JP5197661B2

JP5197661B2 - 核酸検出用プローブ担体

Info

Publication number: JP5197661B2
Application number: JP2010058310A
Authority: JP
Inventors: 智博鈴木; 美絵石井
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2010-03-15
Filing date: 2010-03-15
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2024-07-02
Also published as: JP2010142251A

Description

本発明は、検出対象となる核酸を検出する為の複数のプローブから構成されるプローブセットが固定された核酸検出用のプローブ担体及びそれを用いた検出方法に関する。

ヒトゲノム計画に代表されるように各種の生物の遺伝子が解明され、生命活動のメカニズム、病気、体質等と遺伝子との関連が次々と調べられている。そして、遺伝子の有無やその存在量（発現量）を知ることで、例えば病気などのより詳細な特徴やタイピング、あるいは効果的な治療方法の選択などが可能となることがわかってきた。

検体に含まれている特定の遺伝子の有無やその存在量を調べる方法は、昔から多くの方法が考案されているが、その中でも応用範囲が広く検出対象によらず適用可能な方法として、検出対象とする遺伝子あるいは核酸の特徴的な部分配列を選び、その部分配列の有無あるいは存在量を調べる方法が広く用いられている。具体的には選び出された部分配列の相補鎖に相当する核酸配列（プローブ）を用意し、検体とプローブとがハイブリダイゼーションすることを何らかの手段で検出することにより、検体中の核酸配列の有無を調べる方法である。

ハイブリダイゼーションを利用した特定の核酸の検出方法は、固相、液相を問わず用いることが可能である。例えば液相中で行う場合には、二本鎖形成時に分光特性が変化する標識物質を結合させたプローブ溶液を準備し、これを検体に添加し、その分光特性の変化を測定することで検体中の特定核酸の有無を調べる方法がその一例である。

固相上でハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブを固相上に固定または吸着させておき、その固相上に何らかの検出可能な標識物質により標識した検体を添加し、固相上からの標識物質の信号を測定することにより検出する方法が代表的である。中でもプローブをガラスや金属などの平面基板上に固定したチップ、あるいは微少粒子表面へ固定したビーズ等は代表的な固相ハイブリダイゼーションの形態である。固相上のハイブリダイゼーションが好まれる理由は、Ｂ／Ｆ分離が容易であること、検出領域を物理的に微小化でき高感度化が期待できること、複数種のプローブを物理的に隔離することにより同時多項目の検出が可能であること、固相ゆえにその取り扱いや応用が容易に出来るからである。

固相ハイブリダイゼーションの長所のうち、同時多項目の検出が出来るという特徴は、様々な検出方式を可能にしている。例えば、部分的に同じ配列を有するファミリー遺伝子の検出を行う場合、ファミリー遺伝子間で共通の配列を有する領域に１つのプローブを設定し、反対にファミリー遺伝子間で異なる配列を有する固有の領域にそれぞれ１つのプローブを設定すれば、複数の検体間で遺伝子発現量の比較や、どのタイプのファミリー遺伝子が発現しているのかを正確に識別することが可能となる。また、感染症の起炎菌の判別を行う場合、一般的には菌の遺伝子のうち１６SリボソーマルRNAをコードする配列部分を検出し、その検出された配列により菌種の判別を行うことが多いが、その場合、菌種、株、属のレベルに応じて特異的な配列あるいは共通の配列を選び出すことにより、目的とするレベルの判別を行うことが可能となる。例えば、同じ菌種内では共通し他の菌種とは異なる領域からプローブを設定し、それと同時に、同じ菌種内で株によって異なる領域からプローブを設定すれば、これら複数のプローブにより菌種と株の判別が同時に出来ること
になる。

同一の検出対象核酸に対して、複数のプローブを設定しているDNAアレイとしては、たとえば米国アフィメトリックス社のGeneChipがある。アフィメトリックス社製のDNAアレイを用いた検出方法では、平面基板上に合成されたオリゴＤＮＡに対し、標識された核酸を作用させ、そのハイブリダイゼーションを蛍光検出により測定することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量を検出している（特許文献１参照）。そして同一の検出対象核酸に対して、約１０から２０種のプローブを設定し、それらのプローブから得られる信号を総合的に判定し、遺伝子の発現量を測定している。

