KR20080055799A - 효소학적 오일 에스테르 교환반응 - Google Patents

효소학적 오일 에스테르 교환반응 Download PDF

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Abstract

본 발명은 염기로 연속적 또는 동시적 처리에 의한 킬레이트제를 함유하는 오일의 효소학적 리파제 에스테르 교환반응 공정에 관한 것이다.
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에스테르 교환, 염기, 리파제, 킬레이트제.

Description

효소학적 오일 에스테르 교환반응{ENZYMATIC OIL INTERESTERIFICATION}
본 발명은 하나 이상의 금속 킬레이트제를 함유하는 오일의 효소학적 에스테르 교환반응의 개선된 공정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 리파제 에스테르 교환반응 공정에 적합한 효소 조성물에도 관련된다.
식물 또는 동물 기원의 오일에 있어서 금속의 존재는 이들 오일의 안정성을 해치는 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 오일은 종종 이러한 금속을 제거하기 위해 시트르산 또는 인산과 같은 금속 킬레이트제로 처리한다.
주어진 용도를 위한 꼭 맞는 물리적 및 화학적 성질을 나타내기 위해 종종 식물성 또는 동물성 오일 및 지방이 배합물로서 사용된다. 더 나아가서, 오일 또는 오일들의 배합물은 알맞는 성질(예를 들면, 융점 프로파일, 식감 등)을 얻기 위해 더 처리되어야 한다. 융점 프로파일은 종종 화학적으로 아니면 효소학적으로 글리세롤 골격에 대한 지방산을 재배치 또는 재분포함으로써 조절된다. 이 공정은 종종 "에스테르 교환반응"이라고도 한다. 효소학적 에스테르 교환반응은 리파제를 사용하여 수행된다.
오일에 금속 킬레이트제를 첨가하는 단점은 리파제 에스테르 교환반응 성능에 대한 부정적인 효과를 갖는다는 것이다.
발명의 개요
본 발명의 목적은 하나 이상의 금속 킬레이트제를 함유하는 오일의 효소학적 에스테르 교환반응을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 금속 킬레이트제를 함유하는 오일의 에스테르 교환반응은 i) 오일을 염기와 접촉시키고 ii) 오일을 리파제와 반응시킴으로써 행해진다.
본 발명은 또한 리파제와 염기를 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다. 최종적으로 본발명은 하나 이상의 킬레이트제를 함유하는 오일의 에스테르 교환반응을 위한 염기의 사용에 관련된다.
도 1은 염기를 첨가한 것과 첨가하지 않은 것의 에스테르 교환반응의 전과 후에 시트르산을 함유하는 대두유 배합물의 40℃에서의 고체 지방 함량(SFC)을 나타낸다.
도 2는 속도 상수(1/hr) 대 고정화된 리파제 A (배치(batch) LA350005)에 대해 생산된 오일의 양을 나타낸다. 사전처리: 오일을 탄산나트륨으로 사전처리하는 공정으로부터의 데이터. 동시: 오일을 탄산나트륨으로 처리하고 동시에 에스테르 교환반응시키는 공정으로부터의 데이터. 기준 (대조군): 사전처리 없이 오일의 에스테르 교환반응으로부터의 데이터.
식물성 및 동물성 오일 및 지방의 주성분은 트리아실글리세롤로서, 트리글리세리드라고도 한다. 트리글리세리드는 글리세롤 골격에 에스테르화된 세개의 지방산 잔기들로 구성된다. 부분적인 글리세리드도 또한 자연 구성성분으로서 존재할 수도 있다. 그것들은 글리세롤 골격에서 하나 또는 두개의 지방산 잔기의 가수분해에 의해 형성될 수도 있다. 식물성 및 동물성 오일 및 지방은 종종 그것들을 식품 성분으로서 적합하게 만들기 위해 약간의 변형을 필요로 한다.
용융 프로파일은 종종 지방에 주어진 용도에 알맞는 물리적 성질을 주기 위해 조절되는 것이 필요하다. 원하는 용융 프로파일은 원하는 용도에 의존한다. 꼭 맞는 용융 프로파일은 종종 다른 원료 및 변형의 조합에 의해 얻어진다. 식물성 오일은 전형적으로 40℃에서 약 10-30%의 고체 지방 함량(solid fat content: SFC)을 갖는다. "SFC"는 주어진 온도에서 결정성 형태로 존재하는 지방 또는 오일의 백분율로서 정의된다. 식품 성분으로서 적합하기 위해서 오일을 1 내지 10% 범위의 40℃에서의 SFC를 갖도록 변형시키는 것이 일반적으로 요망된다. 마가린과 같은 제품을 위해, 원하는 SFC는 약 2-4%에 놓인다. 그러나, 예를 들면 초콜렛과 같은 다른 식품을 위해서는, 다른 SFC 프로파일이 바람직하다.
변형 공정은 다른 오일들과 배합하고, 수소첨가하고, 분별 및 에스테르 교환반응하는 것을 포함한다. 에스테르 교환반응은 글리세롤 골격에서 지방산 잔기를 재배치하여 트리글리세리드 조성이 변화되도록 한다. 부분적인 글리세리드도 또한 에스테르 교환반응의 동안에 형성될 수 있으나, 보통은 요망되지 않는다. 보통 형성된 부분적인 글리세리드의 양은 작다.
