KR20080039844A

KR20080039844A - Ｂ―세포 림프종 치료를 위한 ｃｄ20에 대한 모노클로날항체의 제조 방법

Info

Publication number: KR20080039844A
Application number: KR1020077029876A
Authority: KR
Inventors: 파텔 빌루 모라와라
Original assignee: 아베스타 겐그레인 테크놀로지스 피브이티 리미티드
Priority date: 2005-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2008-05-07
Also published as: CN101273063A; AP2007004252A0; WO2006126069A3; AU2006250888A2; CA2609731A1; ZA200711010B; WO2006126069A2; EP1885757A2; BRPI0610203A2; AU2006250888A1; IL187478A0; JP2009508467A; MX2007014673A; US20090285795A1; RU2007147598A

Abstract

본 발명은 재발 또는 불응, 저악성도(low-grade) 또는 소포, CD20-양성, B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)을 갖는 환자의 치료를 위해, CD20에 결합하는 항체의 가용성 형태의 제조에 이용되는 재조합 방법에 관한 것이다. 상기 치료는 면역학적으로 활성인 항-CD20 항체; 또는 방사선표지된 항-CD20 항체의 이용 및/또는 표지 및 비표지된 항체 양자가 NHL의 치료에 이용되는 협력 전략을 포함할 것이다. 상기 절차는 항-CD20을 암호화하는 핵산 서열의 드 노보(de novo) 합성, 구축된 핵산 서열의 컴피턴트 박테리아으로 형질전환 및 원하는 단백질의 발현을 위해 포유류 발현 벡터 내로 상기 핵산 서열의 서브클로닝을 기재한다. 목적 유전자와 관련된 조절 성분을 포함하는 DNA 구축물이 개시되어 있다. 목적 핵산 서열은 적절한 포유류 숙주 세포에서 발현을 허용하기 위해 코돈이 최적화되어 있다.

Description

Ｂ―세포 림프종 치료를 위한 ＣＤ20에 대한 모노클로날 항체의 제조 방법{A METHOD FOR THE PRODUCTION OF A MONOCLONAL ANTIBODY TO CD20 FOR THE TREATMENT OF B-CELL LYMPHOMA}

본 발명은 재발 또는 불응, 저악성도(low-grade) 또는 소포, CD20-양성, B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)을 갖는 환자의 치료를 위해, CD20에 결합하는 항체의 가용성 형태의 제조에 이용되는 재조합 방법에 관한 것이다. 상기 치료는 면역학적으로 활성인 항-CD20 항체; 또는 방사선표지된 항-CD20 항체의 이용 및/또는 표지 및 비표지된 항체 양자가 NHL의 치료에 이용되는 협력 전략을 포함할 것이다. 상기 절차는 항-CD20을 암호화하는 핵산 서열의 드 노보(de novo) 합성, 구축된 핵산 서열의 컴피턴트 박테리아로 형질전환 및 원하는 단백질의 발현을 위해 포유류 발현 벡터 내로 상기 핵산 서열의 서브클로닝을 기재한다. 목적 유전자와 관련된 조절 성분을 포함하는 DNA 구축물이 개시되어 있다. 목적 핵산 서열은 적절한 포유류 숙주 세포에서 발현을 허용하기 위해 코돈이 최적화되어 있다.

항체는 높은 정도의 특이성 및 친화성으로 거의 임의의 분자를 인식하고 표적화하는 강력한 도구로서 고려되어 왔다. 모노클로날 항체 (mAbs)는 RIA, ELISA 면역세포병리(immunocytopathology) 및 유세포분석용 시약의 전세계적인 표준화를 가능하게 하는 시험관 내 진단으로서 이용되어 왔다. 모노클로날 항체는 또한 종양 항원의 생체 내 위치화 및 암의 면역요법에서 배타적으로 이용되어 왔다.