一方、液相、固相を問わず、プローブ核酸を用いて、ハイブリダイゼーションによる検出対象核酸の検出方法は様々な改良が重ねられ、以前に比べて大幅に感度は上昇した。しかし、検出対象核酸を直接ハイブリダイゼーションにより検出するためには、非常に大量の検体量を必要とし非現実的である場合が多く、一般的に得られる検体量では感度的には不充分である。また、一般的には蛍光物質等により検出対象核酸を標識する必要があるため、多くの場合、検出対象核酸をPCR法やRNAポリメレース反応により増幅して標識し、用意したプローブ核酸とハイブリダイゼーションすることが行なわれている。

これら増幅された検出対象核酸とプローブ核酸とはハイブリッド体を形成する。プローブは一般的に人工的に化学合成された核酸であるため、その塩基長は約１５merから８０merであることが多い。また、PCR法等によって増幅された検出対象核酸は１００mer以上であることが一般的である。したがって、プローブと検出対象核酸とで形成されるハイブリッド体は、プローブ結合領域が二本鎖構造をとり、その少なくとも一方の側に検出対象核酸の一本鎖部分が張り出した構造をしている。

米国特許第６４１０２２９号明細書

先に例示した、ファミリー遺伝子の検出や菌種の判別などの場合、標的一本鎖核酸の異なる複数の領域を検出する複数の異なるプローブの設定が有効であるが、たとえばTm値やGC%だけに着目して同レベルの結合力の複数の異なるプローブを設定をすると、各プローブの固定領域に形成されたハイブリッド体の安定性に大きなバラツキが生じる場合があり、そのような場合は同量の検体量があるにもかかわらず、各プローブ固定領域間で蛍光輝度値が大きく異なるという問題が生じる。DNAマイクロアレイなどの測定においては、その測定に際しては蛍光輝度を精細に測定できるスキャナーが使用されるが、ほとんどがマイクロアレイ全面を一括してスキャンする方式を取っており、プローブによって検出感度を変えるといった調整は出来ないのが一般的である。

従って、同一の検出対象核酸における異なる領域を検出できるプローブセットにおいても、異なるプローブの固定領域に形成される各ハイブリッド体の安定性にバラツキが少なく、各ハイブリッド体で同じレベルの検出感度が得られるプローブセットの提供が望まれていた。

従って、本発明の目的は、プローブと検出対象となる一本鎖核酸とのハイブリッド体の安定性に起因する検出値のバラツキを排除した高感度でのプローブによる一本鎖核酸の検出を可能とするプローブセットを用いて形成されたプローブ担体を提供することにある。

上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、検出対象核酸とプローブとのハイブリッド体の安定性を考慮したプローブ設計を行い、同じレベルのハイブリッド体安定性を有するプローブから構成されるプローブセットを供給することで、上記、複数のプローブ間での不均一性を解消できることを見出した。

本発明のプローブ担体は、
検出対象となる一本鎖核酸の増幅産物、およびその相補的な配列を有する一本鎖核酸の増幅産物の検出のためのプローブセットが、各プローブごとに固相上の識別可能な異なる領域に固定されているプローブ担体であって、
該プローブセットは検出対象となる各一本鎖核酸のそれぞれ少なくとも１つの異なる領域を検出するためのプローブを有しており、
前記検出対象となる各一本鎖と前記各プローブとがハイブリッド体を形成したときに、ハイブリッド体がそれぞれ有する一本鎖部分のうち検出対象鎖の５'末端を含む部分の塩基数をそれぞれＬ１、３'末端を含む部分の塩基数をそれぞれＬ２と表わすと、
各ハイブリッド体がそれぞれ
Ｌ２≧Ｌ１
の関係を満たすように各プローブが構成されていることを特徴とする。

また、本発明にかかる核酸の検出方法の一態様は、上記構成のプローブ担体に、検出対象となる一本鎖核酸及びその相補鎖を反応させて、該プローブ担体に固定されたプローブの上に形成された二本鎖のハイブリッド体を検出する工程を有する核酸の検出方法である。
更に、本発明にかかる核酸の検出方法の他の態様は、上記構成のプローブ担体を用いて標的一本鎖核酸を検出する検出方法であって、前記標的一本鎖核酸とその相補的な配列を有する相補一本鎖核酸とを含む試料を前記プローブ担体と反応させることを特徴とする検出方法である。

本発明により、検出対象核酸及びその相補鎖に対してそれぞれ１つ以上設定されたプローブセットにより、同じレベルのハイブリッド体安定性を有するプローブセットをも得ることができる。また、これらプローブセットが結合したプローブ担体も得ることができる。これにより、ハイブリッド体の安定性によらず必要とされる任意のプローブ設定が可能となる。