금속 이온은 그것들이 품질에 부정적으로 영향을 미치기 때문에 오일로부터 주의깊게 제거되어야 한다. 미량의 Fe, Cu 및 Mn이라도 사전 산화력이 있다. 오일로부터 금속 이온을 고립시키기 위해, 하나 이상의 킬레이트제를 첨가한다. 바람직하게는 시트르산 및/또는 인산과 같은 금속 킬레이트제가 오일에 첨가된다. 고립시킨 후 킬레이트제는 1-100 ppm, 전형적으로 10-90 ppm, 예를 들어서 약 50 ppm의 농도로 오일에 용해되어 남아 있다. 식용유는 최종 제품의 소비자에게 허용되는 금속 킬레이트제로 처리된다. 바람직한 구체예에서, 금속 킬레이트제는 산, 바람직하게는 시트르산 및/또는 인산이다. 본 발명에 따르면, 에스테르 교환반응은 금속 이온을 제거하기 위해 킬레이트제에 종속된 오일에 대한 리파제를 사용하여 효소학적으로 수행된다.
오일을 킬레이트제에 종속시키는 주 단점은 소량이라도 오일에 남아 있는 킬레이트제는 리파제의 에스테르 교환반응 성능에 부정적인 영향을 준다는 것이다. 예를 들면, 본 발명자들은 50 ppm 시트르산을 함유하는 대두유에 대한 고정화된 서모미세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa) 리파제의 에스테르 교환반응 성능은 시트르산 없는 오일보다 65% 만큼 더 낮다.
따라서, 해결할 문제는 하나 이상의 금속 킬레이트제를 포함하는 오일의 효소학적 리파제 에스테르 교환반응을 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다. 개선은 효소 조성물의 증가된 생산성 및/또는 증가된 평균 공간 시간 수율을 포함한다.
본 발명자들은 놀랍게도 염기를 오일에 첨가하는 것이 리파제 성능에 상당한 긍정적인 영향을 준다는 것을 발견하였다. 이것은 이하 실시예 1에서 예시되어 있다. 본 발명의 방법은 유효량의 염기가 도입되는 것을 제외하고는 종래의 리파제 에스테르 교환반응 공정으로서 수행될 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 에스테르 교환반응 공정은 50℃ 내지 100℃의 온도에서 수행될 수도 있고, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃, 특히 65℃ 내지 80℃의 온도에서 수행될 수도 있다.
따라서, 제 1 관점에서 본 발명은 하나 이상의 금속 킬레이트제를 함유하는 오일을 에스테르 교환반응하는 공정에 관한 것이며, 다음 단계들을 포함한다:
i) 상기 오일을 염기와 접촉시키는 단계,
ii) 오일을 리파제와 반응시키는 단계.
본 발명에 따르면, 단계 i) 및 ii)는 연속해서 또는 동시에 수행될 수 있다. 연속 처리는 오일을 리파제를 첨가하기 전에 염기로 사전처리하는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 염기와 리파제의 일부, 예를 들면, 30-70%와 같은 10-90%를 초기에 오일에 첨가한 다음 일정 기간 후에 리파제의 나머지, 예를 들면, 70-30%와 같은 90-10%를 첨가하는 것도 또한 생각된다.
동시적인 처리는 오일과 염기를 동시에 처리하는 것을 의미한다. 단계 1) 및 2)를 동시에 수행한다면, 염기와 리파제, 바람직하게는 고정화된 리파제를 포함하는 본 발명의 조성물을 오일에 첨가함으로써 행해질 수도 있다. 동시적인 공정과 연속적인 공정을 실시예 2에 예시한다.
바람직한 구체예에서, 염기는 리파제 전에 따라서 에스테르 교환반응 전에 오일에 첨가된다. 염기는 어떤 수단을 사용하여도 오일에 첨가될 수 있다. 한 구체예에서, 염기는 고전단 내지 저전단 믹서를 사용하여 오일에 포함시킨다. 그러나, 혼합의 다른 수단도 생각된다. 염기를 오일에 포함시킨 후, 리파제를 도입할 수도 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서 염기는 리파제와 동시에 오일에 첨가된다. 염기와 리파제는 상기한 바와 같이 믹서를 사용하는 것과 같은 어떤 적합한 방법으로도 오일에 포함시킬 수 있다. 이하에서 더 논의하게 되는 바와 같이, 염기는 또한 예를 들면, 리파제, 바람직하게는 고정화된 리파제와 염기의 물리적 믹스의 형태로 또는 염기가 포함된 고정화된 리파제로서 효소 조성물에 유리하게 포함될 수도 있다.
제 3의 바람직한 구체예에서, 오일은 별도의 공정 단계에서 염기로 처리되고 염기는 오일로부터 제거된 후 오일과 효소를 접촉시킨다.
제 4의 바람직한 구체예에서, 염기는 컬럼에 패킹된다. 오일은 컬럼 내부의 염기의 패킹된 층을 통과시킴으로써 염기와 접촉된다. 이런 식으로 염기 처리는 예를 들면, 리파제를 지지하는 직렬의 하나 이상의 패킹된 층 반응기들로 작동되는 전형적인 연속식 효소학적 에스테르 교환반응 설비에서 쉽게 실행될 수 있다.