상기 문제는 2가지 기본적인 유형의 항체의 개발을 야기하였다. 키메라 항체로 언급되는 제1유형은 뮤린 불변 도메인이 단지 인간 기원의 동등 도메인에 의해 치환된다 (Morrison et al, P.N. A. S., 1984, 81, 6851-6855; Boulianne et al, Nature, 1985, 314, 268-270; 및 Neuberger et al, Nature, 1985, 314, 268-270). 제2유형은 뮤린 불변 도메인 및 뮤린 골격 영역이 모두 인간 기원의 동등 도메인 및 영역에 의해 치환된다. 상기 제2유형의 항체는 인간화된 또는 CDR-그라프팅된 항체로서 언급된다 (Jones et al, Nature, 1986, 321, 522-525; 및 Riechmann et al, Nature, 1988, 332, 323-327). 예를 들면, 치료 목적으로, 인간 IgGl 및 래트 IgG2b가 현재로 선호되는 이소타입이다. 또한, 인간 IgG 이소타입 중에서, IgGl 및 IgG3가 보체 및 세포 매개 용혈에 가장 효과적으로 것으로 보이므로, 종양 세포의 사멸에 효과적이다. 인간 항체는 당연히 "인간화" 필요를 피할 수 있으나, 인간 항체를 분비하는 세포주는 매우 불안정하고, 일반적으로 상업적인 규모 생산에 부적합한 것으로 증명되었다.

충분히 임상적인 용도로 충분한 양의 항체를 생산하기 위해, 효율적인 재조합 발현 시스템을 이용하는 것이 바람직하다. 골수종세포는 항체 생산 및 분비에 전문화된 천연 숙주를 나타내기 때문에, 상기 유래의 세포주가 재조합 항체의 발현에 이용되어 왔다. 종종, 면역글로불린 유전자 조절 성분에 기초한 복잡한 벡터 디자인이 필요하며, 최종 발현 수준은 매우 가변적인 것으로 보고되었다 (Winter et al, Nature, 1988, 332, 323-327; Weidle et al, Gene, 1987, 60, 205-216; Nakatani et al, Bio/Technology, 1989, 7, 805-810; 및 Gillies et al, Bio/Technology, 1989, 7, 799-804). 대안적인 포유류 발현 시스템은 중국비단털쥐난소 (CHO) 세포의 이용에 의해 제공된 것이다. 상기 세포의 이용은 연구 및 임상 용도를 위한 대량의 몇 가지 치료 단백질의 생산을 가능하게 하였다 (Kaufman et al, Mol. Cell. Biol, 1985, 5, 1750-1759; 및 Zettlmeissl et al, Bio/Technology, 1987, 5, 720-725). 그러나, 항체의 발현을 위해 상기 세포의 이용의 경우는 거의 없으며, 지금까지 보고된 뮤린 항체의 발현 수준은 0.01-0.1. mu.g/ml 정도로 낮았다 (Weidle et al, Gene, 1987, 51, 21-29; 및 Feys et al, IntJ.Cancer, 1988, 2, 26-27).

항-CD20 항체는 프리(pre) B 및 성숙(mature) B 림프구에 위치한 대략 35 KD의 분자량을 갖는 소수성 막횡단 단백질인 항원 CD20 (인간 B 림프구 제한된 분화 항원, Bp35)에 특이적으로 결합한다. 상기 항원은 또한 B 세포 비호지킨 림프종 (NHL)의 90% 이상에서 발현되나, 조혈간세포, 프로(pro) B 세포, 정상 혈장세포 또는 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다. CD20은 세포주기 개시 및 분화에 대한 활성화 과정에서 초기 단계(들)를 조절하고, 아마도 칼슘 이온 채널로서 기능한다. CD20은 세포 표면으로부터 방출되지 않으며, 항체 결합 시 내재화되지 않는다. 유리 CD20 항원은 순환계에서 발견되지 않는다. 상기 항-CD20 항체는 CD20 항원을 통해 결합하는 B 세포를 공격하고 죽이는 신체의 자연 방어를 강화함으로써 작용한다. 숙주 세포 사멸은 2가지 기작에 의해 일어난다: 1) 보체 의존성 세포독 성(CDC) 경로 및 2) 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 경로.

항-CD20 항체는 일반적으로 조작된 키메라 뮤린/인간 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 뮤린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 IgG₁ 카파 면역글로불린이다. 상기 항-CD20 항체는 451 아미노산의 2개의 중쇄 및 231 아미노산의 2개의 경쇄로 이루어지며 (cDNA 분석에 기초함), 대략 145 kD의 분자량을 가진다. 상기 항-CD20 항체는 대략 8.0 nM의 CD20 항원에 대한 결합 친화성을 가진다. 상기 키메라 항-CD20 항체는 항생제 겐타마이신을 포함하는 영양 배지에서 포유류 세포(중국비단털쥐난소) 현탁 배양에 의해 생산된다. 상기 항-CD20 항체는 친화성 및 이온교환 크로마토그래피에 의해 정제된다.