検出対象核酸に対しプローブを設定したときのＬ１，Ｌ２、Ｐを示す図である。検出対象核酸に対し塩基長の異なる２種のプローブを設定したときの図である。検出対象核酸およびその相補鎖に対し２種のプローブを設定したときの図である。

部分的二本鎖構造を有するハイブリッド体に関しては、その安定性に関して研究がなされており、本願出願人は、この安定性に着目した発明を特願２００３−３２４６４７号として出願している。それらの研究によれば、ハイブリッド体の二本鎖構造部の両側に存在する検出対象核酸からなる一本鎖部分のうち、５’側と３’側の塩基長の比率により安定性が異なることが明記されている。さらに詳しくは、２つの一本鎖部分のうち検出対象鎖の５’末端を含む部分の塩基数をＬ１、３’末端を含む部分の塩基数をＬ２と表わしたときに、
Ｌ２≧Ｌ１
の関係を有する場合にハイブリッド体が安定することが明記されている。さらには、その相対比であるＬ２／Ｌ１の大きさが大きいほど、よりハイブリッド体が安定することがわかっている。

このハイブリッド体の安定性に関する知見は、同一検出対象核酸に対して複数のプローブを設定し各プローブのTm値を同一にしたとしても、固相ハイブリダイゼーションなどで得られる蛍光輝度値がプローブにより異なることを示している。

プローブの検出対象核酸に対する結合力はプローブ設計のファクターの一つである。２本鎖核酸を互いに結合して形成している相補鎖、例えばプローブ配列と検出対象の相補鎖から形成される二本鎖の結合力を示す尺度としては、これが解離し一本鎖状態になる温度、すなわちTm値が一般に用いられる。Tm値は、実際にプローブ配列とその相補鎖を用意し、サンプル核酸とプローブとをハイブリダイゼーションさせるときと同じ環境下で、実際に測定することで得ることができる。また、プローブのTm値は計算により算出することも可能である。Tm値の計算方法は、ハイブリダイゼーションにおける塩濃度等をパラメーターにして各種の計算方法が考案されている。一般的に良く用いられる計算方法としては、最近接塩基対法などを用いることができ、これにより計算されたTm値をもとに配列を設定したプローブセットを設定することができる。また、その他の計算手法としてWallace（ワーレス）法も用いることができ、これにより計算されたTm値をもとに配列を設定したプローブセットを設定することができる。さらには、GC%法も用いることができ、これにより計算されたTm値をもとに配列を設定したプローブセットを設定することができる。

プローブの結合力を最適にするためのTm値の調整方法としては、プローブの塩基長を変更する方法や、ＧＣ％を変更する方法もあり、それによって結合力を調整したプローブから構成されたプローブセットを設定することができる。

本発明では、各プローブの結合力を、各プローブの検出位置の検出対象核酸の５’末端からの塩基数に応じて設定して、詳しくは、５’末端からのプローブの検出位置までの塩基数の大きさに応じて調整し、プローブの設計を行う。

核酸を検出対象としたプローブとしては、合成の容易性からDNAを用いることが一般的であるが、近年注目されているPNA(peptidenucleic acids)なども用いることができ、DNAと同様に、結合力を適切に設定することで、本発明のプローブセットを構成することが可能である。また必要であれば、ＤＮＡ、ＰＮＡが混在したプローブセットとすることも可能である。

プローブセット及びプローブ担体についてさらに詳しく説明する。
（第１のプローブセットについて）
第１のプローブセットは、検出対象核酸の配列において、複数箇所のプローブが望まれる場合に特に有効である。検出対象核酸とプローブから構成される、部分的に二本鎖構造を有するハイブリッド体は、二本鎖構造部の両側に一本鎖部分が存在する。このうち検出対象核酸の５’末端側に存在する部分をA鎖、反対に３’末端側に存在する部分をB鎖としたときに、A鎖とB鎖の長さの比に応じて、そのハイブリッド体の安定性は大きく異なる。A鎖の塩基数をL1、B鎖の塩基数をL2としたときに、
Ｌ２≧Ｌ１
の関係を満たすときにハイブリッド体は安定し、また、その安定性はL２/L１の値が大きいほど高まることが知られている。検出対象核酸において各プローブが結合する領域の位置を、検出対象核酸の５’末端からの塩基数Pで表したとき、Pの値が小さくなれば、すなわちＬ２／Ｌ１が大きくなれば、そのハイブリッド体の安定性は高まり、客観的にプローブの結合力は高くなる。

