable of binding to a prion protein and immobilized on a matrix of a solid phase; (b) contacting a resultant of step (a) with a detecting antibody capable of binding to albumin; And (c) detecting the antigen-antibody complex formed in step (b).
상기 항원-항체 복합체 형성의 검출은 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 이용하여 실시할 수 있다.Detection of the antigen-antibody complex formation can be carried out using a label that generates a detectable signal.
본 발명에 따르면, 간편하면서도 신속하게 알츠하이머 질환의 발병 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 나온 데이터를 근거로 하여 알츠하이머 질환 관련 약물을 환자에게 처리할 수 있다.
According to the present invention, it is possible to easily and quickly determine whether to develop Alzheimer's disease. In addition, Alzheimer's disease related drugs can be treated in patients based on the data derived by the methods of the present invention.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(ⅰ) 본 발명은 알츠하이머 질환에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다.(Iii) The present invention provides novel molecular markers for Alzheimer's disease.
(ⅱ) 본 발명은 프리온-알부민 복합체가 알츠하이머 환자에서 적은 양으로 존재한다는 것에 기초한다.(Ii) The present invention is based on the fact that the prion-albumin complex is present in small amounts in Alzheimer's patients.
(ⅲ) 본 발명의 마커를 이용하면 신속·정확하게 알츠하이머 질환의 진단 및 예후 분석을 할 수 있다.
(Iii) By using the marker of the present invention, the diagnosis and prognostic analysis of Alzheimer's disease can be performed quickly and accurately.
도 1은 알츠하이머 질환 환자 및 정상인의 혈액 내에 존재하는 총 프리온 단백질의 양을 보여주는 ELISA 실험 결과이다.
도 2는 알츠하이머 질환 환자 및 정상인의 혈액 내에 존재하는 프리온-알부민 단백질의 양을 보여주는 ELISA 실험 결과이다.1 is an ELISA experiment showing the total amount of prion protein present in the blood of Alzheimer's disease patients and normal people.
Figure 2 is an ELISA experiment showing the amount of prion-albumin protein present in the blood of Alzheimer's disease patients and normal people.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
실험재료 및 실험방법Materials and Experiments
알츠하이머 질환 환자로부터 혈액 채취Blood sampling from Alzheimer's disease patients
알츠하이머 환자(Alzheimer's disease) 14명과 정상인 2명(normal)으로부터 혈액 10 ㎖를 항응고제(citrate)를 이용하여 채취하였다. 항응고제가 충분히 섞이도록 천천히 혼합하였다. 채취된 혈액은 850xg에서 30분간 원심분리 후 혈구와 섞이지 않게 혈장을 분리하였다.
10 ml of blood were collected from 14 Alzheimer's disease patients and 2 normal persons using anticoagulants. Mix slowly to ensure sufficient anticoagulant mix. The collected blood was centrifuged at 850x g for 30 minutes and plasma was separated from the blood cells.
혈액 내 총 프리온 단백질의 양 측정Measure the amount of total prion protein in the blood
알츠하이머 환자로부터 채취한 혈액 내에 존재하는 프리온 단백질의 양을 측정하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 고속 대량 스크리닝(High-Throughput Screening)을 실시하였다. 항-프리온 항체 SAF-32(Cayman Chemical, A03202) 항체의 농도가 2 μg/㎖가 되도록 맞춘 후, 플레이트(Nunc Modules for Fluorescence, 475515)에 100 ㎕씩 넣은 다음 모이스쳐 챔버(moisture chamber)에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후, PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.4, Sigma, P3813)로 3번 세척하였다. Blockace(설인유업주식회사, Japan, UK-B80)를 10 mg/㎖로 물과 희석한 후, 300 ㎕씩 각 웰에 넣어 모이스쳐 챔버 내 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후, PBS로 3번 세척하였다. 혈장을 TBST(Tris buffered saline, with tween 20, pH 8.0, Sigma, P9039)와 섞어 30%로 만들어 주었다. 30% 혈장을 상기의 프리온 항체로 코팅된 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. TBST에 HRP가 부착된 프리온 단백질 항체(HRP conjugated mouse monoclonal anti- prion protein, T2, from Dr. T. Yokoyama) 및 Blockace를 각각 0.01 μg/㎖ 및 0.8 mg/㎖로 마지막 농도가 되도록 희석한 다음 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. ECL 용액(Thermo Scientific, 37070)을 100 ㎕씩 각 웰에 넣어주고, Victor 플레이트 리더(VICTOR3, PerkinElmer)로 신호 강도를 측정하였다.