어떤 이론에도 제한됨이 없이, 금속 킬레이트제를 함유하는 오일의 에스테르 교환반응의 동안에 리파제 성능의 손실에 대한 이유는 효소의 활성 부위 둘레의 국소 환경에서 금속 킬레이드제, 예를 들면, 시트르산은 리파제, 예를 들면 서모미세스 라누기노사(Thermomyces lanuginose) 리파제에 대해 바람직하지 않은 방식으로 전하에 영향을 미칠 수도 있다. 따라서, 오일에 염기가 존재하는 것은 산, 예를 들면 시트르산의 전하를 변화시켜, 리파제에 불리하게 영향을 미치지 않을 것이며, 이로써 리파제 성능을 개선시키도록 한다.
식용유:
어떤 식용유도 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 오일은 미정제, 정제된 것, 표백 및 냄새제거된 것 또는 이들의 조합과 같은 어떤 품질의 것도 될 수 있다.
예를 들면, 정제 오일은 60-90℃의 온도에서 10-30 분간 0.05-0.1% 인산으로 처리하여 고무질을 제거함으로써 제조될 수 있다. 표백 오일은 0.05-0.1% 인산으로 고무질 제거하고, 이어서 105-110℃의 온도에서 15-30 분간 1%의 표백토로 표백하고 여과하여 표백토를 제거함으로써 제조될 수 있다. 활성화된 표백토는 황산 또는 염산으로 처리될 수 있다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 오일 배합물은 대두유에 배합된 예를 들면, 27%의, 충분히 수소첨가된 대두유("대두 플레이크")이다.
바람직한 구체예에서, 오일은 식물성 오일이다. 식물성 오일의 예들은 카놀라유(평지씨), 대두유, 면실유, 야자유, 야자 스테아린, 야자 올레인, 야자핵유, 코코넛유, 옥수수유 및 해바라기유로 구성되는 군으로부터 선택된 오일을 포함한다.
오일 배합물도 본 발명에 따라 생각된다. 예를 들면, 오일 배합물은 한가지 이상의 충분히 그리고 또한 부분적으로 경화된 오일을 함유할 수도 있다.
한 구체예에서, 배합물은 10:90 내지 50:50, 바람직하게는 25:75 내지 30:70의 중량 기준 배합비의 대두유 중의 충분히 또는 부분적으로 경화된 대두유 및/또는 면실유이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 오일 배합물은 야자 스테아린 및 코코넛유의 혼합물이고, 이때 코코넛유는 정제된 것이거나 아니면 정제되고 표백된 것이다.
한가지 구체예에서, 에스테르 교환반응시키는 오일은 평이한 야자 올레인인데, 에스테르 교환반응시킬 때 (연화되는 대신에) 더 경화된다.
리파제
본 발명의 공정에서 사용된 및/또는 조성물에 함유된 리파제는 미생물, 바람직하게는 사상 진균, 효모, 또는 세균으로부터 얻어질 수 있다. 한 구체예에서, 리파제는 이하에 더 기술하는 바와 같이 고정화된 생성물로서 조제될 수도 있다.
본 발명의 목적을 위해, 특정 미생물원과 연관하여 여기서 사용된 "로부터 얻어진"이라는 용어는 효소 및 결과적으로 이 효소를 암호화하는 DNA 서열이 특정 공급원에 의해 제조된다는 것을 의미한다. 다음에 효소는 당업자로 하여금 효소를 포함하는 샘플을 얻을 수 있게 하고 본 발명 방법에서 사용될 수 있는 표준 공지 방법에 의해 상기 특정 공급원으로부터 얻어진다. 상기 표준 방법은 상기 특정 공급원으로부터 직접 정제 또는 같은 공급원에서든지 (상동 재조합 발현) 아니면 다른 공급원에서(이종 재조합 발현) 효소를 암호화하는 DNA 서열의 클로닝과 이어서 재조합 발현일 수 있다.
리파제는 어떤 글리세리드 위치로부터 또는 그것에 어떤 지방산기를 방출 또는 결합할 수 있는 비특이적 리파제일 수 있다. 이러한 리파제는 칸디다 실린드라세(Candida cylindracae), 코리네박테리움 아크네스(Corynebacterium acnes) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)로부터 얻어졌다(Macrae, J.A.O.C.S., 1983, 60:243A-246A; 미국 특허 No. 5,128,251). 리파제는 또한 특정 글리세리드로 또는 그것으로부터 특이적 지방산 기를 단지 부가 또는 제거하는 형태의 것일 수 있다. 이러한 리파제는 특정 글리세리드를 생성하거나 또는 변형시키는데 유용하다. 이러한 리파제는 게오트리첨 칸디디움(Geotrichum candidium) 및 리조푸스(Rhizopus), 아스페르길루스(Aspergillus), 및 뮤코(Mucor) 속들로부터 얻어졌다(Macrae, 1983; 미국 특허 No. 5,128,251). 리파제는 또한 1,3 특이적 리파제일 수도 있다. 이러한 리파제는 서모미세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger), 무코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 리조푸스 델레마르(Rhizopus delemar), 및 리조푸스 아리주스(Rhizopus arrhizus)로부터 얻어졌다(Macrae, 1983).
