KR20080050618A

KR20080050618A - 아시플루오르펜에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는프로토포르피리노겐옥시다아제 및 그 유전자

Info

Publication number: KR20080050618A
Application number: KR1020087009304A
Authority: KR
Inventors: 아유미 다나카; 료우이치 다나카; 가즈시게 가토; 다카코 후카가와
Original assignee: 닛뽕소다 가부시키가이샤; 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-25
Publication date: 2008-06-09
Also published as: EP1930434B1; CN102021189B; US8129589B2; US20120184727A1; EP1930434A1; BRPI0616416A2; JPWO2007034953A1; CN102021189A; US8580940B2; CN101278049A; EP1930434A4; CN101278049B; US20090216004A1; WO2007034953A1

Abstract

아시플루오르펜 내성을 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제, 및 그 유전자 등을 제공하는 것이다. 애기장대의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 남조류에 도입하고, 트랜스포존을 이용하여 남조류의 유전자를 파괴하고, 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자가 파괴된 주를 선발하고, 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 특정하고, 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 단리함으로써, 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 동정한다. 이 수법은 남조류 유래의 포르피리노겐옥시다아제 등, 이미 알려진 단백질과 상동인 다른 생물종 유래의 단백질을 다른 생물종의 유전자 데이터 베이스에서는 발견할 수 없는 경우의 유전자의 단리 수법으로서 유효하다.

Description

아시플루오르펜에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제 및 그 유전자{PROTOPORPHYRINOGEN OXIDASE HAVING ACTIVITY OF IMPARTING RESISTANCE AGAINST ACIFLUORFEN AND GENE THEREOF}

본 발명은, 아시플루오르펜 (ACIFLUORFEN) 에 대한 내성을 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제, 특히 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제 및 그 유전자, 그리고 그 유전자를 삽입한 형질 전환체 등에 관한 것이다.

프로토포르피리노겐옥시다아제는 헴 및 클로로필 합성의 최종 단계의 반응, 즉 프로토포르피리노겐 Ⅸ 에서 6 개의 전자를 빼앗아 프로토포르피린 Ⅸ 를 합성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 헴은 헤모글로빈, 시토크롬 등의 헴 단백질의 보조 인자로서, 호흡이나 에너지 대사, 산소 스트레스에 대한 방어에 불가결한 분자이다. 헴 합성 경로는 미생물, 식물, 동물에 공통되게 존재하고, δ-아미노레블린산을 전구체로 하여 헴를 합성하는 경로이다. 또한, 식물에 있어서는 헴 및 클로로필은 δ-아미노레블린산을 전구체로 하여 프로토포르피린 Ⅸ 까지 공통의 경로에서 합성되어 있고, 프로토포르피리노겐옥시다아제는 이 2 개의 합성 경로의 조절적인 역할도 담당하고 있다고 생각된다. 육상 식물에 있어서 클로로필 대사계를 담당하는 이 프로토포르피리노겐옥시다아제 효소는 디페닐에테르 (이하, DPE 라 약칭하는 경우가 있다) 계 제초제의 표적 효소가 된다. DPE 계 제초제에 의해 프로토포르피리노겐옥시다아제의 활성이 저해되면, 그 효소의 기질인 프로토포르피리노겐 Ⅸ 가 엽록체 중에 축적되어 가, 결국에는 프로토포르피리노겐 Ⅸ 가 세포질 졸(sol) 중에 새고, 거기서 퍼옥시다아제에 의해 그것이 산화되어 프로토포르피린 Ⅸ 를 발생시킨다. 프로토포르피린 Ⅸ 가 광과 산소에 노출되면, 프로토포르피린 Ⅸ 는 1 중항 산소 및 또 다른 반응성 산소종을 생성시킬 수 있다. 지질의 과산화 및 이것이 필연적으로 수반하는 막 손상의 결과로서, 식물 세포는 급속히 사망한다 (Lee et al., 1993, Plant Physiol., 102, 881). 한편, 남조류에서는 DPE 계 제초제 존재하에서도 생육이 가능함이 알려져 있었지만, 그 요인이나 메커니즘은 전혀 알려져 있지 않았다.

프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자는 몇 가지 생물에서 이미 단리되어 있다. 예를 들어, 담배의 PPX1 유전자 (Genbank accession Y13465), PPX2 유전자 (Genbank accession Y13466), 애기장대의 PPOX 유전자 (Genbank accession D83139), 바실루스 서브틸리스의 HemY 유전자 (Genbank accession M97208), 마우스의 PPX 유전자 (Genbank accession D45185), 사람의 PPX 유전자 (Genbank accession D38537), 사카로마이세스 세레비시아의 PPX 유전자 (Genbank accession Z71381), 에쉐리키아 콜리의 hemG 유전자 (Genbank accession X68660) 등이 알려져 있다.

프로토포르피리노겐옥시다아제의 이용법으로서, 예를 들어 특허 문헌 1 은, DPE 계 제초제에 대한 저항성을 부여하는 고초균 (Bacillus subtilis) 에서 유래하 는 프로토포르피리노겐옥시다아제를 식물체내에서 발현시키는 방법, 및 그 프로토포르피리노겐옥시다아제를 발현하는 트랜스제닉 식물을 개시하고 있다. 또한, 예를 들어 특허 문헌 2 는, 식물의 육종에 적합한 포르피린 생합성계의 효소 단백질의 유전자로서, 애기장대 (Arabidopsis thaliana) 식물로부터 얻어질 수 있는 1.7kbp 의 길이를 갖는 유전자이며, 5' 말단으로부터 1.3kbp 의 부위에 제한 효소 EcoRI 의 인식 염기 배열 5'-GAATTC-3' 가 존재하는 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 개시하고 있다. 또한, 예를 들어 특허 문헌 3 은, 래트 또는 클라미도모나스 유래의 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성 저해능을 평가하기 위한 간편한 방법으로서 (1) 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성에 근거하는 증식능이 결손된 숙주 세포에, 숙주 세포내에서 기능 가능한 프로모터, 및 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자가 기능 가능한 형태로 결합되어 이루어지는 DNA 단편이 도입되어 이루어지고, 상기 DNA 단편에 존재하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 발현하는 형질 전환체를, 피험 화합물의 존재하 또는 비존재하에 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성에 근거하는 증식능의 결손을 보완하는 화합물을 실질적으로 함유하지 않는 배지에서 배양하여 각 조건 하에 있어서의 그 형질 전환체의 증식도를 측정하는 공정, (2) 그 증식도의 차이에 근거하여 피험 화합물의 접촉에 의한 상기 형질 전환체의 증식 저해도를 구하여, 피험 화합물의 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성 저해능을 판정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 개시하고 있다.

한편, 남조류에서는 그 유전자 데이터 베이스의 해석으로부터, 대장균 hemK 유사 유전자가 프로토포르피리노겐옥시다아제인 것으로 추정되어 있었으나, 남조류의 그 hemK 유사 유전자는 프로토포르피리노겐옥시다아제가 아님이 그 후 실제로 명백해졌다. 그러나, 남조류의 유전자 데이터 베이스에는 지금까지 동정되어 있는 다른 생물종의 프로토포르피리노겐옥시다아제와 상동인 단백질은 남조류에서는 발견되지 않아, 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제는 아직 단리되어 있지 않았다 (예를 들어, 비특허 문헌 1 참조).

특허 문헌 1: 일본 특허출원 평9-107833호

특허 문헌 2: 일본 공개특허공보 평9-140381호

특허 문헌 3: 일본 특허출원 평11-346787호

비특허 문헌 1: 드미트리 (Dmitrii V. Vavilin), 윔 (Wim F. J. Vermaas)「Regulation of the tetrapyrrole biosynthetic pathway leading to heme and chlorophyll in plants and cyanobacteria (식물과 남조류에 있어서의 헴 및 클로로필로 안내하는 테트라피롤 생합성 경로의 조절)」 Physiologia Plantarum 제 115 권, 제 9 페이지, 2002년

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

상기 서술한 바와 같이, 다른 생물종 유래의 이미 알려진 프로토포르피리노겐옥시다아제와 상동인 단백질은 남조류의 유전자 데이터 베이스에서는 발견되지 않아, 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제는 지금까지 단리되어 있지 않았다. 본 발명의 과제는, 아시플루오르펜 내성을 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제 및 그 유전자, 그리고 그 유전자를 삽입한 형질 전환체 등을 제공하는 것에 있다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 남조류 유래의 프로토포르피리노겐옥시다아제의 단리를 목적으로 하여, 프로토포르피리노겐옥시다아제 결손 대장균을 이용한 상보적 스크리닝을 시도하였다. 이 방법은 프로토포르피리노겐옥시다아제를 결손한 대장균에 남조류 게놈 단편을 도입하여 상보하는 유전자를 탐색하고, 남조류의 프로토포르피리노겐 Ⅸ 의 산화에 관여하는 유전자를 특정하는 방법이다. 사용한 벡터는 상이하지만, 애기장대나 담배 유래의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자는 동일한 방법을 이용하여 단리되었다. 상기 상보적 스크리닝의 개략을 이하에 나타낸다.

먼저, 남조류 (시네코시스티스 PCC6803) 로부터 DNA 를 취득하였다. DNA 라이브러리의 제작시에는 파지 벡터로서 λZAPⅡ 벡터 (STRATEGENE 사 제조) 를 이용하였다. 그 남조류의 전체 염기 배열은 이미 보고되고 있으므로 (약 3,500kb), 벡터의 멀티클로닝 사이트에 포함되는 6 종의 제한 효소 배열에 대하여, 그 남조류의 게놈 배열을 조사한 결과 XbaI, SpeI, EcoRI 의 3 종류가 라이브러리 제작에 적합하다고 생각되었다. 그래서, 이 3 종류의 제한 효소 처리를 기본으로 하여 파지 라이브러리를 제작하였다. 제작한 라이브러리를 프로토포르피리노겐옥시다아제 결손 대장균에 도입하고, 그 형질 전환체의 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 조사함으로써 상보 시험을 실시했지만, 명백한 상보성을 나타내는 것은 관찰되지 않았다. 이 결과로부터, 그 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제가 이 3 종류의 제한 효소 배열을 운 나쁘게 갖고 있었거나, 그 남조류의 프로모터가 잘 작용하지 않았거나 하는 등의 몇 가지 가능성이 생각되었다.

그래서, 새롭게 제한 효소 Tsp5091 을 사용한 한정 분해로 라이브러리를 제작하여 다시 검토하였다. Tsp5091 은 4 염기 인식의 제한 효소이다. 전회의 라이브러리 제작에 사용한 3 종류의 제한 효소 (EcoRI, SpeI, XbaI) 는 6 염기 인식으로서, 지나치게 사이즈가 큰 단편이 어떻게든 생긴다. 또한, 남조류 프로토포르피리노겐옥시다아제의 유전자 배열내에 이들 제한 효소의 인식 배열이 존재했을 경우, 완전한 길이의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 클로닝할 수 없다. 한편, 4 염기 인식의 제한 효소를 이용하여 DNA 를 완전히 절단하면, 수백bp 의 작은 단편이 대량으로 생겨버린다. 이 문제를 해결하기 위하여, 4 염기 인식의 제한 효소로 불완전하게 DNA 를 절단하는 방법 (한정 분해) 을 이용하여 라이브러리를 제작하였다. 그 라이브러리를 사용하였으나, 대장균의 프로토포르피리노겐옥시다아제 결손능을 상보할 수는 없었다.

다음으로, 플라스미드의 상태로 하면 생육 복귀가 관찰될지도 모른다고 생각하여, Tsp5091 남조류 게놈 파지 라이브러리에 대하여 대량의 플라스미드를 잘라내고, Tsp5091 남조류 게놈 플라스미드 라이브러리를 제작하여 검토했지만 현저히 생육 복귀되는 클론은 관찰되지 않았다. 이것으로부터, 남조류 프로토포르피리노겐옥시다아제가 대장균의 프로토포르피리노겐옥시다아제 결손을 상보하지 않거나, 또는 상보하고 있어도 매우 경미할 가능성이 생각되었다.