In order to measure the amount of prion protein present in blood collected from Alzheimer's patients, high-throughput screening was performed as follows. The anti-prion antibody SAF-32 (Cayman Chemical, A03202) antibody was adjusted to a concentration of 2 μg / ml, and then 100 μl of the plate (Nunc Modules for Fluorescence, 475515) was placed in a moisture chamber. The reaction was allowed to react overnight at 캜. After the reaction, it was washed three times with PBS (Phosphate buffered saline, pH 7.4, Sigma, P3813). Blockace (Sinyi Oil Co., Ltd., Japan, UK-B80) was diluted with water to 10 mg / ㎖, 300 ㎕ each well was reacted for 4 hours at room temperature in the moist chamber. After 4 hours, washed three times with PBS. Plasma was mixed with TBST (Tris buffered saline, with tween 20, pH 8.0, Sigma, P9039) to make 30%. 30% plasma was dispensed into the plate coated with the prion antibody by 100 μl, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, each well was washed three times with TBST. HRP-conjugated HRP conjugated mouse monoclonal anti-prion protein (T2, from Dr. T. Yokoyama) and Blockace were diluted to 0.01 μg / ml and 0.8 mg / ml, respectively, to TBST to a final concentration of 100 Each well was aliquoted into μL and reacted at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, each well was washed three times with TBST. 100 μl of ECL solution (Thermo Scientific, 37070) was added to each well and signal strength was measured with Victor plate reader (VICTOR 3 , PerkinElmer).
혈액 내 프리온-알부민 복합체의 양 측정Determination of the amount of prion-albumin complexes in the blood
알츠하이머 환자로부터 채취한 혈액 내에 존재하는 프리온-알부민 복합체의 양을 측정하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 고속 대량 스크리닝(High-Throughput Screening)을 실시하였다. 항-프리온 항체 MA1(Thermo Scientific, MA1-750) 항체의 농도가 2 μg/㎖가 되도록 맞춘 후, 플레이트(Nunc Modules for Fluorescence, 475515)에 100 ㎕씩 넣은 다음 모이스쳐 챔버에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후, PBS(pH 7.4, Sigma, P3813)로 3번 세척하였다. Blockace(설인유업주식회사, Japan, UK-B80)를 10 mg/㎖로 물과 희석한 후, 300 ㎕씩 각 웰에 넣어 모이스쳐 챔버 내 상온에서 4시간 동안 반응시켰다. 4시간 후, PBS로 3번 세척하였다. 혈장을 TBST(pH 8.0, Sigma, P9039)와 섞어 30%로 만들어 주었다. 30% 혈장을 상기의 프리온 항체로 코팅된 플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. TBST에 HRP가 부착된 알부민 단백질 항체(HRP conjugated goat polyclonal anti-human serum albumin, Abcam, Ab19183) 및 Blockace를 각각 0.1 μg/㎖ 및 0.8 mg/㎖로 마지막 농도가 되도록 희석한 다음 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, TBST로 각 웰을 3번 세척하였다. ECL 용액(Thermo Scientific, 37070)을 100 ㎕씩 각 웰에 넣어주고, Victor 플레이트 리더로 신호 강도를 측정하였다.
In order to measure the amount of prion-albumin complexes present in blood collected from Alzheimer's patients, high-throughput screening was performed by the following method. After adjusting the concentration of the anti-prion antibody MA1 (Thermo Scientific, MA1-750) antibody to 2 μg / ml, put 100 μl into the plate (Nunc Modules for Fluorescence, 475515), put in a moisturizing chamber and overnight at 4 ℃ Reacted. After the reaction, the mixture was washed three times with PBS (pH 7.4, Sigma, P3813). Blockace (Sinyi Oil Co., Ltd., Japan, UK-B80) was diluted with water to 10 mg / ㎖, 300 ㎕ each well was reacted for 4 hours at room temperature in the moist chamber. After 4 hours, washed three times with PBS. Plasma was mixed with TBST (pH 8.0, Sigma, P9039) to make 30%. 30% plasma was dispensed into the plate coated with the prion antibody by 100 μl, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the reaction, each well was washed three times with TBST. HRP-conjugated albumin protein antibody (HRP conjugated goat polyclonal anti-human serum albumin, Abcam, Ab19183) and Blockace were diluted to 0.1 μg / ml and 0.8 mg / ml to the final concentration, respectively, and then 100 μl each well. Was dispensed at and reacted at 37 ° C for 1 hour. After the reaction, each well was washed three times with TBST. 100 μl of ECL solution (Thermo Scientific, 37070) was added to each well and signal strength was measured with a Victor plate reader.