본 발명 방법에서 사용된 바람직한 리파제는 서모미세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa) 종의 균주, 바람직하게는 EP 특허 No. 305,216-B1에 개시된 것과 같은 서모미세스 속, 또는 푸자륨 쿨모룸(Fusarium culmorum ), 푸자륨 헤테로스포룸(F. heterosporum), 푸자륨 솔라니(F. solani), 또는 푸자륨 옥시스포룸(F. oxysporum) 종의 균주와 같은 푸자룸 속 내의 사상 진균 종으로부터 얻어진다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 리파제는 칸디다(Candida), 바람직하게는 칸디다 안탁티카(Candida antactica) 종과 같은 효모로부터 얻어진다. 상세히는 칸디다 안탁티카(Candida antactica)로부터의 리파제 B (CalB)가 생각된다.
고정화된 리파제
고정화된 리파제와 같은 고체 형태의 리파제가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 리파제를 고정하는 여러가지 방법들이 본 분야에 잘 공지되어 있다. 리파제 고정화의 개괄은 "Journal of American Oil Chemist's Society", Vol.67, pp. 890-910 (1990)에서 발견되며, 여기서 규조토, 실리카, 다공질 유리, 등과 같은 무기 캐리어; 여러가지 합성 수지 및 합성 수지 이온 교환장치; 그리고 이온교환 기들이 도입된 셀룰로스 및 가교된 덱스트린과 같은 천연 다당류 캐리어를 포함하는 대표적인 리파제 고정화 캐리어의 예들이 예시되어 있다.
적합한 캐리어 물질은 폴리프로필렌, 예를 들면, ACCUREL™(Accordis Membranes GmbH), 및 실리카 또는 그의 혼합물을 포함한다. 적합한 고정화 기술은 EP 140,542, 미국 특허 No. 4,818,695, 미국 특허 No. 5,128,251, 미국 특허 No. 5,508,185 및 미국 특허 No. 6,156,548 (이 문헌들은 모두 여기에 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
바람직한 고정화된 후미콜라 라누기노스(Humicola lanuginose) 리파제(Thermomyces lanuginosa 리파제와 같음)는 미국 특허 No. 5,776,741 (이것은 여기에 참고로 포함된다)에 기재되어 있다. 또 다른 바람직한 리파제는 미국 특허 No. 5,776,741에 기술된 고정화 공정을 사용하여 고정화된 칸디다 안탁티카(Candida antactica) 리파제 B (CalB)이다(예를 들면, Uppeberg et al., 1994, Structure 2:293-308 참조).
마지막으로, 시중에서 이용가능한 고정화된 리파제의 예들은 상표명 LIPOZYME TL IM™, LIPOZYME RM IM™(덴마크의 Novozymes사로부터 이용가능함)하에 판매되는 것들을 포함한다.
염기
어떤 염기도 본 발명 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서 염기는 "약 염기"이다. "약 염기"는 본 발명의 내용에서, 1몰의 수준으로 물에 용해/분산된다면 8 내지 13의 pH를 제공하게 되는 염기, 바람직하게는 10 내지 12의 pH와 같은, 약 11의 pH를 제공하게 되는 염기 또는 문제의 리파제의 pH 최적치 근처의 +/- 1의 pH 범위에 해당하는 염기로서 정의된다.
염기는 수산화리튬(LiOH), 수산화나트륨(NaOH), 수산화칼륨(KOH), 수산화루비듐(RbOH), 수산화세슘(CsOH), 수산화칼슘(Ca(OH)2), 수산화스트론튬(Sr(OH)2), 수산화바륨(Ba(OH)2)을 포함하는 강염기일 수도 있다.
염기는 바람직하게는 아민 또는 탄산염과 같은 염기이다. 약 염기의 예들은 암모니아(NH3), 알라닌(C3H5O2NH2), 디메틸아민((CH3)2NH), 에틸아민(C2H5NH2), 글리신 (C2H3O2NH2), 히드라진(N2H4), 메틸아민(CH3NH2), 트리메틸아민((CH3)3N) 및 탄산나트륨(Na2CO3), 탄산수소나트륨(NaHCO3), 아질산나트륨(NaNO2), 아세트산나트륨(CH3COONa)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 염기는 탄산나트륨 (Na2CO3)이다. 바람직한 구체예에서, 염기는 효소 그램당 0.01 내지 100 밀리몰, 더 구체적으로는 효소 그램당 0.1 내지 60 밀리몰 염기의 양으로 사용된다.
한 구체예에서, 염기는 오일 킬로그램당 0.001 내지 100 밀리몰, 바람직하게는 오일 킬로그램당 0.01 내지 10 밀리몰, 특히 오일 킬로그램당 0.1-1 밀리몰의 양으로 사용된다.
효소 조성물
이 관점에서, 본 발명은 리파제와 염기를 포함하는 효소 조성물에 관련된다. 염기는 상기 "염기" 섹션에서 열거되고 및/또는 정의된 것들 중 어떤 것일 수 있다. 효소 조성물은 킬레이트제를 함유하는 오일에 직접 첨가될 수도 있다. 본 발명의 효소 조성물은 단지 리파제만을 포함하는 효소 조성물보다 킬레이트제를 포함하는 오일의 에스테르 교환반응의 동안에 리파제를 위한 더 최적의 조건을 제공한다.