그래서, 본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 남조류가 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖는다는 지견에 근거하여, 트랜스포존을 이용한 남조류 변이체 스크리닝을 이용함으로써, 남조류 (시네코시스티스 PCC6803) 유래의 포르피리노겐옥시다아제를 처음으로 단리하고, 그 포르피리노겐옥시다아제가 아시플루오르펜 내성을 부여하는 활성을 갖고 있음을 알아냄과 함께, 그 유전자를 동정함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 상기 트랜스포존을 이용한 유전자 스크리닝의 수법은, 남조류 유래의 포르피리노겐옥시다아제 등, 이미 알려진 단백질과 상동인 다른 생물종 유래의 단백질을 다른 생물종의 유전자 데이터 베이스에서는 발견할 수 없는 경우의 유전자의 단리 수법으로서 유효하다는 지견을 얻어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉 본 발명은, (1) 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 남조류 유래인 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제나, (2) 남조류가 시네코시스티스족에 속하는 남조류인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 기재의 프로토포르피리노겐옥시다아제나, (3) 생물이 식물인 것을 특징으로 하는 상기 (1) 또는 (2) 기재의 프로토포르피리노겐옥시다아제에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (4) 하기 (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 나타내는 단백질, (a) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, (b) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질, (c) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열에 대한 상동성이 20％ 이상이고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질이나, (5) 남조류 유래인 것을 특징으로 하는 상기 (4) 기재의 단백질에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (6) 상기 (1) ∼ (3) 중 어느 하나에 기재된 프로토포르피리노겐옥시다아제, 또는 상기 (4) 혹은 (5) 에 기재된 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 나, (7) 하기 (d) 또는 (e) 에 나타내는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA, (d) 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA, (e) 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 나, (8) 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열에 대하여 상보적인 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 나, (9) 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질이 남조류에서 유래하는 것을 특징으로 하는 상기 (7) 또는 (8) 중 어느 하나에 기재된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (10) 상기 (6) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 가 삽입된 재조합 벡터에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (11) 상기 (10) 기재의 재조합 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는 형질 전환체나, (12) 형질 전환체가 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 상기 (11) 기재의 형질 전환체나, (13) 형질 전환체가 미생물인 것을 특징으로 하는 상기 (11) 또는 (12) 기재의 형질 전환체나, (14) 형질 전환체가 식물인 것을 특징으로 하는 상기 (11) 또는 (12) 기재의 형질 전환체나, (15) 광합성능이 향상된 것을 특징으로 하는 상기 (14) 기재의 형질 전환체에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (16) 상기 (11) ∼ (15) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체를 이용한 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해 활성능의 평가 방법이나, (17) 상기 (11) ∼ (16) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체를 이용한 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (18) 이하의 (f) ∼ (j) 의 공정을 포함하는, 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자의 단리 방법, (f) 애기장대의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 남조류에 도입하는 공정; (g) 트랜스포존을 이용하여 남조류의 유전자를 파괴하는 공정; (h) 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자가 파괴된 주를 선발하는 공정; (i) 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 특정하는 공정; (j) 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 단리하는 공정; 에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (19) 상기 (4) 또는 (5) 기재의 단백질의 프로토포르피리노겐옥시다아제로서의 사용 방법이나, (20) 상기 (4) 또는 (5) 기재의 단백질을 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 인위적으로 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 로 전환하는 방법이나, (21) 상기 (6) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 DNA 의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자로서의 사용 방법이나, (22) 상기 (6) ∼ (9) 중 어느 하나에 기재된 DNA 를 인위적으로 발현시키고, 그 발현 산물을 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 로 전환하는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (23) 이하의 1) ∼ 5) 의 공정을 포함하는 특정 생물에 있어서의 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자의 단리 방법, 1) 특정 생물 이외의 다른 생물로부터 소정의 기능을 상보하는 단백질을 코드하는 유전자를 특정 생물에 도입하여 형질 전환체를 제작하는 공정; 2) 형질 전환체의 유전자를 변이 처리 등에 의해 랜덤하게 파괴하여 형질 전환체의 변이주를 제작하는 공정; 3) 소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하고, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제를 이용하거나, 혹은 배양 조건을 변화시킴으로써, 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 파괴된 변이주를 선발하는 공정; 4) 파괴된 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 특정하는 공정; 5) 파괴된 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 공정에 관한 것이다.

또한 본 발명은, (24) 변이 처리가 트랜스포존을 이용한 변이 처리인 것을 특징으로 하는 상기 (23) 기재의 유전자의 단리 방법이나, (25) 특정 생물 이외의 다른 생물로부터 소정의 기능을 상보하는 단백질이 애기장대의 프로토포르피리노겐옥시다아제인 것을 특징으로 하는 상기 (23) 또는 (24) 기재의 유전자의 단리 방법이나, (26) 소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하고, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제가 아시플루오르펜인 것을 특징으로 하는 상기 (25) 기재의 유전자의 단리 방법이나, (27) 특정 생물에 있어서의 소정의 기능을 갖는 단백질이 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제인 것을 특징으로 하는 상기 (25) 또는 (26) 기재의 유전자의 단리 방법에 관한 것이다.

[도 1] 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열과, 남조류 유래의 기능 미지의 유전자가 코드하는 아미노산 배열의 얼라인먼트.

[도 2] 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열과, 다른 생물 유래의 기능 미지의 유전자가 코드하는 아미노산 배열의 얼라인먼트.

[도 3] 시네코시스티스의 slr1790 유전자 파괴용 콘스트럭트 (pslr1790SKM 6.4kb) 를 나타내는 도면이다.

[도 4] 프로트포리피린 Ⅸ 의 샘플 (A), slr1790 의 유전자 파괴주의 추출액 (C), 및 야생주의 추출액 (B) 에 관한, 프로트포리피린 Ⅸ 의 크로마토그램을 나타내는 도면이다.

[도 5] pBI121 의 개략을 나타내는 도면이다.

[도 6] pBIslr1790 의 개략을 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제는 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는다. 여기서, 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제」 란, 적당한 생물 중에 그 프로토포르피리노겐옥시다아제를 도입하고, 그 효소를 그 생물 중에서 적당히 발현시킨 경우에, 그 생물의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되는 프로토포르피리노겐옥시다아제를 의미한다. 그 생물의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되었는지 여부는, 예를 들어 아시플루오르펜의, 그 생물에 대한 48 시간 후의 LC50 치가 그 효소를 도입하기 전에 비해, 그 효소를 도입한 후에 향상되었는지 여부를 확인함으로써 조사할 수 있다. 또한, 특히 생물이 식물일 때에는, 예를 들어 특정량의 아시플루오르펜을 식물의 재배 토양에 시용한 경우에, 상기 효소를 식물 중에서 적당히 발현시키기 전의 식물에 비해, 상기 효소를 식물 중에서 적당히 발현시킨 식물이 황화, 갈변 혹은 고화되는 정도가 저감하는 것을 확인하거나, 동일한 정도의 황화, 갈변 혹은 고화를 일으키게 하는 데 필요한 아시플루오르펜의 단위 면적 당 시용량이, 상기 효소를 식물 중에서 적당히 발현시키기 전의 식물에 비해, 상기 효소를 식물 중에서 적당히 발현시킨 식물에 있어서 증가하는 것을 확인하는 하는 등에 의해, 그 식물의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되었는지 여부를 조사할 수 있다. 또한, 아시플루오르펜에 대한 내성의 향상의 정도는 특별히 제한되지 않지만, 아시플루오르펜의, 그 생물에 대한 48 시간 후의 LC50 치, 또는 동일한 정도의 황화, 갈변 혹은 고화를 일으키게 하는 데 필요한 아시플루오르펜의 단위 면적 당의 시용량이, 그 생물에 그 효소를 도입하기 전에 비해 1.1 배 이상으로 향상되는 것이 바람직하고, 1.5 배 이상으로 향상되는 것이 보다 바람직하고, 2 배 이상으로 향상되는 것이 더욱 바람직하고, 3 배 이상으로 향상되는 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명의 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제」 에는, 그 프로토포르피리노겐옥시다아제 자체가 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖고 있는 경우도 포함된다. 여기서, 「프로토포르피리노겐옥시다아제 자체가 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖고 있다」 란, 1μM 의 아시플루오르펜을 함유하는 적당한 용매 중에 있어서의 프로토포르피리노겐옥시다아제의 비활성이, 아시플루오르펜 비존재하에 있어서의 프로토포르피리노겐옥시다아제의 비활성의 50 분의 1 이상, 바람직하게는 20 분의 1 이상, 보다 바람직하게는 10 분의 1 이상인 것을 의미한다. 여기서 「프로토포르피리노겐옥시다아제 활성」 이란, 프로토포르피리노겐 Ⅸ 를 산화시켜 프로토포르피린 Ⅸ 를 생성하는 효소 활성을 말한다. 어느 단백질의 프로토포르피리노겐옥시다아제 비활성은 그 단백질과 프로토포르피리노겐 Ⅸ 를 적당한 버퍼 또는 염용액 중에서 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 의 생성량을 조사하거나 하는 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는」 에 있어서의 「생물」 은, 특별히 제한되지 않고, 식물이어도 되고 미생물이어도 되지만, 식물인 것이 바람직하고, 그 중에서도 애기장대, 담배, 옥수수, 벼, 보리류 (소맥, 대맥 등), 감자류 (감자 등) 인 것이 바람직하다.

본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제는, 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고 있는 한, 남조류 유래가 아니어도 되지만, 남조류 유 래이어도 된다. 남조류는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 시네코시스티스속, 아나베나속, 글로에오박터속, 프로클로로코커스속, 시네코코커스속, 로도슈도모나스속 등에 속하는 남조류를 들 수 있고, 보다 구체적으로는, 시네코시스티스 PCC6803, 아나베나 PCC7120, 글로에오박터 비올라세우스 PCC7421, 프로클로로코커스 마리나스 SS120, 프로클로로코커스 마리나스 MIT9313, 프로클로로코커스 마리나스 MED4, 시네코코커스 WH8102, 로도슈도모나스 파울스트리스 등을 들 수 있다. 이들 중, 시네코시스티스속에 속하는 남조류가 바람직하고, 시네코시스티스 PCC6803 이 보다 바람직하다.

본 발명에 있어서, 「남조류에서 유래하는 프로토포르피리노겐옥시다아제」 란, 실제로 남조류에 존재하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 외에, 그 프로토포르피리노겐옥시다아제와 동일한 한, 형질 전환 등의 수법을 이용하여 남조류 이외의 미생물 등에 의해 발현된 프로토포르피리노겐옥시다아제도 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 단백질은, (1) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질, 2) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노산 배열, 그리고 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열 중 어느 한 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 포함하고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질, 및 (3) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노산 배열, 그리고 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열 중 어느 한 아미노산 배열에 대한 상동성이 20% 이상이며, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질 중 어느 하나에 나타내는 단백질이다. 이하, 이들 본 발명의 단백질을 총칭하여 「본건 단백질」 이라고 하는 경우가 있다.

본 발명의 상기 단백질 (2) 는 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노산 배열, 그리고 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열 중 어느 한 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 포함하고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질이면 특별히 제한되지 않지만, 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질이나, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 포함하고, 또한 그 아미노산 번호 1 ∼ 34 의 아미노산 배열에 대응하는 아미노산 배열과, 그 아미노산 번호 48 ∼ 176 의 아미노산 배열에 대응하는 아미노산 배열 사이에 10 ∼ 16 개, 바람직하게는 12 ∼ 14 개, 보다 바람직하게는 13 개의 임의의 아미노산 배열을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질이나, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 포함하고, 또한 그 아미노산 번호 1 ∼ 34 의 아미노산 배열에 대응하는 아미노산 배열과, 그 아미노산 번호 48 ∼ 193 의 아미노산 배열에 대응하는 아미노산 사이에 10 ∼ 16 개, 바람직하게는 12 ∼ 14 개, 보다 바람직하게는 13 개의 임의의 아미노산 배열을 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 바람직하게 들 수 있다. 여기서, 아미노산 번호 m ∼ n 의 아미노산 배열에 대응하는 아미노산 배열이란, 아미노산 번호 m ∼ n 의 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 의미한다.

상기 「1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열」 이란, 예를 들어 1 ∼ 20 개, 바람직하게는 1 ∼ 15 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 가장 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 임의의 수의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열을 의미한다.

본 발명에 있어서 「프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는」 이란, 프로토포르피리노겐 Ⅸ 를 산화시켜 프로토포르피린 Ⅸ 를 생성하는 효소 활성을 갖 는 것을 말한다. 어느 단백질이 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는지 여부는 그 단백질과 프로토포르피리노겐 Ⅸ 를 적당한 버퍼 또는 염용액 중에서 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 의 생성을 조사함으로써 용이하게 확인할 수 있다.

또한, 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 단백질」 이란, 적당한 생물 중에 그 단백질을 도입하고, 그 단백질을 그 생물 중에서 적당히 발현시킨 경우에, 그 생물의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되는 단백질을 의미한다. 그 생물의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되었는지 여부는, 예를 들어 아시플루오르펜의, 그 생물에 대한 48 시간 후의 LC50 치가 그 단백질을 도입하기 전에 비해, 그 단백질을 도입한 후에 향상되었는지 여부를 확인함으로써 조사할 수 있다. 또한, 특히 생물이 식물일 때에는, 예를 들어 특정량의 아시플루오르펜을 식물의 재배 토양에 시용한 경우에, 상기 단백질을 식물 중에서 적당히 발현시키기 전의 식물에 비해, 상기 단백질을 식물 중에서 적당히 발현시킨 식물이 황화, 갈변 혹은 고화되는 정도가 저감하는 것을 확인하거나, 동일한 정도의 황화, 갈변 혹은 고화를 일으키게 하는 데 필요한 아시플루오르펜의 단위 면적 당의 시용량이 상기 단백질을 식물 중에서 적당히 발현시키기 전의 식물에 비해, 상기 단백질을 식물 중에서 적당히 발현시킨 식물에 있어서 증가하는 것을 확인하는 등에 의해, 그 식물의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되었는지 여부를 조사할 수 있다. 또한, 아시플루오르펜에 대한 내성의 향상의 정도는 특별히 제한되지 않지만, 아시플루오르펜의, 그 생물에 대한 48 시간 후의 LC50 치, 또는 동일한 정도의 황화, 갈변 혹은 고화를 일으키게 하는 데 필요한 아시플루오르펜의 단위 면적 당 의 시용량이 그 생물에 그 단백질을 도입하기 전에 비해 1.1 배 이상으로 향상되는 것이 바람직하고, 1.5 배 이상으로 향상되는 것이 보다 바람직하고, 2 배 이상으로 향상되는 것이 더욱 바람직하고, 3 배 이상으로 향상되는 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명의 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 단백질」 에는 그 단백질 자체가 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖고 있는 경우도 포함된다. 여기서, 「그 단백질 자체가 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖고 있다」 란, 1μM 의 아시플루오르펜을 함유하는 적당한 용매 중에 있어서의 그 단백질의 비활성 (프로토포르피리노겐옥시다아제 활성에 관함) 이 아시플루오르펜 비존재하에 있어서의 비활성 (프로토포르피리노겐옥시다아제 활성에 관함) 의 50 분의 1 이상, 바람직하게는 20 분의 1 이상, 보다 바람직하게는 10 분의 1 이상인 것을 의미한다. 여기서 「프로토포르피리노겐옥시다아제 활성」 이란, 프로토포르피리노겐 Ⅸ 를 산화시켜 프로토포르피린 Ⅸ 를 생성하는 효소 활성을 말한다. 어느 단백질의 비활성 (프로토포르피리노겐옥시다아제 활성에 관함) 은 그 단백질과 프로토포르피리노겐 Ⅸ 를 적당한 버퍼 또는 염용액 중에서 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 의 생성량을 조사하거나 하는 등에 의해 용이하게 확인할 수 있다. 또한, 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는」 에 있어서의 「생물」 은, 특별히 제한되지 않지만, 식물 및 미생물이 바람직하고, 식물이 특히 바람직하다.