従って検出対象核酸に対して複数のプローブを設定する場合において、Pの大きさに応じてプローブの結合力を調整したプローブセットを供給することで、それらのハイブリッド体の安定性を同じレベルとすることができる。参考として、Ｌ１とＬ２およびＰの関係を図１に簡単に示す。

プローブセットを構成するプローブがD N Aである場合、その結合力を評価、表記する方法として最も一般的な方法は、二本鎖から一本鎖に解離する温度であるTm値である。Tm値の求め方は、前述のようにプローブとその相補鎖を用意し、定法に従って吸収測定をすることにより直接測定することができる。測定する際には、なるべく実際のハイブリダイゼーション条件、すなわちプローブセットと検出対象核酸を含むサンプル核酸をハイブリダイゼーションする条件下に置くことが望ましい。同じ条件下での測定が困難な場合には、必ずしもこの限りではなく、近似の条件下で測定を行えばよい。

また、Tm値を実測しない場合には、計算により求めることも可能である。Tm値の計算手法としては、様々な手法が考案されており、どの手法も特に制限無く用いることが可能だが、なかでも最近接塩基対法、Wallace法、GC％法などは特に本発明に含まれるプローブに好適に用いられる。

なお、最近接塩基対法に関しては、Breslauer K.J.,Frank R.,Blocker H.,Markey L.A.(1986)Predicting DNA duplex stability from the basese quence-Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,3746-3750、Freier S.M.,Kierzek R.,Jaeger J.A.,Sugimoto N.,Caruthers M.H.,Nielson T.,Turner D.H.(1986)Improved free-energy parameters for predictions of RNA duplex stabilit.-Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,9373-9377、Schildkraut C.,Lifson S.(1965)Dependence of the melting temperature of DNA on salt concentration-Biopolymers 3,195-208などを参照し、Wallace法に関しては、Wallace,R.B.;Shaffer,J.;Murphy.F.;Bonner,J.;Hirose,T.;Itakura,K.;(1979)Nucelic AcidRes.6,3543などを参照し、ＧＣ％法に関しては、Dependence of the Melting Temperature of DNA on Salt Concentration、Schildkraut C.,Lifson S.(1965)BIOPOLYMERS 3.195-208、Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro、W.Rychlik、Nucl.AcidsRes.(1990)18(21)6409-6412などを参照する。

プローブセットを構成するプローブのTm値が所望の値にならなかった場合には、プローブごとに配列等の設計を変更し、Tm値を調整することが必要になるが、その調製方法としては、プローブの塩基長を変更する方法や、GC%を変更する方法があり、それ以外にも配列認識における特異性を大幅に低下させない範囲で、なんらかの化学的な修飾を加える方法も利用できる。

プローブとしてはDNAが一般的に用いられるが、PNAもDNAと同様の機能があることが知られており、DNAのプローブと同様にTm値を調整し、プローブとして使用することが可能である。

本発明により検出対象核酸に対し複数のプローブを設定した例を図２に示す。図１に示されるプローブセットは、５’側に設定したプローブAが２５ｂｐであるのに対し、３’側に設定したプローブBは、結合力を上げるため、６０ｂｐのプローブとしている。

（第２のプローブセットについて）
第２のプローブセットは、本発明にかかるプローブセットであり、検出対象となる一本鎖核酸、および相補的な配列を有する相補鎖のそれぞれ少なくとも１つの異なる領域を検出するためのプローブを有することを特徴とするプローブセットである。

検出を必要とする配列領域が、検出対象核酸の３ ’ 末端側に存在する場合、すなわちＬ２／Ｌ１の値が小さい場合、プローブと検出対象核酸が形成するハイブリッド体は、極めて安定性が低いものとなる。その場合、結果的に他のプローブに比較して感度が大幅に低下してしまうだけでなく、場合によっては検出感度を下回り検出不可能になることもある。第２のプローブセットにおいてはこれを回避するため、検出対象とする核酸の相補鎖を検出対象とすることとしたものである。すなわち、検出対象配列をその相補鎖とすることで、Ｌ１とＬ２の値が逆転し、結果的にＬ２／Ｌ１の値が大きくなり、プローブと検出対象鎖が安定したハイブリッド体を形成することが可能となるものである。

相補鎖に対するプローブ設定は、ＰＣＲによりサンプル核酸を調製したときに特に好適に適用できる。通常の対称ＰＣＲ法では検出対象核酸と同じ程度の量の相補鎖核酸が調製されており、特に調製方法を変更することなくサンプル核酸を調製しても、相補鎖に対応するプローブで検出可能である。従って、第２のプローブセットでは、ハイブリッド体安定性を考慮し、検出対象鎖およびその相補鎖からそれぞれ少なくとも１つのプローブを設定したプローブセットとなる。