본 발명의 조성물은 오일의 에스테르 교환반응 공정에서의 용도에 적합한 어떤 식으로도 조제될 수 있다. 조성물은 고정화된 생성물로서 조제될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 리파제와 염기를 포함하는 과립이다. 본 발명의 효소 조성물은 고정화된 리파제와 염기의 믹스일 수도 있고 염기를 포함한 고정화된 리파제일 수도 있다.
리파제는 상기 "리파제" 섹션에서 기술된 것들과 같은 어떤 리파제도 될 수 있다. 바람직한 구체예에서 리파제는 서모미세스 라누기노사(Thermomyces lanuginose)로부터 유도될 수도 있고 또는 칸디다 안탁티카(Candida antactica)로부터 유도된 리파제 B (CalB)일 수도 있다. 바람직한 구체예에서 효소 조성물은 고정화된 서모미세스 라누기노사(Thermomyces lanuginose ) 리파제 또는 칸디다 안탁티카(Candida antactica) 리파제 B와 염기, 바람직하게는 약 염기, 특히 탄산나트륨을 포함하는 과립이다.
염기의 사용
본 발명은 또한 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는 오일의 리파제 에스테르 교환반응 공정에서 염기의 사용에 관련된다. 염기를 이러한 에스테르 교환반응 공정에서 사용할 때 생산성은 실시예 3에서 예시한 바와 같이 증가된다. 염기와 리파제 각각은 "염기" 및 "리파제" 섹션에서 상기 언급한 것들 중 어떤 것도 될 수 있다.
재료 및 방법
재료:
효소:
고정화된 리파제 A: 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa)/서모미세스 라누기노사(Thermomyces lanuginosa)로부터 유도된 고정화된 리파제는 EP 특허 No. 305,216-B1에 개시된 것과 같이 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae)에서 재조합 생산되고 개시되었다. 고정화 방법은 미국 특허 No. 5,776,741에 기술되어있다.
Na2CO3 : Sigma chemical Company, 분석용 등급 (실시예 2)
Na2CO3: 무수 탄산나트륨, NF/EP Fine Granular, Jost Chemical사제 (실시예 3)
오일:
- 충분히 수소첨가된 대두유: ("대두 플레이크" Bunge Foods사제, 로트 345M4-T106R3) (실시예 1)
- 대두유: "Master Chef Salad Oil" C&T Refinery사제, 노스캐롤라이나 샤롯데 소재 Lot L3C27 1337 (실시예 1)
- 충분히 수소첨가된 대두유 및 대두유의 배합물 (배합비 27:73 (w/w)). 액체 대두유는 노르웨이 Denofa 사로부터의 "라피너트 소야올제(raffinert soyaolje)"이다. 이 오일은 RBD 오일인데, 이것은 시트르산을 함유하는 것으로 알려져 있다. 충분히 수소첨가된 대두 플레이크는 미국 Loders Croklaan 사로부터 구입된다. 플레이크의 시트르산 함량에 대한 정보는 입수되지 않는다. (실시예 2)
- 정제된 배합된 야자 스테아린 및 코코넛유 (실시예 3)
- 표백된 배합된 야자 스테아린 및 코코넛유 (실시예 3)
방법:
고체 지방 함량( S olid F at C ontent : SFC )의 측정
고체 지방 함량의 측정을 위해 사용된 방법은 AOCS Official Method Cd 16b-93 "저분해능 핵자기 공명에 의한 고체 지방 함량(SFC)"에 기초한다.
단위의 정의: 고체 지방 함량은 %로서 정의된다.
장치: 오븐, 100℃에서 유지됨
0℃에서 설정된 냉욕
일정 온도 수욕(10℃ 내지 60℃ +/- 0.1℃)
금속 블록(알루미늄), SFC 관을 위한 구멍을 가짐
SFC 관
NMR 분광계, Minispec mq-시리즈 2001, Bruker Optics Inc, 미국 텍사스.
스톱워치
SFC 과정은 다음과 같다:
단계 작업
1 지방 배합물을 100℃에서 30분간 (또는 전자파) 용융시킨다
2 지방 배합물(~ 3 ml)을 NMR 관(두 세트의 관들)에 옮긴다
3 관들을 100℃에서 ~5 분 둔다(겉보기는 관에서 고체)
4 NMR 관들을 60℃에서 5 내지 15 분간 수욕으로 옮긴다.
5 NMR 관들을 0℃에서 60 +/- 1분간 냉욕으로 옮긴다.
6 NMR 관들을 이어서 선택된 온도에서 30분간 수욕에 두는데, 예를 들면, 전형적으로 실행온도는 10℃, 21.1℃, 33.3℃, 및 40℃이다.
7 NMR 관들은 하나씩 NMR 분광계의 공동에 옮기고 가능한 한 신속하게 측정한다. NMR 분광계에서 자석은 40℃에서 항온 유지한다.
NMR 기기의 검정을 위한 미네랄 오일 샘플들은 Bruker Optics Inc(미국 텍사스)에 의해 공급 받는다.