본 발명은 CD20에 결합할 수 있는 항체의 구축, 클로닝, 발현, 정제 및 생산에 관한 것이다. 상기 항체는 재발 또는 불응, 저악성도 또는 소포, CD20-양성, B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)을 갖는 환자의 치료에 대해 표시된 표적화된 치료일 것이다.

발명의 요약

본 발명은 폴리펩티드 항-CD20를 암호화하는 핵산 서열의 형질전환에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 양태에 따라, 항-CD20 분자의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 핵산 서열이 제공된다. 본 발명의 추가의 양태에 따라, 상기 핵산 서열에 의해 암호화되는 해당하는 아미노산 서열이 제공된다.

본 발명의 특정 양태는 항-CD20 분자의 중쇄 및 경쇄의 가변성 영역의 드 노보 합성에 관한 것이다. 또한, 목적 핵산 서열을 갖는 벡터 구축물의 구축, 컴피턴트 박테리아 내로 벡터 구축물의 형질전환 및 항-CD20 사슬의 포유류 발현 벡터 내로 서브클로닝이 개시된다.

발명의 상세한 설명

항-CD20 항체는 마우스-인간 키메라 항체이다. 이는 2개의 사슬로 이루어진다 - 1) 마우스 모노클로날 항체 2B8의 경쇄로부터 유래된 가변성 도메인 및 인간 카파 불변 도메인으로 이루어진 경쇄 및 2) 마우스 모노클로날 항체 2B8의 중쇄의 가변성 도메인 및 인간 IgGl 불변 도메인으로 이루어진 종쇄. 상기 항체 서열은 특허 WO 94/11026에 표시된다.

항-CD20 마우스 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 2B8이 퍼블릭 도메인에서 유용하지 않기 때문에 cDNA-구축물의 암호화 영역의 합성의 면에서 드 노보 접근이 뒤따랐다. 드 노보 유전자 합성은 또한 단백질 발현에 이용되는 특정 포유류 세포주에 대해 코돈 최적화를 가능하게 할 수 있다.

항-CD20 항체의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 표시되어 있다.

항-CD20 항체의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화된 버전은 서열번호 2에 표시되어 있다.

항-CD20 항체의 경쇄의 암호화 DNA 서열에서 코돈은 CHO Kl 및 HEK 293과 같은 포유류 세포주에서 최적의 재조합 단백질 발현을 보장하기 위해 코돈-최적화 과정의 일부로서 변경되었다. 항-CD20 항체의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에 표시되어 있다.

항-CD20 항체의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화된 버전은 서열번호 4에 표시되어 있다.

항-CD20 항체의 중쇄의 암호화 DNA 서열에서 코돈은 CHO Kl 및 HEK 293과 같은 포유류 세포주에서 최적의 재조합 단백질 발현을 보장하기 위해 코돈-최적화 과정의 일부로서 변경되었다.

발현 벡터의 선택:

항-CD20 항체의 발현을 위한 포유류 발현 벡터의 디자인은 시판되는 벡터(예를 들면, 각각 Invitrogen 또는 BD Biosciences 사의 pcDNA 또는 pIRES) 중의 하나에 기초하고, 하기 특징을 포함하도록 변형될 수 있다:

(a) 동일한 벡터의 별개의 발현 카세트에서 항-CD20 항체의 항체 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA의 삽입을 위한 다중 클로닝 자리.

(b) 발현 벡터의 디자인은 또한 형광 보조 세포 분류를 이용하여 높게 발현되는 트랜스펙턴트의 신속한 스크리닝을 허용할 수 있는 녹색형광단백질의 독립적인 (bi-cistronic) IRES-매개 동시 발현을 고려할 수 있다.

(c) 상이한 선택 마커를 갖는 2개의 별개의 포유류 발현 시스템에서 키메라 항체 경쇄 및 중쇄의 클로닝.

포유류 발현 벡터에 RTX 항체 사슬의 서브클로닝

드 노보 합성된 항-CD20 항체-중쇄 (RTX-HC) 및 항-CD20 항체-경쇄 (RTX-LC)는 pBSKII 벡터 내로 클로닝된 cDNA 단편으로서 수득되었으며, 구축물은 각각 pBSKII-RTX-LC 및 pBSKII-RTX-HC로서 언급되었다. 상기 DNA는 DHlOb 대장균 세포 내로 형질전환되었으며, 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트에 도말되었다. 상기 플레이트로부터 하나의 콜로니를 액체 배지에 접종하고, DNA 미니 프렙을 수행하였다. 2가지 항체 사슬의 서열을 서열결정에 의해 확인하였다.