본 발명의 상기 단백 (3) 은 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 (slr1790), 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노 산 배열, 그리고 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열 중 어느 한 아미노산 배열에 대한 상동성이 20% 이상이며, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질인 한 특별히 제한되지 않지만, 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노산 배열, 그리고 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열 중 어느 한 아미노산 배열에 대한 그 상동성은 45% 이상인 것이 바람직하고, 54% 이상인 것이 보다 바람직하고, 65% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 80% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 90% 이상인 것이 더욱 바람직하고, 95% 이상인 것이 가장 바람직하다. 여기서, 본 발명에 있어서 「아미노산 번호 o ∼ p 및 q ∼ r 에 기재된 아미노산 배열에 대한 상동성이 X% 이상」 이란, 아미노산 번호 o ∼ p 의 아미노산 배열과 아미노산 번호 q ∼ r 의 아미노산 배열을 이 순서로 갖고, 또한 아미노산 번호 o ∼ p 의 아미노산 배열과 아미노산 번호 q ∼ r 의 아미노산 배열 사이에 10 ∼ 16 개, 바람직하게는 12 ∼ 14 개, 보다 바람직하게는 13 개의 임의의 아미노산 배열을 갖는 아미노산 배열에 대한 상동성이 X% 이상인 것을 의미한다. 상기 단백 (3) 에 있어서의 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 단백질」 및 「아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 단백질」 그리고 그들의 바람직한 양태는 상기 단백 (2) 에 있어서의 그들의 단백질과 동일한 의미이다.

또한, 본 발명의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열과 상동성이 높 은 단백질을 BLAST 로 검색한 결과, 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열과 상동성이 높은 아미노산 배열을 코드하는 기능 미지의 유전자가 몇 개 나타났다. 그 중, 남조류 유래의 기능 미지의 유전자를 이하의 표 1 에 나타낸다. 또한, 그 유전자가 코드하는 아미노산 배열과, 본 발명의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열의 상동성 (%) 도 표 1 에 나타낸다. 이들도 본건 단백질에 포함된다. 또한, 본 발명의 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열은, 후술의 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 시네코시스티스 PCC6803 유래의 slr1790 유전자에 코드되는 아미노산 배열임이 본 발명자들에 의해 밝혀진 것이다.

또한, 표 1 에 나타낸 유전자가 코드하는 아미노산 배열의 얼라인먼트를 이하의 도 1 에 나타낸다.

도 1 의 얼라인먼트에서는, 7 유전자 모두에서 공통되는 아미노산 아래에 별표를 부여하였다. 또한, 4 ∼ 6 유전자에서 공통되는 아미노산 아래에는 도트를 부여하였다. 표 1 및 도 1 에서 알 수 있듯이, 시네코시스티스 PCC6803 이외의 7 종의 남조류의 이들 아미노산 배열은 시네코시스티스 PCC6803 의 slr1790 유전자가 코드하는 아미노산과 상동성이 높고, 또한 특정 영역이 잘 보존되어 있다. 따라서, 시네코시스티스 PCC6803 의 slr1790 유전자 이외의 이들 유전자가 코드하는 단백도, 시네코시스티스 PCC6803 의 slr1790 유전자가 코드하는 단백 (배열 번호 2 의 아미노산 배열) 과 마찬가지로, 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제인 것으로 예상된다. 또한, 도 1 의 얼라인먼트로부터, 본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제는, 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 또는 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열 중에서도, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열 (배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 582 에 기재된 염기 배열), 특히, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노산 배열 (배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 528 에 기재된 염기 배열) 의 보존성이 높고, 이들 부분의 배열이 그 효소의 성질에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 예상된다.

또한, 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열과 상동성이 높은 아미노산 배열을 코드하는 유전자로서 BLAST 검색으로 나타난 유전자 중, 남조류 이외의 생물 유래의 유전자를 이하의 표 2 에 나타낸다. 이들 유전자의 발현 산물도 본건 단백질에 포함된다.

또한, 표 2 에 나타낸 유전자가 코드하는 아미노산 배열의 얼라인먼트를 이하의 도 2 에 나타낸다.

도 2 의 얼라인먼트에서는, 5 유전자 모두에서 공통되는 아미노산 아래에 별표를 부여하였다. 또한, 3 유전자에서 공통되는 아미노산 아래에는 도트를 부여하였다. 표 2 및 도 2 에서 알 수 있듯이, 시네코시스티스 PCC6803 이외의 4 종의 생물의 이들 아미노산 배열은 시네코시스티스 PCC6803 의 slr1790 유전자가 코드하는 아미노산과 상동성이 높고, 또한 특정한 영역이 잘 보존되어 있다. 따라서, 시네코시스티스 PCC6803 의 slr1790 유전자 이외의 이들 유전자가 코드하는 단백도, 시네코시스티스 PCC6803 의 slr1790 유전자가 코드하는 단백 (배열 번호 2 의 아미노산 배열) 과 마찬가지로, 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 프로토포르피리노겐옥시다아제인 것으로 예상된다.

본 발명은 또한, 상기의 본건 단백질의 프로토포르피리노겐옥시다아제로서의 사용 방법에 관한 것이다. 여기서, 「프로토포르피리노겐옥시다아제로서의 사용」 이란, 예를 들어 본건 단백질을 인비트로 또는 인비보에 있어서 기질 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 인위적으로 접촉시켜 반응 생성물 프로토포르피린 Ⅸ 가 생성되는 반응에 사용하는 것 등을 의미하고, 본건 단백질이 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는다는 지견은 본 발명에 의해 처음 밝혀진 완전히 새로운 지견이다. 또한 본 발명의 본건 단백질을 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 인위적으로 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 로 전환하는 방법에 있어서의 「인위적으로 접촉시킨다」 란, 인비트로 또는 인비보에 있어서 인위적으로 접촉시키는 것을 의미하고, 예를 들어 남조류 세포내에 있어서의 비인위적인 접촉은 포함되지 않는다.

본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 는, (1) 본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제 또는 본건 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA, (2) 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA, (3) 배열 번호 1 의 염기 배열, 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 528 에 기재된 염기 배열, 그리고 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 582 에 기재된 염기 배열 중 어느 한 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 포함하고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA, 및 (4) 배열 번호 1 의 염기 배열, 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 528 에 기재된 염기 배열, 그리고 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 582 에 기재된 염기 배열 중 어느 한 염기 배열에 대하여 상보적인 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 중 어느 한 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 이다. 이들 본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 를 총칭하여 「본건 유전자 DNA」라고 하는 경우가 있다.

본 발명의 상기 DNA (2) 는 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열, 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 528 에 기재된 염기 배열, 그리고 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 582 에 기재된 염기 배열 중 어느 한 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 포함하고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 이면 특별히 제한되지 않지만, 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 나, 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 528 에 기재된 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 포함하고, 또한 그 염기 번호 1 ∼ 102 의 염기 배열에 대응하는 염기 배열과, 그 염기 번호 142 ∼ 528 의 염기 배열에 대응하는 염기 배열 사이에 30 ∼ 48 (단 3 의 배수에 한정한다) 개, 바람직하게는 36 ∼ 42 (단 3 의 배수에 한정한다) 개, 보다 바람직하게는 39 개의 임의의 염기 배열을 갖는 염기 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 나, 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 582 에 기재된 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 포함하고, 또한 그 염기 번호 1 ∼ 102 의 염기 배열에 대응하는 염기 배열과, 그 염기 번호 142 ∼ 582 의 염기 배열에 대응하는 염기 배열 사이에 30 ∼ 48 (단 3 의 배수에 한정한다) 개, 바람직하게는 36 ∼ 42 (단 3 의 배수에 한정한다) 개, 보다 바람직하게는 39 개의 임의의 염기 배열을 갖는 염기 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 를 바람직하게 들 수 있다. 여기서, 염기 번호 m ∼ n 의 염기 배열에 대응하는 염기 배열이란, 염기 번호 m ∼ n 의 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열을 의미한다.

상기 「1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기 배열」 이란, 예를 들어 1 ∼ 20 개, 바람직하게는 1 ∼ 15 개, 보다 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개, 가장 바람직하게는 1 ∼ 3 개의 임의의 수의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기 배열을 의미한다.

예를 들어, 이들 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기 배열로 이루어지는 DNA (변이 DNA) 는 화학 합성, 유전자 공학적 수법, 돌연변이 유발 등의 당업자에게 이미 알려진 임의의 방법에 의해 제작할 수도 있다. 구체적으로는, 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 DNA 에 대하여, 변이원이 되는 약제와 접촉 작용시키는 방법, 자외선을 조사하는 방법, 유전자 공학적인 수법 등을 이용하여, 이들 DNA 에 변이를 도입함으로써, 변이 DNA 를 취득할 수 있다. 유전자 공학적 수법의 하나인 부위 특이적 변이 유발법은 특정 위치에 특정 변이를 도입할 수 있는 수법인 점에서 유용하고, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, N.Y., 1989 (이후, 몰레큘러 클로닝 제 2 판이라 약칭) 등에 기재된 방법에 준하여 실시할 수 있다. 이 변이 DNA 를 적절한 발현계를 이용하여 발현시킴으로써, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 단백질을 얻을 수 있다.

상기 「스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 DNA」 란, DNA 또는 RNA 등의 핵산을 프로브로서 사용하고, 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법, 혹은 서던 블롯 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하고, 구체적으로는 콜로니 혹은 플라크 유래의 DNA 또는 그 DNA 의 단편을 고정화한 필터를 이용하여, 0.7 ∼ 1.0M 의 NaCl 존재하, 65℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 ∼ 2 배 정도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은 150mM 염화 나트륨, 15mM 시트르산 나트륨) 을 이용하여 65℃ 조건하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은 몰레큘러 클로닝 제 2 판 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다.

예를 들어, 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로서는, 프로브로서 사용하는 DNA 의 염기 배열과 일정 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있고, 예를 들어 배열 번호 1 의 염기 배열, 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 528 에 기재된 염기 배열, 그리고 배열 번호 1 의 염기 번호 1 ∼ 102 및 142 ∼ 582 에 기재된 염기 배열 중 어느 한 염기 배열에 대하여 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 바람직하게 예시할 수 있다. 여기서, 본 발명에 있어서 「염기산 번호 s ∼ t 및 u ∼ v 에 기재된 염기 배열에 대한 상동성이 X% 이상」 이란, 염기 번호 s ∼ t 의 염기 배열과 염기 번호 u ∼ v 의 염기 배열을 이 순서로 갖고, 또한 염기 번호 s ∼ t 의 염기 배열과 염기 번호 u ∼ v 의 염기 배열 사이에 30 ∼ 48 (단 3 의 배수에 한정한다) 개, 바람직하게는 36 ∼ 42 (단 3 의 배수에 한정한다) 개, 보다 바람직하게는 39 개의 임의의 염기 배열을 갖는 염기 배열에 대한 상동성이 X% 이상인 것을 의미한다. 또한, 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 로서, 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열, 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 176 에 기재된 아미노산 배열, 그리고 배열 번호 2 의 아미노산 번호 1 ∼ 34 및 48 ∼ 193 에 기재된 아미노산 배열 중 어느 한 아미노산 배열에 대하여 20% 이상, 바람직하게는 45% 이상, 보다 바람직하게는 54% 이상, 더욱 바람직하게는 65% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 를 바람직하게 예시할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기의 본건 DNA 의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자로서의 사용 방법에 관한 것이다. 여기서, 「프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자로서의 사용」 이란, 예를 들어 본건 DNA 를 인비트로 또는 인비보에 있어서 인위적으로 발현시키고, 그 발현 산물인 프로토포르피리노겐옥시다아제를 기질 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 접촉시켜 반응 생성물 프로토포르피린 Ⅸ 를 생성시키는 반응에 사용하는 것 등 의미하고, 본건 DNA 의 발현 산물이 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는다는 지견은 본 발명에 의해 처음 밝혀진 완전히 새로운 지견이다. 본건 DNA 의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자로서 사용함으로써, 예를 들어 아시플루오르펜에 대하여 내성을 갖고 있지 않은 생물에 아시플루오르펜 내성을 부여할 수 있다. 또한 본 발명의 본건 DNA 를 인위적으로 발현시키고, 그 발현 산물을 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 로 전환하는 방법에 있어서의 「인위적으로 발현시키고」 란, 인비트로 또는 인비보에 있어서 인위적으로 발현시키는 것을 의미하고, 예를 들어 남조류 세포내에 있어서의 비인위적인 발현은 포함되지 않는다.