계산: 결과는 예를 들면 "23.24% SFC"의 백분율로서 주어질 것이다.
기준: AOCS Official Method Cd 16b-93 "저분해능 핵자기 공명에 의한 고체 지방 함량(SFC)" QMS 2003-22839
다수 배치 분석
이 방법은 다수 배치 반응에서 에스테르 교환반응을 위한 고정화된 리파제의 성능을 결정하기 위해 사용된다.
원리: 오일 배합물을 촉매로서 고정화된 리파제를 사용하여 배치 반응으로 에스테르 교환반응시킨다. 각 배치 반응의 끝에, 오일을 반응기에 남아 있는 촉매로부터 따라낸다. 다음에, 신선한 오일을 촉매에 첨가하고 또 다른 배치 반응을 수행한다. 효소의 평균 반응 속도는 각 배치 반응으로부터 결정된다.
효소의 재사용으로 수많은 연속 배치 반응들에서 효소의 평균 반응 속도에 기초하여, 효소와 접촉한 오일 부피의 함수로서 효소 불활성화 속도를 추정하는 것이 가능하다.
고체 지방 함량(SFC)은 에스테르 교환반응으로 인한 지방 성질에 대한 변화를 정량하기 위해 사용된다.
결과: 전형적으로 실험은 다음을 위해 사용된다:
* 고체 지방 함량이나 평균 반응 속도 상수를 배치 수 또는 고정화된 효소의 질량 당 오일의 생산된 양에 대해 도시한 것을 봄으로써 두가지 이상의 고정화된 효소의 성능을 직접 나란히 비교하는 것.
* 이하에 기술된 모델에 따라 일정한 변환율에서 주어진 생산성에 대해 평균 생산 속도를 추정하는 것. 결과의 단위는 시간당 고정화된 효소의 질량당 에스테르 교환반응된 오일의 질량이다.
배치 반응기 주입 링과 나사 마개를 갖는 Duran Square 병. 용량 250 ml.
궤도 진탕기를 갖는 오븐 70℃+/-2℃에서 일정한 온도를 유지할 수 있고 궤도 진탕기를 장치할 수 있는 오븐. 진탕 직경: 25 mm 진탕 속력: 300 rpm
더욱 상세한 내용은 덴마크의 Novozymes A/S에 요청시 구할 수 있는 Novozymes' Standard Method (346-SM-0010.01)참조.
실시예 1
킬레이트제를 함유하는 오일에서 리파제 에스테르 교환반응 성능에 대한 염기의 영향
이 실험은 시트르산을 함유하는 오일에 염기(Na2CO3)를 첨가하는 효과를 조사하기 위해 수행하였다.
시트르산과의 오일 배합물의 제조
실험을 시판 대두유("Master Chef Salad Oil" C&T Refinery사제, 노스캐롤라이나 샤롯데 소재 Lot L3C27 1337)에 배합된 27% 충분히 수소첨가된 대두유("대두 플레이크" Bunge Foods사제, 로트 345M4-T106R3)를 사용하여 수행하였다.
오일 배합물의 제조: 73 그램의 충분히 수소첨가된 대두유를 70-80℃로 가열 하고 27 그램의 대두 플레이크를 가한다. 모든 고형물이 용융될 때까지 혼합하고 가열한다. 시트르산 (10-30 ppm)을 첨가하고 약 30분간 교반한다. 플라스틱 병에 채우고 사용할 때까지 냉동기에 보관한다.
오일 배합물의 에스테르 교환반응
0.5 그램 탄산나트륨("탄산나트륨, 무수, 분석 시약, 과립" Mallincrodt 카탈로그 번호 7525)을 0.5 고정화된 리파제 A와 함께 110 그램 오일 배합물에 부었다. 염기 및 효소를 중력에 의해 가라앉도록 하였다. 오일 배합물을 약 22 내지 23 시간 동안 200 rpm (25 mm 궤도)에서 궤도 배양기에서 진탕하였다. 에스테르 교환반응을 70℃에서 실행하고 염기의 첨가없이 제조된 오일 배합물에 대해 반복하였다.
염기를 가진 것과 염기를 가지지 않은 에스테르 교환반응된 오일 배합물의 SFC 측정
100 g 오일 배합물을 모든 효소 및 염기가 병에 보유되도록 주의를 기울이면서 병에서 따라내었다. 오일의 SFC는 앞서 기술한 SFC 방법을 사용하여 측정하였다. SFC는 40℃에서 측정하였다. 100 g 신선한 오일 배합물을 효소 및 염기를 함유하는 병에 첨가하고 에스테르 교환반응을 반복하였다. 오일을 매 22-23 시간 마다 교체하면서 같은 효소 및 염기를 사용하여, 전체적으로 에스테르 교환반응을 2주의 기간에 걸쳐 9회 반복하였다. 첨가된 오일 및 따라낸 오일의 모든 질량을 기록하였다.