전장(full-length) 항-CD20 항체 경쇄 및 중쇄를 각각 포유류 발현 벡터 pCAIN 및 pCAID 내로 서브클로닝하였다. pBSKII/RTX-LC 클론 및 pCAIN 벡터를 BgIII 및 EcoRI으로 절단하였다. 생성된 구축물은 pCAIN/RTX-LC로서 언급하였다. 전자로부터 인서트 (700 bp) 및 후자로부터 벡터 골격을 겔 정제하고, 연결하였다 (도 1). 라이게이션 혼합물을 열충격 컴피턴트 DHlOb 세포 내로 형질전환하고, 선택 항생제로서 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트 상에 도말하였다. 몇 개의 형질전환체를 취하고, DNA 미니 프렙을 수행하였다. 클론을 제한효소 절단에 의해 검사하였다 (도 2).

pBSKII/RTX-HC 클론 및 pCAID 벡터를 BamHI 및 EcoRI으로 절단하고, 생성된 구축물을 pCAID/RTX-HC로서 언급하였다. 전자로부터 인서트 (1429 bp) 및 후자로부터 벡터 골격을 겔 정제하고, 연결하였다 (도 3). 라이게이션 혼합물을 열충격 컴피턴트 DHlOb 세포 내로 형질전환하고, 선택 항생제로서 암피실린을 포함하는 LB 한천 플레이트 상에 도말하였다. 몇 개의 형질전환체를 취하고, DNA 미니 프렙을 수행하였다. 클론을 제한효소 절단에 의해 검사하였다 (도 4).

DNA 서열결정 및 분석:

각각 포유류 발현 벡터 pCAID 및 pCAIN 내로 클로닝된 RTX-HC 및 RTX-LC의 최종 클론을 서열결정하고, 이의 서열 정확성을 확인하였다.

항- CD20 항체 사슬을 암호화하는 유전자의 유지 및 증식:

항-CD20 항체의 키메라 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 cDNA 구축물을 Top 10 (Invitrogen)과 같은 표준 박테리아 세포주에서 유지 및 증식할 것이다.

CHO - Kl 에서 일시적/안정한 재조합 단백질 발현:

(a) 상기 구축물의 일시적/안정한 발현을 산업적 적용으로 FDA 인증된 포유류 세포주인 중국비단털쥐난소 세포 (CHO)를 이용하여 수행할 것이다. 일시적 발현은 구축물의 발현을 검사하고, 재조합 단백질의 소량을 신속하게 수득하는데 유용하다.

(b) 이어서, 원하는 모노클로날 항체의 안정하고 높은 발현을 나타내는 CHO 세포를 표준 절차를 이용하여 개발할 것이다.

항- CD20 항체의 정제:

성숙한 키메라 항체인 항-CD20 항체는 2개의 항체 중쇄 (451 x 2 아미노산) 및 2개의 항체 경쇄 (213 x 2 아미노산)로 이루어지며, 대략 145 kDa의 분자량을 가진다. 양자의 사슬의 N-말단 20 아미노산 리더 서열은 호르몬의 분비 전에 절단되어 제거된다.

전술한 추천된 기능적/결합 분석에 따른 재현성 있는 생활성의 확립에 이어, 정제 절차를 최적화하기 위해 노력할 것이다. 정제 전략은 주요 목적으로서 프로세스 경제학, 시장에 대한 속도, 확장성(scalability), 재현성, 및 기능적 안정성 및 구조적 완전성을 갖는 제품의 최대 순도를 겨낭할 것이다. 이러한 취지로, 여과 (정상 및 접선 흐름 여과) 및 크로마토그래피 양자를 갖는 조합 접근이 개발될 것이다. 프로세스 자격 요건 및 수용 기준 연구를 3개의 배취에 대해 수행할 것이다.