본건 단백질, 본건 유전자 DNA 의 단리 방법은 특별히 제한되지 않고, 분자유전학적 방법, 효소학적 방법 등 일반적으로 알려져 있는 방법으로 얻어진 것이어도 되지만, 이미 알려진 프로토포르피리노겐옥시다아제와의 상동성이 낮은 프로토포르피리노겐옥시다아제를 코드하는 유전자 DNA 를 단리하는 경우에는, (f) 애기장대의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 남조류에 도입하는 공정; (g) 트랜스포존을 이용하여 남조류의 유전자를 파괴하는 공정; (h) 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자가 파괴된 주를 선발하는 공정; (i) 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 특정하는 공정; (j) 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 단리하는 공정을 포함하는, 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자의 단리 방법을 사용하는 것이 바람직하다.

채취원이 되는 생물로서는, 아시플루오르펜에 대하여 내성을 갖고 있지 않은 생물이어도 되지만, 아시플루오르펜에 대하여 내성을 갖고 있는 것이 바람직하다. 이하, 아시플루오르펜에 대하여 내성을 갖고 있는 생물을 채취원으로 한 경우의 방법을 설명한다.

채취원이 되는 생물의 프로토포르피리노겐옥시다아제가 결손되어도, 그 생물이 생육할 수 있도록, 변이원 처리 전에 그 생물의 근연의 생물 등에서 유래하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 채취원이 되는 생물에 미리 도입하고, 그 근연의 생물 등에서 유래하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 채취원이 되는 생물내에서 발현시킨다. 또한, 그 근연의 생물 유래의 프로토포르피리노겐옥시다아제는 아시플루오르펜에 내성을 나타내지 않음이 확인되어 있는 것을 사용한다. 다음으로, 채취원이 되는 그 생물에 대하여 트랜스포존을 이용한 변이원처리를 실시하고, 얻어진 변이체에 대하여 아시플루오르펜 (디페닐에테르계 제초제) 을 이용한 스크리닝을 실시한다. 채취원이 되는 생물은 아시플루오르펜에 내성을 나타내지만, 그 근연의 생물 등에서 유래하는 프로토포르피리노겐옥시다아제는 아시플루오르펜에 내성을 나타내지 않는다 (감수성을 나타낸다). 따라서, 그 근연의 생물 등에서 유래하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 도입한 채취원 (프로토포르피리노겐옥시다아제 결손주) 은 아시플루오르펜에 감수성을 나타낸다. 그래서, 아시플루오르펜 처리하지 않는 경우에는 통상적으로 생육하고, 아시플루오르펜 처리한 경우에 아시플루오르펜 감수성을 나타낸 변이주를 선발한다. 예를 들어, 실시예 3 에 기재된 방법 등에 의해, 아시플루오르펜에 감수성을 나타낸 주에 대하여 트랜스포존의 삽입 위치를 해석함으로써 유전자를 특정할 수 있다. 이와 같이 하여, 채취원 유래의 아시플루오르펜에 내성을 나타내는 프로토포르피리노겐옥시다아제를 코드하는 유전자를 단리할 수 있다.

본 발명에 있어서 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자의 채취원으로서 사용하는 생물은 기존의 프로토포르피리노겐옥시다아제와 낮은 상동성을 나타내는 효소를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 기존의 프로토포르피리노겐옥시다아제와 낮은 상동성을 나타내는 유전자란, 구체적으로는 예를 들어 담배 PPX1 유전자 (Genbank accession Y13465) 에 대한 아미노산 레벨에서의 상동성이 20% 미만인 유전자를 의미한다. 본 발명에 있어서 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자의 채취원으로서 사용하는 생물로서는, 원핵 생물이 바람직하고, 남조류가 보다 바람직하고, 입수의 용이성이나 취급 용이성 등에서 시네코시스티스 (Synechocystis sp. PCC6803) 의 글루코스 내성주가 가장 바람직하다. 이들 균주는, 예를 들어 파스퇴르 연구소 (Institute Pasteur) 로부터 용이하게 입수할 수 있다. 이 주의 배양 조건은 일반적으로 알려져 있는 방법에 의해 실시할 수 있지만, 일정한 광의 존재하, 30℃ 에서 BG11 배지 [Hihara Y, et al. Plant Physiol (1998) 117: pp.1205] 에 TES-KOH (pH-8.2) 를 최종 5mM 이 되도록 조정하여 실시하는 것이 바람직하다.

본건 유전자 DNA 의 취득 방법이나 조제 방법은 특별히 한정되는 것이 아니라, 본 명세서 중에 개시한 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열 정보 또는 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열 정보에 기초하여 적당한 프로브나 프라이머를 조제하고, 그것들을 이용하여 예를 들어 시네코시스티스 PCC6803 이나 그 이외의 남조류 등의 생물의 게놈 DNA 라이브러리 등으로부터 목적의 유전자를 단리하거나, 통상적인 방법에 따라 화학 합성에 의해 조제할 수 있다. 또한, 게놈 DNA 의 취득과 그 클로닝 등은 모두 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다. 본건 유전자 DNA 를 게놈 DNA 라이브러리로부터 스크리닝하는 방법은, 예를 들어 몰레큘러 클로닝 제 2 판에 기재된 방법 등, 당업자에 의해 상용되는 방법을 들 수 있다. 또한, 변이 유전자 또는 상동 유전자로서는, 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열 또는 그 일부를 갖는 DNA 단편을 이용하여, 다른 생물체들로부터 그 DNA 와 호몰로지가 높은 염기 배열을 갖는 DNA 를 적당한 조건하에서 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. 그 밖에, 전술한 변이 DNA 의 제작 방법에 의해 조제할 수도 있다.

본 발명의 재조합 벡터로서는, 본건 유전자 DNA 가 삽입된 재조합 벡터이면 특별히 제한되지 않고, 본 발명의 재조합 벡터는 본건 유전자 DNA 를 발현 벡터에 적절히 도입함으로써 구축할 수 있다. 예를 들어, 본건 유전자 DNA 를 적당한 프로모터의 하류에 연결한 구조물을 바람직하게 예시할 수 있다. 발현 벡터로서는, 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능한 것이나, 혹은 숙주 세포의 염색체 중에 삽입 가능한 것이 바람직하고, 또한 본 발명의 유전자의 발현에 관여하는 프로모터, 터미네이터 등의 제어 배열 및 전사 제어 인자의 유전자를 포함하고 있는 것을 바람직하게 사용할 수 있다.

세균용의 발현 벡터로서는, 예를 들어 pUC118 (타카라 주조사 제조), pUC19〔Gene, 33, 103(1985)〕 등의 pUC 계통이나 pGEMEX-1 (Promega사 제조) 등의 pGEM 계통, pKK223-2 (Pharmacia 사 제조), pBIuescriptⅡ SK(+), pBIueschptⅡ SK(-) (Stratagene 사 제조) 등의 공지 또는 시판 중인 것을 예시할 수 있다.

또한, 세균용의 프로모터로서는, 예를 들어 T7 파지 프로모터, trp 프로모터 (P trp), lac 프로모터 (P lac), recA 프로모터, λPL 프로모터, λPR 프로모터, lpp 프로모터, PSE 프로모터, SP01 프로모터, SP02 프로모터, penP 프로모터 등을 들 수 있다.

식물 세포용의 발현 벡터로서는, 예를 들어 pIG121-Hm〔Plant Cell Report, 15, 809-814(1995)〕, pBI121〔EMBO J. 6, 3901-3907(1987)〕, pLAN411 이나 pLAN421 (Plant Cell Reports 10(1991) 286-290) 을 예시할 수 있다. 또한, 식물용의 프로모터로서는, 예를 들어 컬리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Mol. Gen. Genet (1990) 220, 389-392) 등을 들 수 있다. 또한, 옥수수 유래 알코올 탈수소 효소의 프로모터 (Maydica 35(1990) 353-357), 애기장대 유래 IRE 유전자의 프로모터 (일본 공개특허공보 2000-270873호) 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 형질 전환체로서는, 상기 본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질 전환체이면 특별히 제한되지 않고, 숙주로서는, 세균 등의 미생물이나, 식물, 동물 등을 들 수 있지만, 미생물이나 식물이 바람직하다. 세균으로서, 구체적으로는, 예를 들어 에쉐리키아속 세균, 슈도노카르디아속 세균, 스트렙토마이세스속 세균, 바실루스속 세균, 스트렙토코커스속 세균, 스타필로코커스속 세균 등을 들 수 있다. 또한, 식물로서, 구체적으로는, 애기장대, 담배, 옥수수, 벼, 보리류 (소맥, 대맥 등), 감자류 (감자 등) 등을 들 수 있다.

상기 본 발명의 재조합 벡터를 숙주 미생물에 도입하는 방법으로서는, 몰레큘러 클로닝 제 2 판 등 많은 표준적인 실험실 매뉴얼에 기재되어 있는 방법, 예를 들어 일렉트로포레이션, 형질 도입, 형질 전환 등에 의해 실시할 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 재조합 벡터를 식물에 도입하는 방법으로서는, 파티클 건법, 일렉트로포레이션법, 애그로박테리움법 등을 들 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터가 도입된 형질 전환체, 바람직하게는 형질 전환 식물은 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖고 있다고 생각된다. 여기서, 「아시플루오르펜에 대한 내성을 갖고 있는 형질 전환체」 란, 본 발명의 재조합 벡터를 도입하기 전에 비해 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상된 형질 전환체를 의미한다. 그 형질 전환체의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되었는지 여부는, 아시플루오르펜의, 그 형질 전환체에 대한 48 시간 후의 LC50 치가 그 재조합 벡터를 도입하기 전에 비해, 그 재조합 벡터를 도입한 후에 향상되었는지 여부를 확인함으로써 조사할 수 있다. 또한, 특히 생물이 식물일 때에는, 예를 들어 특정량의 아시플루오르펜을 식물의 재배 토양에 시용한 경우에, 상기 재조합 벡터를 식물 중에서 적당히 발현시키기 전의 식물에 비해, 상기 재조합 벡터를 식물 중에서 적당히 발현시킨 식물이 황화, 갈변 혹은 고화되는 정도가 저감하는 것을 확인하거나, 동일한 정도의 황화, 갈변 혹은 고화를 일으키게 하는 데 필요한 아시플루오르펜의 단위 면적 당의 시용량이 상기 재조합 벡터를 식물 중에서 적당히 발현시키기 전의 식물에 비해, 상기 재조합 벡터를 식물 중에서 적당히 발현시킨 식물에 있어서 증가하는 것을 확인하는 등에 의해, 그 식물의 아시플루오르펜에 대한 내성이 향상되었는지 여부를 조사할 수 있다. 또한, 아시플루오르펜에 대한 내성의 향상의 정도는 특별히 제한되지 않지만, 아시플루오르펜의, 그 생물에 대한 48 시간 후의 LC50 치, 또는 동일한 정도의 황화, 갈변 혹은 고화를 일으키게 하는 데 필요한 아시플루오르펜의 단위 면적 당의 시용량이 그 생물에 그 재조합 벡터를 도입하기 전에 비해 1.1 배 이상으로 향상되는 것이 바람직하고, 1.5 배 이상으로 향상되는 것이 보다 바람직하고, 2 배 이상으로 향상되는 것이 더욱 바람직하고, 3 배 이상으로 향상되는 것이 가장 바람직하다.

예를 들어, 본 발명의 형질 전환체를 적당한 배지에서 배양함으로써, 본건 단백질을 배양물 중에 생성 축적시키고, 또한 그 배양물로부터 본건 단백질을 채취함으로써, 본건 단백질을 대량으로 제조하는 것이 가능하다. 또한, 형질 전환 식물의 경우, 농약·제초제로서의 아시플루오르펜을 산포했을 때, 재배 목적의 형질 전환 식물은 생존하지만, 아시플루오르펜 감수성의 잡초는 사멸하여, 선택적으로 재배 목적의 형질 전환 식물을 육성할 수 있다.