실험 데이터를 도 1에 나타내었다. 각 배치 반응 후의 오일의 고체 지방 함 량을 효소와 접촉한 오일의 양에 대해 도시하였다. 오일의 고체 지방 함량은 에스테르 교환반응으로 인해 저하된다. 이와 같이 같은 반응 조건에서 얻어진 SFC가 낮을수록, 효소 활성은 더 높다. 도 1로부터 염기(탄산나트륨)의 존재는 리파제의 에스테르 교환반응 성능을 상당히 개선시키는 것을 알 수 있다.
실시예 2
탄산나트륨으로 오일의 사전처리에 의한 고정화된 리파제의 향상된 성능
고정화된 리파제 A의 성능은 다수의 배치 실험에서 에스테르 교환반응에 의해 시험하였다. 충분히 수소첨가된 대두유와 대두유의 배합물(배합비 27:73 (w/w))를 사용하였다.
다수 배치 반응에서, 효소를 일련의 배치 반응들에서 재사용하였다. 단일 배치 반응은 본질적으로 일정한 오일 대 효소 비, 일정한 반응시간 및 70℃의 일정한 온도로 수행된다. 에스테르 교환반응의 수준은 40℃에서 지방의 고체 지방 함량(SFC)을 측정함으로써 정량한다.
배치 반응기는 250 ml 정사각 형상의 병이다. 반응의 동안에 병은 궤도 진탕기에서 계속해서 진탕한다. 궤도 직경은 1 인치이고 진탕기는 200 rpm에서 선회한다.
고정화된 리파제 A (배치 LA350005) 및 탄산나트륨(Na2CO3)의 배치를 1) 에스테르 교환반응에 앞서 오일의 Na2CO3 사전처리, 즉, 연속 처리, 그리고 2) 에스테르 교환반응의 동안에 오일의 Na2CO3 처리, 즉 동시 처리에 의해 시험하였다. 고정 화된 리파제 A로 한, 기준 에스테르 교환반응 실험을 같은 오일 배합물을 사용하나 오일의 사전처리 없이 수행하였다. 사전처리와 효소의, 세가지 조합을 시험하였다.
사전처리
오일의 사전처리를 다음의 과정에 따라 수행하였다. 미처리된 오일로 채워진 밀봉된 용기를 70℃에서의 가열 캐비넷에 밤새 두었다.
그 다음 오일을 1 리터 병에 붓고 1 % (w/w)의 탄산나트륨을 첨가하였다. 병을 질소로 정화하고 단단히 밀폐하였다. 오일과 탄산나트륨의 병을 밤새 수욕에 두었다. 오일과 탄산나트륨을 자기 교반 막대를 사용하여 일정하게 혼합하였다. 다음날 교반을 중지하고 탄산나트륨이 가라앉게 하였다. 다수 배치 실험을 위해 사전처리 화학물질이 병에 남아있도록 주의하면서 이 플라스크로부터 직접 오일을 따라내었다.
동시 처리
동시 처리를 위해, 효소와 탄산나트륨을 직접 반응 병에 칭량하였다. 1 그램의 탄산나트륨과 0.5 그램의 고정화된 리파제 A를 병에 첨가하였다. 고체 사전처리 성분이 전체 실험을 통해 병에 남았다.
100 그램 오일을 0.5 그램 리파제 A와 접촉시켰다.
활성 계산
리파제 A의 에스테르 교환반응에 대한 속도론은 농도 파라미터로서 고체 지 방 함량을 갖는 1차 가역 반응 모델을 사용하여 모델을 만들었다.
Figure 112008013548913-PCT00001
상기 식에서 k는 속도 상수이고,
SFCin 은 반응기에 들어가는 오일의 고체 지방 함량이고,
SFCout 은 반응기를 떠나는 오일의 고체 지방 함량이고,
SFCeq 은 반응 평형에서 오일의 고체 지방 함량이고,
w 는 촉매-고정화된 리파제 A이고,
Mb 는 반응기에서 오일의 질량이고,
tb 는 배치 반응기에서의 반응시간이다.
지수 모델을 사용하여 속도 상수를 생산성의 함수로서 기술할 수 있다.
Figure 112008013548913-PCT00002
상기 식에서 kmodel 은 속도 상수 모델이고,
k0 는 신선한 효소에 대한 속도 상수이고,
V½은 효소의, 부피에 기초한 반감기, 즉 kmodel 을 50% 감소시키는데 필요한 효소의 양당 오일의 양이고,
V 는 반응기를 통과한 효소의 양당 오일의 양이다.
도 2에서 속도 상수는 각 처리에 대한 고정화된 리파제 A의 양당 에스테르 교환된 오일의 양에 대해 도시되어 있다.
도 2로부터 효소는 에스테르 교환반응의 동안에 탄산나트륨으로 사전처리 또는 처리된 오일에서 상당히 더 높은 활성을 유지하는 것을 알 수 있다.
상기 (2)에서 주어진 불활성화 모델을 도 2에 나타낸 데이터에 맞춤으로써, 신선한 효소에 대한 속도 상수와 부피에 기초한 반감기가 결정된다. 이들 숫자는 이하 표 1에 열거된다.