따라서, 본 발명은 정제 과정에서 하기 단계를 고려한다:

a. COHC/AlHC/0.45μ 심층 필터를 이용한 초기 투명화

b. 접선 흐름 여과에 기초한 Pellicon XL Biomax 50 kDa 컷-오프를 이용한 농축

c. 크로모(chromo) 단계 - I: 혈청 기재 (2% 소태아혈청[FCS]) 배양 상층액에 대해 Prosep VA Ultra 및 무혈청 배양 상층액에 대해 Prosep VA를 이용한 친화성 크로마토그래피.

d. 크로모 단계 - II: SP Sepharose와 같은 강한 양이온 교환기

e. 크로모 단계 - III: 숙주 세포 단백질 및 핵산의 제거용 Cellufine Q (셀룰로스 기재 매질)와 같은 플로 쓰루(flow through) 기재 강한 음이온 교환기.

f. 크기 배제 여과 및 Cellufine 설페이트를 이용한 용출된 단백질 A를 이용한 바이러스 제거

g. 멸균 여과

h. Remtox/Cellufine ET 크로마토그래피를 이용한 내독소 제거

i. 제형화

생화학적, 면역학적 및 이화학적 방법을 이용한 표적 단백질의 동일성의 확립:

각 단계에서 총 단백질의 회수율은 비신코닌산(BCA) 절차/브래드포드 염료 결합 방법을 이용하여 정량화될 것이다. 정제의 각 단계에서 표적 단백질 농도는 직접 또는 간접 샌드위치 ELISA와 같은 매우 특이적이고, 신뢰성 있는 효소 기재 면역분석법을 이용하여 탐침할 것이다. 정성적인 표적 특이적인 웨스턴 분석이 각 단계에서 따를 것이다. 역상 크로마토그래피, 등전점 포커싱 및 2차원 겔 전기영동을 정제된 산물을 평가하기 위해 이용할 것이다. 2차 구조 분석은 원자외선 원평광 이색성을 이용하여 조사할 수 있다. 분자 질량 및 올리고머 상태를 크기 배제 및 MALDI-TOF를 이용하여 조사할 것이다. 상기 조사는 또한 pH 및 온도에 대한 단백질의 안정성에 집중할 것이다. NESP는 초당화된(hyperglycosylated) 단백질이므로, 정제된 단백질의 당화 패턴은 기체 크로마토그래피 (GC) 분석을 이용하여 조사할 것이다.

7. 항-CD20 항체의 시험관 내 및 생체 내 활성 분석:

항-CD20 항체의 시험관 내 CD20 결합 및 상기 항체의 효과기(effector) 기능을 검출하기 위한 생물분석은 하기를 이용하여 수행할 것이다:

a) 플루오레신 표지된 C1q를 이용하여 유세포 분석에서 인간 C1q 결합 및 CD-20 양성 SB 세포

b) CD20 양성 SB 세포의 보체 의존성 세포 용혈

c) CD20 양성 세포 및 CD20 음성 세포를 이용한 항체 의존성 세포 독성 효과기 분석

항-CD20 항체의 임상전 생체 내 생활성은 하기에 대해 비인간 영장류 (필리핀원숭이)에 대해 시험할 것이다:

a) 말초혈 림프절 및 골수로부터 B 세포 부족의 효능.

b) 키메라 항체와 관련된 임의의 독성의 평가.