본 발명의 형질 전환 식물은 광합성능이 향상되어 있지 않아도 되지만, 광합성능이 향상되어 있는 것이 바람직하고, 아시플루오르펜 존재하에서의 광합성능이 향상되어 있는 것이 보다 바람직하다. 본 발명의 형질 전환 식물은 프로토포르피리노겐옥시다아제가 많이 발현되므로 광합성능이 향상되는 것을 기대할 수 있다. 광합성능이 향상되어 있는지 여부는 본 발명의 재조합 벡터를 도입하기 전의 숙주 식물의 광합성능과, 도입 후의 형질 전환 식물의 광합성능을 비교함으로써 확인할 수 있다. 여기서, 광합성능이 향상되어 있는지 여부는 광합성 증산 측정 장치에 의한 측정치로부터 산출된 광합성 속도를 비교하거나, 일정 기간 동일 조건으로 배양한 후의 식물체의 건조 중량을 비교하는 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 형질 전환체는 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해 활성능의 평가 방법에 사용할 수 있다. 그 평가 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 (1) 그 형질 전환체의 숙주를 피검물질 존재하에서 배양하여 생육 곡선을 기록하고; 2) 그 형질 전환체를 (1) 과 동일한 피검물질 존재하에서 배양하여 생육 곡선을 기록하고; 3) 단계 (1) 과 단계 (2) 에서 기록한 생육 곡선을 비교하는 것을 포함하는 평가 방법을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 형질 전환체는 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제의 스크리닝 방법에도 사용할 수 있다. 그 스크리닝 방법으로서는, 예를 들어 상기의 평가 방법과 동일한 방법을 들 수 있다.

또한, 아시플루오르펜은 디페닐에테르계 제초제의 1 종이다. 본건 단백질은 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고 있으므로, 작용기작이 유사한 다른 디페닐에테르계 제초제에 대한 내성을 그 생물에 부여하는 활성에 대해서도 갖고 있다고 생각된다. 동일한 것이, 본건 프로토포르피리노겐옥시다아제 및 본 발명의 형질 전환체에 대해서도 적용된다고 생각된다.

다음으로, 본 발명의 특정 생물 (예를 들어, 남조류) 에 있어서의 소정의 기능을 갖는 단백질 (예를 들어, 프로토포르피리노겐옥시다아제) 을 코드하는 유전자의 단리 방법에 대하여 설명한다. 이 유전자의 단리 방법은 이하의 1) ∼ 5) 의 공정을 포함하고, 이미 알려진 단백질 (예를 들어, 애기장대 유래의 프로토포르피리노겐옥시다아제) 과 상동인 다른 생물종 유래의 단백질 (예를 들어, 남조류 유래의 프로토포르피리노겐옥시다아제) 을 다른 생물종의 유전자 데이터 베이스에서는 발견할 수 없는 경우의 유전자의 단리 수법으로서 특히 유효하다.

1) 특정 생물 이외의 다른 생물로부터 소정의 기능을 상보하는 단백질을 코드하는 유전자를 특정 생물에 도입하여 형질 전환체를 제작하는 공정

2) 형질 전환체의 유전자를 랜덤하게 파괴하여 형질 전환체의 변이주를 제작하는 공정

3) 소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하고, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제를 이용하거나, 혹은 배양 조건을 변화시킴으로써, 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 파괴된 변이주를 선발하는 공정

4) 파괴된 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 특정하는 공정

5) 파괴된 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 공정

상기 변이 처리로서, 에틸메탄술포네이트 (EMS), N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG), 2,6-디아미노퓨린 (DAP) 등의 약제를 이용하여 세포를 처리하는 변이 처리나, 자외선을 이용하여 세포를 처리하는 변이 처리를 들 수도 있지만, 유전자 레벨의 변이를 도입할 수 있는 트랜스포솜을 사용하는 변이 처리를 바람직하게 예시할 수 있다. 트랜스포솜은 트랜스포존과 트랜스포제스의 복합체로서, 많은 미생물에 유전자 레벨의 변이를 용이하게 도입할 수 있는 것이다 (Hoffman, L.M., Jendrisak, J.J., Meis, R.J., Coryshin, I.Y. and Rezhikof, S.W. Genetica, 108, 19-24(2000)). 예를 들어, 트랜스포솜을 사용하는 방법으로서, EZ::TN^TM〈KAN-2〉Tnp Transposome (EPICENTRE 사 제조) 등을 사용하는 방법이 알려져 있다.

트랜스포존을 사용하는 돌연변이 유발법은 유전자 해석의 강력한 툴로서 당기술 분야에서 공지되어 있다. 유전자 파괴주는 예를 들어 트랜스포존에 의해 도입된 특정한 항생 물질에 대한 내성 마커 등에 의해 선발할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 유전자 파괴주에 대하여 또한, 소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하고, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제를 이용하거나, 혹은 배양 조건을 변화시켜 스크리닝함으로써, 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 트랜스포존의 도입에 의해 파괴된 변이주를 선발할 수 있다. 이 트랜스포존에 인접하는 뉴클레오티드 배열은, 예를 들어 체인 터미네이션법 (Sanger F.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75:5463-5467(1977)) 에 의해 결정할 수 있다. 이와 같이 트랜스포존 태그의 삽입 위치를 해석함으로써, 파괴된 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 특정할 수 있다.

상기 「소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하고, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제」 로서는, 애기장대 유래의 프로토포르피리노겐옥시다아제에 작용하고, 남조류 유래의 프로트포르프리노겐옥시다아제에 작용하지 않는 아시플루오르펜 (디페닐에테르계), 피라플루펜에틸 (페닐피라졸계), 플루미옥사진 (디카르복시이미드계) 을 바람직하게 들 수 있다.

그런데, 헴과 클로로필은 공통된 전구체인 δ-아미노레블린산 (ALA) 으로부터 합성된다. 식물이나 대장균 등에서는 ALA 는 1) 글루타민산에 글루타밀-tRNA 신타제가 작용하여 글루타밀 tRNA 가 생성되는 단계, 2) 생성된 글루타밀 tRNA 에 글루타밀 tRNA 리덕타제가 작용하여 글루타민산 1-세미알데히드가 생성되는 단계, 3) 생성된 글루타민산 1-세미알데히드에 글루타민산 1-세미알데히드아미놈타제를 함유하는 3 단계의 반응 "C5형" 으로 합성되지만, 동물이나 애그로박테리아속 세균에서는 숙시닐 CoA 와 글리신에 ALA 신타제가 작용하여 ALA 가 생성되는 1 단계의 반응 "C4형" 으로 합성된다. 상기와 같이, 애그로박테리아속 세균은 "C4형" 으로 ALA 를 합성하고, 그 효소 ALA 신타제의 존재 자체는 이미 알려져 있지만, 그 유전자가 동정되어 있지 않은 경우, 식물 유래의 글루타밀-tRNA 신타제, 글루타밀-tRNA 리덕타제 및 글루타민산 1-세미알데히드아미노무타제를 코드하는 유전자를 애그로박테리아속 세균에 코인펙션하고, 형질 전환 애그로박테리아속 세균의 유전자를 트랜스포존 등에 의해 랜덤하게 파괴하여 변이주를 제작하고, 그 변이주 중에서, 글루타민산 1-세미알데히드아미놈타제 저해제인 갸바쿨린의 비존재하에서 생육하고, 갸바쿨린의 존재하에서 사멸하는 변이주를 선발하여, 당해 선발한 변이주의 트랜스포존 태그의 삽입 위치를 해석함으로써, 애그로박테리아속 세균 유래의 ALA 신타제 유전자를 동정할 수 있다. 따라서, 상기 「소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하고, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제」 로서, 식물이나 대장균 유래의 글루타민산 1-세미알데히드아미놈타제에 작용하고, 동물이나 애그로박테리아속 세균 유래의 δ-아미노레블린산 (ALA) 신타제에 작용하지 않는 갸바쿨린를 들 수 있다.

또한, 배양 조건을 변화시킴으로써, 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 파괴된 변이주를 선발하는 방법으로서는, 예를 들어 온도 조건에 의해 선발하는 경우에는, 유전자 파괴주를 통상적인 배양 온도와 고온 (혹은 저온) 에서 배양하여 생육에 차이가 인정되는 변이주를 선발하는 방법이나, 예를 들어 광 조건에 의해 선발하는 경우에는, 유전자 파괴주를 통상적인 광 조건과 강광하 (혹은 약광하) 에서 배양하여 생육에 차이가 인정되는 변이주를 선발하는 방법이나, 예를 들어, pH 조건에 의해 선발하는 경우에는, 유전자 파괴주를 통상적인 pH 조건과 고pH (혹은 저 pH) 조건하에서 배양하여 생육에 차이가 인정되는 변이주를 선발하는 방법 등을 예시할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

(남조류에 대한 애기장대 유래 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자의 도 입)

애기장대의 로제트잎으로부터 RNeasy RNA extraction kit (Qiagen 사 제조) 를 이용하여 전체 RNA 를 추출하였다. 얻어진 전체 RNA 로부터 폴리(A)+mRNA 를 통상적인 방법에 의해 정제하였다. 얻어진 폴리(A)+mRNA 를 주형으로 하고, ReverTra-Plus-Kit (TOYOBO 사 제조) 를 이용하여 cDNA 를 합성하였다. 합성한 cDNA 를 주형으로 하고, 제한 효소 AseI 부위를 갖는 프라이머 ATHPPOX.Aself (배열 번호 3) 및 프라이머 ATHPPOX.r (배열 번호 4) 그리고 TaKaRaLA Taq 폴리머라제 (Takara 사 제조) 를 이용하여, 애기장대의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 (1.6kbp) 를 PCR 로 증폭시킨 후, 그 PCR 산물을 AseI 로 절단하였다. PCR 은 변성 (94℃, 30 초), 어닐링 (52℃, 45 초), 신장 (72℃, 120 초) 을 28 사이클 실시하였다.

벡터는 남조류에 대한 형질 전환에 이용할 수 있고, 카나마이신 내성을 갖는 pFS10 을 사용한 [Jansson, et al. Methods Enzymol (1998) 297: pp166]. 이 pFS10 벡터를 제한 효소 NdeI 와 HincⅡ 로 절단하고, 전술한 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자의 PCR 산물과 연결하여 재조합 벡터를 제작하였다. 이 재조합 벡터를 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고, 그 배양물로부터 플라스미드를 정제하였다. 후의 공정인 트랜스포존을 사용한 변이원 처리에서는 카나마이신 내성을 선택 마커로서 이용한다. 그러기 위해 카나마이신 내성 유전자를 제거하고, 새롭게 다른 항생 물질 내 성 유전자 (클로람페니콜 내성 유전자) 를 도입할 필요가 있다.

pFS10 벡터를 주형으로 하고, XbaI 부위를 갖는 프라이머 Chloram.r (배열 번호 5) 과 프라이머 SPE2Xbal.r (배열 번호 6) 그리고 Pyrobest Taq 폴리머라제 (Takara 사 제조) 를 이용하여 1 차 PCR 을 실시하였다. PCR 은 변성 (98℃, 10 초), 어닐링 (55℃, 45 초), 신장 (72℃, 30 초) 을 25 사이클 실시하였다. 이 PCR 에 의해 약 500bp 의 PCR 산물을 얻을 수 있었다. 다음으로, 클로람페니콜 내성 유전자를 주형으로 하고, 앞서 얻어진 PCR 산물 및 프라이머 Chloram. Xbal.f (배열 번호 7) 그리고 Pyrobest Taq 폴리머라제 (Takara 사 제조) 를 이용하여 2 차 PCR 을 실시하였다. PCR 은 변성 (98℃, 10 초), 어닐링 (50℃, 45 초), 신장 (72℃, 90 초) 을 25 사이클 실시하였다. 그 PCR 에 의해 얻어진 클로람페니콜 내성 유전자를 함유하는 PCR 산물을 제한 효소 XbaI 로 절단하였다.

한편, 애기장대의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자와 pFS10 벡터를 연결한 전술한 재조합 벡터도 제한 효소 XbaI 로 절단하고, 카나마이신 내성 유전자를 제거 후, 전술한 XbaI 로 절단한 클로람페니콜 내성 유전자 단편과 연결하여 새로운 재조합 벡터를 얻었다. 이 재조합 벡터를 전술과 동일한 방법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 클로람페니콜을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를 클로람페니콜을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고, 그 배양물로부터 플라스미드를 정제하였다. 이 플라스미드로 시네코시스티스 PCC6803 을 형질 전환하고, 애기장대 유래 프로토포르피리노겐옥시다아제를 발현시킨 시네코시스티스 (이하 「AT 주」 라고 부르는 경우가 있다) 를 제작하였다. 또한, 시네코시스티스 PCC6803 의 형질 전환의 방법은 문헌 [Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167: pp766] 의 방법에 따랐다.

실시예 2

(트랜스포존을 이용한 남조류 변이체의 제작)

시네코시스티스 PCC6803 으로부터 추출한 게놈을 Tsp5091 로 한정 분해하고, 람다 잡 Ⅱ 벡터 키트 (Stratagene 사 제조) 를 이용하여, 게놈 플라스미드 라이브러리를 제작하였다. EZ::TNTM 〈KAN-2〉Insertion Kit (Epicentre 사 제조) 를 이용하여, 게놈 플라스미드 라이브러리에 대하여 트랜스포존을 in vitro 로 삽입하였다. 트랜스포존의 삽입 방법은 Epicentre 사가 개시하는 매뉴얼에 따랐다. 이 트랜스포존 태그가 삽입된 시네코시스티스 게놈 플라스미드 라이브라리를 이용하여, AT 주에 대하여 상동 재조합에 의한 형질 전환을 실시하여, 애기장대 유래 프로토포르피리노겐옥시다아제를 발현시킨 시네코시스티스 변이체를 제작하였다.