検出対象となる一本鎖核酸は、多くの場合、増幅及び標識化が必要であるため、PCR法により事前に増幅調製されることが多いが、その際、検出対象となる一本鎖核酸の相補鎖も同時に合成される。従って、特にPCR産物を検出対象とする場合に第２のプローブセットは好適に用いることができる。第２のプローブセットのプローブは、検出対象核酸、その相補鎖ともにそれぞれ少なくとも１つ設定されていればよく、同一の検出対象鎖に対し２つ以上のプローブを設定することも可能である。プローブセットを構成する各プローブの結合力は、各プローブの検出対象核酸の５’末端からの塩基数に応じて決定したもので
あり、詳しくは、５’末端からの塩基数が大きくなるのに応じて高くなる関係を有するプローブ構成である。

第２のプローブセットにおいて検出対象核酸に対し複数のプローブを設定した例を図３に示す。図３に示されるプローブセットは、検出対象鎖の異なる２つの領域を検出するためのプローブＣ及びＤからなるもので、５’側に設定したプローブCが２５ｂｐであるのに対し、３’側に設定したプローブDも２５ｂｐとしてあり、これらの結合力はほど同一に設定されている。なお、第２のプローブセットにおけるプローブ設計においても第１のプローブセットにおける場合と同様にTm値に基づいて一本鎖核酸への結合力を設定することができる。

ここで、検出対象鎖のプローブＤの認識領域に対応する部分に結合するプローブを設定すると、Ｌ１≧Ｌ２となり、ハイブリッド体が形成された際の安定性が低下する。そこで、プローブで認識する領域を図３に示す相補鎖に設定し、プローブＤを選択することで、相補鎖とプローブＤとが結合したハイブリッド体ではＬ２≧Ｌ１となり安定性を確保することができる。従って、第２のプローブセットによれば、検出対象鎖の異なる領域を認識する異なるプローブを設定する際に、検出対象鎖の３’側の領域にプローブでの認識領域を設定する場合に、その相補鎖側にプローブの結合位置を設定することでプローブの結合力を上げることなく３’側の領域を認識するプローブとのハイブリッド体の安定性を確保でき、プローブ設計における要件を緩和することができる。なお、相補鎖側に設定するプローブは、Ｌ１／Ｌ２が０〜１．５となる範囲から、更には、０〜１となる範囲からプローブが認識する位置を設定することが好ましい。

（プローブ担体について）
上記の第１及び第２のプローブセットの少なくとも一方を構成する各プローブをそれぞれ個々に固相上に結合してプローブ担体を形成することができる。例えば、先に挙げたファミリー遺伝子間で共通の配列を有する領域に１つのプローブを設定し、反対にファミリー遺伝子間で異なる配列を有する固有の領域にそれぞれ１つのプローブを設定して、ファミリー遺伝子の解析を行なう場合などに好適に利用できる。従って、各プローブセットを構成するプローブの種類は分析の用途に応じて２以上の所定数となる。

プローブセットを構成する各プローブの担体への固定にあたっては、各プローブの種類が識別できる必要があるが、その識別方法は、空間的、光学的、時間的、あらゆる手法を用いることが可能である。たとえば同一平面上の分離された異なる領域に、種類ごとにプローブが固定されたDNAマイクロアレイなどは、本発明のプローブ結合担体の好適な代表例である。

プローブの結合方法としては、吸着、イオン結合、水素結合、共有結合等、様々な結合方式が適用可能である。プローブを好ましい方式により結合するためには、プローブに所望の官能基を導入しそれを介して結合することが望ましい。プローブ核酸の５’末端に固定用部位としての官能基を導入することは比較的容易かつ一般的である。同様に３’末端に固定用部位としての官能基を導入することも比較的容易かつ一般的である。また、それ以外にも、プローブ配列中に導入された固定用部位としての官能基などを介して、プローブを固定化することもできる。

固相担体の材質としては、金属、ガラス、プラスチック、金属薄膜、繊維等、プローブが固定できるものは特に制限無く使用できる。形態についても、平面状、ビーズ、ストランド等、特に制限無く使用できる。