통계 분석Statistical analysis
실험에서 얻어진 수치는 Minitab 프로그램을 사용하여 통계치를 얻어내었다. 정량치 항목(data type: quantitative value)은 Student's t-test를 사용하여 유의성(p < 0.05, p < 0.01)을 확인하였다.
The numbers obtained in the experiments were obtained using the Minitab program. The quantitative value (data type) was identified using the Student's t-test (p <0.05, p <0.01).
실험결과Experiment result
알츠하이머 질환 환자와 정상인의 총 A total of Alzheimer's disease patients and normal people 프리온Prion 단백질의 혈액 내 양 비교 Comparison of the amount of protein in the blood
알츠하이머 질환 환자의 혈액을 이용하여 혈장 내에 존재하는 총 프리온 단백질(total prion protein)의 양을 ELISA법으로 측정하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.Using the blood of Alzheimer's disease patients, the amount of total prion protein in plasma was measured by ELISA. The results are shown in Fig.
도 1에 나타난 바와 같이, 알츠하이머 질환 환자의 혈액은 정상인에 비하여 많은 양의 프리온 단백질을 함유하고 있었다.
As shown in Figure 1, the blood of Alzheimer's disease patients contained a large amount of prion protein compared to the normal person.
알츠하이머 질환 환자와 정상인의 프리온-알부민 복합체의 혈액 내 양 비교Comparison of blood levels of prion-albumin complexes in patients with Alzheimer's disease
알츠하이머 질환 환자의 혈액을 이용하여 혈장 내에 존재하는 프리온-알부민 복합체의 양을 ELISA법으로 측정하였다. 프리온 단백질에 대한 항체로 코팅된 96 멀티-웰 플레이트에 정상인 및 알츠하이머 질환 환자의 혈장을 투입한 후, HRP가 부착된 알부민 단백질에 대한 2차 항체를 처리하여 농도를 측정하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.Using the blood of Alzheimer's disease patients, the amount of prion-albumin complexes present in plasma was measured by ELISA. Plasma from normal and Alzheimer's disease patients was injected into 96 multi-well plates coated with antibodies to prion proteins, followed by treatment with secondary antibodies against albumin proteins with HRP. The results are shown in Fig.
도 2에 나타난 바와 같이, 알츠하이머 질환 환자의 혈액은 정상인에 비해 많은 양의 프리온 단백질을 함유하고 있으나, 프리온-알부민 복합체는 정상인에 비해 훨씬 적은 양을 함유하고 있었다. 이러한 결과는, 혈액 내에 존재하는 프리온-알부민 복합체의 양을 측정하여 알츠하이머 질환을 신속하고 정확하게 진단할 수 있음을 의미한다.
As shown in FIG. 2, the blood of Alzheimer's disease patients contained a greater amount of prion protein than a normal person, but the prion-albumin complex contained much less than a normal person. This result means that the Alzheimer's disease can be diagnosed quickly and accurately by measuring the amount of prion-albumin complex present in the blood.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (7)
(ⅰ) 프리온-알부민 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머; 또는
(ⅱ) 프리온에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머, 및 알부민에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머.
Immunoassay kit for diagnosing or prognosticting Alzheimer's disease, comprising the following agents for determining the presence or amount of a complex formed by a prion protein and albumin (prion-albumin complex) present in a biological sample:
(Iii) an antibody or aptamer that specifically binds to the prion-albumin complex; or
(Ii) antibodies or aptamers that specifically bind to prions, and antibodies or aptamers that specifically bind to albumin.
According to claim 1, wherein the immunoassay (immunoassay) kit for Alzheimer's disease diagnosis or prognostic kit, characterized in that the Luminex analysis kit, protein microarray kit or ELISA kit.
In order to provide information necessary for the diagnosis or prognosis of Alzheimer's disease, an antigen-antibody reaction method is used to measure the presence or amount of a complex formed by prion protein and albumin (prion-albumin complex) in a human biological sample. A method for detecting Alzheimer's disease markers.
The method of claim 4, wherein the biological sample is blood, plasma or serum.
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|---|---|---|---|---|
| KR102202120B1 (en) | 2019-10-30 | 2021-01-12 | 재단법인대구경북과학기술원 | Use of Ube2h for Diagnosis or Treatment of Alzheimer's Disease |
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2012
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