실시예 3

(남조류 프로토포르피리노겐옥시다아제 결손주의 스크리닝)

아시플루오르펜에 대한 감수성을 선택 마커로서 이용하여, 실시예 2 에서 제작한 시네코시스티스 변이체 중에서, 남조류 프로토포르피리노겐옥시다아제 결손주의 스크리닝을 실시하였다. 구체적으로는, 이하와 같은 순서로 행하였다.

아시플루오르펜을 최종 농도 500μM 가 되도록 함유하는 BG11 한천 배지에, 실시예 2 에서 제작한 시네코시스티스 변이체를 접종하고, 백색 형광등에 의한 연속 광 조사 (광 강도 30μmol s-lm-2) 하, 30℃ 에서 2 주간, 정치(靜置) 배양을 실시하였다. 또한, 동일한 배양을 아시플루오르펜을 함유하지 않는 BG11 한천 배지를 이용하여 실시하였다. 이들 배양의 결과에 근거하여, 아시플루오르펜 비존재하에서는 생육하지만, 아시플루오르펜 존재하에서는 사멸하는 변이체로서 9 주가 선발되었다. 이 9 주 중, 아시플루오르펜 존재하에서의 생육의 저해 정도가 가장 높았던 균주를 3216 주라 명명하고, 이하에 설명하는 바와 같이, 트랜스포존 태그의 삽입 위치를 해석한 결과, 단백질 slr1790 의 전사 조절 영역으로 추정되는 위치에 트랜스포존 태그가 삽입되어 있었다.

(남조류 변이체의 유전자 해석)

트랜스포존 태그 삽입 위치를 확인하는 방법으로서 2 패턴을 상정하였다.

(1) 사용한 트랜스포존은 태그로서 카나마이신 내성 유전자가 도입되어 있으므로, 이 항생 물질 내성을 이용하여 선발한다.

구체적으로는, 변이주부터 DNA 를 취득하고, 카나마이신 내성 유전자에 포함되어 있지 않은 제한 효소 배열을 이용하여 DNA 를 단편화한다. DNA 를 절단한 동일한 제한 효소로 카나마이신 내성 유전자를 갖지 않는 벡터를 절단한다. 그것들을 연결시켜 대장균으로 형질 전환하고, 카나마이신을 함유하는 배지 상에서 생육해 온 클론에 대하여 플라스미드를 정제하여, 시퀀스를 해석한다.

(2) inverse PCR 법을 사용한다. (1) 과 동일하게 변이주부터 DNA 를 취득하고, 트랜스포존 태그에 포함되어 있지 않은 제한 효소 배열을 이용하여 단편화한다. 이것을 셀프 라이게이션시키고 (고리형화시킨다), 트랜스포존 태그의 외측을 향하는 프라이머를 설계하여 PCR 반응을 실시하고, 증폭된 PCR 산물에 대하여 시퀀 스를 해석한다.

우선은 (1) 에 나타낸 항생 물질 내성을 이용한 방법으로 검토하였다.

(1) 카나마이신 내성을 이용한 검토

<남조류 변이체 DNA 추출>

남조류 변이체 (3216 주) 를 BG11 액체 배지에서 30℃, 명소(明所)에서 12 일간 배양하였다. 배양 종료 후, 집균하여 SDS 법을 이용하여 추출한 결과 약 800㎍ 의 남조류 변이체 DNA 를 얻었다.

<제한 효소에 의한 절단>

제한 효소로서는 EcoR1, Sac1 을 각각 이용하여 남조류 변이체 DNA 및 벡터 (pUC118) 를 절단하였다. 제한 효소 처리 종료 후, 단편화한 남조류 변이체 DNA 는 스핀 칼럼으로 정제하였다. 벡터에 관해서는 셀프 라이게이션을 방지하기 위하여 알칼리 포스파타아제 처리를 실시하였다.

<라이게이션>

데이터 베이스로부터 상기 3 종류의 제한 효소로 절단하면 얻어지는 평균 단편 길이는 EcoR1 에서는 6kb, Sac1 에서는 10kb 였다. 평균 단편 길이를 참고로 인서트/벡터의 몰비를 3/1 과 9/1 로 조정하고 12℃, 16 시간에 라이게이션하였다.

<대장균으로의 형질 전환>

라이게이션액의 일부를 이용하여 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 그 결과, 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서는 콜로니는 관찰되지 않았다.

또한, 라이게이션시의 인서트/벡터의 혼합 비율을 인서트 대과잉으로 해도 동일한 결과였다. 항생 물질 내성을 이용한 선발 방법은 이론적으로는 당연히 가능한 것이지만, 금회의 경우, 예를 들어 인서트/벡터비의 조건이 맞지 않았던 것 등의 문제가 생각된다. 조건 검토의 여지는 있었지만, (2) 에서 나타낸 inverse PCR 법으로 검토하기로 하였다.

(2) inverse PCR 법을 이용한 검토

표현형이 강했던 3216 주에 대하여 검토하였다. DNA 취득은 상기와 동일한 방법으로 실시하고, 제한 효소로서는 EcoR1, Kpn1 을 사용하였다. 제한 효소 처리 종료 후, DNA 단편을 스핀 칼럼으로 정제하였다.

<셀프 라이게이션>

스핀 칼럼으로 정제한 DNA 단편을 이용하여 12℃, 16 시간에 셀프 라이게이션시켰다.

<1st 및 2nd PCR>

inverse PCR 법의 경우, 비특이적인 밴드를 증폭시켜 버릴 우려가 있었으므로, PCR 반응은 2 단계로 나누어 실시하기로 하였다.

프라이머는 트랜스포존 태그의 외측을 향하는 프라이머를 2 조(組) 설계하였다.

또한, 2nd PCR 의 프라이머는 키트 부속의 시퀀스 프라이머를 사용하였다.

(1st PCR 용 프라이머)

KAN-2-fr (배열 번호 17)

KAN-2-rev (배열 번호 18)

(2nd PCR 용 프라이머)

KAN-2FP1 (배열 번호 19)

KAN-2RP1 (배열 번호 20)

셀프 라이게이션시킨 게놈 단편을 템플릿으로 하여 1st PCR 을 실시하였다. 1st PCR 조건은 98℃ 10 초 (변성), 55℃ 30 초 (어닐링), 72℃ 7 분 (신장) 을 30 사이클로 EX taq polymerase (Takara 사 제조) 를 사용하고, 프라이머 농도는 최종 각 0.5μM 으로 실시하였다.

템플릿의 최종 농도는 상기 라이게이션액 50 배 희석, 250 배 희석, 1250 배 희석의 3 단계에서 검토하였다. PCR 산물을 5㎕ 취하여, 아가로스 겔 전기 영동으로 확인하였다. 전기 영동의 결과, EcoR1 로 절단한 템플릿을 사용한 경우에만 7kb 부근에 특이적인 밴드의 증폭이 관찰되었다. 프라이머 제거를 위하여, 1st PCR 산물을 스핀 칼럼으로 정제하여, 2nd PCR 의 템플릿으로 하였다.

2nd PCR 조건은 98℃ 10 초 (변성), 60℃ 30 초 (어닐링), 72℃ 5 분 (신장) 을 3 사이클 실시한 후, 98℃ 10 초 (변성), 58℃ 30 초 (어닐링), 72℃ 5 분 (신장) 을 20 사이클로 EX taq polymerase (Takara 사 제조) 를 사용하여, 프라이머 농도는 최종 각 0.5μM 으로 실시하였다.

PCR 산물을 5㎕ 취하여, 아가로스 겔 전기 영동으로 확인하였다.

그 결과, 프라이머 설계대로, 1st PCR 산물로부터 수백 bp 낮은 위치에 밴드의 증폭은 관찰되었지만, 동시에 비특이적인 밴드의 증폭도 관찰되었다.

2nd PCR 의 조건 검토를 실시했지만, 비특이적인 밴드의 증폭을 억제할 수 없었으므로 1st PCR 에서 특이적으로 증폭된 7kb 부근의 밴드에 대하여 겔 회수를 실시하였다. 이것을 인서트로서 TA 클로닝 (pGEM-T Easy 벡터 사용, Promega 사 제조) 을 실시하고, 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 플레이트 상에 나타난 콜로니를 4 개 선발하여, 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고, 미니 프리퍼레이션법으로 플라스미드의 정제를 실시하였다. pGEM-T Easy 벡터는 EcoR1 처리에 의해 인서트가 잘려나가므로, 정제한 플라스미드를 EcoR1 처리하여, 아가로스 겔 전기 영동으로 확인하였다.

전기 영동의 결과, 플라스미드 1 및 2 는 5kb, 3kb (벡터), 1.8kb 부근에 밴드가 관찰되었다. 인서트 유래의 밴드의 합계 사이즈는 7kb 정도로서, 목적의 클론인 것으로 판단하였다. 플라스미드 1 및 2 에 대하여 EcoR1 처리에서 벡터 유래도 포함하여 절단된 밴드가 3 개 관찰된 것은, 최초의 라이게이션의 단계에서 고리형이 아니라, 콘카테머를 형성했을 가능성이 생각된다. 시퀀스 해석에는 문제가 없으므로 플라스미드 1 에 대하여 시퀀스 반응을 실시하였다.

<시퀀스>

플라스미드 1 에 대하여 디데옥시법에 의한 사이클 시퀀스로 염기 배열을 해석하였다. 시퀀스 프라이머로서는 2nd PCR 에서 사용한 KAN-2FPl 및 KAN-2RPl 을 사용하였다. 사용한 시퀀스 프라이머는 트랜스포존 태그의 DNA 영역과 어닐하기 때문에, 얻어지는 시퀀스 데이터의 시작 부분은 트랜스포존 태그의 DNA 영역이 된다. inverted repeat 시퀀스는 트랜스포존 삽입 클론의 타겟 DNA 와 트랜스포존 태그의 접점에서 발견되는 19bp Transposon Mosaic End Transposase 인식 배열로서, 이 시퀀스는 타겟과 트랜스포존 태그를 식별하는 표지로 할 수 있다.

또한, Transposase 에 의해 촉매되는 트랜스포존 삽입은, 삽입한 트랜스포존의 측면을 지키기 위하여 9-bp 의 타겟 사이트 중복 배열을 생성한다.

이들을 참고로 하여 얻어진 시퀀스를 해석하면 트랜스포존 태그는 남조류 게놈의 256677 번째의 T 에서 256685 번째의 G 사이 (Mosaic end 배열 및 9-bp 중복 배열 확인) 에 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 이 위치는 ORF 영역에는 포함되어 있지 않지만, 하류에 있는 추정 단백질 slr1790 (256698-257279, 193aa) 의 전사 조절 영역인 것으로 생각되었다.

아시플루오르펜 비존재하에서는 성육하지만, 아시플루오르펜 존재하에서는 사멸하는 9 변이주 중, 3216 주 이외의 8 주에 대해서도 동일한 해석을 실시한 결과, 어느 주도 3216 주와 동일한 유전자 (slr1790) 에 트랜스포존 태그가 삽입되어 있었다.

실시예 4

(추정 단백질 slr1790 의 유전자 파괴주의 제작)

slr1790 유전자 (시네코시스티스 게놈 256698 로부터 257279 의 600bp) 가 프로토포르피리노겐옥시다아제를 코드하고 있는지 여부를 확인하기 위하여, slr1790 의 코드 영역에 카나마이신 내성 유전자를 삽입한 재조합 벡터를 이용하 여, 시네코시스티스 PCC6803 의 slr1790 유전자에 대하여 유전자 파괴를 실시하였다. 남조류의 형질 전환은 상동 재조합으로 실시하므로, slr1790 유전자의 상류 700bp 및 하류 600bp 의 배열 (시네코시스티스 게놈 255999 로부터 257920 의 1.9kbp) 을 기초로 프라이머를 설계하였다. 시네코시스티스 PCC6803 으로부터 추출한 DNA 를 주형으로 하고, 그들의 프라이머 Slr1790 km EcoR1 f (배열 번호 8) 및 프라이머 Slr1790 km Hind3 r (배열 번호 9), 그리고 TaKaRa EX Taq 폴리머라제 (Takara 사 제조) 를 사용한 PCR 에 의해, slr1790 유전자의 상류 700bp 및 하류 600bp 의 배열을 포함하는 배열을 증폭시켜 PCR 산물을 얻었다. PCR 은 변성 (98℃, 10 초), 어닐링 (55℃, 30 초), 신장 (72℃, 120 초) 을 28 사이클 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 pGEM-T Easy 벡터 (Promega 사 제조) 에 연결하였다.

slr1790 유전자를 포함하는 배열이 연결된 벡터를 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를, 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고, 그 배양물로부터 플라스미드 (pslr1790S) 를 정제하였다. 다음으로, 트랜스포존 태그에 포함되는 카나마이신 내성 유전자 (1.3kbp) 를 주형으로 하고, Nhe1 부위를 갖는 프라이머 Km Nhe1 f (배열 번호 10) 및 프라이머 km Nhe1 r (배열 번호 11) 그리고 TaKaRa EX Taq 폴리머라제 (Takara 사 제조) 를 사용한 PCR 에 의해, 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 PCR 산물을 증폭시켰다. PCR 은 변성 (98℃, 10 초), 어닐링 (58℃, 30 초), 신장 (72℃, 80 초) 을 28 사이클 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 Nhe1 로 절단하고, 그것을 벡터내의 slr1790 유전자 중류의 Nhe1 부위에 연 결하였다. 이것을 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를, 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고, 그 배양물로부터 플라스미드 (pslr1790SKM) 를 정제하였다. slr1790 유전자 파괴용의 이 콘스트럭트를 도 3 에 나타낸다. 시네코시스티스 PCC6803 을 이 pslr1790SKM 으로 형질 전환하고, 그 형질 전환체를, 카나마이신을 함유하는 BG11 한천 배지에서 배양하여, slr1790 유전자 파괴주를 선발하였다. 또한, 시네코시스티스 PCC6803 의 형질 전환의 방법은 문헌 [Williams JG. Methods Enzymol (1998) 167: pp766] 의 방법에 따랐다.