샘플 확인 V½ [kg/kg] k0 [분-1]
화합물 순서
Na2CO3 사전처리 596 0.293
Na2CO3 사전처리 594 0.301
Na2CO3 사전처리 626 0.289
Na2CO3 동시 722 0.247
Na2CO3 동시 788 0.235
없음 기준 504 0.215
없음 기준 418 0.237
없음 기준 414 0.250
표 1 모델 파라미터 - Lipozyme TL IM, 배치 LA350005.
k0 는 신선한 효소에 대한 속도 상수이고 V½은 부피에 기초한 반감기이다.
불활성화 모델에 대해 결정된 파라미터들은 그것이 주로, 탄산나트륨 처리에 의한 증가인 부피에 기초한 반감기로 표시된 오일 내 효소의 안정성이라는 것을 가리킨다. 부피에 기초한 반감기는 탄산나트륨 처리에 의해 30-70% 증가된다.
실시예 3
오일 효소 조합의 MBA ( Multiple Batch Assay : 다수 배치 분석)에 의해 측정된, 리파제 A로 달성가능한 생산성
이 실험에서 에스테르 교환반응 생산성은 상기 "재료 및 방법" 섹션에서 기재된 MBA (다수 배치 분석)을 사용하여 시험하였다. 오일 배합물은 야자 스테아린 및 코코넛 오일의 혼합물이었는데, 이때 코코넛 오일은 정제된 것이거나 아니면 정제되고 표백된 것이었다. 이들 배합물은 Na2CO3 로 사전처리되고 고정화된 리파제 A로 에스테르 교환반응되며 오일에서의 효소의 생산성을 Na2CO3 로 사전처리되지 않은 기준과 비교하였다.
생산성 결과의 요약
샘플 생산성 kg 오일/kg 효소 생산성 시험 때 남은 10% 상대적 리파제 활성
정제 오일 없음 기준 1,650
Na2CO3 사전 처리 3,620
표백 오일 없음 기준 210
Na2CO3 사전 처리 3,250
정제된 오일 샘플의 생산성은 1,650 kg 오일/ kg 효소인 것으로 발견되었다. Na2CO3 로 사전처리했을 때 생산성은 3,620 kg 오일/kg 효소로 증가하였다.
표백 오일은 210 kg 오일/kg 효소의 생산성 값을 제공하였다. 표백 오일을 Na2CO3 로 사전처리했을 때 생산성은 3,250 kg 오일/kg 효소로 증가된 한편, 정제된 오일의 생산성은 1,650에서 3,620 kg 오일/kg 효소로 증가하였다.

Claims (25)

  1. a) 오일을 염기와 접촉시키는 단계와,
    b) 상기 오일을 리파제와 반응시키는 단계를 포함하는 한가지 이상의 금속 킬레이트제를 함유하는 오일을 에스테르 교환반응시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 a) 및 b)는 연속해서 또는 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 오일은 두가지 이상의 오일의 배합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 식용유이고, 바람직하게는 식물성 오일인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 식물성 오일은 야자 스테아린, 야자 올레인, 야자핵유, 옥수수유, 카놀라유(평지씨), 대두유, 면실유, 야자유, 코코넛유, 또는 해바라기유, 또는 이들의 배합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 오일은 미정제, 정제, 표백된 것, 냄새제거된 것 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 킬레이트제는 산, 바람직하게는 시트르산 또는 인산, 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 금속 킬레이트제는 1 내지 100 ppm, 바람직하게는 10 내지 90 ppm, 특히 약 50 ppm의 농도로 오일에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 염기는 수산화나트륨(NaOH)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 염기는 약 염기, 바람직하게는 탄산나트륨(Na2CO3)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파제는 1,3-특이적 리파제인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파제는 바람직하게는 서 모미세스(Thermomyces) 속의 진균 리파제, 바람직하게는 서모미세스 라누기노사(T. lanuginosa)의 균주 또는 칸디다 안탁티카(Candida antactica)종의 효모로부터 유도된 리파제 B인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파제는 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파제는 LIPOZYME™ TL IM 제품인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 염기는 오일 킬로그램 당 0.001 내지 100 밀리몰, 바람직하게는 오일 킬로그램 당 0.01 내지 10 밀리몰, 특히 오일 킬로그램 당 0.1-1 밀리몰인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 에스테르 교환반응의 동안의 온도는 50℃ 내지 100℃, 바람직하게는 60℃ 내지 90℃, 특히 65℃ 내지 80℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 리파제와 염기를 포함하는 효소 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 염기는 약 염기이고, 바람직하게는 탄산나트륨인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 염기는 수산화나트륨인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  20. 제 17 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파제는 바람직하게는 서모미세스(Thermomyces) 속의 진균 리파제, 바람직하게는 서모미세스 라누기노사(T. lanuginosa)의 균주 또는 칸디다 안탁티카(Candida antactica)종의 효모로부터 유도된 리파제 B인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  21. 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파제는 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  22. 제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 리파제는 염기가 포함된 LIPOZYME™ TL IM 제품인 것을 특징으로 하는효소 조성물.
  23. 제 17 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 염기는 1몰 수준으로 물에 용해/분산시켰을 때 8 내지 13의 pH를 제공하는 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  24. 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 고정화된 리파제와 염기의 혼합물 또는 염기가 포함된 고정화된 리파제인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
  25. 하나 이상의 킬레이트제를 포함하는 리파제로 오일의 에스테르 교환반응에의 염기의 사용.
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