プローブDNAの固定化方法の好適な一例としては、特開平１１−１８７９００に開示されている方法が挙げられる。この公開特許公報により開示されている固定化方法は、ガラス基板上にマレイミド基を導入し、５’末端にチオール基を結合したプローブDNAを結合させる手法であり、この結合様式により、共有結合でプローブD N Aを固相担体であるガラス基板に固定化している。また、プローブごとに異なるエリアに固定化することで、プローブの識別を行なっている。

以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例で、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
（参考例１）
I．ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰのＰＣＲ
（１）プライマーの設計
検査対象の配列を有する検体のモデルとして、市販のＴａｋａｒａ社製ベクターｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ（全長３１６２ｂｐ）を選択し、その塩基配列中より、下記の配列を有するフォワードプライマーF1とリバースプライマーR1の計２種を設計した。なお、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの全塩基配列情報に関しては、Ｔａｋａｒａ社より提供されており、また、公開されているデータベース等からも入手可能である。

プライマーの設計にあたっては、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰの中の、所望の部分塩基配列がＰＣＲ増幅により特異的かつ効率的に増幅されるよう、配列、ＧＣ％、融解温度（Ｔｍ値）に充分配慮して設計を行った。なお、Tm値の計算条件は、Na+が５０ｍM、Mg²⁺が1.5mM、プライマー濃度が0.5μMとした。

設計した上記プライマーを用い、ｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰをテンプレートとしてＰＣＲ増幅することにより、１３２４ｂｐ（ＰＣＲ産物１）のＰＣＲ産物が増幅されることになる。

（２）プライマーの合成
参考例１の（１）で設計した２種のプライマーを合成した。各プライマーの合成は、それぞれの塩基配列を有するＤＮＡ鎖を定法に従ってＤＮＡ合成機で合成した。精製は、カートリッジ精製により行い、２種のプライマーを得た。得られたプライマーは、ＴＥバッファーにて１０μＭの濃度に希釈した。

（３）ＰＣＲ増幅反応
参考例１の（２）で合成した３種のプライマー、鋳型遺伝子ＤＮＡとするＴａｋａｒａ社製ベクターｐＵＣ１１８ＥｃｏＲＩ／ＢＡＰ、およびＱＩＡＧＥＮ社製ＰＣＲキットＨｏｔＳｔａｒＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘを用いて、ＰＣＲ増幅反応を行った。ＭａｓｔｅｒＭｉｘ中にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの４種のデオキシヌクレオチドが含まれているが、ＰＣＲ産物を蛍光標識により標識するため、アマシャムファルマシア社製のＣｙ３ｄＵＴＰを加えて、ＰＣＲ産物をＣｙ３により標識した。

ＰＣＲの反応条件は、下記のプロトコルによって、下記表２に示す組成の反応液の調製を行った。

調製された反応液について、市販のサーマルサイクラーを用いて、下記表３の温度サイクル・プロトコルに従って、ＰＣＲ増幅反応を行った。すなわち、９５℃／１５分の保持（酵素の活性化のため）の後、９２℃（変性）／１５秒、５５℃（アニーリング）／３０秒および７２℃（伸長）／６０秒を１サイクルとして２５サイクル、最後に７２℃／１０分保持した。

増幅反応終了後、ＰＣＲ増幅産物１は精製用カラム（Qiagen QI Aquick PCR Purification Kit）を用いて精製した。精製後、ＰＣＲ増幅産物溶液の液量は、５０μｌとなるよう調製した。得られた精製済ＰＣＲ増幅産物１溶液の一部を取り、定法に従って電気泳動を行い、目的のＰＣＲ産物が合成されていることを確認した。

II．ＤＮＡマイクロアレイの作製
（１）プローブの設計
上記、PCR産物１に対して、３種のプローブを設計した。設計はプライマーの設計と同様、各プローブが設計した部分塩基配列を特異的に認識できるように充分配慮して設計を行った。このプローブ設計においては、プローブとハイブリダイゼーションし、プローブとハイブリッド体を形成するのは、R1のプライマーから伸長したDNA鎖である。各プローブの配列はハイブリッド体の安定性に考慮し、塩基長を調整するなどして充分配慮して設計を行った。

設計されたプローブの塩基配列およびTm値を表４に示す。

ＰＣＲ産物１における検出対象鎖(R1からの伸長鎖)と各プローブとのハイブリッド体において、ハイブリッド部よりも５’側に存在するターゲット鎖の鎖長をＬ１とし、３’側に存在する鎖長をＬ２として、各ＰＣＲ産物に対する各プローブのＬ１、Ｌ２の値を表５に示す。