실시예 5

(추정 단백질 slr1790 의 유전자 파괴주의 해석)

프로토포르피리노겐옥시다아제가 파괴된 경우, 기질인 프로토포르피리노겐 Ⅸ 가 축적될 것이 예상되지만, 프로토포르피리노겐 Ⅸ 는 매우 불안정하기 때문에, 추출 과정에 있어서 공기 중의 산소와 반응하여 용이하게 프로토포르피린 Ⅸ 에 산화되기 때문에, 공기 중에서 추출 조작을 실시한 후의 프로토포르피린 Ⅸ 의 양을 측정함으로써, 프로토포르피리노겐옥시다아제가 파괴되었는지 여부를 판정할 수 있다. slr1790 의 유전자 파괴주에 대한 프로토포르피린 Ⅸ 량의 측정은 이하와 같은 방법으로 실시하였다.

실시예 4 에서 얻어진 slr1790 유전자 파괴주를 시험관을 이용하여, 백색 형광 등에 의한 연속 광 조사 (광 강도 30μmol s^-lm^-2) 하, 30℃ 에서 1 주간, 통기 한 BG11 액체 배지 50㎖ 에서 배양하여 배양액을 얻었다. 얻어진 배양액으로부터, 90% 아세톤을 이용하여, 프로토포르피린 Ⅸ 를 함유하는 색소를 추출하여 색소 추출액을 얻었다. 이 색소 추출액을 HPLC 에 세트하고, 1.2㎖/분의 플로우 레이트, 칼럼 오븐 40℃ 의 조건하, 옥틸실리카 칼럼 (Waters Symmetry C8 (150×4.6㎜)) 및 메탄올 (용출제) 을 이용하여 HPLC 분석을 실시하였다 (펌프 LC-10ATVP 및 오토산프라 SIL-10ADVP 는 (주)시마즈 제작소사 제조). 프로토포르피린 Ⅸ 의 모니터링은 여기 파장 405㎚, 형광 파장 633㎚ 에서 실시하였다 (형광 검출기 RF-10AXL 은 (주)시마즈 제작소사 제조). 그 결과를 도 4 의 C) 에 나타낸다. 또한, slr1790 유전자 파괴주 대신, 그 유전자 파괴를 실시하지 않은 시네코시스티스 PCC6803 을 이용하여 동일한 해석을 실시한 결과를 도 4 의 B) 에 나타낸다. 또한, 프로토포르피린 Ⅸ 의 샘플의 크로마토그램을 도 4 의 A) 에 나타낸다.

도 4 의 결과로부터, slr1790 유전자 파괴주에서는, 그 유전자 파괴를 실시하지 않은 주에 비해, 20 배 이상의 프로토포르피린 Ⅸ 의 축적이 관찰되었다. 이것과, 남조류의 프로토포르피리노겐 Ⅸ 혹은 프로토포르피린 Ⅸ 의 대사에 관여하는 효소 중, 동정되어 있지 않은 것은 프로토포르피리노겐옥시다아제뿐인 것을 고려하면, slr1790 이 프로토포르피리노겐옥시다아제를 코드하고 있음이 분명해졌다. 또한, slr1790 은 이미 알려진 프로토포르피리노겐옥시다아제와의 상동성은 매우 낮다. slr1790 에 대한, 이미 알려진 프로토포르피리노겐옥시다아제의 아미노산 레벨에서의 상동성을 이하의 표 3 에 나타낸다.

실시예 6

(남조류 프로토포르피리노겐옥시다아제 slr1790 의 애기장대로의 도입)

식물용 발현 벡터로서 pBI121 을 사용하였다. pBI121 의 개략도를 도 5 에 나타낸다.

식물의 프로토포르피리노겐옥시다아제는 엽록체, 미토콘드리아에 존재하는 효소이지만, 금회는 slr1790 이 엽록체에서 발현하도록 애기장대 유래 클로로필 a 옥시게나아제 (CAO, Genbank accession BT002075) 의 엽록체 이행 시그널을 slr1790 유전자에 연결하여 도입하였다. 이행 시그널의 예측은 TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) 를 이용하였다. 구체적으로는 이하와 같은 순서로 행하였다.

pBI121 벡터 (14.8kbp) 를 제한 효소 BamH1 및 Sac1 을 이용하여 GUS 유전자 (1.9kbp) 를 제거하고, 나머지의 벡터 부분 (12.9kbp) 을 겔 회수로 정제하였다. 또한, CAO 유래의 엽록체 이행 시그널 (0.2kbp) 은, 실시예 1 에서 얻어진 애기장대 cDNA 를 주형으로 하고, 제한 효소 BamH1, Sac1 인식 부위를 각각 갖는 프라이머 BamSma CAO fr. (배열 번호 12) 과 Sac CAO rev. (배열 번호 13) 그리고 KOD-Plus-폴리머라제 (TOYOBO 사 제조) 를 이용하여 PCR 로 증폭시켰다. PCR 은 변성 (94℃, 15 초), 어닐링 (55℃, 30 초), 신장 (68℃, 15 초) 을 30 사이클 실시하였다.

이렇게 하여 얻은 PCR 산물을 암피실린 내성을 갖는 pTA2 벡터 (TOYOBO 사 제조, KOD-Plus-용 TA 클로닝 벡터, 2.9kbp) 로 연결 후, 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고 플라스미드 (pTACAO) 를 정제하였다. 플라스미드 pTACAO 를 제한 효소 BamH1 및 Sac1 을 이용하여 절단하여, CAO 유래의 엽록체 이행 시그널을 잘라내고, 겔 회수로 정제하였다. 이 정제한 CAO 유래의 엽록체 이행 시그널을 인서트로 하여, 앞서 GUS 유전자를 제거한 pBI121 벡터에 연결하였다. 이것을 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환 후, 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고 플라스미드 (pBICAO, 13.1kbp) 를 정제하였다. pBICAO 는 제한 효소 Sac1 로 절단하고, 셀프 라이게이션을 방지하기 위하여 CIP 처리 후, 겔 회수로 벡터 단편을 정제하였다.

다음으로 slr1790 유전자 (0.6kbp) 는 시네코시스티스로부터 추출한 게놈을 주형으로 하고, 제한 효소 Sac1 인식 부위를 갖는 프라이머, Sac slr1790fr. (배열 번호 14) 과 Sac slr1790 rev. (배열 번호 15) 그리고 KOD-Plus-폴리머라제 (TOYOBO 사 제조) 를 이용하여 PCR 로 증폭시켰다. PCR 은 변성 (94℃, 15 초), 어닐링 (55℃, 30 초), 신장 (68℃, 35 초) 을 30 사이클 실시하였다. 이렇게 하여 얻은 PCR 산물을 암피실린 내성을 갖는 pTA2 벡터에 연결 후, 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환하고, 암피실린을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고 플라스미드 (pTAslr1790Sac) 를 정제하였다. 플라스미드 pTAslr1790Sac 을 제한 효소 Sac1 을 이용하여 절단하여, slr1790 유전자를 잘라내고, 겔 회수로 정제하였다. 이 정제한 slr1790 유전자를 인서트로 하여, 앞서 제한 효소 Sac1 로 절단한 pBICAO 에 연결하였다. 이것을 히트 쇼크법으로 대장균 (JM109) 으로 형질 전환 후, 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에서 선발하였다. 나타난 콜로니를 카나마이신을 함유하는 LB 액체 배지에서 배양하고 플라스미드 (pBIslr1790, 13.6kbp) 를 정제하였다. pBIslr1790 의 개략도를 도 6 에 나타낸다.

다음으로 동결법으로 pBIslr1790 을 도입한 Agrobacterium tumefaciens C58 주를 이용하여, in planta 법으로 애기장대를 형질 전환하였다.

먼저, pBIslr1790 을 유지한 Agrobacterium tumefaciens C58 주의 균체 농도가 OD600=0.8-1.0 부근이 되도록 300㎖ 의 형질 전환 버퍼 (5% sucrose, 0.02% SilwetL-77) 에 현탁하였다. 다음으로, 화분에 심어진 봉오리진 애기장대의 지상부를 상기 현탁액에 30 초간 침지시키고, 그 후 각 화분을 비닐 봉지로 2 일간 덮었다. 비닐 봉지를 제거한 후, 다시 재배를 계속하여 종자를 얻었다. 재배는 그로쓰 챔버 (24 h 명(明), 온도 22℃, 광 강도 70μmols^- ^lm^-2) 내에서 실시하였다. 얻어진 종자를 살균하여, 35ppm 의 카나마이신, 0.6% 의 한천을 함유한 1/2 농도의 Murashige-Skoog 의 배지 [T. Murashige and F. Skoog Physiol. Plant (1962) 15: pp473] 에 파종하여, 형질 전환체를 얻었다 (slr 계). 이 형질 전환체를 흙에 이식하고, 그로쓰 챔버내에서 재배하여, 2 세대째의 종자를 얻었다.

실시예 7

(형질 전환체의 아시플루오르펜에 대한 내성 효과)

아시플루오르펜에 대한 내성 효과는 형질 전환체 2 세대째 중, 유전자 도입이 확인된 것에 대하여 아시플루오르펜에 대한 내성을 검토하였다.

유전자 도입의 유무에 대해서는 이하의 수법에 의해 확인하였다.

그로쓰 챔버내에서 키 1-2㎝ 정도까지 생육시킨 형질 전환 애기장대 slr 계로부터, 잎을 직경 2㎜ 정도 각각의 형질 전환체로부터 회수하여 게놈 DNA 를 추출하였다. 이 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 도입한 유전자의 N 말단 및 C 말단과 어닐하는 프라이머 AtCAO-tra-up (배열 번호 16) 와 Sac slr1790 rev. (배열 번호 15) 그리고 Taq DNA polymerase (SIGMA 사 제조) 를 이용하여 PCR 로 증폭시키고, 아가로스 겔 전기 영동으로 밴드의 유무를 확인하였다. PCR 은 변성 (95℃, 30 초), 어닐링 (55℃, 45 초), 신장 (72℃, 60 초) 을 40 사이클 실시하였다.

유전자 도입이 확인된 형질 전환체에 대하여, 아시플루오르펜에 대한 내성 효과를 검토하였다. 아시플루오르펜은 디메틸포름아미드 및 폴리옥시에틸렌소르비탄계 계면 활성제를 혼합, 용해시켜 유효 성분 4% 가 되도록 유제를 제조하였다. 이것을 아시플루오르펜 농도가 최종 10μM 이 되도록 물로 희석하고, 마이크로피펫을 이용하여, 그로쓰 챔버내에서 키 1-2㎝ 정도까지 생육시킨 애기장대 야생주 유전자 도입을 확인한 형질 전환 애기장대 slr 계의 잎면에 각각 5㎕ 적하 처리하였다.

조사는 약액 처리 7 일 후까지 계속해서 실시하고, 괴사의 정도를 육안으로 평가하였다 (0-5 의 6 단계 평가, 0 은 영향 없음). 처리 7 일 후의 결과를 표 4 에 나타내었다. 그 결과, 애기장대 야생주와 비교하여, slr1790 을 도입한 애기장대는 아시플루오르펜에 대한 내성을 확인할 수 있었다.

slr1790 도입 애기장대의 아시플루오르펜에 대한 내성 효과 (처리 7 일 후)
	아시플루오르펜 10μM 처리
애기장대 야생주	4
slr52	1
slr146	1

완전 고사를 5, 영향 없음을 0 으로 하여 0-5 의 6 단계에서 육안으로 평가하였다.

실시예 8

(프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제의 저해능 시험)

실시예 1 에서 얻어진 AT 주 및 실시예 4 의 방법으로 AT 주의 slr1790 유전자를 파괴한 ATΔslr1790 주를 사용하였다. 배지는 상기의 BG11 액체 배지를 사용하고, 유전자의 결락 및 복귀 변이를 억제하기 위하여, AT 주에는 프로토포르피리노겐옥시다아제와 동시에 클로람페니콜 내성 유전자도 도입되어 있으므로 클로람페니콜을, ATΔslr1790 주는 그 유전자 파괴시에 카나마이신 내성 유전자를 도입하고 있으므로 카나마이신을 각각 최종 25㎍/㎖ 가 되도록 첨가하였다. BG11 액체 배지에서 진탕 전 배양을 실시한 증식기의 AT 주, ATΔslr1790 주를 집균하고, 항생 물질을 첨가한 새로운 BG11 액체 배지에 A730 이 0.1 이 되도록 현탁하여 검토에 사용하였다.