<110> avestha Morawala patell, Villoo <120> method of production of mAB CD 20 <130> 23-05-06 <160> 3 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 708 <212> DNA <213> homosapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(708) <400> 1 atg gat ttt cag gtg cag att atc agc ttc ctg cta atc agt gct tca 48 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Ile Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 gtc ata atg tcc aga gga caa att gtt ctc tcc cag tct cca gca atc 96 Val Ile Met Ser Arg Gly Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc agg gcc agc 144 Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 tca agt gta agt tac atc cac tgg ttc cag cag aag cca gga tcc tcc 192 Ser Ser Val Ser Tyr Ile His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser 50 55 60 ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cct 240 Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 gtt cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg act tct tac tct ctc acc atc 288 Val Arg 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Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 165 170 175 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 3 <211> 1413 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 3 atg ggc tgg agt ctg att ctg ctc ttc ctg gtg gct gtg gcc aca aga 48 Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg 1 5 10 15 gtg ctg tcc cag gtc cag ctg cag cag ctg ggg gcc gag ctg gtt aaa 96 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Leu Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 cct ggc gcc tcc gtg aag atg tcc tgc aaa gca tcc ggc tac acc ttc 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acc agt tac aac atg cat tgg gtg aag caa act ccg ggc aga ggc ctg 192 Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu 50 55 60 gaa tgg ata ggg gcg atc tac ccc ggg aac ggt gac acg agt tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 cag aag ttc aag ggc aag gcg acc ctc acc gcc gac aag tcg tcc tcg 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 acc gct tac atg cag ctg tcc tcc ctg acg tcg gag gac tcg gcc gtg 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tac tac tgc gcc cgc tcg acc tac tac ggc ggc gac tgg tac ttc aac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn 115 120 125 gtg tgg ggg gcc ggc acc acc gtg acc gtg agt gcc gcc tcc acc aag 432 Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys 130 135 140 ggg ccg tcc gtg ttc cca ctc gca cca tca tcc aag tcc acc agt ggg 480 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 ggc act gcc gca tta ggg tgc ctg gtc aag gat tac ttt ccc gaa cct 528 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 gtg acc gtc tct tgg aat tcc ggg gcc ctc acg tcc ggg gtc cat acc 576 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 ttc cca gct gtg ttg cag tcg tcg ggg ctg tac tcc ctg tcc tcg gtt 624 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 gtt acc gtc ccc tcg tca agt ctg ggc acc cag acc tac atc tgc aac 672 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 210 215 220 gtc aat cac aag ccc tcg aac acc aag gtc gac aag aag gcc gaa ccc 720 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro 225 230 235 240 aag tcg tgc gac aag acg cac aca tgt cct ccc tgc ccc gct ccc gaa 768 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 245 250 255 ctg ctg ggc gga cct agt gtg ttc ctg ttc cct cca aag ccc aag gac 816 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 260 265 270 acc ctc atg atc tca cgc acc cca gag gtg acc tgc gtc gtc gtg gat 864 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 275 280 285 gtg tcg cac gag gat ccc gag gtt aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc 912 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 290 295 300 gtg gag gtt cac aac gct aaa acc aag cca cgg gag gag cag tat aac 960 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 305 310 315 320 tcc acg tac cgc gtg gtg tca gtg ctc aca gtg ctt cac caa gac tgg 1008 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 325 330 335 ctc aac ggg aag gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctt ccc 1056 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 340 345 350 gcc ccc atc gag aag act atc tcc aag gct aag gga cag ccg cga gag 1104 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 355 360 365 cct cag gtg tac acc ctg cct ccc tcg cgc gac gag tta aca aag aac 1152 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 370 375 380 cag gta tcg ctc act tgc ctg gtc aaa ggt ttc tac cct tcc gac atc 1200 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 385 390 395 400 gcc gtc gag tgg gag agt aac ggg cag ccc gag aac aac tat aag act 1248 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 405 410 415 aca ccc ccc gtg cta gat tcc gat ggg tcc ttc ttc ctg tac tcg aag 1296 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 420 425 430 ctc aca gtg gat aag agt cgc tgg cag cag ggg aac gtc ttc agt tgc 1344 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 435 440 445 tcc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acg cag aag tcc ctg 1392 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 450 455 460 agc ctg tcg ccc ggc aag tga 1413 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470

Claims

하기 단계를 포함하는 생체 내 생물학적으로 활성인 항-CD20 모노클로날 항체의 제조 방법:

■ 항-CD20 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 드 노보 합성 단계

■ 항-CD20 항체의 전장(full-length) 카파 경쇄의 구축 단계

■ 항-CD20 항체의 전장 IgGl 중쇄의 구축 단계

■ 항-CD20 분자의 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터의 구축 단계

■ 생물학적으로 활성인 항체 분자의 제조를 위한 포유류 발현 벡터에서 항-CD20 항체 사슬의 서브클로닝 단계.
제 1 항에 있어서, 항-CD20 항체의 경쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 1에 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항-CD20 항체의 중쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2에 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 항-CD20의 중쇄를 암호화하는 핵산 단편을 포함하는 벡터를 자리지정 돌연변이유발시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 전장 항-CD20 중쇄 및 경쇄를 포유류 벡터 내로 서브클로닝하는 것을 특징으로 하는 방법.
도 7 또는 도 8의 벡터 구축물로 숙주 세포를 형질전환하는 단계 및 상기 숙주 세포 또는 이의 성장 배지로부터 생성물을 분리하는 단계를 포함하는 생체 내 생물학적으로 활성인 항-CD20 모노클로날 항체의 제조 방법.
항체가 배양물에서 키운 포유류 세포로부터 정제된, 치료학적 유효량의 항-CD20 항체 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 보조제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.