（２）プローブの合成及びDNAマイクロアレイの作製
プローブの合成およびDNAマイクロアレイの作製は、キヤノン社から開示されているDNAマイクロアレイの作製法に従って行なった。すなわち、基板プロセスに関しては、石英ガラスにシランカップリング剤処理及びEMCSを結合し、それにより表面にマレイミド基を導入した。またプローブ合成に関しては、５’末端にチオール基が導入されたプローブを合成しHPLC精製した。DNAマイクロアレイ作製にあたっては、バブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０キヤノン社製）の改造機を使用し、ガラス基板（サイズ（Ｗ×Ｌ×Ｔ）：２５ｍｍ×７５ｍｍ×１ｍｍ）の基板上に、各プローブが１６ずつスポットされたDNAマイクロアレイを作製した。

III．ハイブリダイゼーション反応
IIで作製したＤＮＡマイクロアレイと、サンプル核酸検体としてIで作製したＰＣＲ増幅産物１を用いて、マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションを行った。

（１）ＤＮＡマイクロアレイのブロッキング
ＢＳＡ（牛血清アルブミンＦｒａｃｔｉｏｎＶ：Ｓｉｇｍａ社製）を１重量％となるように、１００ｍＭＮａＣｌ／１０ｍＭリン酸バッファーに溶解し、この溶液にIIで作製したＤＮＡマイクロアレイを室温で２時間浸し、ガラス基板面のブロッキングを行った。ブロッキング終了後、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（ＮａＣｌ３００ｍＭ、ＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅ（ｔｒｉｓｏｄｉｕｍｃｉｔｒａｔｅｄｉｈｙｄｒａｔｅ，Ｃ₆Ｈ₅Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ）３０ｍＭ、ｐＨ７．０）で洗浄を行った後、純水でリンスした。その後、スピン・ドライ装置でＤＮＡマイクロアレイの水切りを行った。

（２）ハイブリダイゼーション溶液の調製
各ＰＣＲ産物は互いに等モルとなるよう調製したうえで、ＰＣＲ増幅産物溶液２マイクロリットルを用いて最終濃度が下記の構成となるよう、ハイブリダイゼーション溶液を調製した。

＜ハイブリダイゼーション溶液の組成＞
６×ＳＳＰＥ／１０％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ／ＰＣＲ増幅産物溶液（６×ＳＳＰＥ：ＮａＣｌ９００ｍＭ、ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ６０ｍＭ、ＥＤＴＡ６ｍＭ、ｐＨ７．４）
（３）ハイブリダイゼーション
水切りしたＤＮＡチップを、ハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットし、上記組成のハイブリダイゼーション溶液を用いて、下記手順および条件でハイブリダイゼーション反応を行った。

＜ハイブリダイゼーション条件・手順＞
上記ハイブリダイゼーション溶液を、６５℃に加温し３分間保持したあと、さらに９２℃で２分間、続いて５５℃で４時間保持した。そのあと、その後、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを用いて、２５℃で洗浄をした。さらに２×ＳＳＣを用いて２０℃で洗浄を行い、必要に応じて通常のマニュアルに従い純水でリンスして、最後にスピン・ドライ装置で水切りを行い乾燥させた。

（４）蛍光測定
ハイブリダイゼーション反応終了後、スピン・ドライ乾燥したＤＮＡチップについて、ＤＮＡマイクロアレイ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、Ｇｅｎｅｐｉｘ４０００Ｂ）を用いで、ハイブリッド体に由来する蛍光測定を行った。各プローブごとに測定した結果を下記の表７に示す。

輝度の算出にあたっては、ＤＮＡチップ上、プローブＤＮＡのスポットの無い部分において観測される蛍光強度をバックグランド値として、各スポットからの見掛けの蛍光強度より、バックグランド値を差し引いた値を、蛍光強度の実測値とした。また測定は２回実施し、その平均値を示す。

本実施例においては、ハイブリッド体の安定性が異なる検出対象領域に３つのプローブを設定したが、各プローブごとにＬ１とＬ２の比を考慮してプローブ配列を設計したため、ハイブリッド体の安定性が異なるにも関わらず、2423から4054のほぼ同じ桁数のレベルの蛍光輝度値が得られた。

（実施例１）
（１）プローブの設計
参考例１で合成したＰＣＲ産物１に対して、新たに１種のプローブを設計した。新たに設計したプローブは、参考例１のＰ１領域に相当する部分で、Ｆ１プライマーからの伸長鎖を検出するよう設定したプローブである。プローブの設計においては、設計した部分塩基配列を特異的に認識できるように充分配慮して設計を行った。設計したプローブの塩基配列およびTm値を表８に示す。