피험 화합물의 원체를 DMSO 에 용해시키고, 각 웰에 최종 약제 처리 농도가 1.0×10^-4M 에서 1.0×10^-9.5M 이 되도록 첨가하였다 (최종 DMSO 농도 0.5%). 시험은 96 구멍 플레이트 1 웰 당 100㎕ 스케일로 실시하고, 배양 온도 30℃, 광 강도 1000lux 의 조건하에서 진탕 배양하였다. 시험 개시 6 일 후에 탁도를 측정하고, 용매 처리구와 비교하여 pI50 치를 산출하였다.

pI50 치=-log (50% 활성 저해 처리 농도 (M))

(제초 처리 활성)

200㎠ 의 단지에 토양을 충전하고, 표층에 개비름의 종자를 뿌리고, 가볍게 흙을 덮은 후, 키가 5 ∼ 10㎝ 가 될 때까지 온실내에서 생육시켰다. 각 피험 화합물의 물 희석액을 소정의 약량이 되도록, 1000 리터/ha 산포량 상당량으로 소형 분무기로 개비름의 경엽부에 산포하였다. 온실내에서 육성시키고, 처리 2 주일 후에 개비름의 제초 효과를 하기의 조사 기준에 따라 조사하여, 살초 지수로 나타내었다. 결과를 이하의 표에 나타낸다.

조사 기준
살초율	살초 지수
0%	0
20 ∼ 29%	2
40 ∼ 49%	4
60 ∼ 69%	6
80 ∼ 89%	8
100%	10
※ 1, 3, 5, 7, 9 의 수치는 각각 0 과 2, 2 와 4, 4 와 6, 6 과 8, 8 과 10 의 중간치를 나타낸다.

피험 화합물	pI50 치		제초 활성 (경엽 처리) (개비름 살초 지수, 16g ai/ha)
피험 화합물	AT 주	ATΔslr1790 주	제초 활성 (경엽 처리) (개비름 살초 지수, 16g ai/ha)
아시플루오르펜	4>	4.5	7
피라플루펜에틸	4>	6.6	10
플루미옥사진	4>	6.7	10
디쿼트	5.2	5	-

피험 화합물

프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제 아시플루오르펜 (디페닐에테르계) 피라플루펜에틸 (페닐피라졸계) 플루미옥사진 (디카르복시이미드계)

비(非)프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제 디쿼트

ATΔslr1790 주는 디페닐에테르계형 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제인 아시플루오르펜 이외의 제에도 감수성을 나타내고, 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제 전반적으로 저해 활성을 나타내었다. 또한, 각 피험 화합물의 ATΔslr1790 주에 대한 pI50 치의 경향은 각각의 경엽 처리 활성을 반영하는 것으로서, 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해 활성능의 평가에 유효하다고 할 수 있다.

실시예 9

(프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제에 특이적인 화합물 스크리닝법)

상기의 실시예로부터 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제는 AT 주에 감수성을 나타내지 않고, ATΔslr1790 주에는 감수성을 나타내었다. 한편, 비프로토포르피리노겐 저해제용 AT 주 및 ATΔslr1790 주의 양방에도 동일한 정도의 저해 활성을 나타내었다. 이와 같이 AT 주와 ATΔslr1790 주의 화합물에 대한 저해능을 비교함으로써, 각 피험 화합물의 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해능을 판정한다.

본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제는 이미 알려진 그 효소와 상당히 상이한 구조를 갖기 때문에, 신규한 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해 제초제의 선발로의 응용을 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로토포르피리노겐옥시다아제는 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해 제초제에 대한 내성을 갖는 광합성 식물의 육종 혹은 스트레스 환경 조건에 저항성을 갖는 식물의 육종으로의 응용을 기대할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자의 단리 방법에 의하면, 이미 알려진 단백질과 상동인 다른 생물종 유래의 단백질을 다른 생물종의 유전자 데이터 베이스에서는 발견할 수 없는 경우라도, 다른 생물종의 유전자를 단리할 수 있는 유효 수법을 제공할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Nippon Soda Co., Ltd. National Univirsity Corporation Hokkaido University <120> Protoporphyrinogen oxidase having resistance to Acifluorfen, and the gene thereof <130> 00F00753 <150> JP2005-278942 <151> 2005-09-26 <160> 20 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 582 <212> DNA <213> Synechocystis sp. PCC6803 <400> 1 atggcctact actggtttaa agccttccac ttgattggca ttgttgtttg gtttgctgga 60 ttattttatt tagtgcgtct ttttgtctat cacgccgagg cagaccagga gccggaacca 120 gctaaaacta tcctcaaaaa acagtatgag ttgatggaaa agcggcttta caacatcatc 180 actacccccg gcatggtagt tacggtggct atggcgatcg gtctcatttt cacagaaccc 240 gaaattctca aatccggctg gctccacatc aaactcacct ttgtggcgtt actgttgctt 300 taccatttct attgtggtcg ggtgatgaaa aagctagccc agggggaatc ccaatggagt 360 gggcaacagt tccgggcttt aaatgaggca ccgactattt tgctcgtggt gattgtccta 420 ctggcggtgt ttaagaataa tttgcccctg gatgcgacca cttggttaat tgtagctttg 480 gttattgcca tggctgcttc gattcaactc tacgctaaaa aacgtcgccg ggaccaagca 540 ctattaacgg aacagcaaaa agcggcttct gctcagaatt ag 582 <210> 2 <211> 193 <212> PRT <213> Synechocystis sp. PCC6803 <400> 2 Met Ala Tyr Tyr Trp Phe Lys Ala Phe His Leu Ile Gly Ile Val Val 1 5 10 15 Trp Phe Ala Gly Leu Phe Tyr Leu Val Arg Leu Phe Val Tyr His Ala 20 25 30 Glu Ala Asp Gln Glu Pro Glu Pro Ala Lys Thr Ile Leu Lys Lys Gln 35 40 45 Tyr Glu Leu Met Glu Lys Arg Leu Tyr Asn Ile Ile Thr Thr Pro Gly 50 55 60 Met Val Val Thr Val Ala Met Ala Ile Gly Leu Ile Phe Thr Glu Pro 65 70 75 80 Glu Ile Leu Lys Ser Gly Trp Leu His Ile Lys Leu Thr Phe Val Ala 85 90 95 Leu Leu Leu Leu Tyr His Phe Tyr Cys Gly Arg Val Met Lys Lys Leu 100 105 110 Ala Gln Gly Glu Ser Gln Trp Ser Gly Gln Gln Phe Arg Ala Leu Asn 115 120 125 Glu Ala Pro Thr Ile Leu Leu Val Val Ile Val Leu Leu Ala Val Phe 130 135 140 Lys Asn Asn Leu Pro Leu Asp Ala Thr Thr Trp Leu Ile Val Ala Leu 145 150 155 160 Val Ile Ala Met Ala Ala Ser Ile Gln Leu Tyr Ala Lys Lys Arg Arg 165 170 175 Arg Asp Gln Ala Leu Leu Thr Glu Gln Gln Lys Ala Ala Ser Ala Gln 180 185 190 Asn <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ATHPPOX. Ase1f <400> 3 ggggattaat ggagttatct cttctccgt 29 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer ATHPPOX.r <400> 4 ttacttgtaa gcgtaccgtg 20 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Chloram.r <400> 5 gctaaccgtt tttatcacct ggggggcacc ttatttt 37 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SPE2Xba1.r <400> 6 tgtttctaga taatcctggt c 21 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Chloram.Xba1.f <400> 7 ggtctagatg atgtccggcg gtgctttt 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Slr1790km EcoR1 f <400> 8 ggggaattct gcttgcatca atatggtggc 30 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Slr1790km Hind3 r <400> 9 gggaagctta ccctggagat ccactggtt 29 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Km Nhe1 f <400> 10 ggggctagcg cgaagaactc cagcatgaga 30 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Km Nhe1 r <400> 11 ggggctagca gcttcacgct gccgcaagca ct 32 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BamSma CAO fr. <400> 12 gaggatcccc gggtggtcag tcccttatga acgccgccgt gtttagtc 48 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sac CAO rev. <400> 13 ttacttgtaa gcgtaccgtg 20 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sac slr1790fr. <400> 14 ccgagctcgc ctactactgg tttaaagcct tc 32 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Sac slr1790 rev <400> 15 ccgagctcct aattctgagc agaagccgc 29 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer AtCAO-tra-up <400> 16 aacgccgccg tgtttagtcc 20 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAN-2-fr <400> 17 ggcctgttga acaagtctgg aa 22 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAN-2-rev <400> 18 ggcgtttccc gttgaatatg gctc 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAN-2ＦＰ1 <400> 19 acctacaaca aagctctcat caacc 25 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KAN-2ＲＰ1 <400> 20 gcaatgtaac atcagagatt ttgag 25

Claims

아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 남조류 유래인 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제.
제 1 항에 있어서,

남조류가 시네코시스티스속에 속하는 남조류인 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

생물이 식물인 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제.
하기 (a) ∼ (c) 중 어느 하나에 나타내는 단백질.

(a) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열로 이루어지는 단백질

(b) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질

(c) 배열 번호 2 에 나타내어지는 아미노산 배열에 대한 상동성이 20％ 이상이고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖는 것을 특징 으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질
제 4 항에 있어서,

남조류 유래인 것을 특징으로 하는 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 기재된 프로토포르피리노겐옥시다아제, 또는 제 4 항 혹은 제 5 항에 기재된 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA.
하기 (d) 또는 (e) 에 나타내는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA.

(d) 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열로 이루어지는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA

(e) 배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열에 있어서, 1 혹은 몇 개의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 배열로 이루어지고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA
배열 번호 1 에 나타내어지는 염기 배열에 대하여 상보 (相補) 적인 배열로 이루어지는 DNA 와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 아시플루오르펜에 대한 내성을 생물에 부여하는 활성을 갖고, 또한 프로토포르피리노겐옥시다 아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,

프로토포르피리노겐옥시다아제 활성을 갖는 단백질이 남조류에서 유래하는 것을 특징으로 하는 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자 DNA 가 삽입된 재조합 벡터.
제 10 항에 기재된 재조합 벡터가 도입된 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 11 항에 있어서,

형질 전환체가 아시플루오르펜에 대한 내성을 갖는 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,

형질 전환체가 미생물인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,

형질 전환체가 식물인 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 14 항에 있어서,

광합성능이 향상된 것을 특징으로 하는 형질 전환체.
제 11 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를 이용한 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해 활성능의 평가 방법.
제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 형질 전환체를 이용한 프로토포르피리노겐옥시다아제 저해제의 스크리닝 방법.
이하의 (f) ∼ (j) 의 공정을 포함하는, 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자의 단리 방법.

(f) 애기장대(Arabidopsis Thaliana)의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 남조류에 도입하는 공정

(g) 트랜스포존을 이용하여 남조류의 유전자를 파괴하는 공정

(h) 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자가 파괴된 주(株)를 선발하는 공정

(i) 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 특정하는 공정

(j) 파괴된 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자를 단리하는 공정
제 4 항 또는 제 5 항에 기재된 단백질의 프로토포르피리노겐옥시다아제로서 의 사용 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 기재된 단백질을 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 인위적으로 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 로 전환하는 방법.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 의 프로토포르피리노겐옥시다아제 유전자로서의 사용 방법.
제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 를 인위적으로 발현시키고, 그 발현 산물을 프로토포르피리노겐 Ⅸ 와 접촉시켜 프로토포르피린 Ⅸ 로 전환하는 방법.
이하의 1) ∼ 5) 의 공정을 포함하는 특정 생물에 있어서의 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자의 단리 방법.

1) 특정 생물 이외의 다른 생물로부터 소정의 기능을 상보하는 단백질을 코드하는 유전자를 특정 생물에 도입하여 형질 전환체를 제작하는 공정

2) 형질 전환체의 유전자를 랜덤하게 파괴하여 형질 전환체의 변이주를 제작하는 공정

3) 소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하여, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제를 이용하거나, 혹은 배양 조건을 변화시킴으로써, 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자가 파괴된 변이주를 선발하는 공정

4) 파괴된 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 특정하는 공정

5) 파괴된 소정의 기능을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 단리하는 공정
제 23 항에 있어서,

변이 처리가 트랜스포존을 이용한 변이 처리인 것을 특징으로 하는 유전자의 단리 방법.
제 23 항 또는 제 24 항에 있어서,

특정 생물 이외의 다른 생물로부터 소정의 기능을 상보하는 단백질이 애기장대의 프로토포르피리노겐옥시다아제인 것을 특징으로 하는 유전자의 단리 방법.
제 25 항에 있어서,

소정의 기능을 상보하는 단백질에 작용하여, 소정의 기능을 갖는 단백질에 작용하지 않는 약제가 아시플루오르펜인 것을 특징으로 하는 유전자의 단리 방법.
제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,

특정 생물에 있어서의 소정의 기능을 갖는 단백질이 남조류의 프로토포르피리노겐옥시다아제인 것을 특징으로 하는 유전자의 단리 방법.