参考例１と同様Ｌ１とＬ２の比を表９に示す。

（２）ＤＮＡマイクロアレイ作製からハイブリダイゼーションまで
参考例１と同様、プローブ合成、チップ作製、同一のＰＣＲ産物１を用いてのハイブリダイゼーションまで行なった。ＤＮＡマイクロアレイにはＰ４のほかに参考例１で設計、使用したＰ３もスポッティングし、他は全て参考例１と同様に行なった。

（３）蛍光測定
参考例１と同様に蛍光輝度を測定した結果を下記表１０に示す。

本実施例においては、ハイブリッド体の安定性が異なる検出対象領域に２つのプローブを設定した。安定性の低い領域のプローブP4は相補鎖に対してプローブを設定したため、安定性が高くなり、P1に比べてTm値の低いプローブにもかかわらずP3とほぼ同じレベルの蛍光輝度値が得られた。

（比較例１）
（１）プローブの設計
参考例１で合成したＰＣＲ産物１に対して、新たに２種のプローブＰ５，Ｐ６を設計した。新たに設計したプローブは、参考例１のＰ１、Ｐ２領域に相当する部分で、Ｒ１プライマーからの伸長鎖を検出するよう設定したプローブである。２つのプローブはいずれもＰ３と同じ結合力(Ｔｍ値)を有するようにプローブを設計してある。設計したプローブの塩基配列およびTm値を表１１に示す。

参考例１と同様Ｌ１とＬ２の比を表１２に示す。

（２）ＤＮＡマイクロアレイ作製からハイブリダイゼーションまで
参考例１と同様、プローブ合成、チップ作製、同一のＰＣＲ産物１を用いてのハイブリダイゼーションまで行なった。ＤＮＡマイクロアレイにはＰ５、Ｐ６のほかに参考例１で設計、使用したＰ３もスポッティングし、他は全て参考例１と同様に行なった。

（３）蛍光測定
参考例１と同様に蛍光輝度を測定した結果を下記表１３に示す。

本実施例においては、ハイブリッド体の安定性が異なる検出対象領域に３つのプローブを設定した。安定性に配慮することなく、各プローブとも同一レベルの結合力（Ｔｍ値）とした。その結果、各プローブから得られる輝度値は、ハイブリッド体の安定性を反映し、同一の検体にも関わらず大きな差が生じた。

Claims

検出対象となる一本鎖核酸の増幅産物、およびその相補的な配列を有する一本鎖核酸の増幅産物の検出のためのプローブセットが、各プローブごとに固相上の識別可能な異なる領域に固定されているプローブ担体であって、
該プローブセットは検出対象となる各一本鎖核酸のそれぞれ少なくとも１つの異なる領域を検出するためのプローブを有しており、
前記検出対象となる各一本鎖と前記各プローブとがハイブリッド体を形成したときに、ハイブリッド体がそれぞれ有する一本鎖部分のうち検出対象鎖の５'末端を含む部分の塩基数をそれぞれＬ１、３'末端を含む部分の塩基数をそれぞれＬ２と表わすと、
各ハイブリッド体がそれぞれ
Ｌ２≧Ｌ１
の関係を満たすように各プローブが構成されていることを特徴とするプローブ担体。
前記プローブがＤＮＡである請求項１に記載のプローブ担体。
前記プローブがＰＮＡである請求項１に記載のプローブ担体。
前記プローブセットを構成する各プローブが、５'側の末端に導入された固定用部位を介して前記固相に固定されている、請求項１から３のいずれか１項に記載のプローブ担体。
前記プローブセットを構成する各プローブが、３'側の末端に導入された固定用部位を介して前記固相に固定されている、請求項１から３のいずれか１項に記載のプローブ担体。
該プローブ担体が平面状のマイクロアレイである請求項４〜５のいずれかに記載のプローブ担体。
請求項１から６のいずれか１項に記載のプローブ担体に、検出対象となる一本鎖核酸及びその相補鎖を反応させて、該プローブ担体に固定されたプローブの上に形成された二本鎖のハイブリッド体を検出する工程を有する核酸の検出方法。
請求項１から６のいずれか１項に記載のプローブ担体を用いて標的一本鎖核酸を検出する検出方法であって、
前記標的一本鎖核酸とその相補的な配列を有する相補一本鎖核酸とを含む試料を前記プローブ担体と反応させる
ことを特徴とする検出方法。